1

Aprecierea microbiologic a laptelui prin metode enzimatice

1. Proba reductazei

2

3

2.

4

5

Controlul pasterurizrii laptelui de consum

1) Proba fosfatazei i 2) Proba peroxidazei

6

7

1. Controlul pasteurizrii smntnii proba peroxidazei Se utilizeaz proba peroxidazei i permite stabilirea eficacitii pasteurizrii nalte

aplicate smntnii. Peroxidaza este o enzim termolabil, distrusa la temperatura de pasteurizare nalt (peste 85C).

Principiul metodei: peroxidaza, prezent n laptele materie prim i nedescompus n cazul realizrii incorecte a pasteurizrii nalte, descompune apa oxigenat n ap i oxigen atomic, care va reaciona cu benzidina i va da coloraie specific.

Aparatur i reactivi: - pipete sau seringi de dozare de 1 i 5 ml; - ap distilat; - benzidin (soluie alcoolic 4%); - acid acetic (soluie 5%); - ap oxigenat (soluie 3%). Mod de lucru: ntr-o eprubet curat i uscat se introduc 3 ml smntn i 2-3 ml ap distilat (nclzit la +40+45C), dup care se agit. n continuare, se adaug n eprubet 1 ml benzidin, 2-3 picturi de acid acetic i 1-2 picturi de ap oxigenat; se agit coninutul eprubetei. Interpretare: smntna nepasteurizat sau pasteurizat necorespunztor se coloreaz n albastru verzui.

2. Controlul pasteurizrii smntnii materie prim utilizat la fabricarea untului

Se utilizeaz proba peroxidazei i permite stabilirea eficacitii pasteurizrii nalte

aplicate smntnii. Peroxidaza este o enzim termolabil, distrusa la temperatura de pasteurizare nalt (peste 85C).

Principiul metodei: peroxidaza, prezent n laptele materie prim i nedescompus n cazul realizrii incorecte a pasteurizrii nalte, descompune apa oxigenat n ap i oxigen atomic, care va reaciona cu benzidina i va da coloraie specific.

Aparatur i reactivi: - pipete sau seringi de dozare de 1 i 5 ml; - benzidin (soluie alcoolic 4%); - acid acetic (soluie 5%); - ap distilat; - ap oxigenat (soluie 3%). Mod de lucru: ntr-o eprubet curat i uscat se introduc 1,5-2 g unt i 3-4 ml ap distilat. Amestecul din eprubet se nclzete pe baia de ap adus la +45+50C, dup care se adaug 1 ml benzidin, 2-3 picturi de acid acetic i 2-3 picturi de ap oxigenat; se agit coninutul eprubetei. Interpretare: Unt fabricat din smntn corect pasteurizat = culoare rmne neschimbat

Unt fabricat din smntn nepasteurizat sau pasteurizat necorespunztor = stratul de grsime se coloreaz n verde cenuiu iar plasma n albastru-verde nchis.

8

Preparate enzimatice folosite la coagularea laptelui.

Coagularea enzimatic a laptelui s-a realizat la nceput exclusiv cu cheag,

ns creterea produciei de brnzeturi pe plan mondial a pus problema

unui nlocuitor pentru cheag. ntruct coagularea laptelui este iniiat prin

scindarea legturii peptidice dintre fenilanina 105 i metionina 106 din k-

cazein, oricare endo-peptidaz care este capabil s produc aceast

hidroliz este un nlocuitor potenial pentru cheag (chimozina). Aceast

proprietate hidrolitic-coagulant nu este suficient, fiind necesar ca

preparatul enzimatic respectiv s aib i o activitate proteolitic

nespecific corespunztoare, n sensul c trebuie evitat degradarea intens

a proteinelor la pH-ul natural al laptelui pentru a nu se distruge zonele

de interaciune pentru agregarea miceliilor.

Principalele preparate enzimatice de origine animal sunt cheagul i

pepsina.

Cheagul - preparat enzimatic din stomacul glandular de viel, miel, ied

sacrificai n perioada de alptare. Se mai numete pressure, rennet.

Preparatul cheag are ca principiu activ chimozina, ns conine i ceva

pepsin, raportul mas chimozin activ/mas pepsin activ > 1,38.

Cheagul industrial se obine sub form lichid sau pulbere.

La folosirea cheagului n soluie apoas trebuie s avem n vedere c

acesta i pierde din activitate dac :

concentraia enzimei n soluie este mic ;

este prezent lumina solar sau chiar lumina din ncperi;

soluia este puternic agitat cu formare de spum ;

temperatura depete 60 C ;

soluia are pH 6,6 7,4.

Stabilitatea enzimei este bun ntre pH 5,0 i 6,0.

