MinidefinitieIncadrare taxonomicaHabitatImplicare in patologia umanaMicrobiologie - principalele caractere si implicatii in patogeneza sidiagnosticul microbiologieFactori de patogenitatePatogenieRaspunsul imunNotiuni de epidemiologie si profilaxie a infectiilor nosocomialeDiagnosticul de laborator

Curs XX. Genul Pseudomonas, Genul Acinetobacter

Genul Pseudomonas

1.II.

\ III.i IV.

V.

VI.VII.VIII.IX.X.

Cuvinte cheie: bacili Gram negativi, oxidază pozitivi, facultativ anaerobi, darpreferând metabolismul aerob, nefermentativi; enzime proteolitice, pigmenţi(piocianina, pioverdina, piorubina etc.); miros aromat; condiţionat patogen,infecţii nosocomiale; hidrofil, psichrotrop; fibroză chistică, bacteriemii, infecţiiurinare, infecţii la arşi; rezistenţă la antibiotice prin mecanisme multiple:enzime, scăderea permeabilităţii, pompe de eflux, modificarea ţintei etc.

1. Minidefiniţie

Microorganismele din Genul Pseudomonas sunt bacili Gram negativr, non-fermentativi (spre deosebire de enterobacterii, care fermentează glucoza), facultativanaerobi, dar preferând aerobioza, nesporulaţi, care pot fi implicaţi În infecţii cu diverselocalizări, la organisme cu imunitate deficitară.

Este unul dintre patogenii cel mai frecvent implicaţi în infecţiile nosocomiale.

II. Încadrare taxonomică

Domeniu: BacteriaPhylum: ProteobacteriaClasa: GammaproteobacteriaOrdin: PseudomonadalesFamilie: PseudomonadaceaeGenus: Pseudomonas

Genul Pseudomonas cuprinde un număr mare de specii, dintre care numai uneleau fost izolate de la om. Din acest gen s-au desprins de-a lungul timpului specii înrudite,dar distincte prin caracterele genetice, cum sunt Burkholderia cepacia,Stenotrophomonas maltophilia etc.

Pseudomonas aeruginosa este specia cel mai frecvent implicată În infecţii la om.

De semenea, se poate întâlni în bazine de înot, instalaţii sanitare etc.

II l. Habitat

Bacteriile din Genul Pseudomonas sunt ubiquitare, putând fi prezente în sol, apenaturale sau bazine de înot, organisme vegetale şi animale. Majoritatea fac parte din floranormală, dar pot deveni patogeni condiţionaţi sau oportunişti pentru om, animale sauplante.

Se remarcă afinitatea microorganismului pentru lichide şi medii umede şi gradulmare de adaptabilitate, datorită necesităţilor reduse de creştere prin dotarea cu o serielargă de enzime active pe substraturi nutritive variate.

Colonizează mediul de spital, fiind prezent în aerosoli, apă ditilată contaminată,soluţii terapeutice - heparina, antiseptice şi/sau soluţii antimicrobiene de clorhexidină,eozină, polimixina B, săpun lichid etc., pe suprafeţe, echipamente - de aspiraţie, dedializă, de susţinere respiratorie, termometre, endoscoape -, pe obiecte, inclusiv flori şifrunze etc.

IV. Implicare in patologia umană

Infecţiile cu Pseudomonas aeruginosa îmbracă forme clinice diferite, în funcţiede virulenţa microorganismului şi de raspunsul gazdei:

Infecţii ale pielii (plăgi chirurgicale, arsuri)• Infecţii de tract urinar, în special nosocomiale, după utilizarea cateterelor urinare• Infecţii ale tractului respirator inferior: pneumonie de ventilaţie, după asistare

respiratorie în timpul intervenţiei chirurgicale şi/sau resuscitare în secţi i de terapieintensivă, cu diseminare la nivel circulator

• Infecţii respiratorii cronice, în special în maladia congenitală numită fibrozăchistică, în care sunt prezente deficite ale sistemului de apărare locală la nivelulcăilor respiratorii

• Endocardite, meningite, otite, infecţii oculare• Septicemie - hemoculturile sunt rar pozitive, calea principală de transmitere este

cea limfatică

V. Microbiologie - principalele caractere, implicaţii în patogeneză şi diagnosticulmicrobiologie

2

Prima descriere a bacteriei datează din 1872, când Schroeter îi dă denumirea de"aeruginosum", provenind de la aspectul asemănător oxidului de fier.

