Curs IV. Creşterea, multiplicarea şi moartea bacteriilor. Cultivarea bacteriilor

1. Creşterea bacteriilor2. Multiplicarea şi moartea bacteriilor3. Cultivarea bacteriilor:

a. Terminologieb. Medii de cultura: gazde vii şi medii artificialec. Clasificarea mediilor de cultura artificialed. Colon ia izolatăe. Aspectul culturilor pe medii solide şi lichidef. Curba creşterii bacterieneg. Masurarea cresterii bacterieneh. Notiuni privind asigurarea calitatii mediilor bacteriene

1. Creşterea bacteriilor

Creşterea bacteriilor este procesul prin care se formează noi constituenţi celulari,care are ca efect creşterea dimensiunii celulare şi maturizarea acesteia

Sinteza specifica a subunităţilor structurale se face pornind de la constituenţisimpli, pentru obţinerea unor compuşi noi, care sunt ulterior asamblaţi, formând copiifidele ale constituenţilor celulari parentali (vezi Metabolismul celulei bacteriene - CursIII).

Modul în care decurge acest proces depinde de:Informaţia geneticăSubstanţe le din mediu (natura, concentratie)Alţi factori care influenţează exprimarea informaţiei genetice: pH,temperatură, presiune osmotică etc.

Creşterea bacteriană continua până într-un moment critic, respectiv un anumitraport volum/suprafata, caâd crşsterea se întrerupe şi apare multiplicarea.

2. Multiplicarea şi moartea bacteriilor

Majoritatea bacteriilor patogene pentru om se multiplică prin diviziune directă,coordonată de informaţia genetică.

Fig. 1 - Schema multiplicării bacteriene prin diviziune directăCellwallCell membraneElongated nucleoJd

Nueleoid divides;cel! wall and membrane

bagin to formtransverse septum

ţraneveree septumbecomes complete

Daughter cellsseperate

Scindarea celulei mame în două celule fiice are loc prin diviziunea materialuluigenetic, a citoplasmei si componentelor ei, concomitent cu invaginarea membranei şiformarea septului transversal

1

• Cultivarea constă în totalitatea proceselor complexe care au loc ca urmare aînsămânţrii microorganismelor pe medii de cultura

• Mediile de cultură sunt combinaţii de substrate nutritive complexe care potsusţine creşterea bacteriană, asigurând nutrienţii ăi condiţiile fizico-chimicenecesare creşterii şi multiplicării microorganismelor

• Cultura bacteriană = totalitatea microorganismelor acumulate prinmultiplicarea într-un mediu de cultură

• Creşterea bacteriană = creşterea numărului sau masei de celule bacteriene• Diviziunea bacteriană = uzual, fisiune binară; înmugurire, sporulare,

fragmentare• Timp de generaţie = timpul necesar pentru o celulă sau o populaţie

bacteriană pentru a se dublaTimpul de generaţie în faza exponentială şi în condiţii optime de cultivare este

determinat genetic.Pentru E. coli şi majoritatea bacteriilor timpul de generaţie este de 15 - 20 minute.Pentru Mycobacterium tuberculosis acest timp este de 18 - 27 ore.

Bacilii şi unii spirili se divid în plan plan transversal. Unii spirili se divid ăn planlongitudinal.

Cocii se divid în planuri perpendiculare succesive (l,2 sau 3 planuri), iardesprţirea incompletă, prin persistenţa formaţiunilor de legătura provenite din învelisurilecelulare, duce la realizarea unui anumit tip de distribuţie: lanţuri, tetrade, ciorchine destruguri etc.

Există şi alte modalităţi de multiplicare, mai puţin frecvente la bacterii lepatogene: înmugurire în cazul bacteriilor fotosintetice, fragmentare în cazul bacteriilorfilamentoase, segmentare în cazul Streptomyces etc.

Într-o populaţie bacteriană se stabileşte un echilibru între multiplicare şi moartecelulară, dependent de competiţia pentru substrat.Există un "pool" de celule vii în cursulperioade lor de scădere a substanţelor nutritive.

3. Cultivarea bacteriilora. Terminologie

b. Medii de cultura: gazde vii şi medii artificialeÎn funcţie de necesităţile nutritive şi metabolice ale microorganismelor, utilizăm

pentru cultivarea acestora gazde vii sau substraturi artificiale.o Gazde vii (animale de laborator, ouă embrionate, culturi de celule) -

indispensabile pentru:• Virusuri• Rickettsii• Chlamydii

o Medii (substraturi) artificiale:• Majoritatea bacteriilor• Fungi• Unele protozoare

2

Cerinţele pe care trebuie să le îndeplinească mediile artificiale pentru a susţinecreşterea bacteriană sunt urmtoarele:

• Să contină factorii de creştere necesari microorganismului a cărui creşteretrebuie să o sustină

• Să fie sterile• Să aibă pH-ul potrivit scopului pentru care este utilizat (de obicei 7.2)• Să aibă o anumită presiune osmotică• Să aibă umiditatea favorabilă cultivării microorganismelor etc.

