INTRODUCERE

Existena lumii microbiene a rmas necunoscut pn la inventarea microscopului la nceputul secolului al XVII-lea. Antonie van Leeuwenhoek (1632 - 1723), savant olandez, a fost primul care a observat cu ajutorul unui microscop rudimentar fabricat de el nsui, particulele invizibile cu ochiul liber: sfere, bastonae, spirili.

Microorganismele au fost descoperite n sec. al XIX-lea i clasificate n regnul vegetal. Haeckel (1866) propune crearea regnului Protista, alturi de cel animal i vegetal. Astfel, el regrupeaz organismele unicelulare sau pluricelulare care nu formeaz esuturi difereniate n: alge, ciuperci, protozoare i bacterii.

n 1978, fiinele vii au fost clasificate n 5 regnuri, dup Whittaker i Margulis: (Prokaryotae, Protoctista, Fungi, Plantae i Animalia), urmnd ca, odat cu dezvoltarea biologiei moleculare, C. Woese s propun, n 1990, o nou clasificare n trei domenii: Archaea, Bacteria i Eucarya. Microbiologia este tiina care se ocup cu studiul microorganismelor, fiine unicelulare sau multicelulare microscopice. Aceast tiin biologic este scindat n mai multe specialiti: micologie, bacteriologie, virologie, algologie, protozoologie.1. DESFURAREA ACTIVITII I PROTECIA MUNCII N LABORATORUL DE MICROBIOLOGIEProtecia mpotriva riscurilor legate de expunerea la ageni biologici n munc se face conform HOTRRII nr. 1.092 din 16 august 2006.Aceast hotrre are ca obiect protecia lucrtorilor mpotriva riscurilor pentru securitatea i sntatea lor, rezultate sau care pot s rezulte din expunerea la ageni microbiologici n cursul activitii, precum i prevenirea acestor riscuri. n sensul acestei hotrri, urmtorii termeni se definesc dup cum urmeaz:

a) ageni biologici - microorganisme, inclusiv microorganismele modificate genetic, culturile celulare i endoparaziii umani, care sunt susceptibile s provoace infecie, alergie sau intoxicaie;

b) cultura celular - creterea in vitro a celulelor izolate din organisme multicelulare;

c) microorganism - o entitate microbiologic, celular sau nu, capabil s se reproduc sau s transfere material genetic.

Agenii biologici sunt clasificai n 4 grupe de risc, n funcie de importana riscului de infecie pe care l prezint, astfel cum se prevede n anexa nr. 3:

a) grupa 1 - ageni biologici care nu sunt susceptibili s provoace o boal la om;

b) grupa 2 - ageni biologici care pot provoca o boal omului i constituie un pericol pentru lucrtori; propagarea lor n colectivitate este improbabil; exist, n general, o profilaxie sau un tratament eficace;

c) grupa 3 - ageni biologici care pot provoca mbolnviri grave la om i constituie un pericol serios pentru lucrtori; ei pot prezenta un risc de propagare n colectivitate, dar exist n general o profilaxie sau un tratament eficace;

d) grupa 4 - ageni biologici care pot provoca boli grave omului i constituie un pericol serios pentru lucrtori; ei pot s prezinte un risc ridicat de propagare n colectivitate i nu exista n general o profilaxie sau un tratament eficace.Cei care lucreaz n laboratorul de microbiologie trebuie s primeasc, sub forma de informri i instructaj, o instruire suficient i adecvat, bazat pe toate informaiile disponibile privind:

a) eventualele riscuri pentru sntate;

b) msurile care trebuie luate pentru a evita expunerea;

c) prescripii aplicabile din domeniul igienei;

d) purtarea i utilizarea echipamentelor i mbrcmintei de protecie;

e) msurile pe care lucrtorii trebuie s le ia n caz de evenimente i/sau incidente periculoase, precum i msurile de prevenire a acestora.

n laboratorul de microbiologie trebuie respectate o serie de reguli de igien, fr de care nu pot fi aplicate metodele de lucru specifice acestei discipline, existnd totodat pericolul contaminrii propriei persoane, a celor din jur, precum i a materialelor care se manipuleaz.

