REACTIA DE AGLUTINARE

Aglutinarea este un test serologic care se bazeaza pe mecanismul de

legare a Ac la un Ag particulat

rezultand un conglomerat vizibil cu ochiul liber

(aglutinat)

REACTIA DE AGLUTINARE

calitativa/semicantitativa > titrare: indicii despre concentratia relativa a Ag/Ac in proba

se desfasoara in 2 etape:

a) combinarea specifica a Ac cu Ag

pe suprafata celule /particule

b) formarea agregatelor vizibile aleAg

particulat

se utilizeaza in urmatoarele scopuri:

a) dg serologic al bolilor infectioase

b) detectarea Ac specifici tisulari in

bolile autoimune

c) detectarea prezentei DAg pe celule

d) tipizarea sangelui in vederea

transfuziei

COMPONENTELE ESENTIALE ALE

TESTELOR SEROLOGICE

ANTIGENELE(Ag)

ANTICORPI(Ac)

Ag si Ac IN REACTIA DE

AGLUTINARE IMUNA Ag sunt: particulate Cunoscute (laborator) in cantitate constanta

Ac sunt (aglutinine): participa la reactie > dilutii

seriate ale serului (bv) au capacitate de aglutinare

diferita (~ izotipuri)ex. Ig M dpdv functional sunt decavalente

teoretic si pentavalente practic

TITRUL

TITRUL aglutinant al serului = inversul celei mai mari dilutii care produce o aglutinare acceptabila

ex: daca dilutia de 1/512 a serului produce o

aglutinare evidenta,

>la dilutia imediat urmatoare (1/1024) aglutinarea

= absenta,

>titrul aglutinant este de 512 U, =

serul imun contine 512 unitati aglutinante.

Titrul aglutinant- exprima in:

nr de unitati aglutinante de Ac/unitata de volum.

FORMAREA COMPLEXELOR IMUNE

Dimensiunea unui CI depinde de:

valenta Ag

concentratia Ac.

Ac in exces > epitopii Ag se satureaza >>

CI de dimensiuni mici

Ag, Ac:concentratii echivalente: o retea extinsa de CI

Ag in exces > situsurile de combinare ale Ac se satureaza >

CI de dimensiuni mici

FACTORI CARE INFLUENTEAZA REACTIA DE AGLUTINARE

densitatea si dispozitia spatiala a D Ag de pe suprafata celulelor / particulelor

potentialul electric al reactantilor > variatiile de pH prezenta electrolitilor in mediul de suspensie ( la conc

fiziologica de NaCl) variatiile de temperatura durata incubatiei:

*pt aglutinarea bacteriana incubatia este de 1-2 ore la 37ºC;

Citirea finala a rezultatelor se face dupa 24 ore la temp camerei

REACTIA DE AGLUTINARE

Principiul reactiei

Ag particulat + Ac >> aglutinare

Formarea aglutinatului:

Ag se leaga la Fab a 2 Ac >>

punti intre Ag

Tipuri majore de aglutinare:

Aglutinarea bacteriana

Hemaglutinarea:

Imuna

Pasiva

virala

REACTIA DE AGLUTINARE METODOLOGIE

Ag particulat (vol. Cunoscut; orig-lab) (Ac?) Ser pacient (vol fix in dilutii seriate (scala geom= 2).

omogenizare reactanti > incubare ~2h.

Aglutinarea este vizibila cu ochiul liber = Ac sun prezenti in

serul bv=Dg+

!* La dilutii mari ale serului nu mai obtinem aglutinarea = Ag particulat

ramane in suspensie.

