Licenta Elena Stan

Universitatea Maritmã din ConstanţaFacultatea de Electromecanicã Navalã

Specializarea: Ingineria şi Protecția Mediului

ECOLOGIA MICROORGANISMELOR IMPLICATE ÎN POLUARE MARINĂ

Coordonator Ştiințific: Absolvent: Lector Dr. Ghițã Simona Stan Elena

Constanţa 2014

Cuprins

Lista figurilorLista tabelelorIntroducere

CAPITOL 11.1. Descrierea conceptului de poluare1.2. Impactul poluării marine la nivel național și internațional1.3. Clasificarea nivelelor de poluare 1.4. Măsuri adoptate pentru prevenirea poluării marine

1.4.1. Poluãrile minore onshore1.4.1.1. Mãsuri de prevenire în cazul exploatãrii conductelor de transfer de țiței1.4.1.2. Mãsuri de prevenire în cazul bunkerajului şi operațiunilor de încãrcare-descãrcare a

tancurilor petroliere1.4.1.3. Mãsuri de prevenire în cazul terminalelor petroliere1.4.1.4. Mãsuri de prevenire în cazul şantierelor navale:

1.4.2. Poluãrile majore offshore1.4.2.1. Mãsuri de prevenire în cazul şantierelor navale:1.4.2.2. Mãsuri de prevenire în cazul terminalelor petroliere

1.5. Efectele ecologice rezultate în urma poluării (doc 2 + ce mai gasesi și tu)1.5.1. Zona țãrmurilor stâncoase şi falezelor1.5.2. Zona plajelor nisipoase1.5.3. Zona de țãrm mlãştinoase cu pante line

CAPITOL 2. Managementul intervenţiei în cazul poluării marine cu hidrocarburi2.1. Descrierea planului de intervenţie în caz de poluare marină2.2. Echipamente şi metode folosite pentru limitarea efectelor poluării CAPITOL 3. Rolul bacteriilor în procesul de bioremediere la nivelul sedimentelor3.1. Studiul proceselor de sedimentare la litoralul românesc al Mării Negre (DOC 3)

3.1.1. Procese de sedimentare litoralã3.1.2 Curenţii şi transportul de sedimente3.1.3 Tendinţe de eroziune a zonei costiere în sectorul Cap Midia – Vama Veche

3.1.3.1. Plaja cuprinsă intre promontoriile Cap Midia şi Cap Ivan3.1.3.2. La sud de Capul Ivan3.1.3.3.Sectorul de plajă Năvodari - Tabăra de copii 3.1.3.4. Cordonul litoral dintre Tabăra Năvodari şi Mamaia Nord 3.1.3.5. Plajele de la Mamaia 3.1.3.6. Sectorul Eforie – Costineşti 3.1.3.7. Zona Eforie Sud 3.1.3.8. Sectorul Olimp 3.1.3.9. Sectorul Saturn – Mangalia 3.1.3.10. Zona 2 Mai – Vama Veche

3.1.4 Concluzii3.2. Bacteriobentosul marin3.3. Strategii de supraviețuire ale bacteriilor în mediul natural

3

CAPITOL 4. Evaluarea structurală și funcțională a microbiotei (DOC 4)4.1 Prelevarea probelor și montarea experimentului – conceptul de microcosmos4.2. Metode microscopice utilizate pentru distingerea fracțiilor celulare vii-moarte

4.2.1. Colorația acridine orange (număr total)4.2.2. Colorația aniline blue (celule cu capsulă)4.2.3. Colorația cu iodura de propidium (celule permeabilizate)

4.3. Determinarea numărului de microorganisme folosind softul CellC4.4. Măsurarea cantității de azot și fosfor din microcosmosuri4.5. Calculul densitãții celulelor şi creşterea procentuală

CAPITOL 5. Utilizarea nanocristalelor semiconductoare pentru vizualizarea microbiotei5.1. Proprietățile nanocristalelor semiconductoare5.2. Proprietăți legate de fenomenul de fotoluminescență

5.2.1. Excitarea luminoasă5.2.2. Absorbţia5.2.3. Emisia

5.3. Fotostabilitatea nanocristalelor 5.4. Biotoxicitatea nanocristalelor 5.5. Măsurători efectuate pe nanocristale CdSe/ZnS (520 nm și 600 nm)

CAPITOL 6. Calculul tehnico-economic al procesului de bioremediere6.1. Calculul economic al analizelor din laborator6.2. Norme de protecţia muncii în laborator

CONCLUZII

BIBLIOGRAFIE

4

Lista figurilor

1.1 Surse de polare marină 121.2 Descrierea celor trei nivele de poluare în cazul transportului naval 141.3 Zonele cu intensităţi maxime de accidente petroliere 154.1 414.2 414.3 414.4 414.5 Microcosmosul 424.6 Tip de microcosmos folosit pentru sisteme cu flux-reflux (Oviatt & all. 1980 ) 444.7 Evoluția în timp a microbiotei la nivelul sedimentelor între martor și proba poluată 464.8 484.9 Calibrarea grilei ocularului: latura pătratului mic este de 10 μm 484.10 Imagine din camp microscopic A-martor; B- proba poluată (colorație AO) 484.11 Numãrul total de celule moarte pentru ambele eşantioane 504.12 Aspecte microscopice A- martor, B- proba poluată (colorație ioduca de propidiu) 50

4.13A Un exemplu de imagini din programul CellC, cu bacterii din microcosm2 unde s-a adãugat colorantul AO

51

4.13B Analiza numãrului total de celule din panoul A folosind software-ul CellC 514.14 The Image J spațiul de calibrare dimensionalã 514.15 Analiza în timp a consumului de fosfat din cele 2 microcosmosuri 524.16 Analiza în timp a consumului de azot din cele 2 microcosmosuri 535.1 Dimensiunea nanocristalelor 555.2 Cele trei procese ale fotoluminiscienței 575.3 Spectru electromagnetic în funcţie de energie 575.4 Spectrul de absorbție 585.5 Spectru de absorbţie al unei soluţii de nanocristale cu defecte 595.6 Spectru de emisie pentru CdSe 59

5.7A.B A-dor 490 nm; B- dor 600 nm 62

5

Lista tabelelor

1.1 Pentru nivelul 1, accidente soldate cu deversãri mai mici de 7 tone 141.2 Pentru nivelul 2, accidente soldate cu deversãri cuprinse între 7 şi 700 tone 141.3 Pentru nivelul 3, accidente soldate cu deversãri de peste 700 tone 141.4 Exemple de accidente navale soldate cu deversări de petrol 151.5 Descrierea efectelor pe termen lung şi scurt a poluării cu hidrocarburi pentru

principalele specii marine18

4.1 Numãrul total de celule 464.2 Numãrul de celule permeabilizate 494.3 LCK 338 524.4 LCK 338 A 524.5 LCK 338 B 524.6 MicroCap C 524.7 LCK 338 D 524.8 Rata de creştere procentuală zilnică calculată în cele douã microcosmosuri 544.9 Rata de creştere procentuală realizată între recoltări în cele douã microcosmosuri 544.10 Rata de creştere între recoltãri şi rata de creştere în 24 de ore pentru eşantioanele M1 şi

rspectiv M254

5.1 Valorile densității celulelor în urma colorării cu dot 490, și 600 nm 62

7

Introducere

Poluarea reprezintă contaminarea mediului înconjurător cu materiale care interferează cu sãnãtatea umană, calitatea vieții sau funcția naturală a ecosistemelor (organismele vii și mediul în care trăiesc).

Privitã istoric, poluarea mediului a apãrut odatã cu omul, dar s-a dezvoltat si s-a diversificat pe mãsura evoluției societãții umane, ajungând astãzi una dintre importantele preocupãri ale specialiştilor din diferite domenii ale ştiinței şÎ tehnicii, ale statelor şÎ guvernelor, ale specialiştilor din diferite domenii ale ştiinței şi tehnicii, ale statelor şi guvernelor, ale întregii populații a Pãmântului. Aceasta, pentru cã primejdia reprezentatã de poluare a crescut şi creşte neîncetat, impunând mãsuri urgente pe plan național şi internațional, în spiritul ideilor pentru combaterea poluãrii.

Etimologic, termenul poluare provine din latinescul polluere = a murdări a pângări, a polua şi s-a folosit iniţial pentru a defini numai rezultatul unei acţiuni umane a cărei consecinţă a fost degradarea propriului mediu de viaţă. Ulterior sensul a fost extins şi asupra unor procese naturale al căror efect este identic. Prin urmare, poaluarea poate fi naturală şi artificială, ultima deţinând cea mai mare pondere.

O primă definiţie a poluării a fost dată la Conferinţa Mondială ONU asupra mediului (1972), definiţie ce consideră poluarea drept „modificarea componentelor naturale sau prezenţa unor componente străine, ca urmare a activităţii omului şi care provoacă prin natura lor, princoncentraţia în care se găsesc şi prin timpul cât acţionează, efecte nocive asupra sănătăţii,crează disconfort sau împietează asupra diferitelor utilizări ale mediului la care acesta putea servi în forma sa anterioară”. Prin această definiţie se recunoaşte oficial faptul că cea mai intensă poluare este consecinţa activităţii antropice.

Scopul lucrãrii este de a puncta detaliile şi a compara performanţele referitoare la proprietãţile microorganismelor implicate în poluarea marinã.

În primul capitol al lucrãrii se disting noțiunile introductive ale conceptului de poluare, precum şi mãsuri de prevenire în diferite cazuri de poluare.

În capitolul al doilea se exemplifica managementul intervenției în cazul poluãrii marine cu hidrocarburi, prin întocmirea unui plan de intervenție şi determinarea echipamentelor şi metodelor utilizate.

În cel de-al treilea capitol se trece în revistã procesele de sedimentare la litoralul Mãrii Negre, descrierea bacteriobentosului marin şi a tehnicilor de supraviețuire ale bacteriilor în mediul natural.

În capitolul patru se descriu procesele de prelevare a probelor şi de colorare cu diferite soluții pentru determinarea unui anumit numãr de celule ( numãr total, celule permeabilizate, celule cu capsulã). De asemenea se realizeazã mãsurarea cantitãții de azot şi fosfor, densitãții celulelor şi creşterea procentualã.

În capitolul cinci au fost analiate proprietãțile nanocristalelor din diferite puncte de vedere, şi de asemenea au fost realizate mãsurãtori asupra nanocristalelor.

În ultimul capitol este compus un calcul economic necesar pentru analizele de laborator, şi un set de norme de protecția muncii ce trebuiesc respectate când se lucreazã în laborator.

9

CAPITOL I. Descrierea conceptului de poluare

1.1. Impactul poluării marine la nivel național și internațional

La modul general, poluarea poate fi definită ca “totalitatea proceselor prin care se introduc în mediu, direct sau indirect, materie sau energie cu efecte dăunatoare sau nocive care alterează ecosistemele, diminuează resursele biologice şi pun în pericol sănătatea omulu. În sensul definit mai sus, prin poluant se înţelege un factor (materie sau energie) care introdus în mediu într - o cantitate care depăşeşte o limită care poate fi suportată de una sau mai multe specii de vieţuitoare, sau de către om, împiedică dezvoltarea normală a acestora. Poluarea mediului înconjurãtor se produce de regulã pe douã cãi:

Artificialã care se datoreazã activitãților umane; Naturalã care survine în urma activitãții vulcanice, erupțiilor de gaze, etc.Activitatea umană produce poluare, indiferent de domeniul în care se desfăşoară. În perioada

anterioară revoluţiei industriale, aproape toate produsele care produceau poluare erau de natură organică şi relativ reduse cantitativ, deci puteau fi uşor transformate prin procesul de biodegradare. Numeroasele procese industriale actuale, tehnicile de cultură agricolă, zootehnia, cercetarea stiinţifică, aglomerările urbane, toate sunt surse de poluare.

Apa este unul din factorii de mediu cel mai afectat d epoluare. Calitatea apei are un rol primordial pentru existența şi dezvoltarea umanã. Criteriile de calitae ale apei se încadreazã în trei categorii de parametrii: Parametrii de bazã: temperatura, pH, oxigenul dizolvat, conductivitate şi conținut de colibacili; Parametrii de poluare: conținut ridicat de Ca, Mg, uleiuri minerale şi compuşi organo-halogenați Indicatori opționali:consum biochimic de oxigen, detergenți ionici, metale grele, arsenic, clor,

Na+, cianuri, uleiuri totale, streptococi şi carbon organic total; Toți aceşi parametri trebuie supravegheați atât pentru apele de suprafațã, subterane şi tratate.

Poluarea apelor marineÎn ultimul deceniu, efectul singular şi global al poluanților chimici şi petrochimici a devenit

o problemã majorã pentru mãri şi oceane. Poluarea marinã (mãri şi oceane) are un impact de mediu în special asupra utilizãrii zonelor litorale şi a resurselor biologice din zonele costiere şi a celor adiacente țãrmurilor mãrilor şi oceanelor.

Poluarea marinã afecteazã pescuitul, creşterea algelor marine, transporturile marine, exploatãrile mineralelor şi a utilizãrilor actuale şi de perspectivã, precum şi progresele tehnologice în acest domeniu.

Surse de poluare marinã (figura 1.1): Platformele offshore de foraj şi extracție; Transport naval de mãrfuri şi persoane; Coliziuni, eşuãri, incendii, alte accidente; Instalații utilizate în operațiunile de încãrcare/descãrcare marfã; Surse provenite de la țãrm: scurgerile pluviale şi deversãrile de ape uzate, provenite din:

- aglomerãrile urbane,- activitãțile desfãşurate pe platformele de producție ale unitãților

deprelucrare/rafinare ale produselor petroliere,- activitãțile desfaşurate în porturi, şantiere navale, etc.

Surse provenite din atmosferã; Sursele provenite din cauze naturale se referã la erupțiile naturale de gaze sau hidrocarburi;

11

Surse de poluare

TransportDeversari de la tarmsurse naturalePlarforme offshoreDin atmosfera

Figura 1.1. Surse de polare marină

Cantitatea medie anualã de hidrocarburi descãrcatã în mediul acvatic este de aproximativ 2.400.000 Mt din care : Descãrcãri de la țãrm (50% - 1 175 000 tone):

- scurgeri pluviale, deversãri ape uzate,- procesare hidrocarburi: rafinare, prelucrare,- activitãți portuare: şantiere navale.

Transport naval (24% - 564 000 tone):- încãrcare descãrcare,- bunkeraj,- coliziuni,- esuãri,- spãrturi în coca navei, incendii.

Atmosfera (13% - 305 000 tone):- gaze, fum, eliminate în atmosfera în urma arderilor hidrocarburilor.

Naturale ( 11% - 258 000 tone):- erupții naturale de gaze/hidrocarburi în mediul acvatic.

Platformele offshore ( 2% - 47 000 tone):- accidente în operațiunile de foraj, extracție, transfer marfã.

Dacã la poluarea aerului imaginea-simbol este oferitã de arborii perforați de ploile acide, la poluarea apei expresia caracteristicã ar putea fi considerate-mareele negre, adicã poluarea, practic continuã, cu petrol a mãrilor şi oceanelor lumii, având efecte dezastruoase asupra florei şi faunei marine.

În acord cu multitudinea de beneficii pe care o aduce dezvoltarea industriei petrolului, trebuie avut în vedere şi amenințãrile emanațiilor apãrute ca urmare a exctracției şi asocierea cu impactul negativ pe care îl are asupra ecosistemului. Activitãțile miniere din zonele de apã din apropierea coastei, precum şi extracțiile de petrol sunt principalele surse de poluare cu hidrocarburi, datorate, în principal, fisurilor produse în țevile de forare, infiltrarea acestora în soluri şi deversarea lor în apã..

Poluarea cu petrol este una dintre cele mai frecvente ipuri de poluare marinã şi cu efectele cele mai nocive. Fiind purtate de curenții marini, scurgerile petroliere, afecteazã apele, zonele de locuit din apropierea coastei şi de asemenea şi alte regiuni care nu sunt producãtoare de petrol.

Tipuri de impact al poluãrii marine: Economic:

12

Impactul economic se referã la efectele negative induse activitãților economice, în cazul unei poluãri accidentale sau cronice. Tipuri de activitãți intreprinse ce vor fi afectate în caz de poluare marinã:

- Industriale- Turistice- Pescuit(industrial,sportiv,acvaculturã)- Transport naval- Extracție/Foraj

Ecologic: efectele induse depind de urmãtorii factori:- Volumul deversãrii şi caracteristicile fizico-chimice ale poluantului;- Condițiile hidro-meteo;- Anotimpul în care se produce dezastrul;- Prezența structurilor hidrotehnice de apãrare, a resurselor de hranã, prezența zonelor

populate aflate în calea deplasãrii poluantului;- Topografia şi geomorfologia țãrmului şi a fundului apei- Relația poluant-sediment din punct de vedere al gradului de amestecare al acestora;În funcție de prezența acestor factori, efectele ecologice ce reultã în urma unei poluãri

includ: Schimbãri fizice şi chimice în cadrul ecosistemului; Schimbãri în ceea ce priveşte dezvoltarea, psihologia şi comportamentul individual ale

organismelor şi speciilor; Creşterea mortalitãții, distrugerea sau modificarea unui întreg ecosistem datoritã efecului

combinat toxicitate-sufocare-înãbuşire;Impactul poate fi introdus fie prin acțiunea directã sau indirectã a poluantului, fie prin

activitatea de depoluare. Social:Poluarea zonelor populate poate avea efecte negative de imagine asupra comunitãții respective

sau efecte negative asupra organismului uman, asupra stãrii de sãnãtate a populației, putând determina chiar evacuarea zonei, în cazuri extreme.

Politic:Se discutã despre impact politic în cazul în care poluarea depãşeşte granițe sau frontiere şi

produce pagube ce pot implica reclamații sau despãgubiri între cele douã sau mai multe state implicate.

Impactul politic este mai accentuat în cazul în care țãrile respective nu sunt membre ale organizațiilor şi convențiilor internaționale care sã le acorde asistențã în caz de poluare.

Studierea tipurilor de impact ce se pot produce într-o zonã poluatã este necesarã pentru stabilirea gradului de vulnerabilitate al zonei.

1.2. Clasificarea nivelelor de poluare

Au fost stabilite trei nivele de gravitate de poluare din punct de vedere al cantitãții de hidrocarburi deversate în timpul unei poluãri:

Nivelul 1 (poluare minorã): mai micã de 7 tone; Nivelul 2 (poluare medie): între 7 şi 700 tone; Nivelul 3 (poluare majorã): peste 700 tone;

Cauzele poluãrii datorate transportului naval provin, cantitativ, din acțiuni de caurãțire a tancurilor, încãrcare sau descãrcare, accidente ale navelor petroliere, deversãri de santinã, ş.a.m.d. Cantitãțile de petrol deversate accidental de o singurã navã pot depãşi uneori celelalte surse de poluare din anul respectiv.

13

O analizã pe cele trei nivele de poluare în funcție de sursele care le-au cauzat este necesarã în vederea ierarhizãrii zonelor cu risc de poluare. Diferite cauze de poluare produc un nivel diferit de poluare, dupã cum se poate observa în figura 1.2:

Fig.1.2. Descrierea celor trei nivele de poluare în cazul transportului naval

Cauze principale Procent (%)Încãrcare/descãrcare 77.5Bunkeraj 14.4Eşuare 5Coliziune 3.1

Tabel 1.1. Pentru nivelul 1, accidente soldate cu deversãri mai mici de 7 tone

Cauze principale Procentaj (%)Încãrcare/descãrcare 43.5Coliziune 26.6Eşuare 26Bunkeraj 3.9

Tabel 1.2. Pentru nivelul 2, accidente soldate cu deversãri cuprinse între 7 şi 700 tone

Cauze principale Procentaj (%)Eşuare 50.6Coliziune 40.6Încãrcare/Descãrcare 8.8

Tabel 1.3.. Pentru nivelul 3, accidente soldate cu deversãri de peste 700 tone

În ciuda faptului cã sunt mai rare, din punct de vedere al contextului general, atunci când se produc, poluãrile majore (de peste 700 tone) pot afecta grav ecosistemul, economia, starea de

14

sãnãtate a populației deoarece cantitatea de petrol deversatã depãşeşte cantitatea provenitã din toate celelalte surse de poluare în anii respectivi.

Numele navei Anul Locatia Petrol deversatAtlantic Empress

1979 Tobago 287.000

ABT Summer 1991 La distanta de 700 Mm de Angola 260.000Castillo de Bellver

1983 Golful Saldanha, Sud Africa 252.000

Amoco Caduz 1978 Bretania, Franta 223.000Haven 1991 Genoa, Italia 144.000Odyssey 1988 La distanta 700 Mm de Noua Scotie,

Canada132.000

Torrey Canyon 1967 Insulele Scilly , Anglia 119.000Urquiola 1976 La Coruna, Spania 100.000Hawaiian Patriot 1977 La distanta de 300 Mm de Honolulu 95.000Independența 1979 Bosphor, Turcia 95.000Jakob Maersk 1975 Oporto, Portugalia 88.000Braer 1993 Shetland Islanda, Anglia 85.000Khark 5 1989 La distanta de 120 Mm la Atlantic

coasta Morocco80.000

Aegean Sea 1992 La Coruna, Spania 74.000Sea Empress 1996 Milford Haven, Anglia 72.000Katina P. 1992 Maputo, Mozambic 72.000Assimi 1983 55 Mm distanta de Muscat, Oman 53.000Metula 1974 Stramtoarea Magellan, Chile 50.000Wafra 1971 Cap Agulhas, Sud Africa 40.000Exxon Valdez 1989 Prince William Sound, Alaska, USA 37.000

Tabel 1.4. Exemple de accidente navale soldate cu deversări de petrol

În cazul zonelor cu trafic intens, probabilitatea producerii accidentelor majore este deosebit de ridicatã (ex., Coasta de Est a Atlanticului de Nord, Sudul Africii) - figura 1.3.

15

Fig.1.3. Zonele cu intensităţi maxime de accidente petroliere

Factorii care contribuie la creşterea numãrului de accidente însoțite de poluãri majore sunt: Creşterea cantitãții de petrol transportat, Caracteristicile locale defectuase de navigație: densitatea traficului, condițiile hidro-meteo,

adâncimea apei, vizibilitatea, comunicațiile radio defectuase, Organizarea defectuasã a operațiunilor de: intrare /ieşire din port, încãrcare-descãrcare marfã,

bunkeraj, Lipsa sistemelor de avertizare.

1.3. Măsuri adoptate pentru prevenirea poluării marine

1.3.1. Poluãrile minore onshorePoluarea de la țãrm poate fi prevenitã sau controlatã prin adoptarea unor mãsuri :

Amplasarea în zonele cu risc a unor baze de interventie, Sisteme de siguranta în exploatare, intretinere, inspectii periodice , etc, Construirea şi monitorizarea statiilor de epurare, Adoptarea unui adru legislativ adoptat situațiilor din zonã Instruirea şi specializarea personalului de intervenție

Existã o serie de mãsuri de prevenrire, în funcție de situația în caz:

1.3.1.1. Mãsuri de prevenire în cazul exploatãrii conductelor de transfer de țiței1Echiparea conductelor cu robinete automate de siguranțã care acționeazã în caz de depãşire a

presiunilor maxime prescrise sau de cãderi de presiune posibile în caz de avarie;2Echiparea conductelor cu un sistem de tip S.C.A.D.A. (sistem centralizat de achiziții de date şi

avertizare) care constã în montarea unor debimetre care pot sesiza apariția avariilor în sistem. Principiul de funcționare se bazeazã pe realizarea bilanțului masic sau de presiune.

