LP 1 - Algoritmul de Diagnostic Virusologic

58
ALGORITMUL DIAGNOSTICULUI IN VIROZE

description

VirusologieUMF "Carol Davila" Bucurestianul III

Transcript of LP 1 - Algoritmul de Diagnostic Virusologic

  • ALGORITMUL

    DIAGNOSTICULUI

    IN VIROZE

  • Etapele diagnosticului

    virusologic

    Recoltarea produsului patologic

    Transportul produselor patologice

    Direciile diagnosticului virusologic

  • RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE STERIL!!!

  • Fluidele orale reduc riscul contaminarii,

    simplifica procedura de recoltare

  • PRODUSE PATOLOGICE Snge - 3-5 ml prin punctia venoasa aseptica, pe anticoagulant.

    Virusuri frecvent izolate: virusuri care disemineaza viremic si agentii etiologici ai febrelor hemoragice.

    Materiile fecale - 4-8 g in solutie de Mg SO4 (stabilizeaza infectivitatea enterovirusurilor).

    Virusuri frecvent izolate: enterovirusuri, rotavirusuri, calicivirusuri, mai rar adenovirusuri enterice.

    Secretii nazo faringiene

    a) spalatura nazo faringiana se obtine cu ajutorul unor tampoane cu coada (sterile) introduse in cornetul nazal inferior.

    b) aspiratul nazofaringian se obtine folosind un speculum nazal prin administrarea a 3 ml ser fiziologic in nari cu o seringa atasata la un tub de plastic.

    c) lavaj traheobronsic se obtine prin bronhoscopie in conditii speciale de catre personal calificat

    Virusuri frecvent izolate: virusurile gripale A si B, virusurile paragripale, adenovirusuri, rhinovirusuri, coronavirusuri, virusul respirator sincitial, v.rujeolos, v. rubeolos, v. urlian.

    Lichid cefalorahidian (LCR) - 5-6 ml prin punctie rahidiana, inainte de inceperea tratamentului.

    Virusuri frecvent izolate: virusul rabic, unele arbovirusuri.

  • PRODUSE PATOLOGICE Saliva. Se recolteaza saliva de langa ductul Stenon cu tampon steril.

    Frecvent este limitata la diagnosticul infectiei rabice.

    Lichid vezicular - Colectarea lichidului din vezicule, bule, pustule se face dupa dezinfectia prealabila a regiunii cutanate sau mucoase. Se perforeaza vezicula cu un ac atasat la o seringa de tuberculina sau cu ajutorul unei pipete.

    Virusuri frecvent izolate: HSV I, HSV II si VZV.

    Urina -100 ml - orice specimen urinar obtinut prin abstinenta de la mictiune timp de 2 ore este adecvat pentru diagnosticul virusologic.

    Virusuri frecvent izolate. V. citomegalic, v. rujeolos.

    Tampoane vaginale, lavaj cervico-vaginal, tampon uretral de la nivelul colului uterin si uretrei (atat la femeie cat si la barbat); cu tampoane sterile, respectiv periuta citologica (pentru uretra masculina), fara toaleta prealabila a regiunii.

    Virusuri frecvent izolate: virusuri herpetice si papilomavirusuri; diagnostic BTS, uretritelor, leziunilor veziculare si hiperplazice genitale.

    Biopsia tisulara. Fragmente de organ recoltate n ctiva ml de solutie salina + ser de vitel 10% + antibiotice n concentratiile folosite n culturile de celule.