Datorită elaborării de piocianină, un pigment de culoare albastru-verzui, a fostdenumit bacil piocianic (gr. 'pios = puroi, cianum = albastru). Puroiul în infecţii cuPseudomonas este albastru-verzui

Bacteriile din Genul Pseudomonas sunt bacili Gram negativi, subţiri, drepţi sauuşor curbaţi (Fig. 1), cu dimensiuni de 0,5-0,8 um / 1,5-3 um, care apar izolaţi, înperechi sau lanţuri scurte. În culturi tinere, putem observa şi forme filamentoase, iar Înculturi îrnbătrânite sau pe medii selective, forme de involuţie, ondulate, bacili În formă devirgulă, coci În lanţuri scurte etc. Sunt nesporulaţi, de obicei necapsulaţi, dar din infecţiisevere s-au izolat şi variante capsulate. Pseudomonas aeruginosa prezintă un singurflagel situat polar, adică la unul din capete (Fig. 2).

Fig. 1. Frotiu din prelevat cu Pseudomonas aeruginosa

Fig. 2. Pseudomonas aeruginosa - flagel polar

Pseudomonadele cresc foarte uşor, cu foarte puţine surse nutritive, deoarece potfolosi foarte multe substanţe ca substrat, inclusiv soluţii alcoolice. Cresc pe mediidiferite, chiar nefavorabile, cu substanţe inhibitorii (selective).

Caracterele de cultură pe medii uzuale sunt: dezvoltarea sub formă de coloniiplate, frecvent pigmentate În albastru-verzui, uneori galben (Fig. 3), cu miros aromat(descris ca miros de tei sau salcâm), datorat producerii de pigmenţi cu structurăfenazinică. Frecvent prezintă un luciu metalic, datorat eliberării de acizi graşi prin lizasubstratului nutritiv. Pigmenţii sunt difuzibili În mediu şi sunt de mai multe tipuri:

• piocianina, pigment albastru-verzui, specific pentru Pseudomonas aeruginosa,care nu apare la nici o altă specie, solubil în c1oroform, apă caldă etc.

• pioverdina, fluoresceina, pigment galben-verzui, produs de P. aeruginosa şi altespecii, insolubil în c1oroform, solubil în apă

• eritrina (piorubina), pigment roşu, solubil în apă, insolubil în c1oroform, uneorivizibil doar după extracţia cu c1oroform a piocianinei

3

\

• piomelanina, pigment negru, apare mai rarPigmenţii sunt sintetizati mai bine în anaerobioză. Există şi tulpini acromogene.Aspectul coloniile diferă în funcţie de mediul pe care sunt cultivate tulpinile de

Pseudomonas aeruginosa:pe agar simplu, colonii cu pigment caracteristic, albastru-verzui, caredifuzează în mediu (Fig. 3)pe agar sânge: colonii gri, lucioase, cu luciu metalic şi hemoliza de tip ~,mai puternică la temperatura camereipe agar Mac Conkey: colonii mici, lactoză negative, incolorepe bulion nutritiv sau apă peptonata 1% tulbură uniform mediul ŞIformează văl la suprafaţa mediului; elaborează un pigment gripe mediu semisolid, în tub creşte la suprafaţa, deoarece preferă aerobioza(fig. 4)

Fig. 3. Aspectul coloniilor de Pseudomonas aeruginosa pe agar simplu

http://www.emlab.com/s/sampling/env-repOlt-03-2007.html

Fig. 4. Creşterea P. aeruginosa pe mediu semisolid, în tub

În anaerobioză, P. aeruginosa creşte folosind ca acceptor final de electroni nitraţii,pe care îi reduce la nitriţi (Fig. 5).

4

Fig. 4. P. aeruginosa reduce nitraţii la nitriţi

Pseudomonadele sunt catalază şi oxidază pozitivi (Fig. 5).

Fig. 5. a.Reacţie pentru catalază pozitivă - efervescenţă În apă oxigenată;b. Reacţie pentru oxidază pozitivă - metoda cu disc impregnat cu reactiv

pentru oxidază

a. b.http://www.rci.rutgers.edu/~microlab/CLASSINFO/IMAGESCIlenzymes.htm

VI. Factori de patogenitate

Factorii de patogenitate ai P. aeruginosa sunt structuri somatice sau produseextracelulare.

Dintre structurile somatice cu rol În patogenitate fac parte capsula polizaharidică,pilii, flagelul, lipopolizaharidul, acesta din urmă cu activitate endotoxinică.

P. aeruginosa eliberează enzime, cum sunt: neuraminidaza, care favorizeazăaderenţa la celulele gazdei, proteaze alcaline, elastaze, hemolizine cu activitatea delecitinaea, fosfolipaze etc. şi toxine, ca: exotoxina A, exotoxina E, piocianina, care

5

6

mediază leziunile tisulare. Exotoxina A, specifica pentru P. aeruginosa, actioneazăasemănător cu toxina difterică.