3Echiparea cu robineți de secționare pentru zonele cu nivel hidrostatic ridicat.4Existența în sistem a stațiilor de lansare-primire, curãțare de parafinã5Inspecția periodicã prin godevilare cu godevile pentru întreținere6Testarea periodicã a conductei la presiune dupã golirea ei prealabilã de hidrocarburi şi umplerea cu

apã.7Supravegherea permanentã cu echipe de liniori a traseului conductelor terestre

16

8Supravegherea permanentã cu mijloace aeriene şi navale a zonei de trecere a conductelor subacvatice

9Pregãtirea şi antrenarea periodicã a personalului de supraveghere şi de intervenție

1.3.1.2. Mãsuri de prevenire în cazul bunkerajului şi operațiunilor de încãrcare-descãrcare a tancurilor petroliere

1Inspectarea tuturor robinetelor care nu au legãturã sau nu sunt utilizate în operațiunile de bunkeraj şi încãrcare-descãrcare, verificarea şi poziționarea acestora pe poziția închis;

2Inspectarea şi blocarea scurgerilor de punte;3Verificarea tãvilor de recuperare aflate sub robineții de cuplare;4Protejarea tancului petrolier aflat în operațiuni încãrcare-descãrcare prin amplasarea unui baraj

flotant antipetrol în jurul acestuia;5Capetele barajului trebuie sã fie cuplate de cheu prin dispozitive speciale etanşe;6Pregãtirea şi utilizarea absorbanților în orice situație în care apar bãlți, pete de petrol pe punte sau în

zona baraj-cheu;7Supravegherea permanentã a operațiunilor şi oprirea lor în caz de pericol;8Pregãtirea şi antrenarea periodicã a personalului implicat în operațiunile curente de supraveghere şi

intervenție;

1.3.1.3. Mãsuri de prevenire în cazul terminalelor petroliereÎn cazul terminalelor petroliere, accidentele de poluare pot apãrea din cauza avarierii

echipamentelor sau înstalațiilor, a greşelilor de proiectare sau din cauza unei erori umane în exploatare.

Mãsurile de prevenire ce trebuiesc asigurate sunt:1. Inspectarea periodicã a instalațiilor, înlocuirea celor defecte şi modernizarea celor depãşite;2. Încadrarea în parametrii de funcționare conform cerințelor specificate în documentația de

proiectare a instalațiilor şi echipamentelor;3. Cunoaşterea şi supravegherea permanentã de cãtre personalul calificat, a instalațiilor şi

echipamentelor din dotare;4. Formarea şi antrenarea periodicã a personalului de exploatare şi intervenție;5. Supravegherea permanentã a zonei, operațiunile navã-țãrm şi invers implicând un risc de poluare

mãrit;6. Protejarea permanentã a zonei cu baraje antipetrol;7. Pregãtirea şi utilizarea rapidã a substanțelor absorbante;

1.3.2. Poluãrile majore offshorePoluãrile majore provenite din transportul naval nu pot fi controlate (ca cele minore) dar pot fi

prevenite prin aplicarea unor masuri de prevenire: Adoptarea unui cadru legislativ şi aderarea la convenții inernaționale şi organisme cu preocupãri

în domeniul prevenirii şÎ combaterii poluãrii cu hidrocarburi(IMO,OPRC,IOPC Fund); Respectarea normelor speciale de construcție a navelor, utilizarea tancurilor de transport marfã

prevãzute cu dublu fund şi dublu bord, pereți despãrțitori etanşi între magazii, utilizarea în magaziile de marfã a instalațiilor de gaz inert, dotarea cu aparaturã modernã de navigație şi comunicare;

Dotãri corespunzãtoare cu echipamente specializate pentru depoluare ; Instruirea şi atestarea personalului de coordonare şi intervenție;

1.4. Efectele ecologice rezultate în urma poluării

17

Din punct de vedere biologic, efectele poluãrii marine cu hidrocarbuti se caracterizeazã prin manifestãri complexe pe termene diferite: Pe termen scurt (sãptãmâni); Pe termen mediu (luni, sezoane); Pe termen lung (ani);

Poluantul care pluteşte poate contamina pãsãrile şi mamiferele care se deplaseazã pe suprafața apei. În zona offshore, suprafețele poluare pot fi evitate; în schimb în apropierea țãrmului acestea sunt adevãrate capcane în care organismele marine sunt prinse şi infestate. Cantitatea şi gradul de persistențã a poluantului care rãmâne pe sol depinde în mare mãsurã de geomorfologia şi de caracteristicile sedimentelor zonei de țãrm poluate.

1.4.1. Zona țãrmurilor stâncoase şi falezelorDatoritã efectului de abraziune produs de acțiunea valurilor care se sparg, pelicula de

poluant se scindeazã în picãturi din ce în ce mai mici, fiind antrenatã de apã. Din cauza acestui fenomen, poluarea țãrmului este minimã, afectând pe termen scurt organismele din zonã. În unele cazuri, poluantul se depune pe stânci sub formã de benzi la nivelul superior al țãrmului la care ajung cele mai înale valuri. Având în vedere cã cele mai frecvente forme de viațã sunt coloniile de pãsãri aflate în zona superioarã a țãrmului, şi acumulãrile de epibiozã de la baza acestuia, impactul unei poluãri este redus. Recolonizarea cu plante şi animale a zonei se produce rapid odatã cu antrenarea poluantului în masa apei şi îndepãrtarea acestuia prin efectul curenților marini;1.4.2. Zona plajelor nisipoase

Poluantul este împins de valuri în interiorul țãrmului, rãmânând pe suprafața acestuia, având tendința de a se amesteca cu nisipul sau de a se infiltra în substrat. Poluantul se depune sub formă de benzi paralele cu malul sau poate acoperi întreaga plajă. Cu cât granulația stratului de sediment este mai mare, cu atât poluantul se infiltrează mai rapid și într-o cantitate mai mare în substrat. Adâncimea maximă la care poluantul poate penetra datorită aportului de nisip este de aproximativ 30 cm (pentru nisip fin) și de aproximativ 60 cm (pentru plaje cu nisip grosier). În aceste condiții poluarea este masivă, persistența afectând grav ecosistemul. Acest tip de țărm, în funcție de expunerea la valuri, permite dezvoltarea algelor, moluștelor, scoicilor, constituind zone de reproducere a păsărilor și peștilor;

1.4.3. Zona de țãrm mlãştinoase cu pante linePoluantul este împins de valuri adânc în zonã producând poluarea unor suprafețe întinse.

Din cauza umiditãții ridicate a solului, poluantul „pluteşte pe țãrm”, migrând în diverse direcții, în funcție de panta acestuia, şi nu se infiltreazã în substrat. Fauna şi flora acestor zone este bogatã şi variatã, fiind în acelaşi timp foarte expusã în cazul unei poluãri de orice tip. Intervenția în astfel de zone este foarte dificilã, existând pericolul amplificãrii efectelor negative induse ecosistemului.

Organismele care supraviețuiesc impactului letal cauzat de evaporarea din prima fazã a poluãrii, acumuleazã în continuare componente toxice (atât din apã cât şi din sedimente şi hrana contaminatã), care se depoziteazã în țesuturi. Concentrațiile acumulate pot avea valori ridicate cu impact negativ asupra dezvoltãrii organismelor afectate. În tabelul 1.5 sunt menţionate efectele pe termen scurt şi lung la o serie de specii:

Sensibilitate Efecte imediate Efecte pe termen lungAlge Slabã Degradarea țesuturilor

în zona de contactRefacere lentã în timp

Moluşte Puternicã Asfixie Acumulare în organismeForme fixate pe roci

Puternicã Asfixie Acumulare în organismele filtratoare în funcție de timpul de contact

18

Peşti Slabã pentru adulți, puternicã pentru larve şi juvenili

La contact direct asfixie prin contaminarea branhiilor

Pãrãsirea zonei poluate; influențã deosebit de grava pentru peştii bentonici prin contaminarea sedimentelor

Mamifere Variabilã, puternicã pentru cele acvatice

Contaminarea externã, indigestie, hipotermie, intoxicare

Decimarea populațiilor, dispariția surselor de hranã

Pãsãri Variabilã, puternicã pentru plonjori

Contaminarea penajului, inroxicare prin indigestie, distrugerea ouãlor

Decimarea populației, pãrãsirea zonei

Tabel 1.5.Descrierea efectelor pe termen lung şi scurt a poluării cu hidrocarburi pentru principalele specii marine

Existența zonelor de reproducere, zonelor protejate (diferite rezervații), a coloniilor de pãsãri, a bancurilor de peşti se constituie în factori ecologici de risc, care sunt cuantificați din punct de vedere valoric pentru fiecare zonã în parte, urmând a fi luați în calcul împreunã cu ceilalți factori (economici, sociali, politici, tipul țãrmului) în vederea stabilirii gradului de vulnerabilitate.

Refacerea ecologicã a unei zone poluate nu depinde numai de cantitatea ci şi de compoziția componentelor toxice care persistã dupã deversare. Repopularea necesitã desfãşurarea unor etape. Rata de refacere depinde de dinamica populațiilor şi de interacțiunea între specii.

19

CAPITOL II. CAPITOL 2. Managementul intervenţiei în cazul poluării marine cu hidrocarburi

Pe zi ce trece simțim tot mai puternic poluarea. Aerul irespirabil, apele murdare, pământul nefertil și lista animalelor pe cale de dispariție, care se mărește simțitor în fiecare an, au efecte devastatoare asupra Pământului și, implicit, a omului. Iar problema majoră se resimte în singurele surse de alimentare cu apă: oceanele. Oceanele ocupă peste 70% din suprafața Pământului, adăpostind un număr mare și o largă varietate de plante și specii de animale marine. De asemenea, ele alimentează cu apă pătabilă întreaga planetă. În concluzie, oceanele sunt cea mai mare sursă de supraviețuire a tuturor viețuitoarelor, inclusiv a omului.

Cu toate acestea, de-a lungul anilor, activitățile umane excedentare au afectat negativ viața marină, prin poluare. Cele mai grave tipuri de poluare au fost înregistrate în urma acțiunilor precum: scurgeri de petrol, deversările deșeurilor industriale în apele oceanelor, a gunoaielor menajere și a materialelor toxice.

Scopul planului este de a stabili un mecanism de asistenta reciproca, in cadrul caruia autoritatile nationale competente ale partilor contractante vor coopera cu scopul de a coordona si integra interventia lor la incidentele privind poluarea marina, care afecteaza sau poate afecta zonele de coasta, marea teritoriala si zonele economice exclusive (denumite in continuare zone de responsabilitate) ale partilor contractante sau la incidente care depasesc capacitatea disponibila de interventie a fiecareia dintre partile contractante.

Obiectivul general al planului este organizarea unei interventii prompte si rapide in cazul deversarilor majore de produse petroliere care afecteaza sau care pot afecta zona de responsabilitate a unia sau mai multor parti contractante si de a facilita cooperarea in domeniul pregatirii si interventiei in cazul poluarii cu produse petroliere.

In acest scop, au fost definite urmatoarele obiective specifice:a. stabilirea extinderii cooperarii pentru implementarea planului intre autoritatile nationale

competente, la nivel operational;b. împartirea responsabilitatilor si anticiparea transferului de responsabilitate de la o parte

contractanta la alta;c. stabilirea principiilor de comanda si cooperare si definirea structurilor corespunzătoare;d. adoptarea intelegerilor privind utilizarea navelor si a aparatelor de zbor din dotarea uneia dintre

partile contractante in zona de responsabilitate a altor parti;e. specificarea tipului de asistenta care ar putea fi furnizata si conditiile in care aceasta este

acordata;f. stabilirea in prealabil a conditiilor financiare si a modalitatilor administrative asociate actiunilor

de cooperare in situatii de urgenta.

2.1. Descrierea planului de intervenţie în caz de poluare marină

Fiecare caz de poluare este tratat in mod diferit in functie de imprejurarile in care se produce. Existã totusi o anumitã grupare a metodelor si mijloacelor de interventie in functie de zona de actiune. Aceastã grupare/clasificare reflectã nu numai diferentierile tehnologice corespunzãtoare conditiilor specifice din fiecare zonã, dar si limitele operationale aferente.

Existã astfel trei mari categorii de interventii:- în zona de larg (offshore);- în zona de radã si port ;- în zona de tarm (onshore).

21

http://www.nauticamagazine.ro/info/lacuri/articol-efectele-poluarii-apelor

Interventii în zona de larg

DELIMITAREDesi nu existã o delimitare strictã a termenului, se acceptã unanim de cãtre specialisti drept

zonã de larg sau de mare deschisã, zona de peste 5 Mm depãrtare de tãrm, situatã în afara golfurilor sau a intrândurilor adãpostite. Zona de larg cuprinde limita de larg a apelor teritoriale (12 Mm) si zona contigua (12Mm) a statului respectiv.

ACTIVITATIIn afara navigatiei libere, zona de larg constituie pentru multe alte state locul unei intense

activitãti economice legate de prospectarea si exploatarea petrolului. Acestea sunt de altfel si principalele surse de poluare cu hidrocarburi. Intr-adevãr, activitatea de foraj marin poate genera atât accidente importante cum ar fi eruptiile scãpate de sub control, însotite sau nu de incendierea peliculei de petrol, cât si deversãri mai mici produse în timpul unor probe de productivitate la sonde, în urma unor manevre gresite de transfer combustibil de la navele de aprovizionare la platforme sau a evacuãrii santinei, a spãlãrii puntii murdare etc.

In cazul platformelor de productie petrolierã, desi existã un întreg lant tehnologic al sistemului de sigurantã si de prevenire a poluãrii, chiar în situatii de limitã, practica a demonstrat cã si acesta este depãsit uneori de adversitatea conditiilor dure de pe mare, de greseala omeneascã sau de reaua intentie (sabotaje, distrugeri provocate de rãzboi etc.). Sã nu uitãm bogata retea de conducte petroliere submarine care se pot sparge din diferite cauze cum ar fi: coroziune naturalã; avarii tehnologice (depãsiri ale presiunii maxime admise); montaje defectuoase, nerezistente la conditiile de mediu; manevre gresite de fixare a platformelor mobile etc. Sistemele de transfer titei, indiferent de tip, ele sunt supuse uneori acelorasi erori tehnice sau umane, adesea accentuate de duritatea factorilor de mediu.

CARACTERISTICIZona de larg este caracterizatã, în general, prin:

- adâncime relativ mare de apã, comparativ cu celelalte zone;- valuri înalte si vânturi puternice, acoperind, practic toatã scara Beaufort;- curenti puternici de suprafatã

Toate acestea necesitand: echipamente /metode de interventie, adaptate conditiilor dure de lucru (echipamente cu caracteristici tehnico-functionale ridicate ). Totodatã, depãrtarea mare fata de mal, face ca fiecare punct din zonã sã se gãseascã izolat de orice bazã de aprovizionare si sustinere logisticã, mijloacele de interventie trebuind sã aibã în consecintã o autonomie ridicatã si o viteza mare de deplasare.

O circumstantã favorizantã a interventiilor de depoluare în zona de larg o constituie gravitatea redusã a impactului ecologic. De fapt, cu cât depãrtarea de tãrm este mai mare si conditiile hidro-meteo sunt mai vitrege, probabilitatea ca pelicula sã scape actiunii degradãrii naturale si sã ajungã la mal (acolo unde impactul ecologic este maxim) este mai micã

O altã caracteristicã a zonei de larg o constituie variabilitatea în timp a conditiilor de mediuAceasta face ca orice interventie în larg sã fie pregãtitã pentru cele mai nefavorabile situatii,

cu atât mai mult cu cât (prin amploarea lor) accidentele de poluare în aceastã zonã reclamã multe zile de lucru.T oate cele de mai sus influenteazã profund atât metodele, dar mai ales mijloacele tehnice de interventie.

METODE DE INTERVENTIECele mai recomandate metode de interventie utilizate in aceasta zona sunt: degradarea

naturala, dispersarea, arderea controlatã si recuperarea mecanicã.

22

Degradarea naturala se aplica in cazul in care conditiile hidro-meteo sunt nefavorabile sau poluarea se deplaseaza spre larg.

Dispersia - datã fiind distanta mare fatã de tãrm, pentru a câstiga timpul pierdut cu alarmarea, cercetarea zonei si pregãtirea interventiei, plus drumul lung al fortelor de interventie, se recomandã folosirea mijloacelor aeropurtate pentru împrãstierea dispersantilor. Avantajele acestora sunt nete:• rapiditate mare de interventie;• razã mare de actiune;• capacitate sporitã de lucru chiar si în conditii hidro-meteo grele pentru aeronave;• productivitate si eficientã foarte bunã în special în cazul poluãrilor de mare amploare ;• protejarea tarmului, pelicula dispersata in masa apei nu se va depune pe litoral.

Arderea controlatã ( avand in vedere distanta mare pana a tarm ) se efectueazã prin traulare de suprafatã în sistem U, cu ajutorul unor baraje antifoc de lungime (min.300 m) si capabile sã reziste conditiilor dure de vânt si val (starea marii <3° B).

Un caz aparte îl constituie situatiile când pelicula se aprinde spontan si arde necontrolat, îngreunând operatiunile de salvare (accidentele platformelor IXTOC-1 din Golful Mexic- 1979,PIPER ALPHA din Marea Nordului – 1987).

In astfel de cazuri stingerea incendiului este foarte dificilã si periculoasã, având prioritate fatã de problemele de combatere a poluãrii, care se vor rezolva abia mai târziu.

Interventii în zona de radã si port

DELIMITAREZona de radã si port este cuprinsã în marea teritorialã. Ea constituie un punct de convergentã

al traficului naval, cuprinzand trasee de navigatie, ancoraje, porturi. Din nefericire, cu toate mãsurile de dirijare si supraveghere a traficului naval, nu o datã s-au produs grave accidente urmate de poluãri cu hidrocarburi.

ACTIVITATICa principale activitati desfasurate in aceasta z ona enumeram: activitati urbane, portuare,

transport naval, santiere navale, oil terminale etc.

SURSE DE POLUARECa principale surse de poluare cronicã în zona de radã si port pot fi întâlnite:

• activitatea de navigatie (deversãri de santine, spãlãri de tancuri, aruncarea rezidurilor de hidrocarburi etc.);• evacuãrile urbane neepurate, mai ales cele provenind din zonele industriale prelucrãtoare de hidrocarburi (rafinarii,oil terminale etc.);• scurgerile pluviale provenind de pe platforma portuarã (santiere navale, intreprinderi de exploatare si transport portuar, dane murdare cu hidrocarburi etc.).

Ca surse de poluare accidentalã, cele mai frecvente sunt urmãtoarele:- accidentele navale (esuãri, coliziuni, explozii, scufundãri de nave etc.);- erori grave de operare la terminalele petroliere;- situatii speciale (sabotaje, bombardamente etc.).

CARACTERISTICIIn privinta conditiilor geografice si de mediu, zona de radã si port nu este asa de durã

precum cea de larg. Intrucât porturile sunt amplasate în locuri adãpostite natural, iar prin constructiile hidrotehnice aferente (diguri, dane etc.) se asigurã un adãpost suplimentar pentru nave, caracteristicile hidrologice sunt favorabile desfãsurãrii permanente a activitãtilor indiferent de sezon. Lipsesc curentii, valurile sunt relativ mici, chiar pe vânt puternic, iar adâncimea apei este

23

suficient de mare ca sã permitã interventia oricãrui mijloc plutitor. Accesul se poate realiza usor si rapid, atât de pe apã cât si de pe uscat, în orice zonã. Totodatã, datoritã configuratiei danelor, operatiunile de limitare a zonei poluate se pot efectua foarte rapid, usurându-se operatiunile ulterioare de recuperare si de curãtire. In schimb, prezenta navelor amarate la cheu, uneori în danã dublã sau chiar triplã, îngreuneazã considerabil procesul si manevrabilitatea mijloacelor de recuperare în toate zonele portului. Mai mult, o peliculã plutitoare care se rãspândeste printre nave, creeazã un pericol potential de incendiu, deosebit de grav pentru securitatea navelor respective 4si a portului în ansamblu. Ca sã nu mai vorbim de emanatiile de vapori ale fractiunilor volatile din titei care, purtate de vânt cãtre aglomeratiile urbane adiacente portului, pot agrava impactul social al accidentului.

Din punct de vedere al impactului in zona se pot face urmatoarele aprecieri:- impactul ecologic este de nivel mediu datorita existentei reduse a bancurilor de pesti, numarului de pasari, alge, epibioza;- impactul economic este de nivel major datorita incarcarii deosebite d.p.v. al activitatilor economice din zona;- impactul social este de nivel major datorat existentei aglomerarilor urbane.

METODE DE INTERVENTIEParticularitãtile zonei de radã si port determinã metodele si mijloacele de interventie

specifice. Ca metode, arderea controlatã este evident, prohibitã, lãsând locul recuperãrii mecanice si dispersãrii. Pentru constructiile hidrotehnice, instalatiile portuare si navele murdãrite de hidrocarburi se aplicã metode specifice interventiilor în zona de tãrm (spãlare, curãtire mecanicã cu dispersanti, cu substante absorbante sau cu substante biodegradabile).

Interventii în zona tãrmului

DELIMITAREZona de tarm cuprinde portiunea de uscat si apa, adiacenta liniei de baza (stabilita conform

legislatiei in vigoare ca fiind linia celui mai mare reflux de-a lungul tarmului). O delimitare stricta pe mare (d.p.v. al responsabilitatilor in cazul unei interventii) nu a fost inca stabilita.

ACTIVITATI In aceasta zona omul desfãsoarã o serie de activitãti economice: pescuit, turism, acvaculturã,

exploatare de resurse minerale, la care se adaugã zonele locuite, de la micile sate de pescari la marile aglomerãri urbane din jurul porturilor importante.

Consecintele unei poluãri cu hidrocarburi sunt maxime pentru aceastã zonã, eforturile de prevenire si combatere fiind concentrate in vederea protejarii tãrmului.

oluarea cronicã are un impact slab cu tãrmul; în schimb poluarea accidentalã creeazã mari probleme.

SURSE DE POLUARECa surse principale de poluare, cronica pot fi: evacuarile urbane, pluviale etc. Ca surse principale de poluare accidentala pot fi: accidentele navale, esuari, etc. Sunt consemnate: esuãrile unor tancuri petroliere si situatiile în care, în ciuda tuturor eforturilor, pelicula din larg ajunge la mal.

CARACTERISTICITipul tarmuluiIn functie de geomorfologia litoralului, din punctul nostru de vedere se întâlnesc patru grupe distincte de tãrmuri:- cu plaje nisipoase;

24

- cu faleze stâncoase;- cu zone mlãstinoase ( de tip deltaic sau de tip intermareic);- lacuri litorale.

