Interacțiunea enzimă-substratCinetica reactiilor enzimatice - teoria starii stationare k2 = k cat...
Transcript of Interacțiunea enzimă-substratCinetica reactiilor enzimatice - teoria starii stationare k2 = k cat...
Cataliza biochimică
Enzimele - situsuri de legare Substrat
Reactiile enzimatice Intermediari covalenti
cbc.arizona.edu
Formarea unui
intermediar covalent acil
Interacțiunea enzimă-substrat
https://chem.libretexts.org/
Interactiunileenzima-substrat
grupari
bazice
acide
nucleofile
ARNaza pancreatica bovina
Cataliza biochimică
Interacțiunea enzimă-substrat
www.namrata.co
E. Fischer-1894
Specificitatea enzimelor
D. Koshland-1958
Enzimeleproteine specifice
Complementaritate parteneri
Stabilizarea starii de tranzitie??
Enzimelestructuri flexibile
Modificarea conformatiei situs activ
Situs flexibil
Cataliza biochimică
Interacțiunea enzimă-substrat
Modelul de inducere a conformatiei
www.quora.com
Cataliza biochimică
Interacțiunea enzimă-substrat
iws.collin.edu
Modificarea conformatiei situsului activIn prezenta substratului
Distorsionarea legaturilor chimice ale substratului
energie mai mica(clivarea substratului)
Cataliza biochimicăInteracțiunea enzimă-substrat
Matsunaga Y, Fujisaki H, et al. (2012) PLOS Computational Biology 8(6): e1002555
Sol M. Resnick, and Alexander J. B. Zehnder Appl. Environ. Microbiol. 2000;66:2045-2051
Teoria starii de tranzitie
Cataliza biochimică
[X‡] = [X] -G‡
RTexp
concentrația speciei în starea de tranziție
CorelațieStr.-reactivitate
Adaptată din research.cm.utexas.edu
= [X‡] = [X] -G‡
RT
-d[X]dt
kT
hexp
k1 =-G‡
RT
kT
hexp
k1 =S‡
RT
kT
hexp
-H‡
RTexp
Rata de descompunere a speciei X
Constanta vitezei de reacție de ordinul I
-G‡ k1
Starea de tranzitiemaxim energetic
Intermediarii
Energii mai mici
Leg chimice formate
Teoria starii de tranzitie
Cataliza biochimică
Starea de tranzitie a E. coli tARN-Adenozine Deaminazei
http://pubs.acs.org/JACSbeta/
Postulatul lui Hammond
Reactia in etape: A I P
I -intermediar instabil
Structura I ~ Structura T#
Stabilizarea T#
Lizozimul
Carboxanioni intermediari ~ T#
Protein structure and Function, Petsko & Ringe, 2004
http://www.chemguide.co.uk/
Cataliza biochimică
Energia de activare
Enzimele reduc Ea a reactie
http://www.mtchs.org/BIO/
Constanta vitezei (k1) 10X
ΔΔG҂ = 5,71 KJ/Mol
½ ΔG legatura de H
Constanta vitezei (k1) 106x
ΔΔG҂ = 34 KJ/Mol
1/10 ΔG C-C
ΔΔG҂ = Eanecat - Eacat
http://i.stack.imgur.com/KQSgM.jpg
Cataliza biochimică
Cataliza bazicaCataliza acida
Stabilizare
Catena laterala aminoaciziaspartat, glutamat, tirozina histidina si lizina
Stari de tranzitie nefavorabile
Transfer proton(baza)
Transfer proton(acid)
Stabilizarea stării de tranziție
Cataliza biochimică
Carboxipeptidaze
Anhidraza carbonicaStructura situsului activ al
Carboxipeptidazei Ahttp://www.open.edu/openlearn/
Stabilizarea stării de tranziție
Cataliza biochimică
Cataliza electrofilă
Stabilizarea starii de tranzitie
Endonucleaza G
Arg 110 si Mg2+
Wu SL et al.J. Biomed. Sci., 2009
Implicata in procesele de proliferare celulara
(inclusiv apoptoza)
Proteina AIF și endonucleaza G sunt eliberate din mitocondrie si provoaca degradarea ADN-uluihttp://www.protein.bio.msu.ru/
Stabilizarea stării de tranziție
Cataliza biochimică
Cataliza electrofilă
Gruparea –OH a serinei
În enzime- grupări nucleofile (în cataliză):
Serin proteaze
Colinesteraze
www.atsdr.cdc.gov
Stabilizarea stării de tranziție
Cataliza biochimică
Cataliza nucleofila
https://proteopedia.org
Gruparea –OH a serinei
Leucocitesteraza (LE)
http://slideplayer.com/slide/4366028/
existența unei infecții urinarepH, conc. Proteinei, NO2
-
https://drugsdetails.com
Indoxil + Sare diazoniu → azoderivat (violet)
Esterul ac. Indolcarboxylic → Indoxil + AcidLE
Limita de detecție 10-25 Leu/µl
Stabilizarea stării de tranziție
Cataliza biochimică
Cataliza nucleofila
Lipaze (situs activ)www.thermofisher.com
Fosfataza acida (E coli)www.scielo.br
Gruparea –OH a serinei
Stabilizarea stării de tranziție
Cataliza biochimică
Cataliza nucleofila
Thomas, Shafee, (2014). "Evolvability of a viral protease: experimental evolution of catalysis, robustness and specificity". PhD Thesis. University of Cambridge.
