Instruirea practică în laboratorul de microbiologie

1. Analiza bacteriologică a apei

Prin această analiză se urmăreşte determinarea numărului total de germeni şi a germenilor din grupul coli (prezenţa unui număr mare de germeni care se dezvoltă la 37°C indică posibilitatea unei contaminări, iar prezenţa germenilor coli în apă indică o contaminare fecală).

Stabilirea numărului total de germeni constă în:

a. recoltarea probelor: se realizează prin prelevarea a câte 100 ml apă de analizat în flacoane de sticlă sterilizate, astupate cu dopuri, cu atenţie, pentru a evita infectarea din afară.

b. analiza propriu-zisă:

* introducerea a câte 1 ml de lichid de analizat, cu ajutorul unei pipete sterilă, în două plăci Petri,

* introducerea a câte 0,1 ml din apa de analizat în alte două cutii Petri.

° Dacă nu se cunoaşte gradul de puritate al apei se fac diluţii din probele de apă de 1/10 şi 1/100, din care se însămânţează câte 1 ml în plăcile Petri.

° Diluţia se face cu apă potabilă sterilă.° În cutii se toarnă agar nutritiv topit şi răcit la 45°C.° Se agită conţinutul în plan orizontal.° Se incubează în termostat timp de 24 ore la 35°C.

c. stabilirea numărului total de germeni: numărul total de germeni este dat de numărul coloniilor dezvoltate pe suprafaţa şi în interiorul agarului. Dacă plăcile conţin mai puţin de 100 colonii se numără pe o jumătate sau pe un sfert de placă, iar rezultatul se înmulţeşte cu 2, respectiv cu 4.

În cazul când s-au făcut diluţii 1/10 sau 1/100 din proba de apă, acestea se vor lua în considerare la stabilirea numărului total de germeni.

2. Analiza bacteriologică a aerului

Prin această analiză se face determinarea numărului total de germeni (bacterii aerobe, drojdii şi mucegaiuri) din 1 m3 de aer.

Metoda de lucru constă în pregătirea unei serii de capsule Petri sterilizate, cu diametrul de 10 cm, în care se pune mediul nutritiv.

Capsulele în care s-a turnat mediul sterilizat se ţin 2-3 zile la termostat, pentru a vedea dacă sunt sterile.

Se lasă apoi descoperite timp de 10 min la temperatura camerei, după care se ţin 2-3 zile la o temperatură de 30°C, cele cu agar nutritiv şi 5-7 zile la temperatura camerei, cele cu malţ-agar.

Pe agar nutritiv se numără bacteriile aerobe, iar pe malţ-agar, drojdiile şi mucegaiurile.

După incubare se numără coloniile din fiecare placă şi se face media numărului găsit pe plăcile cu acelaşi mediu.

Numărul total de bacterii aerobe, respectiv de drojdii şi mucegaiuri se determină cu relaţia:

unde: - reprezintă numărul de microorganisme pe m3 de aer; - reprezintă media numărului de colonii găsite pe plăci.

Instruirea practica în laboratorul de biochimie

Această instruire are ca scop formarea deprinderilor de executare a analizelor biochimice specifice produselor din carne şi de a stabili în acest fel caracteristicile fizico-chimice ale acestora.

Se execută următoarele lucrări:

- determinarea acidităţii, pH-ului şi a indicelui de aciditate;- determinarea conţinutului de substanţe grase, a indicelui de saponificare;- determinarea prospeţimii grăsimii; - determinarea clorurii de sodiu; - dozarea nitritului; - determinarea amoniacului; - determinarea azotului uşor hidrolizabil; - identificarea hidrogenului sulfurat; - determinarea substanţelor proteice totale.

1. Determinarea conţinutului de substanţe grase

Fig. 1 Aparatul Soxhlet

Analiza are la bază proprietatea grăsimilor de a fi solubile în solvenţi organici (eter etilic, eter de petrol etc.). Se efectuează prin extracţie, folosind, în acest scop, aparatul Soxhlet.

Aparatul Soxhlet se compune din balonul de distilare (1), corpul de extracţie (2), prevăzut cu un tub (3), care permite trecerea vaporilor spre refrigerentul (4) şi cu un alt tub (5), ce permite sifonarea solventului.

Lucrarea se desfăşoară în trei faze şi anume:

- pregătirea cartuşului cu proba de analizat;- montarea aparatului cu extracţia propriu zisă;- cântărirea balonului după extracţie şi calculul.