Pentu desfurarea unei activiti normale de lucru n laboratoarele de microbiologie se vor respecta urmtoarele reguli:- s se asigure condiiile corespunztoare s nu se serveasc masa i s nu se bea n zonele de lucru unde exist riscul de contaminare cu ageni biologici;- ntreinerea n perfect stare de curenie a ncperilor (pardoseal, perei, plafon i geamuri), combaterea insectelor i a mucegaiului;

- ndeprtarea de pe mesele de lucru i din ncpere a tuturor obiectelor inutile;

- ntreinerea n perfect stare de curenie a aparaturii, mobilierului i meselor de lucru;

- tergerea meselor de lucru cu un dezinfectant nainte de nceperea lucrului; evitarea formrii curenilor de aer n ncperile de lucru;

- iradierea cu raze ultraviolete a atmosferei i suprafeelor de lucru nainte de nceperea activitii;

- ntreinerea n perfect stare de curenie a minilor, mbrcmintei i nclmintei persoanelor care lucreaz n laborator;

- asigurarea spaiilor dotate cu instalaii igienico-sanitare adecvate, care pot include soluii/picturi pentru ochi i/sau substane antiseptice pentru piele; - utilizarea de mijloace ce permit colectarea, depozitarea i eliminarea deeurilor n deplin securitate, dac este cazul, dup tratarea acestora, inclusiv utilizarea unor recipiente sigure, uor identificabile;De aceea, n laboratorul de microbiologie:- purtai un halat de laborator dintr-un material neinflamabil, n stare bun, curat i dintr-o singur culoare;

- lsai-v hainele n vestiar sau n spaiul special amenajat; dup terminarea lucrrilor, halatul va fi pstrat n locuri speciale;

- protejai-v uviele lungi de pr, purtai unghiile curate i tiate scurt; - splai-v minile cu ap cald i spun (de preferin lichid sau pudr, cu aciune bactericid) i tergei-le pe un prosop de hrtie de folosin unic nainte i dup manipularea microbiologic;

- dup utilizarea sticlriei cu care ai manipulat microorganismele, aceasta trebuie depozitat separat n vederea autoclavrii;

- nu depozitai alimentele personale n frigiderul laboratorului;

- nu vorbii, nu strnutai i nu tuii n timpul nsmnrilor. 2. LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE - GENERALITIPentru ca cercetarea de laborator s poat fi realizat n condiii corespunztoare, o prim cerin este organizarea unor laboratoare specializate de cercetare.Organizarea acestor laboratoare trebuie gndit i privit cu mult flexibilitate.

Laboratorul de microbiologie trebuie s cuprind dou compartimente:

- o sal de pregtire a mediilor i obiectelor de lucru i de decontaminare, coninnd mese, un autoclav, o etuv, un congelator i un frigider (care va fi utilizat i pentru pstrarea tulpinilor microbiene). Tot aici se poate stoca sticlria, mediile de cultur precum i reactivii.

- o sal de lucrri propriu-zise, de manipulare a culturilor microbiene, la adpost de curenii de aer, dotat cu mese cu suprafa neted, rezistent, impermeabil, cu conducte de gaz i prize electrice, un sistem de vid i de aer comprimat i o hot sterilizabil, cu radiaii ultraviolete (eventual o hot cu flux laminar). n msura n care este posibil, n legtur cu aceast sal, ar trebui s existe anexe prevzute cu termostate la diferite temperaturi ( 25 0C, 30 0C, 37 0C, 44 0C, 55 0C).

Manipulrile de culturi microbiene sau de produse susceptibile s conin microorganisme se efectueaz innd cont de unele tehnici particulare prin care s se evite cele dou tipuri de contaminare:

1. contaminarea culturii sau a produsului ce trebuie analizat datorit personalului sau mediului nconjurtor;

2. contaminarea personalului sau a mediului nconjurtor de ctre microorganismele studiate.

n laboratorul de microbiologie, operaia de baz este transferul de microorganisme dintr-un recipient n altul, lucrare ce se execut n zona steril de protecie din jurul flcrii becului de gaz.

Recipientele din sticl sunt din sticl borosilicat (sticl Pyrex, Duran, Schott,...). Recipientele din materiale plastice pot fi de mai multe tipuri cele mai folosite sunt din polipropilen (pp) autoclavabil.

Sticlria cel mai des utilizat n laboratorul de microbiologie const n eprubete de diferite dimensiuni, flacoane Erlenmeyer, plci Petri, pipete Pasteur i pipete gradate. n ultima perioad sunt din ce n ce mai mult utilizate recipientele i pipetele din plastic, de unic folosin (single use, disposable). Pentru prelevarea i inocularea culturilor se utilizeaz ansa sau firul metalic, fabricate din nicrom. Ustensilele de etalare permit repartizarea uniform a inoculului pe suprafaa mediilor solidificate i pot fi fabricate prin ndoirea unui tub sau a unei baghete din sticl. n afara acestor ustensile curente de lucru, mai pot fi ntrebuinate o serie de alte instrumente, n funcie de operaia efectuat.