Utilizările mediilor de cultură acoperă atât obiective ale microbiologieifundamentale, cât şi ale celei applicative. Dintre acestea enumerăm:

• Păstrarea microorganismelor în culturi şi subculturi• Izolare/numărare (alimente, apă, cosmetice, produse farmaceutice)• Microbiologie clinică/microorganisme patogene şi condiţionat patogene:

o Izolareo Identificare (interes terapeutic/taxonomie, interes epidemiologic)

• TSA (Testarea Sensibilităţii la Antibiotice)• Microbiologia mediului• Producţie şi control al producţiei (antibiotice, enzime, toxine, seruri

terapeutice, vaccinuri etc.; teste de sterilitate, evaluarea activităţii biologice,etc.)

Principalele componente ale mediilor de cultură sunt următoarele:• Derivaţi proteici:

o Infuzii şi extracte - în care se obţine coagularea proteinelor prin încălzireo Peptone, obţinute prin hidroliză din proteine animale sau vegetale (carne,

cazeina, soia, levuri, ficat, malţ, gelatină etc.; standardiza bilehidroliza enzimatică (enzime pancreatice sau gastrice; enzime vegetale) :

conservă conţinutul de aminoacizi şi vitaminehidroliza acidă (HCl, H2S04): distruge vitaminele şi parţial aminoacizii

Având în vedere că o parte din aceste medii pot fi utilizate pentru cultivarea unormicroorganisme în scopul obţinerii de produse administrate la om, Decizia EU97/534/EC a stabilit facptul că materialele brute provenind din ţările cu encefalopatiespongiformă bovină sunt eliminate.

• Carbohidraţii sunt introduşi În mediile de cultură ca substrate fermentabile- glucoza, lactoza, zaharoza, manitolul etc .. Pentru diferenţierea bacteriilor în funcţie despectrul de activitatea asupra zaharurilor pe mediile de cultură se utilizează indicatorii depH

Ca indicatori de pH se utilizează: roşu fenol, albastru bromtimol etc.,Mai pot fi utilizaţi indicatori redox, necesari stabilirii capacităţii de susţinere a

creşterii bacteriilor anaerobe, indicatori pentru detectarea H2S (săruri de fier) etc.• Săruri: sursa de microelemente, tamponare (fosfaţi), osmolaritate (NaCl)

3

• Agenţi selectivi:o NaCI: inhibă bacterii le Gram negative în mediul hiperclorurat tip

Chapman şi favorizează stafilocociio Bila sau săruri biliare (ex. Taurocolat de Na): inhibă bacteriile Gram

pozitive ţi favorizează patogenii intestinalio Coloranţi: crystal violet, verde malahit etc.

• Agenţi de solidificare: cel mai utilizat este agarul. introducerea lui înbacteriologie este legat de numele Dr. Walter Hesse şi soţiei sale, Angelina FanyHesse

Povestea soţilor Hesse:Fanny Angelina Eilshemius - născută în 1850 în New York, ca fiică a unui

emigrant olandez bogat; în tinereţe a călătorit în Europa, unde l-a intâlnit pe tânarulmedic german Walther Hesse, cu care s-a căsătorit în 1874. Ca medic de teren, W.Hesse a ajuns în situaţia să fie interesat de noua ştiintă care tocmai lua naştere,microbiologia şi în 1881 ajunge în laboratorul lui R. Koch, unde a început să studiezemetabolismul şi aspecte de sănătate publică pentru multe bacterii, asistat de soţia sa,Lina, ca devotat tehnician de laborator, desenator, tehnoredactor al lucrărilor sale .•:. Problema: într-o var fierbinte, Walther incerca să facă numărători de bacterii din

aer pe plăci cu GELATINĂ, CARE SE TOPEA LA CĂLDURĂ. Atunci, el a avutideea s-o intrebe pe Lina: "De ce jeleurile şi budincile tale răâan solide cand ecald afaăa?"

.:. Explicaţia: Lina utiliza AGAR-AGAR, un polizaharid complex extras din algemarine. Acest ingredient era utilizat de sute de ani ca agent de gelificare in Asia;Lina învaşase asta de la o vecină din New-York, olandeză emigrată din insuleleJava .