In functie de adversitatea conditiilor hidro-meteo se intalnesc tarmuri:- expuse – actiuniii valurilor- adapostite – golfuri, estuare, acolo unde datorita conformatiei tarmului marea este calma actiunea valurilor fiind foarte slaba.

Toate acestea influenteaza alegerea tipului interventiei si nivelul de degradare a poluantului. Dupã cum se vede, aceastã clasificare nu poate acoperi în întregime diversitatea situatiilor care pot exista faptic, însã ea încearcã sã grupeze particularitãtile specifice de interventie.

Printre caracteristicile lor comune acestor zone, putem aminti:- Adâncimea micã a apei, împiedicând accesul dinspre mare a multor tipuri de utilaje plutitoare;- Valuri deferlante, îngreunând pânã la nefunctionare utilizarea barajelor flotante si a recuperatoarele mecanice;- Prezenta vegetatiei acvatice, a stâncilor submarine, a gheturilor plutitoare, dupã caz, creind probleme de dispunere, manevrare si functionare a dispozitivelor plutitoare;- Accesul adesea dificil de pe tãrm pentru utilajele terestre, la care se adaugã uneori si depãrtarea fatã de centrele urbanistice sau de cãile rutiere, producând dificultãti de transport în asigurarea interventiei.

O alta particularitate a zonei o reprezinta gradul de incarcare care poate fi ridicat din punct de vedere: al biodiversitatii, economic, social, etc.Din punct de vedere al biodiversitatii, zona tãrmului prezintã o serie de caracteristici speciale, care o fac deosebit de sensibilã la orice agresiune externã.

Astfel, aici se întâlneste cea mai mare diversitate si densitate de forme de viatã de pe toatã întinderea mãrii. Aici este locul predilect de hrãnire si de reproducere pentru numeroase specii de vietuitoare marine, atât acvatice, cât si terestre.

Acolo unde existã obiective economice speciale, acestea trebuie protejate cu orice pret: ferme de mariculturã, captãri de apã, uzine de desalinizare, santiere navale, oil terminale, etc. Din punct de vedere al impactului in zona se pot face urmatoarele aprecieri:- impactul ecologic - major - bancuri de pesti, mamifere, pasari, alge, epibioza- impactul economic - major - activitati economice- impactul social - major - asezari urbane

METODE DE INTERVENTIEIn functie de tipul tãrmului, si de elementele sale specifice locale, metodele si mijloacele de

interventie vor trebui sã protejeze zonele senzitive si sa limiteze pe cât posibil la o zonã minimã dezastrul.

Ca metode de interventie utilizate in zona tarmului sunt: degradarea naturala, protejarea zonelor sensibile sau limitarea si recuperarea poluantului.

In primul rând, se va urmãri împiedicarea deplasãrii peliculei de hidrocarburi de-a lungul tãrmului, sub actiunea vântului sau a curentilor, folosind atât baraje flotante, cât si orice neregularitate din linia malului (golfuri, intrânduri etc.).

In faza urmatoare se va interveni atât de pe mare, cât si de pe uscat pentru recuperarea hidrocarburilor plutitoare sau a celor scurse de pe mal în urma spãlarii acestuia cu jeturi de apã caldã, fãrã a utiliza dispersanti.

Curãtirea tãrmului poluat se realizeaza in trei etape care constau in:- Depoluarea primara – recuperarea petrolului care balteste;

25

- Recuperarea propriuzisa – colectarea poluantului de pe suprafata solului, a resturilor de petrol vascos ( petrol ramas dupa evaporarea fractiilor usoare), a celui infiltrat in substrat, curatirea platformelor poluate, etc.;- Depoluarea finala, care consta in îndepãrtarea, spãlarea, dispersia, ultimelor ramasite, irizatii de pe sol.

Nu întotdeauna utilajele pot face fatã acestor operatiuni de amploare, astfel cã de multe ori curãtirea se face manual, prin aportul voluntarilor.

In final se aplicã dacã este posibil, un tratament cu substante biodegradante pentru accelerarea refacerii biologice a mediului.

O atentie deosebitã se va acorda salvãrii vietuitoarelor marine murdare de hidrocarburi (pãsãri si mamifere), atât prin prinderea si spãlarea lor, cât si prin hrãnirea fortatã, tinând cont cã sursele lor de hranã naturalã au fost afectate. De asemenea, cadavrele vietuitoarelor moarte trebuie strânse si incinerate pentru a nu da nastere la alte complicatii.

Mult timp dupã ce interventia de combatere a poluãrii a fost încheiatã, va trebui urmãritã refacerea mediului marin pentru a constata eventualele modificãri ecologice si a le corecta, pe mãsura posibilitãtilor.

Fazele interventiei

Operatiunile de interventie in caz de poluare au fost impartite in patru faze distincte: Faza I – Notificarea Faza II – Evaluarea si activarea planului Faza III – Operatiunile comune de interventie pe mare Faza IV – Operatiunile comune de interventie la tarm

Se intelege de la sine ca, in functie de imprejurari, unele faze sau parti ale acestora se pot suprapune.

Faza INotificarea si verificarea informatiilor privind poluarile accidentale se vor face la nivel

national, in conformitate cu dispozitiile PNI.Indiferent de necesitatea activarii planului, autoritatea operationala a partii contractante in a

carei zona de responsabilitate s-a produs accidentul, dupa primirea si verificarea raportului incidentului, va informa imediat autoritatile operationale ale celorlalte parti prin intermediul punctelor nationale de contact ale acestora.Autoritatea operationala alerteaza, de asemenea, celelalte autoritati implicate din propria tara, inclusiv CNE, in conformitate cu dispozitiile PNI.

Faza a II-aAutoritatea operationala a partii contractante afectate de un incident sau partea contractanta

care ar putea fi afectata prima, va evalua si va determina, luand in considerare gravitatea incidentului, inclusiv factori precum zona de producere a poluarii, natura si cantitatea poluantului deversat si alte elemente relevante, nivelul de interventie necesar si daca este necesara activarea planului.Inainte de activarea planului, autoritatea operationala a partii in cauza isi activeaza PNI.

Decizia de activare a planului se ia de catre autoritatea operationala a partii contractante afectate sau a celei care ar putea fi afectata prima de incident.

Dupa luarea unei astfel de decizii, autoritatea operationala a partii contractante afectate sau a celei care ar putea fi afectata prima de incident isi asuma rolul de autoritate lider si: informeaza autoritatile operationale ale celorlalte parti prin intermediul punctelor nationale de

contact , asupra activarii planului si asupra faptului ca propriul CNE si-a asumat rolul de CSE; activeaza propriul CIU, care isi va asuma rolul de CCIU; activeaza propria echipa de sprijin;

26

desemneaza CSE care, in legatura cu autoritatea lider si propria echipa de sprijin, formuleaza strategia de urmat si evalueaza necesitatea solicitarii de asistenta de la alte parti contractante. CSE initiaza fazele III si IV ale interventiei;

solicitarea asistentei din partea celorlalte parti contractante, pe baza cerintelor si a necesitatilor exprimate de CSE;

Faza a III-aObiectivele de baza ale operatiunilor comune de interventie pe mare sunt stoparea deversarii

poluantului la sursa, restrangerea ariei de raspandire a acestuia si inlaturarea unei cantitati cat mai mari de poluant de pe suprafata apei marii, inainte ca acesta sa ajunga pe tarmul uneia dintre parti.

Operatiunile comune de interventie pe mare se realizeaza in conformitate cu procedurile descrise in PNI al partii contractante lider. Comanda operationala a operatiunilor comune de interventie este exercitata de autoritatea lider prin intermediul CSE. Se utilizeaza in primul rand resursele nationale, care vor fi suplimentate, daca este necesar, cu personal si mijloace de la celelalte parti contractante, oferite ca asistenta, la cererea autoritatii lider. Personalul si mijloacele partilor asistente functioneaza sub control operational direct si sub comanda tactica a propriilor CNE si a comandantilor de unitati sau a sefilor de echipe.

In cursul operatiunilor comune de interventie, CIU al statului lider, care si-a asumat rolul de CCIU, serveste ca principal centru de comunicatii si ca baza a CSE.

Faza a IV-aObiectivele principale ale operatiunilor comune de interventie la tarm sunt de a proteja

zonele de coasta sensibile din punct de vedere ecologic si alte resurse vulnerabile la poluare impotriva efectelor poluantilor si de a-i inlatura pe cei care au atins tarmul pentru a preveni recontaminarea altor zone de coasta.

Aceasta faza include si actiunile de tratare si eliminare finala a poluantilor colectati si/sau a materialului contaminat din structura plajelor.

Principiile enuntate in faza a III-a se aplica si pe intreaga durata a acestei faze.Pentru cresterea eficientei operatiunilor comune de interventie pe tarm, CCIU poate fi

transferat, la alegerea autoritatii lider, in locatii alternative adecvate, mai apropiate de locul operatiunilor (conform pct. 3.3). In asemenea cazuri, autoritatea lider informeaza imediat autoritatile operationale ale partilor contractante asistente.

Incheierea operatiunilor comune de interventie si dezactivarea planului

CSE incheie operatiunile comune de interventie atunci cand: masurile de interventie in caz de poluare s-au finalizat, iar poluantul nu mai ameninta interesele vreunei parti contractante si masurile de interventie in caz de poluare s-au derulat pana la un punct de la care resursele si capacitatile de interventie ale partii lider sunt suficiente pentru finalizarea lor cu succes. Atunci cand decide incheierea operatiunilor comune de interventie, CSE ia in considerare in mod deosebit consecintele financiare ale continuarii acestora. Dupa luarea deciziei de incheiere a operatiunilor comune de interventie, CSE informeaza imediat CNE ai celorlalte parti contractante si autoritatile lor operationale despre decizia luata si despre dezactivarea planului.

Dupa dezactivarea planului, intregul personal, echipamentele, produsele ramase neutilizate si celelalte mijloace implicate in operatiunile comune de interventie se intorc sau sunt returnate in tarile lor de origine. Partea care a solicitat asistenta ia masurile necesare pentru repatrierea rapida a personalului partilor asistente, desi coordonarea si pregatirea formalitatilor necesare pentru repatriere acestuia raman in responsabilitatea autoritatilor lor operationale.

Partea care a solicitat asistenta raspunzatoare de inapoierea in tara de origine a intregului

27

echipament oferit ca asistenta si a tuturor produselor pentru tratare neutilizate. Intregul echipament si celelalte mijloace sunt inapoiate curate si in cea mai buna stare de functionare posibila.

Autoritatile operationale ale partilor implicate pot decide prin contacte directe ca produsele de tratare neutilizate sa ramana in tara care a solicitat asistenta, in conformitate cu legislatia nationala a partii contractante.

Unitatile autonome (vapoare, aparate de zbor) se intorc in tara lor de origine utilizandu-si propria capacitate de deplasare. Partea contractanta care a solicitat asistenta este raspunzatoare de facilitarea formalitatilor privind parasirea teritoriului/apelor teritoriale/spatiului aerian de catre unitatile oferite ca asistenta. Partea contractanta care a solicitat asistenta pregateste un raport asupra eficientei personalului, echipamentului, produselor si a altor mijloace primite ca asistenta. Aceste rapoarte sunt transmise celorlalte parti contractante

2.2. Echipamente şi metode folosite pentru limitarea efectelor poluării

Detinatorii de lucrari cu rol de aparare impotriva poluãrii marine işi constituie stocuri de materiale si mijloace de interventie operative, numai din sortimentele şi in cantitatile necesare, in functie de amplasarea zonei, gradul de amenajare al acesteia, tipul de lucrari cu rol de aparare existente.

Fondurile necesare pentru constituirea stocurilor de materiale si mijloacelor de aparare vor fi asigurate din bugetul de stat, din bugetele locale şi din sursele proprii ale operatorilor economici implicati in gestionarea situatiilor de urgențã. Fondurile alocate de la bugetul de stat vor fi prevazute distinct in bugetele Ministerului Mediului şi PAdurilor şi Ministerului Agriculturii şi Dezvoltãrii Rurale, iar cele alocate de la bugetele locale, in bugetele comunelor, omelor şi judetelor, dupã caz.

Unele mijloace care presupun o continuitate in folosire pot deservi activitatea generalã de intretinere a constructiilor cu rol de aparare impotriva inundatiilor. Acelaşi regim au si mijloacele de calcul, masurare, transmisie şi avertizare. Operatorii economici care au objective inundabile sau potential poluatori, precum primarii municipiilor, oraselor Si comunelor vor stabili in planurile de aparare modul de asigurare a materialelor i mijloacelor de interventie sj locurile de depozitare.

Limitare şi recuperare în zona de larg

Recuperarea mecanicã, se realizeazã cu utilaje recuperatoare de capacitate mare, în sistemul V, J, W, U de traulare de suprafatã cu baraje flotante de tip offshore. Aceste baraje trebuie sã aibã o jupã de cel putin 0,8 m, un bord liber de cel putin 0,6 m, sã urmãreascã bine valul, sã fie stabile in plan vertical, la tractiune transversalã si la oscilatii pe valuri, sã aibã o bunã rezistentã mecanicã si o andurantã corespunzãtoare solicitãrilor dure din zona de larg (mare de pânã la 3 -40 Beaufort, curent de pânã la 1,5-2 Nd, vânt de 10 ÷ 15 Nd, val max 2-3 m etc.).

Recuperatoarele trebuie sã nu fie influentate in functionare de valuri, trebuie sã aibã capacitãti si randamente mari, sã poatã fi manevrate în orice conditii hidro-meteo.

De regulã, echipamentele de interventie sunt montate pe nave mari (preferabil trawlere) capabile sã actioneze pe mare agitata si sã le asigure suportul functional necesar (energie, mijloace de manevrã, spatii de lansare/recuperare echipamente, spatii de depozitare pentru hidrocarburile recuperate etc.).

In situatii speciale (pierderi la conductele submarine de transport titei), recuperarea se poate efectua cu ajutorul unor corturi submarine sau rezervoare flotante, 3dispersia realizanduse cu ajutorul unor dispozitive de injectie submarinã (în cazul eruptiilor), pentru obtinerea unei mai bune amestecãri cu hidrocarburile.

28

Limitare în zona de radã si port

Limitarea zonei poluate se poate face fie cu baraje flotante de tip “harbour”, tractate de regulã cu salupe, fie cu baraje submarine prin perdele de bule, în special pentru danele petroliere. Barajele flotante protejaza, preventiv, navele petroliere aflate în operatiuni de încãrcare-descãrcare. Eventualele variatii de nivel produse de maree sau valuri sunt compensate la capetele barajului prin dispozitive de etansare la cheu prin glisiere verticale. Lansarea la apã si recuperarea barajelor se face de obicei de pe mal, în perimetre special amenajate.

Recuperarea hidrocarburilor, tinând cont atât de resturile plutitoare ce le însotesc, cât si de consistenta lor, se realizeazã cu recuperatoare cu discuri, cu bandã, cu tamburi, cu parâmã, sau cu discuri dintate. Acestea au capacitãti medii, iar reziduurile sunt evacuate periodic fie într-o navã colectoare, fie într-un tanc special.

Pentru a pãtrunde în toate zonele si în spatiile restranse dintre nave, salupele colectoare trebuie sã aibã dimensiuni relativ mici si sã fie foarte manevrabile.Se poate lucra si cu utilaje independente, manevrate de pe mal (dig, cheu, danã) cu macaralele de cheu sau cu alte mijloace mobile.

Dispersanti, pot fi împrãstiati cu ajutorul unor dispozitive speciale montate pe salupe si chiar pe bãrci pneumatice. De regulã, pentru zona de radã si port se folosesc salupe complexe care pot sã întindã un baraj mic, pot sã recupereze dinamic prin traulare de suprafatã în sistem V sau J (cu una sau douã aripi mici de baraj sustinute de tangoane) sau pot pulveriza dispersanti etc. Aceste salupe au caracteristicile principale cuprinse astfel:

5lungimea totalã 6-24 m; deplasament 4-20 tone; capacitate stocare 0,6-2,0 m3; productivitate 5-20 t/orã; vitezã maximã 4-10 Nd.

Se pot aplica deasemenea tehnici speciale, cum ar fi de exemplu tratarea peliculei cu substante absorbante sau cu substante coagulante, urmatã de colectarea aglomerãrilor rezultate.

Limitare în zona de țãrm

Curãtirea tãrmului poluat se realizeaza in trei etape care constau in: Depoluarea primara – recuperarea petrolului care balteste; Recuperarea propriuzisa – colectarea poluantului de pe suprafata solului, a resturilor de petrol

vascos ( petrol ramas dupa evaporarea fractiilor usoare), a celui infiltrat in substrat, curatirea platformelor poluate, etc.;

Depoluarea finala, care consta in îndepãrtarea, spãlarea, dispersia, ultimelor ramasite, irizatii de pe sol.

Nu întotdeauna utilajele pot face fatã acestor operatiuni de amploare, astfel cã de multe ori curãtirea se face manual, prin aportul voluntarilor.In final se aplicã dacã este posibil, un tratament cu substante biodegradante pentru accelerarea refacerii biologice a mediului.

O atentie deosebitã se va acorda salvãrii vietuitoarelor marine murdare de hidrocarburi (pãsãri si mamifere), atât prin prinderea si spãlarea lor, cât si prin hrãnirea fortatã, tinând cont cã sursele lor de hranã naturalã au fost afectate. De asemenea, cadavrele vietuitoarelor moarte trebuie strânse si incinerate pentru a nu da nastere la alte complicatii.Mult timp dupã ce interventia de combatere a poluãrii a fost încheiatã, va trebui urmãritã refacerea mediului marin pentru a constata eventualele modificãri ecologice si a le corecta, pe mãsura posibilitãtilor.

29

Utilizarea agentilor de dispersie

Fiecare parte contractanta isi defineste strategia privind utilizarea agentilor de dispersie in combaterea poluarilor cu produse petroliere si le descrie in PNI. In acest scop, partile contractante respecta “Liniile directoare privind utilizarea agentilor de dispersie”.

Fiecare parte contractanta informeaza celelalte parti contractante asupra strategiei privind utilizarea agentilor de dispersie. Informatiile includ cel putin enumerarea agentilor de dispersie aprobati spre utilizare in apele teritoriale ale partii contractante si zonele in care utilizarea acestora este permisa, restrictionata sau interzisa.

In cazul operatiunilor comune de interventie, partile contractante respecta principiul autorizarii prealabile a utilizarii agentilor de dispersie. Autorizatia poate fi emisa numai de catre CSE sau de catre o alta persoana desemnata de acesta.

In zona de responsabilitate a fiecarei parti contractante, agentii de dispersare se utilizeaza intotdeauna in conformitate cu dispozitiile PNI al partii contractante implicate. Daca nu s-a decis altfel in contactele directe dintre CSE si CNE ai partilor contractante care participa la operatiunile comune de interventie, acelasi principiu se aplica si in zonele de responsabilitate ale partilor contractante.

Daca o parte contractanta a interzis utilizarea agentilor de dispersie in apele sale teritoriale, celelalte parti contractante care participa la operatiunile comune de interventie trebuie sa respecte aceasta decizie.

a) Recuperatoare mici: sunt reprezentate de salupele recuperatoare de pânã la 10 m lungime, autopropulsate, cu unul sau douã dispozitive recuperatoare si având, eventual, douã aripi mici de baraj sustinute de tangoane. Caracteristicile tipice de operare sunt:

- v = 0,25 la 0,75 Nd (0,5-1,5 km/h);- W = 1,5 la 8,0 m;- R = 50% la 75%;- P = 400 l/min.

b)Recuperatoare medii: sunt reprezentate de ambarcatiuni ceva mai mari, autopropulsate, cu unul sau douã dispozitive recuperatoare si care lucreazã prin traulare cu ajutorul uneia sau a douã aripi de baraj. Caracteristicile tipice de operare sunt:

- v= 0,50 la 1,00 Nd (1,0 – 2,0 km/h);- W = 15,0 la 60,0 m;- R= 50% la 75%;- P = 1.200 l/min.

c)Recuperatoare mari: sunt reprezentate de nave adaptate sau special concepute pentru lupta antipoluare, dispunând de agregate puternice de recuperare si pompare, tancuri de reziduuri, instalatii complexe de manevrare a unor baraje flotante lungi si operând în sistem de traulare V, U, W, J. Caracteristicile tipice de operare sunt:

- V = 1,00 la 2,00 Nd (2,0 – 4,0 km/h);- W = 50,0 la 150,0 m;- R= 50% la 75%;- P = 2.200 l/min.

DISPERSIEd)Imprãstietoare de dispersanti montate pe nave: sunt reprezentate de acele nave sau ambarcatiuni care au montate în borduri douã tevi cu düze sau pulverizatoare de dispersanti. Caracteristicile tipice de operare sunt:

- v= 5,00 la 10,00 Nd (,0 – 20 km/h);

30

- W = 10 la 30 m;- D= 20% la 70%;- P = 75 l/min.

e)Imprãstietoare de dispersant montate pe aeronave mici: sunt reprezentate de helicoptere sau avioane mono sau biloc care au montate pe ele instalatii de împrãstiat dispersantii, similare celor folosite în agriculturã pentru împrãstiat amendamente. Caracteristicile tipice de operare sunt:

- v = 75 la 150 Km/h;- W = 15 la 20 m;- D= 20% la 70%;- P = 500 l/min.

f)Imprãstietoare de dispersant montate pe aeronave mari: sunt reprezentate de sistemele de mare capacitate de împrãstiere montate pe avioane cargo speciale, similare celor folosite pentru stingerea incendiilor în pãduri. Caractersiticile tipice de operare sunt:

- v = 200 la 350 km/h; - W = 30 la 60 m;- D = 20% la 70%- 10P = 3.500 l/min.

ARDEREg)Baraje antifoc: sunt reprezentate de sistemul de izolare a unei pete de hidrocarburi în vârful concavitãtii unui baraj antifoc care opereazã în sistemul U de traulare. De regulã, deschiderea traulului reprezintã cam o treime din lungimea barajului, iar acumularea hidrocarburilor se realizeazã în treimea din vârful concavitãtii acestuia. Caracteristicile tipice de operare sunt:

- v= 0,25 la 0,75 Nd (0,5 la 1,5 km/h);- W = 50 la 100 m;- A= 80% la 98%;

Viteza de ardere a hidrocarburilor variazã, de obicei între 1-2 l/min/m2, functie de tipul hidrocarburii, grosimea peliculei si conditiile de mediu.

Acoperirea zonei de lucru Alegerea unuia sau altuia dintre sistemele descrise mai sus depinde de mai multi factori printre care si mãrimea suprafetei peliculei de hidrocarburi asupra cãreia se intervine. Timpul în care aceastã suprafatã este necesar a fi depoluata trebuie sã fie cât mai redus cu putintã, atât din motive economice cât mai ales ecologice. Alegând o duratã rezonabila (de scurta) a interventiei si cunoscând caracteristicile tipice de operare ale fiecãrui sistem, se poate proceda atât la alegerea metodei cât si a numãrului necesar de utilaje. Invers, în cazul în care se dispune de un anumit numãr din fiecare categorie de utilaje, se poate determina timpul de operare. Viteza de acoperire a zonei se obtine înmultinând lãtimea de lucru a fiecãrui utilaj cu viteza sa.

