Micro Biolog i e

CUPRINS

MODULUL I - MICROBIOLOGIE GENERAL| 2

1. Obiectul de studiul al microbiologiei 2

2. Caractere generale [i pozi]ia microorganismelor `n lumea vie 7

2.1. Prionii 8

2.2. Virusurile 9

Test de autoevaluare 14

2.3. Bacteriile 15


2.4. Cyanobacteriile (algele albastre-verzi) 27

2.5. Protozoarele 27

2.6. Ciupercile 28


Rezumat modul I 31

MODULUL II - MICROBIOLOGIA SOLULUI 32

1. Solul ca mediu de via]\ pentru microorganisme 32

2. Circuitul azotului 33

3. Influen]a factorilor ecologici asupra microorganismelor 39

4. Interrela]iile dintre microorganismele din sol 42

5. Interrela]iile dintre plantele superioare

[i microorganismele din sol 45


Rezumat modul II 49

MODULUL III - MICROBIOLOGIA FERMENTA}IILOR 50

1. Fermenta]ia alcoolic\ 51

2. Utilizarea microorganismelor `n vinifica]ie 52


Rezumat modul III 59

MODULUL IV - LUCR|RI PRACTICE 60

1. Examenul microscopic al microorganismelor 60

2. Sterilizarea 63

3. Tehnica cultiv\rii microorganismelor 68

Teme de verificare 71

Bibliografie 72

2

1. OBIECTUL DE STUDIU AL MICROBIOLOGIEI Microbiologia este [tiin]a care se ocup\ cu studiul microorganismelor. Microorganismele constituie un grup foarte mare de organisme, diferite ca natur\, form\ [i activitate biologic\, cu o organizare unicelular\ [i o structur\ intern\ relativ simpl\, având drept `ns\ caractere comune dimensiunile microscopice care le fac invizibile cu ochiul liber. Din grupul microorganismelor fac parte bacteriile, ciupercile microscopice (mucegaiurile [i levurile), algele unicelulare [i protozoarele. La lumea microorganismelor au fost al\turate [i virusurile care sunt entit\]i infec]ioase alc\tuite din componentele chimice esen]iale ale organismelor vii, proteine [i acizi nucleici cu o organizare acelular\, care le face inapte de a se multiplica `n afara unei celule vii, fapt ce le oblig\ la un parazitism intracelular absolut. De[i Microbiologia este o [tiin]\ relativ tân\r\, datorit\ domeniului de studiu foarte vast, `n cadrul ei s-au diferen]iat o serie de discipline microbiologice independente. Acestea pot fi grupate dup\ mai multe criterii:

A. Dup\ grupul taxanomic studiat: 1. Virologia 2. Bacteriologia 3. Micologia 4. Algologia (ficologia) 5. Protozoologia

B. Dup\ activitatea microorganismelor `n raport cu mediul `n care tr\iesc:

1. Microbiologia acvatic\ 2. Microbiologia solului

C. Dup\ natura problemelor studiate: 1. Fiziologia microorganismelor 2. Ecologia microorganismelor 3. Genetica microorganismelor

D. Dup\ aplica]iile practice: 1. Microbiologia medical\ - uman\ [i veterinar\ 2. Imunologia 3. Microbiologia industrial\ 4. Microbiologia agricol\ 5. Microbiologia insectelor 6. Microbiologia geologic\ 7. Microbiologia cosmic\ 8. Patologia vegetal\ (Fitopatologia)

MODULUL I

MICROBIOLOGIE GENERAL|

3

Istoricul Microbiologiei Microbiologia este o [tiin]a relativ tân\r\, datorit\ faptului c\ din

lipsa mijloacelor de investiga]ie, oamenii de [tiin]\ s-au ocupat `n primul rând de vie]uitoarele vizibile. Existen]a microorganismelor ca agen]i etiologici ai unor boli, era `ns\ b\nuit\ `nc\ din antichitate.

Hipocrat (400 `.e.n.) `ntemeietorul medicinei, cosidera doi factori responsabili de aceste boli: unul intrisec, reprezentat de contribu]ia bolnavului [i altul extrinsec, constând dintr-o alterare necunoscut\ a aerului care devine nociv.

Aceast\ prim\ ipotez\ asupra etiologiei bolilor infec]ioase a persistat mult\ vreme sub forma teoriei miasmelor (gr.miasma = emana]ie putred\, murd\rie).

Varon (100 `.e.n.), considera c\ alterarea aerului (gr. malaria = aer r\u) este determinat\ de animale foarte mici, invizibile care p\trund `n organism prin gur\ [i prin n\ri.

Fracastor (1488-1553) intuie[te foarte corect una dintre caracteristicile esen]iale ale bolilor produse de microorganisme [i anume contagiozitatea lor. El arat\ c\ "infec]ia este aceea[i pentru cel care a primit-o [i pentru cel care a dat-o" [i c\ ea este produs\ de "particule mici [i imperceptibile" care trec de la un organism bolnav la altul s\n\tos.

Antony Leeuwenhoek (1632-1723) reu[e[te descoperirea microorganismelor folosind ca microscop un sistem de lentile biconvexe de construc]ie proprie, cu o putere de m\rire de 40-275 x. El observ\ protozoare, alge, nematozi, levuri [i bacterii pe care le descrie [i deseneaz\ `n lucrarea sa "Arcana naturae ope microscopiorum detecta" (Tainele naturii descoperite cu ajutorul microscoapelor (1675). De[i, descoperirile lui Leeuwenhoek au stârnit admira]ia [i interesul oamenilor de [tiin]\, studiul microorganismelor a r\mas `n continuare empiric, constituind doar o preocupare a amatorilor de curiozit\]i ale naturii. ~n felul acesta se acumuleaz\ numai date disparate cu privire la forma, structura, m\rimea [i distribu]ia `n natur\ a acestor microorganisme.

K. Linnaeus, celebru botanist, `n opera sa "Systema naturae" (1735) `ncearc\ o sistematizare a vie]uitoarelor cunoscute, reunind toate microorganismele `ntr-un grup denumit semnificativ "Chaos".

Terehovski, folosind pentru prima dat\ metode experimentale, public\ `n anul 1775 lucrarea " De Chao infusorii Linnaei" `n care demonstreaz\ c\ fiin]ele foarte mici, observate `n diferite infuzii bogate `n substan]e organice, cresc, se divid [i se mi[c\ datorit\ unor for]e interne proprii, ajungând la concluzia c\ aceste organisme sunt adev\rate animale `n miniatur\.

Louis Pasteur (1822-1895) savant francez, prin lucr\rile sale stabile[te principiile care stau [i azi la baza acestei [tiin]e.

Primele cercet\ri ale lui Pasteur au fost legate de fenomenul asimetriei moleculare. La acidul tartric racemic, compus inactiv pentru lumina polarizat\, demonstreaz\ c\ este un amestec echimolecular de acid dextrogir [i acid levogir, ale c\ror cristale sunt de forme asimetrice [i enantiomorfe. De asemeni, a observat c\ dac\ `n amestecul racemic, inactiv din punct de vedere optic se dezvolt\ un mucegai (Penicillium glaucum) solu]ia devine optic activ\, deviind de ast\ dat\ spre stânga planul luminii polarizate. Mucegaiul degradeaz\ izomerul dextrogir l\sându-l intact pe cel levogir, care astfel poate fi izolat `n stare pur\. Aceast\ descoperire pe lâng\ faptul c\ furniza un procedeu simplu de separare a izomerilor optici a demonstrat [i interven]ia unei caracteristici fizice, ca disimetria molecular\ `n fenomenele chimice ale vie]ii dar, mai ales a atras aten]ia lui Pasteur asupra unui fenomen spre care se va

4

`ndrepta `n continuare curiozitatea lui de cercet\tor: microorganismele produc transform\ri ale substan]elor organice printr-o activitate selectiv\ foarte specific\.

Cercet\rile lui Pasteur asupra fermenta]iei vinului [i berii l-au condus la urm\toarele concluzii fundamentale:

1. fermenta]iile sunt procese biologice determinate de ac]iunea unor microorganisme anaerobe, deci fermenta]ia este via]\ f\r\ aer;

2. fiecare fermenta]ie este produs\ de un anumit tip de microorganism care este specific `n sensul c\ determin\ o anumit\ transformare a mediului pe care cre[te;

3. dezvoltarea unui microorganism str\in `n mediul unde ac]ioneaz\ un microorganism cu ac]iune fermentativ\ specific\, deviaz\ cursul normal al fermenta]iei `n dauna calit\]ii (prin apari]ia compu[ilor nedori]i), [i a randamentului ei `n produs util determinând o a[a numit\ "boal\" a fermenta]iei;

4. microorganismele str\ine care produc bolile vinului [i ale berii sunt consecin]a contamin\rilor din aer, de pe vasele sau din ingredientele folosite `n produc]ie, iar multiplicarea lor poate fi prevenit\ prin `nc\lzire, procedeu utilizat sub denumirea de pasteurizare.

Pân\ la Pasteur ideea particip\rii microorganismelor la determinarea unor boli era respins\, ca nefiind probat\ pe cale experimental\. Pasteur extinde no]iunea de specificitate din domeniul fermenta]iilor `n acela al patologiei omului [i animalelor, `n sensul c\, orice boal\ infec]ioas\ este rezultatul activit\]ii vitale a unui anumit microorganism specific, care se dezvolt\ ca parazit `n organismul animal respectiv. Ulterior, cercet\rile acestuia au demonstrat principiul vaccin\rii [i stabilirea bazelor [tiin]ifice ale prepar\rii vaccinului, contribuind `n acela[i timp la descoperirea fenomenului de imunitate.

Studiind boala "holera g\inilor" Pasteur observ\ c\ agentul ei patogen `[i pierde complet, prin `nvechirea culturii, capacitatea sa specific\ de a produce aceast\ boal\, adic\ devine avirulent. Inoculat\ la p\s\ri s\n\toase, cultura avirulent\, le confer\ `ns\ rezisten]a fa]\ de holer\, `n sensul c\ ele nu se mai `mboln\vesc nici dac\ sunt infectate cu o cultur\ proasp\t\, virulent\, p\s\rile "vaccinate" devenind "imune".

Pe acela[i principiu Pasteur a mai preparat [i utilizat cu succes "vaccinul antic\rbunos" (1881), apoi vaccinul antirabic (1885).

L. Pasteur rezolv\ [i problema genera]iei spontane. Ignorarea unor principii esen]iale, care mai târziu au stat la baza microbiologiei experimentale, `n ceea ce prive[te sterilizarea [i asepsia, au f\cut posibil\ concluzia fals\ c\ microorganismele pot lua na[tere prin organizarea spontan\ a substan]elor organice din produsele supuse fermenta]iei sau putrefac]iei. Folosind baloane speciale cu "gât de leb\d\", Pasteur demonstreaz\ c\ un mediu de cultur\ sterilizat, `n spe]\ bulionul de carne, poate r\mâne steril timp `ndelungat, dac\ se evit\ contaminarea lui cu germeni din aer. Dac\ prin `nclinarea unui asemenea balon, mediul "spal\" por]iunile incurbate ale gâtului r\mas descoperit, por]iunile `n care s-au depus bacteriile din aer, bulionul se infecteaz\. Faptul c\ `n baloanele cu mediu steril `nchise ermetic nu apar niciodat\ microorganisme, `n timp ce acela[i mediu se infecteaz\ dac\ este l\sat `n contact cu aerul, dovede[te c\ microorganismele nu iau na[tere spontan din materia organic\ inanimat\ ci numai se `nmul]esc `n ea, pornind de la organisme similare provenite din mediul `nconjur\tor.

5

L. Pasteur a adoptat pentru denumirea organismelor microscopice termenul de "microb" creat de medicul francez Sedillot, iar noua [tiin]\ care studiaz\ microbii a r\mas cu numele de Microbiologie.

Robert Koch (1843-1910) a adus `n dezvoltarea microbiologiei ca [tiin]\, contribu]ii de ordin tehnic [i teoretic deosebit de valoroase, `ntre care conceptul de "cultur\ pur\", respectiv de organism cultivat `ntr-un mediu lipsit de alte organisme. Realizarea culturilor pure este facilitat\ prin introducerea `n tehnica microbiologiei de c\tre Koch, a mediilor de cultur\ solidificate (cu gelatin\ sau agar).

Pe lâng\ faptul c\ a descoperit mai multe specii de bacterii patogene, `ntre care bacilul tuberculozei (Mycobacterium tuberculosis) [i vibrionul holerei, Koch demonstreaz\ f\r\ echivoc c\ bacteria carbonoas\ (Bacilus anthracis) este agentul patogen al bolii denumit\ antrax sau c\rbune, pe care `l cultiv\ "in vitro" `n ser sanguin, studiind formarea de spori termorezisten]i, alternan]a de sporulare [i germinare, precum [i faptul c\ infec]ia natural\ a animalelor provine din sol prin iarba contaminat\.

Pe baza acestor cercet\ri, R. Koch stabile[te criteriile indispensabile pentru ca un microorganism izolat dintr-un organism afectat de o anumit\ boal\ s\ poat\ fi considerat `n mod justificat ca agentul cauzal al bolii respective. Aceste criterii cunoscute sub numele de postulatele lui Koch, sunt urm\toarele:

1. microorganismul incriminat s\ poat\ fi pus `ntotdeauna `n eviden]\ `n toate cazurile bolii respective, iar distribu]ia lui s\ corespund\ leziunilor caracteristice bolii;

2. s\ poat\ fi utilizat `n cultur\ pur\, pe medii artificiale; 3. dup\ ce este cultivat "in vitro" mai multe genera]ii s\ reproduc\

boala [i leziunile specifice la animalele sensibile de la care s\ poat\ fi reizolat.

Postulatele lui Koch, au reprezentat [i reprezint\ `nc\ un principiu eficace de lucru, a c\rui respectare previne interpret\rile eronate, `n materie de diagnostic bacteriologic sau de identificare a unor agen]i infec]io[i.

Ilia Metchnikoff (1845-1916), biolog rus, studiind digestia intracelular\ la echinoderme, demonstreaz\ capacitatea anumitor celule de a capta [i `ngloba diferite particule cu care vin `n contact [i emite ipoteza c\ celulele cu func]ii asem\n\toare, denumite de el "fagocite" ar putea exista [i `n organismul altor animale.

Ulterior (1884), studiind infec]ia crustaceului Daphnia magna cu ciuperca Monospora (Metschnikowia) bicuspidata, observ\ c\ sporii aciculari ai levurii p\trund odat\ cu hrana `n tubul digestiv al dafniei de unde, str\pungând peretele acestuia, trec `n cavitatea general\ unde sunt ataca]i de celule mobile. Când infec]ia este moderat\, amoebocitele `nglobeaz\ [i diger\ to]i sporii ciupercii [i astfel crustaceul supravie]uie[te. Când `ns\ infec]ia este masiv\, sporii r\ma[i nefagocita]i germineaz\ [i dau na[tere formei vegetative a ciupercii, care prin multiplicare, invadeaz\ tot organismul dafniei, determinându-i moartea.

Metchnikoff extinde rezultatele acestor observa]ii la animalele superioare [i la om, demonstrând prezen]a [i importan]a celulelor cu propriet\]i fagocitare, `n reac]iile de ap\rare ale organismului fa]\ de bacteriile patogene, stabilind astfel bazele imunit\]ii celulare.

Ivanovski (1864-1920) demonstreaz\ c\ mozaicul tutunului este produs de un agent patogen invizibil la microscop, care traverseaz\ filtrele bacteriene [i poate fi transmis de la o plant\ bolnav\ la una s\n\toas\ prin intermediul filtratului acelular al trituratului de frunze, cu leziuni.

6

Beijerinck (1851-1953) confirm\ `n 1898 filtrabilitatea agentului patogen [i intuie[te natura deosebit\ a agentului patogen pe care `l considera ca agent contagios viu (contagium vivum fluidum). Aceast\ intui]ie a f\cut din Beijerinck adev\ratul intemeietor al virologiei ca [tiin]\.

Winogradski (1856-1953), lucrând la Institutul Pasteur din Paris, a descris procesul de asimilare la organismele chimiosintetizante [i fenomenul de fixare a azotului atmosferic de c\tre microorganisme. ~n acela[i timp el a elaborat metode speciale pentru cercetarea activit\]ii microorganismelor din sol, fiind considerat intemeieorul microbiologiei solului.

Alexander Fleming (1881-1955), observ\ `n anul 1929 c\ unele culturi de Penicillium, elaboreaz\ o substan]\ cu propriet\]i microbiene specifice – penicilina. Acest prim antibiotic a fost mai târziu purificat de Florey [i Chain (1940).

Prin lucr\rile sale Fleming deschide era antibioticelor, de o importan]\ excep]ional\ `n medicin\ [i biologie. {coala româneasc\ de Microbiologie Victor Babe[ (1854-1926), fondatorul [colii române[ti de microbiologie a desf\[urat o prodigioas\ activitate de cercet\tor studiind numeroase boli ale omului printre care lepra, tuberculoza, holera, febra tifoid\ [i mai ales turbarea.

~n colaborare cu Cornil, el este autorul primei lucr\ri de sintez\ `n bacteriologie [i anatomie patologic\ din lume, ap\rut\ `n 1885. “Bacteriile [i rolul lor `n etiologia, anatomia [i histologia patologic\ a bolilor infec]ioase”.

A studiat, de asemenea asocia]iile microbiene, fiind primul cercet\tor care dup\ Pasteur, [i-a dat seama de importan]a terapeutic\ a antagonismului microbian. Ioan Cantacuzino (1863-1934) este creatorul Institutului de Microbiologie, care `I poart\ numele [i al [colii contemporane de microbiologie din ]ara noastr\. Cele mai importante lucr\ri sunt referitoare la aparatele [i func]iile fagocitare `n regnul animal [i problema imunit\]ii la nevertebrate. Cantacuzino a studiat de asemenea, diferite boli ca holera, febra tifoid\, scarlatina, tuberculoza, creind [i organizând condi]iile produc]iei de seruri [i vaccinuri `n ]ara noastr\. Constantin Ionescu-Mih\ie[ti (1883-1962), a adus contribu]ii [tiin]ifice valoroase `n domeniul virologiei, imunologiei [i microbiologiei generale. Dumitru Combiescu (1887-1961) a desf\[urat o ampl\ activitate `n domeniul rickettsiozelor [i zoonazelor. Mihai Ciuc\ (1883-1969), este autorul unor lucr\ri deosebit de importante `n domeniul bacteriofagilor, paludismului, salmonelozelor, difteriei. {tefan Nicolau (1896-1967) este creatorul [colii române[ti de virologie [I fondatorul institutului respectiv. A publicat numeroase lucr\ri originale `n domeniul herpesului, turb\rii, febrei aftoase, febrei galbene, hepatitelor virale. Traian S\vulescu (1889-1963) este creatorul [i `ndrum\torul [colii române[ti de fitopatologie. Este autorul unor lucr\ri de sintez\ ca: Monografia uredinalelor, Monografia ustilaginalelor, [i a unor lucr\ri originale `n fitopatologie [i `n domeniul imunit\]ii plantelor fa]\ de bolile bacteriene

7

2. CARACTERE GENERALE {I POZI}IA MICROORGANISMELOR ~N LUMEA VIE

Microorganismele, cu excep]ia celor cu structur\ acelular\ (virusurile) au ca unitate elementar\ de baz\ celula. Celula la microorganisme, asem\n\toare `n general cu celula vegetal\ [i animal\, prezint\ unele particularit\]i `n func]ie de grupul de microorganisme considerat. Aceste particularit\]i structurale [i func]ionale au determinat `mp\r]irea microorganismelor `n dou\ grupe (Eduard Chatton, 1932 [i Stanier, 1970). ~ntre microorganismele procariote [i eucariote exist\ diferen]e esen]iale structurale, func]ionale [i de compozi]ie.

Diferen]ele dintre celula procariot\ [i celula ecucariot\

Procariote Eucariote Caracterul� Bacterii

Cyanobacterii� Alge, Fungi, Protozoare,

Plante, Animale Nucleul f\r\ membran\ cu membran\ Compozi]ia chimic\ a membranei citoplasmatice

f\r\ steroli (cu excep]ia micoplasmelor)

con]ine steroli

Sistemul respirator `n membran\ citoplasmatic\ mitocondrii Ribozomii 70 S 80 S Curen]ii citoplasmatici absen]i prezen]i Reticulul endoplasmatic absent prezent Tipul de diviziune direct\ (sciziparitatea) Mitoz\

Pozi]ia microorganismelor `n lumea vie Dup\ acumularea a numeroase cuno[tin]e asupra microorganismelor a

fost necesar\ introducerea acestora `ntr-un grup taxonomic. Ini]ial microorganismele au fost incluse `n regnul Plantae, dar pe parcursul timpului datorit\ unor descoperiri noi au ap\rut alte sisteme de clasificare.

A. Sistemul tradi]ional: 1. Regnul Plantae; 2. Regnul Animalia.

B. Sistemul lui Hogg [i Haeckel: 1. Regnul Monera; 2. Regnul Plantae; 3. Regnul Animalia.

C. Sistemul lui Copeland: 1. Regnul Procaryotae (Monera); 2. Regnul Protista; 3. Regnul Plantae; 4. Regnul Animalia.

D. Sistemul lui Whittaker: 1. Regnul Procaryotae (bacterii, cianobacterii = alge albastre-verzi); 2. Regnul Protista (protozoare, diatomee); 3. Regnul Fungi (ciuperci); 4. Regnul Plantae (alge verzi, brune, ro[ii, brofite, traheofite); 5. Regnul Animalia (animale multicelulare).

Ast\zi, majoritatea speciali[tilor din domeniul microbiologiei au acceptat sistemul de clasificare elaborat de Whittaeker `n anul 1969 [i care corespunde necesit\]ilor actuale.

8

Din punct de vedere taxonomic subdiviziunile regnului sunt: `ncreng\tura, sub`ncreng\tura, clasa, ordinul, familia, genul, specia. Unitatea de lucru efectiv\ este specia la care denumirea este `n sistemul binominal, numele organismului fiind derivat din latin\ sau greac\. ~n sistemele de clasificare prezentate anterior sunt cuprinse numai organismele care au ca unitate de baz\, celula, eucariot\ sau procariot\, nefiind introduse entit\]ile infec]ioase cum sunt virusurile sau prionii [i care au fost "al\turate" acestor sisteme de clasificare. 2.1. PRIONII

Bolile produse de prioni sunt cunoscute la om [i animale. Prima semnalare a unei boli de natur\ prionic\ a fost f\cut\ `n Anglia `n anul 1732 la ovine. Ast\zi sunt cunoscute ca boli certe, produse de prioni, urm\toarele: - la animale:

1. encefalopatia spongiform\ la ovine, denumit\ popular scrapie (engl.); tramblanta (fr.). ~n România mai este utilizat impropriu termenul de "c\piala" oilor, dar aceasta este o boal\ bine cunoscut\ [i este produs\ de un parazit animal. Medicii veterinari aviza]i folosesc termenul francez de tramblanta oilor. 2. encefalopatia spongiform\ bovin\; 3. encefalopatia spongiform\ a felinelor; 4. encefalopatia spongiform\ a nurcilor; 5. encefalopatia spongiform\ a hamsterilor. - la om:

1. Boala "Kurru". Aceasta este prima semnalat\ [i cel mai bine studiat\. A fost depistat\ la un trib local `n Papua - Noua Guinee. Dup\ interzicerea consumului de carne, `n stare proasp\t\, aceast\ boal\ a fost eradicat\. 2. Boala Creutsfeldt-Jacob. 3. Boala Alzheimer. Agentul infec]ios Ast\zi se consider\ c\ agentul infec]ios este o molecul\ proteic\ cu greutatea molecular\ de 27 kilodaltoni, alc\tuit\ dintr-un lan] de 240 de aminoacizi [i care prezint\ o configura]ie spa]ial\ asem\n\toare unui metru de tâmpl\rie par]ial destins. Aceast\ protein\ a fost izolat\ din creierul tuturor cazurilor bolnave studiate. Surpriza a sosit `n momentul studierii `n paralel (la oi) a creierului la animale s\n\toase [i care prezint\ o protein\ celular\ similar\. Lan]ul de aminoacizi este identic cu excep]ia unui singur aminoacid (schimbat). Proteina celular\ normal\ prezint\ o configura]ie spa]ial\ asem\n\toare unui resort. Speciali[tii din biochimie consider\ c\ prin schimbarea unui singur aminoacid din lan] nu se poate modifica configura]ia spa]ial\. ~n acela[i timp proteina infec]ioas\ rezist\ la atacul proteazelor celulare. Se consider\ c\ procesul infec]ios se desf\[oar\ astfel: celula prepar\ proteina celular\ normal\ care se acumuleaz\ `n lizozomi, ace[tia o transport\ la exteriorul celulei [i `n momentul `n care aceast\ protein\ p\trunde din nou `n celul\ este degradat\ de proteaze. ~n cazul proteinei infec]ioase aceasta se acumuleaz\ `n lizozomi `n mod continuu pân\ când ace[tia "crap\". Enzimele din interiorul lor degradeaz\ componentele celulare [i `n final `ntreaga celul\ nervoas\. ~n locul acesteia r\mâne un orificiu. Din acest motiv, dup\ un timp creierul atacat arat\ ca un

9

burete (cu numeroase orificii). ~n stadiul final al bolii, creierul degenereaz\ complet, având dimensiunea unei nuci. Studiile cele mai ample sunt efectuate la animale, la om ele fiind extrem de pu]ine, deoarece boala poate fi studiat\ numai dup\ moartea individului. 2.2. VIRUSURILE Virusurile reprezint\ o categorie specific\ de agen]i infec]io[i, structural [i fiziologic fundamental diferi]i de oricare dintre microorganismele cunoscute (Zarnea G., 1983). Morfologia virusurilor Din punct de vedere morfologic virusurile pot apar]ine urm\toarelor tipuri principale: form\ cilindric\-alungit\ sau de bastona[ (virusul mozaicului tutunului); form\ sferic\ (izometric\), sferoidal\ (virusul gripal), form\ paralelipipedic\ (virusul variolei), form\ de cartu[ sau obuz (virusul piticirii galbene la cartof), form\ de mormoloc, spermatozoid sau cirea[\ cu coad\ (unii bacteriofagi). Dimensiunile virusurilor 17 nm - 2500 nm. Structura virusurilor De[i diferitele virusuri se deosebesc mult ca form\ [i dimensiuni ele sunt constituite dup\ principii comune. Particula viral\ matur\ (virionul) este alc\tuit\ din dou\ componente esen]iale: genomul viral [i capsida, precum [i un constituient accesoriu, `nveli[ul extern. Genomul viral este reprezentat `n mod obi[nuit printr-o molecul\ de acid nucleic (ADN sau ARN, niciodat\ ambele). Genomul viral poart\ informa]ia genetic\ necesar\ replic\rii `n sensul sintezei constituien]ilor virali [i a precursorilor lor. Capsida viral\ (gr. "Kapsa" = cutie), acoper\ genomul fiind alc\tuit\ din subunit\]i proteice denumite capsomere. Capsomerele sunt constituite din molecule proteice a[ezate `n mod regulat, formând `n ansamblu structura specific\ a virusului. Capsida protejeaz\ materialul genetic. Capsida [i genomul viral formeaz\ nucleocapsida. La unele virusuri nucleocapsida este acoperit\ de o alt\ structur\ numit\ `nveli[ul extern sau peplosul (gr. peplos = manta). Virusurile plantelor Virusurile plantelor au o mare importan]\ ca agen]i patogeni datorit\ marii lor r\spândiri [i faptului c\ acela[i virus poate infecta plante care apar]in la diferite familii botanice. Bolile produse de virusuri la plante sunt denumite viroze. Pân\ `n prezent sunt cunoscute câteva sute de boli virale, produse de virusuri care apar]in la 25 genuri distincte. Din punct de vedere morfologic virusurile plantelor apar]in la dou\ grupuri: grupul virusurilor izometrice (izodiametrice) sau sferice [i grupul virusurilor alungite. ~n general virusurile plantelor au o structur\ chimic\ mai simpl\ decât virusurile animale [i bacteriofagii. Mecanismul de transmitere: Virusurile se pot transmite de la planta bolnav\ la planta s\n\toas\ pe mai multe c\i:

10

A - transmitere mecanic\: prin contact `ntre frunze; anastomoze radiculare; unelte de lucru; altoire. B - transmiterea prin vectori se realizeaz\ prin intermediul insectelor (cca.400 specii): afide [i cicade. Rela]ia dintre virus - insect\ vectoare este variabil\ [i corespunde la 3 situa]ii: ♦ Virusuri nepersistente, pot fi transmise pân\ la circa 4 ore de la achizi]ie. ♦ Virusuri semipersistente au capacitatea de infectare variabil\ de la 10-100 ore de la achizi]ie. ♦ Virusuri persistente cu o capacitate de infectare de peste 100 ore (uneori chiar toat\ durata de via]\ a vectorului). ~n func]ie de r\spândirea [i comportarea virusurilor `n corpul vectorului, acestea se `mpart `n 3 categorii: ♦ Virusuri localizate pe stilet (virusuri nepersistente). ♦ Virusuri circulante (virusuri persistente) pot fi transmise timp `ndelungat ajungând `n hemolimfa insectei. ♦ Virusuri propagative (virusuri persistente) se multiplic\ `n corpul vectorului fiind transmise toat\ via]a insectei. C - transmiterea prin intermediul ciupercilor fitopatogene din sol, (ex.Polymyxa betae transmite virusul rizomaniei la sfecla pentru zah\r). D - transmiterea prin intermediul nematozilor. E - transmiterea prin semin]e (cca. 1/3 din virusuri). Circula]ia virusurilor `n interiorul plantelor se realizeaz\ prin parenchim (plasmodesme), prin floem [i prin xilem. Bacteriofagii Bacteriofagii sunt virusuri adaptate la via]a parazitar\ `n celulele bacteriene [i care prin multiplicare produc liza acestora. ~n anul 1915 Twort, descoper\ fenomenul de liz\ transmisibil\, dar nu poate explica cu exactitate cauza acesteia. D'Herelle (1917) demonstreaz\ natura particular\ a fagului [i `l consider\, ca virus, determinându-l bacteriofag (mânc\tor de bacterii). ~n anul 1940, ia fiin]\ un grup de cercet\tori, denumit "grupul fag", condus de Delbrück, sistemul bacterie-bacteriofag fiind folosit ca model experimental pentru cele mai importante studii de genetic\ molecular\. Structura fagilor difer\ de la un grup la altul, `n majoritate, ace[tia `ncadrându-se `n dou\ tipuri de baz\ [i anume: - tipul icosaedric (poliedric); - tipul filamentos.