Laboratorul de microbiologie trebuie s aib n dotare urmtoarele aparate i echipamente:

Tabel 1. Principalele aparate i echipamente necesare n laboratorul de microbiologie

AparateRolNumr

Robinete cu ap cald i rece, de preferin acionate cu piciorul- splarea minilor

- splarea diferitelor obiecte- 1-acionat cu piciorul

- mai multe acionate manual

Hot cu flux laminar sau ni sterilizabil- indispensabil lucrrilor de microbiologie1

Bec de gaz tip Bunsen- pentru lucrul n zona steril din jurul flcrii cu con albastru i pentru sterilizarea ansei

1 pentru fiecare student

Etuv

Termostat bacteriologic- pentru sterilizarea sticlriei

- pentru incubarea culturilor

25 oC1 oC: 1

30 oC1 oC: 1

37 oC1 oC: 2

44 oC1 oC: 1

Autoclav- pentru sterilizarea mediilor de cultur, stclriei, etc. i pentru decontaminarea obiectelor

1

Baie de ap termostatat- lichefierea mediilor gelozate

- teste enzimatice

- studiul aciunii cldurii asupra bacteriilor3

Plite electrice- necesare pentru colorarea sporilor sau colorarea Ziehl-Neelsen1 la doi studeni

Frigidere

Camere frigorifice- conservarea la frig la 3oC2oC a mediilor de cultur preparate, a reactivilor biologici i a tulpinilor bacteriene1

1

Congelator- conservarea la frig la o temperatur mai mic de 18 oC a mediilor de cultur i reactivi, usele bacteriene, probe pentru analiz.1 pentru usele bacteriene

Computer- necesar prelucrrii datelor experimentale1

Balane

- utilizate pentru cntrirea pudrei dehidratate de mediu de cultur sau componentelor mediilor de cultur pentru prepararea sa3

pH-metre-permit controlarea pH-ului a mediului de cultur2

Microscop optic cu obiective cu diferite grosismente (de preferat contrast de faz)- observarea bacteriilor vii (40x)

- observarea bacteriilor moarte, fixate i colorate pe frotiu (100x)1 microscop standard pentru student

Microscop cu fluorescen- observarea bacililor acido-alcoolo-rezisteni 1

Microscop echipat cu camer video, cuplat la un monitor- permite prezentarea n stare proaspt a coloraiilor Gram, etc.1

3. TEHNICI DE STERILIZARE A OBIECTELOR N LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE

Distrugerea microorganismelor sau sterilizarea este indispensabil pentru pregtirea materialului de lucru i a mediilor de cultur.

Sterilizarea reprezint operaia de distrugere sau ndeprtarea tuturor formelor vegetative i de rezisten a microorganismelor patogene i apatogene.

Un produs este considerat steril cnd nu mai conine forme de microorganisme ce pot fi revitalizate. Exist mai multe procedee de sterilizare care corespund diferitelor tipuri de materiale ce trebuie tratate.

Metode de realizare a sterilizrii:

a) cu aer cald (140-200 oC);

b) cu vapori sub presiune (120-140 oC);

c) prin nclziri repetate (70-100 oC);

d) filtrare prin materiale poroase;

e) utilizarea radiaiilor (UV, IR, raze X, raze gamma, etc.)

f) utilizarea agenilor chimici (oxid de etilen, formaldehid, etc.)

g) preparare pe cale aseptic.

Produsele sterilizate nu trebuie s conin microorganisme vii sub form vegetativ sau sporulent capabile s se dezvolte n condiii adecvate. Metoda de sterilizare se alege n funcie de proprietile fizico-chimice ale produsului supus sterilizrii evitndu-se eventualele modificri din punct de vedere al calitii acestuia.

Metodele a)-c) sunt metode termice i se pot realiza prin nclzire uscat (a) i nclzire umed (b-c). Ultima variant este destul de eficient deoarece aburul i apa cald acioneaz prin hidratare cu coagularea i hidroliza proteinei bacteriene.

Sterilizarea prin metoda d) se utilizeaz frecvent n cazul produselor termolabile i cnd cheltuielile prin (a-c) sunt foarte mari; se utilizeaz filtre (plci) poroase, Jena G5, de azbest-celuloz; cu membran.