Solicitarea asistentei suplimentare de la alte parti contractante

In cazul unui incident de poluare cu o anvergura si de o natura la care, in opinia autoritatii lider, resursele si capacitatile comune ale partilor contractante nu pot face fata, partea lider poate solicita asistenta suplimentara din partea altor parti contractante.

In asemenea imprejurari si dupa consultari cu autoritatea lider, alte parti contractante pot solicita, de asemenea, in conformitate cu nevoile lor, asistenta suplimentara. Daca mai multe parti contractante solicita asistenta de la alte parti contractante, coordonarea acestor actiuni intre partile contractante se realizeaza la nivelul autoritatilor lor operationale.

31

CAPITOL III. Rolul bacteriilor în procesul de bioremediere la nivelul sedimentelor

3.1. Studiul proceselor de sedimentare la litoralul românesc al Mării Negre

Zona costierã a României este supusă permanent proceselor de eroziune, fenomenul accentuându-se în ultimii 30 de ani ca urmare a construirii lacurilor de baraj Porţile de Fier I şi II, în acest fel cantitatea de sedimente adusă de Dunăre în Marea Neagră reducându-se la jumătate şi dereglând echilibrul sedimentar costier. Acestei cauze i se pot adăuga şi scăderea aportului de sedimente pe suprafeţele de plajă, pierderea de sediment către larg datorită construirii digurilor portuare, prăbuşirea falezelor datorită instabilităţii geotehnice a zonelor situate în partea superioară a pantelor şi/sau acţiunii valurilor la baza falezelor etc. Amploarea eroziunii costiere diferă de la un sector la altul.

3.1.1. Procese de sedimentare litoralãProcesele de sedimentare litorală sunt controlate, în principal, de mişcarea apei. Cel mai

important element îl reprezintă valurile, mai precis, energia lor. La fel de importanţi sunt curenţii litorali, de la cel de transfer litoral la cel de retur. Atât valurile cât şi curenţii sunt generaţi şi controlaţi de condiţiile meteorologice, în primul rând de vânt.

Sedimentele sunt deplasate de curenţi prin târâre pe fund (bedload), sau în semisuspensie sau suspensie, şi acumulate în funcţie de orientarea generală a coastei, mişcarea lor putând fi transversală sau longitudinală faţă de ţărm. Morfologia zonei costiere şi înclinarea pantei submarine a plajei reprezintă alte elemente care influenţează procesele de acumulare/erodare a zonei de coastă. În lungul zonei de deferlare a valurilor se înregistrează o mişcare a materialului nisipos spre coastă, cu o componentă în lungul litoralului. În zona barei, transportul sedimentelor în suspensie şi semisuspensie, este deosebit de activ, pe bară rămânând particulele grosiere care nu pot fi preluate de curent. În zona de surf se produce o segregare a materialului după caracteristicile sale morfologice şi fizice (cum ar fi dimensiune sau greutate specifică).

Din punct de vedere hidraulic raportul dintre debitul solid transportat de un curent litoral şi capacitatea acestuia de transport defineşte gradul de saturare al curentului. Când raportul este subunitar există posibilitatea apariţiei fenomenului de eroziune. Componenta principală a echilibrului dinamic al unei zone litorale o reprezintă „bugetul“ sau „balanţa“ materialului sedimentar. În procesul evoluţiei coastei, materialul detritic grosier se „consumă“ prin tocire şi făramiţare, sedimentele putând fi transportate în alte zone ale litoralului. Refacerea stocului de sedimente litorale se poate realiza prin alimentarea zonei costiere cu aluviuni aduse de cursuri de apă, prin eroziunea falezelor, a materialelor provenite prin transferul de sedimente din zone vecine ale litoralului sau de pe fundul mării. Interceptarea şi micşorarea debitelor solide, precum şi exploatarea materialelor sedimentare de pe plajă, stricăechilibrul sedimentar al litoralului, generând eroziuni intense ale acestuia.

O altă cauză de primă importanţă a modificărilor litoralului o prezintă furtunile foarte puternice care, cel mai adesea au loc de 2-3 ori pe an. În timpul acestor furtuni, energia valurilor şi capacitatea de transport a curentului litoral de sedimente creşte cu câteva ordine de mărime. Astfel, se produce o foarte intensă eroziune a litoralului. În cazul unui litoral în care balanţa de material sedimentar este deficitară, transformările determinate de furtunile foarte puternice sunt uneori ireversibile.

Un alt factor care determină schimbări majore ale morfologiei litoralului este modificarea nivelului apelor mării. Oscilaţiile nivelului mării, care pot fi sezoniere, multianuale sau de natură eustatică, pot genera fenomene de eroziune a zonelor de coastă. La Constanţa, unde măsurătorile nivelului mării au fost făcute din anul 1933, se constată o creştere a nivelului mediu anual de

33

aproximativ 2,2 mm/an. Nivelul Mării Negre este dependent de schimbările globale de climă şi de nivel al Oceanului Mondial, dar şi de aportul lichid şi solid al Dunării.

În trecutul geologic al Mării Negre, modificările de nivel ale apei au fost generate de schimbări climatice majore – răciri pronunţate datorate glaciaţiunilor, urmate de incălziri ce au dus la topirea calotelor glaciare. Ultima glaciaţiune din Pleistocenul superior a determinat o scădere a nivelului apei pană la aproximativ 120 m. Toate aceste schimbări ale nivelului mării au determinat şi schimbări majore în poziţia liniei ţărmului şi structura zonei costiere.

Alţi factori care pot influenţa procesele costiere sunt: temperatura aerului, regimul precipitaţiilor, direcţia şi viteza vanturilor şi variaţiile presiunii barometrice.

3.1.2 Curenţii şi transportul de sedimentePe litoralul românesc al Mării Negre, datorită direcţiei vânturilor dominante şi morfologiei

fundului bazinului marin, curenţii paraleli cu ţărmul sunt orientaţi predominant nord-sud. În perioadele de calm atmosferic valoarea măsurată a curentului longitudinal nord-sud este de 3-50 cm/s (Bondar, Roventa, 1967). În timpul vânturilor din nord şi nord-est (14-15 m/s), viteza curentului poate ajunge la 1 m/s la suprafaţă şi 0.2-0.3 m/s la fund (Bondar, Roventa, 1967). Curenţii în sens contrar apar în perioadele vânturilor din direcţia sud şi sudest.

La gurile de vărsare ale Dunării există şi curenţii de apă dulce care se dispersează în evantai spre larg şi pot ajunge (Gastescu, 1986) până la 3 kilometri depărtare de ţărm. Teoriile anterioare care menţionau existenţa unui curent compensator sud-nord pe sub curentul longitudinal nord-sud au fost infirmate.

3.1.3 Tendinţe de eroziune a zonei costiere în sectorul Cap Midia – Vama Veche

3.1.3.1. Plaja cuprinsă între promontoriile Cap Midia şi Cap Ivan, evoluează în condiţii naturale, intervenţia umană în acest sector fiind nesemnificativă. Acest sector costier se menţine intr-o stare de echilibru dinamic. Aportul de material sedimentar de origine danubiană echilibrează balanţa proceselor sedimentare, ceea ce conferă stabilitate liniei ţărmului.

3.1.3.2. La sud de Capul Ivan, zona costieră a suferit importante modificări prin construirea platformei industriale Midia precum şi a acvatoriului portuar Midia - Năvodari. Digurile de larg ale acestui acvatoriu au generat modificări majore ale circulaţiei litorale, barand şi deviind spre larg curentul litoral de sedimente. Ca urmare plaja Mamaia - Năvodari, situată imediat la sud de acestea, evoluează în condiţiile unui aport foarte redus de material sedimentar.

3.1.3.3. În sectorul de plajă Năvodari - Tabăra de copii se constată o situaţie staţionară a liniei ţărmului, dar stocul de sedimente al plajei emerse este mult diminuat. Aportul masiv de cochilii se reflectă în granulometria sedimentelor de plajă.

3.1.3.4. Cordonul litoral dintre Tabăra Năvodari şi Mamaia Nord continuă să fie afectat de procese erozive. Efectele deficitului de sedimente sunt aici puternic resimţite; retragerea liniei ţărmului este generală, dar cu valori diferite, mai lentă în partea nordică şi mai accentuată spre sud.

3.1.3.5. Plajele de la Mamaia aparţin “complexului de plaje barieră”, fiind delimitat la nord de Portul Midia şi de Capul Singol la sud. Acestea au fost contruite de valuri şi curenţi de-a lungul ultimei faze de transgresiune a Mării Negre, izolând în spate laguna Siutghiol. Înainte de 1975, Portul Midia a fost extins până la 6 m adancime. În 1975 digul de tip jetty a fost adâncit spre offshore pană la 12 m. Concomitent, s-a remarcat o eroziune severă a plajelor sudice. În scopul realizării unei protecţii costiere, în faţa Hotelului Parc au fost amplasate epiuri în formă de Y şi a fost dragat nisip adiţional din Lacul Tăbăcărie în vederea alimentării artificiale pentru nou creata plajă. Curenţii locali au dispersat sedimentele înspre nord. În decursul următorilor ani, eroziunea s-a

34

deplasat către sud, între hotelurile Dacia şi Perla. În 1984 un nou epiu a fost construit în faţă Capului Singol în vederea diminuării eroziunii. Între anii 1974 – 1984 se remarcă o reducere importantă a aportului de sedimente. După 1980, s-a observat o retragere a liniei ţărmului cu valori între 15-70 m în zona Mamaia (Raport JICA). Sedimentele au devenit mai grosiere datorită adaosului de cochilii versus fracţia terigenă, care a fost transportată înspre larg. Datorită acestei eroziuni severe, între 1989 – 1990, partea sudică a plajei de la Mamaia cunoaşte o alimentare artificială executată cu sedimente dragate din Lacul Siutghiol, concomitent cu realizarea a şase diguri “sparge - val”, care au indus câteva celule de circulaţie litorală, în care se manifestă o acumulare de sedimente de tip “tombolo” în spatele digurilor cu mai multe canale între ele. Operaţiunile de dragare au fost efectuate fără un studiu litologic al sedimentelor din Lacul Siutghiol în prealabil. Consecutiv, o importantă cantitate de silt şi argilă siltică a fost introdusă în circulaţia costieră, contribuind şi mai mult la inrăutăţirea calităţii plajei şi a siguranţei hidrogeologice.

3.1.3.6. Sectorul Eforie – Costineşti a fost influenţat de o serie de construcţii: extinderea portului Constanţa în anii ’70, extinderea digului sudic de tip jetty în 1978 şi construcţia Yacht Club Europa in 1986. Construcţia digului a fost executată în acelaşi timp cu lucrările de dragare pe canalul Dunăre-Marea Neagră. Digul de tip jetty din partea sudică a Portului Constanţa a redus mult intensitatea acţiunii valurilor din partea nordică a sectorului Eforie Nord prin procesul de difracţie a valurilor.

3.1.3.7. Zona Eforie Sud este puternic afectată de procesele de alunecare a falezelor, datorită excesului de apă din stratele superioare. Baza falezei este protejată de plaje şi de ziduri de protecţie (seawalls), ceea ce face ca spălarea acesteia de către valuri să fie destul de redusă. Valoarea medie a retragerii ţărmului în ultimii 25 ani a fost de 10-20 m, mai mare în partea sudică a barei litorale Techirghiol (Constantinescu, 2005). Plaja Costineşti prezintă o eroziune redusă în partea nordică şi o depunere uşoară în partea sudică, fiind destul de stabilă. Eroziunea din partea nordică a apărut ca rezultat al unor lucrări de denisipare, în vederea folosirii materialului la construirea fundaţiilor caselor din zonă. De remarcat este şi momentul septembrie 2005 cand au avut loc importante inundaţii în toată zona Dobrogei de Sud, acestea afectând foarte sever şi staţiunea Costineşti. Excesul de apă, ca rezultat al ploilor torenţiale, a făcut ca nivelul lacului de la Costineşti să crească spăland tot nisipul de pe plajă în mare. Se aşteaptă, totuşi, ca plaja sa fie recuperată în mod natural cu ajutorul valurilor şi a curenţilor.

3.1.3.8. Sectorul Olimp – Venus cuprinde în cea mai mare parte plaje antropice, excepţie făcand bariera naturală situată în faţa Lacului Tatlageac şi Balta Neptun, în partea nordică a zonei mai sus menţionate. Plajele au fost alimentate artificial şi protejate cu ajutorul multor diguri de tip jetty şi sparge – val construite la finalul anilor ’70. Originea acestui nisip utilizat la înnisiparea artificială nu este cunoscută din cauza lipsei de date, dar se poate presupune că ar fi putut fi adus de pe plajele naturale din vecinătate, fie din Balta Mangalia, fie din Olimp. Datorită protecţiei acestor plaje artificiale cu ajutorul jettis-urilor şi a breakwater-urilor, nu a fost semnalată încă eroziune în zonă.

3.1.3.9. Sectorul Saturn – Mangalia cuprinde cinci plaje protejate de opt jettis-uri şi de un dig sparge – val. Expansiunea Portului Mangalia începută în anii ’60, începută prin tăierea unor canale de navigaţie către Lacul Mangalia şi extinderea digului sparge – val din nord, a dus la o retragere a liniei de ţărm cu o rată de 0,7 m/an.

3.1.3.10. Zona 2 Mai – Vama Veche este reprezentată de un sector cu faleză, la Limanu, şi două sectoare cu plaje nisipoase la 2 Mai şi Vama Veche, care includ şi porţiuni de faleză. Între anii 1979 – 2002 au fost executate importante lucrări de întreţinere portuară, ceea ce a generat majore modificări ale liniei ţărmului. În acest sector retragerea liniei ţărmului s-a manifestat extrem de activ. Cauza principală a eroziunii este datorată construirii digurilor de tip jetty din Portul Mangalia.

35

Stadiul actual de evoluţie al ţărmului românesc scoate în evidenţă o serie de concluzii majore, după cum urmează: retragerea generalizată a liniei ţărmului, îndeosebi în avalul structurilor hidrotehnice majore (acvatorii portuare), pierderea unor cantităţi importante de nisip, dirijate pe timp de furtună spre larg, care sunt scoase astfel din circuitul costier (proces determinat de creşterea pantei subacvatice pe fondul unui input de sedimente drastic diminuat), intervenţia directă antropică asupra sedimentelor de plajă, care constă, în principal, în îndepărtarea în timpul verii a fracţiei organogene grosiere de pe plajele turistice.

Ţinând seama de tendinţa globală de creştere eustatică a nivelului mării şi, implicit, de toate fenomenele conexe, se impune cu stringenţă adaptarea strategiilor de protecţie costieră la noile condiţii hidrodinamice.

3.2. Bacteriobentosul marin

Distribuția bacteriilor bentale este determinatã de mai mulți factori. Adâncimea la care se gãsesc în coloana de sediment influențeazã accesul la nutrienți şi oxigen. Densitatea maximã este atinsã la interfața dintre sediment şi apã.

Localizarea geograficã a sedimentelor este şi ea importantã. În regiunile mai apropiate de țãrm, densitatea bacteriobentosului creşte datoritã cantitãții mai mari de compuşi organici rezultați prin depunerea resturilor vegetale şi animale. Ca factori nefavorabili, apar variații de salinitate şi temperaturã şi hidrodinamismul.

De asemena, tipul de sediment influențeazã abundența bacteriilor. Mâlurile, mâluriile cu argile, sedimentele detritice sunt foarte bogate în nutrient organici, deci şi în microorganisme, spre deosebire de nisipuri.

Prin metode de numãrare directã, densitãțile microbiotei bentice litorale determinate de diverşi autori în diferite zone ale lumii se încadreazã în limitele de aproximativ 106−109 celule per cm3, cu variații circadiene şi sezoniere.

Trebuie menționat faptul cã dintre celulele bacteriene vizualizate prin metode de numãrare directã rareori mai mult de 60% sunt vii, iar cele cultivabile pot reprezenta sub 1‰.

Bacteriile colonizeazã doar o micã parte din suprafața sedimentelor (sub 1%), preferând spații adãpostite (fisuri, crãpãturi) fațã de abraziune, mişcãrile apei şi consumatori. Depunerile de detritus favorizeazã, evident, colonizarea microbianã.

În general, numãrul procariotelor este maxim în regiunile litorale ( mai ales în cele vecine cu marile colectivitãți urbane), în estuare şi scade progresiv în zonele pelagive pe mãsura îndepãrtãrii de țãrm şi odatã cu adâncimea. Numãrul acestora este, de asemenea, crescut în zonele de ridicare a apelor reci de la adâncime ( upwelling zones) şi în primii centimetri ai sedimentelor marine unde pot ajunge la valori ridicate. Acesta scade mult odatã cu profunzimea sedimentelor datoritã anaerobiozei şi lipsei nutrienților din aceste zone.

Microorganisemele au un rol esențial în ecosistemele marine având un rol cheie în relațiile trofice din acest tip de ecosisteme, ele reprezintã atât miroorganismele (microbiota) care descompun „zãpada”marinã, dar şi valorificã substanța organicã dizolvatã şi în acelaşi timp inițiazã formarea epibiozelor.

Bacteriile marine cresc optim la concentrații saline între 33-35% şi nu se dezvoltã sau se dezvoltã slab în absența NaCl, sunt psichotrofe sau psichrofile cu excepția celor din apele tropicale de suprafațã. În funcție de habitat sunt barofobe (la suprafața mãrii), barotolerante sau barofile. Prezintã un pleomorfism accentuat determinat, probabil, de oligotrofie şi de efectele presiunilor hidrostatice cu valori ridicate. Cele mai multe, 80-95 % sunt Gram negative, mobile (75-85%), aerobe, facultativ anaerobe, iar cele din adâncul sedimentelor obligat anaerobe.

Bioremedierea reprezintã procesul de reconstrucție ecologicã prin care microbiota naturalã este utilizatã pentru a reduce concentrație, într-un anumit mediu, sau toxicitatea unor poluanți, prin biodegradarea lor. Deşi prezintã anumite limitãri, bioremedierea rãmâne o modalitate extrem de atractivã de reconstrucție ecologicã, datoritã costurilor sale scãzute.

36

Una din cele mai frecvente şi mai periculoase forme de poluare a ecosistemelor marine o constituie deversarea de produse petroliere. Petrolul şi produsele derivate sunt amestecuri complexe conținând diferite tipuri de hidrocarburi.: alcani, cicloalcani, alchene, hidrocarburi aromatice şi poliaromatice, asfaltene, hidrocarburi sulfurate. Unele microorganisme posedã cãi metabolice prin care astfel de compuşi pot fi oxidați ( de obicei aerob), de regulã cu formarea de acizi graşi. În general, fiecari dintre speciile sau tulpinile de microorganisme hidrocarbon-oxidante este specializatã strict pe un numãr restrâns de hidrocarburi.

Diverşi factori de mediu pot influența modul în care decurge procesul de bioremediere: starea fizicã a poluantului, solubilitatea acestuia, suprafața disponibilã pentru interacțiunea între acesta şi microorganisme, concentrația sa, eventualele poluãri anterioare (care favorizeazã microbiota hidrocarbon-degradativâ), temperatura, nutrienții (azot, fosfor), oxigenul, salinitatea şi presiunea hidrostaticã.

Pornind de la cunoaşterea principiilor procesului şi a factorilor favorizați sau inhibitori, bioremedierea naturalã poate fi dirijatã de cãtre om în sensul unei eficiențe superioare, prin biostimulare (adaosul de nutrienți în mediu) sau bioaugumentare (adaosul de organisme degradative). S-a demonstrat cã biostimularea poate da rezultate foarte bune în diverse medii.

Tehnicile de simulare include suplimentarea surselor de azot şi fosfor, oxigenarea artificialâ (unde este cazul) şi adiția de sufractanți.

Sedimentele marine litorale sunt unul dintre mediile cele mai de afectate de poluare cu hidrocarburi, efectele acesteia diferã în funcție de tipul de sediment.

Similare ca efecte cu acesti tip de poluare sunt şi contaminãrile cu mixturi lipidice de origine biologicã (în special vegetalã), din ce în ce mai frecvente odatã cu utilizarea pe scarã tot mai extinsã a acestor uleiuri în producția de biocombustibili şi în alte ramuri industriale.

Uleiurile vegetale (mai ales de floarea-soarelui, rapilã, in, palmier) reprezintã una din cele mai frecvente surse de poluare în multe state ale lumii. Uleiurile vegetale diferã foarte mult în ceea ce priveşte compoziția lor şi mai ales raportul între acizii graşi saturați şi nesaturați şi lungimea catenelor acestora. Compoziția, alãturi de diverşi factori de mediu, determinã rata de biodegradare a acestora.

3.3. Strategii de supraviețuire ale bacteriilor în mediul natural

Supraviețuirea a fost definitã ca fiind abilitatea de menținere a viabilitãții în consiții nefavorabile. Ambiguu este in ce anume constituie termenii „viabilitate”şi „nefavorabil”. Printre mecanismele de supraviețuire ale microorganismelor se numãrã şi formarea sporilor şi chisturilor de cãtre microorganisme de sol. Existã microorganisme care nu îndeplinesc niciuna din aceste activitãți, însã reuşesc sã se izoleze de mediul înconjurãtor nefavorabil. Aceste microorganisme rezistã ca celule vegetative, dar îşi folosesc rezerva de energie foarte încet ca rezultat al activitãții metabolice scãzutã.

Existã anumiți factori de stres, cum a fi înfometarea, care conduc bacteriile sã îs micşoreze dimensiunea şi activitatea pânã când acel factor de stres va fi eliminat. (Stevenson, 1978). Multiplicarea microbialã în habitate naturale trebuie sã fie presupusã cã ar alterna cu perioada de hibernare (dormancy). Acest punc de vedere nu ia în considerare schimbãrile de metabolism ca rãspuns la schimbãrile de nivel de nutrienți, ci propune doar aceste douã stãri (Jannasch, 1966). Observarea comunã fãcutã asupra habitatelor cu nivele scãzute de nutrienți a numãrului mare de bacterii microscopice unde ar fi trebuit sã existe un numãr scãzut de bacterii mãsurat de metode de culturã, sugereazã faptul cã o proporție mare din populația microbialã sunt într-adevãr în starea de hibernare(dormant) sau sunt supuse unei schimbãri în metabolism ca rãspuns la schimbãrii condițiilor de mediu. A fost demonstrat faptul cã populații naturale de microorganisme din apa de mare tind sã rãspundã la îmbogãțirea organicã a mediului în aproximativ 12 ore.

Abilitatea de a reduce rapid rata metabolicã endogenã poate fi o condiția primordialã pentru supraviețuire dacã bacteriile sunt nevoite sa îndure condiții de înfometare. Multe investigații

37

sugereazã cã respirația redusã şi metabolismul endogen redus sunt mecanisme ce sporesc supraviețuirea în condiții de nutriție slabã. Folosind izolatori, cum ar fi ramuri ale speciei selectate pentru longevitate folosind tampon fosfat.

Abilitaea de a funcționa la o ratã metabolicã foarte scãzutã nu aparține doar bacteriilor marine, ci a fost observatã şi la bacteriile din sol şi este consideratã a fi un mecanism de adaptare prin care bacteriile din sol supraviețuiesc în condiții de nutriție extrem de scãzutã.