Rezistenţa la un număr mare de clase de antibiotice constituie adesea un factorsuplimentar de patogenitate la P. aeruginosa, mai ales în infecţiile nosocomiale.

VII. Patogenie

Etapele instalării infecţiei cu P. aeruginosa sunt:

- aderenţa la celulele endoteliale, cu ajutorul pililor şi proteinelor implicate înaderenţă

persistenţa la nivel local prin intermediul materialului exopolizaharidic, custructură de alginat, care face posibilă formarea unui biofilm cu protejarea bacteriei faţăde factorii de apărare locali, antibiotice etc.

- efecte locale prin exotoxina A, care inhibă sinteza proteică, prin mecanismasemănător toxinei difterice, fosfolipaze cu efect hemolitic şi de degradare asurfactantului pulmonar, elastaze care degradează proteinele matricei extracelulare şi IgG etc. Aceste enzime joacă un rol important în invazie şi distrucţia celulară, la nivelpulmonar şi/sau în alte zone anatomice (cornee, alte ţesuturi invadate etc.). Pigmenţii şialţi compuşi cu fier cauzează leziuni entoteliale caracteristice infecţiei cu P. aeruginosa

- efecte generalizate, în infecţii sistemice, prin endotoxina capabilă de a declanşaşocul septic

VIII. Răspunsul imun

Imunitatea În infecţiile cu P. aeruginosa este naturală şi/sau câştigată.Imunitatea naturală este reprezentată de integritatea pielii/mucoaselor, intervenţia

celulelor fagocitare, a sistemului complement etc.Imunitatea câţtigată este humorala (Ac antitoxici, Ac antibacterieni - Ig G anti

,,0", anti-endotoxinice, tip specifice) şi celulară (Iimfocite T).

IX. Noţiuni de epidemiologie şi profilaxie a infecţiilor nosocomiale

Infecţie nosocomială sau infecţie spitalicească este considerată orice infecţiecâştigată de un pacient internat sau care primeţte îngrijiri în ambulator, care devinemanifestă în timpul internării (după cel puţin 48 h de la internare) sau după externare (ex.la câteva luni după inserţia unei proteze).

Infecţiile nosocomiale au multiple consecinţe medicale, etice, economice, legaleetc.

Principalele categorii de microorganisme implicate în etiologia infecţii lornosocomiale sunt:

bacilii Gram negativi: Pseudomonas, Klebsiella, Acinetobacter etc. - panala 60% din infecţiile nosocomiale

7

\

cocii Gram pozitivi: Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus etc.fungii: Candida albicans etc.

Pseudomonas aeruginosa este bacilul Gram negativ cel mai frecvent implicat înetiologia infeţiilor nosocomiale, provenind din surse exterioare spitalului (aer, suprafeţe,surse de apă) sau surse din spital (pacienţi cu infecţii, purtători - aproximativ 10% dinoameni poartă P. aeruginosa în colon), diferite echipamente contaminate.

Cei mai expuşi sunt indivizii care prezintă factori de risc, cum sunt:Investigaţii exploratorii moderne si/sau tratamente care afectează integritateapielii şi mucoaselor: abord arterial, uretral, cateterisme, intubaţii, bronhoscopiietc.; în aceste situaţii, foarte importantă este respectarea procedurilorinvestigaţionale, respectiv spălarea corectă a mânilor, schimbarea echipamentuluide protecţie între proceduri, existenţa unor echipe distincte de personal afectateîngrijirii pacienţilor septici şi aseptici etc.

• Imaturitatea sau deprimarea sistemului imunitar: nou născuţi distrofici, pacienţi cuafecţiuni coexistente internaţi în servicii de hematologie, oncologie, urologie,reanimare şi terapie intensivă etc., cu neoplasme, tuberculoză, SIDA, arsuri,politraumatisme etc., pacienţi imunosupresaţi prin tratamente cu citostatice,radioterapie etc.

• Utilizarea neadecvată a antibioticelor, care contribuie la selecţia de tulpinirezistente şi favorizează autoinfecţia prin suprimarea florei normale. Greşelile potconsta în: nerespectarea ordinii de administrare a antibioticelor, nerespectareaduratei de administrare (scurtare sau prelungire), nerespectarea dozelor,nerespectarea politicii de administrare a antibioticelor, rezultate din datelecumulative ale rezistenţei la antibiotice prezentate de laboratorul de microbiologieetc.

