VIRUSOLOGIELucrari practicePrepar. Univ Dr. Aura TemereancaAsist. Univ dr. Cornel PopescuSef Lucrari Univ. dr. Camelia Sultana

ALGORITMUL DIAGNOSTICULUI IN VIROZE

Etapele diagnosticului virusologicOrientarea diagnosticului (suspiciunea de viroz)Recoltarea produsului patologicTransportul produselor patologiceDireciile diagnosticului virusologic

Etapele diagnosticului virusologicOrientarea diagnosticuluiRecoltarea produsului patologicTransportul produselor patologiceDireciile diagnosticului virusologic

Formular de trimitere pentru diagnostic virusologicAdresa spitalului/policlinicii/ cabinetului ce trimite produsul patologicMedicul caruia i se va comunica rezultatul (tel, fax, e-mail)Nume, prenume pacientSex, VarstaDate clinice, suspiciune diagnosticData debutului simptomatolgieiTipul produs patologicData, ora recoltariiTipul tratamentului administrat in prealabilDate epidemiologice (contact cu boli infectioase transmisibile, vectori, calatorii in zone endemice pt o anumita boala, vaccinari)Analiza solicitataSemnatura, parafa medicului

V. Varicela - Zoster

Etapele diagnosticului virusologicSuspiciunea de virozRecoltarea produsului patologic Transportul produselor patologiceDireciile diagnosticului virusologic

RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE S T E R I L !!!

Conteinere sterile pentru recoltarea si transportulproduselor patologice

RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE S T E R I L ! ! !

Recoltarea probelor - locul & timpul potrivit

POLIO (enterovirusuri)

Recoltarea produselor patologice

PRODUSE PATOLOGICESnge - 3-5 ml prin punctia venoasa aseptica, pe anticoagulant.Virusuri frecvent izolate: virusuri care disemineaza viremic si agentii etiologici ai febrelor hemoragice.Materiile fecale - 4-8 g in solutie de Mg SO4 (stabilizeaza infectivitatea enterovirusurilor).Virusuri frecvent izolate: enterovirusuri, rotavirusuri, calicivirusuri, mai rar adenovirusuri enterice.Secretii nazo faringienea) spalatura nazo faringiana se obtine cu ajutorul unor tampoane cu coada (sterile) introduse in cornetul nazal inferior. b) aspiratul nazofaringian se obtine folosind un speculum nazal prin administrarea a 3 ml ser fiziologic in nari cu o seringa atasata la un tub de plastic. c) lavaj traheobronsic se obtine prin bronhoscopie in conditii speciale de catre personal calificat Virusuri frecvent izolate: virusurile gripale A si B, virusurile paragripale, adenovirusuri, rhinovirusuri, coronavirusuri, virusul respirator sincitial, v.rujeolos, v. rubeolos, v. urlian.Lichid cefalorahidian (LCR) - 5-6 ml prin punctie rahidiana, inainte de inceperea tratamentului. Virusuri frecvent izolate: virusul rabic, unele arbovirusuri.

PRODUSE PATOLOGICESaliva. Se recolteaza saliva de langa ductul Stenon cu tampon steril. Frecvent este limitata la diagnosticul infectiei rabice.Lichid vezicular - Colectarea lichidului din vezicule, bule, pustule se face dupa dezinfectia prealabila a regiunii cutanate sau mucoase. Se perforeaza vezicula cu un ac atasat la o seringa de tuberculina sau cu ajutorul unei pipete. Virusuri frecvent izolate: HSV I, HSV II si VZV.Urina -100 ml - orice specimen urinar obtinut prin abstinenta de la mictiune timp de 2 ore este adecvat pentru diagnosticul virusologic.Virusuri frecvent izolate. V. citomegalic, v. rujeolos.Tampoane vaginale, lavaj cervico-vaginal, tampon uretral de la nivelul colului uterin si uretrei (atat la femeie cat si la barbat); cu tampoane sterile, respectiv periuta citologica (pentru uretra masculina), fara toaleta prealabila a regiunii. Virusuri frecvent izolate: virusuri herpetice si papilomavirusuri; diagnostic BTS, uretritelor, leziunilor veziculare si hiperplazice genitale. Biopsia tisulara. Fragmente de organ recoltate n ctiva ml de solutie salina + ser de vitel 10% + antibiotice n concentratiile folosite n culturile de celule.