Forma latentã a diferitelor grupuri de bacterii cum ar fi speciile din genul Myxococcus, Azotobacter, Streptomyces, Thermoactinomyces, Bacillus şi Costridium dezvoltã sub condiții de limitare a nutrienților. Limitarea carbonului, nitrogenului sau fosforului duc la dezvoltarea sporilor, ceea ce nu e o condiție de reproducere, ci una de supraviețuire. Aceastã stare este foarte rezistentã la agenții distructivi cum ar fi temperatura, deshidratarea, pesticide, antibiotice sau coloranți. Conținutul de apã a sporilor este foarte scãzutã şi metabolismul este redus la nul cât timp celulele rãmân viabile, cum este demonstrat de acțiunea de germinație la apriția condițiilor favorabile. Sporii în stare latentã au o încãrcare energeticã scãzutã şi o concentrație micã de trifosfați nucleozidici, coenzima acetil A şi nucleotide pirimidinice. Fosfogliceratul şi proteine de bazã par a fi sursele de energie primare pentru sinteza ATP, în primele minute ale germinației, când ATP este sintetizat rapid înainte ca sinteza macromolecularã sã poatã fi observatã. Germinația sporilor variazã, fiind influențatã de condițiile ce au declanşat sporularea şi condițiile în forma sporularã. Totuşi, agenții implicați în inițierea germinãrii sunt nutriționali, enzimatici, chimici, şi fizici : zaharuri, aminoacizi, purine, sãruri, detergenți, calciu, acid dipicolinic, lizozime. Un stadiu interesant al germinãrii este activarea sporului. Sporii abia formați au nevoie de condiții de stres, spre exemplu radiații, pH scãzut sau temperaturi ridicate pentru ca inițierea sã aibã loc, chiar dacã acele condiții optime sunt îndeplinite. Totuşi, sporii vechi vor germina fãrã activare. Odatã activate, celulele în stare latentã pot genera ATP, sintetiza ARN, şi asambla aminoacizi în proteine, inițial cu prețul compuşilor stocați. Sporularea este o tranziție între celula vegetativã şi spor şi nu se întâmplã brusc ci ca un transfer în urma evenimentelor apãrute ca rãspuns la privarea nutriționalã. Concomitent cu forma sporularã apar o serie de evenimente ce odatã complete, previn întoarcerea. Punctul fãrã întoarcere reprezintã acumularea a sufieciente evenimente succesive de supraviețuire. Aceste evenimente bine stabilite pentru bacteriile ce formeazã spori, pot fi similare stadiului de latențã observat la celulele viabile, singura deosebire realã fiind lipsa unei condiții evidente de morfologice diferitã.

A fost demonstrat faptul cã unele specii de bacterii autohtone mediului marin pot suferi o „diviziune reductivã” ca reacție la lipsa carbonului şi nitrogenului, astfel producând o populație de celule proporțional reduse în dimensiune şi mãrite ca volum. Consecința modulãrii respirației endogene este o ratã scãzutã a metabolismului şi inițierea degradãrii macromoeculare.

În condiții de lipsã de nutrienți, energia necesarã întreținerii trebuie sã fie furnizatã de substraturile endogene. Din acest motiv, o ratã scãzutã a metabolismului endogen poate ajuta la prelungirea vieții unui organism în condiții precare. Bacteriile care au cea mai mare capacitate din punct de vedere al longevitãții s-au dovedit a fi de dimensiuni reduse în comparație cu ramurile dezvoltate în laborator şi cu rate ale metabolismului considerabil mai scãzute. Aceastã caracteristicã de metabolism scãzut este împãrtãşitã cu sporii ce manifestã o bunã capacitate de supraviețuire şi au o ratã a metabolismului abia detectabilã. Ipoteza este cã aceste rãspunsuri la condiții precare de viațã reprezintã strategii de supraviețuire a bacteriilor în mediul marin şi cã abilitatea de a manifesta asemenea reacții aduc bacteriilor un avantaj selectiv.

De vreme ce substanțele dizolvate organice sunt prezente în ocean în concentrații de numai câteva micrograme de carbon per litru, celule mici şi rotunde pot însemna o stare morfologicã şi fiziologicã normalã în acest mediu. Anumite specii par sã deținã informație geneticã necesarã pentru a face fațã la perioade prelungite de condiții de nutriție redusă, tipic celei întâlnite la bacteriile din ocean(Carlucci, 1974).

Un fenomen de „rotunjire” precum şi o scãdere concomitentã în volum la expunerea inițialã la condiții lipsite de compuşi nutritivi. Fenomenul de „rotunjire” la specia Vibrio a fost

38

remarcatã prin faptul cã celule mici au fost observate adaptându-se la condiții precare impuse de mediul natural.( Guelin, 1979; Felter, 1975)

Schimbãrile morfologice ce au loc în interiorul celulei atunci când unele celule se „rotunjesc” şi scad în volum au fost raportate ca fiind rãspunsuri fiziologice tipice ale unor bacterii la expunerea la condiții de absențã a nutrienților. a afirmat cã bacteriile mici de formã ovalã, observate în general în sisteme naturale prin microscopie, reprezintã forme latente în dezvoltarea târzie, ca rãspuns la condiții fizice sau chimice ale mediului. Deşi este o explicație acceptabilã, aceasta poate fi extinsã, si se poate afirma cã este o formã „latentă” , asemenea sporulãrii pentru bacterii ce nu formeaza spori(Stevenson, 1978).

În largul oceanului mediul este în permanențã oligotrof, cu perioade foarte scurte de aport de nutrienți, astfel celulele bacteriene se vor comporta conform timpului petrecut într-un astfel de mediu. În timp ce celulele cu expunere recentã la un anumit tip de mediu pot avea o reacție mai conservativã la condiții de absențã a nutrienților, acelea cu expunere îndelungatã la acelaşi condiții vor aborda strategii mai extreme pentru supraviețuire. Existã multe mecanisme ce permit supraviețuirea în ,sistemele naturale instabile, şi totuşi fluctuații ale numãrului de bacterii în sistemele acvatice naturale asociate cu distribuția geograficã şi sezonierã aratã tipare consecvente ce coreleazã cu parametrii fizici şi chimici. Aceste tipare sugereazã cã bacteriile existã în formã latentã în anumite perioade ale anului. Acestea însã rãmân viabile şi atunci când condițiile sunt oportune, bacteriile se întorc la forma în care se pot reproduce.

39

CAPITOL IV. Evaluarea structurală și funcțională a microbiotei

4.1. Prelevarea probelor și montarea experimentului – conceptul de microcosmos

Am prelevat proba naturalã din zona Portul Tomis. Ulterior, proba din Bodengreifer a fost transferatã în sticlã de polietilenã (PET) consideratã de noi ca microcosmos ( am adus-o în laborator timp de o sãptãmânã). Apoi experimentele vizate de noi au urmãrit fracția bacterianã de la interfațã sediment-apã).

Mostre de apã au fost colectate în Martie 2014 din Marea Neagrã (la o adâncime de 0.5 m; portul Tomis, 44o10’44’’N; 28o39’32’’E) ce au fost folosite pentru ansamblul de microcosmos realizat în sticle transparente de polietilenã. În experimentul nostru, microcosmosul format cu ajutorul unui volum de 300mL de apã de mare naturalã şi sedimente au fost menținute la o temperaturã de 18 oC şi iluminat artificial timp de o lunã (din Martie până în Aprilie).

Fig.4.1: Fig.4.2:

Au fost realizate douã tipuri de microcosmosuri: Au fost realizate trei tipuri de microcosmosuri: eşantion cu apã din Marea Neagrã ce va servi drept control (M3); control suplimentat cu benzinã (0.5% v/w) (M2) şi eşantionul de control suplimentat cu benzinã (0.5% v/w) şi nutrienți (nitrat de amoniu) (M1). A fost folosit şi un filtru Milipore de 0.45 µm.

Fig.4.3: Fig.4.4:

Astfel vom avea 2 microcosmosuri din care vor fi 4 recoltări (subprobe) la 1,14,30,50 zile. În ultimii doi ani, s-a experimentat cu mictocosmosuri de mãrimi intermediare, ce se intenționeazã a tine locul unui ecosistem marin de coastã. Microcosmosurile conțin comunitãți

41

cuplate planctonice şi bentonice, şi au fost administrate şi eşantionate intensiv şi continuu pentru mai bine de un an (C.A. Oviatt, H. Walker and M.E.Pildon, 1989)

În studiul întregilor ecosisteme, nu a fost încã posibilã realizarea unor mãsurãtori singulare sau alte metode acceptate pentru a compara condițiile şi stãrile ecosistemelor. Fiecare ecosistem este un complex de mai multe variabile şi procese ce se schimbã în timp.

Abordarea cu microcosmosuri este relativ nouã, şi nu au fost dezvoltate criterii adecvate ce pot fi utilizate pentru a evalua starea acestor ecosisteme închise. Existã tendința de a se cãuta tipare similare în ciclul sezonier al diferitelor variabile pentru a considera posibile similitudini holistice, dar nu se cunoaşte o modalitate exactã de a defini aceste similaritãți.

În primele experimente cu microcosmosuri a fost folositã analiza multivariatã pentru a studia cum un set de variabile cu o interacțiune complexã între ele poate fi redus la un numãr mai mic de dimensiuni expunând diferențele în comportamentul microcosmosurilor, şi diferențe între comportamentele microcosmosurilor şi cel al sistemului natural (Oviat et all, 1977, Oviatt et al., 1979, Pilson et. Al., 1979).

Valoarea experimentalã a microcosmosurilor a fost documentatã (Whittaker, 1961; Gorden, 1969, Wilhm, 1970; /ferens&Beyers,k 1972; Kersting, 1975, Cooke, 1977, Reed, 1978; Bryfogle&McDiffett, 1979; Giddings&Eddlemon, 1979).Microcosmosurile, în general, nu modeleazã ecosisteme specifice dar mai degrabã simuleazã sub condiții de laborator anumite proprietãți fundamentale ale sistemului natural ca şi metabolsim de comunitate, interacțiuni la niveluri trofice, succesiune de comunitate, mineralizare nutritivã şi reciclare şi stabilitate. Aplicațiile abordãrii cu microcosmosuri la sisteme acvatice nu numai ajutã la înțelegerea mai profundã a acestor procese ecologice dar în acelaşi timp faciliteazã manipularea experimentalã ceea ce nu este controlatã cu uşurințã în sistemul natural. În plus, este studiat un sistem ecologic, cu toate cã este artificial şi mai complex decât echivalentul natural.

În prezentul studiu, a fost fãcutã o încercare de a realiza un microcosmos acvatic autonom? (self-maintaining) Dinamica populației şi interacțiunile la nivelul trofic descriu caracterul biologic al sistemului. Comportamentele nutriționale au fost monitorizate cu ajutorul unor analize chimica standard şi tehnici de urmãrire radio (radiotracer).

Proiectul microcosmosuluiMicrocosmosul (figura 4.1) este modelat dupã proiectul multicomportamental şi de

dimensiuni mari al lui Ringelberg&Kersting (1978). Trei nivele trofice sunt separate fizic dar totuşi conectate printr-un flux continuu prin întubare Tygon (7.9 mm). Este menținut un debit de 350 ml h−1. Ratele de diluare corespunzãtoare pentru unitãți erbivore, alge şi de descompunere sunt 22.4 zile, 0.9 zile şi 5.8 zile.

Fig.4.5. Microcosmosul: A=rezervorul autotrof; H= rezervorul erbivor; D= rezervorul de descompunere; P= pompã;

42

Unitatea de alge (190 litri) este amestecatã de o pompã centrifugã ce recirculã o parte din fluxul de fund. Turbulența de suprafațã este minimã. Unitãțile erbivore şi de descompunere baloane de sticlã de apã din polipropilenã inversate. O plasã nitex din rezervorul de erbivore (7.6 l) previne ca zooplanctonul sã intre în unitatea de descompunere. Rezervorul de descompunere (4.39 l) are un strat de 18 cm de pietriş nontoxic ce se comportã ca un substrat bacterian 17 oC sub o photocycle de 15:9 L:D. Douã lumini albe fluorescente ( de 15 şi 20 watt), la o distanțã de 24 cm, oferã unitãții de alge o iluminație de 538 μW cm−2 la suprafața apei. Unitatea erbivorã primeşte o iluminare în mod indirect de 68 μW cm−2. Unitatea de descompunere şi tubul de conexiune sunt ținute la întuneric total.

Inițierea microcosmosuluiMicrocosmosul a fost umplut cu un mediu definit chimic (Rees, 1979), o variantã modificatã

a mediului Woods Hole ( Nichols, 1973), cu un pH ajustat de 7.2. Nu au fost adãugate vitamine sau un buffer Tris( Jassby et al., 1977). Concentrațiile mediului de nitrogen şi fosfor au fost de 19μMşi respectiv 1.3 μM .

Bacteriile au putut coloniza substratul de pietriş de descompunere pentru douã sãptãmâni înaintea adãugãrii de alge şi zooplankton (Spott, 1979). Nu a fost fãcutã nicio încercare de a identifica aceste bacterii.

Metoda microcosmosuluiMicrocosmosul acvatic din acest studiu modeleazã prototipul de dimensiuni mari al lui

Ringelberg&Kersting (1978). Natura multicomportamentalã a ambelor sisteme faliciteazã starea de auto-întreținere prelungitã. Sunt asigurate mineralizare suficientã şi reciclarea nutritivã şi, în acelaşi timp, este prevenitã hrãnirea excesivã a erbivorelor. Se presupune cã mineralizarea se produce predominant în rezervorul de descompunere, la nivelul substratului de pietriş în particular., aşa cum a fost evidențiat de nivelurile mai scãzute de oxigen dizolvat şi pH fațã de nivelurile din celelalte douã unitãți, regenerarea evidentã a amoniacului şi ortofosfat, şi ocaziunal de niveluri ridicate de alcalinitate, concentrația carbonului inorganic dizolvat fiind un indicator al activitãții heterotrofice (Bruning et. al., 1978). Filtrul pune la dispoziție o suprafațã de dimensiuni mari, importantã, disponibilã pentru ataşarea bacteriilor, un factor important pentru nutriție ( Spotte, 1979). Un debit nedirecțional extras de sub substrat permite recilarea nutritivã. Hrãnirea excesivã a erbivorelor este prevenitã prin separarea nivelurilor trofice.

Un microcosmos delimiteazã spațial o porțiune reprezentativã a unui întreg ecosistem. În interiorul granițelor fizice, chimice şi biologice ale acestui mictrosistem, proceduri interente identificabile se produc în ecosistemul natural. Mineralizarea, reciclarea nutritivã, metabolismul comunitãții şi succesiunea, interacțiunea între nivelele trofice, şi transferul de energie sunt câteva din proprietãțile care susțin microcosmosul ca o subunitate ecologicã viabilã ce este mai maleabilã din punct de vedere al controlului şi manipulãrii experimentale. Înainte ca aceste microcosmosuri sã poatã deveni “cobaii” (Cooke, 1977) cercetãrilor acvatice, reprezentarea solidã a ecosistemului natural trebuie demonstratã. În prezenta investigație, în ciuda câtorva neajunsuri, tiparele biologice şi chimice caracteristice gãsite în naturã au fost evidente, susținând şi mai departe cercetarea potențialului microcosmosurilor acvatice.

Odum H.T. este recunoscut ca pionier în utilizarea ecosistemelor mici, închise şi deschise de predare în clasă. Aceste mici ecosisteme au fost adesea construite din acvarii sau sticle şi au fost denumite, microcosmosuri. Studiile lui Odum pe diferite microcosmosuri influenţat proiectarea biosferei (Beyers, 1964). Microcosmosul şi mesocosmosul sunt acvarii utilizate ca instrumente care să permită studiul experimental al ecosistemelor acvatice. Cercetările din ultimele decenii au demonstrat capacitatea de a efectua experimente pe modele funcţionale ecosistemului acvatic într-un laborator. Aceste microcosmosuri pot avea capacitatea de câţiva litri, când sunt vizate studii

43

asupra microorganismelor, până la acvarii de capacităţi mari daca se fac studii asupra unor comunităţi de organisme macroscopice (peşti, diferite nevertebrate, etc).

Din momentul când a fost descoperit rolul procariotelor heterotrofe în circuitul biogeochimic din ecosistemele acvatice şi capacitatea lor de supravieţuire într-un mediu extrem, au fost propuse diferite protocoale pentru a experimenta statusul lor fiziologic şi efectele la variabilele de mediu. Capacitatea microorganismelor de a degrada compuşi xenobiotici (sintetizaţi industrial) la compuşi ce nu prezintă pericol biologic, se încearcă a fi exploatată cât mai eficient şi constituie obiectul unor investigaţii ştiinţifice din ce în ce mai aprofundate (Head & all., 2006).

În experimentele noastre am utilizat microcosmosuri ca model experimental („ex situ”) pentru standardizarea unor metode de izolare şi cuantificare a bacterioplanctonului marin (cuantificarea / enumerarea bacteriilor din mediul marin natural şi contaminat cu hidrocarburi prin metode independente de creştere şi multiplicare celulară). Prin utilizarea acestor modele experimentale avem în vedere şi experimente de simulare în laborator privind atenuarea gradului de poluare utilizând microorganisme hidrocarbon-tolerante/oxidante (Medina-Bellver & all., 2005).

Modelul vasului propus de Williams & Lenton (2007) simulează un vas ce conţine un lichid neutru (matrice), în care este suspendată o populaţie microbiană. Compoziţia mediului lichid determină mediul microorganismelor. Anumite substanţe chimice prezente în mediu sunt numite „nutrienţi” ce pot fi consumaţi ca hrană şi convertiţi în biomasă, în timp ce alte elemente nu sunt consumate şi formează mediul abiotic. Mediul se presupune a avea proprietăţi, precum temperatura, pH, salinitate, etc, care pot afecta sau pot fi afectate de activitatea microbiană. Elementele neconsumate şi proprietăţile fizice ale mediului din vas, sunt denumite în continuare „factori abiotici”, pentru a se distinge de nutrienţi. Mediul lichid din fiecare vas se presupune că este bine omogenizat, astfel încât în absenţa unei perturbări, compoziţia mediului din fiecare vas va ajunge la o stare de echilibru. Microorganismele influenţează nivelul factorilor abiotici, cum ar fi, prin acţiunea produşilor lor metabolici proporţional cu cantitatea de biomasă formată.

Prin acestea rezumăm importanţa bioremedierii în ecologia microbiană care a permis identificarea anumitor populaţii microbiene eficiente în degradarea hidrocarburilor în mediile naturale. Pentru a cultiva microorganisme oligotrofe (care există în mediul natural), Button & all. (1993) au folosit apă de mare naturală (cu concentrație foarte mică de carbon organic) ca mediu, pentru a estima numărul microorganismelor (Gregori & all., 2003).

Numeroase studii care vizează procesul de biodegradare a hidrocarburilor din mediul acvatic, folosesc ca model experimental microcosmosul. De exemplu, Sayler & all. (1983) au utilizat microcosmosuri în acvarii de sticlă care conţin 13-15 cm sediment şi cca. 57 litri apă; aceste acvarii au fost ulterior menţinute la temperatura de 15oC păstrând un ciclu diurnal de lumină (12 ore). Alte studii care au vizat prelevarea de probe din mediu cu sistem maree, au fost concepute microcosmosuri cu o curgere a apei la fiecare 6 ore, sistemul de scurgere a apei fiind situat la1 m de la suprafaţa apei(figura 4.2).

Fig.4.6. Tip de microcosmos folosit pentru sisteme cu flux-reflux (Oviatt & all. 1980 )

44

Alt experiment, dezvoltat de Teira & all. (2007) a constat în utilizarea a 10 microcosmosuri constând în sticle PET de 5 litri, cu o deschidere largă, fiind ţinute la temperatura camerei în care în opt au fost adăugate hidrocarburi policiclice aromatice iar două menţinute ca martor. Experimente în care au fost utilizate astfel de microcosmosuri, au fost dezvoltate de numeroşi autori (Cragg and Fry, 1984; Elstad, 1986; Sanchez & all., 2006).

În diferite experimente au fost utilizate ecosisteme artificiale pentru a crea comunităţi microbiene capabile de a îndepărta poluanţi precum 3-cloroanilina (Swenson & all., 2000). Recent, s-a argumentat teoretic faptul că un caz cu selecţie multiplă poate avea un efect semnificativ în natură (Goodnight, 2005). Prezenţa în funcţionalitatea unui ecosistem a unor fenomene precum dependenţa metabolică şi circuitul nutrienţilor, înseamnă că selecţia ecosistemului se bazează pe diferenţe calitative ale grupului clasic de selecţie. Mediul reprezintă parte integrantă a unui ecosistem dinamic. Williams & Lenton (2007) au prezentat un model experimental de selecţie în cazul ecosistemelor artificiale de simulare a unui microcosmos bacterian experimentat în containere izolate. Ecosistemele selectate permit evoluţia interacţiunii comunităţilor microbiene cu mediul lor abiotic, cu selecţia asupra proprietăţilor sistemului biotic-abiotic. Modelul permite evidenţierea adaptării individuale şi presiunea selecţiei naturale generată de interacţiunile ecologice, pentru a fi incluse alături de selecţia ecosistemului impus artificial asupra comunităţilor din mediu abiotic. Aceste microcosmosuri ne ajută foarte mult în dezvoltarea unor protocoale de lucru care vizează punerea în evidenţă a anumitor dinamici a celulelor bacteriene în diferite condiţii de mediu, pentru a desluşi modul cum reacţionează această componentă importantă la factorii perturbatori care pot interveni în mediul natural, referindu-mă la poluarea cu diferite hidrocarburi în mediul marin, de exemplu.

Numãrul total de celule (AO; DAPI). Numãrul total de bacterii din eşantioanele naturale a fost calculat folosind colorația acridine orange (Luna et al., 2002; Lunau et al., 2005; Manini & Danovaro, 2006). Pentru fiecare eşantion procesat concentrația de fluorocrom a fost standardizatã (spre exemplu, pentru colorația AO au fost folositți între 20 şi 40 µl) în func în funcie de cantitatea de apã ce a fost filtratã.

Pentru AODC (numãrul direct de celule) au fost colorate subeşantioane timp de 5 minute şi au fost filtrate cu ajutorul unor filtre Milipore de 0.22µm. Filtrele de colorare au fost spãlate cu 10 ml de apã distilatã .

Este necesarã distingerea celulelor din punct de vedere al morfologiei deoarece fluorocromul este specific becteriilor.

Colorația acridine orange nu numai cã interacționeazã cu ADN-ul şi ARN-ul ci se şi uneşte cu alte componente celulare. Atunci când colorația AO se uneşte cu ADN, acesta este foarte similar din punct de vedere spectral cu fluoresceina, cu o excitație maximã la 502 nm şi o emisie maximã la 525 nm (verde). Atunci când se asimileazã cu RNA, excitația maximã se deplaseazã la 460 nm (albastru) şi emisia maximã se deplaseazã la 650 nm (roşu).Numãrul de celule moarte (PI+). A fost folositã colorația cu iodura de propidiu (eşantion de 5 μl/ml) pentru colorarea celulelor moarte în microcosmosul aflat în discuție. PI se impregneazã în membranã şi în general este exclusã din celulele vii. Atunci când este excitatã cu o luminã de lungime de undã de 488nm, acesasta capãtã culoarea roşie şi poate fi detectatã cu un filtru trece bandã de 562-588 nm. Eşantioanele au fost filtrate de un filtru Milipore cu porii de diminesiuni de 0,22µm şi vizualizate la un microscop epifluorescent (N-400FL, lamp Hg 100 W, 450-480 nm).