Sursele patogenilor nosocomiali sunt elucidate doar în doua treimi dintre cazuri:• Translocare (schimbarea situsului unor bacterii care colonizează

normal .organismul, cu invadarea unor situsuri anatomice normalsterile), de exemplu la pacientii aplastici (8%),Surse de infecţie digestive (10%)

• Surse cutanate, în cazul dispozitivelor intravasculare (33,6%) -Fig. 6

• Surse urinare (16%) - infecţii urinare, mai ales după cateterizareurinară

• Surse respiratorii (Fig. 7)

Cei mai expuşi sunt pacienţii cu fibroză chistică, arşii şi pacienţii cu neoplasme,care rămân internaţi pentru perioade lungi de timp în unităţi de îngrijire medicală.

\

Fig. 6. Surse de infecţie în cazul dispozitivelor intravasculare

Fig. 7. Sursa de infecţie respiratorie - aparat de ventilaţie mecanică

În cazul infecţiilor cu Pseudomonas aeruginosa au fost utilizate vaccinuripiocianice polivalente, în scop profilactic şi/sau terapeutic sau vaccinuri monovalente, înscop terapeutic.

Profilaxia nespecifică constă în curăţirea şi dezinfecţia mediului spitalicesc,educarea periodică a personalului, controlul şi monitorizarea purtătorilor, evitareacontaminării, utilizarea antisepticelor şi dezinfectantelor, în funcţie de rezultatele testăriisensibil ităţi i etc.

X. Diagnosticul de laborator

Diagnosticul infecţiilor cu Pseudomonas aeruginosa este exclusiv bacteriologie.Etapele diagnosticului sunt următoarele:etape:

1. Prelevarea, transportul şi pregătirea probelor2. Examenul microscopic direct pentru: spută, LCR, lichide de puncţie,

aspirate traheale3. Izolarea - se face prin inoculare directă pe agar-sânge, mediu Mc Conkey

sau alte medi i diferenţiale şi prin îmbogăţire în apă peptonată 1%, când seanticipeazî prelevate cu un număr mic de bacterii sau bulion cu TTC

8

(tripheniltetrazolium chloride 1%), care inhibă microorganismele asociateîn prelevate presupus pluricontaminate

4. Identificarea se face prin:microscopie: bacili Gram negativiaspectul pe agar sânge: ~- hemolitic, colonii S, mai rar R, luciu metalic,miros aromaticaspectul pe medii care susţin producerea de pigment King A (sau King P)pentru piocianină, King B (sau King F) pentru fluoresceinăaspectul pe apă peptonată 1% - văl la suprafaţă, uneori pigmentaspectul pe medii cu TTC 1% - colonii roşu Închis

5. Detectarea unor markeri microbiologiei de interes epidemiologic:serogrup, lizotip, pattern molecuJar etc.

6. Testarea sensibilităţii la antibiotice - permite detectarea unor fenotipuri derezistenţă complexe, deseori cu rezistenţă multiplă la beta-lactamine,aminoglicozide, quinolone etc.

Genul Acinetobacter

1. MinidefinitieII. Incadrare taxonomicaIII. HabitatIV. Implicare in patologia umanaV. Microbiologie - principalele caractere si implicatii in patogeneza si

diagnosticul microbiologieVI. Factori de patogenitateVII. PatogenieVIII. Raspunsul imunIX. Notiuni de epidemiologie si profilaxie a infectiilor nosocomialeX. Diagnosticul de laborator

Cuvinte cheie: cocobacili gram negativi, nefermentativi, oxidază negativi, catalazăpozitivi; infecţii asociate îngrijirilor medicale, infecţii În mediul extraspitalicesc

1. Minidefiniţie

Cocobacili Gram negativi, nefermentativi, nesporulaţi, imobili, strict aerobi,catalază pozitivi, oxidază negativi, pot fi implicaţi În patologia umană ca microorganismeoportuniste. Frecvent implicaţi în infecţii nosocomiale.

II. lncadrare taxonomică

Domeniu: Bacteria;

Phylum: Proteobacteria;

9

Folosesc diferite substanţe organice ca sursă de carbon.

Clasa: Gammaproteobacteria;

Ordin: Pseudomonadales;

Familie: Moraxellaceae

\ Gen: Acinetobacter

Cuprinde peste 30 specii diferenţiate prin metode genetice. Specii mai frecventimplicate sunt: Acinetobacter baumannii, Acinetobacter calcoaceticus, facând parte dincomplexul Acb (Acinetobacter calcoaceticus - A. baumanii)

III. Habitat

Ubiquitar, se găseşte În sol, surse de apă, pe suprafeţe uscate, pe suprafaţaalimentelor, iar În mediul de spital, pe suprafeţe, instrumentar medical etc.