Mod de lucru

a. proba de analizat (5-10 g), care a fost în prealabil mărunţită, se amestecă cu 15 g sulfat de sodiu anhidru

Amestecul se introduce într-un cartuş de hârtie de filtru.

Cartuşul se introduce în extractor.

Se toarnă apoi solventul (până se produce sifonarea) şi, în plus, cca. 50 ml solvent.

b. aparatul se montează pe o baie de apă.

Se dă drumul la apa de răcire să circule prin refrigerent.

Se încălzeşte balonul, astfel ca extracţia să dureze 5-6 ore cu o frecvenţă de 10-12 sifonări/oră.

După terminarea extracţiei se distilă solventul, iar urmele de eter din gră-sime se îndepărtează prin uscare în etuvă.

După răcire, balonul se cântăreşte la balanţa analitică.

c. Calculul conţinutului de grăsime se face pe baza relaţiei:

Substanţe grase

în care:- , reprezintă masa probei de analizat în , este in g,- , reprezintă masa balonului gol în ,- , reprezintă masa balonului cu grăsime în .

2. Dozarea nitritului prin metoda Lombard-Zambelli

Determinarea nitriţilor se bazează pe compararea intensităţii culorii compusului azoic galben-portocaliu, format în urma reacţiei dintre acidul sulfanilic, fenol şi nitriţii din extractul apos al probei, cu o scară etalon de soluţii de nitrit de sodiu, obţinută în aceleaşi condiţii.

Metoda de dozare a nitriţilor cuprinde următoarele etape:

- pregătirea extractului apos al probei; constă în cântărirea a 10 g din preparatul de carne care a fost în prealabil mărunţit şi aducerea cu apă, la balon cotat de 100 cm3. Se lasă timp de 30 min după care se filtrează într-un vas Erlenmeyer curat şi uscat.

- prepararea reactivului Lombard-Zambelli; se face după schema de mai jos:

Fig. 1 Fazele pregătirii soluţiei acetice de alfa-naftilamină

- pregătirea soluţiei etalon; se face după schema de mai jos.

Fig. 2 Fazele pregătirii soluţiei acetice de acid sulfanilic

Soluţia etalon se prepară în ziua folosirii.

- pregătirea scării etalon; se face prin alegerea a 12 eprubete de aceeaşi mărime în care se adaugă reactivii conform schemei de mai jos.

Fig. 3 Fazele pregătirii soluţiei etalon

După adaosul reactivului Lombard-Zambelli se amestecă prin răsturnări repetate şi se lasă în repaos 10 min.

Se adaugă 1 cm3 amoniac (d = 0,92) şi se amestecă.

Se păstrează maximum 20 zile la întuneric, la temperatura camerei.

Fig. 4 Fazele pregătirii scării comparatoare

- stabilirea cantităţii de nitrit din probă.

Din extractul apos pregătit anterior se ia 1 cm3.

Acesta se introduce într-o eprubetă identică cu cele folosite la scara etalon.

Se adaugă 1 cm3 reactiv Lombard-Zambelli.

Se amestecă prin răsturnări repetate.

După un repaos de 10 min, se adaugă 1 cm3 soluţie de amoniac.

Se amestecă.

După 10 min se compară vizual culoarea obţinută cu aceea a scării etalon.

Conţinutul de nitriţi din proba de analizat, exprimat în mg/100 g, este dat de numărul de ordine al eprubetei cu aceeaşi culoare din scara etalon.

Fig. 5 Pregătirea probei de comparat

3. Determinarea prospeţimii grăsimii (reacţia Kreis)

Această analiză se face cu scopul de a stabili gradul de râncezire a grăsimii din carne şi a preparatelor din carne.

Analiza se bazează pe reacţia dintre grupările epihidrin-aldehidice ale grăsimilor rân-cede şi fluoroglucina, în urma căreia apare coloraţia roz sau roşie.

Fazele determinării:

- extragerea a 10 g slănină sau ţesut gras din proba de cercetat, introducerea ei într-o eprubetă şi menţinerea la 105°C timp de 15-20 min.

- după topire, se decantează grăsimea.

- din grăsimea decantată se ia 1 cm3, se introduce într-o eprubetă şi se adaugă 1 cm3 acid clorhidric şi 1 cm3 soluţie de fluoroglucină.

- se agită eprubeta şi se urmăreşte modificarea coloraţiei lichidului.

Interpretarea reacţiei.