Datele cele mai numeroase cunoscute `n prezent sunt cele referitoare la fagii din seria T, `ndeosebi la fagi T-par (T2, T4, T6). Anatomia fagilor T-par Particula viral\ matur\ a fagilor T-par cu g.m. 2,2 x 10o este alc\tuit\ din ADN [i protein\ [i din punct de vedere anatomic prezint\ urm\toarele componente: cap, guler, coad\, plac\ bazal\ [i fibrele cozii. Capul fagului, la microscop prezint\ o form\ poliedric\ iar `n sec]iune are o form\ hexagonal\, cu o lungime de 100 nm [i o l\]ime de 65 nm. Aceasta este constituit din capsomere cu Ø de 4 nm, dar nu este cunoscut `nc\, num\rul [i modul de a[ezare al acestora. ~n interiorul capului, se g\se[te genomul, alc\tuit dintr-o molecul\ de ADN d.c., liniar\, cu lungimea de 50 µm, ce cuprinde 200 gene, fiind `mpachetat\ foarte strâns.

11

~n partea bazal\ a capului, la locul de prindere al cozii se afl\ un dop proteic, cu rol de articulare mecanic\. ~ntre acest dop [i placa bazal\ se g\se[te un tub lung de 120 nm, reprezentat de cilindrul axial al cozii. El are un Ø de 7,5 nm [i un canal central cu Ø de 2 nm, prin care trece ADN-ul `n momentul introducerii `n celula bacterian\. La exteriorul cilindrului axial se g\se[te teaca contractil\ a cozii, care `n stare extins\ are o lungime de 80 nm, iar când se contract\, teaca se scurteaz\ la 1/2 respectiv 35 nm. Teaca este constituit\ din 24 inele suprapuse [i datorit\ aranjamentului capsomerelor formeaz\ o helice. Gulerul fagului este situat `ntre dopul proteic [i coada fagului [i are forma unui disc hexagonal de 1,5 nm grosime cu Ø de 3,6 nm. Placa bazal\ este un disc hexagonal cu Ø de 40 nm [i este prev\zut la partea inferioar\ cu 6 cârlige (cro[etele cozii) care sunt unit\]i integrale de fixare a fagului pe bacterie. ~n momentul contrac]iei, placa bazal\ ia forma de stea cu Ø m\rit la 60 nm [i este lipsit\ de dopul central. Fibrele cozii sunt structuri filamentoase, proteice de 130 nm lungime, fixate cu unul din capete pe placa bazal\, iar cu cel\lalt cap\t pe gulerul fagului, cea de-a doua leg\tur\ fiind mai slab\. Aceste fibrile formeaz\ o re]ea care `mbrac\ teaca contractil\ a cozii [i care `n perioada premerg\toare fix\rii fagului, se desprind de pe guler [i r\mân legate numai pe placa bazal\, `notând libere `n mediu [i au aspectul unor picioare de p\ianjen. Structura genomului Bacteriofagii prezint\ `n majoritate un genom format dintr-o singur\ molecul\ de A.N. (ADN m.c., ADN d.c. , ARN m.c.) cu o singur\ excep]ie fagul Ø 6 de la Pseudomonas phaseolicola care are un genom ARN segmentat, format din 3 segmente. Genomul bacteriofagilor se deosebe[te de genomul virusurilor animale [i vegetale prin prezen]a unor baze nucleice neobi[nuite, cum ar fi la bacteriofagii T-par, `n loc de citozin\ prezint\ 5-hidroximetilcitozin\, iar la fagii de la Bacillus subtilis, 5-hidroximetilluracil [i 5-4,5 hidroximetiluracil. Legat de acest aspect s-a emis ipoteza c\ aceste baze nucleice ar avea rol de protec]ie a AN fagic `mpotriva ac]iunii unor enzime virale (nucleaze) care atac\ numai AN str\in [i `n felul acesta poate degrada selectiv cromozomul bacterian `n cursul sintezei de virus. Infec]ia celulei bacteriene. Replicarea Ciclul de replicare vegetativ\ a fagului are urm\toarele etape: I. Adsorb]ia reprezint\ procesul de fixare a particulelor virale pe suprafa]a bacteriilor. Dup\ o serie de ciocniri `ntâmpl\toare fagul se fixeaz\ pe peretele celular prin intermediul fibrelor cozii, realizând faza de fixare ini]ial\, care poate fi reversibil\. Urmeaz\ faza de fixare ireversibil\ realizat\ prin intermediul cro[etelor [i este condi]ionat\ de prezen]a receptorilor de fag. Ace[tia sunt reprezenta]i de orice structur\ existent\ la suprafa]a celulei bacteriene sau pe pilii [i flagelii acesteia, iar sinteza lor este controlat\ de gene bacteriene. II. Injectarea genomului viral `n celula bacterian\ Dup\ fixarea ireversibil\ pe peretele celular are loc o contrac]ie a cozii fagului, axul central al acesteia p\trunzând `n adâncimea peretelui celular 12 nm iar genomul este injectat prin intermediul cilindrului axial tubular. Nu se cunosc `nc\ for]ele care proiecteaz\ genomul viral `n interiorul celulei, injectarea f\cându-se rapid (15 secunde la T4).

12

III. Replicarea bacteriofagilor Dup\ p\trunderea genomului fagic `n interiorul celulei bacteriene au loc procese coordonate de cele 200 gene, care `[i `ncep activitatea e[alonat `n mai multe faze: 1 - formarea proteinelor timpurii cu rol `n: a - "astuparea" g\urilor produse la intrare `n peretele celular; b - blocheaz\ transcrierea informa]iei de c\tre ARN m al celulei gazd\, rolul fiind preluat de ARN m viral; c - degradarea ADN gazd\, de unele proteine, fiind f\r\mi]at pân\ la nucleotide `n segmente de ADN d.h. mici de 1/100 din cromozomul originar, care sunt degradate `n continuare la nucleotide formându-se un stoc din care cel pu]in 1/3 sunt utilizate la formarea fagilor progeni. . 2. replicarea genomului viral, care este semiconservativ\ [i nu prin efectuarea de copii identice, repetate ale genomului originar; 3. formarea proteinelor tardive. Sinteza acestora devine predominant\ când ADN viral a ajuns la rata maxim\ de replicare. Proteinele tardive sunt grupate `n 3 categorii: a - proteine structurale ale virusului; b - proteine active `n procesul de morfogenez\; c - enzime necesare lizei celulei bacteriene. 4. ansamblarea [i morfogeneza virusului care, este dirijat\ de 50 de gene din cele 200. Fagul este constituit din 3 por]iuni distincte care se formeaz\ separat pe trei linii principale care duc independent la formarea capului, a cozii [i a fibrelor cozii. ~n treptele urm\toare compu[ii fini]i se combin\ pentru a forma particula viral\. ~ncorporarea genomului are loc `naintea unirii celor trei componente, formarea capului fagic nefiind definitiv\, `ncorporarea activat\ de unele proteine care asigur\ "aspirarea" ADN `n precap. ADN se ruleaz\ ca o bobin\ a c\rei ax este perpendicular fa]\ de cel al cozii. Bobinarea are loc de la exterior la interior, ultima spir\ fiind prima care iese `n momentul infec]iei virale. Concomitent cu `mpachetarea ADN, capul fagului cre[te `n volum [i devine matur. Urmeaz\ unirea celor trei componente, cap, coad\, fibrele cozii, des\vâr[indu-se fagul matur. Liza bacterian\ [i eliberarea fagului Liza bacterian\ se datore[te ac]iunii unei enzime (endolizina) a c\rei sintez\ este indus\ de prezen]a fagului `n celula bacterian\. La un moment dat, când con]inutul `n endolizin\ este maxim, metabolismul celular `nceteaz\ brusc [i are loc o distrugere masiv\ a peretelui celular, cu un caracter exploziv, fagii fiind expulza]i `n exterior. Fagii filamento[i Fagii filamento[i care infecteaz\ E. coli, au forma unor bastona[e flexibile cu Ø de 6 nm [i o lungime de 1000-2000 nm. Structura este aceea a unui cilindru proteic gol deschis la capete (capsid\) `n interior aflându-se genomul fagic format din ADN m.c., o molecul\ circular\. Fagii filamento[i infecteaz\ numai bacteriile cu caracter mascul, ca [i fagii cu ARN, adsorb]ia f\cându-se pe receptori speciali situa]i la extremitatea liber\ a pililor de sex. Fagii maturi sunt elimina]i prin intermediul unor pori care se formeaz\ `n membrana citoplasmatic\, bacteria nefiind lizat\, aceasta continu\ s\ se

13

divid\ un timp, ulterior con]inutul celular trece la exterior prin porii deschi[i de virioni. Cianofagii Au form\ asem\n\toare cu bacteriofagii T-impar. Genomul este reprezentat de ADN d.c. de 13,2 µm. Micovirusurile Sunt virusuri care atac\ fungii, fiind cunoscute [i sub denumirea de micofagi. Structura micovirusurilor. Cel mai bine studiat este virusul care infecteaz\ specia Penicillium chrysogenum, care se prezint\ sub forma unor mici particule poliedrice cu Ø de 33-41 nm. Genomul este reprezentat de o molecul\ de ARN d.c. La fungi virusurile sunt `n general latente, celulele se dezvolt\ mai lent, dar nu lizeaz\ constant. Micovirusurile au fost eviden]iate [i `n sporii fungilor. Transmiterea micovirusurilor `n general se face `n urma plasmogamiei (heterocarioza). Rolul bacteriofagilor `n sol Coloniile de bacterii cultivate pe medii artificiale `n zonele unde sunt atacate de bacteriofagi apar ca ni[te zone clare "plaje" de liz\, iar `n suspensii bacteriene atacul fagilor produce limpezirea mediului datorit\ lizei bacteriilor parazitate care dispar. Din astfel de suspensii de bacterii lizate se pot ob]ine prin ultra filtrare suspensii de bacteriofagi. O proprietate deosebit\ a unor tulpini de fagi, este capacitatea de a tr\i `n unele celule bacteriene f\r\ a provoca moartea acestora, dar eliberând `n afar\ noi particule virale. Astfel de fagi sunt denumi]i "bacteriofagi tempera]i", iar celulele bacteriene ce-l g\zduiesc se numesc "celule lizogene". Importan]a bacteriofagilor din sol const\ `n faptul c\ influen]eaz\ ecologia bacteriilor gazd\, distrugând speciile de bacterii "lizosensibile", modificând uneori echilibrul microbian. R\spândirea virusurilor din sol este influen]at\ de capacitatea humusului [i argilelor de a absorbi [i imobiliza particulele de virus. Se [tie `n acest sens c\ solurile argiloase [i bogate `n humus adsorb mai mult particulele de virus de cât cele nisipoase. De aici rezult\ [i posibilitatea r\spândirii diferen]iate a unor boli virotice ale plantelor [i ai bacteriofagilor `n natur\. Importan]a agricol\ a bacteriofagilor este pu]in cunoscut\ `nc\. Existen]a bacteriofagilor a fost demonstrat\ `nc\ din anul 1927 de c\tre A. Grigne, fiind dovedit\ `n solele cultivate cu plante leguminoase. Densitatea lor maxim\ este `n zona rizosferic\ [i `n nodozit\]ile mature sau la `nceputul `mb\trânirii. R\spândirea bacteriofagilor nu este influen]at\ prea mult de condi]iile din sol. Astfel au fost identifica]i `n soluri cu pH `ntre 5,2-9,3, cât [i `n soluri care au suferit `nghe]ul iernii.

14

1. Virusurile sunt:

a) organisme acelulare

b) organisme procariote

c) organisme eucariote

2. Genomul viral este format din:

a) ADN [i ARN

b) ADN sau ARN

c) ADN

d) ARN

3. P\trunderea (Infec]ia) virusului `n celula bacterian\ are loc:

a) prin for]e proprii

b) printr-un vector activ

c) prin "`nglobare", de c\tre celul\

4. Pentru sinteza capsidei virale se utilizeaz\:

a) proteine existente `n citoplasm\

b) proteine sintetizate de ARN gazd\

c) proteine sintetizate de AN viral

Rezultatele corecte:

1 - a; 2 - b; 3 - a; 4 - b

2.3. BACTERIILE

Test de autoevaluare

15

Sunt organisme unicelulare cu o structur\ complex\ care au un metobolism propriu datorit\ unui aparat enzimatic complex ce le asigur\ desf\[urarea proceselor vitale. ~n linii generale bacteriile au o serie de caractere generale ce pot fi sistematizate astfel: ♦ Nucleul celulei bacteriene este de tip procariot, adic\ lipsit de membran\, iar afinit\]ile tinctoriale nu sunt deosebite fa]\ de citoplasm\. ♦ Bacteriile au un polimorfism accentuat, putând `mbr\ca mai multe aspecte morfologice ca forme sferice, cilindrice, spiralate sau helicoidale, filamentoase [i p\trate. ♦ Mi[carea la speciile mobile este asigurat\ de organite speciale, numite cili sau flageli. ♦ Bacteriile sunt lipsite de clorofil\, dar unele grupe au pigmen]i sintetizan]i [i ca atare pot folosi energia luminoas\. ♦ Altele `[i procur\ energia necesar\ sintezelor celulare [i altor manifest\ri vitale, dezintegrând diverse substan]e chimice prin intermediul proceselor fermentative, fiind din acest punct de vedere, organisme chimiosintetizante (Chemotrofe). ♦ Se `nmul]esc prin aciziparitate, dar se cunosc la unele grupe [i forme de conjugare de tip parasexuat, cu formare de celule sexuate de sens diferit; forma de sciziparitate r\mâne `ns\ forma esen]ial\ de reproducere. ♦ Bacteriile pot forma spori, ce constituie un mijloc de conservare a speciei, la unele grupe. Morfologia bacteriilor Din punct de vedere al formei exterioare se disting cinci tipuri de baz\, dup\ cum urmeaz\: - bacterii sferice denumite coci, cu genul principal Coccus; - bacterii cilindrice sub form\ de bastona[ drept sau u[or curbat din care face parte genul Bacillus; - bacterii spiralate sau elicoidale, `n care se cuprind trei categorii de germeni [i anume: vibrionii, spirilii [i spirocheta; - bacterii filamentoase, cu celule alungite `n care se cuprind actinomicetele; - bacterii p\trate, sunt foarte rare, `ntâlnite `n apele saline. Dup\ forma celulelor [i modul de grupare `n urma procesului de diviziune, bacteriile se `mpart `n urm\toarele tipuri [i subtipuri morfologice: Bacteriile sferice sau cocii, au form\ sferic\, ovoidal\, sau elipsoidal\, cu cele dou\ diametre aproximativ egale. ~n func]ie de pozi]ia celulelor fiice dup\ diviziune, cocii prezint\ urm\toarele moduri de grupare: Cocul simplu, izolat, la care celulele r\mân independente dup\ diviziune (ex. Micrococcus ureae). Diplococul, la care diviziunea se face dup\ planuri succesive paralele, celulele rezultate r\mânând grupate câte dou\ (ex. Diplococcus pneumoniae). Streptococul, la care diviziunea se face dup\ planuri succesive paralele, iar celulele rezultate formeaz\ lan]uri de lungimi variabile (ex. Streptococcus lactis). Tetracocul, la care planurile de diviziune sunt perpendiculare unele fa]\ de altele, iar celulele rezultate sunt dispuse câte 4 la un loc (ex. genul Gafkia). Sarcina, la care planurile de diviziune sunt orientate dup\ cele trei direc]ii ale spa]iului [i reciproc perpendiculare unul pe altul, rezultând o grupare de celule sub form\ de cub (ex. Sporosarcina ureae).

16

Stafilococul, la care planurile succesive de diviziune sunt dispuse `n mai multe direc]ii, iar celulele rezultate se grupeaz\ ca un ciorchine (ex. Staphyllococcus aureus. Bacteriile cilindrice, cunoscute sub denumirea de bacili au form\ de bastona[e, cu raportul `ntre cele dou\ axe foarte diferit, de la forme cu aspect filamentoase, pân\ la unele cu aspect aproape sferic. Unele dintre bacteriile cilindrice au proprietatea de a forma spori. Bacteriile spiralate, sunt elicoidale cuprind trei subtipuri morfologice: Vibrionul, `n form\ curbat\, cu un singur tur de spir\. Spirilul, `n form\ de spiral\ cu mai multe ture de spir\, rigide ca un baston. Spirocheta, sub form\ de spiral\ cu mai multe ture de spir\ dar flexibile, care se poate strânge [i relaxa. Bacteriile filamentoase, au ca prototip actinomicetele, microorganisme cu asem\n\ri morfologice cu fungii, cu particularitatea de a forma hife, cu tendin]\ de ramificare, de unde [i aspectul lor de miceliu. ~n unele cazuri, spre exemplu la Sphaerotilus nutans aspectul filamentos este determinat de a[ezarea celulelor individuale `n lan]uri de celule reunite printr-o teac\ delicat\, cu perete neted. Bacteriile p\trate, eviden]iate `n apa hipersalin\ din peninsula Sinai, au forma unor p\trate cu latura de 1,5-11 µm [i o grosime de 0,1 µm. Formeaz\ placarde de 8-16 celule p\trate rezultate `n urma diviziunii. Structura celulei bacteriene Celula bacterian\ este o entitate morfologic\ [i func]ional\ echivalent\ cu celulele organismelor superioare, cu o structur\ complex\ format\ din urm\toarele componente, de la exterior c\tre interior, luând ca reper peretele celular: ♦ Structur\ extraparietal\ format\ din: capsul\; cilii sau flagelii; aparatul fimbrial [i pilii de sex. ♦ Peretele celular. ♦ Structura intraparietal\ compus\ din: membrana citoplasmatic\, mezozomii, citoplasm\, aparatul nuclear, incluziunile, ribozomii, vacuolele, sporul bacterian. Capsula este o secre]ie care apare la unele bacterii, ce se fixeaz\ la exteriorul celulei [i constituie un `nveli[ `n jurul acesteia. ñ func]ie de raportul fa]\ de celula bacterian\ capsula este de mai multe feluri: ♦ microcapsula, cu grosimea fin\ de 0,2 µm, ce se pune `n eviden]\ prin metode imunologice; ♦ stratul mucos caracterizat prin prezen]a unei mase amorfe neorganizate `n jurul celulei; ♦ zooglea ce se prezint\ ca un strat mucos neorganizat care `nglobeaz\ mai multe celule microbiene. Compozi]ia chimic\ a capsulei difer\ `n func]ie de specia bacterian\ la care apare [i de condi]iile de mediu, fiind format\ din 98 % ap\, al]i constituien]i ca polizaharidele [i polipeptide. Func]iile biologice ale capsulei sunt urm\toarele: - func]ia de protec]ie `mpotriva fagocitelor la bacteriile patogene; - func]ia de virulen]\; - func]ia de protec]ie `mpotriva desica]iei. Cilii sau flagelii Cilii sau flagelii sunt forma]iuni filamentoase, cilindrice, lungi, sub]iri, situate la suprafa]a celulei bacteriene [i reprezint\ organite de mi[care ale

17

acesteia. Prezen]a cililor este caracteristic\ numai anumitor specii de bacterii, mobile. Num\rul cililor este variabil, func]ie de specie, de la unu pân\ la o sut\. ~n func]ie de inser]ia pe corpul bacteriei cilii pot avea urm\toarele pozi]ii: - monotrih\, un cil la un singur pol; - amfitrich\, cu câte un cil la ambii poli ai celulei; - peritrich\, cu cili dispu[i `n jurul bacteriei; - lophotrich\, cu cili dispu[i la un pol sub form\ de m\nunchi. Cilii sunt organite lungi de 16-18 µm [i sub]iri, cu diametrul de 0,01-0,02 µm pe toat\ lungimea, de obicei ondula]i. Implantarea lor se face `n citoplasm\ printr-un corp bazal situat `ntre peretele celular [i membrana citoplasmatic\. La bacteriile Gram-pozitive corpusculul bazal este format din dou\ discuri (inele), angrenate `mpreun\ sub forma butonilor de man[et\. Lungimea cililor dep\[e[te pe cea a celulei, `n mod excep]ional pân\ la de 10 ori. Cu ajutorul cililor bacteriile se pot deplasa linear sau se pot rostogoli. Viteza de `naintare este mare, parcurgând `ntr-o secund\ o distan]\ de la 10 pân\ la 40 ori mai mare ca diametrul longitudinal al bacteriei. Aparatul fimbrial. Fimbriile sunt forma]iuni filamentoase prezente pe suprafa]a bacteriilor imobile sau mobile, `n num\r mare, de ordinul sutelor (100-400). Ele au o pozi]ie radial\ [i sunt mai scurte ca cilii; nu servesc la mi[care ci au rol de fixare pe diferite substrate solide sau pe hematii, pe care le aglutieaz\. Fimbriile sunt de natur\ intracelular\ deoarece dup\ `ndep\rtarea peretelui celular, r\mân fixate pe protopla[ti. Pilii sunt, dup\ Ottow, apendice filamentoase care au un canal prin care se face transferul cromozomului bacterian de la celula mam\ (F+) la celula femel\ (F-), fiind denumite [i "pili de sex". Peretele celular Este invizibil sau foarte greu vizibil la microscopul fotonic [i reprezint\ aproximativ 20 % din greutatea uscat\ a celulei [i 25 % din volumul ei. Peretele celular are rol: - de sus]inere mecanic\; - asigur\ individualitatea morfologic\; - ofer\ protec]ie fa]\ de [ocul osmotic; - particip\ la procesul de diviziune celular\; - con]ine receptori de virus; - mediaz\ schimbul de substan]e cu mediu. Peretele celular este absent la micoplasmatale. Colora]ia Gram permite clasificarea bacteriilor dup\ peretele celular `n dou\ mari categorii: Gram+ (violet) [i Gram- (ro[u). ~ntre cele dou\ categorii exist\ diferen]e mari de compozi]ie chimic\ [i anume: 1. Peptidogliconul (mureina) este prezent la majoritatea bacteriilor, fiind de mai multe tipuri moleculare: 80-90 % laG+; 10-20 % la G-. 2. Acizii teichonici sunt foarte abunden]i la bacteriile Gram+. 3. Acizii lipoteichonici sunt `ntâlni]i la bacteriile Gram+ asocia]i la membrana citoplasmatic\ dar se g\sesc [i `n peretele celular. 4. Acizii teichuronici sunt caracteristici bacteriilor Gram+. 5. Lipopoliozidele caracterizeaz\ bacteriile Gram- [i sunt responsabile de primul control al permeabilit\]ii celulare. Bacteriile Gram- sunt `n general mai rezistente la inhibitori (peniciline, coloran]i) decât cele Gram+. 6. Acizii gra[i se g\sesc sub forma unor lan]uri lungi la nivelul peretelui celular la actinomicete [i la bacteriile coryneforme.

18

Membrana citoplasmatic\, acoper\ citoplasma bacteriilor [i o separ\ de fa]a intern\ a peretelui celular. Are o grosime de 7,5 nm [i este constituit\ din dou\ straturi fosfolipidice. Analiza chimic\ a membranei eviden]iaz\ trei tipuri de molecule: lipide, proteine [i glucide. Proteinele reprezint\ peste 50 % din total. Membrana citoplasmatic\ este o barier\ osmotic\ de permeabilitate care regleaz\ p\trunderea `n celul\ [i eliminarea selectiv\ a diferitelor substan]e. Ea men]ine `n celul\ o concentra]ie ridicat\ de macromolecule, molecule mici [i chiar ioni `mpedicându-le difuzarea `n mediu de[i concentra]ia extracelular\ este mai mic\. Con]ine permeazele care asigur\ transportul activ `n interiorul celulei a unor substan]e organice polare din mediu. Membrana citoplasmatic\ are rol `n cre[terea [i diviziunea celular\; la nivelul s\u ia na[tere semnalul care declan[eaz\ ini]ierea replic\rii cromozomului bacterian. ~n sfâr[it, membrana citoplasmatic\ este suportul enzimelor care particip\ la sinteza ATP (la eucariote aceste enzime se afl\ `n mitocondrii). Mezozomii sunt forma]iuni care deriv\ din membrana citoplasmatic\ sub forma unor invagin\ri, legate de ADN celular. Aceste organite celulare joac\ un rol important `n diviziunea nucleului [i `n formarea septului care separ\ cele dou\ celule fiice. La bacteriile purpurii mezozomii con]in pigmen]i clorofilieni. La bacteriile fixatoare de N2, nitrogenaza care este inhibat\ de O2, este protejat\ de mezozomi. La bacteriile nitrificatoare numeroasele invagin\ri ale membranei citoplasmatice m\resc suprafa]a de schimb enzimatic. Citoplasma, este un sistem coloidal constituit din s\ruri minerale, compu[i solubili de natur\ lipoproteic\, nucleoproteine, lipide [i ap\. Are un pH cuprins `ntre 7-7,2. Citoplasma poate fi caracterizat\ ca un complex de st\ri fizice `ntr-o continu\ transformare, `n func]ie de starea fiziologic\ a vârstei celulei. Ribozomii sunt forma]iuni citoplasmatice, sferice. O celul\ bacterian\ con]ine `n medie 18.000 ribozomi de tip 70 S, cu un diametru de 10-30 nm. Fiecare ribozom se disociaz\ `n dou\ subunit\]i, 30 S [i 50 S. Fiecare subunitate 50 S este legat\ de o subunitate 30 S prin intermediul leg\turilor ARN - protein\ [i protein\-protein\. Ribozomii 70 S joac\ un rol precis `n cursul traducerii lan]urilor de ARN `n proteine. Materialul nuclear ("nucleul") este constituit dintr-un cromozom format de o bucl\ de ADN aflat `n suspensie, `n citoplasm\. Lungimea acestuia este mare, ajungând la Escherichia coli la 1 mm, ceea ce implic\ o r\sucire foarte accentuat\. Plasmidele sunt considerate material genetic extracromozomial, fiind independente de nucleu.

Plasmidele nu sunt indispensabile pentru via]a celular\ dar pot aduce un avantaj selectiv. Ele poart\ informa]ia pentru degradarea unor substraturi [i pentru rezisten]a la antibiotice.

Replicarea plasmidelor se produce `n dou\ momente diferite: atunci când celula se divide [i atunci când se produce procesul de conjugare.

Bacteriile pot con]ine mai multe plasmide. Escherichia coli, de exemplu, posed\ pe cromozom 1 sau 2 plasmide conjugate [i 10-15 plasmide neconjugate.

Vacuolele sunt forma]iuni sferice care apar `n citoplasm\ `n faza de cre[tere activ\ a celulelor bacteriene. ~n interiorul lor se g\se[te ap\ sau gaz.

19

Cele cu ap\ au rol `n men]inerea presiunii osmotice `n raport cu mediul extern, iar cele cu gaz au rol de flota]ie.

Incluziunile sunt forma]iuni inerte care apar `n citoplasm\ la sfâr[itul periodei exponen]iale de cre[tere a celulei. Ele pot fi formate din glicogen, amidon, carbonat de calciu [i fosfat anorganic.

Sporul bacterian este o forma]iune care deriv\ din celula vegetativ\ a bacteriilor, `n anumite condi]ii de via]\. Sporul este o form\ de conservare a speciei la condi]iile nefavorabile de mediu [i concentreaz\ `ntr-un volum redus toate componentele esen]iale ale celulei din care provine.

Form\ sporului poate fi sferic\ sau oval\. Dispunere sporului `n celula vegetativ\ poate fi central\, subterminal\,

terminal\ sau lateral\. Dup\ modul de formare, structur\ [i rezisten]\ la factorii de mediu,

sporul bacterian poate fi de mai multe tipuri: 1. Endosporul (sporul propriu-zis) apare `n interiorul unei celule

vegetative numit\ "sporangiu" [i prezint\ o mare rezisten]\ la condi]iile nefavorabile de mediu, `n special la varia]iile temperaturii. O celul\ vegetativ\ poate forma un singur endospor.

Bacteriile susceptibile de a produce endospori apar]in genurilor: Bacillus, Clostridium, Delsulfatomaculum, Sporosarcina, Sporolactobacillus, Thermoactinomyces.

2. Artrosporii se formeaz\ prin fragmentarea unor celule vegetative. Au o form\ neregulat\ [i o rezisten]\ intermediar\ `ntre cea a endosporului [i celula vegetativ\. Artrosporii sunt caracteristici bacteriilor actinomicete.

3. Chi[tii sunt stadii de rapaus sau supravie]uire, formate ca r\spuns la modific\rile de mediu [i provin din transformarea unei celule vegetative, prin `ngro[area pere]ilor [i acumularea de material de rezerv\. Au o rezisten]\ mai mic\ decât endosporul [i nu sunt termorezisten]i.

4. Gonidia apare endocelular prin condensarea [i fragmentarea protoplasmei unei celule vegetative numit\ gonidangiu. ~n interiorul unei celule apar de regul\ mai multe gonidii care sunt eliberate `n mediu prin ruperea peretelui gonidangiului. Principala lor func]ie prive[te capacitatea de reproducere, neavând rezisten]a caracteristic\ sporului.

Compozi]ia chimic\ a bacteriilor Compozi]ia chimic\ a celulei bacteriene nu difer\ prea mult de cea a

celorlalte organisme vii. Ea con]ine cca. 600 molecule diferite, organice [i anorganice.