Numãrul de celule încapsulate (AB+). O fracțiune importantã a nivelului de polizaharide depistat în învelişul celuar al bacteriilor este împaãrțitã în bacterii marine libere şi bacterii asociate particulelor (Heissenberger et al., 1996) şi reprezintã bacteriile active (Stoderegger & Herndl, 2002). Alicotele recoltate din microcosmosuri au fost tratate cu colorația aniline blue (20 µg/ml concentrație finalã) timp de 5 minute şi filtrate cu filtru Milipore de 0,22µm.

Pentru toate fluorocromurile folosite în determinarea variatelor fracțiuni celulare a fost realizat un control la fiecare 20 de sectoare, dupã care am determinat numãrul de bacterii prin procesare electronicã a imaginilor fotografice ale fiecãrui sector.

45

Filtrul Milipore a fost poziționat la scurt timp pe suportul microscopului. A fost folositã o cantitate micã de ulei de imersiune a fost plasat deasupra filtrului. 4.2. Metode microscopice utilizate pentru distingerea fracțiilor celulare vii-moarte

”Microbii” sunt organisme importante ce îndeplinesc procesul de transformare din materie organicã în soluri sau medii acvatice. Ei reprezintã punctul central al analizei în domeniile respirației solului, mineralizãrii, emisiilor de gaze, sau veriga troficã foarte importantã numitã şi bulca microbianã. Analizele asupra activitãții microbiene au devenit proceduri standard în diferite programe de monitorizare a mediului în agriculturã şi biotehnologie, tratare de deşeuri, monitorizarea poluãrii sau proiecte de remediere. Acestea adesea includ analize detaliate asupra comunitãților microbiene, concentrandu-se asupra diferențelor dintre organisme individuale, forme de creştere, clase de mãrimi, semnãturi metabolice sau alte proprietãți ecologice speifice ce sunt legate de parametrii ce descriu activitatea microbianã, sãnãtatea solului sau alte caracteristici proprii ale solului. În acest context, numãrul şi biomasa microorganismelor (bacterii, drojdii, fungi, cianobacterii, alge, protozoare), precum şi descrierea şi monitorizarea microorganismelor sunt cerințe primordiale în înțelegerea proceselor microbiologice, astfel ele fiind în misiunea de cercetare ecologicã.

S-a pus mult accent pe determinarea diferențelor între celulele active şi cele în stare latentã, sau în distingerea celulelor vii de cele moarte. Unele din aceste abordãri presupun determinarea fercvenței de diviziune (fdc), determinarea creşterii active, determinarea celulelor ce respirã cu ajutorul celulelor ce reduc tetrazoliu, monitorizarea asimilãrii de substanțe etichetate C❑

14 de cãtre micro-autoradiografie, parțial cu ajutorul tehnicilor epifluorescente, sau determinarea ratelor de creştere şi producțiilor de biomasã prin mãsurarea micro-coloniilor.

Vizualizarea microorganismelor în general necesitã proceduri de colorare. Contrastul celulelor bacteriene în condiții de iluminat normale este prea scãzut pentru a le distinge de un fundal luminat, procedeu şi mai dificil în cazul apei. Existã o serie întreagã de coloranți şi modalitãți de colorare. Aceastã afirmație este adevãratã în special în cazul coloranților fluorescenți a cãror folosințã a crescut enorm de la introducerea sondelor moleculare în ecologia microbianã. Tehnicile din ziua de azi preferã coloranții fluorescenți deoarece prezintã o sensibilitate mai mare, spre exemplu DAPI sau acridine orange (AO). Deşi aceste tehnici sunt dedicate detecției bacteriilor, au existat mai multe încercãri de a se folosi şi asupra fungilor sau drojdiilor.

4.2.1. Colorația acridine orange (număr total)Acridine Orange manifestã o afinitate crescutã pentru organite acide. Poate fi folosit în

colorarea eucariotelor şi procariotelor deopotrivã. AO nu numai că se intercaleazã între ADN şi ARN dar şi se uneşte cu alți consituenți celulari, ca de exemplu detritus şi argilã. Colorantul ia culoarea verde fluorescent atunci când e fixat în ADN. AO este un colorant cationic, ce se absoarbe în mod normal la argilã încãrcatã negativ, compuşi din clei vegetal, polizaharide acide, glicozaminoglicani (mucopolizaharide), lipozomi sau fosfolipide încãrcate negativ. Astfel, un factor important pentru fluorescențã pare a fi valoarea pH-ului. Acesta poate face diferența între celulele vii şi cele moarte. Aceastã analogie a fost atribuitã diferitelor culori fluorescente prezente (verde şi roşu) în momentul în care se fixeazã în ADN şi ARN. A fost demonstrat faptul cã celulele în fazã latentã prezintã fluorescențã verde, iar cele active prezintã fluorescențã roşie. Mai mult, a fost posibilã distincția între sporii viabili şi cei ce nu mai sunt viabili şi s-a efectuat monitorizarea activitãților fiziologice.

AO şi DAPI sunt cei mai folosiți coloranți pentru calcularea numãrului total de bacterii în eşantioane de sol sau apã. Numãrarea microorganismelor este mai dificilã în sol decât în apã din cauza prezenței particulelor de sol şi altã colorare puternicã de fond nespecificã. Folosind microscopul confocal cu laser şi analiza automatã a imaginii, au fost comparate diferite metode. S-au observat diferențe majore în folosirea colorantului AO, FITC şi DTAF. Au fost raportate colorãri

46

de fond puternice cu AO a unui sol ce avea o concentrație mai mare de argilã şi lut decât nisip. De asemenea, s-a constatat o colorare de fond puternicã folosind şi DAPI, iodura de propidiu, iodura de etidiu, fapt ce se poate datora structurii lor cationice. Coloranții ationici FITC şi DTAF au afişat o colorare de fond mult mai puțin perceptibilã şi imagini cu un contrast bun. DTAF are o puritate mai ridicatã fațã de FITC.

Numãrul total de bacterii din eşantioanele naturale au fost determinate folosind acridine orange orange (Luna et al., 2002; Lunau et al., 2005; Manini & Danovaro, 2006). Pentru fiecare eşantion procesat am standardizat cu concentrație de fluorocrom (de exemplu, pentru vopseaua AO a fost folositã între 20 şi 40 µl) dependentã de eşantionul filtrat.

Pentru AO (concentrațiile finale de vopsea fiind de 5 μg/ml) au fost colorate subeşantioane (reprezentând cele patru recoltãri) tip de 5 minute şi apoi au fost diltrate pe Milipore negru cu mãrimea porilor de 0.22µm. Filtrele au fost apoi curãțate cu 10 ml de apã distilatã.

Este necesarã diferențierea celulelor din punct de vedere al morfologiei pentru cã niciun fluorocrom nu este cu adevãrat specific bacteriilor.

Colorantul AO nu numai cã se îmbinã cu AND-ul şi ARN-ul, ci şi cu celelalte componente celulare. Atunci când AO se uneşte cu AND-ul, este foarte similar fluoresceinei, cu o excitație maximã la 502 nm şi o emisie maximã la 525 nm (verde). Atunci când se asociazã cu ARN-ul, excitația maximã se schimbã la 460 nm (albastru) iar emisia maximã la 650 nm (roşu).

Probe M1 (densitatea celulelor /mL) M21 zi 5,65 x 103 4,98 x 103

7 zile 7,1 x 103 5,42 x 103

14 zile 7,56 x 103 6,32 x 103

20 zile 9,98 x 103 6,15 x 103

Tabel 4.1 Numãrul total de celule

1 zi 7 zile 14 zile 20 zile0

2

4

6

8

10

12

M1M2

Fig 4.7 Evoluția în timp a microbiotei la nivelul sedimentelor între martor și proba poluată

Măsurătorile s-au efectuat utilizând o grilă oculară calibrată anterior tipului de microscop (suprafaţa 0,01mm2), iar imaginile digitate au fost supuse analizei automate pentru numărarea bacteriilor (cu programul CellC).

47

Fig.4.8:

Fig. 4.9. Calibrarea grilei ocularului: latura pătratului mic este de 10 μm

T=NAfaV unde:

- T- număr bacterii per unitate de volum;- N- număr bacterii per aria graticulei; - Af- aria de filtrare; - V-volumul probei filtrate; - aria graticulei;

Etalonarea pătratului grilei de măsurare s-a făcut astfel:10 x10 : 1000μm x1000μm / 10 x 20: 480 µm x480µm10 x 40: 260 µm x 260 µm9 x 100: 100μm x 100μm- adică 10.000 μm2 10 x 100: 100μm x 100μm- adică 10.000 μm2

A B Fig.4.10. Imagine din camp microscopic A-martor; B- proba poluată (colorație AO)

48

Se observă un număr mai mare de celule în martor comparativ cu proba poluată deoarece impactul poluantului la nivel de sediment este mult mai mare afectând microbiota prin reducerea densității celulare. Acest aspect reiese și din calculul creșterii procentuale descris la subpunctul 4.5.

4.2.2. Colorația aniline blue (celule cu capsulă)Bacterioplanctonul este principalul mediator în transformarea carbonului organic în biomasã

şi dioxid de carbon(Azam & Cho 1987) . Astfel, bacterioplanctonul joacã un rol principal în lanțul trofic din ocean, direcționând o parte considerabilã a producției de fitoplancton (planctonul vegetal) în veriga troficã microbianã. Abundența si productivitatea bacterioplanctonului rãmân relativ constante pentru o razã întinsã a sistemelor acvatice s (Cole et al. 1988, Ducklow & Carlson 1992). Aparent, respirația bacterianã este şi mai constantã fațã de producție sau abundențã, ducând la o eficiențã în creşterea numãrului de bacterii de la sisteme oligotrofice la eutrofices (Del Giorgio & Cole 1998).

Bacteriile cu o structurã intracelularã intactã, considerate aşadar bacterii potențial active, sunt învelite într-un un strat capsulat, în vreme ce marea majoritate a celulelor cu o structurã intracelularã deterioratã nu prezintã o astfel de capsulã e (Heissenberger et al. 1996). Astfel, se presupune imediat cã bacteriile cu metabolism activ prezintã un strat de încapsulare, în vreme ce bacteriile inactive se elibereazã rapid de capsulã. Bacteriile active îşi reînnoiesc în permanențã învelişul capsular şi elibereazã o fracțiune destul de mare din stratuul polizaharidic în apa ce constituie mediul înconjurãtor. Aceste polizaharide derivate din capsulã ce sunt eliberate în apã s-au dovedit a fi foarte rezistente la utilizarea ulterioarã de cãtre bacterii (Stoderegger & Herndl 1998).

Metoda de colorare ce este folositã în cazul celulelor cu capsulã este de regulã o metodã de combinare a douã tehnici de colorare, unde celula bacterianã este coloratã cu un colorant bazic şi fondul cu un colorant acid, lãsând capsula necoloratã. Aceastã metodã de colorare „negativã” a permis distingerea între bacteriile cu capsulã şi cele fãrã capsulã în cazul în care dimensiunile capsulei depãşesc 150nm în diametru. Capsulele sunt clar vizibile ca o aurã albã (necoloratã, transparentã), în jurul celulei bacteriene.

Nu a fost gãsitã nicio legãturã între dimensiunea bacteriilor şi prezența capsulei în cazul bacterioplanctonului natural. Chiar şi cele mai mici bacterii sunt capabile sã dezvolte o capsulã suficient de mare încât sã poatã fi vãzutã folosind microscopie opticã.

În continuare vom trece datele obținute de noi în probele recoltate pe colorantul AB. Apoi interpretarea datelor.

4.2.3. Colorația cu iodurã de propidiu (celule permeabilizate)Iodura de propidiu este un colorant roşu fluorescent ce coloreazã ADN-ul atât la celule

procariote cât şi la eucariote. Are o eficiențã crescutã şi este cunoscut drept un indicator al celulelor moarte. Datoritã puterii sale de a se fixa de ADN, este folosit de asemenea pentru determinarea concentrațiilor de ADN din sol. Acestea nu se fixeazã de pereții celulelor sau de materiale inerte, astfel putând fi folosit la colorarea în materiale complexe cum ar fi solurile cu o concentrație ridicatã de argilã sau nãmol. Membranele au permeabilitate scãzutã la iodura de propidiu.

Detecția celulelor şi obținerea informației cu privire la activitatea acestora sau la proprietãțile fiziologice sau taxonomice au atins o importanțã destul de majorã în ecologia microbianã. Dezvoltarea echipamentelor cu ajutorul cãrora a devenit posibilã diferențierea celulelor vii de cele moarte, obținerea caracteristicilor structurii peretelui sau alte proprietãți, a permis îmbunãtãțirea numãrului de instrumente capabile în ecologia microbianã. Detecția simultanã a celulelor moarte şi vii a devenit posibilã prin folosirea coloranților ce se bazeazã pe diferențele între permeabilitatea pereților celulelor a substanțelor organice. Colorantul nucleic verde SYTOX trece de pereții celulari ai celulelor Gram-pozitive şi Gram-negative, dar nu poate penetra pereții celulelor vii. Excitația poate fi efectuatã de luminã la 470-490 nm; bacteriile moarte capãtã o culoare verde aprins. Coloranții SYTOX oranj şi SYTOX albastru pot genera alte culori.

49

Celulele vii sunt de asemenea impermeabile la coloranți pe bazã de cianuri dimer sau monomer. Aceşi coloranți au aplicații pentru cianobacterii, bacterii şi chiar virusuri. Sunt folosiți de exemplu pentru colorarea Gram a bacteriilor, datoritã penetrãrii uşoare în majoritatea celulelor, dar concentrația finalã din interiorul celulei depinde de capacitatea lor de asimilare. Acestea se fixeazã de asemenea şi de acizii nucleici.

Am folosit iodura de propidiu ( eşantioane de 3,3 şi respectiv 5 μl/ml) pentru coloranmrea de celule moarte din microcosmosul nostru. Iodura de propidiu este nu poate pãtrunde de membranã şi va fi în general exclusã din celulele vii. Când este excitatã de o luminã de lungime de undã de 488 nm, devine fluorescentã de culoare roşie şi poate fi detectatã cu un filtru trece-bandã de 562-588 nm. Eşantioanele au fost filtrate de un filtru Milipore cu pori de mãrime 0,22µm şi vizualizate la un microscop epifluorescent (N-400FL, lampã Hg 100 W, tip de filtru albastru, 450-480 nm).Cu privire la numãrul de celule moarte obținute dupã colorarea cu iodurã de propidiu (figura 4.6) , a fost obținut un numãr relativ scãzut de celule moarte raportate la numãrul total.

Celulele colorate cu iodura de propidiu s-au distins de celelalte categorii celulare prin fluorescenţa roşie, care pătrunde doar în celulele a căror membrană plasmatică şi-a pierdut, permeabilitatea selectivă (Manini şi Danovaro, 2006; Falcioni şi colab., 2008).

M1 M20

0.10.20.30.40.50.60.70.8

nr. c

ell /

ml

Fig.4.11. Numãrul total de celule moarte pentru ambele eşantioane

probe M1 (densitatea celulelor /mL) M21 zi 0,54 x 102 0,59 x 102

7 zile 0,50 x 102 0,47 x 102

14 0,52 x 102 0,68 x 102

20 0,61 x 102 0,76 x 102

Tabel 4.2. Numãrul de celule permeabilizate

Numãrul total de celule moarte sunt 0.0061 % pentru M1 şi respectiv 0.012 % pentru M2 din numãrul total de celule.

A B

Fig. 4.12. Aspecte microscopice A- martor, B- proba poluată (colorație ioduca de propidiu)

50

4.3. Determinarea numărului de microorganisme folosind softul CellC

Analiza automatã a imaginii pentru epifluorescențãCalculul numãrului de celule a fost realizat folosind douã softuri de imagine digitalã pentru

maãsurarea dimensiunilor unei celule ( CellC şi Image J soft). În literaturã se menționeazã cã este necesarã cuantificarea a cel puțin 400-600 de celule pentru fiecare filtru; acest numãr de celule a fost transformat în celule/mL folosind ecuația clasicã. (Fry, 1990; Sherr et al., 2001), folosind un dispozitiv dreptunghiular calibrat (calibrated square eye piece), (suprafațã 0.01mm2). Calibrarea la scarãa fost realizatã ținându-se cont de dimensiunile dispozitivului/obiectivului şi de cantitatea de apã filtratã, necesarã pentru identificarea zonelor cheie luate în considerare fațã de aria totalã a filtrului (Millipore, filtru de 0.22µm ). În final se va face corecția pentru fiecare diluare a eşantionului.

Abordarea automatã nu numai cã va elimina necesitatea unei analize foarte lungi şi obositoare ci şi va permite biologiştilor sã mãsoare caracteristicile celulare ce nu reuşeau cu tehnicile standard (Sellinummi, 2008).

Microfotografiile realizate cu ajutorul camerei digitale Sony DSC-P200 (Cyber-shot, 7,2 megapixeli) au fost folosite pentru analiza automatã a imaginilor şi pentru calculul numãrului de celule heterotrofice (Selinummi et al., 2005), CellC fiind un software de analizã a imaginilor uşor de utilizat ce permite analiza multiplelor imagini digitale microscopice. (http://www.cs.tut.fi/sgn/csb/cellc/).

Figura 4.8 dezvãluie modalitatea de calcul automat al numãrului de celule cu ajutoarul software-ului CellC folosind imaginile digitale microscopice obținute expreimental în studiul microcosmosurilor.

Programul CellC poate realiza totodatã şi segmentarea şi analiza imaginii de calcul al numãrului total, şi apoi segmentarea celulelor din fundal şi extragerea grupurilor de celule individuale (Selinummi et al., 2005).

A. B.

Fig. 4.13. Un exemplu de imafini sin programul CellC, cu bacterii din microcosm2 unde s-a adãugat colorantul AO (A); Analiza numãrului total de celule din panoul A folosind software-ul CellC (B)

Programul Image J este al doilea software folosit în mãsurarea automatã a proprietãților celulelor (mãrime, formã, analiza imaginilor microscopice pentru determinarea numãrului de celule).

Programul Image J prezintã abilitatea de a susține funcții standard de procesare a imaginilor digitale şi de asemenea poate face modificãri precum scalarea geometricã, rotație, etc. Imaginea poate fi astfel mãritã pânã la o scarã de 32:1 sau micşoratã pânã la 1:32. Programul suportã un numãr limitat de imagini, proporțional cu memoria disponibilã. Calibrarea dimensionalã a spațiului poate oferi mãsuratorile în diferite unitãți de mãsurã: pixeli, milimetri, micrometri, (figura 4.9).

51

http://www.cs.tut.fi/sgn/csb/cellc/

Pentru studiul bacteriilor heterotrofice din imagini, a fost folosit programul ImageJ pentru mãsurarea celulelor şi a statisticilor bazate pe pixeli definite cu ajutorul selectiilor fãcute de utilizator, realizând histograme de densitate şi grafice liniare, suportã funcții de procesare a imaginilor cum ar fi modificarea constrastului, detecția de margini, filtrare, etc.

Fig. 4.14. The Image J spațiul de calibrare dimensionalã

Combinarea celor douã programe ne ajutã sã stabilim numãrul corect de celule din eşantioanele naturale, prin separarea cu succes a celulelor cu ajutorul programului ImageJ şi apoi efectuarea calculelor automate cu programul CellC, obținând astfel numãrul de celule.

4.4. Măsurarea cantității de azot și fosfor din microcosmosuri

Mãsurarea nitrogenului şi fosfatului din trei microcosmosuri. A fost folosit metoda himicã Hach Lange pentru determinarea totalului de nitrogen şi fosfatului. Eşantioanele examinate (apã de mare) şi reagenți vor trebui aduşi la temperatura camerei (15-25oC) pentru a obține valorile corecte. Rezultatele pentru nitrogeni au fost citite de Spectophotometric DR 2800, o lungime de undã de 345 nm iar pentru fosfat au fost citite 890 nm.

Testele biochemicale au fost efectuate pentru a observa cantitãțile de nitrogen şi fosfat parțial consumate de fiecare microcosmos.

Principiul metodei biochimice pentru determinarea fosfatului constã în urmãtorul proces: ionii reacționeazã cu fosfatul şi ioni molybdate intr-o soluție acidã antimonil formând un complex antimonil fosfomolibdic ce va fi redus de acidul ascorbic în fosfomolibden albastru. De asemena, principiul metodelor pentru determinarea totalului de nitrogen este: nitrogen anorganic şi organic este oxidat pânã la nitrat prin digestia cu peroxodisulfat. Ionii de nitrat reacționeazã cu 2.6-dimetilfenol în o soluție de acid sulfuric şi acid fosforic pentru a forma nitrofenol.

4.4.1 Metoda de lucru Hach Lange pentru determinarea fosfatuluiIonii de fosfat reacționeazã cu ionii molibdat şi antimonil într-o soluție acidã formând un

complex antimonil fosfomolibdat, care este redus cu acid ascorbic la albastru fosfomolibden. Proba de analizat trebuie sã fie la temperatura camerei. Se îndepãrteazã cu grijã folia de pe capacul DosiCap Zip (cuveta este prevazutã cu un cãpãcel

ce conține o substanțã ce va reacționa cu proba noastrã de analizat). Se desfileteazã capacul DosiCap Zip . Adãugãm cu pipeta 0,4 ml probã. Înfiletãm capacul DosiCap Zip la loc. Agitãm energic. Se introduce la termostat HT 200 S , în programul standard HT timp de 15 min. În cuveta racitã , se adaugã cu pipeta 0,5 ml reactiv B . Înfiletãm un capac gri DosiCap C pe cuvetã. Agitãm cuveta de câteva ori. Dupã 10 min. mai agitãm de câteva ori , curãțãm bine exteriorul cuvetei şi măsurăm.

52

7 zile 14 zile1.1

1.15

1.2

1.25

1.3

1.35

M1M2

fosfat total

mg/

L

Fig. 4.15. Analiza în timp a consumului de fosfat din cele 2 microcosmosuri

4.4.2. Metoda de lucru Hach Lange pentru determinarea azotului totalAzotul legat anorganic şi organic este oxidat la nitrat prin digestie cu peroxodisulfat. Ionii de

nitrat reacționeazã cu 2,6 –dimetilfenol într-o soluție de acid sulfuric si fosforic pentru a forma un nitrofenol.