REACTIA DE AGLUTINAREAPLICATII

AGLUTINAREA BACTERIANA se foloseste in laborator pt a stabili titrul de Ac serici in bolile infectioase

EX: tifos exantematic, infectii cu Brucella,enterobacterii- Salmonella exista 2 forme:

a) aglutinare de tip H (hauch = val): produsa de o suspensie de celule bacteriene

flagelate in cursul careia se formeaza flocoane bacteriene mari si laxe;

*Ag flagelare aglutineaza (flagelilor bacterieni) interactioneaza cu Ac specifici

b) aglutinarea de tip O sau somatica (ohne hauch = fara val): produsa de bacteriile

imobile; se formeaza conglomerate celulare dense, compacte, in care

celulele bacteriene reactioneaza prin intermediul Ag somatice reprezentate

de LPS (lipopolizaharide =componente majore ale suprafetei celulelor Gram

-).

* Ag somatice interactioneaza cu Ac specifici serici.

AGLUTINAREA BACTERIANATESTUL WIDAL

Utilizare: Dg serologic al infectiilor cu Salmonella Typhi

Georges-Fernand-Isidor Widal si Sicard in 1896 au descris Reactia Widal

Acest test si-a dovedit valoarea de dg in cazurile in care nu se puteau obtine cultivarea celulelor

TESTUL WIDAL

Utilizare: dg febrei tifoide

Principiul testului Widal:

Ac (ser bv) reactioneaza cu

Ag (pe suport solid-lab)>aglutinare vizibila

TESTUL WIDAL

poate fi facut

in tub:dilutii seriate >

titrulpe lama: calitativa

DG SEROLOGIC AL INFECTIILOR CU SALMONELLA

serotipizare

identificarea tipurilor

serologice de Salmonella

utilizandu-se seruri

imune cu specificitate

cunoscuta prin reactia

de aglutinare in tub sau

pe lama

serodiagnostic

al febrelor tifoide/paratifoide

cu un set de Ag

standardizate:

Reactia de aglutinare =

T Widal in tuburi

SERODIAGNOSTIC: REACTIA DE AGLUTINARE

(T WIDAL) Materiale necesare:

1) Ag standardizate O, H:

suspensie celulara alcoolata

O ( 500 mil cel/ml)si

suspensie celulara formolata

pt H (500 mil/ml)

2) Dilutii seriate ale serurilor de

la bolnavi

Evidentiaza

Ac anti-H care sunt puternic

stimulati

1) prin vaccinare specifica

2) dupa infectie cu tulpini

flagelate

* suspensiile antigenice Vi

sunt alcoolate

AGLUTINAREA-CUM APARE DUPA REACTIE

Aglutinarea O este granulara Aglutinarea H este slaba si floculara

Citirea si interpretarea rezultatelor

Aglutininele anti-H si anti-O apar in ser in prima saptamana de boala;

titrul lor creste pana la maxim in zilele 16-29 de la debut si ramane ridicat in convalescenta si o scurta perioada dupa vindeare.

Aglutininele anti-H au un titru inalt ( 1/1000-1/5000) iar aglutininele anti-O : 1/250-1/1000.

reactie pozitiva: >1/500 pt aglutininele anti-O > 1/1000 pt aglutininele H.

AGLUTINAREA-REMEMBER

este o reactie Ag-Ac

Ac specifici din ser aglutineaza bacteria at c sunt prezenti Ag correspunzatori

Rezultatul este observabil ca o solutie particulata/ conglomerate vizibile

Gradata dupa intensitate ca fiind 1+, 2+, 3+, si 4+

4+ reprezinta un background clar cu o aglutinare de 100%

aglutinarea O este granulara

aglutinarea H este slaba si floculara

PROBLEME CU TESTUL WIDAL

detecteaza doar

Ac aglutinanti posibile aglutinari

nespecifice

Rezultatele aglutinarii:

Titrurile > 1:100= Ac+ pt Ag somatice si flagelare

Titrurile > 1:40= Ac + pt Ag Vi

*Titrurile pozitive variaza de la un laborator la altul!