Apa este mediul biogen esen]ial [i reprezint\ 78 % din greutatea medie acelulei bacteriene. Se g\se[te sub form\ de ap\ liber\ sau legat\ de diferite componente celulare. Apa `ndepline[te numeroase func]ii:

- este solvent al compu[ilor hidrosolubili; - este mediu de dispersie pentru constituien]ii chimici insolubili `n ap\; - condi]ioneaz\ activitatea enzimelor; - asigur\ transportul elementelor de metabolism. S\rurile minerale reprezint\ 2-20 % din greutatea uscat\ a bacteriilor [i

sunt reprezentate de principalele elemente. Cel mai bine este reprezentat fosforul (∼ 45 %). Substan]ele minerale au rol `n:

- reglarea presiunii osmotice; - activeaz\ unele sisteme enzimatice; - regleaz\ pH-ul; - influen]eaz\ permeabilitatea peretelui celular; - intr\ `n compozi]ia unor constituien]i celulari.

20

Acizii nucleici. ADN se g\se[te sub forma unei singure molecule circulare, dublu helicale. Reprezint\ 1/5 din con]inutul celular.

ARN reprezint\ cca 17 % din greutatea uscat\ a celulei bacteriene [i se g\se[te localizat `n citoplasm\ sub trei forme: ARN m, ARN t, ARN r.

Proteinele reprezint\ cca 60 % din greutatea uscat\ a bacteriilor [i se g\sesc sub form\ de holoproteine [i heteroproteine.

Proteinele au rol structural iar unele `ndeplinesc func]ia de enzime. Glucidele reprezint\ 4-25 % din greutatea uscat\ a celulei bacteriene [i

se g\sesc sub form\ de glucide simple (mono [i dizaharide) [i polizaharide. Glucidele simple particip\ la metabolismul bacterian iar polizaharidele

au rol structural, energetic sau de material de rezerv\. Lipidele se g\sesc `n propor]ie de 1-20 %, din greutatea uscat\ a bacteriilor, iar aceast\ varia]ie este specific\ depinzând de vârsta celulei [i compozi]ia mediului de cultur\. Lipidele se g\sesc `n membrana citoplasmatic\ [i sub form\ de granule intracitoplasmatice. Pigmen]ii sunt substan]e colorate care se g\sesc `n citoplasma bacteriilor cromogene. Dup\ localizarea pigmen]ilor fa]\ de celul\, bacteriile se `mpart `n dou\ categorii: - bacterii cromopare, la care pigmentul este eliminat `n mediul pe care `l coloreaz\ (Ex. Pseudomonas fluorescens); - bacterii cromofore, la care pigmentul r\mâne localizat `n celula bacterian\ (Ex. Staphylococcus aureus). Pigmen]ii pot fi de mai multe tipuri, dup\ compozi]ia chimic\: bacterioclorofite, pigmen]i carotenoizi (ro[ii, galbeni, portocalii), antocianici, pigmen]i melanici (brun sau negru). Pigmen]ii pot avea rol `n fotosintez\, rol antibiotic, de protec]ie `mpotriva radia]iilor luminoase [i ultraviolete, rol de vitamine. Enzimele bacteriene constituie o grup\ de proteine cu importan]\ biologic\ deosebit\, de catalizatori ai celulei vii, fiind solubile `n ap\, termolabile, criolabile [i sensibile la ac]iunea radia]iei ultraviolete. Dup\ substratul asupra c\ruia ac]ioneaz\ enzimele se clasific\ `n: - exoenzime care sunt eliberate `n mediul `nconjur\tor ac]ionând asupra unui substrat din afara celulei; ele sunt angrenate `n procesele de catabolism; - endoenzime sunt secretate intracelular [i particip\ la reac]iile de sintez\ (anabolism). Dup\ viteza de ac]iune enzimele pot fi de dou\ categorii: - enzime constitutive, care sunt preexistente [i care ac]ioneaz\ rapid asupra unui substrat. Sunt sintetizate `n tot cursul vie]ii bacteriei; - enzime adaptive, care ac]ioneaz\ lent, deoarece celula trebuie s\ se adapteze la substrat, apari]ia enzimelor fiind legat\ de mediu. Cre[terea [i multiplicarea bacteriilor Ciclul de dezvoltare al bacteriilor se compune din dou\ faze: cre[terea [i multiplicare. Prin cre[tere se `n]elege procesul de neoformare, `n condi]ii favorabile, `n protoplasma bacteriei, a substan]ei de constitu]ie. Aceast\ cre[tere se continu\ pân\ la atingerea unei limite, când survine diviziunea celular\. Prin multiplicare se `n]elege sporirea num\rului de indivizi, care se face prin diviziune celular\. Diviziunea celular\ poate fi: - izomorf\, când celulele fiice rezultate sunt egale; - heteromorfe, când celulele fiice rezultate nu sunt egale; ~n afara diviziunii celulare, multiplicare se mai poate realiza prin: - fragmentarea con]inutului celular `n mai multe elemente;

21

- prin `nmugurire. Evolu]ia unei culturi bacteriene ~n urma studierii multiplic\rii bacteriilor pe medii artificiale, s-a constatat c\ acest proces se realizeaz\ `n mai multe faze succesive: 1. Faza de lag sau (cre[tere zero), este cuprins\ `ntre momentul `ns\mân]\rii bacteriilor [i momentul `nceperii multiplic\rii, când num\rul bacteriilor din inocul nu cre[te, iar cultura nu este vizibil\ macroscopic. Aceast\ faz\ dureaz\ aproximativ 2 ore [i este o etap\ de adaptare la noile condi]ii de cultur\. 2. Faza de accelerare a ritmului de cre[tere, care corespunde `nceperii multiplic\rii, a c\rei vitez\ cre[te progresiv [i `n care celulele sunt tinere. 3. Faza exponen]ial\ sau de multiplicare logaritmic\, `n care procesul se accentueaz\ `n progresie geometric\, iar durata unei genera]ii este minim\.

Cre[terea exponen]ial\ a unui organism unicelular ce realizeaz\ o genera]ie la 20 minute (dup\ Stanier, 1966)

Num\r de organisme exprimat `n: Timpul

(minute) Num\r de diviziuni

nr.aritmetic log2 log10 0 0 1 0 0,000

20 1 2 1 0,301 40 2 4 2 0,602 60 3 8 3 0,903 80 4 16 4 1,204 100 5 32 5 1,505 120 6 64 6 1,806 140 7 128 7 2,107 160 8 256 8 2,408 180 9 512 9 2,708 200 10 1024 10 3,010

4. Faza `ncetinirii ritmului de cre[terem când rata multiplic\rii `ncepe s\ scad\ progresiv. 5. Faza sta]ionar\, cu ritm de cre[tere zero, care se caracterizeaz\ prin faptul c\ num\rul celulelor r\mâne constant din cauza echilibrului ce se stabile[te `ntre num\rul celulelor ce mor [i a celor ce apar `n urma unei diviziuni foarte lente. Aceast\ faz\ corespunde celulelor mature. 6. Faza ini]ial\ de declin, `n care num\rul celulelor viabile scade progresiv, prin moartea unora dintre ele. Aceast\ faz\ corespunde celulelor b\trâne, cu forme de involu]ie, când apar numero[i spori. 7. Faza intermediar\ de declin `n care num\rul celulelor continu\ s\ scad\, cu un ritm de dispari]ie constant. 8. Faza final\ de declin `ncheie evolu]ia unei culturi prin moartea `n ritm lent a celulelor pân\ la sterilizarea complet\ a culturii. Oprirea multiplic\rii bacteriilor [i `n cele din urm\ moartea lor se datore[te unei serii de factori ca: - lipsa substan]elor nutritive esen]iale din mediul nutritiv; - competi]ia pentru O2 sau activitatea slab\ a substan]elor folosite pentru procesele respiratorii; - modific\rile fizico-chimice ale mediului de cultur\ (acumulare de acizi, alcooli etc.); - acumularea produ[ilor de catabolism [i a toxinelor `n concentra]ii incompatibile cu via]a celulelor.

22

Nutri]ia bacteriilor Bacteriile pot folosi pentru manifest\rile lor vitale, fie energia radiant\ luminoas\ `n cazul celor capabile de fotosintez\, fie energia eliberat\ prin reac]ii chimice oxidative, la `ntuneric, `n cazul celor chimiotrofe. Dup\ sursa de energie bacteriile pot fi clasificate astfel: - fototrofe (fotosintetizante) a c\ror surs\ primar\ de energie este lumina; - chemotrofe (chimiosintetizante) a c\ror surs\ de energie este ob]inut\ la `ntuneric `n urma reac]iei de oxido-reducere a unor substan]e organice sau anorganice. ~n func]ie de capacitatea de sintez\ a metaboli]ilor esen]iali, bacteriile prezint\ urm\toarele tipuri de nutri]ie: - Autotrofia, corespunde capacit\]ii de sintez\ a tuturor constituien]ilor celulari prin mijloace proprii, pornind de la surse simple anorganice de C [i N ca: CO2, NH3, NO2

-, NO3-.

- Heterotrofia, implic\ incapacitatea de sintez\ a unor metaboli]i esen]iali [i de aceea este nevoie de prezen]a substan]elor organice ca surs\ de C sau N. Bacteriile care folosesc o surs\ organic\ de carbon sunt denumite bacterii de fermenta]ie iar cele care utilizeaz\ o surs\ organic\ de azot mai sunt denumite bacterii de putrefac]ie. ~n concluzie, autotrofele prin sintezele lor genereaz\ substan]a organic\ plecând de la compu[i minerali simpli, pe când heterotrofele nu-[i pot realiza sintezele proprii decât dac\ dispun de substan]e organice pe care le descompun pân\ la produ[i mai simpli [i pe care `i utilizeaz\ `n metabolismul lor. - Paratrofia reprezint\ tipul de nutri]ie la care cre[terea este dependent\ de energia furnizat\ de celula parazitat\. Respira]ia microorganismelor Dup\ exigen]ele fa]\ de oxigenul molecular, microorganismele se grupeaz\ `n patru tipuri respiratorii: 1. Microorganisme strict (obligatoriu) aerobe care folosesc O2 ca acceptor final de H, având nevoie de prezen]a continu\ a oxigenului atmosferic. 2. Microorganisme strict (obligatoriu) anaerobe, care nu se pot dezvolta `n prezen]a oxigenului molecular, putând fi cultivate numai pe medii s\r\cite `n O2. Ele nu dispun de enzimele respiratorii din categoria citocromilor. Anaerobioza lor strict\ const\ `n faptul c\, `n prezen]a O2, care se comport\ ca acceptor final de H, se formeaz\ peroxidul de hidrogen, care este toxic [i nu ap\. 3. Microorganisme facultativ anaerobe, care sunt capabile s\-[i orienteze metabolismul spre respira]ie sau spre fermenta]ie, `n func]ie de disponibilit\]ile de O2 [i care au `n mod obi[nuit un metabolism anaerob f\r\ a fi `ns\ sensibile la prezen]a O2. Unele microorganisme de acest tip respirator (levurile) pot trece de la un metabolism aerob la unul anaerob, `n func]ie de condi]iile de mediu. 4. Microorganismele microaerofile, au nevoie de o concentra]ie de O2 mai mic\ decât aceea din aerul atmosferic. Aceast\ particularitate se datoreaz\ sensibilit\]ii unora dintre enzimele lor la condi]iile de oxidare puternic\.

23

Grupe particulare de bacterii

Bacteriile glasogene Apa chimic\ [i biologic\, pur\, poate r\mâne `n stare lichid\ pân\ la -40oC. Supus\ la temperaaturi inferiore lui zero grade, ea nu `nghea]\ decât `n prezen]a nucleelor glasogene. Aceste nuclee pot fi reprezentate de particulele minerale care provoac\ congelarea `ncepând de la -10oC. La temperaturi situate `ntre -10oC [i zero, ghea]a nu se formeaz\ la plante decât `n prezen]a bacteriilor specifice care, posed\ `n membran\, nucleele glasogene. Su[ele bacteriene `n cauz\, apar]in speciilor Pseudomonas syringae [i Erwinia herbicola; ele pot fi saprofite (epifite) sau parazite pe organele plantelor `n cauz\ (frunze, flori, fructe). Procentul de nuclee glasogene este ridicat la Ps. syringae (60 %) [i mai mic la E. herbicola (1-5 %). Puterea glasogen\ a bacteriilor se exprim\ "in vitro" sau `n "in vivo" pe organele plantelor. Pe de alt\ parte su[ele inductoare de ghea]\ se multiplic\ abundent pe organele necrozate prin `nghe], ceea ce le ofer\ un avantaj selectiv considerabil. Când o suspensie de bacterii glasogene este pulverizat\ pe frunze, apar simptomele `nghe]ului cu ofilirea ireversibil\, dac\ ele sunt plasate (]inute) 1 or\ la -5oC, pe când plantele martor netratate cu bacterii r\mân imune la toate alter\rile vizibile. La vi]a de vie s-a observat o corela]ie ridicat\ `ntre num\rul de bacterii glasogene prezente pe muguri [i pierderile cauzate de frig la temperaturi apropiate de 0oC. Bacteriile glasogene care provoac\ `nghe]area au fost observate la plante foarte diverse (pin, cire[, piersic, prun, cais, forsi]ia, fasole, porumb, tomate, c\p[un). Su[ele bacteriene active, datorit\ capacit\]ii de a induce formarea ghe]ii, prezint\ o gen\ specific\ care cedeaz\ o protein\ foarte particular\ `n membrana lor. Proteina este format\ din 1200 de aminocizi cu o structur\ repetitiv\ foarte accentuat\. Compus din 1200 de aminoacizi, acest polipeptid comport\ repeti]ii `n mai mult de 100 exemplare. Reducerea num\rului de repeti]ii `n lan]ul polipeptidic reduce activitatea glasogen\. Alte proteine care au o structur\ repetitiv\ sunt prezente de asemenea, `n sângele a numeroase specii de animale din regiunile polare, unde ele au un efect antigel. Bacteriile glasogene joac\ un rol important `n practic\ deoarece provoac\ `nghe]area `n prim\var\ a numeroase plante, `n special pomii fructiferi [i vi]a de vie. Binen]eles c\ se `ncearc\ stoparea ac]iunii acestor bacterii pe diferite c\i (tratamente chimice cu antiabiotice, pulveriz\ri cu ap\, fumiga]ii, folosirea bacteriofagilor, a microorganismelor antagoniste, aplicarea de polimeri care limiteaz\ schimburile termice cu exteriorul etc.). ~n ultimii ani s-a ob]inut prin inginerie genetic\ su[e neglasogene de Ps. syringae, care aplicate pe plante inhib\ dezvoltarea speciilor glasogene ~n sens pozitiv specia Ps. syringae glasogen\ este utilizat\ pentru ob]inerea z\pezii artificiale (Snow max).

24

Micoplasmele Micoplasmele reprezint\ un grup particular de bacterii lipsite de perete celular, la care celula este delimitat\ de o membran\ lipoproteic\, cu o compozi]ie chimic\ asem\n\toare celulei animale. Sunt considerate cele mai mici organisme capabile de cre[tere autonom\ pe medii acelulare. Micoplasmele sunt grupate `n clasa Mollicutes (moli = moale, pliabil [i cute = piele), cu dou\ genuri: - Mycoplasma, a c\rei cre[tere este dependent\ de prezen]a sterolilor `n mediu. - Acholeplasma, care se dezvolt\ independent de steroli. Morfologie. Datorit\ lipsei peretelui celular, micoplasmele au o plasticitate natural\ foarte mare, fiind descrise mai multe tipuri morfologice ca: sferice-cocoidale, diplococi, filamentoase. Cu toate acestea, cultivate `n condi]ii de mediu bine definite, fiecarespecie are o morfologie caracteristic\, `ncât polimorfismul acestora nu trebuie confundat cu pleomorfismul care implic\ obligatoriu existen]a a mai mult de o form\ celular\ distinct\, `n cursul vie]ii unui organism. Micoplasmele sunt Gram-negative. Dimensiunile lor variaz\ de la 125-250 nm la formele sferice, pân\ la 150 µm la cele filamentoase. Lipsa peretelui celular este r\spunz\toare de instabilitatea morfologic\ [i de alte propriet\]i cum ar fi: - sensibilitatea osmotic\; - rezisten]a la antibiotice care ac]ioneaz\ asupra sintezei peretelui celular (penicilina); - tendin]a de p\trundere [i cre[tere `n profunzimea mediilor; - capacitatea de a traversa filtrele bacteriene. Multiplicarea micoplasmelor se poate realiza la aceea[i specie prin diviziune, `nmugurire [i fragmentarea filamentelor. ~n condi]ii naturale micoplasmele sunt parazite, instalarea lor `n diferite organisme fiind u[urat\ de natura chimic\ a membranei similar\ membranelor gazdei. Micoplasmele produc peste 40 de boli la plante dar [i la animale [i om. Actinomicetele Actinomicetele constituie un grup mare de bacterii filamentoase, Gram pozitive, caracterizate printr-o mare varietate morfologic\. Mult\ vreme actinomicetele au fost considerate ca f\când parte din categoria ciupercilor, deoarece au particularitate de a forma hife (filmente) ramificate [i spori de diseminare. Morfologie. Majoritatea actinomicetelor au o form\ alungit\ filamentoas\, cu tendin]\ de ramificare, de unde [i aspectul lor de miceliu. Filamentele miceliene au un Ø cuprins `ntre 0,5-2 µm [i prezint\ o structur\ de tip procariot, corespunzând unor celule foarte lungi, multinucleate, f\r\ pere]i transversali. Pe medii de cultur\ solide formeaz\ colonii dense cu aspect cartilaginos sau cretos, aderente la substrat. Pe aceste colonii se formeaz\ sporofori cu spori. Sporoforii sunt diferi]i ca form\: spirala]i, drep]i sau curba]i. Sporii sunt de asemenea varia]i ca form\, fiind sferici ovali, alungi]i sau cilindrici. Suprafa]a sporilor este neted\ sau prezint\ diverse ornamenta]ii. Actinomicetele produc pigmen]i care dau miceliului aerian culori diferite (galben, portocaliu, ro[u, violet pân\ la albastru sau cenu[iu). La unele specii pigmen]ii difuzeaz\ `n mediu.

25

Metabolism. O particularitate a fiziologiei actinomicetelor este modul lor de nutri]ie omnivor, care le permite s\ se dezvolte pe substraturi organice dintre cele mai diferite. ~n condi]ii naturale, pe resturi vegetale actinomicetele `ncep s\ se dezvolte numai dup\ ce bacteriile [i ciupercile au `ncetat s\ se mai multiplice, atunci când toate substan]ele u[or asimilabile din resturile vegetale au fost descompuse de predecesorii lor. Capacitatea lor de a degrada substan]ele organice dintre cele mai complexe le confer\un rol important `n natur\, `n special, `n descompunerea substan]elor organice din n\moluri [i sol. ~n sol acestea particip\ la degradarea biologic\ [i mineralizarea substan]elor organice. Importan]a lor practic\ este legat\ `n mod deosebit prin intermediul speciilor genului Streptomyces, de producere de substan]e antibiotice (pân\ `n prezent peste 500 de antibiotice distincte). Aproximativ 50 % din tulpinile izolate `n natur\ produc antibiotice. Unele actinomicete produc boli la plante, animale [i om.

Rolul bacteriilor `n natur\ Bacteriile care tr\iesc `n natur\ joac\ un rol important `n mineralizarea

compu[ilor organici, contribuind astfel la realizarea circuitului elementelor `n natur\ (azotul, fosforul, potasiul, calciul, magneziul [i microelementele).

Bacteriile contribuie [i la formarea substan]elor humice, `mbog\]ind solul `n materie organic\.

Prin unele substan]e bacteriene de natur\ mucilaginoas\ cum sunt polizaharidele capsulare, acestea contribuie la agregarea particulelor de sol, deci la `mbun\t\]irea structurii solului.

Unele specii bacteriene au capacitatea de a produce antibiotice, care pot limita dezvoltarea unor grupe de microorganisme din sol, deci men]in sau schimb\ echilibru biologic din sol.

Unele grupe de bacterii tr\iesc `n simbioz\ cu plantele superioare producând nodozit\]i [i realizeaz\ fixarea azotului atmosferic; altele activeaz\ `n zona r\d\cinii plantelor contribuind la dezvoltarea acestora [i la sporirea activit\]ii rizosferice.

~n medii specifice unele grupe de bacterii produc procese fermentative utile ca, fermenta]ia amidonului, a pectinelor, fermenta]ia lactic\, butiric\, propionic\ etc.

Alte grupe de bacterii au capacitatea de a secreta enzime extracelulare cu care lizeaz\ unele bacterii sau ciuperci.

26

1. Bacteriile sunt organisme:

a) pluricelulare

b) acelulare

c) unicelulare

2. Bacteriile prezint\:

a) nucleu complet

b) nucleu f\r\ membran\

c) nu prezint\ nucleu

3. Celula bacterian\ este protejat\ de:

a) membran\ celular\

b) membran\ citoplasmatic\

c) perete celular

d) nu este protejat\

4. Bacteriile au dimensiuni care se m\soar\ `n:

a) mm

b) cm

c) nm

d) µm

Rezultate corecte:

1 - c; 2 - b; 3 - c; 4 - µm.


27

2.4. CYANOBACTERIILE (ALGELE ALBASTRE-VERZI) Sunt organisme procariote care folosesc apa ca donator de electroni [i

`n prezen]a luminii produc oxigen. Mecanismul lor fotosintetic este identic cu cel al algelor eucariote.

Celulele prezint\ un perete rigid, multistratificat, asem\n\tor cu cel de la bacteriile Gram-negative. Peretele celular poate fi acoperit la exterior cu o teac\ gelatinoas\ sau fibroas\. Cele mai multe Cyanobacterii sunt mobile `ntr-un anumit stadiu de dezvoltare, având o mobilitate de tip glisant, asem\nându-se cu bacteriile filamentoase glisante de tip Beggiatoa.

Pigmen]ii fotosintetizan]i sunt reprezenta]i numai de clorofila "a" [i deficobiliproteine (alloficocyanina, ficocyanina [i uneori ficoeritrina). ~n citoplasm\ se observ\ vacuole cu gaze ce au rol de flota]ie.

Unele cyanobacterii sunt unicelulare, iar altele filamentoase, formând lan]uri mai lungi.

Cyanobacteriile sunt strict fotoautotrofe [i nu se pot dezvolta numai `n prezen]a substan]elor organice, nu au nevoie de vitamine ca factor de cre[tere, iar ca surs\ de azot folosesc azota]ii, s\rurile de amoniu, iar unele specii folosesc azotul molecular, fiind fixatoare de azot (Nostoc [i Anabaena).

Sunt mult r\spândite `n sol, `n apele dulci [i ape s\rate din m\ri [i oceane. Sunt mai tolerante fa]\ de condi]iile extreme nefavorabile decât algele eucariote.

Ele constituie primele organisme ce populeaz\ rocile dezagregate, participând la procesul de solificare [i favorizeaz\ dezvoltarea `n masa lor mucilaginoas\ a unor bacterii fixatoare de azot `ntre care Azotobacter [i Clostridium.

Dintre cyanobacterii mai r\spândite `n natur\ sunt genurile Gloeocapsa [i Chroococcus care sunt organisme unicelulare. Alte grupe sunt filamentoase ca, Oscillatoria [i Lyngbia. Genurile Nostoc [i Anabaena ce au capacitate de a fixa azotul molecular tr\iesc `n solurile umede din orez\rii, unde asigur\ N2 necesar plantelor.

2.5. PROTOZOARELE Sunt organisme unicelulare la care se cunoa[te un anumit ciclu evolutiv

[i care reprezint\ vie]uitoare complete [i independente, fiind cuprinse `n `ncreng\tura Protozoa, regn. Protista..

Celula unui protozor se compune din protoplasm\, `n care se g\sesc incluziunile granulare, condriozomii, precum [i diferite substan]e de rezerv\. De asemenea, se g\sesc unul sau mai mul]i nuclei cu forme [i structuri diferite.

Ca substan]e de rezerv\ `n celulele de protozoare s-au descoperit; amidonul, glicogenul, leucozina, gr\simi [i substan]e proteice de rezerv\ cum este volutina.

~nmul]irea protozoarelor se face pe cale asexuat\ prin `mp\r]irea celulei `n dou\ p\r]i aproape egale, `n urma c\rui proces apar dou\ celule fiice. ~nmul]irea sexuat\ are loc dup\ mai multe diviziuni simple, prin conjugare `ntre game]i. ~n urma contopirii game]ilor iau na[tere zigo]ii care `n condi]ii neprielnice se transform\ `n zigochi[ti sau chi[ti de repaus care au o mare rezisten]\ la temperaturi nefavorabile, concentra]ii mari de s\ruri solubile, usc\ciune sau acumulare `n mediul ambiant a unor factori nocivi. La revenirea condi]iilor favorabile, din zigochi[ti apar indivizi obi[nui]i.

28

~n sol sunt r\spândite protozoare din urm\toarele clase: Rhizopoda, Sarcodina, Mastigophora (Flagelata) [i Infusoria (Cilliata).

Din clasa Sarcodina cele mai r\spândite genuri sunt: Negleria, Amoeba.

Clasa Mastigophora (Flagelata) are `n sol forme autotrofe cât [i heterotrofe. Cele autotrofe posed\ `n celule cromatofori. Ca reprezentan]i avem genurile Bodo, Euglena.

Clasa Infusoria (Ciliata) cuprinde protozoare care se mi[c\ cu ajutorul a numero[i cili care sunt excrescen]e protoplasmatice. Din acest grup ca reprezentan]i cit\m: Paramoecium, Balantiophorus [i Colpoda.

Rolul protozoarelor `n sol este secundar fa]\ ce acele al bacteriilor [i ciupercilor. Ele sunt `n majoritate pr\d\tori ce se hr\nesc cu bacterii [i se g\sesc `n sol `ntre 10.000 pân\ la câteva sute de exemplare la grmul de sol. Ca micropr\d\tori protozoarele contribuie la diminuarea num\rului de bacterii `n sol.

~n acela[i timp s-a constatat c\ prin moartea lor protozoarele pun la dispozi]ia microorganismelor surse nutritive care stimuleaz\ cre[terea num\rului acestora `n sol.

~n unele experien]e cu Azotobacter `n culturile la care s-au ad\ugat protozoare (Colpidium colpoda), s-a fixat mai mult azot decât la culturile martor.

Se trage de aici concluzia c\ protozoarele fagocitând bacteriile, formeaz\ colonia s\ produc\ mai multe celule tinere care sunt mai active `n fixarea azotului molecular. Pe de alt\ parte se presupune c\ protozoarele ar elimina `n mediu de cultur\ unele substan]e stimulatoare pentru dezvoltarea bacteriilor.

Dup\ al]i autori `n afar\ de ac]iunea indirect\ asupra biologiei solului, protozoarele ar contribui [i la formarea humusului.

2.6. CIUPERCILE Ciupercile reprezint\ un grup numeros la care se cunosc cca. 100.000

de specii, fiind cuprinse `n regnul Fungi. De asemeni, ele constituie o component\ important\ a microflorei

solului la care s-au identificat peste 170 de genuri [i peste 800 de specii. Frecven]a lor `n sol variaz\ `ntre 8.000 [i 1.000.000 de indivizi pe gramul de sol.

Ciupercile au un rol important `n natur\ participând `n descompunerea substan]elor organice; formeaz\ asocia]ii sub form\ de micoriz\ cu r\d\cinile plantelor; produc substan]e antibiotice participând `n acest fel la antagonismul microbian [i la reglarea echilibrului biologic `n sol.

Morfologia ciupercilor Aparatul vegetativ este un tal prezint\ cu constitu]ie variat\ iar

complexitatea acestuia cre[te pe m\sura evolu]iei filogenetice. Astfel, la ciupercile din sub`ncreng\tura Mastigomycotina aparatul vegetativ este o celul\ nud\ - gimnoplast su o asocierede gimnopla[ti ce formeaz\ un plasmodiu.

La ciupercile din Zigomycotina aparartul vegetativ cu aspect filiform este un sifonoplast, neseptat, format din hife simple sau ramificate.

La ciupercile din sub`ncreng\tura Ascomycotina, Basidiomycotina [i Deuteromycotina, aparatul vegetativ poate fi unicelular, sub form\ de dermoplast ca la Saccharomycetaceae, iar la majoritatea este un tal filamentos pluricelular, format din hife septate.

29

Talul ciupercilor poate fi filamentos la ciupercile microscopice, sau masiv la unele ciuperci din sub`ncreng\tura Basidiomycotina, formând corpuri de fructificare de dimensiuni vizibile cu ochiul liber (carpofori).

Reproducerea ciupercilor Ciupercile se pot reproduce pe mai multe c\i [i anume: - vegetativ, prin fragmente de tal sau prin `nmugurire; - asexuat, prin spori haploidali ce apar pe corpi de fructificare special

forma]i pe miceliu; - sexuat, prin unirea game]ilor care dau produ[i de fecunda]ie ce poart\

denumiri diferite ca: zigo]i, asce [i bazidii. ~n urma procesului de reducere cromatic\ se revine la faza asexuat\

reprezentat\ prin spori haploidali ce poart\ denumirea de spori imobili, zoospori, ascospori sau bazidiospori, dup\ gruparea sistematic\ din care ciupercile fac parte.

Cre[terea Cre[terea filamentelor miceliene este strict apical\ comparativ cu

cre[terea intercalar\ cunoscut\ la alte organisme filamentoase. Apexul hifelor este bogat `n vezicule ce con]in hidrolaze [i sintezaze,

necesare cre[terii `n lungime. Acumularea apical\ a veziculelor implic\ o circula]ie acropetal\ a con]inutului citoplasmatic, afluxul de elemente nutritive realizându-se din regiunile mature `n zonele de cre[tere.

Dac\ veziculele purt\toare de enzime de cre[tere sunt prea numeroase, apar ramifica]ii laterale la câ]iva µm distan]\ de apex.