Compozitia chimicã privind reactivii. Conținutul cuvetei

Nr. CE Componente Greutate231-639-5 Acid sulfuric 60%

231-633-2 Acid fosforic, acid ortofosforic 33%231-791-2 Apã 7%

Tabel 4.3. LCK 338

Nr. CE Componente Greutate231-791-2 Apã > 98%215-185-5 Sodã causticã, hidroxid de sodiu < 2%

Tabel 4.4. LCK 338 A

Nr. CE Componente Greutate231-781-8 Peroxodisulfat dipotasiu, persulfat de

potasiu65%

231-891-6 Metaborat de sodiu 20%Tabel 4.5. LCK 338 B

Nr. CE Componente Greutate231-821-4 Sulfit de sodium > 70%247-852-1 Azida de sodiu < 0,7%

Tabel 4.6. MicroCap C

Nr. CE Componente Greutate231-791-2 Apã > 75%200-661-7 Propan-2-ol, izopropil alcool,izopropanol 20%209-400-1 2,6 xylenol < 1%

53

204-662-3 Acetat de izopentyl < 1%Tabel 4.7. LCK 338 D

Proba de analizat (apã rezidualã), precum şi reactivii trebuiesc aduşi la temperatura camerei (15-25 C) pentru obținerea unor valori corecte.

Într-o eprubetã de reacție uscatã adãugãm în succesiune rapidã 0,2 ml probã, 2,3 ml soluție A (LCK 338 A), 1 tabletã B (LCK 138/238/338 B).

Închidem imediat eprubeta de reacție şi nu amestecãm. Îl încãlzim imediat în termostatul HT 200 în programul standard 15 minute. Lãsãm sã se rãceascã pânã la temperatura camerei şi adãugãm un MicroCap C (LCK

138/238/338 C). Închidem eprubeta de reacție şi o agitãm de câteva ori pânã când conținutul este dizolvat

complet din MicroCap C şi proba nu prezintã precipitat. Picuram 0,5 ml din eprubeta de reacție cu eşantionul preparat în recipientul de testare. Picurãm apoi cu atenție 0,2 ml de soluție D (LCK 138/238/338 D). Închidem imediat recipientul şi rãsturnãm de câteva ori pânã se uniformizeazã. Lãsãm 15 minute sã reacționeze , curãțãm exteriorul cuvetei şi mãsurãm cu ajutorul

spectofotometrului DR 2800.

Notã specialã Dupã adãugarea reactivilor – soluția de hidroxid de sodiu A, tableta B, MicroCap C – eprubetele

de reactivi trebuiesc închise imediat. Eprubetele de reacție nu trebuie utilizate mai mult de 13 ori. Dupã utilizare se curãțã bine cu o

perie şi apa de la robinet, apoi se clãteşte cu apã distilatã fãrã azot.

7 zile 14 zile0

0.51

1.52

2.53

3.5

M1M2

azot total

mg/

L

Fig. 4.16.Analiza în timp a consumului de azot din cele 2 microcosmosuri

4.5. Calculul densitãții celulelor şi creşterea procentuală

Pentru a calcula aceşti parametri am folosit programul Image J pe un eşantion de 200 de celule; dimensiunile celulelor au fost convertite ulterior la biovolum (utilizând formulele de mai jos şi raportând în cele din urmă media pentru cele trei microcosmosuri), astfel în final putând să calculăm biomasa corespunzătoare (Bölter şi colab., 1993; Paul şi colab., 1999). Pentru a calcula biomasa bacteriană, pentru fiecare bacterie numărată, a fost evaluat /clasificat tipul morfologic al acesteia (coci şi respectiv bacili). Pentru fiecare celulă s-a măsurat diametrul şi lungimea prin raportare la grila micrometrului, utilizând analiza de imagine digitală. Volumul bacililor s-a calculat prin aplicarea formulei pentru un cilindru cu capete emisferice (Fry, 1990; Sherr şi colab., 2001; Popovici şi Ardelean, 2010):

V= π4

d2 x (l−d3 )

unde: - l= lungimea celulei;

54

- d=diametrul celulei;

Volumul cocilor s-a calculat aplicând următoarea formulă: V= πd3

6Ulterior volumul celular a fost convertit în biomasă celulară uscată utilizând formula propusă

de Loferer-Krössbacher şi colab., (1998): mu=435 xV 0 , 86 unde:

- mu=masa uscată (exprimată în femtograme);- V=volumul celulei (exprimat în micrometri cubi);

Biomasa uscată a fost calculată pentru fiecare celulă, după care am făcut media pentru fiecare clasă de mărimi în parte, pentru ca în final să aflăm media pentru fiecare microcosmos.

Am analizat în termeni de rată de creştere, numărul total de celule din microcosmosurile poluate cu hidrocarburi. Am ales să calculăm creşterea procentuală de la o recoltare la alta folosind media geometrică a creşterii procentuale, datorită faptului că nu este clar dacă toate celulele prezente în fiecare microcosmos sunt capabile de creştere celulară şi diviziune (Polyanskaya şi colab., 2008).

În tabelul 4.8. este reprezentată rata de creştere procentuală zilnică calculată în cele douã microcosmosuri utilizând datele obţinute prin coloraţia cu acridin orange.

Rata de creştere procentuală / ziM1 M2

7 zile 4,28 1,4714 zile 0,93 2,37

20 zile 5,33 -0,44

Tabelul 4.8. Rata de creştere procentuală zilnică calculată în cele douã microcosmosuri

Rata de creştere procentuală zilnică, a fost utilizată pentru a calcula media geometrică pentru primele 50 zile, rezultatele obţinute fiind următoarele: M1 (2,192); M2 (1,503).

În tabelul 4.9 este prezentată rata de creştere realizată după fiecare recoltare a probelor din cele douã microcosmosuri cu apă de mare filtrată.

Rata de creştere între recoltări

M1 M27 zile 125,7 108,84

14 zile

106,5 116,61

20 zile

132,0 97,31

Tabelul 4.9. Rata de creştere procentuală realizată între recoltări în cele douã microcosmosuri

Rata de creştere între recoltãri Rata de creştere (%) / 24hM1 M2 M1 M2

7 zile 125,7 108,84 4,28 1,4714 zile 106,5 116,61 0,93 2,3720 zile 132,0 97,31 5,33 -0,44

55

Tabel 4.10 Rata de creştere între recoltãri şi rata de creştere în 24 de ore pentru eşantioanele M1 şi rspectiv M2

56

CAPITOL V. Utilizarea nanocristalelor semiconductoare pentru vizualizarea microbiotei (490, 520 nm și 600 nm)

5.1. Proprietățile nanocristalelor semiconductoare

Nanocristalele semiconductoare aparţin unei clase intermediare, ce face trecerea între sistemele microscopice (atomi, nuclee, electroni) şi cele macroscopice (materiale masive), denumită mezoscopică pentru prima dată în 1981 de von Kampen. De aceea nu trebuie să mire faptul că întâlnim proprietăţi comune cu cele 2 mari categorii amintite mai sus. Astfel, nanocristalele păstrează structura cristalină a materialului din care provin, dar în acelaşi timp o dată cu micşorarea dimensiunilor şi confinarea cuantică a purtătorilor de sarcină, proprietăţile optice şi electrice se modifică în sensul asemănării cu atomii şi moleculele.

Putem observa o deplasare a spectrului spre albastru („Blue Shift”), o dată cu o mărire a dimensiunii benzii interzise şi apariţia nivelelor energetice discrete. În ceea ce priveşte proprietăţile electrice, adăugarea sau îndepărtarea unui singur electron (prin tunelare) din componenţa quantum dot-ului, începe să aibă efecte notabile, în plus intervenind şi o cuantizare a sarcinii (ca şi în cazul lumii în care se putea accepta sau ceda energie sub formă de cuante (fotoni) şi în acest caz unitatea de referinţă devine sarcina unui electron ).

Nu se poate face o tratare individuală a fiecărei proprietăţi fără a face referire la alta, existând o interdependenţă între acestea. De exemplu dimensiunea nanostructurii e direct legată de lărgimea benzii interzise; aceasta la rândul ei defineşte absorbţia şi emisia. Şi astfel un fenomen se va explica cu ajutorul altuia, în final rezultând o imagine de ansamblu asupra caracteristicilor quantum dot-urilor. Proprietãțile principale ale nanocristalelor constau în: Dimensiunea QD. Raportul Suprafaţă/Volum mare

Dacă dorim dimensiunea în sens strict vom considera doar miezul (core) şi stratul protector (shell). Aceştia au diametre e aproximativ 3-10 nm (minim – emisie albastră, maxim - roşu). Într-o abordare mai puţin strictă se consideră şi cei 1-2 nm ai stratului organic (coat).

Mai există şi o ultimă dimensiune, cea hidrodinamică, care consideră şi solventul aderat în timpul sintezei, ajungându-se la dimensiuni comparabile cu cele ale unei proteine.

În figura de mai jos (fig.5.1) se compară dimensiunile nanocristalelor cu agenţii de etichetare (markere) folosiţi în mod obişnuit şi alte structuri biologice ca bacterii sau celula animală.

Fig. 5.1.Dimensiunea nanocristalelor

57

Luând în calcul al treilea criteriu, nanocristalele au dimensiuni de la cele mai mici (albastru), la cele mai mari (roşu), între 10-20 nm. Ca referinţă sunt prezentate 2 proteine: proteina cu fluorescenţă verde (GFP - Fig. 5.1) şi ficoeritrina (pigment roşu) cu dimensiune mai mare.

În ceea ce priveşte raportul suprafaţă/volum în nanocristalele cu dimensiuni mici (D≅ nm), mai mult de jumătate din atomii constituenţi pot fi conţinuţi de parte exterioară a structurii. De aici importanţa mărită a suprafeţei de contact şi a proprietăţilor acesteia, în directă legătură cu producerea „trapelor” energetice şi fenomenelor e fotoluminescenţă.

Nivele discrete de energie. Densitatea de stări de energie Nivele discrete de energie sunt o consecinţă directă a fenomenului de confinare cuantică a

electronilor. Este întâlnit şi la gropile sau firele cuantice, dar aici cuantizarea are loc pe toate cele 3 direcţii după formula:

pentru cub: En=πℏ

2 m¿e

|k⃗|2 unde k⃗=nx k⃗ x+ny k⃗ y+nz k⃗ z este vectorul de undã;

m¿e−¿ masa efectivã;

ℏ−¿constanta Planck redusã;

pentru sferă: En , l=ℏ2

2m¿e

b⃗n ,l2

R2 unde R este raza sferei şi bn ,l zerourile funcției Bessel de ordin1

Variaţia benzii interzise(Eg) cu dimensiunea. Fenomenul de Blue Shift Una dintre caracteristicile principale ale unui semiconductor este lărgimea benzii interzise

(Eg – „Energy gap”) ce influenţează proprietăţile luminoase în mod direct. Aceasta poate fi controlată foarte precis prin varierea dimensiunii nanocristalelor. În cazul QD-urilor, ele fiind oricum foarte mici, adăugarea sau îndepărtarea unui singur atom se va concretiza într-o modificare sesizabilă a organizării la nivel energetic. Acest lucru nu este posibil pentru materialele semiconductoare masive, un atom reprezentând o cantitate infimă, de aceea ele au o BI fixă în general, ce nu depăşeşte 3 eV.

Dacă se foloseşte modelul quantum dot-urilor sferici se găseşte o dependenţă a BI invers

proporţională cu dimensiunea razei conform relaţiei En , l=ℏ2

2m¿e

b⃗n ,l2

R2 în care se înlocuieşte

m¿e →m¿

e−g=m¿

e m¿g

m¿e+m¿

g

, particula luată în discuţie fiind excitonul în acest caz.

În măsurarea benzii interzise se consideră recombinarea pentru stare minimă de energie (cea mai probabilă) şi pentru care e−¿ ϵ Ev ¿ şi e+¿ϵ Ec ¿ pentru care bn ,l=π

⇒Eg=ℏ2 π2

2 m¿e−g

1R2 , dacă se consideră E v referinţă sau

Eg=Ev+ℏ2 π2

2 m¿e−g

1R2 , faţă de nivelul energetic minim posibil.

Nanodot-urile fac trecerea de la atomi la macrosisteme. Ele preiau structura discretă de energii de la microsisteme şi păstrează benzile interzise din cadrul semiconductoarelor.

Distanţa dintre nivelele energetice (ΔE) şi valoarea Eg cresc o dată cu micşorarea dimensiunii quantum dot-ului care va avea banda interzisã mai mare decât a materialului din care provine.

Proprietăţi legate de fenomenele de absorbţie/emisie luminoasă Acestea sunt de fapt proprietăţile care aduc, atâta popularitate quantum dot-urilor şi nu neapărat

pentru că ar fi cele mai importante, dar deocamdată aplicaţiile care le folosesc au răspândirea cea mai mare. Şi acesta poate fi şi din cauza evidenţierii lor foarte uşoară. Aceste proprietãți vor fi discutate în detaliu în urmãtorul subcapitol 5.2:

- Excitarea luminoasă

58

- Absorbţia- Emisia- Fotostabilitatea. Fenomenul de fotodecolorare („bleaching”)

Biotoxicitatea nanocristalelorÎn legătură cu acest subiect au fost făcute numeroase cercetări [], care ne avertizează asupra

faptului că în urma expunerii la radiaţie UV, în soluţiile pe bază de apă pot avea loc oxidări care produc ionii de Cd+2 (toxici). Acest subiect va fi discutat în detaliu în subcapitolul 5.4.

5.2. Proprietăți legate de fenomenul de fotoluminescență

În cadrul fotoluminescenţei intervin trei procese: stimularea probei, absorbţia radiaţiei excitatoare, emisie luminoasă. În această ordine logică se vor prezenta şi proprietăţile remarcabile ce survin în cadrul fiecărui fenomen.

Fig.5.2 Cele trei procese ale fotoluminiscienței

5.2.1. Excitarea luminoasăUn material semiconductor are în general banda interzisă între 1 ÷3 eV . Datorită

miniaturizării se mai adaugă, în medie, un surplus de energie de aproximativ ∆ Eg≅ 1 eV . Suntem deci într-o gamă orientativă 1 ÷ 4eV . Între aceste limite trebuie să se situeze energia radiaţiei stimulatoare pentru a obţine emisie. Conform figurii urmãtoare ne situăm în zona spectrului vizibil şi ultraviolet apropiat:

Fig.5.3 Spectru electromagnetic în funcţie de energie

Spectrele de excitaţie sunt generate scanând spectrul de absorbţie în timp ce se monitorizează emisia pentru un singur maxim (lungime de undă). Se găseşte astfel lungimea de undă optimă pentru iluminare. Dacă analizăm spectrul de absorbţie (Fig.5.3) se observă prezenţa unui maxim în apropierea maximului de emisie şi apoi spre ultraviolet o creştere aproape exponenţială. În mod uzual pentru aplicaţiile comune se va folosi o sursă cu radiaţie ultravioletă, dar nu foarte depărtată de spectrul vizibil pentru a nu suprasatura probele (electronii pot absorbi o cantitate puţin mai mare de energie decât cantitatea necesară tranziţiei, surplusul transformându-se în energie termică sau vibraţie (fonon) transmisă reţelei cristaline).

59

Principalul avantaj al quantum dot-urilor în fața de structurilor obişnuite (e.g. pigmenţi organici) reprezintã faptul cã nanocristale cu dimensiuni diferite pot fi stimulate în acelaşi timp, cu aceeaşi sursă de excitaţie ultravioletă. De aici derivă: costul minim pentru sursele de radiaţie mult simplificate, efectuarea măsurătorilor simultane pe mai multe specii diferite (analize multiplex), în biologie: posibilitatea utilizării soluţiilor compuse care conţin mai multe tipuri de NC-le cu roluri şi afinităţi pentru diverse ţesuturi şi substanţe, observarea organelor fiind făcută în paralel, aceeaşi soluţie poate emite lumină din tot spectrul vizibil.

5.2.2. AbsorbţiaLegea generală care descrie fenomenul de absorbţie a fost găsită experimental şi

fundamentată teoretic de către Bouguer (1729). Se găsea o legătură astfel între cantitatea de lumină absorbită de proprietăţile materialului pe care-l străbătea.

Dacă se ia o probă spre analiză, se va observa că fiecare moleculă adăugată contribuie la mărirea cantităţii de lumină absorbită; din acest motiv eşantioanele concentrate sunt colorare mai intens decât cele diluate. Pe de altă parte dacă se pãstreazã constantă concentraţia şi se variazã doar volumul, absorbţia va creşte cu acesta. Combinând conceptele de absorbţie cuantizată pentru lungimi de undă discrete (specifice qd-urilor) cu efectele legate de concentraţie şi volum se poate scrie o relaţie pentru anticiparea cantităţii de lumină absorbită la o lungime de undă dată: A=α ∙ l ∙ c

O altă formă poate mai uşor de înţeles a legii Beer-Lambert este: I 1=I 0∙ 10−α ∙l ∙ c

Unde: A - absorbanțã; α - absorbtivitatea mediului sau coeficient de extincţie. Este proporţional cu numărul de

molecule absorbante din unitatea de volum şi invers proporţional cu lungimea de undă a radiaţiei ce străbate substanţa. (notat deseori şi cu ε). Coeficientul de extincţie este o măsură directă a capacităţii unei molecule de a absorbi lumină.

l - dimensiunea (lungimea, grosimea) stratului de soluţie străbătut de lumină ; c - concentraţia componentei care absoarbe radiaţia (a soluţiei) c; I 0 - intensitatea luminii incidente (asociată cu intensitatea maximă a luminii transmise pentru

apa distilată) ; I 1- intensitatea luminii transmise (emergente) ; T – transmitanţa;

Spre deosebire de spectrul uniform al materialelor semiconductoare masive, în cazul quantum dot-urilor spectrul de absorbţie apare sub forma unor suişuri şi coborâşuri, cu maxime din ce în ce mai pronunţate o dată ce ne deplasăm spre lungimi de undă mai mici.

60

Fig.5.4. Spectrul de absorbție

Figura 5.4. este preluată de pe site-ul celor de la Evident Technologies şi reprezintă spectrul de absorbţie al unui set de 6 eşantioane (6 spectre de absorbţie). Unităţile arbitrare pot fi: număr de tranziţii efectuate în urma excitării într-un interval de timp, intensitatea de lumină, etc. Este irelevantă unitatea de măsură pe ordonată, ceea ce interesează este alura spectrului.

Dacă s-ar fi reprezentat şi spectrul de absorbţie al materialului semiconductor din care provin respectivele nanoparticule, s-ar fi observat o deplasare spre lungimi de undă mai mici ale acestora din urmă.

Proprietatea nanocristalelor de a absorbi radiaţie într-un spectru foarte larg (absorbţia corespunzătoare materialelor din care provin se întinde pe o gamă mult mai restrânsă), se poate explica în felul următor: nivelele de energie în QD-uri sunt discrete; lumina absorbită trebuie să corespundă diferenţei de energie dintre cele 2 nivele implicate în tranziţie. În BV există electroni aflaţi în foarte multe stări energetice (degenerarea mare a nivelelor energetice datorită fenomenului e confinare cuantică → discretizarea energiei pe toate cele 3 axele). În BC există destule nivele libere, astfel încât este o probabilitate foarte mare ca o radiaţie cu energia mai mare decât lărgimea BI să găsească o combinaţie de nivele BV-BC cu diferenţa energetică potrivită.

O altă proprietate a nanocristalelor semiconductoare este mărirea probabilităţii de absorbţie a luminii cu adăugarea fiecărui atom (de Cd sau Se) conform Legii Bouguer - Lambert - Beer. Din moment ce anumite nanodot-uri pot avea în componenţă şi mii de atomi identici, absorbţia va deveni foarte mare. Coeficientul de extincţie poate ajunge până la valori de (105 ÷ 106 ) mol−1 ∙ cm−1. Informaţii ce se pot deduce cu ajutorul unui spectru de absorbţie:

măsurând deviaţia spectrului de absorbţie se poate calcula raza quantum dot-ului cu „modelul benzii hiperbolice” şi putem afla informaţii despre confinarea cuantică.

alungire considerabilă a spectrului în partea inferioară („tail”) ne dă informaţii asupra unei inomogenităţii pronunţate a soluţiei sau defecte la nivelul reţelei cristaline ala nanostructurilor, din cauze diverse ca dopare sau iradiere

Fig.5.5. Spectru de absorbţie al unei soluţii de nanocristale cu defecte

existenţa unor maxime ascuţite în spectrul de absorbţie reprezintă o absorbţie excitonică ce corespunde unei tranziţii de tip E v−Ec(nivelul inferior BV – nivelul superior BC). Tranziţiile ce implică nivele energetice superioare sunt rar întâlnit şi caracterizează mostrele extrem de pure.

5.2.3. Emisia Electronii ce au făcut tranziţia din BV→BC vor reveni, în mod natural după un scurt timp,

în BC. Altă tendinţă naturală este ca această trecere dintr-o stare în alta să se facă cheltuind o energie minimă. Astfel tranziţiile radiative dominante vor fi între nivelul minim al benzii de

61

conducţie (Ec) şi nivelul maxim al benzii de valenţă (E v) (denumite şi tranziţii 1s-1s sau 0-0), adică exact lărgimea benzii interzise (Eg). Dacă purtătorii de sarcină se află pe un nivel superior aceştia vor ajunge pe E v cedând energia suplimentară reţelei cristaline. Procese tocmai descrise definesc spectrul de emisie prezentat în figura de jos:

Fig.5.6. Spectru de emisie pentru CdSe

Analizând graficul se observă cã:

Spectrul de emisie nu prezintă maxime secundare.Aceasta se întâmplă din 2 motive: datorită efectelor cuantice emisiile de tipul 1s -1s sunt foarte eficiente şi domină celelalte

tranziţii. Componentele vibronice rămase sunt aşadar foarte slabe; nivelele vibraţionale existente sunt foarte apropiate de E v sau Ec, deci contribuţia lor nu va

lărgi foarte mult spectrul ; Spectrul de emisie este îngust (pentru considerarea unui eşantion cu maximum de omogenitate

realizabil - diferenţe între constituenţi de până la 4-5%) .Este o consecinţă a primei caracteristici prezentate. Qd-urile suferă totuşi o lărgire a spectrului, dar este de altă natură faţă de pigmenţii organici (tranziţii vibraţionale). Emisia de radiaţie este dependentă de mărimea nanocristalelor. În procesul de fabricaţie nu se pot obţine structuri perfect identice; chiar dacă diferenţele sunt foarte mici, spectrul unei mixturi va fi mai larg decât al unui singur constituent (1 qd emite o singură linie îngustă).

Se micşorează substanţial zonele de suprapunere a spectrelor vecine mărind performanţele în cadrul analizei de tip multiplex (metodă prin care mai mulţi parametrii sunt testaţi şi procesaţi simultan). Aşadar culori diverse pot fi folosite în acelaşi timp fără interferenţe;

În aplicaţiile medicale nanocristalele vor avea o senzitivitate mărită la stimuli diverşi; Un spectru mai îngust va da o culoare de saturaţie mărită, ochiul percepând o puritate, o

claritatea şi o intensitate mărită a culorii; Din punct de vedere cantitativ se emite mai multă radiaţie din următoarele considerente:

având un spectru îngust, se vor elimina sau în orice caz diminua foarte tare metodele (inexacte) de compensare a pierderilor de radiaţie. În plus fiind necesară o singură sursă de excitare, nu mai prezintă interes reglările adiţionale de intensitate;

în cazul coloranţilor organici tradiţionali, mare parte din lumina emisă era înlăturată datorită interferenţei maximelor secundare cu spectrul altor culori. În cazul Qd-urilor acest fenomen nu mai are loc;

se pot folosi filtre mai înguste cu performanţă mărită, ce pot rejecta mai bine „zgomotele” sau interferenţele fluorescente;

Uşurinţa separării spectrului de absorbţie de cel de emisie;

62

5.3. Fotostabilitatea nanocristalelor

Fotostabilitatea se referă de obicei la proprietatea nanocristalelor de a-şi păstra caracteristicile fluorescente cât mai mult posibil (chiar şi ore în anumite condiţii [], faţă de minute în cazul pigmenţilor organici). Perioada la care se face referire a fost numită în literatura de specialitate „fluorescence lifetime” („timpul de viaţă al fluorescenţei”) şi este un parametru important, considerat mai ales în aplicaţiile biologice de durată.