Gradul de prospeţime al grăsimii se apreciază astfel:

- carne proaspătă: coloraţie roz

- came relativ proaspătă: coloraţie roşie

- carne alterată: coloraţie violet

Notă:

Pentru precizarea caracteristicilor chimice ale grăsimilor în practică, se mai procedează şi la determinarea indicelui de aciditate, a indicelui de iod, a indicelui de peroxid.

4. Identificarea amoniacului cu reactivul Nessler

Reacţia, se bazează pe proprietatea pe care o are amoniacul de a forma, cu reactivul Nessler, un precipitat brun, cu o mare putere colorantă.

Aceasta metodă permite identificarea urmelor de amoniac.

Fazele de desfăşurare:

- prepararea extractului de carne; se face prin recoltarea unei probe de carne curăţată de ţesut conjunctiv, vase şi grăsime, din care se cântăresc 10 g, se toacă mărunt şi se aduce cu 100 cm3 apă distilată, într-un pahar de laborator. Se lasă la temperatura camerei 10-15 min şi se omogenizează, după care se filtrează, filtratul fiind folosit apoi pentru analize.

- prepararea reactivului Nessler; are loc în mai multe etape

Fig. 1 Fazele pregătirii reactivului Nessler

- analiza existenţei amoniacului; constă din observarea modificării coloraţiei şi a gradului de limpezire când extractul de carne vine în contact cu reactivul Nessler.

Fig. 2 Analiza existenţei amoniacului

- interpretarea reacţiei (interpretarea rezultatelor): reacţia se consideră:

* negativă, după adăugarea a 10 picături de reactiv nu se modifică claritatea extractului;

* slab pozitivă, după adăugarea a minimum 6 picături reactiv apare un precipitat uşor şi o coloraţie galben intens;

* pozitivă, la adăugarea primelor picături de reactiv apare o tulbureală vizibilă şi coloraţie galben pronunţată, iar după adăugarea ultimelor picături se formează un precipitat abundent de culoare galben-portocalie.

5. Determinarea azotului uşor hidrolizabil

Azotul uşor hidrolizabil, exprimat în amoniac se determină prin punerea lui în libertate cu ajutorul unei baze slabe, antrenarea cu vapori de apă şi prinderea într-o soluţie acidă.

Determinarea se realizează cu ajutorul unei instalaţii de distilare şi cuprinde următoa-rele faze:

- pregătirea probei de analizat;

- distilarea;

- titrarea cu NaOH 0,1 n a excesului de H2SO4 0,1 n;

Pregătirea probei de analizat Distilarea

Titrarea excesului de acid sulfuric

Fig. 1 Fazele determinării azotului uşor hidrolizat

- calculul cantităţii de azot uşor hidrolizabil: azotul uşor hidroiizabil se exprimă în mg amoniac la 100 g produs de analizat şi se calculează cu formula:

,

în care:

- 0,0017 reprezintă cantitatea de amoniac în , corespunzătoare la 1 ml H2SO4

0,1 n;

- reprezintă volumul de H2SO4 0,1 n introdus în balonul Erlenmeyer, în ;

- reprezintă volumul de NaOH 0,1 n folosit la titrarea excesului de H2SO4 0,1 n, în ;

- reprezintă masa probei luată în analiză, în .

6. Determinarea substanţelor proteice totale (metoda Kjeldhal)

Conţinutul de substanţe proteice din carne şi produsele din carne se stabileşte prin determinarea azotului total.

În urma reacţiilor de oxidare azotul este trecut în sulfat de amoniu iar prin distilare, amoniacul ce rezultă este prins într-o cantitate cunoscută de acid sulfuric concentrat.

Prin titrare cu hidroxid de sodiu, se determină cantitatea de acid sulfuric ce nu a reacţionat cu amoniacul.

Analiza se desfăşoară în mai multe etape:

- mineralizarea substanţelor organice;

- răcirea şi trecerea în balonul de distilare;

- neutralizarea acidului şi distilarea;

- titrarea distilatului;

Mineralizarea Răcirea şi trecerea în balonul de distilare

Titrarea acidului sulfuric în exces Neutralizarea acidului şi distilarea

Fig. 1 Fazele de determinare a substanţelor proteice totale

- calculul conţinutului substanţelor proteice totale se calculează cu formula:

în care:

- reprezintă masa de azot în , corespunzătoare la 1 ml hidroxid de sodiu soluţie 0,1 n;

- reprezintă volumul de acid sulfuric 0,1 n, introdus în vasul conic, în ;

- reprezintă volumul de hidroxid de sodiu 0,1 n, folosit la titrarea excesului de acid sulfuric, în ;

- reprezintă masa probei luată pentru analiză, în .