La un moment dat apare o concuren]\ trofic\ `ntre axul principal [i ramifica]iile principale, secundare sau ter]iare, dat\ `n principal de con]inutul mai sc\zut al mediului `n elemente nutritive.

Nutri]ia. Ciupercile sunt organisme total lipsite de pigmen]i asimilatori,

prezentând o nutri]ie heterotrof\. Dup\ felul substratului folosit ciupercile se `mpart `n: - saprofite, care se dezvolt\ numai pe substraturi organice `n

descompunere; - facultativ parazite, sunt cele care `n majoritatea timpului se dezvolt\

pe substraturi `n descompunere, dar `n anumite condi]ii se dezvolt\ [i parazit; - facultativ saprofite, sunt ciupercile care `n mod normal se dezvolt\ ca

parazite, dar `ntr-o anumit\ perioad\ a ciclului ontogenetic cu o nutri]ie saprofit\;

- parazite, care se dezvolt\ numai `n ]esuturi vii, neputând fi cultivate pe medii artificiale.

Cerin]e fa]\ de mediu Temperatura. Majoritatea ciupercilor sunt mezofile cu un optim de

cre[tere situat `ntre 25-35oC. Unele specii sunt termotolerante (20-50oC). Temperatura maxim\ limit\ de dezvoltare este de 60-62oC. Ciupercile

termofile joac\ un rol important `n procesele de degradare a compostului. PH-ul. Majoritatea ciupercilor pot s\ se dezvolte `ntr-o zon\ de pH

cuprins `ntre 4,5-8. Optimul fiind situat `ntre 5,5-7,5. Exist\ specii de ciuperci acidofile cu cre[tere la un pH inferior lui 4,5

sau acido-tolerante. Aera]ia.Unele specii de ciuperci sunt microaerofile, altele sunt strict

anaerobe, dar majoritatea sunt aerobe.

30

1. Cyanobacteriile sunt:

a) procariote

b) eucariote

c) entit\]i infec]ioase

2. Protozoarele sunt:

a) animale unicelulare

b) plante

c) organisme unicelulare independente

3. Ciupercile au o nutri]ie:

a) autotrof\

b) heterotrof\

c) paratrof\

Rezultate corecte:

1 - a; 2 - c; 3 - b.


31

Pozi]ia microorganismelor `n lumea vie

1. Regnul Procaryotae (bacterii, cianobacterii = alge albastre-verzi); 2. Regnul Protista (protozoare, diatomee); 3. Regnul Fungi (ciuperci); 4. Regnul Plantae (alge verzi, brune, ro[ii, brofite, traheofite); 5. Regnul Animalia (animale multicelulare).

Prionii sunt molecule proteice cu greutatea molecular\ de 27 kilodaltoni, alc\tuite dintr-un lan] de 240 de aminoacizi.

Virusurile sunt entit\]i infec]ioase constituite din protein\ [i un acid nucleic. Morfologia virusurilor

form\ cilindric\-alungit\ sau de bastona[; form\ sferic\ (izometric\), form\ paralelipipedic\ form\ de cartu[ sau obuz form\ de mormoloc, sau cirea[\ cu coad\

Dimensiunile virusurilor = 17 nm - 2500 nm. Structura virusurilor

Genomul viral (ADN sau ARN, niciodat\ ambele) [i capsida viral\ alc\tuit\ din subunit\]i proteice

Bacteriile Sunt organisme unicelulare cu o structur\ complex\ de tip procariot. Morfologia bacteriilor - bacterii sferice (coci). - bacterii sub form\ de bastona[ (bacili). - bacterii spiralate. - bacterii filamentoase. - bacterii p\trate. Structura celulei bacteriene

♦ Structura extraparietal\ format\ din: capsul\; cilii sau flagelii; aparatul fimbrial [i pilii de sex.

♦ Peretele celular. ♦ Structura intraparietal\ compus\ din: membrana citoplasmatic\, mezozomii, citoplasm\, aparatul nuclear, incluziunile, ribozomii, vacuolele, sporul bacterian. Grupe particulare de bacterii

Bacteriile glasogene Micoplasmele Actinomicetele Cyanobacteriile (algele albastre-verzi)

Sunt organisme procariote, fotoautotrofe, chimiosintetizante. Protozoarele. Sunt organisme unicelulare, mobile, heterotrofe, eucariote. Ciupercile. Sunt organisme heterotrofe, eucariote.

Morfologia ciupercilor. Aparatul vegetativ poate fi: gimnoplast, plasmodiu, sifonoplast, tal filamentos, tal masiv. Reproducerea ciupercilor se poate realiza: vegetativ, asexuat, sexuat. Nutri]ia. Dup\ felul substratului folosit ciupercile se `mpart `n: saprofite, facultativ parazite, facultativ saprofite, parazite.

REZUMAT MODUL I

32

MICROBIOLOGIA SOLULUI 1.SOLUL CA MEDIU DE VIA}| PENTRU MICROORGANISME

Solul a fost definit `n diferite feluri. Accept\m defini]ia ce consider\ solul ca rezultat al unui proces istoric `ndelungat [i care se formeaz\ sub influen]a factorilor naturali [i ai activit\]ii omului. Dintre factorii naturali men]ion\m: natura rocii-mam\, climatul zonei, vegeta]ia, relieful [i vârsta solului. Nici unul dintre factorii men]iona]i nu poate fi considerat unic sau preponderent `n formarea solului, deoarece ei ac]ioneaz\ simultan. Solul apare, astfel, ca rezultat al interac]iunilor `ndelungate `ntre aer [i p\mânt, pe de o parte, [i `ntre plante [i animale, pe de alt\ parte; "un corp istoric natural care s-a format din roc\ prin influen]a simultan\ a factorilor fizici, chimici [i biologici" (Fedorov, 1954). De aici rezult\ c\, solul poate asigura condi]ii favorabile pentru cre[terea, dezvoltarea [i `nmul]irea microorganismelor [i plantelor, care, la rândul lor, contribuie la formarea [i fertilitatea solului. Solul, pentru ca s\ ofere condi]ii vitale optime microorganismelor care `l populeaz\, trebuie s\ `ndeplineasc\ unele condi]ii chimice [i fiziologice, care se realizeaz\ fie prin fenomene naturale, fie prin dirijarea lor de c\tre om, prin diferite metode de `ntre]inere [i exploatare. Prezen]a microorganismelor `n sol este influen]at\ `n primul rând, de condi]iile sta]ionare ale mediului. Cele care tr\iesc continuu `n sol se adapteaz\ la condi]ii sta]ionare specifice. Aceste condi]ii depind, `n mare m\sur\, de natura solului, adic\ de compozi]ia lui granulometric\ [i de tipul de sol (al stadiului s\u de dezvoltare). Aceste condi]ii particulare ale solului, coroborate cu ac]iunea factorilor ecologici, contribuie hot\râtor la aprecierea activit\]ii popula]iei din sol [i a structurii ei. Popula]ia solului Popula]ia solului este constituit\ din totalitatea vie]uitoarelor care exist\ `n sol. Ele au o mare diversitate de forme, dimensiuni, apartenen]\ sistematic\ [i activitate biologic\. Cele care au dimensiuni mai mari formeaz\ macropopula]ia solului, ele fiind studiate din cele mai vechi timpuri. Restul de vie]uitoare au fost puse `n eviden]\ numai dup\ perfec]ionarea mijloacelor de m\rire a imaginii, ele formând micropopula]ia solului. Macropopula]ia este reprezentat\ de macroflor\ [i macrofaun\. Macroflora, este format\ din p\r]ile subterane (r\d\cini, tulpini [i frunze ajunse `n sol, organe sub diverse forme) ale plantelor superioare (agricole, horticole, buruieni etc.) care furnizeaz\ solului cea mai important\ surs\ de materie organic\. R\d\cinile au `n plus un rol important [i `n modificarea concentra]iei solu]iei solului (ca urmare a procesului de adsorb]ie) [i `n eliminarea a numeroase substan]e (`n special enzime) care intervin direct

MODULUL II

MICROBIOLOGIA SOLULUI

33

`n activitatea microorganismelor. Datorit\ acestor condi]ii specifice, num\rul de microorganisme aflate `n jurul r\d\cinilor (rizosfer\) dep\[e[te cu mult pe cel aflat `n restul solului. Macrofauna, cuprinde o diversitate mare de organisme, dintre care amintim: protozoarele, nematozii (circa 10 mii/mp), viermii inela]i, râmele (90-500 kg/ha), furnicile, coleopterele [i diverse vertebrate care, prin activitatea lor, `mbog\]esc solul `n materie organic\, ce va fi utilizat\ de microorganisme. Micropopula]ia din sol este reprezentat\ de microflor\ [i microfaun\. Microflora constituie popula]ia cea mai important\ pentru via]a solului. Ea este format\ din bacterii, cyanobacterii, ciuperci microscopice [i alge. Cea mai important\ indica]ie asupra activit\]ii microorganismelor din sol este dat\ de num\rul lor `n unitatea de volum, de greutate sau de suprafa]\. Valoarea absolut\ a unor microorganisme raportat\ la un gram de sol, variaz\ `ntre 1 milion-1 miliard de bacterii, `ntre 5.000-50.000 la ciuperci, `ntre 3.000-30.000 la actinomicete [i 500-5.000 la alge (la adâncimea de 2-5 cm). Microfauna solului este constituit\ din protozoare monocelulare (`ntre 100-1.000 buc./g sol), dintre care cele mai numeroase apar]in `ncreng\turii Flagellate. De[i ac]iunea lor este cunoscut\, rolul protozoarelor `n sol nu este pe deplin clarificat. Num\rul microorganismelor din sol [i componen]a lor constituie un important criteriu practic `n aprecierea activit\]ii biologice a acestora. Pentru edificarea complet\ a acestei activit\]i, este necesar\ [i cunoa[terea activit\]ii biochimice a microorganismelor.

2. CIRCUITUL AZOTULUI Azotul este un element esen]ial pentru existen]a vie]ii `n biosfer\,

deoarece este `nclus `n structura tuturor proteinelor [i a acizilor nucleici. De[i este prezent `n natur\ `n cantit\]i foarte mari, se g\se[te aproape invariabil `n forme inaccesibile plantelor [i animalelor.

Circuitul azotului `n natur\ se desf\[oar\ pe parcursul a mai multor etape care implic\ desf\[urarea unor multiple activit\]i biochimice, unele au loc `n anaerobioz\ iar altele `n prezen]a oxigenului.

Aceste etape sunt: ♦ fixarea N2; ♦ amonificarea; ♦ nitrificarea; ♦ denitrificarea. I. Fixarea azotului molecular care se poate realiza pe cale abiotic\ [i

biotic\. Pe cale abiotic\ fixarea se realizeaz\ prin iradieri, desc\rc\ri electrice

[i prin intermediul precipita]iilor. Pe cale biotic\ fixarea azotului molecular este un proces lent [i

continuu prin care, sub ac]iunea a peste 100 genuri de bacterii diferite, azotul gazos atmosferic este convertit la forme fixe (NH4

-, NO3-, NO2

-), care sunt folosite de plante [i introduse `n forme organice utilizând energia ob]inut\ prin fotosintez\.

Bacteriile care particip\ la aceast\ fixare au fost grupate astfel: - bacterii fixatoare de N2 libere aerobe; - bacterii fixatoare de N2 libere anaerobe; - bacterii fixatoare de N2 care tr\iesc `n asocia]ie cu plantele.

34

~n cazul celui de-al treilea grup `n func]ie de rela]ia care se stabile[te `ntre cei doi parteneri:

♦ simbioza Rhizobium - leguminoase; ♦ simbioza Actinomicete - neleguminoase; ♦ simbioza asociativ\.

II. Amonificarea, const\ `n mineralizarea azotului proteic pân\ la NH3. III. Nitrificarea cu cele dou\ trepte intermediare: nitritarea [i nitratarea

`n care are loc oxidarea NH3 pân\ la nitri]i respectiv nitra]i. IV. Denitrificarea este procesul prin care are loc reducerea azotului

nitric pân\ la azot molecular, `ncheindu-se `n acest mod circuitul azotului. Toate procesele desf\[urate pe parcursul celor patru etape sunt mediate

numai de bacterii, cu excep]ia unei etape premerg\toare amonific\rii, proteoliza `n care pot ac]iona [i microfungii.

~n timp ce `n ecosistemele naturale, circuitul azotului este un proces echilibrat, `n sensul c\ pierderile de azot din sol sunt compensate de procesele de fixare, `n sistemele supuse procesului de agricultur\, pierderile dep\[esc ritmul de `nlocuire.

Dac\ rezervele de azot din sol sunt limitate, fapt ce duce la apari]ia unor frecvente dezechilibre `ntre nevoia de azot [i posibilitatea de a o satisface, din contr\, rezerva de azot atmosferic, este practic inepuizabil\, calculele ar\tând c\ aceasta ar putea asigura necesarul pentru cel pu]in 800.000 ani. Din p\cate aceast\ imens\ cantitate este inaccesibil\, direct, organismelor vii [i mai cu seam\ plantelor superioare.

~n cursul ultimilor decenii datorit\ nevoilor crescânde de hran\ pentru o popula]ie `n permanent\ dezvoltare, cantit\]ile de `ngr\[\minte chimice cu N2 aplicate au crescut continuu. De[i o perioad\ de timp, `ngr\[\mintele chimice cu N au `ndrept\]it speran]ele rezolv\rii [i pe viitor a satisfacerii nevoilor nutritive pentru popula]ie, criza energetic\ a ultimilor ani [i apari]ia unor efecte secundare nedorite, a impus reconsiderarea acestei posibilit\]i.

Azotul atmosferic este convertit, industrial `n NH3 prin procedeul Haber. Reac]ia are loc la temperaturi ridicate de cca. 500oC [i la o presiune de 300-600 atmosfere, ceea ce presupune un consum ridicat de energie de cca 22.000 kcal/kg.

~n acela[i timp excesul de `ngr\[\minte chimice cu azot are efecte negative asupra mediului [i uneori asupra omului prin produsele vegetale pe care acesta le consum\.

Cre[terea con]inutului `n protein\ la plante sub influen]a `ngr\[\mintelor cu azot are loc `n limita poten]ialului genetic al speciei sau soiului. De aceea excesul de azot duce la o serie de deranjamente [i la acumularea de azot nitric `n plante. Aceste acumul\ri `n plantele furajere sau alimentare provoac\ intoxica]ii grave ce pot duce chiar la moartea individului.

La copii, nitra]ii, sunt redu[i la nitri]i care fiind absorbi]i de sânge reduc capacitatea acestuia de a transporta oxigenul prin formarea metahemoglobinei.

La adul]i, nitra]ii sunt converti]i la nitrosamin\ care, de asemenea este otr\vitoare.

Folosirea `n doze excesive a azotului duce la sp\larea acestuia [i la `mbog\]irea `n nitra]i a pânzei de ap\ freatic\ care poate fi utilizat\ ca ap\ potabil\ sau `n ad\patul animalelor.

De asemenea, utilizarea intensiv\ a `ngr\[\mintelor chimice duce la cre[terea con]inutului solului `n unele elemente (Zn, Pb, Ni, Cr etc.) care anterior se g\seau `n forme solubile doar ca urme.

Cre[terea concentra]iei acestora peste o anumit\ limit\, având efecte toxice asupra plantelor [i microorganismelor (Davidescu, 1974).

35

Datorit\ crizei energetice [i efectelor secundare ale `ngr\[\mintelor chimice cu N, o aten]ie tot mai mare se acord\ `n ultimul timp mecanismelor naturale de fixare a azotului `n sol [i `n special fixarea biologic\.

Prin procesele de fixare biologic\ sunt introduse `n sol cantit\]i foarte mari de azot.

Microorganismele fixatoare de azot posed\ un complex enzimatic denumit nitrogenaz\ capabil s\ activeze tripla leg\tur\ a moleculei de azot, care poate fi astfel redus\ la amoniac.

Procesul de desf\[oar\ la o temperatur\ relativ sc\zut\ de 15-40oC frecvent `ntâlnite `n sol [i la presiune atmosferic\ normal\.

~n func]ie de numero[i factori, dar mai ales de planta de cultur\, cantitatea de azot atmosferic fixat\ biologic variaz\ `ntre limite foarte largi.

Legat de acest aspect, `n anul 1971 Hank a sintetizat rezultatele din literatura de specialitate pentru diferite ecosisteme, astfel:

- culturi de câmp 7-28 kg N/ha; - angiosperme [i alte plante neleguminoase 7-114 kg N/ha; - leguminoase 73-865 kg N/ha; - p\dure 58-594 kg N/ha; - p\[uni 13-99 kg N/ha; - ape 70-250 kg N/ha. Fenomenul de fixare a azotului de c\tre microorgansime a fost pus `n

eviden]\ `n anul 1888 de c\tre Berthelot. Acesta a urm\rit `n paralel varia]ia azotului `n vase cu sol nesteril [i `n vase cu sol steril, constatând c\ `n solul nesteril con]inutul `n azot cre[te, pe cât\ vreme `n vasele cu sol sterilizat nu.

Fixarea N2 de microorganisme libere aerobe ~n anul 1901 Beijerinck reu[e[te izolarea din sol a dou\ specii de

bacterii, care au capacitatea de fixare aerob\ a azotului molecular. Ulterior, cercet\rile au eviden]iat existen]a [i a altor specii capabile s\

realizeze acest proces. Dintre cele mai cunoscute specii putem enumera: - Azotobacter chroococcum; - Azotobacter vinelandii; - Azotobacter agile; - Azotobacter insigne; - Azotobacter macrocytogenes; - Azotobacter mobile; - Azotobacter fluminensis; - Beijerinckia indica; - Derxia gummosa; - Rhodospirillum sp.; - Rhodopseudomonas sp. Dintre acestea cele mai r\spândite [i mai cunoscute sunt cele din genul

Azotobacter. Bacteriile din genul Azotobacter sunt r\spândite `n natur\ mai ales `n

solurile cultivate, bogate `n humus cu reac]ie neutr\ [i se g\sesc rar `n solurile acide, podzolice, turboase [i ml\[tinoase.

Morfologia lor este foarte variabil\ `n func]ie de condi]iile de mediu, fapt ce explic\ descrierea la un moment dat a numerose specii separate care ulterior au fost considerate ca sinonime.

Dintre speciile genului Azotobacter cea mai r\spândit\ [i mai eficace este Azotobacter chroococcum.

Azotobacter chroococcum prezint\ o serie de aspecte morfologice considerate ca f\când parte dintr-un ciclu de evolu]ie corelat cu vârsta.

36

~n func]ie de vârsta coloniei celulele apar diferen]iat: 1. Celule tinere, au aspect de bastona[e groase de 2 x 4 µm, cu capetele

rotunjite, izolate sau `n perechi. 2. Celulele adulte, sunt sferice sau ovale ca ni[te coci mari de 2 x 1,2

µm, con]inând numeroase granula]ii constituite din lipide, volutin\, glicogen etc.

3. Celulele b\trâne care apar `n a 5-a zi de dezvoltare a culturii, sunt aproape sferice [i au dimensiuni mai mici de 1,5 x 1,3 µm. ~n condi]ii nefavorabile de mediu apar chi[tii.

Chi[tii sunt prev\zu]i cu un perete gros, format din dou\ straturi [i apar prin modificarea celulelor adulte sau a celulelor b\trâne. Ace[tia mai poart\ numele de macrochi[ti.

Citoplasma lor este constituit\ din protein\ concentrat\. Chistul este o form\ latent\, de rezisten]\ a germenului, care sub

aceast\ form\ se men]ine viabil mai multe luni sau chiar ani. Prin germinare, din chi[ti iau na[tere celule tinere care reiau ciclul descris.

~n condi]ii de cultur\ pe medii lichide Azotobacter formeaz\ un v\l gros la suprafa]\, albicios, care cade treptat la fund, formeaz\ un depozit dens albicios [i care mai târziu devine brun-negru.

Pe mediile solide formeaz\ colonii lucitoare, la `nceput incolore, vâscoase, cu tendin]a de scurgere prin glisare pe suprafa]a mediului. Cu timpul ele se coloreaz\ `n brun-negru, datorit\ pigmentului melanic.

Bacteria se dezvolt\ la temperatura cuprins\ `ntre 9-35oC [i la un pH `ntre 5,8-8,5, fiind foarte sensibil\ la aciditate sub pH=5,8.

Este strict aerob\, Gram negative [i oxideaz\ complet hidra]ii de carbon pân\ la CO2, f\r\ a produce `n mediu metaboli]i intermediari. ~n condi]ii optime fixeaz\ aproximativ 20 mg N2 pentru fiecare gram de glucide oxidate.

Randamentul fix\rii este variabil de la o tulpin\ la alta, dup\ natura sursei de carbon. Deosebirile dintre diferitele tulpini constau `n viteza ac]iunii lor, unele fiind `n stare s\ fixeze `n 3 zile 100 % din concentra]ia final\, `n timp ce altele realizeaz\ fixarea `ntregii cantit\]i numai dup\ 12 zile.

Fixarea anaerob\ a azotului molecular Fixarea anaerob\ a N2 a fost eviden]iat\ `nc\ din 1893 de Winogradski

care a reu[it izolarea [i cultivarea pe un mediu nutritiv lipsit de N, a speciei Clostridium pasteurianum, specie mult r\spândit\ `n sol.

Ulterior au fost descrise [i alte specii anaerobe care apar]in genurile: Desulfovibrio sp., Desulfatomaculum sp., Methanobacillus sp.

Clostridium pasteurianum, face parte din grupul bacteriilor butirice. Se prezint\ `n cazul formelor tinere vegetative sub form\ de bastona[ Gram pozitiv, cu capetele rotunjite, cu dimensiuni variabile, cuprinse `ntre 1,5-8 x 0,8-1,3 µm. Este mobil, cu cili dispu[i peritrichi, adesea fuziform. La celulele b\trâne apar forme de involu]ie filamentoase sau cocoide, iar con]inutul celulelor este granulos [i se coloreaz\ `n violet cu solu]ie iodurat\ Lugol, con]inând substan]e iodofile.

Bacteria prezint\ un spor central cu diametrul de 1-1,3 µm; este un microorganism anaerob obligat, care se dezvolt\ `n condi]ii optime la 20-30oC [i la un pH = 7,3-8,9.

Cultivat pe un mediu ce con]ine substan]e hidrocarbonate dar, lipsit de N, ob]ine energie din fermentarea acestora [i fixeaz\ N2 atmosferic. Cantitatea de N fixat este propor]ional\ cu cantitatea de glucoz\ fermentat\ [i este de aproximativ 3 mg pe gramul de glucoz\ consumat\.

Randamentul fix\rii N, de c\tre Clostridium pasteurianum este maxim când este asociat\ cu bacteriile celulolitice anaerobe care pun la dispozi]ie

37

hidra]i de carbon solubili ca glicerina sau manita care se g\sesc `n sol `n concentra]ii mici.

Fixare anaerob\ a N2 are un rol esen]ial `n solurile pu]in aerate sau invadate de ap\ (mla[tini, orez\rii) unde Clostridium pasteurinum este principalul fixator de azot.

~n ceea ce prive[te propor]ia dintre cele dou\ specii descrise, Fedorov arat\ c\ `n soluri Azotobacter chroococcum a fost g\sit numai `n 30 % din cazuri, `n timp ce Clostridium pasteurianum `n 70 %, având deci o preponderen]\ mai mare.

Simbioza asociativ\ Prima semnalare a fix\rii N2 de microorganisme asociative a fost f\cut\

`n anul 1974. Cercet\rile efectuate au pus `n eviden]\ existen]a a mai multor specii de

bacterii ale genului Azospirillum sp., Bacillus sp., Klebsiella sp., care tr\iesc `n asocia]ie cu r\d\cinile unor graminee.

- Azospirillum lipoferum - porumb; - Azospirillum brasilense - grâu, orez; - Bacillus macerans - porumb; - Klebsiella pneumoniae - Poa pratensis. ~n România prima semnalare a fost realizat\ `n anul 1980 de c\tre Hera. Fixarea asociativ\ este mai r\spândit\ de aproximativ 5 ori `n zonele

tropicale fa]\ de zona temperat\.

Simbioza Rhizobium - leguminoase ~n solurile cultivate cu leguminoase, `n afar\ de fixarea N2 atmosferic

de c\tre bacteriile libere aerobe sau anaerobe se mai produce [i fixarea de c\tre microorganismele simbiotice care tr\iesc `n nodozit\]ile de pe r\d\cinile acestor plante.

De[i formarea de nodozit\]i pe r\d\cinile plantelor leguminoase se cunoa[te din antichitate, fenomenul era considerat ca un proces patologic, tumoral sau datorat unor `n]ep\turi de insecte.

Abia `n 1865, Voronin a descris nodozit\]ile [i corpusculii ce-i con]in, iar `n 1887 Beijerinck a izolat [i descris bacteriile care le produc.

Biologia bacteriilor de nodozit\]i Bacteriile care produc nodozit\]i la leguminoasele cu care tr\iesc `n

simbioz\, apar]in genului Rhizobium care cuprinde mai multe specii distincte, cu capacitatea de a infecta numai anumite plante gazde, dup\ cum urmeaz\: Rhizobium leguminosarum - maz\re, bob, linte, R. trifolii - trifoiul, R. japonicum - soia, R. phaseoli - fasolea, R. lupini - lupinul, R. meliloti - lucerna.

Activitatea diferitelor specii de Rhizobium este variabil\ de la o specie la alta, `n func]ie de dou\ propriet\]i biologice importante: infec]iozitatea, care reprezint\ capacitatea de a produce nodozit\]i [i eficien]a, care se refer\ la capacitatea de a fixa N2.

Bacteriile ajung `n zona rizosferic\ la nivelul peri[orilor absorban]i fiind stimulate de secre]iile radiculare care au rol chimiotactic pozitiv, dup\ care are loc un proces de recunoa[tere a celor doi parteneri. Recunoa[terea se realizeaz\ prin intermediul unor substan]e specifice denumite generic lectine. Dup\ legarea ireversibil\ are loc deformarea peri[orului radicular, care ia form\ de cârlig, sub ac]iunea unor substan]e eliminate de bacterii.

Ulterior, peretele peri[orului absorbant este dizolvat sub ac]iunea unor enzime secretate de bacterii [i acestea p\trund `n interior formând un cordon de infec]ie care ajunge `n celulele parenchimului cortical.

38

Cordonul este format la `nceput dintr-o matrice mucoas\ `n care se g\sesc bacterii [i care treptat se acoper\ cu o teac\ celulozic\. Acest man[on este constituit din secre]ii ale ambilor parteneri.

Pe m\sur\ ce cordonul infec]ios `nainteaz\, bacteriile se multiplic\ continuu [i sunt eliberate fie prin unele fisuri ale acestuia, fie prin extremitatea lui distal\ [i se a[eaz\ la periferia celulelor unde se multiplic\ activ. ~n acela[i timp celulele cortexului radicular infectat se multiplic\ rapid, transmi]ând infec]ia bacterian\ celulelor fiice.

Rezultatul acestei prolifer\ri este nodozitatea, care la `nceput este inclus\ `n cortexul radicular, apoi `l deformeaz\ pe m\sur\ ce cre[te [i `n cele din urm\ `l rupe.

Ea apare ca rezultat al invad\rii [i multiplic\rii bacteriilor `n celulele gazde [i al ac]iunii unor substan]e stimulente de tipul auxinei (acid indolilacetic), secretate de bacterii.

La leguminoasele erbacee anuale nodulul este o structur\ efemer\, `n timp ce la cele perene dureaz\ 5-6 ani, dup\ care sufer\ modific\ri degenerative care duc la necrozarea [i deta[area lui de r\d\cin\.

S-a constatat c\ `n procesul fix\rii N2 nu toate nodozit\]ile sunt la fel de active, ele `mp\r]indu-se `n dou\ categorii:

♦ Nodozit\]i "eficiente", sunt relativ pu]in numeroase [i se formeaz\ mai ales pe r\d\cinile principale; sunt mai voluminoase [i au o suprafa]\ neted\ sau rugoas\. Aceste nodozit\]i con]in un pigment ro[u de natur\ proteic\, leghemoglobina (hemoglobina leguminoaselor).

Nodozit\]ile eficiente au o structur\ caracteristic\ fiind constituite din mai multe regiuni:

- regiunea periferic\ este reprezentat\ de cortexul nodozit\]ilor, format din mai multe straturi de celule, compacte, cu rol de protec]ie;

- regiunea meristematic\, este situat\ `n regiunea distal\ cu nodozit\]i formate din celule neinfectate [i asigur\ cre[terea nodozit\]ilor prin diviziune;

- regiunea central\ este alc\tuit\ din trei zone distincte: a - zona de invazie, situat\ sub meristem, este format\ din celule

neinfectate [i celule m\rite, infectate; b- zona simbiotic\, ocup\ por]iunea cea mai mare din nodozit\]i

[i prezint\ dou\ subzone: - subzona simbiotic\ timpurie, cu celule ce con]in bacterii care nu prolifereaz\; - subzona simbiotic\ tardiv\, celule pline cu bacterii. Este zona de fixare activ\ a N2.

c - zona de senescen]\, corespunde celulelor [i bacteriilor `n curs de degenerare sau moarte.

♦ Nodozit\]ile "neeficiente", sunt mai numeroase, mai mici, cu suprafa]a neted\ [i sunt r\spândite pe tot sistemul radicular. Infec]ia lor este foarte limitat\, ele con]in foarte pu]ine bacterii. Activitatea lor dureaz\ numai câteva zile, iar fa]\ de celelalte sunt nepigmentate.

Mecanismul simbiozei plant\-bacterie Bacteriile simbiotice iau energia necesar\ asimil\rii azotului molecular,

prin procedee de degradare a substan]elor hidrocarbonate furnizate de planta gazd\.

La rândul lor bacteriile asimileaz\ N2 atmosferic pân\ la stadiul de acid aspartic care este preluat de plant\. Aceasta, prin transaminare enzimatic\ `n prezen]a acidului piruvic sintetizeaz\ alanina.