Sterilizarea prin e) dei prezint unele dezavantaje este aplicat tot mai mult n special pentru aerul din boxe sterile.

Sterilizarea prin f) se aplic produselor termolabile la rece cu etilenoxid, formaldehid, fenol, etc. Se poate utiliza combinaia a)-c) i adugare de substane chimice ca: aldehid formic, ap oxigenat, acid 5-nitrofenilacrilic.

Prepararea pe cale aseptic se folosete atunci cnd nu este posibila sterilizarea prin a)-e), realizndu-se n boxe sterile n care aerul din acestea se sterilizeaz prin d)-f).

n laboratorul de microbiologie de analize de rutin, cldura reprezint modalitatea de sterilizare cea mai ntrebuinat.

STERILIZAREA PRIN CLDUR

Cldura umed. Sterilizarea prin cldur umed se efectueaz n autoclavul cu aburi prin procedeul de autoclavare.

Principiu: n atmosfera de vapori de ap sub presiune, toate bacteriile (inclusiv formele sporulate) sunt omorte dup 20 minute la 1210C. Aceasta este metoda cea mai eficient de sterilizare.

Autoclavul permite:

- pregtirea materialului (medii de cultur, diferite obiecte) n vederea utilizrii n laborator, prin distrugerea microorganismelor;

- decontaminarea materialelor dup folosirea n laborator (cel puin 30 minute la 1210C). Microorganismele din produsele patologice, eantioanele de ap i produse alimentare analizate, din culturile microbiene de laborator etc., trebuie neaprat distruse.

Aceste dou operaii ar trebui efectuate de preferin n dou autoclave diferite sau, cel puin, n mod separat.

Duratele de sterilizare sunt date doar pentru obiecte, medii de cultur sau alte substane ce trebuie sterilizate n autoclav pentru analizele de rutin.

Tabel 2. Duratele de sterilizare pentru diferite materiale sterilizate

MaterialulsterilizatTemperatura(0C)Presiunea (barr)Timp (minute)

Sticlrie curat121120

Ap, ser fiziologic121120

Parafin121120

Sruri minerale121120

Medii curente (bulion nutritiv, geloz nutritiv)121115 - 20

Lapte degresat1150,715

Glucoz n soluie 1100,520

Controlul eficienei sterilizrii prin autoclavare este realizat adesea cu ajutorul unor indicatori de sterilizare cum sunt hrtiile indicatoare: sunt comercializate benzi de hrtie special imprimate pentru a vira culoarea dac au fost ndeplinite condiiile de sterilizare.

Pasteurizarea

Sterilizarea trebuie s fie deosebit de pasteurizare, care reprezint doar un procedeu de conservare utilizat n industria alimentar. Pasteurizarea const n tratarea produsului la o temperatur n domeniul 56 0C 85 0C, o durat variabil de la cteva minute pn la o or, n mediu umed, n funcie de produs.

n aceste condiii, majoritatea celulelor vegetative bacteriene sunt distruse, dar nu i formele sporulate.

TyndalizareaTyndalizarea const n 2 - 3 pasteurizri repetate, alternate cu perioade n care proba este meninut n condiii favorabile pentru germinarea endosporilor bacterieni, care devin vulnerabili trecnd n stare vegetativ i sunt distrui prin pasteurizare. Tyndalizearea se poate realiza n baie de ap, de exemplu, n urmtoarele condiii: nclzire la 56 0C (pn la 80 0C) timp de 1 or, 3 - 7 zile consecutiv, cu un interval de 24 de ore.

Tyndalizarea se poate folosi pentru distrugerea microorganismelor n mediile ce conin substane termolabile.

Cldura uscat

Sterilizarea prin cldur uscat se efectueaz n sterilizatoarele cu aer cald (etuv).

Cldura uscat nu poate distruge bacteriile i n special sporii bacterieni, dect la o temperatur mai ridicat ca n cazul cldurii umede. Tratamentul pentru sterilizare cu cldur uscat este de 4 ore la 140 0C sau 1 or la 180 0C.

Un alt procedeu de sterilizare prin cldur uscat este flambarea, care se efectueaz n flacra becului de gaz pentru: extremitatea firului ansei, exteriorul pipetelor, gtul eprubetelor i al flacoanelor.

ALTE PROCEDEE DE STERILIZARE

Sterilizarea prin filtrare

Filtrarea const n trecerea unui produs lichid printr-un perete poros sau o membran care reine bacteriile. Se pot utiliza filtre de porelan (Chamberland), de sticl poroas sau membrane tip Millipore, cu pori de diferite dimensiuni.