Triada catalitică
Stabilizarea stării de tranziție
Cataliza nucleofila
gruparea -OH tirozinica
Topoisomerase IB situs activ (PDB 1A36)
helicase.pbworks.com
Stabilizarea stării de tranziție
Cataliza nucleofila
topoizomeraze
glutamin sintetaza
gruparea -OH tirozinica
Stabilizarea stării de tranziție
Cataliza nucleofila
Spodenkiewicz, M. et al, Biology 2016, 5(4), 40
Homodecamer2 x pentamer
glutamin sintetaza – deficiență
Stabilizarea stării de tranziție
Cataliza nucleofila
Reprezentarea schematică a fiziopatologiei deficientei GS: scăderea detoxifierii NH3și împiedicarea reaprovizionării ciclului Gln-Glu-GABA
Spodenkiewicz, M. et al, Biology 2016, 5(4), 40
Glutamat-cistein ligaza (γ-glutamilcistein sintetaza, EC 6.3.2.2)
William B. Musgrave et al. Biochem. J. 2013;450:63-72
gruparea -OH tirozinica
Stabilizarea stării de tranziție
Cataliza nucleofila
Biosinteza glutationuluiAlmuafri, F., et al.,
Blood Cells, Molecules and Diseases2017;65:73-77
Anemie hemolitică moderată – 3 surori
Gruparea -SH a cisteinei - tiol proteaze papainaficina
Papaina situs activ www.cambridgemedchemconsulting.com
Stabilizarea stării de tranziție
Cataliza nucleofila
Yao, Q. et al., PNAS,2009. 106 (10) 3716-3721
tiol proteaze (bromelaina) gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaza
www.studyblue.com
Influenta bromelainei asupra unor mediatori care intervin in inflamatia acuta
Srivastava, AK et al.,Braz. Arch. Biol. Technol., 59, 2016
Stabilizarea stării de tranziție
Cataliza nucleofila
•imidazolul din histidina cresterea nucleofilicitatii gruparilor -OH si -SH
Stabilizarea stării de tranziție
Cataliza nucleofila
Freeman and co, Biochemistry, 2007
Ash, E. L., et al., H-bond: Proposal for reaction-driven ring flip mechanism in serine
protease catalysis, PNAS, 2000, 97(19)10371-10376
Stabilizarea stării de tranziție
Cataliza nucleofila
• imidazolul din histidina transferul grupei fosfat
Fosfoglicerat mutazaEnzimă glicolitică
2,3-BPG ↑ eritrocite
Controlul afinitățiiHb-O2
gruparea –NH2 (lizinica) - cataliza acetoacetat decarboxilazei
Highbarger, L.A. and Gerlt, J.A,Biochemistry, 35, 41-46, 2016
Gerlt, J.A. Nature Chemical Biology
5, 454 – 455, 2009
Stabilizarea stării de tranziție
Cataliza covalentă
gruparea –NH2 (lizinica) - cataliza acetoacetat decarboxilazei
Stabilizarea stării de tranziție
Cataliza covalentă
Dovedirea intermediarului catalitic
CO
CH3
CH2
- CO2
CO
O
NH2EH+
C
CH3
CH2
CO
O
NH
E C
CH3
CH2
HNE
C
CH3
CH3
NH
EH2O
H+ NH2E+ + C
CH3
CH3
O
CH3COCH2CO2NH2E C
CH3
CH3
NH
EBH4
-
+ CH
CH3
CH3
NH2E
gruparea –NH2 (lizinică) - cataliza transladolazei;
Transaldolaza situs activ www.nature.com chemwiki.ucdavis.edu
Stabilizarea stării de tranziție
Cataliza covalentă
gruparea –NH2 (lizinică) - adolazei;
Stabilizarea stării de tranziție
Cataliza covalentă
C O
CH2
CH2 OH H2N E
H+O P
C
CH2
CH OH
NH
E
O P
H
H+
C
CH2
C
HO
HN E
O P
H
C
OH
R
H+
C
CH2
CHO
NH
E
O P
H
C OHH
R
H2O C
CH2
CHO
O
O P
H
C OHH
R
H2N E+
Stabilizarea stării de tranziție
Cataliza covalentă
Cataliza electrofilă în cazul piridoxal fosfatului
Richard, J.P. et al.,Current Opinion in Chemical Biology,
13(4), 2009, 475-483
Situs catalitic DAA transferazeiBacillus sp. YM-1
https://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/m-csa/entry/66/
PLPY31K145
L201E177
• gruparea carboxilica (aspartat) - ATPaze (K+/Na+, Ca2+).