Poate coloniza organisme vii, cu sau fără manifestări de natură infecţioasă,Portajul cutanat sau gastrointestinal este de până la 25% la indivizi sănătoşi.La pacienţi spitalizaţi pentru perioade mai lungi de timp pot coloniza tractul

respirator.

IV. Implicare În patologia umană

Cauzează infecţii la pacienţi care prezintă factori de risc, În special internaţi Înspital, În secţii ca reanimarea şi terapia intensivă, oncologie, arşi etc.

Principalele afecţiuni cauzate de Acinetobacter sunt: pneumonie, meningită,septicemie, infecţii gastrointestinale, infecţii de tract urinar, infecţii de plagă.

În ambulator poate să cauzeze pneumonii şi infecţii de plagă.

V. Microbiologie - principalele caractere, implicaţii În patogeneză şi diagnosticulmicrobiologie

Bacteriile din Genul Acinetobacter, familia Moraxellaceae sunt cocobacili Gramnegativi, cu dimensiuni de 1.0-1.5/1.5-2.5 u, imobili, nesporulaţi, catalază pozitivi,oxidază negativi, strict aerobi .:

Aspectul pe frotiu este de cocobacili rezistenţi la decolorare, În perechi saugrupaţi În grămezi, cu variaţii de dimensiune şi colorabilitate, iar În culturi vechi iauforme cocoide.

Pe mediile de cultură se dezvoltă sub forma coloniilor incolore, galben pal sau gri,uneori mucoide. Unele tulpini pot fi hemolitice pe agar sânge.

10

11

VI. Factori de patogenitate

Deşi nu este considerat un microorganism cu grad înalt de patogenitate,Acinetobacter posedă factori de patogenitate cum sunt: capsula, fimbriile implicate înaderenţă, enzime cu activitate lipolitică, lipopolizaharidul, sideroforii, proteine alemembranei externe cu rol în aderenţă etc.

VII. Patogenie

La pacienţii cu factori de risc (după chirurgie majoră, cu neoplazii, arsuri, vârsteextreme, tratamente îndelungate cu antibiotice, boli pulmonare cronice, tratament cuimunosupresoare, dispozitive protetice endotraheale, gastrice etc.), bacteria provenită dinflora endogenă sau din mediul exterior poate determina manifestări patologice de naturăinfecţioasă, cu exacerbarea virulenţei, creşterea hidrofobicităţii tulpinilor la nivelulsuprafeţelor dispozitivelor etc.

VIII. Răspunsul imun

Imunitatea este de tip umoral şi celular. Mai multe antigene, Între care proteinelemembranei externe sunt implicate în stimularea răspunsului imun, astfel că au fostîncercate vaccinuri preparate din acestea, cu bune rezultate la pacienţii cu risc Înalt.

IX. Noţiuni de epidemiologie şi profilaxie a infecţiilor nosocomiale

Infecţiile apar mai frecvent În sezonul cald, dar pot surveni în oricare perioadă aanului.

Situsurile anatomice de colonizare la indivizi sănătoşi sunt cele cu umiditatecrescută, aşa cum întâlnim la nivelul axilelor, zonei inghinale, spaţiilor interdigitale etc.;cel puţin 25% din populaţia normală este purtătoare, iar în spital procentul purtătoriloreste mai mare, în special la pacienţi care sunt asistaţi ventilator.

X. Diagnosticul de laborator

Prelevatele pot fi insămânţate pe medii simple, ca agarul nutritiv simplu sau agartripticase soya sau pe medii cu compoziţie controlată În nutrienţi şi săruri minerale.

Pentru izolare din prelevate pluricontaminate se utilizează medii cu adaos selectivde antibiotice şi/ sau bilă.

Există specii care cresc la temperaturi mai joase decât 37 OC.Identificarea se face pe baza caracterelor microscopice, de cultură şi metabolice.Identificarea de certitudine se face prin metode moleculare bazate pe hibridizarea

ADN.Pentru tipizarea În scopuri epidemiologice se poate utilize ribotipia, analiza cu

enzime de restricţie etc.

Este necesară testarea sensibilităţii la antibiotice, având În vedere existenţafenotipurilor cu rezistenţă multiplă, mai ale În mediul de spital.

Tratamentul empiric se face cu monoterapie în infecţii urinare, cu asocieri ~-lactamine-aminoglicozide În pneumone şi septicemia şi cu tigeciclină În cazul tulpini lorcu rezistenţă multiplă.

12