MMM

LP 6 MICROBIOLOGIE

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC IN INFECTII PRODUSE DE GENURILE VIBRIO, PSEUDOMONAS, HELICOBACTER1. GENUL VIBRIO:

DEFINITIE: bacili Gram (-), scurti, incurbati, in forma de virgula, nesporulati, necapsulati, mobili (1 flagel polar mai lung decat corpul bacterian), produc oxidaza.

Genul Vibrio este impartit in mai multe specii, cele cu importanta in producerea infectiilor umane, sunt:

* Vibrio cholerae- serogrup O1: produce holera,

* Vibrio cholerae serogrup non- O1: forme clinice de diaree mai usoara decat holera si forme extraintestinale,

* Vibrio parahaemolyticus: gastroenterite si infectii extraintestinale,

* Alti vibrioni: V. vulnificus, V. alginolyticus, V. fluvialis etc: sunt agentii etiologici ai unor infectii otice, infectii ale plagilor, tesuturi moi, infectii extraintestinale.1. Vibrio cholerae: microorganism non halofil, se gaseste in ape dulci, lacuri, ape curgatoare, Delta Dunarii, unde se multiplica in organisme microscopice (zooplancton) sau macroscopice (crustacee), Vibrionii din serogrupul O1, care determina producerea holerei, sunt impartiti in 3 subtipuri:

- OGAWA,

- INABA,

- HIKOJIMA.

* V. cholerae serogrup O1, cuprinde 2 biotipuri: clasic si El Tor.

2. V. parahaemolyticus: - microorganism halofil,

- se multiplica in ape marine , estuare, ape costale, sarate,- traiesc in simbioza cu crustaceele acestor ecosisteme.DIAGNOSTIC DE LABORATOR IN HOLERA:DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIC DIRECT Diagnosticul serologic este f. rar utilizat, pentru ca rezultatul este tardiv, iar in holera diagnosticul este de mare urgenta. Produse patologice:

materii fecale (la bolnavii cu forma acuta de boala, se izoleaza germenii in cultura pura),

produs de voma,

bila,

lambouri de rufe murdarite cu materii fecale,

continut intestinal de la cadavre (intestin subtire),

* materii fecale, bila de la contacti, convalescenti, pacienti cu forme inaparente de boala. Conditii de recolta: materiile fecale se recolteaza inainte de administrarea unui chimioterapic,

de la bolnavii cu tulburari acute, se recolteaza materii fecale din scaun emis spontan, daca bolnavul nu are tulburari gastro intestinale (contacti, convalescenti, forme inaparente de boala, purtatori cronici): se administreaza purgativ salin,

NU se recolteaza cu sonda.

Aprecierea aspectului macroscopic: materii fecale de consistenta redusa, apoase, aspect riziform (apa de orez), Transport: mediu Cary Blair transportat si stocat la temperatura camerei (V. cholerae rezista si 1 saptamana in Cary Blair, la temperatura camerei), Examen microscopic:

preparat proaspat intre lama si lamela: flora bacteriana cu aspect morfologic caracteristic: bacterii incurbate in forma de virgula, cu mobilitate f. mare determinata de cilul polar, mai lung decat corpul bacterian, frotiuri Gram si albastru metilen: absente sau extrem de rare PMN (1-3 PMN/ camp) si bacili incurbati Gram (-) cu flagel polar,

Imbogatire: apa peptonata alcalina pH 9,0 9,2 incubare la 37C timp de 4- 6- max 8 ore (daca se depasesc 8 ore, flora de asociatie din materiile fecale, determina acidifierea mediului si vibrionii sunt distrusi),

multiplicarea vibrionilor holerici determina formarea la suprafata mediului de imbogatire/ apa peptonata, un val (sunt aerobi, se dezvolta la suprafata mediului), Cultivare: insamantare din suprafata mediului de imbogatire sau din valul format, pe medii selective, solide:* moderat selectiv: BSA (Bile Salts, Agar),* inalt selective: TCBS (Thiosulphate, Citrate, Bile Salts, Sucrose)* Agar 5% sange berbec,* Agar MacConkey Incubare: 18- 20 ore la 37C,

Identificare Vibrio cholerae pe baza caracterelor culturale mediul BSA: colonii plate sau usor convexe, netede, umede, extrem de transparente (se vad doar dupa deschiderea placii), mediul TCBS: colonii galbene, geloza- sange: V. cholerae non: O1 produc beta- hemoliza, MacConkey: V. cholerae cresc sub forma de colonii lactozo- negative (L-). - medii cromogene

Identificare pe baza caracterelor microscopice: bacili Gram (-) incurbati, in forma de virgula, cu flagel polar, mai lung decat corpul bacterian. Identificare pe baza caracterelor biochimice: V. cholerae clasic si ElTor:- R. catalazei: (+),