  • Transportul probelor recoltate

    Rapid

    La rece

    Sigur ambalare riguros corecta

    etichetarea cu semn biorisc

    documentatie in legatura cu agentul biologic transportat

  • Formular de trimitere pentru diagnostic

    virusologic

    Adresa spitalului/policlinicii/

    cabinetului ce trimite produsul

    patologic

    Medicul caruia i se va

    comunica rezultatul (tel, fax, e-

    mail)

    Nume, prenume pacient Sex, Varsta

    Date clinice, suspiciune

    diagnostic

    Data debutului

    simptomatolgiei

    Tipul produs patologic Data, ora recoltarii

    Tipul tratamentului administrat

    in prealabil

    Date epidemiologice (contact

    cu boli infectioase

    transmisibile, vectori, calatorii

    in zone endemice pt o anumita

    boala, vaccinari)

    Analiza solicitata

    Semnatura, parafa medicului

  • 1. Izolare virala in: Culturi de celule

    Ou de gaina embrionat

    Animal de laborator

    2. Detectia directa a : Particulelor virale EM , IEM

    Antigene virale ELISA, IF

    Genom viral PCR; Rt-PCR

    3. Teste Serologice: a. Ac virus- specifici tip IgM

    b. seroconversia in ac virus- specifici tip IgG

    Direciile diagnosticului virusologic

  • Pocks-uri pe MCA a OGE - v. variolic

    Izolarea virala prin inoculare pe OGE

  • Detectia directa a

    particulei virale prin Microscopie Electronica

    Coloratia negativa

    acetat de uranil

    acid fosfotungstic

    Metode care cresc sensibilitatea

    (106-108 particule/ml): SPIEM, SIA

    Metode de concentrare: ultracentrifugare

    difuzia in agar

    centrifugare directa pe grila de ME

  • Diagnosticul serologic pe prob unic de ser - anticorpi antivirali de tip

    IgM (rspunsul imun primar) - ELISA de captur

    pe probe pereche de ser - proba I - la debut

    - proba II - la 2-3 sptmni

    ELISA tehnica indirect sau de competiie

    seroconversia (proba I - nu exist anticorpi/ proba II

    - apar anticorpi specifici virusului de detectat),

    creterea semnificativ a titrului de anticorpi ntre cele 2 probe (de minim 4 ori)

  • Etapele diagnosticului virusologic

    Suspiciunea de viroz

    Recoltarea produsului patologic

    Transportul produselor patologice

    Direciile diagnosticului virusologic

    Izolarea viral

    Dem. virusului/componente Diagnosticul

    serologic

  • VIRUSOLOGIE

    Lucrari practice

    Prepar. Univ Dr. Aura Temereanca

    Asist. Univ dr. Cornel Popescu

    Sef Lucrari Univ. dr. Camelia Sultana

  • ALGORITMUL

    DIAGNOSTICULUI

    IN VIROZE

  • Etapele diagnosticului

    virusologic

    Orientarea diagnosticului (suspiciunea

    de viroz)

    Recoltarea produsului patologic

    Transportul produselor patologice

    Direciile diagnosticului virusologic

  • Etapele diagnosticului

    virusologic

    Orientarea diagnosticului

    Recoltarea produsului patologic

    Transportul produselor patologice

    Direciile diagnosticului virusologic

  • Formular de trimitere pentru diagnostic

    virusologic

    Adresa spitalului/policlinicii/

    cabinetului ce trimite produsul

    patologic

    Medicul caruia i se va

    comunica rezultatul (tel, fax, e-

    mail)

    Nume, prenume pacient Sex, Varsta

    Date clinice, suspiciune

    diagnostic

    Data debutului

    simptomatolgiei

    Tipul produs patologic Data, ora recoltarii

    Tipul tratamentului administrat

    in prealabil

    Date epidemiologice (contact

    cu boli infectioase

    transmisibile, vectori, calatorii

    in zone endemice pt o anumita

    boala, vaccinari)

    Analiza solicitata

    Semnatura, parafa medicului

  • V. Varicela - Zoster

  • Etapele diagnosticului

    virusologic

    Suspiciunea de viroz

    Recoltarea produsului patologic

    Transportul produselor patologice

    Direciile diagnosticului virusologic

  • RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE

    S T E R I L !!!

  • Conteinere sterile pentru recoltarea si transportul

    produselor patologice

  • RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE

    S T E R I L ! ! !