Etapele diagnosticului virusologicSuspiciunea de virozRecoltarea produsului patologicTransportul produselor patologiceDireciile diagnosticului virusologic

Transportul probelor recoltateRapidLa rece Sigurambalare riguros corectaetichetarea cu semn biorisc documentatie in legatura cu agentul biologic transportat

Etapele diagnosticului virusologicSuspiciunea de virozRecoltarea produsului patologicTransportul produselor patologiceDireciile diagnosticului virusologic

DIRECIILE DIAGNOSTICULUI VIRUSOLOGIC Izolarea viral

Demonstrarea prezenei virusului / componentelor sale

3. Diagnosticul serologic

Izolarea virusurilor

Izolarea virusurilor 3 sisteme de izolare folosite n virusologie

Culturi de celuleOu de gin embrionat Animalul de laborator

Izolarea virusurilor in culturi de celule

HEK 293HeLaBSC-40Infectate cu v. variolicNeinfectateIzolarea pe culturi de celule = EFECTE CITOPATICE

RABIESus- neuron fara incluzii NegriJos neuron cu incluzii Negri (col HE)

Izolarea virala prin inoculare la animalul de laborator

RABIE modificari patognomonice in SNCInfiltrat mononuclear perivascular- susFocare de infiltratie limfocitare in celulele gliale -jos

Pocks-uri pe Membrana Chorio-alantoindiana OGE - v. variolic Izolarea virala prin inoculare pe OGE

DIRECIILE DIAGNOSTICULUI VIRUSOLOGIC Izolarea viral

Demonstrarea prezenei virusului / componentelor sale

3. Diagnosticul serologic

Detectia directa a particulei virale

Microscopia electronicaColoratia negativa acetat de uranil acid fosfotungsticMetode care cresc sensibilitatea (106-108 particule/ml)Metode de concentrare: ultracentrifugare difuzia in agarcentrifugare directa pe grila de ME

Microscopie electronica Coloratie negativavaccinia

Microscopie electronica Coloratie negativavariola

Electron micrographs of hepatitis C virus purified from cell culture. Scale bar is 50 nanometers.

Detectia directa a componentelor viraleAcid nucleicAntigene virale

Detectia directa a acidului nucleic viral - PCR

Thermocycler

Detectia directa a antigenelor virale ELISA (test imuno-enzimatic)

sandwich ELISA. (1) Plate is coated with a capture antibody; (2) sample is added, and any antigen present binds to capture antibody; (3) detecting antibody is added, and binds to antigen; (4) enzyme-linked secondary antibody is added, and binds to detecting antibody; (5) substrate is added, and is converted by enzyme to detectable form.

Detectia directa a antigenelor virale reactia de imunofluorescenta (IF)(test rapid de detectie a Ag)

Identificarea virusurilor prin neutralizarea efectului citopatogenReactia de Seroneutralizare- Identificarea EnterovirusurilorRSN

Identificarea virusurilor prin inhibarea efectului viralReactia de Hemaglutinoinhibare -Identificarea virusurilor gripaleRHAI

DIRECIILE DIAGNOSTICULUI VIRUSOLOGIC Izolarea viral

Demonstrarea prezenei virusului / componentelor sale

3. Diagnosticul serologic

Raspuns imun primarRaspuns imun secundarDiagnosticul serologic in infectiile virale

Diagnosticul serologicpe prob unic de ser - anticorpi antivirali de tip IgM (rspunsul imun primar) - ELISA de captur pe probe pereche de ser proba I - la debutproba II - la 2-3 sptmni ELISA tehnica indirect sau de competiie

seroconversia In proba I nu exist anticorpi In proba II apar anticorpi specifici virusului de detectat creterea semnificativ a titrului de anticorpi ntre cele 2 probe (de minim 4 ori)

Etapele diagnosticului virusologicSuspiciunea de virozRecoltarea produsului patologicTransportul produselor patologiceDireciile diagnosticului virusologicIzolarea viralDem. virusului/componenteDiagnosticul serologic

*These are examples of lab materials useful for collection of orthopox specimens for laboratory testing including the plastic vials in which lesion crusts would be shipped to the LRN site for analysis. *What about the past? Its encouraging to note that smallpox was eradicated as a naturally occurring disease in the absence of high-tech diagnostic tools. During the time when smallpox was epidemic, clinical diagnosis drove the immediate medical response, and presumably this would be expected to reoccur if smallpox were to re-emerge in the future. Diagnostic electron microscopy capability was more common in the past, and relatively low-tech gel diffusion serological assays were available. *Cell culture isolation can be an important and very sensitive method for detection of vaccinia since it also amplifies the virus for further characterization. It should be noted that specimens with high suspicion for variola should not be subjected to culture in a pre-event setting due to concerns for biocontainment and laboratory safety. *This is an example of a negatively stained electron micrographic preparation of vaccinia virus. You can see the characteristic brick-shaped particle of the orthopoxvirus and the characteristic surface morphology (example seen on the left). The EM process for orthopoxvirus identification may be accomplished relatively quickly by a skilled observer and can be used to differentiate generic orthopoxviruses from other groups of viral agents. However, it may not be as sensitive as real-time PCR and cannot differentiate between variola and vaccinia.