Pepsina este un preparat enzimatic care se obine din mucoasa roie a

stomacelor de vit i mai ales porc, unde se gsete sub form inactiv de

pepsinogen. Trecerea sub form activ are loc sub influena HCl folosit la

9

extracia enzimei din mucoasa stomacal roie. Preparatul mai conine i

chimozin, raportul mas chimozin activ/mas pepsin activ > 0,154.

Pepsina coaguleaz bine numai laptele acidifiat la pH 6,6. n comparaie

cu cheagul are o activitate proteolitic mai mare putnd conduce la

defecte de gust (gust amar). Se obine sub form de pepsin praf tip L

(putere de coagulare 1:50000 sau 1: 120.000). Pepsina praf are 3% ap,

maximum 40% (pt. 1:120000) - 58%(1:50000) NaCl i maximum 3,5% lipide.

Preparatele enzimatice fungice se prezint sub form de pulberi fine,

omogene, alb-glbui, solubile n ap, ns ca aciune sunt inferioare

enzimelor coagulante de origine animal, n principal cheag.

La folosirea preparatelor enzimatice fungice trebuie s avem n

vedere urmtoarele:

creterea temperaturii de coagulare peste 30 C influeneaz pozitiv

coagularea (deci trebuie s se in seama de sortimentele de brnz cu

temperatura de coagulare a laptelui 30 C);

aciditatea laptelui 20 T influeneaz negativ aciunea enzimelor;

coagulul obinut are o durat mai lung de ntrire, consistena mai

moale, ceea ce favorizeaz pierderi de substan uscat n zer. Se impune

prelungirea duratei de coagulare i prelucrare a coagulului cu 10 - 15 min,

respectiv creterea aciditii laptelui supus nchegrii i creterea

temperaturii acestuia;

activitatea proteolitic a enzimelor fungice este mai mare dect a

cheagului, n special asupra proteinelor serice, ceea ce nseamn pierderi de

proteine n zer.

Preparatele enzimatice de origine bacterian sau fungic au o utilizare mai

limitat din urmtoarele motive:

- au activitate proteolitic mai mare i din aceast cauz produc

defecte la brnzeturi ;

- coagulul obinut este moale, iar pierderile de cazein i grsime n zer

sunt mai mari.

-

-

10

-

-

-

Determinarea eficienei produselor enzimatice de nchegare a laptelui

(determinarea triei cheagului)

11

12

Aprecierea strii de prospeime a crnii de pete,

prin identificarea reductazei (proba cu albastru de metilen)

Determinarea reductazei servete la aprecierea gradului de contaminare

microbian a crnii de pete.

Principiul metodei: reductaza produs de ctre bacterii reduce albastrul de

metilen la leucoderivatul su incolor; cu ct sunt prezente mai multe bacterii n

prob, cu att decolorarea este mai rapid.

Reactivi: soluie albastru de metilen (se dizolv 5 ml soluie saturat alcoolic

de clorhidrat de albastru de metilen, n 200 ml ap distilat).

Mod de lucru: 5 g carne (fin mrunit) se mojareaz cu ap distilat steril

(nclzit la +40C) i se trece cantitativ ntr-un balon de 60 ml, prevzut cu dop

lefuit. Se adaug apa steril (nclzit la +40C) pn la umplere i se trateaz cu

1 ml soluie albastru de metilen.

Se agit energic i se introduce ntr-un termostat reglat la +45C,

nregistrndu-se timpul de decolorarea a preparatului.

Interpretarea rezultatelor:

pete proaspt - decolorare dup 2 ore;

pete alterat - decolorare dup 1 or.

Aprecierea strii de prospeime a crnii de pete,

prin identificarea peroxidazei

Peroxidaza (enzim din clasa oxidoreductazelor) este inhibat de ctre procesul

de putrefacie, absena acesteia constituind un indiciu al lipsei de prospeime a

crnii de pete.

Principiul metodei: peroxidaza acioneaz cu ap oxigenat, formnd complexul

,,peroxidaz-H2O2, n care apa oxigenat este activat i deci capabil de a oxida

diferite substane printre care i benzidina. Benzidina rmas neoxidat, mpreuna

cu parachinondiamid, d un compus de coloare albastru-verzui, care, cu timpul,

devine brun.

Reactivi: soluie alcoolic de benzidin (0,2%); ap oxigenat (1%).

Mod de lucru: ntr-o eprubeta se introduc 2 ml extract de carne filtrat (preparat

din 50 g carne i 100 ml ap distilat) i 5 picturi benzidin, dup care se agit; n

continuare, se adaug 2 picturi ap oxigenat i se urmrete evoluia culorii.

Interpretarea rezultatelor:

reacie pozitiv (carne proaspt) - dup min. 30 secunde i max. 2 minute apare

o culoare albastr-verzuie care vireaz n brun nchis;

reacie negativ (nceput de alterare) - nu apare nici o coloraie.