•:. Din bucatarie in laboratorul de microbiologie - Calităţile agar-agarului:(a) netoxic pentru majoritatea microorganismelor.(b) se topeşte doar la 1000C, dar solidifică la aprox. 450C (temperatura la caremajoritatea bacteriilor supravieţuiesc).

Lina. Hesse Walther Hesse

4

Caracterele mediilor de uz general

(c) netoxic pentru alte forme de viată.(d) stabil la temperatura de sterilizare(e) inert fiziologic, deoarece foarte putine bacterii poseda enzime care-l pot digera.Lina si Walther au discutat posibilitatea utilizarii in laborator a agarului, idee care s-adovedit excelenta:

• Factori de imbogătire: sânge, Factor X, V sau XV (hemofili), Hb, albumină, ou,ser, soluţii chimic definite etc.

• Substrate enzimatice analoge unor substrate metabolice - utilizate pentrudiferenţierea rapidă a unor bacterii (medii cromogene)

c. Clasificarea mediilor artificiale• Dupa starea fizică: lichide, semisolide, solide

• După compoziţia chimică: complexe; chimic definite

• Dupa utilizare:o De transporto De izolareo De imbogăţire,o De identificare - pentru testarea unor caracteristici enzimatice (unitest,

multitest),

• Conţin ingrediente care convin majoritătii microorganismelor• Nu conţin ingredientele necesare creşterii microorganismelor prototrofe

(fastidioase, pretenţioase)• Nu încurajează selectarea unor anumite bacterii

Medii speciale

• Mediul electiv - ingredientele convin cel mai bine unei anumite bacterii(ex. Mediul Loeffler cu ser de bou pentru bacilul difteric)

• Mediul selectiv - inhibă dezvoltarea altor bacterii decât a celor a cărorizolare se urmăreşte (ex. mediu cu telurit de K pentru difteric, medii cubilă pentru anumiţi bacili Gram negativi)

• Mediul de îmbogăţire - favorizează înmulţirea bacteriilor patogene şiinhibă dezvoltarea florei de asociaţie); functionează concomitent ca mediuelectiv şi mediu selectiv: ex. Mediul hiperclorurat pentru stafilococ)

• Mediul diferenţial: conţine un anumit substrat care poate fi sau numetabolizat (ex. Mc Conkey pentru enterobacterii)

5

Fig. 2 - E. coli (lactoză pozitiv) si Salmon elia (lactoză negativ) pe mediul selectivşi diferenţial Mc Conkey

• Medii şi procedee de cultivare pentru anaerobi şi microaerofili

Mediu lichid cu thioglicolat - conţine un substrat nutritiv, thioglicolat(pentru fixarea 02), agar pentru realizarea unei consistenţe semisolide, care săscadă indicele de difuzie a 02 şi un indicaor redox (resazurina sau albastrul demetilen)

Cultivarea în exicator cu lumânare - se face pentru realizareamicroaerofiliei, pentru satisfacerea necesităţii unor bacterii de a beneficia deun conţinut de 02 mai mic decât cel atmosferic şi de un conţinut crescut deC02 (capnofilie)

Jar, Gas-Pack: pentru anaerobi si facultativ anaerobi

Fig. 3 - Aspectul creşterii pe medii lichide cu agenţi de oxidoreducere, înfuncţie de comportamentul bacteriei faţă de oxigen

Obligate Obligate Micro· Facultativ.aerobc aneercbc aercphile anaerobe

6

lichide

d. Colonia izolată

• Se obţine pe medii solide• Reprezintă totalitatea bacteriilor rezultate din multiplicarea

unei singure celule bacteriene (UFC = Unitate Formatoare deColonii)

• Reprezintă o clonă bacteriană sau o tulpină bacteriană• Se obţine prin tehnica dispersiei cu ansa sau cu bagheta în L pe

medii solide

e. Aspectul culturilor pe medii solide si lichidePe medii solide:

• Colonia S (Smooth) are suprafata neteda, bombata, neteda,adesea lucioasa, margini circulare bine trasate

• Colon ia R (Rough) = plata, suprafata cu rugozitati, marginicrenelate; nu pastreaza capsula si de obicei nu pastreazavirulenta (exceptie: B. anthracis, Mycobacterium tuberculosis)

• Colon ia M (Mucoid) = mare, stralucitoare, mucoasa, uneorifenomen de curgere; la speciile cu capsula bine reprezentata(ex. Klebsiella pneumoniae, Str. pneumoniae)