Cataliza nucleofila
www.rpi.edu
Structura Na,K-ATPazei cu ouabainahttps://www.researchgate.net/
Reactia: R1 R2 P
Etape determinanta de viteza
Cinetica starii stationare
Starea stationara Sistemele dinamice
Rata formare = rata distrugere
Populatia tarii
Sisteme biochimice
metabolit
celula
Xformare
Ydegradare
vformare = vdegradare
Stare stationara
Intelegere metabolism
S > E
Stare prestationara
Analiza mecanisme de reactie
Ecuatia Michaelis-Menten
ES - Complex enzima-substrat
Leonor Michaelis (1913)
[E] = constant, rata de reactie creste cu cresterea [S] pana cand viteza maxima, Vmax, este atinsa
v =[E]0[S]kcat
Km + [S]
E + S ES P + EKS kcat
v =[E]0[S]kcat
Km + [S]
[S] < < Km
v =kcat
Km
[E]0[S]
a) Enzima libera + substrat
[S] = Km
v =kcat
2[E]0
b) Enzima saturata 50% cu substratul
[S] >> Km
v =kcat [E]0
c) Enzima saturata cu substratul
KS =[E][S]
[ES]
E + S ES P + EKS kcat
v = kcat [ES][E] = [E]0 - [ES]
Reactia enzimei cu un singur substrat
v = kcat [ES][ES] =[E]0[S]
KS + [S]
v =[E]0[S]kcat
Km + [S]
E + S ES P + EKS kcat
Reactia enzimei cu un singur substrat
KS = Km
v =[E]0[S]kcat
Km + [S]
EP disociere rapidă
E + S ES P + Ek1
k-1
k2
Michaelis-Menten - premiza: E E + S k2 << k-1
G. E. Briggs 1925J. B. S. Haldane
[ES] cinetica stationarak2 ~ k-1
d[ES]/dt = 0 = k1[E][S] - k2[ES] - k-1[ES]
Cinetica reactiilor enzimatice - teoria starii stationare
v =[E]0[S]k2
[S] + (k2 + k-1)/k1
(k2 + k-1)/k1 = Km
Km = Ksk2 << k-1
E + S ES P + Ek1
k-1
k2
Cinetica reactiilor enzimatice - teoria starii stationare
k2 = kcat
vmax= [E]0 kcat
v =vmax [S]
Km + [S]
Ecuatia Michaelis-Menten
Introduction to Enzyme and Coenzyme Chemistry (2004) Second Edition, TIM BUGG, Blackwell Publishing
Ec. M-M Vmax??
Cataliza biochimică
Variante ale ecuatiei Michaelis-Menten
Introduction to Enzyme and Coenzyme Chemistry (2004) Second Edition, TIM BUGG, Blackwell Publishing
Cataliza biochimică
Variante ale ecuatiei Michaelis-Menten
Cataliza biochimică
Variante ale ecuatiei Michaelis-Menten
Hanes-Woolf
http://www1.lsbu.ac.uk/water/enztech/determination.html
Eisenthal și Cornish-BowdenPlot grafic
Cataliza biochimică
Alte modalități de determinare ale Km și vmax
allos=altstereos=solid, spatiugrec
Cataliza biochimică
Controlul alosteric al activității enzimatice
Modalități de reglare a activității enzimatice:
a) Controlul disponibilității enzimei
b) Controlul activității enzimatice
Hemoglobina
Modelul simetric(Monod, Wyman, Changeux) Premise
Cataliza biochimică
Controlul alosteric al activității enzimatice
a. proteina – oligomersubunitățile orientate simetric
b. Oligomerul2 stări conformaționaleT (deoxi-Hb) si R (oxi-Hb)
c. ligandul se leagă la o subunitate
d. simetria conformațională păstrată ↓
trecerea T R în toate subunitățile??
Modelul secvential(Kochland)
Cataliza biochimică
Controlul alosteric al activității enzimatice
Premise
a. legarea ligandului induce schimbări conformaționale(subunitatea vecina)
b. interacțiunile cooperative din subunitățile vecine schimbări conformaționale
Cooperare pozitivănegativă
Cataliza biochimică
Controlul alosteric al activității enzimatice
Ecuația Hill
5. Cataliza biochimică
Inhibitia feedback a ATCazei controleaza sinteza pirimidinei
Cataliza biochimică
Inhibitia feedback a ATCazei controleaza sinteza pirimidinei
https://bio.libretexts.org
ATCaza umană – parte integrantăa unui complex enzimatic
Ruiz-Ramos et. al., Stucture, 24, 1081-1094 (2016)
PALA = N-fosfoacetil-aspartat
Cataliza biochimică
Inhibitia feedback a ATCazei controleaza sinteza pirimidinei
Ruiz-Ramos et. al., Stucture, 24, 1081-1094 (2016)
în absența inhibitorului
în prezența inhibitorului