CAUZE DE REZULTAT FALS-NEGATIV IN T. WIDAL

Ag bacteriene nu sunt expuse la suprafata si nu sunt accesibile reactiei cu Ac <Ag capsulare: mascheaza Ag O: se utilizeaza un preparat Ag bacterian supus in prealabil tratamentului termic pt a expune Ag O al suprafetei celulare.

Statusul de purtator : o inoculare inadecvata de Ag bacterian care la

nivelul gazdei nu reuseste sa induca producerea de Ac.

Dificultati tehnice /erori de procedura.

Tt anterioare cu ATB.

Variatii in prepararea kiturilor comerciale

HEMAGLUTINAREA

REACTIILE DE HEMAGLUTINARE UTILIZEAZA HEMATIILE CA:

Celule indicator

Ag

APLICATII:Tipizarea sangelui (hemaglutinare directa)Diagnosticul unor anumite boli (hemaglutinare pasiva)Identificatrea unor virusuri (hemaglutinarea virala )

HEMAGLUTINAREA DIRECTAPRINCIPII IMMUNOLOGICE

Componentele immunologice principale:

Ag (de pe RBC) & Ac

APLICATIE PRINCIPALA:

TIPIZAREA GRUPELOR DE SANGE

REGULA DE AUR:

Ag sunt pe suprafata RBC

Ac sunt in ser

SISTEMUL ABO AL GRUPELOR SANGVINE

Exprimat in → tesuturi & fluidele organismului inclusiv pe RBC, plachete & celule endoteliale

3 Ag: A, B, H

2 Ac: anti-A and anti-B

4 fenotipuri: A, B, AB, O →

A & B: transmitere fenotipica autozomal co-dominanta (exprimata pe group A / B / AB de pe RBC);

CLASIFICAREA Ac DE GRUP SANGVIN

Alloanticorpi:

•Reactioneaza cu Ag straine care nu sunt prezente pe propriile RBC

•Sunt produse ca rezultat al stimularii imune via transfuzii/sarcina

Autoanticorpii:

Reactioneaza cu Ag de pe propriile RBC/ acelasi Ag de pe celulele altui individ

REACTIVITATEA INCRUCISATA

Ac > reactie incrucisata cu Ag nespecific in cazul in care Ag impartasesc un epitop similar/ identic

TESTAREA GRUPELOR SANGVINE

DIRECT / FORWARD TYPING

BETH-VINCENT TESTTestare pt Ag

RBC pacient = Ag ? necunoscute

seruri (Ac) cunoscuti

METODA: pe lama/in tub

INDIRECT/REVERSE TYPING (SIMONIN TEST)

Testare pt Ac

Ag cunoscut (celula)

Ac ? necunoscut (serul pacientului)serul este combinat cu celule cu Ag cunoscut intr-o

proportie de 2:1

METODA: pe lama/in tub

Grup O, Rh+Fara aglutinare cu serul anti-A si anti-BDa aglutinare cu serul anti Rh

Grup B, Rh-Fara aglutinare cu serul anti-A si anti-RhDa aglutinare cu serul anti-B

SISTEMUL DE GROUP SANGVIN RhCLASIFICARE/NOMENCLATURA

WienerIPOTEZA ALELELOR MULTIPLE5 Ag: Rho, rh’, rh”, hr’, hr”RosenfeldSistem NumericRh1 - Rh5Fischer & Race3 allele: D/d, C/c and E/e5 Ag: D, C, E, c, ed → fara locus D → fara produsi antigenici

Antigenele Rh

Sistem complex reprezentat de cateva subunitati Ag : A, B, C, D, E.