~n continuare planta gazd\ sintetizeaz\ ceilal]i aminoacizi, prin transaminare, pornind de la alanin\ [i diferi]i acizi cetonici.

39

Leghemoglobina este singurul reprezentant al hemoglobinelor din regnul vegetal, aceasta apare `n stadiul activ al fix\rii, numai `n nodulii eficien]i, afla]i la maturitate, ca rezultat al simbiozei `ntre bacterii [i leguminoase. ~n acest sens bacteriile aduc nucleul "hem" iar planta "proteina". Pigmentul nu poate fi sintetizat separat nici de bacterii nici de planta gazd\ [i fixarea N2 este propor]ional\ cu concentra]ia pigmentului din nodozit\]i.

Simbioza Frankia - Plante neleguminoase (Actinorizele) Actinorizele reprezint\ asocia]ii simbiotice fixatoare de N2 la

aproximaativ 200 specii de angiosperme, care sunt plante leguminoase caracteristice zonelor cu deficit de azot.

Bacteriile care tr\iesc `n simbioz\ cu aceste plante apar]in genului Frankia, fam. Frankiaceae, ord. Actynomycetales. Cele mai cunoscute genuri de plante `n zona noastr\: Hippophae, Elaeagnus.

Formarea nodozit\]ilor Modul de recunoa[tere `ntre cei doi parteneri [i infec]ia sunt

asem\n\toare ca la simbioza dintre bacteriile genului Rhizobium [i plantele leguminoase.

Evolu]ia procesului infec]ios determin\ apari]ia unor nodozit\]i laterale pe suprafa]a r\d\cinilor. Forma]iunile simple originale au o asem\nare extern\ evident\ cu nodozit\]ile de leguminoase. Dup\ 10-15 zile pe suprafa]a nodulului simplu originar apar lobi noi situa]i `n partea apical\.

Repetarea acestui proces de ramificare [i producerea anual\ de noi noduli pe r\d\cini duce la apari]ia unei grup\ri compacte cu aspect caroloid, fiecare lob reprezentând o nodozitate individual\.

Importan]a deosebit\ a actinorizelor decurge din faptul c\ cele mai multe plante gazd\ sunt specii pionier. Ele populeaz\ terenurile cu deficit mare de azot, terenurile ml\[tinoase, soluri s\race, dune de nisip, pietri[, regiuni subalpine, zone de de[ert.

~n al doilea rând sunt importante prin larga r\spândire a plantelor gazd\, prezente `n regiunile arctice, temperate, subtropicale, tropicale [i de la regiunile de [es pân\ la cele subalpine.

II. Amonificarea

Substan]ele organice azotate, reprezentând 99 % din rezervele totale de N2 din sol, constau din rezerve humice [i din al]i compu[i acumula]i `n mod natural `n sol prin procesul de fixare biologic\ a N2 [i prin cel de degradare a resturilor organice vegetale [i animale, a `ngr\[\mintelor verzi [i a b\legarului. ~ns\[i celulele bacteriene reprezint\ o mas\ de substan]\ organic\, predominant proteic\, de aproximativ 6 t/ha, la care se adaug\ circa 20 de tone reprezentate de restul microflorei [i microfaunei. Dac\ acest N2 organic ar r\mâne ca atare, rezervele de N2 accesibile plantelor s-ar mic[ora `n fiecare an [i nu ar mai permite cre[terea plantelor. ~n mod normal `ns\, aceste substan]e sufer\ un proces de mineralizare, la sfâr[itul c\ruia sunt aduse `n stare de NH3. Procesul de amonificare propriu-zis este precedat de descompunerea moleculelor proteice prin hidroliz\, cu ajutorul proteazelor extracelulare eliberate de numeroasele specii de microorganisme aerobe [i anaerobe dup\ formula general\: H2O H2O H2O protein\ peptone peptide aminoacizi

proteinaze peptidaze

40

Aminoacizii rezulta]i din aceast\ degradare p\trund `n interiorul celulelor bacteriene, unde sufer\ un proces de dezaminare, din care rezult\ NH3 [i acidul organic corespunz\tor. Se `ntâlnesc mai multe tipuri de dezaminare [i anume:

1. Dezaminarea hidrolitic\ 2. Dezaminarea hidrolitic\ [i decarboxilare 3. Dezaminarea reduc\toare 4. Dezaminarea reduc\toare cu decarboxilare (anaerob\) 5. Dezaminarea oxidativ\ cu decarboxilare 6. Dezaminarea cu desaturare. Din asemenea reac]ii, `n afar\ de NH3, pot rezulta acizii: acetic, formic,

propionic, butiric, valerianic. ~n func]ie de condi]iile de mediu [i natura microflorei, ace[ti acizi pot fi

oxida]i complet la CO2 [i H2O (`n mediul aerob), acumula]i ca atare, transforma]i `n alcooli.

Amonificarea `n sens strict poate fi definit\ deci ca un proces biologic `n care se elibereaz\ `n sol NH3, ca rezultat al ac]iunii microflorei solului asupra aminoacizilor rezulta]i din descompunerea substan]elor proteice. ~n acest sens nu este inclus\ `n amonificare, eliberarea de NH3 sub ac]iunea micoflorei temporare de putrefac]ie.

~n acest proces NH3 poate fi refolosit ca atare, de o serie `ntreag\ de microorganisme. Cea mai mare parte din el sufer\ `n continuare o transformare absolut necesar\ pentru via]a din sol, `n forme accesibile plantelor, iar restul poate fi fixat `n sol, mai ales `n soluri acide sau se evapor\ `n atmosfer\.

Microflora capabil\ s\ produc\ amonificarea substan]elor proteice este numeroas\ [i diferit\ [i ac]ioneaz\ `n timp dup\ cum urmeaz\:

La `nceputul procesului intervin bacterii obligat aerobe cum sunt: Bacillus cereus var. micoides, B. subtilis, B. thermoproteolyticus, specii nesporulate ca: Serratia marcescens, Arthrobacter etc. [i specii facultativ anaerobe cum sunt: Proteus vulgaris, Pseudomonas fluorescens, Escherichia coli, Sarcina lutea etc.

Dup\ 2-3 zile intr\ `n ac]iune specii obligat anaerobe cum sunt: Clostridium putrefaciens, C. perfringens [i unele actinomicete ca: Streptomyces violaceus [i Micromonospora chaleea, care `ncep s\ predomine [i fac ca degajarea de NH3 s\ fie maxim\.

~ncepând cu ziua a 4-a mediul este invadat de mucegaiuri [i degajarea de NH3 descre[te datorit\ faptului c\ acestea folosesc NH3 pentru sinteza proteinelor proprii [i produc mult acid care neutralizeaz\ amoniacul.

Hidroliza ureei este realizat\ de un grup numeros de microorganisme capabile s\ produc\ enzima ureaza.

~n acest grup `ntâlnim specii din genurile: Achromobacter sp., Bacillus sp., Clostridium sp., Corynebacterium sp.,

Pseudomonas sp., actinomicete [i microfungi filamento[i. La acestea se adaug\ grupul urobacteriilor caracterizate prin rezisten]a

la concentra]ii mari de uree [i la pH alcalin [i prin capacitatea de a elibera cantit\]i mari de NH3.

Din grupa urobacteriilor fac parte: Bacillus (Urobacillus) pasteuri, Micrococcus ureae, Planosarcina ureae etc.

Activitatea amonificatoare a urobacteriilor este foarte important\ deoarece ureea con]ine 47 % N2 - care ar fi altfel neutilizat de plante. Cantitatea de uree eliminat\ `n natur\ este mare atingând câteva zeci de milioane de tone pe an. Se estimeaz\ c\ popula]ia uman\ ar elimina `n 24 ore circa 15.000 t N ureic, iar animalele circa 1.500.000 tone. La aceste cantit\]i se mai adaug\

41

`ngr\[\mintele cu uree, aplicate prin tehnologiile actuale sub form\ de cianamid\ de Ca.

Acest compus fabricat din N2 din aer [i carbur\ de calciu nu este asimilabil de c\tre plante. Ea sufer\ `n sol unele transform\ri abiotice [i biotice enzimatice pân\ la NH3.

III. Nitrificarea Nitrificarea este un proces de oxidare a NH3 [i a altor forme reduse ale

N2 anorganic eliberate `n sol `n cursul procesului de amonificare, `n nitra]i care reprezint\ forma asimilabil\ pentru majoritatea plantelor verzi.

~n acela[i timp `ns\, nitra]ii reprezint\ [i forma sub care N2 din sol este pierdut, deoarece fiind solubili, sunt sp\la]i de ploaie sau redu[i la NH3, nitra]i sau chiar N2 molecular prin denitrificare.

Natura biologic\ a acestui proces a fost demonstrat\ prin suprimarea lui `n urma steriliz\rii solului prin `nc\lzire la 110oC, sau prin tratarea cu vapori de cloroform. ~n laborator s-a demonstrat c\ procesul se desf\[oar\ `n dou\ faze:

1. Nitritarea - const\ `n dispari]ia NH3 [i `nlocuirea lui cu nitri]i. 2. Nitratarea, `nlocuirea nitri]ilor cu nitra]i (HNO2 HNO3). Microorganismele nitrificatoare sunt autotrofe chimiosintetizante care

`[i procur\ prin reac]ii chimice oxidative, energia necesar\ pentru producerea substan]elor celulare proprii.

Ele sunt aerobe stricte - r\spândite practic `n toate tipurile de sol, [i folosesc ca surs\ de carbon, C mineral din CO2 [i carbona]i, iar ca surs\ de N amoniacul sau nitri]ii.

~ntre bacteriile nitroase - nitrit bacteriile - putem cita: Nitrozomonas europaea, Nitrosococcus oceanus, Nitrosospira briensis [i Nitrosolobus multiformis, care transform\ s\rurile amoniacale `n nitri]i.

Bacteriile nitrice (nitratbacteriile) frecvent `ntâlnite sunt: Nitrobacter Winogradskii, Nitrospira gracilis [i Nitrococcus mobilis, ce realizeaz\ etapa a doua a nitrific\rii, nitratarea - care const\ `n oxidarea nitri]ilor pân\ la nitra]i

Nitrificarea care reprezint\ a 3-a faz\ a circuitului azotului `n natur\, este un proces de importan]\ excep]ional\, deoarece aduce substan]ele azotate `n forma cea mai u[or accesibil\ plantelor.

Dealtfel, s-a observat c\ `n general num\rul microorganismelor nitrificatoare este propor]ional cu fertilitatea solului, putând ajunge, `n solurile fertile, pân\ la un milion de bacterii pe gramul de sol. Num\rul mare de nitrificatori din solurile fertile, comparativ cu solurile `n]elenite, se datoreaz\ [i faptului c\ primele sunt lucrate [i deci bine aerate.

IV. Denitrificarea Nitra]ii acumula]i `n sol, ca rezultat al procesului de nitrificare, sunt `n

parte consuma]i de plantele superioare, iar o cantitate variabil\ este sp\lat\ de apele de infiltrare [i [iroire. Nitra]ii pot fi folosi]i [i de microorganisme, fie c\ sunt asimila]i `n cursul proceselor de sintez\ a protoplasmei acestora (asimilarea nitri]ilor), fie c\ sunt redu[i, pentru oxidarea unei substan]e organice sau minerale.

Denitrificarea reprezint\ un proces care `nchide circuitul prin `ntoarcerea N2 molecular `n natur\.

Reducerea nitra]ilor `n procesul de denitrificare se face fie pân\ la N2 sau NH3, fie pân\ la stadii intermediare ca nitri]i, acidul hiponitros etc.

Condi]iile optime de producere sunt realizate `n solurile saturate cu ap\ [i `n structurile profunde `n care pot reac]iona urm\toarele grupuri de microorganisme.

42

Bacteriile denitrificatoare propriu zise ce reduc NO3- la N2 sunt:

Pseudomonas stutzeri [i Pseudomonas denitrificans. Dintre microorganismele din flora general\ a solului capabile s\ reduc\

NO3- la NO2

- sunt: Bacillus megaterium, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa etc., precum [i unele bacterii sulfuroase ca: Thiobacillus denitrificans.

Semnifica]ia procesului de denitrificare este `nc\ controversat\, acesta fiind considerat de unii autori ca un fenomen patologic, inconstant [i relativ rar `n condi]ii naturale ale solurilor de cultur\. Este sigur c\ reducerea nitra]ilor pân\ la N2 gazos reprezint\ pentru solul respectiv o pierdere real\ care poate ajunge pân\ la 120 kg N2/ha/an, cu toate c\ o parte din N2 degajat poate fi preluat de fixatorii de N2 anaerobi cum sunt: Clostridium pasteurianum.

~n acela[i timp, reducerea incomplet\, pân\ la stadiile intermediare, de nitri]i [i NH3, este mai pu]in d\un\toare pentru fertilitatea solului respectiv, deoarece NH3 poate fi folosit de unele microorganisme heterotrofe, `n timp ce nitri]ii sunt prelua]i de nitratbacterii [i reoxid\ri `n nitra]i.

3. INFLUEN}A FACTORILOR ECOLOGICI ASUPRA MICROORGANISMELOR

Influen]a pH-ului Pentru marea majoritate a micropopula]iei solului, pH-ul optim este cel apropiat de neutralitate. A[a se explic\ de ce `n solurile cu reac]ie neutr\ se g\se[te cea mai bogat\ [i variat\ microflor\. Dup\ preferin]ele fa]\ de pH-ul solului, microorganismele pot fi grupate `n: - Neutrofile, care prefer\ un pH `n jur de 7. Din aceast\ categorie fac parte cele mai multe [i mai importante microorganisme din sol (Azotobacter, bacteriile nitrificatoare autotrofe, microorganismele celulolitice cele mai active, actinomicetele). - Acidofile, a c\ror dezvoltare maxim\ este la un pH `n jur de 3 (genul Thiobacillus). - Bazofile, cu o dezvoltare maxim\ la un pH mai mare de 8 (Bacillus ureolitici). - Indiferente sunt majoritatea ciupercilor. pH-ul solului poate fi considerat ca un factor de reglaj al competi]iei pentru hran\. De exemplu, ciupercile, care suport\ u[or (chiar preferabil) reac]ia acid\ a solului, concureaz\ toate celelalte microorganisme din solurile acide. Calcarizarea solurilor acide stimuleaz\ evident activitatea lor biologic\. Cu cât pH-ul solului neamendat este mai sc\zut, cu atât este stimulat\ mai puternic activitatea microorganismelor. Exist\ o corela]ie `ntre con]inutul de substan]e nutritive [i reac]ia solului, dovedit\ prin schimbul de ioni. Schimbul este `ntr-un raport echivalent `ntre ionii de hidrogen produ[i de r\d\cinile plantelor `n timpul respira]iei [i a asimil\rii substan]elor nutritive, cu bazele absorbite prin schimb cu mineralele argiloase [i coloizii organici. Dezalcalinizarea permanent\ [i formarea acizilor, `n cadrul descompunerii substan]elor organice, duce la acidifierea solului. ~n cazul când mineralizarea, degradarea [i unele m\suri de fertilizare nu pot acoperi dezalcalinizarea, aciditatea se men]ine. Aceasta duce la o restructurare a microorganismelor, predominând ciupercile care prefer\ aciditatea [i bacteriile anaerobe. Consecin]ele sunt urm\toarele: microorganismele respective descompun materialul din care se formeaz\ humusul [i produc

43

substan]e de inhibare a cre[terii; se formeaz\ humusul brun, care duce la podzolirea solului. Influen]a temperaturii Dependen]a fa]\ de temperatur\ a microorganismelor este, `n general, mai mare decât cea a plantelor verzi. Temperatura este un factor foarte important pentru cantitatea de humus format\ `n solurile din regiunile umede cu clim\ temperat\. Limitele optime ale temperaturii pentru microorganismele din sol sunt `ntre 20-30oC. Bacteriile au o adaptabilitate foarte mare la oscila]iile de temperatur\. Referindu-ne la dinamica sintezei [i descompunerii humusului, s-a constatat c\ odat\ cu sc\derea temperaturii scade, `n general [i activitatea microorganismelor. ~n func]ie de adaptarea la factorul termic, microorganismele pot fi: - Psihrofile, cele care `[i desf\[oar\ activitatea la temperaturi sc\zute (cea mai mare parte a micropopula]iei solurilor polare). - Mezofile sunt microorganisme a c\ror optim de activitate metabolic\ este `n jur de 30oC. ~n acest grup se `ncadreaz\ cele mai multe [i mai importante bacterii din solurile cu clim\ temperat\. - Termofile sunt microorganisme al c\ror metabolism este intens la temperaturi relativ ridicate. De exemplu, specii de microorganisme din gunoiul de grajd. Influen]a apei `n sol Activitatea biologic\ a unui sol tinde s\ se diminueze odat\ cu sc\derea con]inutului `n ap\, dar contrar celor observate la plante, punctul de ofilire (pF = 4,2) nu constituie un prag indicator al `ncet\rii activit\]ii microbiene. Se apreciaz\ c\ limita superioar\ oric\rei activit\]i biologice corespunde la pF= 5,5-5,6. Uscarea solului peste aceste valori antreneaz\ moartea tuturor microorganismelor. Aceast\ particularitate a microorganismelor fa]\ de plantele superioare se explic\ `n primul rând prin presiunea osmotic\ mai ridicat\ din celulele microbiene; `n al doilea rând bacteriile din sol nu pierd ap\ prin transpira]ie ca plantele superioare [i `n al treilea rând suprafa]a de absorb]ie la microorganisme fa]\ de masa protoplasmatic\ egal\, este mai mare ca la plante. Moartea microorganismelor la umiditate sc\zut\ este determinat\ de mai mul]i factori ca, durata [i nivelul usc\rii, tipul microorganismului, tipul de sol [i structura solului. ~n func]ie de nevoile de ap\, microorganismele se `mpart `n mai multe grupe: Microorganisme hiperxerofile sunt germeni al c\ror prag este superior valorii pF = 4,9. Aici majoritatea microorganismelor sunt cele amonificatoare, amilolitice [i cele care degradeaz\ substan]ele vegetale complexe. Microorganismele xerofile sunt cele al c\ror prag este cuprins `ntre pF = 4,9-4,2. Aici se includ germenii care degradeaz\ celuloza, cei care oxideaz\ sulful, o parte din microorganismele amilolitice, amonificatorii ureei [i cei care produc nitrificarea sulfatului de amoniu. Microorganismele hidrofile includ germeni care au pragul pF = 2. Aici se g\sesc agen]i care descompun carboximetilceluloza, ce fixeaz\ azotul atmosferic, precum [i o parte dintre nitrificatorii sulfatului de amoniu. Existen]a pragurilor diferite ridic\ probleme de ordin practic deosebit de importante pentru agricultur\. Astfel, una dintre consecin]e este predominarea selectiv\ a unor procese microbiene asupra altora. Aceasta se

44

`ntâmpl\ `n cazul umidit\]ii situate `n vecin\tatea punctului de ofilire, când predominarea proceselor de celuloliz\ asupra amonific\rii, are drept urmare imobilizarea total\ sau par]ial\ a azotului mineral. De asemenea, `n cazul umidit\]ii sc\zute predomin\ procesele de amonificare, fapt ce antreneaz\ o acumulare de azot amoniacal remarcat\ `n solurile `n curs de uscare. Diferitele grupe de microorganisme au un grad variat de rezisten]\ fa]\ de usc\ciune. Astfel, ciupercile [i bacteriile sunt mai sensibile, comparativ cu actinomicetele. Influen]a energiei radiante Lumina solar\ are, adesea, o influen]\ d\un\toare asupra microflorei solului, chiar [i asupra algelor care sunt fotosintetizante. Ac]iunea bactericid\ a lumii se datoreaz\ mai ales radia]iilor din domeniul albastru-violet al spectrului, care induc `n celulele microbiene formarea de peroxizi sau determin\ hidroliza proteinelor. Radia]iile ultraviolete au o foarte puternic\ ac]iune bactericid\ la lungimile de und\ cuprinse `ntre 2000 [i 3000 Å. Efectul lor `n sol este minim, din cauza puterii reduse de p\trundere `n acest mediu. Lumina difuz\ a zilei este necesar\ activit\]ii vitale a microbilor sintetiza]i din sol. Lumina mai slab\ [i o umiditate mai ridicat\ favorizeaz\ descompunerea microbian\ a humusului. Prezen]a `n sol a unor elemente radioactive, mai evident\ `n solurile formate din roci vulcanice, stimuleaz\ formarea de nodozit\]i la leguminoase, activitatea bacteriilor din genul Azotobacter, a proteolizei [i a denitrific\rii. Activitatea microbian\ a diferitelor soluri Diferitele tipuri de sol, formate sub influen]a unui complex de factori, a dus la o mare varia]ie taxonomic\ a microorganismelor care `l populeaz\. S-a constatat c\, paralel cu modificarea tipurilor de sol, se schimb\ [i micropopula]ia, exprimat\ prin dominarea unor specii, dispari]ia altora sau reducerea num\rului lor. Varia]ia activit\]ii microflorei din sol, `n func]ie de tipul de sol, nu trebuie legat\ numai de factorii climatici, ci [i de modific\rea condi]iilor de nutri]ie pentru microorganisme. P. Papacostea (1972) a pus `n eviden]\ existen]a, `n solurile din ]ara noastr\, a unor microorganisme indicatoare, caracteristice unor tipuri de sol. Astfel, a stabilit o clasificare a solurilor, pe baza microorganismelor specifice [i anume: ♦ Soluri cu Mucor rammanianus (foarte acide, specifice paji[tilor alpine [i acelora de sub p\dure de molid), care nu sunt utilizate pentru exploatarea agricol\. ♦ Soluri cu Pseudomonas acidophilus [i P. pseudogley, din care fac parte solurile podzolice [i pseudogleizate. ♦ Soluri cu Pseudomonas lemonnieri [i P. aureofaciens, care sunt cele mai fertile. Activitatea microbian\ din sol este influen]at\ [i de textura [i structura solului care, la rândul lor, depinde de compozi]ia chimic\ a diferitelor frac]ii minerale [i organice din sol; compozi]ia chimic\ este, [i ea, `n mare m\sur\, rezultat al activit\]ii microbiene a solului. Pentru acela[i tip de sol, exist\ o diferen]iere a distribuirii microorganismelor [i a activit\]ii lor `n func]ie de m\rimea agregatelor. Microflora fiec\rui tip de sol se modific\, adesea, `n cursul aceluia[i an, `n func]ie de varia]ia factorilor climatici, adic\ apare o varia]ie sezonier\ a microflorei. ~n zonele temperate, intensitatea maxim\ a proceselor microbiene

45

din sol s-a constatat prim\vara [i uneori, toamna; mai sc\zut\ iarna [i vara. Varia]ia sezonier\ afecteaz\ `n primul rând, straturile superficiale ale solului, diminuându-se `n adâncime. Pe lâng\ varia]iile sezoniere, microflora solului poate suferi varia]ii `n decurs de câteva zile sau chiar `n timp de 24 de ore. 4. INTERRELA}IILE DINTRE MICROORGANISMELE

DIN SOL

S-a mai men]ionat anterior c\, `ntre microorganismele din sol pot fi pot fi raporturi de convie]uire, cât [i raporturi antagoniste. Un exemplu tipic de conlucrare [i activitate reciproc\ este cel oferit de popularea ini]ial\ a rocilor, când bacterii, ciuperci [i alge albastre tr\iesc `n vecin\tate, sprijinindu-se [i completându-[i activitatea. ~n timpul circuitului biologic al substan]elor, apar de asemenea raporturi care se eviden]iaz\ prin activitatea [i colaborarea lor reciproc complementar\. Un alt exemplu edificator este cel privind prelucrarea resturilor vegetale la care particip\, adesea, `n acela[i timp, pe baza "diviziunii muncii", bacterii, ciuperci [i actinomicete: bacilii fitofagi [i mucoraceele prelucreaz\ compu[ii u[or valorificabili ai carbonului (acizi, zah\r [i amidon) [i compu[i ai azotului (proteine), pe când altele (Cellvibrio [i Pseudomonas) prelucreaz\ celuloza, hemiceluloza [i pectina, iar bazidiomicetele prelucreaz\ ligninele. Grupurile de microorganisme men]ionate, adesea, nu-[i desf\[oar\ activitatea concomitent, ci `n succesiunea men]ionat\, adic\ `n cadrul unei metabioze. Metabioza sau comensalismul bacterian Prin acest fenomen se `n]elege rela]iile dintre reprezentan]ii a dou\ sau mai multe specii de microorganisme (care convie]uiesc [i se succed) `n care unul dintre microorganisme profit\ iar cel\lalt `n aparen]\, nici nu profit\ [i nici nu este influen]at negativ. Metabioza reprezint\ raporturi generale [i trepte superioare de convie]uire, care se realizeaz\ prin mai multe mecanisme: ♦ Un microorganism produce metaboli]i necesari altuia. Un exemplu de metabioz\ foarte strict\ este activitatea microorganismelor denitrificatoare: amoniacul este transformat, `n sol, `n nitrit de Nitrosomonas, iar nitritul `n nitrat de Nitrobacter. Nitratul produs de Nitrobacter este neutilizabil de Nitrosomonas, care oxideaz\ amoniacul. Pentru a se putea prelucra autotrof o cantitate suficient\ de CO2, transformarea nitri]ilor `n nitra]i se va efectua mult mai repede decât transformarea amoniacului `n nitri]i, deoarece câ[tigul de energie, `n cazul form\rii nitri]ilor din amoniac, este mult mai mare decât la formarea nitra]ilor din nitri]i. ~n metabioaza transform\rii sulfului `n hidrogen sulfurat [i sulfat, sulful produs `n a doua etap\ poate fi utilizat de c\tre bacteriile denitrificatoare. La descompunerea celulozei particip\ trei micropopula]ii, `n mod succesiv. Micropopula]ia ini]ial\ se dezvolt\ pe seama celulozei din resturile vegetale. Produ[ii rezulta]i (glucoz\, acizi organici) sunt utiliza]i de micropopula]ia secundar\. Pe seama microorganismelor moarte din micropopula]iile primare [i secundare se dezvolt\ micropopula]ia ter]iar\. ♦ Un microorganism degradeaz\ sau inactiveaz\ o substan]\ care are un efect toxic asupra celuilalt microorganism. De exemplu, unele microorganisme degradeaz\ sau inactiveaz\ unele antibiotice, favorizând astfel dezvoltarea microorganismelor care sunt sensibile la antibioticul respectiv. ♦ Un microorganism altereaz\ mediul, din punct de vedere fizico-chimic. ~n acest caz, este interesant\ metabioza ce se realizeaz\ `ntre bacteriile

46

aerobe [i cele anaerobe din sol, care explic\ faptul c\ bacteriile anaerobe se pot dezvolta [i `n straturile superioare, bine aerisite, ale solului. Un exemplu elocvent este cauza metabiozei dintre bacteriile aerobe [i cele anaerobe `n cadrul agregatelor particulelor din sol: cele aerobe se dezvolt\ pe suprafa]a agregatelor [i consum\ O2, `mpiedicând, astfel, difuzarea oxigenului `n interiorul agregatelor, prin aceasta favorizeaz\ dezvoltarea bacteriilor anaerobe din interiorul agregatelor. Raporturi antagoniste Antagonismul const\ `n rela]ii `n care un microorganism sau un fag exercit\ o ac]iune defavorabil\ asupra unui alt microorganism. Fenomenul apare când un organism secret\ `n mediu produse ale activit\]ii vitale care inhib\ dezvoltarea altui organism sau `l omoar\. ~n sol apar urm\toarele aspecte de antagonisme `ntre microorganismele care `l populeaz\: - Antagonismul microbian propriu-zis, care se realizeaz\ prin: Concuren]\ pentru sursa de hran\, ce apare când dou\ specii au necesit\]i nutritive asem\n\toare. Specia cu o cre[tere rapid\ `mpiedic\ dezvoltarea speciei cu cre[tere lent\. De exemplu, la `nceputul descompunerii resturilor vegetale [i animale, bacteriile se dezvolt\ abundent, `n timp ce actinomicetele nu se dezvolt\. Dup\ epuizarea substan]elor u[or asimilabile, bacteriile mor. ~n locul lor apar actinomicetele care se multiplic\ rapid, consumând resturile organice care nu au fost descompuse de bacterii. Modificarea mediului prin produ[i metabolici. De ezemplu, acidul lactic [i acidul butiric, produ[i ai bacteriilor de fermenta]ie, ac]ioneaz\ asupra tuturor microorganismelor asociate [i, astfel `mpiedic\ multiplicarea bacteriilor de putrefac]ie. Tot aici, trebuie men]ionat [i fenomenul de antibioz\, când antibioticul produs de un microorganism poate elimina dezvoltarea altor organisme din sol. De exemplu, Streptomyces grisseus produce streptomicin\, care inhib\ activitatea bacteriei Bacillus subtilis. Parazitismul este fenomenul prin care un fag sau un microorganism se dezvolt\ pe seama [i `n dauna altui microorganism. Dup\ cum s-a mai men]ionat, fagii paraziteaz\ bacterii, actinomicete, cianobacterii [i ciuperci, al c\rui mecanism a fost, de asemenea, descris anterior. Sunt [i bacterii [i actinomicete care lizeaz\ alte bacterii, respectiv ciuperci sau alge. Bacteriile micolitice sunt mixobacterii sau tulpini de Bacillus [i Pseudomonas, iar actinomicetele micolitice sunt streptomicete [i nocardii. Liza la cianobacterii [i la algele verzi este efectuat\ de mixobacterii [i alte bacterii, precum [i de unele tulpini de streptomicete. Sunt [i cazuri când atât parazitul cât [i gazda sunt ciuperci. De exemplu, Penicillium vermiculatum este parazit pe Rhizoctonia solani. Aceasta din urm\ poate fi parazit la rândul ei pe alte ciuperci, de exemplu pe Mucor recuvus. Pr\d\torismul (preda]ia) este un act de agresiune când un microorganism (agresor) atac\ pe un altul (prada) pe care `l captureaz\, ingereaz\ [i diger\. De exemplu, bacteriile sunt o hran\ a protozoarelor (protozoarul Rhizopoda consum\ `n timpul existen]ei sale circa 40.000 de bacterii). Prin aceasta, `ns\, nu se reduce num\rul bacteriilor, ci se poate, uneori, m\ri intensitatea proceselor fiziologice ale bacteriilor. Astfel de rela]ii pot fi considerate ca rela]ii de simbioz\. Sunt [i ciuperci pr\d\toare care consum\ animale mici, bacterii pr\d\toare, protozoare, metazoare [i chiar bacteriofagi.