Sterilizarea prin gaze toxice

Oxidul de etilen, de exemplu, este foarte utilizat pentru sterilizarea materialului medico-chirurgical, a materialelor din plastic numite sterile, de unic folosin din industrie.

Sterilizarea cu ajutorul radiaiilorRadiaiile ultraviolete - sunt radiaii cu utilizare curent n laboratorul de microbiologie; ele sunt bactericide, dar nu distrug sporii bacterieni. Acest tip de radiaii acioneaz n mod direct i au putere de penetraie sczut (civa milimetri). Lmpile germicide al cror efect se bazeaz pe aciunea radiaiilor UV cu lungimea de und de 254 nm sunt utilizate :

- pentru sterilizarea apei

- pentru sterilizarea incintelor i a aerului ambiant

Radiaiile gamma

Radiaiile gamma fac parte din categoria radiaiilor ionizante i au un efect puternic microbicid. Sunt dificil de produs i de utilizat i foarte periculoase datorit efectelor pe care le au asupra materiei vii.

Acest tip de radiaii poate fi utilizat n sterilizarea materialului medical i microbiologic de folosin unic sau pentru sterilizarea unor deeuri.

3.1. PREGTIREA I STERILIZAREA STICLRIEI N LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE

Pregtirea i sterilizarea materialului n vederea utilizrii n laboratorul de microbiologie este o operaie deosebit de important deoarece exactitatea rezultatelor precum i reuita desfurrii proceselor microbiologice depind n mare msur de rigurozitatea cu care se efectueaz.

Principalele operaii de pregtire a sticlriei de laborator sunt:

- splarea

- uscarea

- executarea dopurilor i ambalareaRecipientele pot fi pregtite cu dop din vat hidrofob pentru a nu pstra umezeala dup autoclavare. Din ce n ce mai folosite sunt dopurile din celuloz comprimat (comercializate), sterilizabile pan la 200 0C. Pentru nlocuirea eprubetelor cu dop de vat, n scopul pstrrii optime a culturilor, se pot utiliza tuburi prevzute cu capsule care se monteaz prin nurubare.

Pentru evitarea contaminrii mediilor de cultur utilizate n analiza microbiologic sau n obinerea culturilor microbiologice, sticlria de laborator trebuie ambalat i sterilizat corespunztor. Sterilizarea se efectueaz la etuv (sau pupinel), iar materialele supuse acestei operaii trebuie s fie curate i mpachetate n hrtie sau aezate n conteinere metalice nchise. Sterilizarea uscat se poate aplica pentru articole din sticl (plci Petri, baloane, pipete, eprubete), obiecte din porelan, instrumentar metalic fr suduri n cositor, pulberi uscate etc. Aerul fiind slab conductor de cldur, sterilizatorul trebuie s uniformizeze temperatura i s asigure ptrunderea aerului fierbinte n obiectele de sterilizat. n calcularea timpului de sterilizare uscat trebuie avute n vedere urmtoarele etape:

perioada de nclzire la temperatura de sterilizare, socotit n general o or;

perioada de meninere a temperaturii de sterilizare;

perioada de rcire n care scderea temperaturii trebuie realizat treptat pentru evitarea spargerii obiectelor de sticl prin oc termic, aproximativ 2 ore.n practic se procedeaz la alegerea unei temperaturi de sterilizare de 180 oC i a unei durate de o or. Din exces de pruden se practic sterilizri la temperaturi mai ridicate sau de durate mai mari. n unele cazuri aceast practic este duntoare deoarece, de exemplu, vata ordinar - la durate i temperaturi mari de sterilizare uscat - elibereaz gudroane ce pot inhiba creterea microbian.

Materiale utilizate:

- pipete;

- plci Petri;

- eprubete;

- flacoane Erlenmayer;

- vat hidrofob;

- tifon;

- hrtie ambalaj i etuv.