Contine 3 proteine membranare integraleRhD/Rho ( important)RhCcEeRh> Asociate cu GP:(Rh50, RhAg)

Antigenul D → consta intr-o proteina: RhD→cel mai immunogenic > urmat de c, E, C e

TESTARE Rh

Testarea pt Ag Rho (D) :

Folosim ser uman

RBC (Ag=parte integrala din membrana, mult mai putin numeroase decat Ag ABO)

Mediu de reactie (proteine)

Rh-varianta Du

Weak D Antigen (Du)Varianta Rho >Aglutinare slaba/absenta a RBC cu serul anti-D → poate fi detectat doar cu reactivul anti-globulina umana (R Coombs) (anti-D bovin) Varianta slaba este produsa in 3 situatii:

Lipseste o parte din Ag DGena D este translocata pe cromozomul opus genei C → (+) impiedicare stericaMostenirea unei gene ce codifica mai putin Ag D

HEMAGLUTINAREA PASIVA

OBIECTIVE:detectarea titrurilor scazute de Ac serici (ex Rh Du)

PRICIPIU:Ac (bv ser) reactioneaza cu Ag adsorbit pe RBC > hemaglutinatinare

*(RBC = pasive, nu participa to reactie)

COMPONENTE:

Suport solid pt Ag solubil (cunoscut)RBC = celule indicator

Particule de latexCarbuneBentonita

Serul > Ac necunoscut

HEMAGLUTINAREA PASIVAAPPLICATII:

TESTUL ANTIGLOBULINIC

TESTUL ANTIGLOBULINIC

TESTUL ANTI-HUMAN GLOBULIN (AHG),

TEST COOMBS

UTILIZARI:Detectarea Ac (IgG) anti-eritrocitari cu specificitate pt sistemul

ABO/Rh

PRINCIPIUL TESTULUI ANTIGLOBULINIC

Metoda:1) RBC > sensibilizate prin acoperirea cu IgG / complement >Nu vor aglutina direct cand sunt centrifugate. Pt a obtine aglutinarea: 2) + alt Ac > reactioneaza cu RBC prin Fc (IgG) sau C3b/C3d 3) > "punte" intre : Ac /C' adaugat si IgG de pe RBC > aglutinare.

RBC acop cu IgG RBC acop cu Complement

PRINCIPIUL TESTULUI ANTIGLOBULINIC(II)

Avem nevoie de:

Reactiv anti-globulinic (Reactiv Coombs ) care se va lega deFc (IgG )atasata la RBCC3b/C3d atasata la RBC.

Pt a obtine reactivul anti-globulinic (Coombs): Iepuri > immunizati cu gamma globulina umane produc Ac (reactiv AHG ) fata de IgG / C3d.

TIPURI DE TESTE ANTIGLOBULINICE

Prima data Coombs si Mourant au detectat acesti Ac in vitro (prin Testul Antiglobulinic Indirect) in special cei legati de sistemul Rh, care pot produce boala hemolitica a nou-nascutului.Exista doua tipuri de teste antiglobulinice:

1. Direct Antiglobulin Test (DAT) – detecteaza in vivo Ac /C3 de pe RBC

2. Indirect Antiglobulin Test (IAT) – utilizeaza o etapa suplimentara de incubatie la 37oC > detecteaza Ac serici care pot reactiona cu Ag de pe celule in vitro.  

Dupa spalarea RBC, reactivul Coombs este utilizat pt detectarea Ac de pe RBC

TIPURI SPECIFICEDE REACTIVI AHG (COOMBS)

Ser , polispecific (policlonal) anti-human:

amestec de Anti-IgG & Anti-C3b, -C3dReactivi monospecifici (monoclonali)

Anti-IgG / Anti-C3b,-C3d

*Nota: 

*Reactivii nu contin Ac IgM. Prezenta Ac IgM pe RBC este evidentiata de C3 (IgM = puternic activator al C').