47

Studiul raporturilor antagoniste dintre diferi]i reprezentan]i ai micropopula]iei solului prezint\ interes `n sensul dirij\rii lor pentru protec]ia plantelor cultivate, excluzând astfel mijloacele chimice de combatere, care prezint\ multe neajunsuri. Simbioza (mutualismul) Simbioza este o form\ de convie]uire `ntre dou\ sau mai multe specii [i const\ `ntr-o nutri]ie `ncruci[at\: fiecare simbiont produce un metabolit pe care nu-l poate produce cel\lalt. ~n formele ei superioare, simbioza const\ [i `ntr-o p\trundere morfologic\ reciproc\ a ambilor parteneri (ex. lichenii). Uneori, `n rela]iile simbiotice se pot observa [i tr\s\turi parazitare. Simbioza poate ave loc `ntre parteneri apar]inând unor grupe diferite de microorganisme [i anume: a) ~ntre diferite bacterii, de exemplu, simbioza dintre bacteriile denitrificatoare [i cele fixatoare de azot, pe de o parte [i bacteriile celulolitice, pe de alt\ parte. (Simbioza const\ `n schimbul de surs\ de C [i energie [i de surs\ de N). b) ~ntre bacterii [i ciuperci care se bazeaz\, mi ales pe un schimb de factori de cre[tere. c) ~ntre bacterii [i alge, de exemplu, `ntre Azotobcter [i unele alge. d) ~ntre bacterii [i protozoare. S-a constatat c\, `n prezen]a protozoarelor, culturile bacteriene respir\ mai intens, iar cele de Azotobacter fixeaz\ mai mult N2. Multe protozoare con]in bacterii endosimbiotice, de exemplu, ciliatul Spirostomul teres con]ine Chromatium vinosum. e) ~ntre ciuperci [i alge, de exemplu, lichenii. Ei reprezint\ forma superioar\ de simbioz\ dintre microorganisme. Simbioza lichenilor ac]ioneaz\ asupra formei, metabolismului [i `nmul]irii organismelor participante. La formarea lichenilor particip\ adesea, din partea algelor, cianoficee filiforme [i cloroficee unicelulare, iar din partea ciupercilor, de preferin]\, ascomicete [i, numai rareori, bazidiomicete. 5. INTERRELA}IILE DINTRE PLANTELE SUPERIOARE

{I MICROORGANISMELE DIN SOL

Plantele superioare, dezvoltându-se `n acela[i mediu natural (sol) cu microorganismele, intr\ adesea cu acestea `n concuren]\ pentru hran\. Poate c\ termenul de "concuren]\" nu este cel mai potrivit, deoarece prezen]a bacteriilor `n sol poate s\ aib\ un efect favorabil asupra plantelor de cultur\, [i invers, plantele de cultur\ pot avea o ac]iune favorabil\ asupra florei bacteriene din sol. Aspectul cel mai concludent este cel privind rela]iile dintre r\d\cinile plantelor [i microorganisme. Se apreciaz\ c\ `ntre microorganismele din sol [i plantele superioare se stabilesc rela]ii de simbioz\. Apreciind beneficiile reciproce `ntre microorganismele simbiotice ca parazi]i care, "`mpreun\ cu specia gazd\, au evolut pân\ la un stadiu de toleran]\ mutual\ complet\, astfel `ncât ele sunt `n mod constant prezente `n fiecare individ al speciei gazd\ (Dr\gan [I Kiss, 1986). Din cele expuse, rezult\ c\ simbioza, `n acest caz, este o infec]ie atenuat\, poten]ial d\un\toare unuia dintre parteneri. De aceea, `n anumite condi]ii, simbiontul poate deveni patogen. ~n cele ce urmeaz\ ne vom referi la câteva aspecte ale rela]iilor dintre microorganisme [i plantele superioare (simbioza dintre rizobii [i plantele leguminoase, ca [i alte simbioze dintre microorganisme [i plantele superioare,

48

au fost prezentate când s-a descris, `n detaliu fixarea simbiotic\ a azotului atmosferic). Aspectul cel mai important `l consider\m cel privind rela]iile dintre sistemul radicular al plantelor [i microflora solului. Pentru aceasta este necesar s\ definim câteva no]iuni (spermatosfera [i rizosfera). Spermatosfera este zona de sol care `nconjoar\ semin]ele `n curs de germinare. ~n aceast\ zon\, num\rul microorganismelor, `n special cel al bacteriilor, este mult mai mare decât `n zona f\r\ semin]e `n curs de germinare. Aceasta, pentru c\ microorganismele utilizeaz\ substan]ele eliminate de semin]e `n timpul germin\rii lor [i produc, la rândul lor, fitohormoni care stimuleaz\ germinarea [i apoi cre[terea plantei. ~n mod treptat, spermatosfera se transform\ `n rizosfer\. Rizosfera Rizosfera este zona de sol care `nconjoar\ r\d\cinile [i este influen]at\ de acestea din punct de vedere fizic, chimic [i biologic, datorit\ ac]iunilor specifice dintre microorganismele solului [i plantele superioare. ~n cadrul rizosferei sunt trei subzone (dup\ Berezova, 1950) care se deosebesc `ntre ele atât `n privin]a densit\]ii microbiene, cât [i prin structura speciilor de microorganisme. ♦ Prima zon\, numit\ "rizosfera intern\" (rizosfera propriu-zis\), are o raz\ de 0-0,5 cm. Ea cuprinde microorganismele de la suprafa]a r\d\cinilor. ♦ A doua zon\, numit\ ''zona periradicular\", cuprinde microorganismele care se g\sesc la o distan]\ de 0,5 cm de r\d\cin\. ♦ A treia zon\ sau "rizosfera extern\" ("edatosfera") cuprinde microorganismele care se g\sesc la o distan]\ mai mare de 0,5 cm de r\d\cin\. Prezen]a mai multor microorganisme (`n special bacterii) `n rizosfer\ decât `n solul nerizosferic (f\r\ r\d\cini), se nume[te efect rizosferic. Intensitatea efectului rizosferic la bacterii se exprim\ prin raportul R/S (rizosfer\/sol nerizosferic) care, `n general este de 5:10 (la actinomicete, ciuperci, alge [i protozoare R/S este `ntre 2 [i 3). Num\rul bacteriilor `n rizosfer\ este influen]at de urm\torii factori: - Distan]a dintre suprafa]a r\d\cinii [i particulele de sol. Pe suprafa]a r\d\cinii se g\sesc cele mai multe bacterii. - Zonele r\d\cinii. Solul din jurul perilor radiculari con]ine mai multe bacterii decât cel din jurul celorlalte zone ale r\d\cinii. - Distan]a dintre zonele r\d\cinii [i suprafa]a solului. Zonele r\d\cinilor mai apropiate de suprafa]a solului au o rizosfer\ mai bogat\ `n bacterii decât zonele r\d\cinilor, de pe aceea[i plant\, care se g\se[te la adâncime. - Specia plantei. ~n rizosfera gramineelor perene se g\sesc mai multe bacterii decât la cele anuale, iar la lucern\ [i trifoi mai multe decât la leguminoase. - Faza de vegeta]ie. Flora bacterian\ din rizosfer\ cre[te `n cursul dezvolt\rii plantei, ajungând la o valoare maxim\ `n perioada `nfloritului, dup\ care scade evident. - Con]inutul solului `n substan]e nutritive. ~n solurile fertile, raportul R/S este mai mic decât la solurile s\race. Efectul rizosferic se manifest\ nu numai sub aspect cantitativ (num\r de microorganisme), ci [i calitativ, fapt ce const\ `n modificarea echilibrului dintre diferite grupe de microorganisme din sol. ~n rizosfera plantelor predomin\ bacteriile nesporogene, bastona[ele Gram-negative din genurile Pseudomonas, Flavobacterium, Achromobacter [i Agrobacterium (`n rizosfera unor plante se dezvolt\ [i Rhizobium, Azotobacter, Azospirillum [.a.).

49

Rela]iile dintre r\d\cinile plantelor [i microorganismele din rizosfer\ Aportul plantelor. R\d\cinile influen]eaz\, din punct de vedere mecanic, structura solului, elibereaz\ CO2, secret\ metaboli]i cu ac]iune energetic\, enzimatic\, care activeaz\ sau inhib\ cre[terea lor, l\sând resturi de ]esuturi care sunt utilizate ca hran\ de microorganismele din sol. Bacteriile din rizosfer\ sunt acelea care utilizeaz\ excre]iile radiculare [i substan]ele provenite din exfolierea ]esuturilor radiculare. Excre]iile radiculare con]in: aminoacizi, vitamine, acizi organici simpli, zaharuri, baze azotate, enzime, glucozide [.a. Bacteriile cu un poten]ial ridicat de sintez\ a substan]elor biologic active din rizosfer\, cu o mare capacitate de `nmul]ire [i capabile s\ se hr\neasc\ cu produsele de eliminare ale r\d\cinilor, ca [i acelea care prin metabolismul lor produc substan]e ce inhib\ `nmul]irea altora, ajung dominante `n structura microbiologic\ a rizosferei. Cantitatea [i calitatea produ[ilor elimina]i de r\d\cinile plantelolr sunt determinate, pe lâng\ baza ereditar\, [i de unii factori externi, dintre care men]ion\m: condi]iile de nutri]ie, umiditatea, lumina, pH-ul, temperatura, aera]ia [i altele care condi]ioneaz\ buna cre[tere [i dezvoltare a plantelor [i, `n special, a sistemului radicular. Aportul bacteriilor const\ `n urm\toarele: - ~mbun\t\]esc condi]iile nutritive ale plantelor prin mineralizarea compu[ilor organici, producând N, P, K, S, Ca etc. sub form\ accesibil\ plantelor. - Stimuleaz\ cre[terea plantelor prin fitohormonii pe care `i produc [i care sunt absorbi]i de r\d\cinile plantelor. Principalele specii microbiene care au aceast\ capacitate sunt: Pseudomonas sinuosa, P. fluorescens, P. desmoliticum, Bacillus mesentericus flavus [.a. - Descompun unele substan]e fitotoxice, cum este cumarina. - Au efect fitosanitar prin antagonismul ce are loc `ntre microorganismele saprofite [i cele patogene. Rolul sanitar al microorganismelor `n rizosfer\ mai const\ `n faptul c\ ele consum\ unele substan]e eliminate de r\d\cinile plantelor care pot deveni d\un\toare, când s-ar acumula `ntr-o cantitate mare. Micoriza sau simbioza ciupercilor cu r\d\cinile plantelor Micoriza este rezultatul simbiozei ciupercilor cu multe monocotiledonate (de exemplu, orhidee) [i dicotiledonate superioare (de exemplu, plantele lemnoase [i ierboase), precum [i cu mu[chii (Bryophyte) [i ferigile (Pteridophyta). Ciupercile de micoriz\ iau de la plante substan]e nutritive organice (glucide, vitamine [i al]i factori de cre[tere) [i, `n schimb, favorizeaz\ absorb]ia apei [i a substan]elor nutritive minerale (P, N, K [.a.). Se citeaz\ cazuri când ciupercile de micoriz\ produc fitohormoni [i ap\r\ plantele de unii parazi]i. Aspectul de simbioz\ dintre plante [i ciuperci este `nc\ mult discutat, `n sensul c\ nu se [tie precis dac\ este vorba de simbioz\, parazitism sau comensalism. Ceea ce este cert este c\ micorizele arborilor sunt simbioze. ~n ceea ce prive[te "acuza]ia" de parazitism, men]ion\m c\ ciupercile asociate cu r\d\cinile arborilor cu func]ie de micoriz\ se deosebesc de parazi]ii adev\ra]i ai r\d\cinilor prin aceea c\ nu ac]ioneaz\ toxic asupra gazdei, ci, din contr\, stimuleaz\ cre[terea ei. Micorizele pot fi ectotrofe sau endotrofe. Micorizele ectotrofe sunt frecvente la arbori (Pinaceae, Betulaceae, Fagaceae), a c\ror r\d\cini nu au peri[ori radiculari. R\d\cinile acestora sunt

50

acoperite cu un man[on micelian, de la care se emit unele hife spre exterior (sol), iar altele spre interior. Acestea din urm\ p\trund `ntre celulele parenchimului cortical al r\d\cinii [i formeaz\ o re]ea intercelular\ numit\ "`mpletitura lui Harting". Cele mai frecvente ciuperci simbiotice sunt bazidiomicetele superioare (mai rar forme inperfecte sau ascomicete). Micorizele endotrofe sunt mai frecvente decât cele ectotrofe, g\sindu-se la arbori, arbu[ti, plante ierboase ale c\ror r\d\cini sunt normale (cu peri radiculari). ~n acest caz, ciupercile endotrofe emit hife `n spa]iul intercelular [i `n interiorul celulelor scoar]ei [i epidermei. Totodat\ emit hife [i spre exterior. Hifele intracelulare ale micorizelor endotrofe sunt digerate de planta gazd\. ~n acest caz, planta gazd\ care utilizeaz\ produ[ii de digestie poate fi considerat\ ca un parazit al ciupercii. Trebuie s\ re]inem, totu[i, c\ digestia unei p\r]i a hifelor ciupercilor de c\tre plante are un rol important `n stabilirea echilibrului fiziologic dintre ciuperci [i planta gazd\. Digerarea ciupercilor (funcologia) trebuie privit\, `n primul rând, ca o reac]ie de ap\rare a plantei. Avantajele [i dezavantajele convie]uirii dintre cei doi parteneri depind, `n primul rând, de activitatea individual\ a partenerului respectiv. Când planta gazd\ este puternic\, se men]ine echilibru necesar prin digerare de ciuperci. Când activitatea individual\ a plantei gazd\ este `n dificultate, se poate ca ciuperca - partener al simbiozei - s\ devin\ parazit [i deci s\ d\uneze plantei. E posibil s\ apar\ [i fenomenul invers. Dezvoltarea micorizei este determinat\, pe lând\ `nsu[irile fiziologice ale partenerilor simbiozei [i de condi]iile de mediu, `n primul rând, de `nsu[irile fizice [i chimice ale solului. ~n solurile de p\dure, ciupercile care formeaz\ micorize au via]a nelimitat\, iar `n cele supuse unei inunda]ii de durat\ sunt distruse complet. Solurile paji[tilor sunt, `n general, lipsite de ciuperci care formeaz\ micoriza. Majoritatea ciupercilor de micoriz\ prefer\ solurile cu o reac]ie pu]in acid\. Exist\ [i forme care prefer\ solurile acide sau puternic alcaline. Se pare c\ humusul are o influen]\ direct\ [i pozitiv\ asupra micorizei. Con]inutul solului `n vitamine [i aminoacizi influen]eaz\ r\spândirea [i activitatea ciupercilor care formeaz\ micorize. Sunt [i cazuri când solul con]ine substan]e care inhib\ cre[terea ciupercilor [i, prin aceasta, dezvoltarea micorizei. Folosirea micorizei `n agricultur\ este o problem\ `n cercetare, cu perspective promi]\toare, privind inocularea solului [i a puie]ilor cu ciuperci de micoriz\.

51

1. Fixarea N2 este realizat\ de: a) virusuri b) bacterii c) cyanobacterii d) alge e) protozoare f) ciuperci

2. Azotul este utilizat de plantele superioare sub form\ de: a) azot molecular (atmosferic) b) nitri]i c) nitra]i d) amoniac e) monoxid de azot

3. Fixarea aerob\ a azotului molecular este realizat\ de: a) Azotobacter chroococcum b) Clostridium pasteurianum c) Rhizobium leguminosarum d) Frankia alni 4. Nodozit\]ile "eficiente" de pe r\d\cinile de leguminoase con]in un

pigment: a) galben b) albastru c) ro[u d) alb 5. Metabioza este o rela]ie de: a) parazitism b) pr\d\torism c) simbioz\ d) neutralism 6. ~n cazul rizosferei se stabile[te o rela]ie de: a) neutralism b) simbioz\ c) antagonism 7. Micorizele reprezint\ simbioza dintre plante [i: a) ciuperci b) bacterii c) alge d) protozoare

Rezultate corecte: 1 - b,c; 2 - c; 3 - a; 4 - c; 5 - a; 6 - b; 7 - a.


52

MICROBIOLOGIA SOLULUI 1. Solul ca mediu de via]\ pentru microorganisme

Prezen]a microorganismelor `n sol este influen]at\ `n primul rând, de condi]iile sta]ionare ale mediului.

Popula]ia solului: Macroflora, este format\ din p\r]ile subterane (r\d\cini, tulpini [i frunze ajunse `n sol, organe sub diverse forme) ale plantelor superioare. Macrofauna, cuprinde nematozii, viermii inela]i, râmele, furnicile, coleopterele [i diverse vertebrate.

Microflora este format\ din bacterii, cyanobacterii, ciuperci microscopice [i alge. Microfauna solului este constituit\ din protozoare monocelulare. 2. Circuitul azotului

♦ fixarea N2; ♦ amonificarea; ♦ nitrificarea; ♦ denitrificarea.

3. Influen]a factorilor de mediu asupra microorganismelor Influen]a pH-ului

Dup\ preferin]ele fa]\ de pH-ul solului, microorganismele pot fi grupate `n: neutrofile, acidofile, bazofile, indiferente.

Influen]a temperaturii ~n func]ie de adaptarea la factorul termic, microorganismele pot fi:

psihrofile, mezofile, termofile. Influen]a apei `n sol

~n func]ie de nevoile de ap\, microorganismele se `mpart `n mai multe grupe: Microorganisme hiperxerofile, xerofile, hidrofile

4. Interrela]iile dintre microorganismele din sol Metabioza sau comensalismul bacterian Raporturi antagoniste

Concuren]\ pentru sursa de hran\. Modificarea mediului prin produ[i metabolici. Parazitismul Pr\d\torismul Simbioza (mutualismul) 5. Interrela]iile dintre plantele superioare [i microorganismele din sol Spermatosfera Rizosfera Micoriza Micorizele ectotrofe Micorizele endotrofe

REZUMAT MODUL II

53

Microbiologia fermenta]iilor studiaz\ caracteristicile biologice [i

biochimice, precum [i condi]iile optime de activitate ale microorganismelor care produc transform\ri chimice `n diferite substraturi, cu formarea unor cantit\]i relativ mari de substan]e cu valoare util\ sau economic\.

De asemenea, ea studiaz\ rolul microorganismelor `n apari]ia unor modific\ri utile a diferitelor produse alimentare, modalit\]ile de a dirija aceast\ activitate microbian\, ca [i posibilit\]ile de compatere a microorganismelor d\un\toare pentru evolu]ia normal\ a proceselor fermentative sau pentru buna conservare a produselor alimentare.

Fermenta]iile sunt procese biochimice determinate de enzimele unor microorganisme cum sunt bacteriile, levurile, mucegaiurile care au proprietatea de a degrada `n condi]ii de anaerobioz\ diferi]i compu[i organici ai carbonului cu formarea de substan]e cu o condi]ie chimic\ mai simpl\. Din descompunerea anaerob\ a hidra]ilor de carbon rezult\ o serie `ntreag\ de produ[i finali cu 1, 2, 3 sau 4 atomi de carbon, care apar obi[nuit prin degradarea glucozei pân\ la acid piruvic.

De cele mai multe ori unul dintre produ[ii rezulta]i predomin\ cantitativ [i ca stare caracterizeaz\ procesul de fermenta]ie alcoolic\, lactic\, butiric\, propionic\ etc.

Termenul generic al fermenta]iei (lat.fervere = a fierbe) a fost ales pentru a indica aspectul de lichid care fierbe, caracteristic pentru faza de intensitate maxim\ a procesului fermentativ, aceea `n care, datorit\ eliber\rii CO2 sub form\ de bule de gaz, se produce o efervescen]\ a mediului lichid `n special `n vasele foarte mari (de exemplu la mustul de struguri care fermenteaz\).

Ini]ial fermenta]iile se produceau sub ac]iunea micoflorei "spontane", s\lbatice, care se g\sesc pe suprafa]a sau `n interiorul produsului supus fermenta]iei. Aceste microorganisme sunt slab sau inegal active, sau `n amestec cu specii d\un\toare, a c\ror activitate diminueaz\ calitatea produsului final. ~n prezent pentru a se preveni aceste inconvenien]e se recurge la microorganisme selec]ionate, cu ajutorul c\rora se ob]in produse de calitate superioar\, se `mbun\t\]e[te randamentul [i se scurteaz\ durata procesului tehnologic.

Microorganismele utilizate `n procesele fermentative de tip industrial au urm\toarele calit\]i ce pot fi astfel sintetizate:

- cresc rapid [i pot fi u[or cultivate `n cantit\]i mari pe medii ce con]in substan]ele organice corespunz\toare;

- au capacitatea de a-[i men]ine constant propriet\]ile fiziologice, `n anumite condi]ii de cultur\, producând u[or [i `n cantit\]i mari, enzimele necesare pentru transformarea substratului `n sensul dorit;

- realizeaz\ aceste modific\ri, cu formarea unor produ[i folositori, `n condi]ii relativ simple [i pu]in costisitoare.

MODULUL III

MICROBIOLOGIA FERMENTA}IILOR

54

Microorganismele de utilitate industrial\ sunt ast\zi folosite pentru procese ca:

- biosinteza a diferite substan]e chimice (alcooli, acid acetic, acid lactic, acid citric, aceton\, antibiotice);

- producerea pe cale fermentativ\ a unor alimente (produse lactate, brânzeturi) a unor b\uturi alcoolice (vin, bere) [i a furajelor `nsilozate;

- ob]inerea de produse folosite `n industria textilelor (fibre de in, cânep\ prin topire).

Microbiologia industrial\ mai studiaz\ [i aplic\ metodele de combatere a alter\rilor microbiene a alimentelor cu ajutorul conserv\rii prin refrigerare, sterilizare, fermenta]ii [i alte procese tehnice.

1. Fermenta]ia alcoolic\ Alcoolul etilic sau etanolul (CH3CH2OH) se ob]ine prin fermentarea

complet\, `n special de c\tre unele drojdii, a diferite zaharuri, hidra]i de carbon, urmat\ de separarea prin distilare [i purificare a alcoolului ob]inut. Fermenta]ia alcoolic\ este una din cele mai importante fermenta]ii industriale, deoarece alcoolul este `ntrebuin]at curent `n industria alimentar\, chimic\, farmaceutic\ a parfumurilor [i cauciucului.

Materiile prime folosite la fabricarea alcoolului sunt ieftine, abundente `n natur\ [i sunt grupate astfel:

- materii prime amidonoase, rezultate din cartofi, porumb, orz, secar\, care se pot utiliza dup\ transformarea hidrolitic\ a amidonului din compozi]ia lor `n zaharuri mai simple, fermenta]iile de c\tre levuri;

- materii prime zaharoase, provenite din sfecla de zah\r sau trestia de zah\r, sucurile de fructe, melasa rezultat\ ca de[eu de la fabricarea zah\rului [i le[iilor sulfitice ce rezult\ ca de[eu de la fabricarea celulozei, cu con]inut sc\zut de 1-5 % zah\r;

- materii prime celulolitice, rezultate din industria hârtiei ca lemnul [i stuful, care prin fierbere cu acizi sub presiune se hidrolizeaz\ cu formarea de hidra]i de carbon mai simpli, fermentabili.

~nainte de folosirea lor `n fermenta]iile industriale, amidonurile, celulozele [i hemicelulozele trebuiesc hidrolizate sau convertite `n zaharuri cu molecula relativ simple [i fermentabile. ~n acest scop se folosesc fie preparate enzimatice, ca mal]ul de cereale, sau enzime de natur\ microbian\, provenite de la bacterii [i mucegaiuri, fie anumite substan]e chimice ca acizii dilua]i, sau ac]iunea asociat\ a unora din ace[ti agen]i.

Microorganismele care produc fermenta]ia alcoolic\ a zaharurilor sunt reprezentate de ciuperci `n principal din genul Saccharomyces [i unele bacterii ca, Thermobacterium mobile, B. macerans, Sarcina ventriculi, Bacillus acetosetilycus etc.

Fermenta]ia alcoolic\ poate fi spontan\, produs\ de drojdiile s\lbatice, prezente `n natur\, sau dirijat\ prin introducerea `n materialul de fermentat a unor su[e de drojdii selec]ionate, ce au capacitate superioar\ de fermenta]ie.

Temperatura optim\ de activitate este de 28-32oC.Tulpinile sel;ec]ionate au capacitatea de a suporta concentra]ii mari de alcool [i de a consuma cantit\]i mari de hidrocarbonate pentru sintezele lor proprii.

Aceste drojdii au un echipament enzimatic foarte bogat, gra]ie c\ruia ob]in `n mediu anaerob energia necesar\ manifest\rilor vitale, prin procesul de fermenta]ie alcoolic\ a hidra]ilor de carbon, dup\ rela]ia global\:

C6H12O6 2CH3-CH2OH + CO2

55

2. Utilizarea microorganismelor `n vinifica]ie Vinul este o b\utur\ alcoolic\ nedistilat\, cunoscut\ din cele mai vechi

timpuri, care se ob]ine prin fermenta]ia alcoolic\ a mustului de struguri. Fermenta]ia mustului, ob]inut prin zdrobirea strugurilor recolta]i la maturitate, se face `n vase speciale deschise, sub ac]iunea drojdiilor din flora natural\ sau a unor tulpini selec]ionate.

Pe struguri, `n must [i respectiv `n vin, exist\ un num\r `nsemnat de microorganisme, bacterii [i ciuperci care iau parte la procesul de fermenta]ie, având fie un rol pozitiv `n cazul fermenta]iilor normale, fie un rol negativ, de "`mboln\vire" a vinului, când declan[eaz\ unele procese fermentative care duc la efecte nedorite.

Levurile Levurile sunt ciuperci microscopice care au capacitatea de a produce

fermenta]ia caracteristic\ a mediilor ce con]in zaharuri (levere = a ridica). Ele sunt grupate din punct de vedere sistematic `n sub`ncr. Ascomycotina, fam. Saccharomycetaceae [i `n sub`ncr. Deuteromycotina (Fungi imperfe]i), fam. Cryptococcaceae.

R\spândirea levurilor Levurile sunt larg r\spândite `n natur\, ele se `ntâlnesc `n sol, ape, pe

plante, flori, fructe etc. Solul este considerat rezervorul principal al levurilor, unde num\rul lor

este `n medie de ≈ 250.000 pe gramul de sol. ~n general, se `ntâlnesc `n stratul superficial cuprins `ntre 2-10 cm iar `n

solurile podgoriilor pân\ la 30-40 cm, atât ca forme vegetative cât [i forme de rezisten]\.

Levurile apar pe boabe `n timpul matur\rii acestora [i sunt r\spândite de insecte (`n special Drosophylla) prin intermediul particulelor de praf [i nu `n ultimul rând odat\ cu stropii provoca]i de ploi.

Levurile ce se g\sesc pe struguri apar]in la mai multe specii, propor]ia dintre ele fiind diferit\ `n func]ie de mai mul]i factori: condi]iile climatice, starea de s\n\tate a recoltei, con]inutul `n zah\r al mustului etc.

Principalele levuri `ntâlnite `n vin Levuri sporogene Saccharomyces ellipsoideus (Sacch. cerevisiae), prezint\ importan]a

cea mai mare pentru fermenta]ia mustului. Levurile acestei specii au form\ elipsoidal\ sau globuloas\.

La fermentarea mustului prezint\ un randament ridicat realizând `n medie 1 ml alcool pur din 1,7 g zah\r [i rezist\ pân\ la concentra]ii de 16 % vol. alcool, uneori chiar mai mult.

Temperatura optim\ este de 20-25oC [i suport\ concentra]ii de pân\ la 250-300 mg.l SO2 total.

Dup\ declan[area fermenta]iei ele pun st\pânire rapid pe mediu pentru ca la sfâr[itul procesului num\rul lor s\ scad\ foarte mult.

Saccharomyces oviformis. Se prezint\ sub form\ oval\, uneori rotund\. Aceast\ levur\ este specific\ regiunilor calde unde strugurii realizeaz\ concentra]ii ridicate `n zah\r. Prezint\ acela[i randament `n alcool dar are o putere alcooligen\ mai mare decât Sacch. ellipsoideus dep\[ind uneori 18 % vol. alcool.

Specia devine dominant\ spre sfâr[itul fermenta]iei [i suport\ concentra]ii de pân\ la 300 mg/l SO2 total [i 100 mg/l SO2 liber.

Este considerat\ o bun\ levur\ de finisaj la prepararea vinurilor seci, ob]inute din musturi bogate `n zah\r. ~n schimb trebuie inactivat\ sau `nl\turat\

56

din vinurile demiseci, demidulci [i dulci, `ntrucât majoritatea accidentelor de refermentare se datore[te acestei specii.

Saccharomyces acidifaciens (Sacch. bailii). Specie rezistent\ la concentra]ii mari de SO2, putându-se dezvolta pân\

la concentra]ii de 12 % vol. alcool. Provoac\ `mboln\virea vinurilor demiseci [i dulci sulfitate.

Contaminarea este facilitat\ de proprietatea ei de a fermenta cu u[urin]\ fructoza l\sând neatins\ glucoza.

Cum majoritatea levurilor fermenteaz\ mai `ntâi glucoza `n vinurile dulci-licoroase zah\rul restant este constituit `n principal din fructoz\.