  • Recoltarea probelor- locul & timpul potrivit

    POLIO (enterovirusuri)

  • Recoltarea produselor patologice

  • PRODUSE PATOLOGICE Snge - 3-5 ml prin punctia venoasa aseptica, pe anticoagulant.

    Virusuri frecvent izolate: virusuri care disemineaza viremic si agentii etiologici ai febrelor hemoragice.

    Materiile fecale - 4-8 g in solutie de Mg SO4 (stabilizeaza infectivitatea enterovirusurilor).

    Virusuri frecvent izolate: enterovirusuri, rotavirusuri, calicivirusuri, mai rar adenovirusuri enterice.

    Secretii nazo faringiene

    a) spalatura nazo faringiana se obtine cu ajutorul unor tampoane cu coada (sterile) introduse in cornetul nazal inferior.

    b) aspiratul nazofaringian se obtine folosind un speculum nazal prin administrarea a 3 ml ser fiziologic in nari cu o seringa atasata la un tub de plastic.

    c) lavaj traheobronsic se obtine prin bronhoscopie in conditii speciale de catre personal calificat

    Virusuri frecvent izolate: virusurile gripale A si B, virusurile paragripale, adenovirusuri, rhinovirusuri, coronavirusuri, virusul respirator sincitial, v.rujeolos, v. rubeolos, v. urlian.

    Lichid cefalorahidian (LCR) - 5-6 ml prin punctie rahidiana, inainte de inceperea tratamentului.

    Virusuri frecvent izolate: virusul rabic, unele arbovirusuri.

  • PRODUSE PATOLOGICE Saliva. Se recolteaza saliva de langa ductul Stenon cu tampon steril.

    Frecvent este limitata la diagnosticul infectiei rabice.

    Lichid vezicular - Colectarea lichidului din vezicule, bule, pustule se face dupa dezinfectia prealabila a regiunii cutanate sau mucoase. Se perforeaza vezicula cu un ac atasat la o seringa de tuberculina sau cu ajutorul unei pipete.

    Virusuri frecvent izolate: HSV I, HSV II si VZV.

    Urina -100 ml - orice specimen urinar obtinut prin abstinenta de la mictiune timp de 2 ore este adecvat pentru diagnosticul virusologic.

    Virusuri frecvent izolate. V. citomegalic, v. rujeolos.

    Tampoane vaginale, lavaj cervico-vaginal, tampon uretral de la nivelul colului uterin si uretrei (atat la femeie cat si la barbat); cu tampoane sterile, respectiv periuta citologica (pentru uretra masculina), fara toaleta prealabila a regiunii.

    Virusuri frecvent izolate: virusuri herpetice si papilomavirusuri; diagnostic BTS, uretritelor, leziunilor veziculare si hiperplazice genitale.

    Biopsia tisulara. Fragmente de organ recoltate n ctiva ml de solutie salina + ser de vitel 10% + antibiotice n concentratiile folosite n culturile de celule.

  • Etapele diagnosticului

    virusologic

    Suspiciunea de viroz

    Recoltarea produsului patologic

    Transportul produselor

    patologice Direciile diagnosticului virusologic

  • Transportul probelor recoltate

    Rapid

    La rece

    Sigur ambalare riguros corecta

    etichetarea cu semn biorisc

    documentatie in legatura cu agentul biologic transportat

  • Etapele diagnosticului

    virusologic

    Suspiciunea de viroz

    Recoltarea produsului patologic

    Transportul produselor patologice

    Direciile diagnosticului virusologic

  • DIRECIILE DIAGNOSTICULUI VIRUSOLOGIC

    1. Izolarea viral

    2. Demonstrarea prezenei

    virusului / componentelor sale

    3. Diagnosticul serologic

  • Izolarea

    virusurilor

  • Izolarea virusurilor

    3 sisteme de izolare folosite n virusologie

    Culturi de celule

    Ou de gin embrionat

    Animalul de laborator

  • Izolarea virusurilor

    in culturi de celule

  • HEK 293 HeLa BSC-40

    Infectate cu v. variolic

    Neinfectate

    Izolarea pe culturi de celule

    = EFECTE CITOPATICE

  • RABIE

    Sus- neuron fara

    incluzii Negri

    Jos neuron cu incluzii

    Negri (col HE)