- R. oxidazei (+),

- fermenteaza glucoza fara producere de gaz (G+, g-)- V. cholerae clasic: lactozo (+) tardiv (L+),- fermenteaza manita (M+),- zaharoza Z (+/-),- lizindecarboxilaza (+),

- ornitindecarboxilaza (+),Diagnostic diferential inttre V. cholerae classic si ElTor:

CARACTERBIOTIP

CLASICElTor

Sensibilitate la polimixina+-

Hemoliza-+

Aglutinare hematii de pui-+

Voges- Proskauer_+

Liza prin bacteriofagClasic IV+-

ElTor 5-+

Identificare pe baza caracterelor antigenoice: aglutinare pe lama cu ser antiholeric grup O:1,

aglutinare pe lama cu ser anti O: 139 (mutanta O a biovarului ElTor).

test de imobilizare: suspensie de materii fecale + 1 picatura de ser antiholeric O:1: se observa la microscop imobilizarea bacililor.* Imunofluorescenta: nespecifica.

Lizotipia:

Metode de biologie moleculara

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC IN INFECTII PRODUSE DE

GENUL PSEUDOMONAS

Microorganismele genului Pseudomonas sunt foarte raspandite in natura: apa, sol, unde indeplinesc functii de mineralizare a materiei organice vegetale si animale, de unde ajung frecvent in tractul digestiv uman si animal.

Definitie:

bacili Gram (-) drepti sau incurbati, polimorfi, mobili, cu cili polari (monotrichi sau lophotrichi),

strict aerobi,

catalaza (+),

oxidaza (+),

nesporulati,

necapsulati (exceptie fac variantele fenotip mucos, virulente, izolate din supuratii cronice bronho- pulmonare),

unele specii produc pigmenti difuzibili, fluorescenti (pioverdina, piocianina),

miros specific, aromat (flori de tei),

cresc pe medii simple,

majoritatea speciilor sunt nepatogene. In Genul Pseudomonas sunt cuprinse specii fluorescente si nefluorescente.

Pseudomonas aeruginosa este specia cel mai frecvent implicata in imbolnaviri umane.

Ps. aeruginosa este principala bacterie condittionat patogena, implicata in proportie de aproximativ 10- 15% in infectiile intraspitalicesti.Diagnostic de laborator:1. Prelevate :

secretii plagi, puroi, urina, sange, LCR, sputa,

2. Recolta, Transport (rezistent, nepretentios),3. Examinare macroscopica (puroi verde, albastrui)4. Examinare microscopica a produsului patologic: Frotiuri colorate Gram si albastru de metilen: frecvente PMN, frecventi bacili Gram (-) drepti, incurbati, polimorfi, nesporulati, necapsulati.

5. Cultivare:

* Medii lichide (bulion, apa peptonata): creste cu tulburarea mediului si formarea unei pelicule la suprafata acestuia; in cateva zile pelicula se rupe, cade la fundul tubului, iar mediul devine vascos, filant,

la suprafata se formeaza un inel pigmentat, colorat verde- albastrui, cu miros de flori de tei,

* Medii solide:colonii tip S, M, R- Istrate Meitert: colonii Lactozo (-), mici, albastre, aderente de mediu,

- Geloza- sange: colonii gri, lucioase, hemoliza tip , luciu metalic,

Medii diferentiale, selective pentru Enterobacterii: CLED/ geloza lactozata, MacConkey, ADCL etc: colonii lactozo (-):

Medii care pun in evidenta pigmentogeneza: King A, B,

6. Incubare 24- 48 ore la 37C (Ps. aeruginosa se dezvolta la +4C si 42C : criterii orientative de diagnostic),

7. Identificare:

a) caractere microscopice: bacili Gram (-), drepti, incurbati, polimorfi, dispusi in perechi, gramezi, lanturi.

b) caractere culturale (vezi punctul 5),c) caractere biochimice:

catalaza (+),

oxidaza (+),

glucoza, lactoza, zaharoza (-): bacterie inerta din punct de vedere al metabolismului glucidic,

TSI, MIU, MILF: teste nemodificate,

creste pe mediu cu citrat ca unica sursa de carbon (virare spre albastru a mediului citrat Simmons),

pigmenti piocianina, piuoverdina, piorubrina, piomelanmina,

creste la 42C,

d) Bacteriocinotipia,

e) Lizotipia,

f) Antibiotipia/ Antibiograma:

este obligatorie,

pune in evidenta tulpinile multidrog rezistente: rezistenta la cel putin 3 clase de antibiotice, izolate din infectii intraspitalicesti.