Saccharomyces chevalieri, se aseam\n\ sub raporul activit\]ii fermentative cu Saccharomyces ellipsoideus dar sunt pu]in `ntâlnite `n vinuri.

Saccharomyces bayanus, este prezent\ `n toate regiunile viticole dar se `ntâlne[te `n propor]ii foarte mici la fermentarea mustului când formeaz\ propor]ii m\rite de acizi volatili [i glicoli.

Saccharomyces italicus, Sacch. uvarum, Sacch, florentinus, sunt levuri specifice `n general regiunilor viticole meridionale, au propriet\]i asem\n\toare speciei Sacch. ellipsoideus dar cu o fermentare mai lent\ decât aceasta.

Saccharomyces rosei, levur\ prezent\ constant pe struguri [i `n musturi care fermenteaz\.

Au proprietatea de a fermenta lent, dar regulat, cantit\]i importante de zah\r f\r\ formarea de acizi volatili. Este folosit\ pentru ob]inerea vinurilor cu un con]inut de pân\ la 12 % vol. alcool, pentru vinuri cu rest de zah\r precum [i pentru recolte atacate de man\ [i putregai cenu[iu, la care ob]inerea de vinuri cu aciditate volatil\ sc\zut\ este o problem\ dificil\.

Pichia membranefaciens, P. fermentans [i Hansenula anomala, sunt levuri cu putere alcooligen\ slab\, sunt `ncadrate `n categoria levurilor patogene, care `n condi]ii oxidative provoac\ vinurilor boala denumit\ "floare".

De asemeni, afecteaz\ calitatea vinurilor prin propor]ii ridicate de esteri, acetat de etil, acetat de amil pe care `l formeaz\ [i care imprim\ mirosuri nepl\cute.

Saccharomycoides ludwigii, este o levur\ de dimensiuni mari, de form\ apiculat\, rar `ntâlnit\ pe struguri [i `n musturi normale. Excep]ional de rezistent\ la SO2 (700-1000 mg/l) [i este specific\ musturilor p\strate cu doze mari din acest antiseptic. Este o levur\ patogen\ pentru vinurile demiseci sau dulci aflate `n butoaie sau sticle c\rora le provoac\ referment\ri.

Hanseniospora valbyensis, H. uvarum, H. osmophila. Levur\ apiculat\, specific\ vegeta]iei calde, provoac\ declan[area fermenta]iei a[a cum `n regiunile r\coroase acest proces este declan[at de Kloeckera apiculata. Are capacitate mare de a asimila azota]i.

Levuri nesporogene Torulopsis stellata. Levur\ prezent\ pe struguri stafidi]i `n urma

apari]iei mucegaiului nobil. Prezint\ o rezisten]\ mai mare decât levurile apiculate, la concentra]ii

de SO2 [i alcool dar mai sc\zut\ decât Sacch. ellipsoideus. Brettonomyces intermedius. Numele genului se datoreaz\ ac]iunii unor

specii de a imprima berei britanice gust [i arom\ caracteristice `n urma unor procese secundare de fermenta]ie.

Speciile acestui gen sunt `ntâlnite `n propor]ii mici `n musturi [i vin. Mai frecvent se `ntâlnesc `n vinurile bolnave de floare, o]etite. Prezen]a lor favorizeaz\ formarea de acetat de etil [i al]i compu[i ce dau mirosuri intense cu iz de [oarece.

57

Candida vini (Candida vini, Mycoderna vini). Speciile acestui gen sunt cunoscute sub denumirea de "levuri de

floare"producând boala denumit\ floarea vinului, caracterizat\ prin formarea unei pelicule la suprafa]a vinurilor slab alcoolice, p\strate `n vase incomplet pline.

Kloeckera apiculata, cunoscut\ [i sub denumirea de levur\ s\lbatic\, este extrem de r\spândit\ pe toate fructele `n regiunea cu climat temperat-r\coros. Prezint\ celule sub form\ de l\mâie, având unul sau ambele capete ascu]ite.

~n practic\ sunt cunoscute sub denumirea de levuri apiculate. Acestea apar pe bace la faza de pârg\, iar la maturitatea deplin\ a strugurilor reprezint\ 99 % din totalul levurilor existente `n acest moment.

Ele declan[eaz\ fermenta]ia mustului, având o capacitate foarte mare de `nmul]ire. randamentul `n alcool este mai sc\zut decât al levurilor eliptice. Ele consum\ pentru l ml alcool pur 2,1 g zah\r.

Puterea alcooligen\ este redus\ realizând 4-5 % vol. alcool, concentra]ie maxim\ pân\ la care aceast\ specie poate rezista.

Prezint\ o sensibilitate mai mare decât levurile eliptice la SO2. Rhodotorula mucilaginosa, Rh. glutinis sunt levuri denumite [i

mucilaginoase deoarece produc mucilagii `n musturi [i vinurile tinere s\race `n aciditate [i formeaz\ pigmen]i carotenoizi galbeni pân\ la ro[ii.

Se `ntâlnesc `n pivni]ele de vinuri `n care formeaz\ `mpreun\ cu unele bacterii [i alte ciuperci depuneri mucilaginoase pe pere]ii umezi. De[i, sensibile la alcool prezint\ o rezisten]\ mare la temperaturi ridicate (50-60oC) [i la ac]iunea substan]elor alcaline (fosfat trisodic 1 %). Rezist\ la ac]iunea acidului boric pân\ la concentra]ia de 3 %.

Mucegaiurile Ciupercile care formeaz\ colonii pufoase vizibile cu ochiul liber, `n

practic\ sunt denumite mucegaiuri. Mucegaiurile, obi[nuit aerobe, sunt foarte r\spândite `n natur\,

`ntâlnindu-se aproape `n toate mediile, datorit\ capacit\]ii mari de `nmul]ire [i de r\spândire precum [i a rezisten]ei mari la condi]iile mai pu]in prielnice de mediu.

Sunt frecvent `ntâlnite `n vii, pe frunze, boabe, `n sol, pe utilajele [i pere]ii pivni]elor, precum [i la suprafa]a mustului `n primele etape de vinifica]ie. Mucor racemosus, produce `n vie infec]ia strugurilor pe vreme ploioas\. ~n cazul `n care se afl\ complet scufundate `n must ciuperca se prezint\ sub form\ de fragmente de sifonoplast; are capacitatea de a produce fermentarea mustului pân\ la 5-7 % vol. alcool Mucor circinelloides, este o alt\ specie care este folosit\ la fabricarea berei. Mucor piriformis, oxideaz\ par]ial glucidele cu formarea oxizilor citric, oxalic, gluconic etc. Rhizopus nigricans este frecvent pe strugurii v\t\ma]i, `n pivni]e sau pe utilajele folosite `n vinifica]ie, formând pe suprafa]a substratului degradat un mucegai de culoare negricioas\. Prezint\ capacitate mic\ de fermenta]ie. Aspergillus niger, se dezvolt\ `n crame [i pivni]e, pe vase vinicole, dopuri, formând un mucegai negru. Aspergillus glaucus, se `ntâlne[te mai frecvent pe suporturi lemnoase din pivni]e. Penicillium glaucum, produce putrezirea boabelor incomplet coapte sau strugurii v\t\ma]i de insecte sau grindin\.

58

Dac\ contaminarea se extinde devreme se pot produce pierderi de recolt\ importante, boabele atacate fiind complet distruse. Când atac\ strugurii cop]i, mustul ob]inut are gust amar. ~n crame [i pivni]e se dezvolt\ pe dopuri, vase vinicole etc., p\trunzând `n lemnul doagelor. ~n timpul fructific\rii secret\ esteri cu gust [i miros caracteristic de mucegai ce se transmit vinului. Genul Merulius cuprinde specii extrem de p\gubitoare care se dezvolt\ `n pivni]e, pe butoaie, c\zi, pe rafturi, stelaje [i orice obiect din lemn pe care se formeaz\ un miceliu alb, cu aspect buretos. Speciile genului Merulius formeaz\ substan]e cu miros specific nepl\cut, unele atac\ numai celuloza, altele numai lignina, transformând lemnul `ntr-o mas\ moale, de culoare brun\ sau alb\. Merulius lachrymans, denumit\ popular ciuperca igrasiei sau buretele de cas\, formeaz\ un mucegai alb-cenu[iu [i filamente izolate sau cordoane compacte. Cladosporium cellare. Se dezvolt\ pe toate substraturile lemnoase dar [i pe pere]ii pivni]elor [i chiar pe ramele de fier, grilaje, sârme etc., datorit\ capacit\]ii acesteia de a provoca microcondensarea pe suprafa]a hifelor sale, a moleculelor compu[ilor organici [i anorganici `n stare de vapori, existen]i `n aerul din pivni]\. ~n unele pivni]e acest mucegai se dezvolt\ pe pere]i `ntr-un strat gros cu aspect de catifea [i datorit\ capacit\]ilor sale de a purifica aerul [i de a regla umiditatea atmosferic\, realizeaz\ condi]ii deosebite pentru maturarea [i `nvechirea vinurilor. Botryotinia fuckeliana prezint\ ca form\ conidian\ Botrytis fuckeliana [i produce "putregaiul cenu[iu al strugurilor".

Aceast\ boal\ apare la intrarea `n pârg\ [i este favorizat\ de cr\parea sau r\rirea pieli]ei boabelor, produc]ia `n unii ani putând fi diminuat\ cu 60-90 %. Vinurile ob]inute din strugurii ataca]i de aceast\ ciuperc\ sunt slab alcoolice, nepl\cute la gust, cu miros specific de mucegai [i care se `mboln\vesc u[or. ~n unele toamne secetoase, cu dimine]i nelipsite de rou\ apare a[a numitul "putregai nobil", care conduce la ob]inerea unui must de `nalt\ calitate. ~n acest caz scade mult con]inutul boabelor `n ap\ [i cre[te concentra]ia `n zah\r (de la 200-220 pân\ la 400-500 g/l). Produc]ia scade mult, uneori cu peste 40 %, dar se ob]in vinuri cu o arom\ buchet deosebit\ [i foarte pl\cut\. Bacteriile vinului Bacteriile prezint\ o mare importan]\ pentru calitatea vinurilor. Unele dintre ele `n anumite condi]ii pot contribui prin activitatea lor la `mbun\t\]irea acesteia; cele mai multe pot provoca vinurilor transform\ri nedorite [i chiar `mboln\viri grave. ~n perioada recolt\rii strugurilor pe pieli]a boabelor, pe lâng\ levuri [i mucegaiuri se g\sesc [i bacterii, dar pot fi `ntâlnite de asemenea `n crame [i pivni]e, `ndeosebi pe suprafa]a intern\ a butoaielor [i cisternelor `n care se fermenteaz\ mustul sau se p\streaz\ vinul [i care nu a fost corect cur\]ate [i `ntre]inute. Dup\ procesele pe care le declan[eaz\, bacteriile au fost grupate `n: - bacterii lactice; - bacterii acetice.

59

Bacteriile acetice Sunt microorganisme aerobe, se `ntâlnesc atât pe strugurii s\n\to[i cât [i pe cei v\t\ma]i, precum [i `n musturi sau vinuri, mai ales când sunt p\strate `n vase incomplet pline. Bacteriile acetice care se dezvolt\ `n vin formeaz\ la suprafa]a acestuia un v\l sau o pelicul\ care uneori poate fi albuie, sub]ire, aproape transparent\ cu reflexe irizante [i care poate urca rapid pe pere]ii vasului. Alteori acest v\l este mai gros, uleios, hidrofob [i se coloreaz\ pe m\sura `mb\trânirii `n brun. ~ntr-un al treilea caz v\lul format atinge mai mul]i milimetri grosime, este vâscos, greu de desf\cut [i care cu timpul cade la fundul vasului, cunoscut [i sub numele de cuib de o]et. Genul Acetobacter Acest gen grupeaz\ specii cu celule sub form\ de bastona[e dispuse izolat, `n perechi sau lan]uri ce sunt imobile sau prev\zute cu cili dispu[i peritriche. Speciile genului Acetobacter produc oxidarea etanolului pân\ la acid acetic, la un pH de aproximativ 4, precum [i a acidului acetic a lacta]iilor [i aminoacizilor. Ciclul Krebs este prezent [i activ. Se dezvolt\ la temperaturi cuprinse `ntre 5-42oC, cu un optim de 30oC. Speciile cele mai importante sunt: - Acetobacter aceti; - Acetobacter pasteurianus; - Acetobacter peroxydans. Genul Gluconobacter Cuprinde bacterii asem\n\toare din punct de vedere morfologic cu speciile genului Acetobacter. Singurul criteriu de diferen]iere `l reprezint\ flagela]ia când aceasta exist\. Astfel, speciile genului Gluconobacter sunt lofotriche (3-8 cili la fiecare pol) fa]\ de cilia]ia peritriche la Acetobacter. Produc oxidarea moderat\ a etanolului pân\ la acidul acetic la un pH=4,5.

Temperatura optim\ de dezvoltare este 25-30oC dar varia]ia acesteia poate fi cuprins\ `ntre 7-41oC.

Fiziologic se deosebe[te de genul Acetobacter prin urm\toarele propriet\]i:

- ciclul Krebs nu este complet. - nu oxideaz\ acidul acetic [i lacta]ii pân\ la CO2. Bacterii lactice Reprezentan]ii acestui grup sunt facultativi-anaerobi [i particip\ la o

serie de transform\ri `n vin [i anume: - transformarea glucidelor `n acid lactic [i al]i produ[i secundari

(glicerol, alcool etilic, acid acetic etc); - fermenta]ia malolactic\; - degradarea acidului tartric, citric; - degradarea glicerolului [i a altor componen]i. Genul Pediococcus Cuprinde bacterii Gram (+) cu aspect sferic grupate sub form\ de

diplococi sau tetracoci. Sunt nesporulate, imobile, homofermentative. Fermenteaz\ glucidele,

iar acidul malic numai la pH ridicat. Nu degradeaz\ acidul citric [i tartric, din acest motiv nu sunt considerate d\un\toare.

Prezint\ dou\ specii importante:

60

- Pediococcus cerevisiae; - Pediococcus pentosacens. Genul Leuconostoc Cuprinde bacterii Gram (+), cu celule de form\ sferic\, ovoid\ sau

alungit\, dispuse sub forma unor [iraguri de m\rgele ca [i streptococii. Produc fermenta]ia malolactic\ numai `n vinuri foarte acide, nesulfitate

sau cu un con]inut redus de SO2. Principalele specii: - Leuconostoc gracile, este specia cea mai frecvent\ `n vinuri.

Descompune energic acidul malic [i `n m\sur\ mai mic\ acidul citric. - Leuconostoc oinos A, X, P. Genul Lactobacillus Grupeaz\ bacterii Gram (+) [i cuprinde atât specii homofermentative

cât [i specii heterofermentative. Specii homofermentative: Lactobacillus plantarum se prezint\ sub form\ de bastona[e scurte,

izolate sau grupate. Lactobacillus casei, se prezint\ sub forma unor bacili lungi [i sub]iri

izola]i sau grupa]i. Specii heterofermentative: - Lactobacillus fructivorans; - Lactobacillus hilgardii; - Lactobacillus brevis.

61

1. Fermenta]ia alcoolic\ a mustului este realizat\ de:

a) bacterii acetice

b) mucegaiuri

c) levuri

d) bacterii lactice

2. Permanentizarea levurilor se realizeaz\:

a) pe vasele de vinifica]ie

b) pe plantele de vi]\ de vie

c) `n sol

d) `n aer

3. Specia cu putere alcooligen\ cea mai mare este:

a) Candida vini

b) Kloeckera apiculata

c) Saccharomyces oviformis

d) Saccharomyces ellipsoideus

4. Putregaiul nobil al strugurilor este produs de:

a) Merulius lachrymans

b) Aspergillus niger

c) Botryotinia fuckeliana

d) Cladosporium cellare

5. Fermenta]ia malolactic\ a vinului este produs\ de:

a) levuri

b) bacterii lactice

c) bacterii acetice

d) mucegaiuri

Rezultate corecte:

1 - c; 2 - c; 3 - c; 4 - c; 5 - b.


62

1. Fermenta]ia alcoolic\ Materiile prime folosite la fabricarea alcoolului sunt: - materii prime amidonoase. - materii prime zaharoase. - materii prime celulolitice.

2. Utilizarea microorganismelor `n vinifica]ie Levurile

Principalele levuri `ntâlnite `n vin Levuri sporogene

Saccharomyces spp Pichia spp.. Saccharomycoides sp.

Hanseniospora spp Levuri nesporogene

Torulopsis sp Brettonomyces sp Candida sp.

Kloeckera sp Rhodotorula sp. Mucegaiurile

Mucor spp. Rhizopus sp Aspergillus spp. Penicillium spp Merulius sp. Cladosporium sp. Botryotinia sp Bacteriile vinului Bacteriile acetice Genul Acetobacter Genul Gluconobacter

Bacterii lactice Genul Pediococcus Genul Leuconostoc Genul Lactobacillus

REZUMAT MODUL III

63

1. EXAMENUL MICROSCOPIC AL MICROORGANISMELOR

Microscopul este un instrument optic cu ajutorul c\ruia pot fi v\zute [i studiate corpuri foarte mici, situate mult sub limita vizibilit\]ii cu ochiul liber. Microscoapele au suferit `n decursul timpului multiple perfec]ion\ri care au permis s\ se m\reasc\ imaginea obiectivului de cercetat de mai multe mii de ori. Perfec]ion\ri ulterioare, mai ales la microscopul electronic, au permis a fi v\zute particule cu dimensiuni de 100 de ori mai mici ca cele observate cu microscoapele optice cele mai puternice. Microscopul optic este format din dou\ p\r]i [i anume: - partea mecanic\; - partea optic\. Partea mecanic\ a microscopului este la rândul ei constituit\ din: 1 piciorul microscopului; 2. platina; 3. tubul [i dispozitivele de punere la punct a imaginii (viza macrometric\ [i viza micrometric\). 1. Piciorul microscopului are `n general forma de potcoav\ sau la tipurile moderne, forma paralelipipedic\ `n care este inclus\ [i sursa de lumin\. 2. Corpul microscopului sau coloana, poate face corp comun cu piciorul sau este legat\ cu ajutorul unei articula]ii care permite `nclina]ii pân\ la 90o. 3. Platina sau masa microscopului, este fixat\ de coloan\ [i intercalat\ `ntre dispozitivul de iluminat [i tubul microscopic, pe ea fixându-se preparatul de examinat. Platina poate fi p\trat\ sau rotund\ [i prezint\ `n centru o deschidere circular\ pentru trecerea razelor luminoase. Platinele pot fi fixe sau mobile, fiind `n cel din urm\ caz deplasabile cu ajutorul a dou\ [uruburi de centrare. Preparatul se fixeaz\ pe platin\ cu ajutorul a doi cavaleri (lame metalice flexibile) sau se a[eaz\ pe a[a numitul "c\rucior mobil". C\ruciorul este prev\zut cu o rigl\ gradat\ [i cu un "vernier" pentru determinarea pozi]iei obiectivului de observat, `n cele dou\ direc]ii de deplasare. 4. Tubul microscopului are la partea inferioar\ revolverul, care este constituit din dou\ calote concentrice dispuse una peste alta [i unite la mijloc printr-un [urub. ~n revolver se `n[urubeaz\ obiectivele `ntr-o anumit\ ordine, `n a[a fel ca rotirea acestuia `n sensul acelor de ceasornic s\ aduc\ `n axul optic al microscopului obiective din ce `n ce mai puternice. La partea superioar\ a tubului se afl\ ocularul. Tubul este fixat printr-un jgheab vertical la coloana microscopului [i poate fi mi[cat cu ajutorul unui

MODULUL IV

LUCR|RI PRACTICE

64

[urub cu cremalier\, `n sus [i `n jos; este `nnegrit `n interior pentru a nu reflecta lumina. Dispozitivul de punere la punct a imaginii este format din dou\ perechi de [uruburi. Prima pereche serve[te la mi[c\ri rapide prin intermediul cremalierei [i se nume[te viz\ macrometric\. Punerea la punct a imaginii se face cu ajutorul vizei micrometrice care este situat\ `n coloana microscopului. Partea optic\ a microscopului este format\ din: - aparatul de luminat; - obiectivele [i ocularele. Aparatul de iluminat fixat sub platin\, are ca scop s\ permit\ observarea preparatului microscopic prin lumina transmis\. El se compune din: oglind\, diafragm\ [i condensator. Oglinda `ndreapt\ razele luminoase furnizate de c\tre sursa natural\ sau artificial\ `n axul optic al microscopului, dup\ ce acestea au trecut prin condensator. Oglinda are o fa]\ plan\ care se folose[te când se lucreaz\ cu condensatorul, iar cea concav\ când se lucreaz\ f\r\ condensator [i cu obiective mici. ~ntre oglind\ [i condensator se g\se[te de obicei un inel care se poate scoate la nevoie din axul optic al microscopului [i `n care se pot a[eza discuri de sticl\, mat\ sau colorat\ diferit, ce poart\ numele de filtre. Când se folose[te lumina artificial\ se lucreaz\ cu filtru albastru care permite o mai bun\ apreciere a nuan]elor `n raport cu obiectivul folosit. Diafragma iris se g\se[te situat\ deasupra inelelor portfiltre [i serve[te la limitarea fasciculelor de raze provenite de pe oglind\, ce intr\ `n condensator. Diafragma poate fi `nchis\ sau deschis\, `n raport cu obiectivul folosit. Condensatorul, situat sub platin\ este format dintr-un sistem de lentile convergente, care concentreaz\ lumina pe preparatul de observat. Obiectivele sunt sisteme de lentile, care dau o prim\ imagine real\ m\rit\ [i r\sturnat\ a obiectivelor de examinat. Imaginea furnizat\ de obiectiv este prins\ de c\tre ocular, situat la partea superioar\ a tubului; aceast\ imagine este din nou m\rit\ [i transformat\ `n imagine virtual\. Obiectivele sunt de dou\ categorii [i anume: - obiective acromatice; - obiective apocromatice. Aceste obiective se deosebesc prin corec]ia mai mult sau mai pu]in perfect\ a abera]iilor cromatice [i de sfericitate. Obiectivele se mai `mpart `n: obiective uscate [i obiective umede sau cu imersie. Acestea difer\ dup\ natura mediului ce se interpune `ntre lentila frontal\ [i obiectul de examinat. La obiectivele uscate acest mediu este aerul a c\rui indice de refrac]ie (n=1) este foarte diferit de indicele mediu al sticlei (n=1,5). La obiectivele cu imersie mediul ce separ\ lentila frontal\ de lama portobiect este lichid, cu un indice de refrac]ie apropiat de cel al sticlei. el mai utilizat este uleiul de cedru, al c\rui indice este (n=1,515). ~n cazul obiectivelor uscate, toate razele luminoase a c\ror `nclinare, `n raport cu axa, dep\[e[te o anumit\ valoare, sufer\ reflexia total\ `n momentul trecerii din lama de sticl\ `n aer. Prin interpunerea uleiului de cedru `ntre lentila frontal\ a obiectivului [i lama portobiect se suprim\ reflexia total\ [i refrac]ia, ob]inându-se o luminozitate mai mare a imaginii.

65

Ocularele Ocularul este alc\tuit din dou\ lentile plan-convexe montate `ntr-un cilindru metalic [i separate `ntre ele printr-o diafragm\. Ele transform\ imaginea dat\ de obiectiv `ntr-o imagine virtual\, m\rit\ [i dreapt\. Puterea de m\rire a microscopului, este produsul dintre puterea de m\rire a obiectivului [i cea a ocularului. Dispozitivul optic al microscopului obi[nuit permite o m\rire medie `ntre 900 [i 2000 ori. Sursele de lumin\ Pentru luminarea preparatului microscopic se utilizeaz\ fie lumina zilei, fie lumina artificial\, furnizat\ de diferite tipuri de l\mpi. Punerea la punct a imaginii microscopice se face diferen]iat: Pentru obiectivele uscate, dup\ centrarea luminii, `nainte de a pune preparatul de platin\, se va ridica tubul cu ajutorul vizei macrometrice pân\ la o distan]\ mai mare decât distan]a frontal\ a obiectivului celui mai mic (2-3 cm). Dup\ ce s-a montat preparatul de examinat pe platin\, se coboar\ tubul cu ajutorul vizei macrometrice pân\ ce apare imaginea, dup\ care se folose[te viza micrometric\. Pentru obiectivele cu imersie, dup\ ce s-a f\cut centrarea perfect\ a sursei de lumin\, folosind oglinda plan\ [i condensatorul ridicat, cu diafragma deschis\, se pune preparatul pe platin\ [i se fixeaz\ cu cei doi cavaleri. Se pune apoi o pic\tur\ de ulei de cedru pe lam\ [i se coboar\ tubul microscopului cu viza macrometric\ pân\ ce, privind lateral, observ\m c\ lentila frontal\ a obiectivului cu imersie ajunge `n contact cu pic\tura de ulei de cedru. Din acest moment vom privi prin ocular [i vom continua coborârea tubului cu ajutorul vizei micrometrice pân\ ce imaginea este clar\. Dup\ terminarea examin\rii, `nainte de a scoate lama de pe platina microscopului se ridic\ tubul microscopului cu viza macrometric\ pentru a nu se zgâria lentila frontal\ a obiectivului, iar uleiul de cedru de pe obiectivul cu imersie se [terge cu pulpa degetului. ~ntre]inerea microscopului Microscopul trebuie ferit de praf, vapori, acizi [i umezeal\, pentru care, dup\ `ncetarea lucrului se pune `n cutia lui sau se protejeaz\ cu o hus\ din folie de polietilen\. Se `ntre]ine periodic [tergând ocularele [i obiectivele cu piele de c\prioar\ sau `n lips\, cu o cârp\ moale care nu las\ scame. Obiectivul cu imersie se [terge din timp `n timp cu vat\ cu xilol.

M|SUR|TORI MICROSCOPICE Microorganismele au dimensiuni care se `ncadreaz\ `ntre anumite limite [i care caracterizeaz\ genurile [i speciile respective. Fiind de dimensiuni foarte mici, nu se pot m\sura direct, ci indirect cu ajutorul unei sc\ri arbitrare. Cel mai obi[nuit procedeu de m\surare microscopic\ este al ocularului micrometric care se etaloneaz\ cu micrometru obiectiv. Micrometrul obiectiv este etalonul ce st\ la baza m\sur\torilor microscopice. Este constituit dintr-o lam\ portobiect pe care este gravat\ la mijloc o scar\ lung\ de 1 mm, divizat\ `n 100 p\r]i egale. Intervalul care separ\ dou\ diviziuni este de 1/100 mm (0,01 mm sau 10 micrometri = 10 µm). Pentru a u[ura observa]ia, dup\ primele 5 diviziuni mici avem o diviziune ceva mai lung\, iar din 10 `n 10 diviziuni câte o linie [i mai lung\; `n felul acesta putem determina u[or un num\r anumit de diviziuni. Micrometrul ocular are form\ circular\, fiind un disc de sticl\ cu diametrul potrivit, `ncât se poate introduce `n montura metalic\ a ocularului. Pe el este o scar\ de 1 cm `mp\r]it\ `n 100 de p\r]i, deci fiecare diviziune are 0,1

66

mm sau 100 µm. Diviziunile sunt [i aici diferen]iate pe lungimi ca [i la micrometrul obiectiv. Pentru a cunoa[te pentru fiecare combina]ie de ocular [i obiectiv pe care le are un microscop, valoarea `n micrometri a unei diviziuni de pe micrometrul ocular, se determin\ indicele sau coeficientul micrometric dup\ cum urmeaz\. Determinarea indicelui micrometric Se a[eaz\ nicrometrul ocular `n tubul ocularului, iar lama micrometrului obiectiv pe platina microscopului. Se potrive[te scara micrometrului ocular ca s\ se suprapun\ peste cea a micrometrului obiectiv. Pentru calcularea coeficientului micrometric ne servim de formula:

noc

nobx10 `n care:

n ob = num\rul de diviziuni ale micrometrului obiectiv care se suprapune peste un anumit num\r de diviziuni ale micrometrului ocular; n oc = num\rul de diviziuni ale micrometrului ocular care s-au suprapus peste un anumit num\r de diviziuni ale micrometrului obiectiv. Astfel, dac\ 5 diviziuni ale micrometrului obiectiv acoper\ 10 diviziuni ale micrometrului ocular, coeficientul micrometric va fi:

10105x

= 1050

= 5

Coeficientul micrometric se calculeaz\ pentru fiecare combina]ie de ocular [i obiectiv [i de obicei se fac tabele din care se extrag valorile necesare gata calculate. Pentru efectuarea m\sur\torii unui microorganism se procedeaz\ `n felul urm\tor: Se pune lama portobiect sau frotiul preg\tit pe platina microscpului, se fixeaz\ lumina [i imaginea, dup\ care se m\soar\ lungimea, l\]imea sau diametrul obiectivului respectiv cu ajutorul sc\rii micrometrului ocular care a r\mas montat\ `n ocularul respectiv. Num\rul de diviziuni ce rezult\ din m\sur\toare se `nmul]e[te cu coeficientul micrometric al combina]iei ocular obiectiv cu care s-a lucrat [i se ob]ine astfel valoarea `n micrometri a dimensiunilor c\utate. Pentru a se m\ri precizia, se recomand\ s\ se fac\ un num\r mai mare de m\sur\tori [i apoi media lor, care ne d\ mai exact valoarea dimensiunilor unor microorganisme.

2. STERILIZAREA Prin sterilizare se `n]elege distrugerea sau `ndep\rtarea microorganismelor dintr-un spa]iu sau de pe o suprafa]\ dat\. Metodele folosite `n acest scop sunt numeroase [i utilizarea lor depinde de natura mediului pe care `l steriliz\m. Dup\ natura agentului, metodele de sterilizare pot fi de dou\ feluri: prin agen]i fizici [i prin agen]i chimici. Sterilizarea prin agen]i fizici ~n acest scop se folosesc mai multe metode de sterilizare cum sun: c\ldura, filtrarea, centrifugarea, radia]iile ultraviolete [i ultrasunetele.