  • Izolarea virala

    prin

    inoculare la

    animalul de

    laborator

  • RABIE modificari

    patognomonice in SNC

    Infiltrat mononuclear perivascular-

    sus

    Focare de infiltratie limfocitare in

    celulele gliale -jos

  • Pocks-uri pe Membrana Chorio-alantoindiana OGE - v. variolic

    Izolarea virala prin inoculare pe OGE

  • DIRECIILE DIAGNOSTICULUI VIRUSOLOGIC

    1. Izolarea viral

    2. Demonstrarea prezenei

    virusului / componentelor sale

    3. Diagnosticul serologic

  • Detectia directa

    a particulei

    virale

  • Microscopia electronica

    Coloratia negativa

    acetat de uranil

    acid fosfotungstic

    Metode care cresc sensibilitatea

    (106-108 particule/ml)

    Metode de concentrare: ultracentrifugare

    difuzia in agar

    centrifugare directa pe grila de ME

  • Microscopie electronica

    Coloratie negativa

    vaccinia

  • Microscopie electronica

    Coloratie negativa

    variola

  • Electron micrographs of hepatitis C virus purified from cell culture.

    Scale bar is 50 nanometers.

  • Detectia directa a

    componentelor

    viraleAcid nucleic

    Antigene virale

  • Detectia directa a acidului

    nucleic viral - PCR

  • Thermocycler

  • Detectia directa a antigenelor

    virale ELISA (test imuno-enzimatic)

  • sandwich ELISA. (1) Plate is coated with a capture antibody; (2) sample is added,

    and any antigen present binds to capture antibody; (3) detecting antibody is added,

    and binds to antigen; (4) enzyme-linked secondary antibody is added, and binds to

    detecting antibody; (5) substrate is added, and is converted by enzyme to

    detectable form.

  • Detectia directa a antigenelor virale

    reactia de imunofluorescenta (IF)(test rapid de detectie a Ag)

  • Identificarea virusurilor prin neutralizarea

    efectului citopatogen

    Reactia de Seroneutralizare

    - Identificarea Enterovirusurilor

    RSN

  • Identificarea virusurilor prin inhibarea efectului viral

    Matrice

    Nucleocapsida helicoidala

    ARNss

    HA - hemaglutinina

    transcriptaza

    anvelopa

    NA - neuraminidaza

    Reactia de Hemaglutinoinhibare

    -Identificarea virusurilor gripale

    RHAI

  • DIRECIILE DIAGNOSTICULUI VIRUSOLOGIC

    1. Izolarea viral

    2. Demonstrarea prezenei

    virusului / componentelor sale

    3. Diagnosticul serologic

  • Raspuns

    imun

    primar

    Raspuns

    imun

    secundar

    Diagnosticul serologic in infectiile virale

  • Diagnosticul serologic pe prob unic de ser - anticorpi antivirali de

    tip IgM (rspunsul imun primar) - ELISA de captur

    pe probe pereche de ser- proba I - la debut

    - proba II - la 2-3 sptmni

    ELISA tehnica indirect sau de competiie

    seroconversia In proba I nu exist anticorpi In proba II apar anticorpi specifici virusului de detectat

    creterea semnificativ a titrului de anticorpi ntre cele 2 probe (de minim 4 ori)

  • Etapele diagnosticului virusologic

    Suspiciunea de viroz

    Recoltarea produsului patologic

    Transportul produselor patologice

    Direciile diagnosticului virusologic

    Izolarea viral

    Dem. virusului/

    componente

    Diagnosticul

    serologic

    1. Algoritmul de diagnostic virusologic1