Mod de lucru:Se execut dopuri de vat hidrofob pentru eprubete, astfel nct s poat fi extrase uor n timpul inoculrii, iar densitatea materialului s asigure sterilitatea. Eprubetele se introduc n coul de srm i se acoper cu hrtie. Pipetele se astup la partea opus vrfului, cu un dop subire de vat care s rein microorganismele ce ar putea ptrunde n pipet pe la partea superioar. Pipetele se ambaleaz ntr-o fie de hrtie care se rsucete n jurul tubului de sticl, ncepnd de la vrf. Plcile Petri se ambaleaz n hrtie de ambalaj, n funcie de numrul necesar. Flacoanele Erlenmayer pentru medii de cultur se astup cu dop de vat nfurat n tifon. Toat sticlria se sterilizeaz 1 or la 180 oC la etuv, timp socotit din momentul atingerii temperaturii. Dup aceast perioad etuva se oprete i se ateapt rcirea materialului.4. EXAMENUL MICROSCOPIC AL MICROORGANISMELOR

Studiul morfologiei microbiene nu poate fi conceput fr utilizarea microscopului; examenul microscopic joac un rol important n studiul i identificarea germenilor, precum i n determinarea numrului acestora.Microscopul (grec. mikrs: mic; skopein: a observa) este un instrument optic care mrete imaginea unui obiect observat printr-un sistem de lentile. MICROSCOPUL OPTIC

Microscopul optic se compune dintr-un stativ pe care sunt montate un sistem de transmisie optic, o platin port-obiect i un sistem de iluminare.

Sistemul de transmisie optic

Ocularele au puterea de mrire de 5x, 7x, 10x, 15x, 20x i chiar 30x. n lucrrile curente cele mai des folosite sunt cele 7x i 10x. Ocularele au rolul de a mri imaginea preparatului, dar i de a aplatiza i lumina cmpul optic.

Obiectivele reprezint un sistem optic bine centrat, constituit din una sau mai multe lentile destinate a forma o imagine real a obiectului. Puterea lor de mrire este invers proporional cu distana focal, adic cu distana dintre obiect i lentila pe care se formeaz imaginea. Calitatea esenial a obiectivelor este puterea lor de rezoluie. Aceasta la rndul ei depinde de mrimea deschiderii unghiului pe care l face conul de raze care intr n lentil precum i de indicele de refracie al mediului dintre obiect i lentil. Obiectivele sunt fixate prin nurubare pe un revolver port-obiectiv care permite selecionarea rapid a unuia din ele, prin simpla rotire. Gama de obiective necesare n microbiologie se compune din trei obiective cu puterea de mrire de 10x, 20x, 40x i un obiectiv cu imersie cu grosismentul 90x. Acest obiectiv se folosete n cazul n care obiectul ce trebuie examinat este mai mic sau dac este necesar a se observa amnunte foarte fine. La obiectivul cu imersie este necesar a se interpune ntre obiect i lentila frontal a obiectivului un lichid transparent (ulei de cedru, ulei de parafin, balsam de Canada etc.).

100 (m

domeniul microscopiei

optice celule epiteliale

10 (m globule roii din snge

bacterii tipice

1(m domeniul

microscopiei micoplasme electronice

100 nm

virusuri

10 nm (100()

proteine

1 nm (10() aminoacizi

atomi

0,1 nm (1()

Figura 1. Domeniile microscopiei optice i electronice

Sistemul de iluminare se compune din surs luminoas i dintr-un condensator.

Condensatorul este o pies care se gsete imediat sub platina microscopului i care are rolul nu att de a strnge (condensa) razele luminoase venite de la sursa de lumin, ct de a mri seciunea conului de lumin pentru o mai bun claritate a imaginii.

Sistemul de reglare Deplasarea platinei port-obiect sau a sistemului optic se efectueaz cu ajutorul unei cremaliere, prin intermediul a dou butoane: unul mare care d o micare ampl i rapid (viza macrometric) i altul mic, pentru reglajul fin ( viza micrometric).

Modul de utilizare a microscopuluiPreparatul este plasat pe platina microscopului, avnd grij s fie bine fixat n dispozitivul de prindere. Este selectat obiectivul; n general, un examen debuteaz cu utilizarea obiectivului cel mai mic. n practic, se utilizeaz obiectivul 10x, apoi 20x pentru un preparat necunoscut sau pentru drojdii i mucegaiuri i obiectivul 40x pentru bacterii. Se regleaz distana lentilei obiectivului fa de preparat prin micarea vizei macrometrice i a celei micrometrice. (Obiectivele au o distan de reglare care descrete cu puterea lor). Cutarea imaginii este apoi efectuat prin manevrarea butonului care acioneaz cremaliera, iar dup fixarea imaginii se face o nou reglare a acesteia. Curarea sistemului optic se efectueaz regulat cu xylol i nu cu alcool etilic.