In tratamentul infectiilor cu Ps. aeruginosa, se utilizeaza asociatii de substante antimicrobiene, deoarece in monoterapie exista riscul selectarii tulpinilor multirezistente. Se recomanda asocierea unei peniciline (ticarcilina, mezlocilina, piperacilina) cu un aminoglicozid (amikacina, tobramicina). Dintre clasele noi de antibiotice cu efect antipseudomonazic se recomanda: piperacilina/ tazobactam (tazocin), cefoperazona, imipenem, meropenem, ceftazidim, noile quinolone, tigecyclina etc. In scop terapeutic se mai poate utiliza vaccinul piocianic monovalent.

GENUL CAMPYLOBACTERDefinitie: bacterii Gram (-) cu o morfologie caracteristica in forma de S, spirale, mobile, datorita unui flagel polar sau cate unul la fiecare capat, nesporulate, microaerofile.

Din Genul Campylobacter, fac parte 13 specii dintre care, cu importanta medicala majora sunt C. jejuni si C. coli. C. jejuni este un patogen obisnuit al omului, producand enterocolite, rareori infectii sistemice. In etiologia bolii diareice, este izolat cu aproape aceeasi frecventa ca si Shigella si Salmonella.Diagnostic de laborator. Diagnostic bacteriologic direct.

1. Prelevate clinice: materii fecale, sange.

2. Examinare macroscopica prelevat patologic: scaun diareic cu mucus, puroi, sange,3. Examinare microscopica a prelevatului: coloratii Gram, Giemsa, AM, fucsina din coloratia Ziehl Neelsen

The photograph is of a modified fuchsin stain of organisms recovered from a stool cultureobtained from a 1-year old Guatemalan girl suffering3 days of diarrhea as a result of a Campylobacter infection. A smear of the cultured organism was stained with undiluted carbolfuschin Ziehl-Neelsen solution (Merck) for 3 minutes at room temperature.

4. Examinare pe camp intunecat sau la microscopul cu contrast de faza: se vizualizeaza bacteriile cu morfologia si mobilitatea caracteristice.5. Cultivare: medii de cultura speciale: Skirrow, Butzler, Campylosel

geloza Columbia + 5% sange de berbec, supliment inhibitor (antibiotice: colistin, trimetoprim, cefalotin, amphotericina B),

incubare la 42C, 24- 48 ore, atmosfera in microaerofilie (85% N2, 10% CO2, 5%O2), obtinuta cu plicuri generatoare de amestec gazos/ Campypak,6. Identificare:a) caractere microscopice: bacili Gram (-) in forma de virgula sau spiralati, in aripi de pescarus,

b) caractere culturale: colonii netede, plate, umede, gri, luciu metalic, tendinta de a se intinde de-a lungul striului.c) caractere biochimice:

catalaza (+),

oxidaza (+),

bacteriile din Genul Campylobacter nu degradeaza zaharurile nici fermentativ, nici oxidativ,

Identificarea se face pe baza urmatoarelor teste:

reducerea nitratilor,

producerea de H2S,

testul hipuratului (+),

sensibilitatea la antibiotice: furazolidon, eritromicina, ac. nalidixic, ciprofloxacina, d) Teste serologice: RFC si ELISA: pentru evidentierea enterotoxinelor sau a

citotoxinelor. 7. Antibiograma

Helicobacter pyloriDefinitie: bacterie deosebita datorita habitatului neobisnuit- mucoasa gastrica, cu pH f. scazut, intalnita mai frecvent la persoane cu hipo/ aclorhidrie. Bacteriile sunt caracterizate prin prezenta unui manunchi de 4-6 flageli polari. 1. Prelevate: piesa biopsica din mucoasa gastrica, recoltatat prin endoscopie.

2. Transport,

3. Examen microscopic: prezente PMN, bacili Gram (-) spiralati, incurbati,4. Cultivare: H. pylori este o bacterie pretentioasa, necesita medii speciale, imbogatite:

geloza cord creier (BHI), geloza triptticaza soia, geloza chocolat, Brucella agar, Mueller Hinton, cu adaos de sange,

atmosfera in microaerofilie,

temperatura 37C- 42C,

5. Identificare: caractere microscopice,

caractere culturale: colonii mici, transparente, usor bombate, slab beta- hemolitice, caractere biochimice:

catalaza (+),

oxidaza (+),

ureaza (+),

hipuratul (-),

caractere antigenice: RFC, reactia de aglutinare, hemaglutinare, ELISA.

In 1994 Organizatia Mondiala a Sanatatii a clasificat Helicobacter pylori in Clasa I a cauzelor cancerigene.

Tratament: amoxicilina + Metronidazol + preparate cu bismut (protector al mucoasei gastrice).PAGE 1