LP 5 - Diagnosticul in Infectia Cu Virusuri Gripale

7/23/2019 LP 5 - Diagnosticul in Infectia Cu Virusuri Gripale

http://slidepdf.com/reader/full/lp-5-diagnosticul-in-infectia-cu-virusuri-gripale 1/47

Diagnostic in infectia cu

virusuri gripale



Orientare clinica

• febra (3-5 zile), mialgie, cefalee, astenie (>2

saptamani), tuse neproductiva, faringita, rinoree.

• Gripa nu se diagnosticheazaclinic!!!

Simptomatologie asemanatoare cu infectii determinate de:

Mycoplasma pneumoniae, adenovirusuri, virusulrespirator sincitial, rhinovirusuri, virusuri paragripale,

si Legionella spp.



Forma clinicã Etiologie viralãcomunã

Etiologie viralãrarã

Guturai,Rhinofaringite

Rhino,coronavirusuri

v. gripale,Enterovirusuri(Cox)

Laringo-traheobronsite

VRS, V.paragripale

Adeno-, v.rujeolic

Bronsite V. gripale V. paragripale

Pneumonii V. gripale,SARS

V. gripeiaviare,Micoplasme



ETIOLOGIE

POSIBILA

Produs

Patologic

IZOLARE Dg. DIRECT

=detectie

directa

Dg.

INDIRECT

=serologie

V GRIPALE(A, B, C) SNF (ENF)

ANF

ATB

•OGE

•Culturi

celulare

DA –

PCRsi IF

DA –

studiiepidemiolog

ice

DIAGNOSTICUL DE GRIPA



Produse patologice : a)Spalatura nazo faringiana (SNF) =

Exsudat nazo faringian

Recoltare.

N- tampoane sterile cu coada introduse in cornetul nazal inferior,secretii de la nivelul peretelui posterior al nazofarinxului.

F - tampon prin cavitatea bucala pentru secretii de pe peretele

lateral/posterior al orofaringelui si din orice arie adiacenta cuinflamatie, exudat sau ulceratie.

se evita atingerea tamponului de limba, obraji sau buze pentru evitareacotaminarii.

Stocare si transport.

optim imediat dupa recoltare (cand nu este posibil: -70 C, cu transport

pe zapada carbonica)Prelucrare.

tamponul sau secretiile recoltate sunt dispuse intr-un tub steril cu circa15 ml mediu minim o ora, timp necesar elutiei virusului. centrifugarela 2500 - 15 minute, la 4° C. Supernatantul este indepartat sisedimentul este resuspendat in 3-4 ml TFS sau mediu. In final

depozitul de celule reluat in TFS serveste pentru izolare virala saupentru efectuarea de frotiuri ce vor fi testate in imunofluorescenta.



Produse patologice :

a) exsudat nazo faringian

b) aspiratul nazofaringian se obtine folosind unspeculum nazal prin administrarea a 3 ml ser fiziologic in

nari cu o seringa atasata la un tub de plastic.

c) lavaj traheobronsic se obtine prin bronhoscopiein conditii speciale de catre personal calificat.



Directii de diagnostic

• IZOLARE – OGE/ c.c .

•

DETECTIE RAPIDA –

RIF / Rt PCR

• DIAGNOSTIC SEROLOGIC



1.-culturi primare de rinichide maimuta rhesus.

-linia continua epiteliala de

rinichi de caine(MDCK).

2. pe OGE- 9-11 zile,

inoculat – intraamniotic

– intraalantoidian.

Izolare virala – diagnostic de electie



V. GRIPAL ESTE NONCITOPATOGEN!!

Tipuri v gripal: A, B, C

Subtipuri: A(H1N1)

A(H3,N2)… Dupa HA si NA

•16 tipuri de HA

•

9 tipuri de NA

Matrice

Nucleocapsida helicoidalaARNss

HA - hemaglutinina

transcriptaza

anvelopa

NA - neuraminidaza



Demonstrarea izolarii v.gripale

pe culturi de celule - HEMADSORBTIE

• 48 ore dupa inocularea

v. gripal se incearca

detectia virusului prin

hemadsorbtie, obisnuit

cu eritrocite de cobai

• Hematiile adsorbite

specific rozeteaza la

periferia celulelor

infectate.



Etape:

•Ag. viral - dilutii binare

•suspensie de hematii

•Se incubeaza la temperatura camerei - 30 minute

•Martorul reactiei contine suspensie hematii

Rol RHA:

Demonstrarea prezentei virusului hemaglutinant

Titrarea antigenului hemaglutinant

UHA

DEMONSTRAREA PREZENTEI

VIRUSULUI IN OGE

REACTIA DE HEMAGLUTINARE -RHA



IDENTIFICAREA V. GRIPALE

R. HEMAGLUTINO-INHIBARE

RHAIEtape:

•Ag. viral hemaglutinant •Dilutii binare din serurile imune de referinta (Ac antivirali

cunoscuti)- 60 min la 37°C.•Sistem indicator - suspensia de hematii.•Se incubeaza 60 min la temperatura camerei