REACTIVIReactivul Anti-Human globulin (AHG or Coombs)

Pot fi obtinuti prin:

injectarea iepurilor cu IgG / C3 uman purificat > recoltarea Ac produsi de iepuri >

ser poli/monospecific

tehnologia Ac monoclonali > ser monospecific

TEHNOLOGIA AC MONOCLONALI

SUMARUL REACTIEI

RBC acoperite cu Ac* IgG si/sau C' (in vivo/in vitro-prin incubare cu seruri lab)

RBC > spalate 3-4X pt indepartarea Ac/C' liberi/nelegati

Ramane doar Ac/C' atasat la RBCAd R. AHG (Coombs)Ac din R. Coombs reactioneaza cu IgG/ C3b/C3d din

C' de pe RBC, > aglutinareaDaca NU aglutinare > verificam prin add Coombs

control reagent cells* (CCC).*joaca rol de Ag

TESTAREA ANTIGLOBULINICA INDIRECTA

Este utilizata in mod frecvent pt detectarea:

1) Du slab la donatorii de sange si la femeile insarcinate cu D(-) la R.T. la tipizarea ABO si Rh.

2) Prezenta sau absenta Ag din sistemele minore de grupe sangvine ( Kell, Kidd, si Duffy).

3) Ac neasteptati, semnificativi clinic descoperiti in teste screening.

TESTAREA ANTIGLOBULINICA INDIRECTA

SCOP:

detectarea in vitro a sensibilizarii RBC . 

Se face at c sensibilizarea nu duce direct la aglutinare <

-sunt prea putine Ag pe RBC,

-sunt prea putini Ac in ser si/sau sunt IgG .

TESTAREA ANTIGLOBULINICA INDIRECTA

PRINCIPIU

Incubarea RBC cu serul bv la 37oC x 15 -30 min.

Spalari RBC 3-4x .  

Add R. AHG (Coombs) > centrifugare > citirea aglutinarii

Daca test - >

add Coombs Control Check Cells pt verificarea rezultatelor fals-negative

INTERPRETATION OF ANTIGLOBULIN TESTS

At ca RBC sunt acoperite (sensibilizate) in vivo/in vitro >interpretarea finala se bazeaza pe prezenta/nu a hemaglutinarii

1) Positive Antiglobulin Test 

Wash cells three tim es to rem ove

unbound antibody

Only antibody attached to the cells

rem ain

A d d A n ti-H u m a n G lo b u lin

Visible Agglutination in the test tube:

Grade the reaction strength

NEGATIVE ANTIGLOBULIN TESTAntibodies are not

attached to the antigens during

incubation.

Wash the cells 3 times to remove any

unattached antibodies.

Ad d An ti-h u m an g lo b u lin

No visible agglutination and therefore a negative

test

Add Coombs Control Check Cells

DAT POZITIV

Dg: anemia hemolitica autoimuna (dem prezenta AAc anti RBC)

Boala hemolitica a nou-nascutului (dem prezenta Ac anti Rh/anti ABO)

Transfuzii recente (RBC/plasma/masa tr)

MedicatieCautam alte date de lab care indica o distructie

RBC: Ht, bilirubina, LDH)

CAUZE CLINICE DE DAT POSITIV

Sensibilizarea hematiilor datorata medicamentelor:

– penicilina si cephalosporinele pot induce acoperirea nespecifica a RBC

– tetraciclinele, antihistaminele si sulfonamidele pot determina aparitia unor CI capabile sa activeze C'3

– ibuprofen, levodopa si methyldopa pot produce reactii autoimune. 

*Daca pacientul are un DAT+ > trebuie luate in considerare reactii induse de medicamente

THE END

IMPORTANTA T WIDAL

A scazut datorita:

Incidenta febrei tifoide a scazut A crescut utilizarea vaccinarii in masa

TESTAREA PURTATORILOR DE TIFOS

Cei mai multi purtatori de bacili tifoizi au Ac anti-Vi Ag (Salmonella T)

Titrurile de Ac anti-Vi par sa se coreleze mai bine cu starea de purtator decat cele de Ac anti-O/ H>

> utilizarea aglutinarii anti-Vi (R Felix)

REACTIA WEIL-FELIX

In 1915, Weil si Felix au aratat ca in serul pacientilor infectati cu oricare membru al grupului de Salmonella typhi contine aglutinine pentru 1/mai multe linii de Proteus OX.