Fig. 4. Colonii S, M, hemolitice pe medii solide; creştere S, R pe medii

7

1,0

, - - - - - - - - - - - - ~- - - - - i'urbidiii - - - - - 0]5 fi-Viablecount (opticaldensity) g

. 0.50 Q)"O

<ilu

0.25 liO

Pe medii lichide:• Varianta S (Smooth) = tulbură omogen mediul• Varianta R (Rough) = tulburare mai putin omogenă; pot lăsa mediul limpede şi

lasă flocoane care se depun sau formează văI la suprafaţa mediului (ex. B.difteric)

o Obs.: Bacteriile si fungii facultativ anaerobi se dezvoltă în toată masa delichid, tulburându-l; bacteriile strict aerobe se dezvoltă preponderent lasuprafaţa mediului

f. Curba creşterii bacteriene

Fig. 5. Curba creşterii bacteriene

• Faza de lag este o fază în care numărul bacteriilor stationează sau scade. Este operioadă de adaptare şi durează aproximativ două ore.

• Faza de multiplicare logaritmică (exponentială) este o fază adecvată studieriibacteriei si recoltării pentru prepararea vaccinurilor şi durează aproximativ două -trei ore

• Faza stationară este o fază de multiplicare aritmetică. În această fază numărulcelulelor care mor este egal cu numărul celulelor nou apărute. Începe apariţiaspori lor. Este o fază adecvată identificării bacteriilor şi durează două-trei zile

• Faza de declin este o fază în care apare sărăcirea substratului, apar compuţi toxici;sporogeneza la speciile sporogene. Durează două-trei luni

Se pot obţine culturi continue prin împrospătarea mediului de cultură.Aceasta se poate realiza prin utilizarea unor dispozitive, cum sunt:

o Chemo statul - realizează înlocuirea mediului la intervale fixe - celulelecresc in regim de semiînfometare pentru un anumit metabolit

8

-,:,'~~~:

o Turbidostat - scurgerea mediului este reglată fotoelectric, prin măsurareaturbidităţii culturii; se adaugă mediu când turbiditatea depăşeşte un anumitnivel

g. Măsurarea creşterii bacteriene - modalităţi de realizare

• Numărătoare directă a celulelor bacteriene se poate realiza cu ajutorul camerelorde numărare

Fig. 6. Camere de numărare

• Calculul biomasei - se realizează prin cântărirea masei uscate a celulelor şiraportarea ei la unitatea de volum de cultură

• Numărarea celulelor viabile - se realizează prin însămânţarea unor diluţii serialezecimale pe medii de cultură solide, urmată de numărarea coloniilor care sedezvoltă pe mediile de cultură solide. Rezultatul numărătorii se exprimă înUFC/ml (Unităţi Formatoare de Colonii pe mi)

9

tjmL j)mLFig. 7 - Metoda diluţiilor

50,000bactcriafmL

(apuroxlmatenumber)

9 rnL water 9 mLwatcr 9 mt.warcr 9mLwater

1:10 1:100 1:1000 1:10,000ditutlon dilution dllulion dillftion

5,000 500 50 5baclcria/mL bacterla.mt, bacteriaJmL becterlarml,

• Măsurare turbidităţii culturii bacteriene

Intensitatea fascicul ului luminos transmis prin recipientul cu cultură bacterianăeste convertită în unitîţi de densitate optică (OD - Spectrofotometrie) sau în unitaţi deabsorbanţă (Unitaţi Klett - Fotometrie) .

h. Notiuni privind asigurarea calitatii mediilor de culturaCerinţe privind cultivarea bacteriilor

• Trasabilitatea mediilor: intrare, data expirare, regula first in /first out• Condiţii de stocare corespunzătoare• Dacă mediile se prepară din medii pulbere în laborator, trebuie asigurat controlul

apei (pH, conductivitate)• Controlul sterilizării: precauţii de temperatură şi durată; control fizic, chimic şi

biologic al sterilizării• Repartizarea mediilor: se poate face manual, semiautomat, automat

Surse de eroare

• Condiţiile de stocare a mediului deshidratat• Cantârirea pulberii

10

• Măsurarea apei şi/sau calitatea apei• Sticlărie murdară• Dizolvare incompletă• Supraîncalzire• pH incorect• Aditivi necorespunzători• Control de calitate• Control pH (nu pe mediu fierbinte)• Control sterilitate pentru 5% din numărul plăcilor dacă loturile sunt < 100 unităţi,

dar nu mai puţin de 2 unităţi; 10 unităţi din loturi > 100 unităţi)• Examenul macroscopic pentru culoare, limpezime• Capacitatea de susţinere a creşterii cu tulpini de referintă• Stabilitate în condiţiile de stocaj

11