Reglarea intensitii luminii condensatorului se face innd seama de puterea de mrire a obiectivelor; cu ct aceasta este mai mare, cu att poziia condensatorului este mai ridicat.

EXAMENUL PREPARATELOR N STARE PROASPT

Acest tip de operaie const n examinarea unui microorganism ntr-un mediu lichid ntre lam i lamel.

4.1. STUDIUL MICROSCOPIC AL CULTURILOR DE DROJDII

Drojdiile reprezint un grup taxonomic complex i heterogen de microorganisme unicelulare eucariote, care se nmulesc prin nmugurire, ca form general de reproducere i n mod particular prin ascospori. Una din proprietile cele mai importante ale drojdiilor este aceea de a fermenta o serie de zaharuri, n condiii de anaerobioz, cu formare de alcool etilic, dioxid de carbon i compui secundari, care dau aroma caracteristic produselor fermentate, proprietate foarte mult utilizat n industria alimentar. Drojdiile au o compoziie chimic valoroas i, dup cultivare n condiii de aerare sunt utilizate ca surs de proteine cu denumirea de SCP (single cell protein) n alimentaia omului i a animalelor.

Celula de drojdie are n mod obinuit form sferic, oval, cilindric, apiculat, sau form de sticl, cu dimensiuni medii de 4 - 14 (m. Forma i dimensiunea celulei sunt caractere de specie i pot fi influenate de starea fiziologic i de condiiile de cultivare.

Principiul metodei: Pentru evidenierea caracterelor morfologice i structurale ale drojdiilor se folosesc preparate microscopice n stare proaspt, studiate la microscop cu obiectivele 10x, 20x, 40x.Materiale utilizate: - ca materiale biologice se vor utiliza o tulpin de Saccharomyces cerevisiae i o tulpin de Candida utilis, cultivate pe mediu cu extract de mal-agar.

- lame de microscop;

- lamele de microscop

- microscop;

- pipete sterile;

- ans;

- eprubete sterile;

- albastru de metilen;

- alcool etilic 95 %;

- ap distilat 100 mL;

- sticlu picurtoare.

Mod de lucru:a) Prepararea colorantului-soluie albastru de metilen

Se cntresc 0,3 g albastru de metilen, peste care se adaug 30 mL alcool etilic 95 %. Dup dizolvarea colorantului n alcool se adaug 100 mL ap distilat.

b) Evidenierea caracterelor morfologice

De pe suprafaa mediului de cultur se recolteaz cu ansa o poriune din cultura de drojdie care se amestec ntr-o eprubet cu civa mL ap. Din suspensia de celule se depune pe lama microscopic o pictur cu diametrul de ~ 0,7 cm, n zona central, cu ajutorul unei pipete. Se acoper preparatul cu o lamel curat, evitndu-se formarea de bule de aer. Se examineaz la microscop cu obiectivele de 10x, 20x i 40x, reinndu-se forma celulei, prezena nucleilor, prezena celulelor nmugurite.

c) Evidenierea celulelor autolizate

O suspensie de celule de drojdie se amestec n volume egale cu o soluie de albastru de metilen diluat i dup 3-5 minute se execut un preparat umed: celulele autolizate vor apare intens colorate n albastru, comparativ cu celulele vii, necolorate. ntr-un cmp microscopic se vor determina numrul total de celule i separat, celulele autolizate, fcndu-se raportul acestora.

4.2. STUDIUL MICROSCOPIC AL CULTURILOR DE MUCEGAI

Mucegaiurile (sau fungii filamentoi) includ microorganisme de tip eucariot, monocelulare sau pluricelulare, cu nutriie de tip absorbtiv, difereniate din punct de vedere morfologic i care se reproduc prin spori sexuai sau asexuai. Corpul mucegaiurilor const din celule filamentoase, ramificate, numite hife, care formeaz miceliul. Mucegaiurile pot fi monocelulare, cnd se dezvolt sub forma unei celule uriae cu ramificaii (miceliu coenocitic) sau pluricelulare, caz n care miceliul este septat prin perei despritori (miceliu necoenocitic). Aparatul reproductor este reprezentat de hifele reproductoare purttoare de spori sexuai sau asexuai.

Principiul metodei: Pentru evidenierea caracterelor morfologice i structurale-hife vegetative i aparat reproductor - se efectueaz un preparat proaspt ntre lam i lamel sau un preparat n lactofenol, prin tehnica benzii adezive.Materiale utilizate:- culturi de Aspergillus niger i Penicillium sp. n plci Petri ;

- lame microscopice;

- lamele microscopice;

- microscop;

- pipete sterile;

- ans;

- lactofenol;

- band adeziv transparent.