67

Sterilizarea prin c\ldur\ Este metoda cel mai des utilizat\ `n microbiologie, fie sub form\ de c\ldur\ uscat\ sau de c\ldur\ umed\. Ac]iunea distrug\toare a c\ldurii asupra microbilor se exercit\ prin coagularea proteinelor care intr\ `n constitu]ia acestora, sau prin carbonizare. Sterilizarea prin c\ldur\ uscat\ se poate realiza `n mai multe moduri: - `nc\lzirea la ro[u se folose[te pentru sterilizarea fierului sau ansei de platin\ [i a spatulei `nainte de `ntrebuin]are [i dup\; metoda const\ `n a men]ine obiectul de sterilizat `n flac\ra unui bec de gaz sau a unei l\mpi de alcool, pân\ la `nro[ire. De obicei `nainte de sterilizare instrumentele respective se las\ s\ se r\ceasc\ pu]in. - flambarea const\ `n trecerea obiectului de câteva ori, timp de câteva secunde, prin flac\r\; `n acest fel substan]ele organice aflate eventual pe obiect sunt carbonizate. Flambarea serve[te la sterilizarea pipetelor `n momentul `ntrebuin]\rii, a gâtului flacoanelor [i al eprubetelor. Instrumentele de metal ca, bisturie, foarfeci, pense nu se flambeaz\ deoarece se deterioreaz\. - sterilizarea prin aer cald se bazeaz\ pe carbonizarea materiei vii cu ajutorul temperaturii `nalte: aerul `nc\lzit la 180oC `n etuv\ distruge atât formele vegetative cât [i sporii `n timp de o or\. Aceast\ metod\ se folose[te pentru sterilizarea obiectelor de sticl\ (baloane, eprubete, tuburi de sticl\, pl\ci Petri, pâlnii, fiole etc.) obiecte din por]elan (capsule, mojare), instrumente chirurgicale (foarfece, bisturie, pense). Pentru a fi men]inut\ `n stare steril\ [i curat\, sticl\ria ce urmeaz\ a fi supus\ steriliz\rii se preg\te[te `n prealabil, dup\ ce a fost sp\lat\, cur\]at\ [i uscat\. Astfel, baloanele, eprubetele [i pipetele, vor fi acoperite cu dopuri de vat\, iar pl\cile Petri, pipetele gradate, mojarele, capsulele etc. vor fi ambalate `n hârtie pergament. Obiectele de sterilizat se introduc `n etuv\ care se regleaz\ pentru temperatura de 180oC [i se a[eaz\ `n interiorul etuvei pe rafturi; eventual eprubetele se pot introduce `n co[uri de sârm\ special confec]ionate. Men]inerea temperaturii la 180oC trebuie s\ dureze o or\, dup\ care se las\ se se r\ceasc\ aparatul sub 100oC, `nainte de a-l deschide; astfel obiectele care vin `n contact cu aerul rece se pot sparge. Dac\ temperatura `n etuv\ dep\[e[te 180oC dopurile [i hârtia de ambalaj devin brune, sf\râmicioase [i nu mai asigur\ o protec]ie suficient\ `mpotriva unei eventuale reinfect\ri. Pentru a ne asigura c\ s-a realizat temperatura de 180oC se introduce `n etuv\ odat\ cu sticl\ria de sterilizat pu]in\ zaharoz\ care se caramelizeaz\ la 170oC. Sterilizarea prin c\ldur\ umed\ este mai des folosit\ `n microbiologie deoarece se realizeaz\ distrugerea eficace a germenilor la o temperatur\ mult mai joas\, c\ldura umed\ având putere de p\trundere mai mare. Sterilizarea prin c\ldur\ umed\ se poate realiza `n mai multe feluri: prin fierbere, prin vapori produ[i continuu, prin vapori sub presiune [i la temperatura sub 100oC (pasteurizarea [i tindalizarea). Fierberea este folosit\ curent la sterilizarea unor instrumente ca, seringi cu arm\tur\ metalic\ (acestea trebuiesc montate `nainte de introducerea `n fierb\tor), timp de 30'. Se folose[te apa distilat\ pentru a se evita depunerea s\rurilor pe obiectele de sterilizat, iar pentru a se ridica punctul de fierbere, `n apa distilat\ de adaug\ borax. Prin aceast\ metod\ nu sunt distruse unele forme sporulate care rezist\ pân\ la 120oC; de aceea obiectele sterilizate prin fierbere se folosesc `n urm\toarele dou\ ore [i nu se men]in un timp mai `ndelungat. Pasteurizarea se realizeaz\ prin `nc\lzirea pe baia de ap\ a substan]elor repartizate `n diverse flacoane la temperatura de 55-95oC, urmat\ de r\cirea

68

brusc\ [i men]inerea la +4oC. ~nc\lzirea are ca scop distrugerea formelor vegetative, iar r\cirea brusc\ [i men]inerea la temperatur\ sc\zut\ `mpiedic\ germinarea formelor de rezisten]\. Aceast\ metod\ se aplic\ lichidelor supuse unei alter\ri rapide, `n scopul de a le men]ine valoarea factorilor activi. Tindalizarea este o metod\ de sterilizare frac]ionat\ sau discontinu\, prin care se realizeaz\ o sterilizare complet\, distrugându-se atât formele vegetative cât [i sporii; metoda serve[te la sterilizarea substan]elor care se degradeaz\ cu u[urin]\ la temperaturi mai ridicate, cum sunt mediile ce con]in glucide, serul sanguin etc. Metoda const\ `n `nc\lzirea substan]elor ce urmeaz\ a fi sterilizate, câte o or\ pe zi la temperaturi `ntre 56-65oC `ntr-o baie de ap\, timp de trei zile succesiv. Explica]ia eficien]ei metodei este aceea c\ treptat rezisten]a sporilor sub influen]a c\ldurii cedeaz\ sau c\ formele vegetative sunt distruse dup\ ce sporii au germinat `n intervalul celor trei zile. Sterilizarea prin vapori produ[i continuu la 100oC se realizeaz\ `n autoclav, l\sând robinetul de evacuare a vaporilor deschis. Prin aceast\ metod\ se distrug numai formele vegetative [i se folose[te pentru sterilizarea substan]elor ce se degradeaz\ u[or, sub ac]iunea c\ldurii. Sterilizarea prin vapori de ap\ sub presiune (autoclavarea) este metoda cea mai utilizat\ [i mai eficace, deoarece realizeaz\ o sterilizare complet\. Principiul metodei const\ `n faptul c\ temperatura vaporilor de ap\ `ntr-un spa]iu `nchis cre[te propor]ional cu presiunea la care ace[tia sunt supu[i: astfel la 1/2 atmosfere temperatura este de 115oC timp de 90', la o atmosfer\ temperatura cre[te la 120oC timp de 30' [i la 2 atmosfere se realizeaz\ o temperatur\ de 134oC timp de 10'. Aparatul folosit pentru sterilizarea prin vapori sub presiune se nume[te autoclav. El se compune dintr-un cazan cu pere]i gro[i, rezisten]i la presiunea de 3-4 atmosfere. La partea superioar\ este acoperit cu un capac care se `nchide ermetic cu ajutorul unor [uruburi speciale (buloane) [i al unei garnituri de azbest sau cauciuc. ~n capac sunt practicate orificii `n care sunt montate urm\toarele dispozitive: un manometru pentru indicarea presiunii de vapori `n autoclav; un robinet pentru evacuarea aerului [i a vaporilor; o supap\ de siguran]\ care permite ie[irea vaporilor `n cazul dep\[irii presiunii prea mari, pentru a evita pericolul de explozie al aparatului. Cazanul prezint\ la partea inferioar\ un orificiu prin care se face leg\tura cu un tub de nivel prin care se controleaz\ nivelul apei `n autoclav [i un robinet de scurgere a apei. ~n interiorul cazanului se afl\ un gr\tar mobil care serve[te ca suport pentru materialele de sterilizat. Cazanul este sus]inut de o `mbr\c\minte din tabl\ groas\ care la partea inferioar\ are o ni[\ de unde se introduce sursa de c\ldur\ (bec de gaz sau lamp\ cu benzin\), unele autoclave sunt prev\zute cu `nc\lzire electric\. Modul de func]ionare a autoclavului Mai `ntâi se introduce `n cazan apa distilat\ necesar\ form\rii de vapori, care se controleaz\ cu ajutorul coloanei de nivel. Nivelul apei trebuie s\ fie cu câ]iva centimetri sub cel al suportului. Se a[eaz\ apoi materialele de sterilizat fie direct pe suport sau introduse `n prealabil `n co[ule]e de sârm\; se ia precau]ia ca materialele s\ fie acoperite cu hârtie pentru a nu se umecta dopurile de vat\ din cauza vaporilor. Se `nchide dup\ aceea capacul autoclavului cu ajutorul buloanelor, care se strâng `n sens diametral opus, dou\ câte dou\. Robinetul de vapori r\mâne deschis pân\ ce se evacueaz\ aerul. Când aburul iese `n jet continuu `nseamn\

69

c\ aerul este complet evacuat [i se poate `nchide robinetul de vapori, dup\ care presiunea `n cazan `ncepe s\ creasc\ treptat. Dup\ ce s-a atins presiunea dorit\ care se cite[te pe manometru, se regleaz\ sursa de c\ldur\ mai moderat [i se men]ine timp de 20-30 minute dup\ care sterilizarea este terminat\. Capacul autoclavului nu se deschide decât dup\ ce acul manometrului a ajuns la 0; astfel sc\derea brusc\ a presiunii duce la fierberea mediilor lichide cu degajare de vapori [i aruncarea sau cel pu]in umectarea dopurilor vaselor puse la sterilizat. ~n autoclav se sterilizeaz\ de obicei culturile de care nu mai avem nevoie pentru ca vasele respective s\ nu r\mân\ infectate. De asemenea se sterilizeaz\: - sticl\ria de laborator; - obiectele de cauciuc; - aparatele de filtrat din sticl\, por]elan azbest sau metal; - mediile de cultur\, apa distilat\ [i unele solu]ii. Pentru controlul bunei func]ion\ri a autoclavului se `ntrebuin]eaz\ unele metode de testare. - Testele chimice utilizeaz\ substan]e cu punct de topire constant, ca floarea de sulf la 115oC [i acidul benzoic la 121oC. - Unele teste biologice, utilizeaz\ bacterii sporulate care dup\ sterilizare se `ns\mân]eaz\ pe medii de cultur\. Dac\ sterilizarea a fost corect executat\, germenii fiind distru[i nu mai cresc pe mediile `ns\mân]ate. Controlul se mai face prin termometre `nregistratoare foarte exacte. Filtrarea Filtrarea nu este un fenomen pur mecanic `n care filtrul se comport\ ca o sit\, ci la baza sa st\ adsorb]ia particulelor din lichidul de filtrat de c\tre pere]ii capilarelor care reprezint\ porii filtrelor; adsorb]ia este determinat\ de vâscozitate, temperatur\, pH-ul solu]iilor [i `nc\rcarea electric\ a particulelor [i a filtrului. Acest procedeu se aplic\ pentru sterilizarea anumitor lichide care se degradeaz\ u[or sub ac]iunea temperaturilor ridicate. Filtrele folosite `n microbiologie sunt de mai multe feluri, dup\ natura substan]ei poroase din care sunt fabricate. Filtrele Chamberland sunt din por]elan [i au forma unor lumân\ri (bujii), `nchise la cap\tul inferior. La extremitatea liber\ au o por]iune impermeabil\ din por]elan sm\l]uit sau sunt prev\zute cu o tetin\, de asemenea sm\l]uit\. Porii filtrelor au m\rimi diferite [i se noteaz\ cu litera L, urmat\ de cifre de la 1 la 7, filtrul L1 fiind cel mai grosier. Filtrele Berkefeld sunt fabricate din p\mânt de infuzorii sau kiselgur. Dup\ dimensiunea porilor sunt notate `n felul urm\tor: W = filtre cu pori mici; V = filtre cu pori mari; N = filtre cu m\rimea porilor intermediar\ (normal). Filtrele Seitz sunt constituite din pl\ci de azbest care formeaz\ substan]a poroas\ prin care se efectueaz\ filtrarea; ele sunt de dimensiuni diferite, notate dup\ cum urmeaz\: EK = cu dimensiuni care re]in bacteriile, dar las\ s\ treac\ virusurile; EK1 = intermediare [i EK2 = care re]in [i virusurile mari. Membrana de azbest este montat\ la fundul unei cupe de metal, `n care se introduce lichidul ce trebuie filtrat. Diferitele tipuri de filtre se monteaz\ `n aparate speciale iar filtrarea se face prin presiune pozitiv\ sau prin aspira]ia aerului cu o pomp\ de biciclet\, `n primul caz [i o pomp\ de vid `n cel de al doilea. Opera]ia de filtrare se face dup\ anumite reguli:

70

- `nainte de filtrare se sterilizeaz\ filtrele `n autoclav; - filtrarea se face la o aspira]ie moderat\ [i la o durat\ medie de 15 minute; - pentru a evita colmatarea filtrelor, lichidele vor fi diluate `n solu]ie cloro-sodic\ izotomic\ [i filtrate pe hârtie de filtru; - dup\ `ntrebuin]are filtrele se sterilizeaz\ `n autoclav [i apoi se spal\ energic cu peria. Filtrele de azbest nu se regenereaz\. - regenerarea se face prin ardere `n cuptoare la 280oC, sau prin men]inerea câteva ore `n solu]ie de permanganat de potasiu 1 % [i apoi `n solu]ie de hiposulfit de sodiu 5 %. Centrifugarea, se folose[te pentru sterilizarea unor lichide care nu suport\ ac]iunea c\ldurii. ~n acest scop se folosesc centrifugi cu viteza de 5000-6000 tura]ii/minut; for]a centrifug\ ce se creeaz\ impinge particulele ce se g\sesc `n suspensie, `ntre care pot fi microorganisme, c\tre fundul tubului, `n a[a fel c\ lichidul supernetant din tub este liber de germeni. Cu cât particulele sunt mai fine cu atât durata [i viteza de centrifugare trebuiesc sporite. Ultracentrifuga atinge pân\ la 100.000 ture pe minut [i chiar mai mult. Sterilizarea prin raze ultraviolete Radia]iile ultraviolete distrug formele vegetative ale majorit\]ii speciilor de microorganisme, `ns\ ac]ioneaz\ slab asupra sporilor. Moartea bacteriilor s-ar datora unui efect fotoelectric `n urma absorb]iei specifice a razelor de c\tre anumite grupe moleculare, care sunt astfel profund alterate. Razele ultraviolete se folosesc pentru sterilizarea unor substan]e care se degradeaz\ u[or prin alte metode. Se pot steriliza pe aceast\ cale numai corpurile transparente care permit trecerea acestor raze. Se mai utilizeaz\ `n sterilizarea apei potabile [i a unor medii de cultur\. Cele mai active sunt radia]iile ultraviolete cu lungimea de 2540-2800 . Sterilizarea prin ultrasunete Ultrasunetele sunt unde acustice a c\ror frecven]\ trece cu mult de limita perceptibilit\]ii auditive. Ele se ob]in prin trecerea unui curent electric alternativ de `nalt\ frecven]\ printr-un cristal de cuar]. Cristalul sufer\ deform\ri mecanice de unde rezult\ vibra]ii de 20 Khz [i care se produc numai `n acela[i sens. Unii autori atribuie rolul principal al steriliz\rii prin ultrasunete, ioniz\rii gazelor din lichidul expus acestora, urmat de degajarea de perhidrol, oxid [i bioxid de azot. Al]i autori sus]in c\ `n faza ini]ial\ ar avea loc o intens\ traumatizare a corpului microbilor, provocat\ de fluxul de electroni. Sterilizarea prin agen]i chimici Unele substan]e chimice se folosesc `n laboratorul de microbiologie fie pentru a `mpiedica dezvoltarea bacteriilor `ntr-un mediu de cultur\, fie pentru distrugerea lor complet\. ~n primul caz, substan]a chimic\ are ac]iune bacteriostatic\ sau dezinfectant\, iar `n al doilea este bactericid\ sau antiseptic\. ~ntre ac]iunea bacteriostatic\ [i cea bactericid\, la unele substan]e deosebirea este dat\ de concentra]ia produsului (doza). Cei mai cunoscu]i agen]i chimici folosi]i `n sterilizare sunt: - acizii: acidul boric 3-4 %, acidul sulfuric 5 %; - s\ruri: azotatul de argint 1 %, biclorura de mercur 1 ‰, oxiclorura de mercur 1/6000; - substan]ele oxidante: cloramina (25 % clor activ suspensie de 10-20 %; iodul (solu]ie alcoolic\) 1-5 %; apa oxigenat\ solu]ie 5 %; permanganatul de potasiu solu]ie 0,1 % ca dezinfectant [i 0,01 % ca antiseptic; aldehida formic\ sub form\ de vapori [i ca solu]ie `n ap\ 5 %; fenolul solu]ie 3-5 %;

71

cresolii sub form\ de emulsie 5 %; creolina sub form\ de emulsie 5-10 % `n ap\; hidroxidul de sodiu 3 %).

3. TEHNICA CULTIV|RII MICROORGANISMELOR Mediile de cultur\ reprezint\ substraturi nutritive lichide sau solide, organice sau anorganice care pot asigura cre[terea [i dezvoltarea microorganismelor. Ele trebuie s\ `ntruneasc\ anumite calit\]i care s\ permit\ dezvoltarea microorganismelor: - Astfel, trebuie s\ con]in\ substan]e nutritive necesare [i factorii de cre[tere `n cantit\]i indicate `n re]etele de preparare. - S\ aib\ un anumit pH corespunz\tor cerin]elor germenului respectiv. - Mediul trebuie s\ fie stabil pe `ntreaga durat\ a cultiv\rii microorganismelor.

-Trebuie s\ fie steril `n momentul `ns\mân]\rii [i `n perioada dezvolt\rii microorganismelor. - Trebuie s\ asigure condi]ii aerobe sau anaerobe, func]ie de cerin]ele microorganismelor ce se cultiv\. - S\ aib\ un anumit grad de umiditate care s\ se men]in\ pe tot timpul cultiv\rii. Din punct de vedere al provenien]ei mediile pot fi: de origine natural\ (cartof, morcov), animal\ (lapte, bil\), mediul de extract de sol [i artificial\ (apa peptonat\, bulionul nutritiv, geloza, gelatina). Din punct de vedere al complexit\]ii compozi]iei mediile pot fi: - medii simple sau uzuale folosite pentru cultivarea celor mai multe specii microbiene ca: apa peptonat\, bulionul, geloza, gelatina, extractul de sol; - medii complexe sunt folosite pentru izolarea [i cre[terea unor microorganisme care se dezvolt\ slab sau nu se dezvolt\ pe medii simple (bilion-ser, bulion-sânge, bulion glucozat, geloz\-ser, geloz\ sânge); - medii speciale cu o compozi]ie care permite cre[terea preferen]ial\ a unor specii de microorganisme [i pun `n eviden]\ anumite caracteristici metabolice. Acestea pot fi la rândul lor `mp\r]ite `n: a) medii de `mbog\]ire capabile s\ favorizeze dezvoltarea unor specii microbiene care se afl\ `n concentra]ii mici, `n produse cu flor\ asociat\ (ex. mediul Müller-Kauffmann); b) medii selective ce con]in substan]e bacteriostatice care inhib\ cre[terea unor specii saprofite sau patogene (ex. mediile Istrati-Meitert, Levin, Endo); c) medii elective sunt cele f\r\ substan]e bacteriostatice a c\ror compozi]ii ofer\ condi]ii de dezvoltare a unor specii care cresc mai rapid decât flora de asocia]ie (ex. mediul Löffler, Bordet-Gengou); d) medii diferen]iale sau de identificare ce con]in indicatori pentru punerea `n eviden]\ a unor procese biochimice caracteristice pentru metabolismul unei specii (ex. fermentarea zaharurilor, capacitatea de oxidare, reducere); e) mediile de conservare sunt mediile pentru men]inerea `n via]\ a unor culturi pe o durat\ de timp anumit\ (ex. Dorset, agarul moale etc.).

72

Prepararea mediilor de cultur\ Mediile simple lichide

Bulionul de carne este mediul de baz\ `n microbiologie. Prepararea lor se realizeaz\ `n dou\ etape [i anume, prepararea maceratului de carne [i apoi prepararea bulionului propriu-zis. Maceratul. Carnea slab\ de vit\ `n cantitate de 500 g, se cur\]\ de oase, tendoane, aponevroze [i gr\simi, se toac\ [i se macereaz\ la rece, timp de 12-24 ore `n 100 ml ap\ de robinet. ~n acest timp se realizeaz\ autoliza ]esuturilor [i solubilizarea produselor de autoliz\ `n ap\. Se fierbe apoi maceratul timp de 10 minute pentru a se accentua dizolvarea substan]elor solubile [i a se coagula albuminele insolubile. Dup\ r\cire se filtreaz\ prin hârtie de filtru sau vat\ pentru a opri gr\simile, care sub aceast\ form\ nu pot fi utilizate de bacterii. Se repartizeaz\ apoi zeama de carne `n flacoane sterilizate care se `nchid cu dopuri de vat\ `nvelite `n tifon [i se sterilizeaz\ 30 minute la 120oC. Maceratul astfel ob]inut se poate p\stra steril la rece, timp `ndelungat [i constituie substan]a de baz\ pentru preg\tirea mediilor lichide sau solide. Pentru a produce un bilion cu calit\]i nutritive superioare, se folose[te procedeul autoclav\rii maceratului de carne la 2 atmosfere. ~n acest caz, proteinele sunt degradate `n propor]ie mai mare, pân\ la stadiul de peptone [i aminoacizi, devenind mai accesibile. Bulionul propriu-zis se prepar\ `n felul urm\tor: la 1000 ml zeam\ de carne se adaug\ la cald 10 g pepton\ [i 5 g NaCl, se amestec\ totul [i se `nc\lze[te `n continuare pân\ la dizolvarea total\ a peptonei. Se las\ s\ se r\ceasc\, se determin\ [i se corecteaz\ pH-ul la 7,5-7,8 cu ajutorul unei solu]ii de NaOH 10 %. Apoi mediul se autoclaveaz\ timp de 15 minute la 120oC pentru precipitarea s\rurilor alcalino-teroase. Pentru `ndep\rtarea precipitatului [i a resturilor de gr\simi se filtreaz\ prin hârtie de filtru, apoi se repartizeaz\ `n baloane, care se `nchid cu dopuri de vat\ [i se sterilizeaz\ 20 minute la 115oC. Mediul cu extract de sol La 1000 g sol fertil se adaug\ 1000 ml ap\ de robinet. Amestecul se autoclaveaz\ la 120oC timp de 30 minute. Se adaug\ `n continuare 0,5 g CaCO3, pentru a produce flocularea coloizilor, apoi se agit\ [i se filtreaz\ la cald prin hârtie de filtru dubl\. Filtratul ini]ial nu este clar, dar se continu\ opera]ia pân\ se ob]ine un lichid limpede. Acesta din urm\ se repartizeaz\ `n baloane care se acoper\ cu dopuri de vat\, se sterilizeaz\ `n autoclav la 112oC timp de 20 minute; `n prealabil se corecteaz\ reac]ia la pH=7. Medii sintetice Mediul Thornton se folose[te la cultivarea bacteriilor din sol [i ap\. El are urm\toarea compozi]ie: KHPO4………….1 g KNO3………….0.5 g Mg SO4………….0,2 g Asparagin\…….0,5 g CaSO4…………..0,1 g

Glucoz\………. 20 g NaCl……………. 0,1 g

Agar-agar…….. 20 g FeCl3…………….0,002 g

Ap\ distilat\ ….. 1000 ml. Ingredientele se dizolv\ la cald [i pH-ul se aduce la 7,6; sterilizarea se face la 105oC, timp de 20 minute, trei zile consecutiv.

73

Medii naturale Mediu de felii de cartof Se spal\ tuberculii, se dezinfecteaz\ cu sublimat coroziv solu]ie 0,1 % timp de o or\, dup\ care se spal\ din nou [i se cur\]\ de coaj\. Se taie tuberculii `n felii sub]iri de 2-3 mm [i acestea se a[eaz\ `n pl\ci Petri, la care se adaug\ pu]in\ ap\. Se mai pot folosi tuberculii sub form\ de cilindri, cu ajutorul perforatorului de dopuri, se introduc `n eprubete [i se sterilizeaz\ frac]ionat, pentru a se impiedica uscarea mediului. Determinarea reac]iei (pH) mediilor de cultur\ Pe lâng\ condi]iile ce trebuie s\ le `ndeplineasc\, mediile de cultur\ au un anumit grad de alcalinitate sau aciditate `n func]ie de cerin]ele microorganismelor cultivate. Gradul de alcalinitate sau de aciditate al mediilor de cultur\ se exprim\ prin "pH" care reprezint\ logaritmul de semn schimbat al concentra]iei ionilor de H+ din solu]ia dat\. Scara de pH cuprinde toate gradele de reactivitate chimic\ `ntre 0 [i 14, de la aciditatea absolut\ (0), pân\ la alcalinitatea absolut\ (14), neutralitatea fiind reprezentat\ de valoarea 7 (ob]inut\ `n raport constant de disociere a apei, care este neutr\). ~n general, pentru bacterii, mediile trebuie s\ aib\ pH-ul cuprins `ntre 7,2 [i 7,6, pentru actinomicete 7,0-7,6 iar pentru ciuperci `n jur de 5,6. Determinarea pH-ului de cultur\ se face fie cu ajutorul metodelor electrometrice foarte precise, fie prin metode colorimetrice, care sunt prezentate la lucr\rile practice de chimie [i biochimie. Corectarea pH-ului mediului se face cu solu]ii normale de NaOH [i HCl sau de alte concentra]ii (10 % sau 20 %). ~n mod curent, determinarea pH-ului se mai efectueaz\ [i cu ajutorul hârtiei indicatoare care se bazeaz\ pe principiul schimb\rii de culoare. Exist\ diferite m\rci de hârtie indicatoare fabricate de firme ca Merck din Germania. Determinarea pH-ului cu benzi de hârtie este `ns\ mai pu]in precis\ ca cea efectuat\ prin metodele electrometrice sau colorimetrice; de aceea `n lucr\rile de mare precizie se vor utiliza numai aceste metode. ~n timpul steriliz\rii mediilor de cultur\ pH-ul se modific\ cu 0,2-0,4 unit\]i, `n func]ie de temperatur\ [i de aceea este necesar\ ajustarea acestora `nainte de sterilizare cu 0,2-0,4 unit\]i `n plus. ~n timpul cultiv\rii pe medii, microorganismele modific\ uneori valoarea pH-ului ini]ial.

74

V\ rug\m s\ expedia]i `n scris r\spunsurile dvs. (max. 10 pagini

dactilografiate dup\ normele conven]ionale).

1. Bacteriile

1.1. Defini]ie; Pozi]ia `n lumea vie; Nomenclatur\

1.2. Morfologia bacteriilor

1.3. Structura bacteriilor

a - structura extraparietal\

b - peretele celular

c - structura intraparietal\

1.4. Respira]ia bacteriilor

1.5. Nutri]ia bacteriilor

2. Circuitul azotului

2.1. Etapele circuitului azotului

2.2. Fixarea N2 pe cale biotic\

a - fixarea N2 de microorganisme libere

b - fixarea N2 de microorganisme simbiotice (numai Simbioza

Rhizobium - leguminoase)

2.3. Amonificarea

2.4. Nitrificarea

2.5. Denitrificarea

3. Rolul microorganismelor `n vinifica]ie

3.1. R\spândirea levurilor `n natur\

3.2. Principalele specii de levuri utile `n vinifica]ie

3.3. Principalele specii de levuri d\un\toare `n vinifica]ie

3.4. Mucegaiuri utile `n vinifica]ie

3.5. Bacterii utile `n ob]inerea vinurilor

TEME DE VERIFICARE

75

BIBLIOGRAFIE

1.Anghel I., Toma M., Voica C., Cojocaru I. - Biologia [i tehnologia

drojdiilor, Vol. I - 1989, Vol. II - 1991, Vol. III - 1993. Ed. Tehnic\,

Bucure[ti.

2. Buchanan R.E., Gibbons N.E. - “Bergey’s manual of determinative

Bacteriology” , Ed. Wiliams.

3. Eliade Gh., Ghinea L., {tefanic Gh. - Microbiologia solului, Ed. CERES,

Bucure[ti, 1975.

4. Eliade Gh., Ghinea L., {tefanic Gh. - Bazele biologice ale fertilit\]ii

solului. Ed. CERES, Bucure[ti, 1983.

5. Hatman M. - Microbiologie - Lucr\ri practice, Universitatea Agronomic\

Ia[i - Centrul de multiplicare, Ia[i, 1990.

6. Hatman M., Ulea E. - Microbiologie - Curs, Universitatea Agronomic\ Ia[i

- Centrulde multiplicare, Ia[i, 1993.

7. Kiss {t., {tefanic GH., Pasca Daniela, Dr\gan-Bularde Zborovschi,

Cri[an R. - Enzimologia mediului `nconjur\tor, Ed. CERES, Vol. I -

1991, Vol. II, 1993.

8. Mih\escu Gh., Gavril\ L. - Biologia microorganismelor fixatoare de azot,

Ed. CERES, Bucure[ti, 1989.

9. Papacostea P. - Biologia solului. Ed. {tiin]ific\ [i Enciclopedic\, Bucure[ti,

1976.

10. Zarnea Gh. - Tratat de microbiologie general\, Ed. Academiei Române,

Bucure[ti, Vol. I - 1983, Vol. II - 1984, Vol. III - 1986, Vol. IV -

1990,Vol.V - 1994.

Micro Biolog i e

Documents

Transcript of Micro Biolog i e