In cazul febrei tifoide reactia apare in <6zile si se obtine max< 2 sapt.

T. Weil-Felix se bazeaza pe cross-reactivitatea cu Ag OX-19 and OX-2 ale P. vulgaris si OXk de P mirabilis, in care,

in serul pacientilor este cautat Ac anti-OAg

INTERPRETAREA T. WEIL-FELIX

Serul < bv tifos endemic aglutineaza Ag OX19, OX2. Ag< scoamele de tifos aglutineaza liniile Oxk. Testul este negativ in eruptia rickettsiala si in febra Q.R fals- pozitive pot aparea si in infectii urinare cu Proteus

TESTUL FELIX-WEIL

este indicat atunci cand avem un pacient cu o eruptie dg tifos, anumite boli ricketsiale Bv suspectat de ricketsia> testat anti- (OX-2, OX-19, OX-K).

SERO CONVERSIA

Reprezinta dezvoltarea in ser, ca rezultat al unei infectii sau a unei imunizari, a unui titru detectabil de Ac specifici fata de microorganisme

SERO REVERSIA

Sero reversia este opusul seroconversiei Apare atunci cand testele serologice nu mai pot detecta prezenta unor Ac/Ag in serul unui pacient

TESTAREA IN PERECHE

Testarea pentru bolile infectioase > in pereche:

in faza acuta,in faza convalescenta

(~ la 2 sapt)

Clinic semnificativ: Crestere de 4x a titrului Reactie + in 2 tuburi aglutinare

Ag SOMATIC (O) localizare: perete celular > prezinta variatii

de ordin chimic.

Toate liniile de Salmonella cu

> Ag O comun = un grup serologic.

Genul Salmonella > 47 de grupe serologice

(noteaza cu majuscule de la A.....Z iar

ultimile 15 grupe cu numere 51-56)

AgO> Corespunde endotoxinei,

Ag O - clasificare

Ag majore:

> specificitatea de

grup

Ag minore:

=modif chim minore

ale Ag majore

Ag SOMATIC (O)

SomaticStabil termic Produce o aglutinare granulara > in varianta smooth (S) sau rough (R) Unele dintre acestea pot fi supuse la conversie lysogenica de catre bacteriophagi

Ag FLAGELAR (H)

Stabile termicApar in flageli Compuse din flageline (proteine) Aglutinarea este rapida, slaba si flocularaPot aparea variatii de faza reversibila

se gaseste numai la formele mobile

imprima specificitatea de de tip antigenic (aprox 2000

de variante Ag H = serotipuri)

Ag DE INVELIS(Vi=K)

= de suprafata,

situat > perete (K=Kapsel= capsula) actioneaza ca factor de virulenta structura G-L-P tulpinile bact care au Ag Vi vor fi aglutinate

numai de Ac anti-V Ag Vi se gaseste la putine serotipuri de

Salmonella, > rezistenta la fagocitoza

* chiar daca se afla in cantitate prea mica pt a

forma o structura capsulara vizibila, este suficient

pt a masca Ag O > inhiba aglutinarea celulelor

respective in prezenta serului specific anti-O.

TESTUL STANDARD AGLUTINARE PT Ac SERICI ANTI- S. Tpyhi, S.

Paratyphi

Pentru suspensiile de Ag O & Vi :

Incubare la 37ºC x 2 h Frigider o.n. la 4ºC Incubare la R.T. x2 h

inainte de citire

Pentru suspensiile de H

Incubare la 56ºC x 2 h

REACTIA DE AGLUTINAREUTILIZARI

se utilizeaza in urmatoarele scopuri:

a) dg serologic al bolilor infectioase

b) detectarea Ac specifici tisulari in

bolile autoimune

c) detectarea prezentei epitopilor

antigenici de pe celule

d) tipizarea sangelui in vederea

transfuziei

Variante :

pe lama

in tub

pe microplaci speciale