Reactia de identificare a virusurilor gripale

UHAI



DIAGNOSTIC SEROLOGIC

RHAI = Tulpini de referinta + ser pacient

•diagnostic retrospectiv,

•recoltarea de probe de serpereche

•cresteri semnificative (de

peste 4 ori) a titrului Ac

specifici

•sau determinarea

rezultatului vaccinarii



OMS - Global Influenza

Surveillance Network

2012-2013 Emisfera de Nord

•

A / California/7/2009 (H1N1) -like virus;• A / Victoria/361/2011 (H3N2)-like virus;

• B / Wisconsin/1/2010-like virus.

http://en.wikipedia.org/wiki/National_Influenza_Centers






Reactia de Imunofluorescenta directa

(RIF)

test rapid, reproductibil, ieftin

detecteaza ANTIGENE VIRALE cu anticorpi marcati

cu fluorocromi

ID

PP

Anticorpi marcati cu

fluoresceina sau rhodamina



Reactia de Imunofluorescenta

(RIF)

Aplicatii – DIAGNOSTIC IN•Infectiile herpetice

•Infectiile respiratorii (Gripa)

•Rabia



Teste moleculare

NAT (nucleic acid tests)

RT PCR

• Swine flu real-time PCR kit

• Quick Diagnosis of Flu Strains Possible with New

Microchip Test - FluChip,• Inexpensive Test Detects influenza Infections Quickly

and Accurately – MChip

• FDA Approves New Laboratory Test To Detect HumanInfections With Avian Influenza A/H5 Viruses (

http://www.nih.gov/news/pr/aug2006/niaid-28.htm


http://www.nih.gov/news/pr/nov2006/niaid-14.htm


http://www.hhs.gov/news/press/2006pres/20060203.html










DIAGOSTIC IN VIROZERESPIRATORII



VIROZE RESPIRATORII



Diagnostic in infectia cu

virusuri gripale



Orientare clinica

febra (3-5 zile), mialgie, cefalee, astenie(>2 saptamani), tuse neproductiva,faringita, rinoree.

Gripa nu se diagnosticheaza clinic.

Simptomatologie asemanatoare cu infectii determinate de:

Mycoplasma pneumoniae, adenovirusuri,

virusul respirator sincitial, rhinovirusuri,virusuri paragripale, si Legionella spp.

ORTHOMIXOVIRUSURI V GRIPALE A B C



ORTHOMIXOVIRUSURI-V. GRIPALE A, B, C

myxa-mucus

tip A, B, C : NP, M

subtipuri: HA si NA – 15 tipuri de HA si 9 de NA

Matrice

Nucleocapsida helicoidala

ARNss

HA - hemaglutinina

transcriptaza

anvelopa

NA - neuraminidaza



Produse patologice :

a) spalatura nazo faringiana se obtine cuajutorul unor tampoane cu coada (sterile)introduse in cornetul nazal inferior.

b) aspiratul nazofaringian se obtine folosind

un speculum nazal prin administrarea a 3 ml serfiziologic in nari cu o seringa atasata la un tub deplastic.

c) lavaj traheobronsic se obtine prinbronhoscopie in conditii speciale de catre personal

calificat

Pentru a mari sansa de izolare probele se recolteazain primele 72 ore de la debutul infectiei.



Produse patologice

Exsudat naso-faringian/SNF Recoltare. tampon steril - recoltare secretii de pe peretele

posterior si lateral al orofaringelui si din orice arie adiacenta cuinflamatie, exudat sau ulceratie. Se evita atingerea tamponuluide limba, obraji sau buze pentru evitarea contaminarii;

recoltarea nazala se obtine cu ajutorul unui tampon cu coadaintrodus in cornetul nazal inferior.

Stocare si transport. Optim se inoculeaza imediat duparecoltare. Daca aceasta nu este posibil se ingheata la -70 C sise transporta pe zapada carbonica

Prelucrare. Tamponul este dispus intr-un tub steril cu circa 15ml mediu de transport pentru virusuri si 2% SFV minim o ora,timp necesar elutiei virusului. Tubul se centrifugheaza la 2500g, 15 minute, la 4 C. Supernatantul este indepartat sisedimentul este resuspendat in 3-4 ml TFS sau mediu decultura. Spalarea celulelor se poate repeta pentru indepartareaurmelor de mucus din secretii. In final depozitul de celule reluatin TFS serveste pentru izolare virala sau pentru efectuarea defrotiuri ce vor fi testate in imunofluorescenta cu intreaga baterie

de seruri antivirale disponibile.



Diagnosticul de laborator al gripeiDirectii de diagnostic

Izolare virala + identificare

Detectie directa antigene virale- RIF

acid nucleic- PCR

Diagnostic serologic



1.-culturi primare de rinichide maimuta rhesus.

-linia continua epitelialade rinichi de caine (MDCK- Madin-Darby CanineKidney).

2. pe ou de gaina embrionat,de 9-11 zile, inoculatintraamniotic sauintraalantoidian.