Fotodecolorarea reprezintă distrugerea fluoroforilor de către lumina intensă, diverse procese chimice, interacţiuni mecanice de suprafaţă sau variaţii ale ph-ului soluţiei gazdă. În microscopie acest fenomen îngreunează observarea moleculelor fluorescente deoarece chiar lumina folosită pentru excitare sau observarea diverselor zone, produce stricăciuni iremediabile. Astfel mostrele nu vor mai putea fi reexaminate mai târziu; de obicei procesul este ireversibil.

Ca măsuri se încercă o expunere mai mică a probelor prin baleiaj laser, o creştere a concentraţiei fluoroforilor, scăzând-o pe cea a oxigenului sau introducerea substanţelor cu rezistenţă mai mare la stimuli luminoşi (cum sunt Quantum Dot-urile).

Nanodot-urile sunt mai bune din toate punctele de vedere (fiind fluorofori aproape ideali): au stabilitate mai mare (aproape 100% în condiţii optime de lucru), senzitivitate mai mare, luminozitate mărită şi o siguranţă sporită în analize. Acestea sunt calităţile principale ce ies în evidenţă la o primă examinare.

O degradare uşoară poate apărea pentru excitare din zona ultraviolet (λ<300nm). Pe de altă parte se preferă acest „overcloacking”. Dacă se va iradia cu o lumină mai puternică va fi şi o intensitate mult mărită a emisie. Frecvent se acceptă aceste compromisuri pentru a îmbunătăţi calitatea; de fapt distrugerile structurale serioase apar pentru fascicule foarte intense de radiaţie stimulatoare.

Stabilitatea nanocristalelor este influenţată de foarte mulţi factori: contează în primul rând materialul din care sunt confecţionate, dacă sunt sau nu protejate de un strat suplimentar (shell) sau dacă prezintă conjugări cu molecule biologice. Trebuie luat în calcul mediul gazdă: în uzualele soluţii ce conţin apă, nanodot-urile ce au la suprafaţă tiol (pentru protecţie) pot experimenta instabilitate chimică în 3 etape: oxidare fotocatalitică a liganzilor din tiol, foto-oxidarea nanodot-urilor şi în final precipitarea acestora, ce duce la formarea unor aglomeraţii mai mari (clustere), ce îngreunează deplasarea sau penetrarea membranelor celulare. Cu toate acestea nanocristalele sunt o alternativă bună pentru înlocuirea tradiţionalilor pigmenţi organici, singurul lucru ce rămâne în discuţie fiind toxicitatea acestora.

5.4. Biotoxicitatea nanocristalelor

Datorită proprietăţilor remarcabile, nanodot-urile au început să fie folosite din ce în ce mai mult în aplicaţiile „in vivo”. Ambiguităţi cu privire la toxicitatea nanocristalelor vin din cauză că toxicitatea derivă din factori multiplii variabili cum ar fi: proprietăţile fizico-chimice, condiţiile de mediu (durata expunerii, intensitatea radiaţiei), dimensiunea, structura quantum dot-urilor, dacă sunt sau nu căptuşite (unele mostre s-au dovedit toxice doar după degradarea stratului protector).

Pentru o expunere de 30 min la aer sau iradiere îndelungată (2-8 ore), chiar şi o concentraţie de 0.0625 mg/mL a nanocristalelor în soluţie, este toxică.

”În prezent, toxicitatea potenţială, manifestată în anumite condiţii, exclude folosirea QD-urilor ca mobile în distribuirea medicamentelor (în organisme), deşi au un potenţial foarte mare mai ales dacă sunt aduse modificări la nivelul de suprafaţă” (Mihrimah Oykan, 2004).

Păreri recente ne aduc aminte că doar miezul (core) conţine cadmiu, restul de straturi adiţionale au rolul de a proteja organismul de eventualele pericole. Există exemple destul de clare care certifică faptul că funcţionarea normală a moleculelor nu a fost influenţată de marcarea lor cu nanocristale (celulele erau stabile şi după 12 zile de la dopare).

63

Cu privire la introducerea qd-urilor in organism aceasta se poate face în diverse moduri: injectare, fagocitoză sau mecanisme asemănătoare contaminării cu viruşi. Studiul eliminării lor este abia la început, în prezent. S-a observat însă că nanoparticulele sunt recunoscute imediat de către organism ca fiind străine şi se elimină prin căile excretorii primare (ficat, splină, sistem limfatic).

Cu toate că nu au fost făcute până acum cercetări numeroase pentru a determina toxicitatea faţă de organismul uman sau mediul înconjurător, se poate concluziona că aceste structuri nu sunt foarte toxice. Riscuri există totuşi în anumite condiţii.

5.5. Măsurători efectuate pe nanocristale CdSe/ZnS (490, 520 nm și 600 nm)

În urma colorației probelor cu cele două doturi cunatice am obținut urmatoarele date (tabel 5.1):

proba M1 M220 zile (la final de experiment)

0,24 x 102 0,43x102

Tabel 5.1 Valorile densității celulelor în urma colorării cu dot 490, și 600 nm

A B

Fig.5.7. A-dor 490 nm; B- dor 600 nm

Se observă faptul că densitatea numerică se apropie de numărul celulelor colorate cu iodura de propidiu, ceea ce ne face să deducem că aceste doturi pun în valoare fracia celulelor mosrte.

64

CAPITOL VI. Calculul tehnico-economic al procesului de bioremediere

6.1. Calculul economic al analizelor din laborator

65

6.2. Norme de protecţia muncii în laborator

Dotarea cu echipament individual de protecțieArt. 13. – Toți lucrãtorii din laboratoarele de analize fizico-chimice sunt obligați sã utilizeze echipamentul de protecție adecvat, conform "normativului cadru de acordare şi utilizare a echipamentului individual de protecție" emis de MMPS.Art. 18. - Cãile de acces ale laboratoarelor vor fi menținute libere şi curate, îndepãrtându-se imediat materialele şi scurgerile cãzute pe pardosealã.Art. 35. - La executarea lucrãrilor de laborator vor participa cel puțin douã persoane.Art. 41. - Este obligatorie acoperirea pãrului şi purtarea hainelor incheiate.

Tehnica de lucru în laboratoareArt. 91. - Toate analizele fizico-chimice de laborator trebuie sã fie executate cu cantitãțile şi concentrațiile de substanțe strict necesare, precis cântãrite sau mãsurate, şi cu repsctarea integralã a instrucțiunilor de manipulare şi a instrucțiunilor proprii de securitate a muncii.Art. 93. - Pentru lucrãrile cu cantitãți mici de substanțe (de ordinul a 2-5 mg) se vor folosi, de regulã, tuburi capilare închise la un capãt, în care introducerea substanțelor se va face cu o microspatulã sau cu o pipetã capilarã. Pentru ca substanțele sã ajungã la fundul tubului capilar, acestea se centrifugheazã.Art. 94. – Instalațiile utilizate la efectuarea de analize se vor monta înainte de a introduce în diversele lor pãrți componente, substanțele cu care se va lucra.Art. 98. - Lucrãrile cu substanțe nocive şi acizi concentrați sau de încãlzire a substanțelor toxice, în vas deschis, trebuie executate numai sub nişã, al cãrei tiraj se va verifica în prealabil, pentru ca sã corespundã gradului admis de toxicitate al substanțelor cu care se lucreazã.Art. 103. - Este interzis sã se lucreze cu substanțe necorespunzãtoare sau care nu sunt precis identificate şi a cãror compoziție nu este indicatã pe bazã de buletine de analizã.Art. 104. - Atunci când se lucreazã dupã o rețetã datã, aceasta trebuie aplicatã cu strictețe, fãrã nicio modificare sau improvizație.Art. 108. - Dacã se întrevede apariția unui pericol în una din fazele lucrãrii ce se efectueazã, executantul este obligat sã întrerupã lucrarea.Art. 110. - Pentru a mirosi o substanțã, gazul sau vaporii trebuie îndreptați spre manipulant, prin mişcarea mâinii, cu foarte mari precauțiuni, neaplecând capul deasupra vasului şi fãrã a inspira profund.Art. 111. - Eprubeta în care se încãlzeşte un lichid se va ține cu deschizãtura într-o parte şi nu spre operator sau spre altã persoanã; eprubeta se va încãlzi pe toatã suprafața ei.Art. 112. - Pentru încãlzirea vaselor de reacție cu becuri infraroşii, acestea din urmã nu se vor aşeza sub vas; ele se vor aşeza lateral.Art. 117. - Este interzisã deversarea conținutului aparatelor direct în rețeaua de canalizare sau evacuare a gazelor prin trompa de la canal, cu excepția cazurilor în care canalizarea este legatã la rețeaua de ape chimic impure. Înainte de deversarea în sistemul normal de canalizare, substanțele vor fi obligatoriu neutralizate.Art. 118. - Spãlarea aparaturii se va face imediat dupã terminarea lucrãrii de laborator, dar numai dupã ce s-a efectuat neutralizarea adecvatã; spãlarea se va executa numai cu solvenți specifici pentru impuritãțile respective. numai dupã 10 minute de la terminarea tuturor operațiilor de neutralizare şi spãlare se poate opri ventilatorul.

Principii de aplicare a metodologiei de lucruArt. 119. - Se interzice lucrul fãrã aparate de masurã, control, calitate şi precizie corespunzãtoare.Art. 120. – Toți compuşii organici care conțin carbon, hidrogen, oxigen şi azot trebuie manipulați cu grijã cu atât mai mare, cu cât procentul în oxigen şi azot este mai ridicat.Art. 122. - Se va evita în toate împrejurãrile, contactul cu combinații ca alcooli, esteri, hidrocarburi clorurate şi hidrocarburi aromatice şi alifatice, care acționeazã ca narcotice.

66

Art. 123. - Se va evita contactul epidermei cu amine, fenoli şi nitroderivați, în prezența acizilor concentrați şi a bazelor tari.Art. 127. - Toate substantele oxidante (apa oxigenatã, acidul cromic, permanganatul de potasiu, acidul azotic, acidul percloric, etc.) trebuie manipulate cu atenție; riscul se poate reduce prin diluarea lor cu apã. Se vor evita, pe cât posibil, reacțiile cu compuşi organici sau cu alte mijloace de reducere, sau se vor lua mãsuri deosebite.

Prelevarea probelor pentru analizeArt. 130. - Deplasarea la locul de prelevare a probelor se va face numai pe cãile normale de acces. Locurile de luare a probelor şi cãile de acces la ele trebuie sã fie bine iluminate.Art. 131. - Aparatura utilizatã pentru recoltarea probelor de analizã trebuie sã fie în stare perfectã: sondele sã fie rotunjite la capãt, sã nu fie crãpate, iar borcanele de probã sã fie curate, uscate şi sã aibã dop rodat.Art. 133. - Dupã caz, vasele în care urmeazã sã se ia probe la care existã pericolul formãrii amestecurilor explozive vor fi inertizate.Art. 138. – Recipienții cu probe se transformã în laborator cu mijloace adecvate (cãrucioare); sticlele şi borcanele se transportã aşezate în coşuri de protecție sau lãdițe speciale.Art. 140. - Verificarea nivelurilor în vase se va face cu ajutorul aparatelor de mãsurã şi control.

Manipularea aparaturii de laborator1. Aparatura acționatã electricArt. 252. - Aparatele electrice de încãlzit (cuptoare, etuve, bãi electrice etc.) trebuie aşezate pe mese protejate cu tablã de oțel şi foi de azbest.Art. 254. - Se interzice conectarea mai multor aparate electrice la o singurã prizã.Art. 256. - Se interzice folosirea aparatelor la care se observã scântei sau care prezintã scurtcircuite.Art. 258. - Se interzice manipularea cu mâinile libere neprotejate cu mãnusi electrizolante, a aparatelor şi a instalațiilor electrice aflate sub tensiune.2. Dispozitive de incãlzireArt. 274. - La aprinderea becurilor de gaz, deschiderea robinetului trebuie sã se faca treptat; mai intâi se va aduce flacãra la gura becului, dupã care se va deschide gazul. Dacã becul se aprinde în interior, se va întrerupe imediat alimentarea cu gaz.Art. 275. - Înainte de utilizare se va controla tubul de legaturã cu care este racirdat becul, care nu trebuie sã fie prea larg la capete. Tubul nu trebuie sã ajungã în contact cu vase fierbinți sau sã fie în apropierea flãcãrii.Art. 276. - Nu se va lucra cu tuburi învechite sau defecte.Art. 277. - La întrebuințarea becurilor sau lãmpilor în care combustibilul lichid vine sub presiune se vor respecta urmãtoarele:- nu se va utiliza benzina la lãmpile care sunt destinate pentru petrol;- lampa va fi menținutã permanet curatã; înainte de fiecare aprindere, gaura pentru trecerea vaporilor inflamabili va fi curatatã şi se va controla dacã existã o cantitate suficientã de combustibil;- nu este permisã arderea întregii cantitãți de combustibil;- se va urmãri ca presiunea în rezervor sã nu depãşeascã presiunea normalã, iar rezervorul sã nu fie prea încãlzit (peste 35C);- alimentarea lãmpii se va face numai dupã oprirea flãcãrii; Art. 278. - La folosirea lãmpilor cu spirt se vor lua urmãtoarele mãsuri:- se va observa ca lampa sã nu se rãstoarne;- nu se vor utiliza lãmpi defecte;- nu se va permite o încãlzire prea mare a rezervorului;- nu se va aprinde lampa aplecându-se spre altã lampã care funcționeazã.3. Sticlãrie de laborator

67

Art. 279. - La recepție şi înainte de utilizare sticlãria de laborator se va verifica bucatã cu bucatã. Vasele care prezintã zgârieturi, crãpãturi, tensiuni interne sau alte defecțiuni se vor restitui magaziei sau se vor intrebuința exclusiv pentru operații nepericuloase.Art. 280. - Dopurile din cauciuc sau plutã trebuie potrivite înainte de introducere in gâtul vaselor de sticlã prin pilire sau la polizor; ele trebuie sã intre prin presare uşoarã. În momentul introducerii dopului, vasul trebuie sã fie ținut de gât.Art. 281. - Tuburile de sticlã care urmeazã sã fie introduse în gãurile dopurilor sau în tuburi de cauciuc trebuie tãiate drept, iar marginile ascuțite ale sticlei vor fi rotunjite la flacãrã.Art. 282. - Când tuburile au pereții prea subțiri, se vor înveli într-un material textil umed pentru a fi rupte.Art. 283. - În momentul ruperii, tuburile de sticlã se vor ține aproape de crestãturã.Art. 284. - Tubul de sticlã care se introduce în orificiul unui dop sau al unui tub de cauciuc se țin cât mai aproape de capãtul care se introduce; se recomandã învelirea mâinilor care țin dopul şi a tubului cu material textil umed, tubul fiind uns cu glicerinã sau cu apã.Art. 287. – Recipienții mari de sticlã nu se vor aşeza direct pe masã, ci pe o placã din azbest sau alt material elastic.Art. 288. - Încãlzirea vaselor de sticlã se va face progresiv, fie pe bãi, fie pe o sitã de fier acoperitã cu azbest.Art. 289. - La incãlzirea unui lichid in eprubetã, gura eprubetei nu trebuie sã fie îndreptatã spre nici o persoanã.Art. 290. - Pentru a evita supraîncalzirea lichidelor se vor folosi bucãțele de piatrã ponce sau porțelan poros; acestea se vor introduce întotdeauna când lichidul este încã rece.Art. 291. - Baloanele cu fund rotund se vor aşeza pe masa de lucru sprijinindu-se pe inele din material elastic, de dimensiuni potrivite.Art. 292. - Vasele ce conțin substanțe solide în suspensie trebuie agitate în timpul încãlzirii.Art. 293. - Baghetele folosite pentru amestecare trebuie sã fie rotunjite la capete cu ajutorul flãcãrii; agitarea se va face printr-o mişcare circularã de-a lungul pereților vasului. Pentru transvazarea precipitatelor se vor folosi baghete de sticlã având aplicatã pe unul din capete o bucatã de tub din cauciuc.Art. 295. - Aparatura fierbinte se va apuca fie cu o carpã uscatã, fie cu un cleşte de lemn sau de metal în cazul creuzetelor sau capsulelor supuse calcinãrii.Art. 296. - Aparatura de sticlã fierbinte se va feri de şocuri termice, respectiv nu se va aşeza pe un loc ud sau rece şi nu se vor turna lichide reci în interior.Art. 297. - Se interzice încãlzirea aparaturii de sticlã cu flacãra directã.Art. 298. - Cleştele cu care se apucã aparatura fierbinte de sticlã sau porțelan se va încãlzi puțin înainte.Art. 299. - Sitele utilizate pentru încãlzirea aparaturii de sticlã vor fi izolate cu azbest pe toatã porțiunea de contact între sitã şi vasul de sticlã.Art. 300. - Se va verifica întotdeauna ca aparatura de sticlã supusã încãlzirii sã aibã asigurat un orificiu de ieşire a vaporilor degajați în timpul incãlzirii.Art. 303. - Transportul vaselor din sticlã se va face astfel încât sã fie asigurate împotriva spargerilor. Paharele şi alte vase mici din sticlã trebuie ținute cu toatã palma şi nu apucate sau ținute de margine. Recipienții sau vasele cu gât lung trebuie sã se ținã cu o mânã de fund şi cu cealaltã de gât. Transportul pe distanțe mai lungi se va face numai în cutii sau coşuri amenajate corespunzãtor.Art. 304. - Spãlarea vaselor de sticlã se va face imediat dupã terminarea analizei, cu lichide potrivite, în care impuritãțile respective sunt solubile. Este interzisã curãțarea cu nisip sau alte materiale solide.

68

BIBLIOGRAFIE

[1] D. B. Roszak and R. R. Colwell, „Survival Strategies of Bacteria in the Natural Environment”, Microbiological Reviews Sept. 1987;[2] Stevenson, L.H. 1978. A case for bacterial dormancy in aquatic systems. Microb. Ecol.4:127-133;[3] 22. Carlucci, A. F. 1974. Nutrients and microbial response to nutrients in seawater, p. 245-248. [4] In R. R. Colell aind R. Y.Morita (ed.). Effect of the ocean enviironnient on microbial activities. University Park Press. Baltimolr-e;[5] Guelin, A. M., I. E. Mishustina, L. V. Andreev, M. A. Bobyk, and V. A. Lambina. 1979. Some problems of the ecology and taxonomy of marine microvibrios. Biol. Bull. Acad. Sci. USSR 5:336-340;[6] Casida, L. E. 1965. Abundant microorganisms in soil. Appl. Microbiol. 13:327-334;[7] Conn, H. J. 1948. [Ihe most abundant groups of bacteria in soil. Bacteriol. Rev. 12:257-273;[8] Daley, R. J., and J. E. Hobbie. 1975. Direct counts of aquaticbacteria by a modified epifluorescence technique. Limnol.Oceanogr. 20:875-882;[9] Dawes, E. A. 1976. Endoguenous metabolism aild the survival of starved prokarvotes. Symp. Soc. Gen. Microbiol. 26:19-53;[10] Delpy, L. P., G. Beranger, and M. Kaweh. 1956. Bacterial growsth phases. Ann. Inst. Pasteur (Paris) 91:112-115;[11] Drlica, K. 1984. Biology of bacterial DNA topoisomerases. Microbiol. Rev. 48:273-289.[12] Azam F, Cho BC (1987) Bacterial utilization of organic matter in the sea. In: Fletcher M (ed) ecology of microbial communities. Cambridge University Press, Cambridge, p 261–281;[13] Azam F, Cho BC (1987) Bacterial utilization of organic matter in the sea. In: Fletcher M (ed) Ecology of microbial communities. Cambridge University Press, Cambridge, p 261–281;[14] Azam F, Cho BC (1987) Bacterial utilization of organic matter in the sea. In: Fletcher M (ed) Ecology of microbial communities. Cambridge University Press, Cambridge, p 261–281;[15] Stoderegger K, Herndl GJ (1998) Production and release of bacterial capsular material and its subsequent utilization by marine bacterioplankton. Limnol Oceanogr 43:877–884;[16] C.A.Oviatt, H. Walker and M.E.Q. Pilson, „An exploratory Analysis of Microcosm and Ecosystem Behavior Using Multivariate Techniques”, Marine Ecology, April 20 1980;[17] Oviatt, C. A., Nixon, S. W., Perez, K. T., Buckley, B. (1979). On the season and nature of perturbations in microcosm experiments. In: Dame, R. (ed.) Marsh-estuarine systems simulations. ighth Belle W. Baruch Inst. Mar. Biol. and Coastal Research Symposium, Georgetown, South Carolina. January 1977, pp. 143-164;[18]Oviatt, C. A., Perez, K. T., Nixon, S. W (1977). Multivariate analysis of experimental marine ecosystems: results for Narragansett Bay. Helgolander wiss. eeresunters. 30: 30-46; [19] [18]Rees, M. J. Mon. Not. R. astr. Soc. 176, 483 (1976).[20] Carter, B. Large Numbers in Astrophysics and Cosmology Paper presented at Clifford Centennial Meet., Princeton (1970).[21] Salpeter, E. E. Astrophys. J. 115, 326 (1952); Phys. Rev. 107, 516 (1967).[22] Kahn, F. D. in Emerging Universe (eds Jacobs, K. C. & Saslaw, W. C.) 71 (Virginia University Press, 1972).[23] Weinberg, S. Phys. Rev. Lett. 19, 1264 (1967): Salam, A. in Elementary Particle Theory (ed. Svartholm, N.) (Almquist and Wiksell, Stockhohn, 1968).[24] Wheeler, J. A. in Gravitation Ch. 44 (1971)[25] Bruenn, S. W., Arnett, W. D. & Schamm, D. N. Astrophys. J. 213, 213 (1977).[26] Luna, G.M., Manini, E., and Danovaro, R. 2002. Large fraction of dead and inactive bacteria in coastal marine sediments: comparison of protocols for determination and ecological significance. Appl. Environ. Microbiol. 68(7): 3509–3513. doi:10.1128/AEM.68.7.3509-3513.2002. PMID:12089035.

69

[27] Lunau, M., Lemke, A., Walther, K., Martens-Habbena, W., and Simon M. dead and inactive bacteria in coastal marine sediments:2005. An improoved method for counting bacteria from sediments and turbid environments by epifluorescence microscopy. Environ. Microbiol. 7(7): 961–968. doi:10.1111/j.1462-2920.2005.00767.x. PMID:15946292.

70

Licenta Elena Stan

Documents

Transcript of Licenta Elena Stan