Hemadsorbtiademonstreaza izolarea v.gripalepe culturi de celule

Virusurile gripale nu suntcitopatogene.

La 48 ore dupa inocularea v.gripal se incearca detectia

virusului prin hemadsorbtie,obisnuit cu eritrocite decobai la 4 C.

Hemadsorbtia rezulta dinincorporarea in membrana

plasmatica celulara a HAvirale. Hematiile adsorbitespecific rozeteaza laperiferia celulelor infectate.



1.-culturi primare de rinichi demaimuta rhesus.

-linia continua epiteliala derinichi de caine (MDCK -Madin-Darby CanineKidney).

2. pe ou de gainaembrionat, de 9-11 zile,inoculat intraamnioticsau intraalantoidian.




Izolarea pe OGE

Izolarea se dem. prin proprieratea v.gripale de a aglutina hematii

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/1/1b/White_chicken_egg_square.jpg

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/1/1b/White_chicken_egg_square.jpg



REACTIA DE HEMAGLUTINARE

Capacitatea unor virusuri de a aglutinahematiile unor specii de animale

Virusurile care poseda capacitatea de a

aglutina hematii se numesc virusurihemaglutinante (rubeola, rujeola, urlian,unele adenovirusuri, enterovirusuri, gripalesi paragripale)

Punerea in contact a unor dilutii succesive,binare de antigen hemaglutinant cuhematiile corespunzatoare virusuluiincriminat



Etape:

•Ag. viral - dilutii binare

•suspensie de hematii

•Se incubeaza la temperatura camerei - 60 minute

Rol RHA:

Demonstrarea prezentei virusului hemaglutinant

Titrarea antigenului hemaglutinant inaintea reactiei de hemagutino-inhibare

UHA

DEMONSTRAREA PREZENTEI VIRUSULUIIN OGEREACTIA DE HEMAGLUTINARE



CLASIFICAREA V. HEMAGLUTINANTE

I. HA structurala care distruge R V gripale, paragripale

II. HA structurala care nu distruge R Arbovirusuri, v rubeolos

III. HA non-structurala poxvirusuri

IDENTIFICAREA V GRIPALE



IDENTIFICAREA V. GRIPALER. HEMAGLUTINO-INHIBARE

Tehnica reactiei:

dilutii binare din ser imun de referintaag. viral hemaglutinant - 60 min la 37°C.sistem indicator - suspensia de hematii.Se incubeaza 60 min la temperatura camerei

Reactia de identificare a virusurilor gripale

UHAI






acid nucleic- PCR




Imunofluorescenta directa –

test rapid, reproductibil, ieftin

Diagnostic rapid in

gripa,

infectie herpetica,

rabie.



Reactia deImunofluorescentadirecta

Amprenta se va usca bine:

pp. amprentat direct pe lama

Imersie in acetona la 2-8°C timp de 10

minute si uscare.

ID

PP



Reactivii trebuie sa fie la temp.camerei

Incubare cu anticorp fluorescent (30 min la 37° C)

Spalare

Citire la MO in lumina UV

ID

PP

Anticorpi monoclonali marcati

cu ITCF

anti epitopi specifici de la

nivelul anvelopei,

ex. anti H1N1; anti H3N3



Di ti l d l b t l i i






acid nucleic- PCR




Diagnosticul serologic

Necesita recoltarea de probe de ser pereche de laacelasi pacient.

Nu se practica in mod curent decit in caz de epidemii,pentru diagnostic retrospectiv.

Diagnosticul necesita demonstrarea unei cresterisemnificative (de peste 4 ori) a titrului Acspecifici antivirali intre proba de faza acuta, recoltatala o saptamana de la debutul bolii si cea dinconvalescenta, recoltata 2-3 saptamani mai tarziu.

Metoda preferata de evidentiere a anticorpilor antivirali specifici este hemaglutinoinhibarea.



DIAGNOSTIC SEROLOGIC

RHAI = Tulpini de referinta + ser pacient

•diagnostic retrospectiv,

•recoltarea de probe de ser

pereche•cresteri semnificative (de

peste 4 ori) a titrului Ac

specifici



Pacient cu febra, cefalee, astenie,tuse neproductiva. Ce produsepatologice utilizati?

Cum faceti diagnosticul rapid?

Pe ce substraturi se poate faceizolarea virala?

Este diagnosticul serologic de primaintentie in aceasta viroza?



Precizati tipul de reactie reprezentata in sirurile de godeuri C, D, Esi principiul tehnicii.Pentru ce viroze tehnica aceasta este de electie si ce simptomeclinice prezinta pacientul?



Precizati tipul de reactie si infectiile viralecare pot fi diagnosticate cu aceasta.



Cum demonstrati izolarea unuivirus hemaglutinant?

Cum se face identificareavirusurilor hemaglutinante?

LP 5 - Diagnosticul in Infectia Cu Virusuri Gripale

Documents

Transcript of LP 5 - Diagnosticul in Infectia Cu Virusuri Gripale