Mod de lucru:

Se efectueaz un preparat umed ntre lam i lamel, n felul urmtor: din cultura n plci Petri se recolteaz cu ajutorul firului metalic, din partea marginal a coloniei i fr a deranja structura iniial a miceliului, o mic poriune, care se desprinde uor ntr-o pictur de ap steril sau lactofenol de pe lama microscopic. Se aeaz lamela evitnd formarea n preparat a bulelor de gaz i se face studiul cu obiectivele 10x, 20x i 40x. Pentru meninerea ct mai exact a structurii aparatului reproductor, se poate aeza uor banda cu partea adeziv peste cultura de mucegai din placa Petri, apoi se pune peste pictura de lactofenol de pe lama microscopic. Se examineaz cu aceleai obiective. Pentru cele dou tulpini fungice se observ forma hifelor, prezena septurilor hifale, prezena conidiforilor cu organele de fructificaie specifice genurilor Aspergillus i Penicillum.

4.3. EVIDENIEREA MICROSCOPIC A BACTERIILOR

Bacteriile sunt microorganisme monocelulare de tip procariot, cu un cromozom unic, cu dimensiuni medii ntre 0,5 - 8 (m, care se nmulesc asexuat prin sciziune binar, izomorf. Bacteriile au un rol major n natur n transformarea compuilor organici n compui anorganici simpli, prin procesul de mineralizare a materiei organice nevii, contribuind la realizarea circuitelor unor elemente chimice de importan vital: carbon, azot, sulf, fosfor .a. n procesele industriale, bacteriile sunt utilizate drept culturi starter n unele procese fermentative din industria alimentar (fabricarea produselor lactate, n panificaie, la conservarea materiilor prime vegetale), la obinerea de enzime, proteine, aminoacizi, acizi organici, solveni, antibiotice, ngrminte biologice, insecticide , vitamine, hormoni etc.

Principiul metodei: metoda se bazeaz pe efectuarea preparatului proaspt ntre lam i lamel din culturi bacteriene obinute din Bacillus subtilis i Lactobacillus sp.

Materiale utilizate:

- cultur n slanturi de Bacillus subtilis;

- cultur de Lactobacillus n mediu lichid (mediul MRS);

- lame microscop;

- lamele;

- ans;

- ap distilat.

Mod de lucru:Pe lama microscopic se pune o pictur de ap steril cu diametrul de 0,7 -1 cm. Cu vrful firului metalic se recolteaz steril, la flacra de gaz, o poriune dintr-o cultur de Bacillus subtilis pe agar nutritiv, n eprubete. Cultura se omogenizeaz ntr-o pictur de ap, apoi se ia o lamel curat , se sprijin pe lam la un unghi de 45o , se deplaseaz pn cnd lamela devine tangent la pictur i se las s cad peste aceasta: lichidul n exces se absoarbe cu o hrtie de filtru. Un preparat bun nu trebuie s prezinte bule de aer; acestea pot determina aglomerri de celule i mpiedic o bun observare a proprietilor.

Pentru executarea preparatului din culturile lichide de Lactobacillus, se recolteaz din proba omogenizat cu o pipet din care se las s cad pe lam o pictur, care se acoper apoi cu lamela.

Se observ cu obiectivele 20x i 40x. Se vor urmri: n ambele cazuri-forma celulelor, eventual formarea de lanuri de bacili; prezena sporilor bacterieni n cazul preparatului cu Bacillus subtilis.EXAMENUL PREPARATELOR BACTERIENE N STARE USCAT

Efectuarea unui preparat n stare uscat sau frotiu const n etalarea probei de studiat urmat de o uscare, de o fixare i, eventual, de o colorare. Frotiurile sunt realizate frecvent pentru bacterii sau pentru produse care conin bacterii, rareori pentru alte microorganisme.

4.4. TEHNICA DE EXECUTARE A PREPARATELOR USCATE. COLORAIA GRAM

n anul 1884 Christian Gram a constatat c bacteriile reacioneaz diferit n urma aceleiai tehnici de colorare i pune bazele metodei difereniale de colorare ce i poart numele, prin care bacteriile sunt mprite n dou mari grupe: Gram - pozitive i Gram - negative. Aceast afinitate tinctorial diferit fa de colorani este datorat structurii deosebite a peretelui celular la cele dou categorii de bacterii : bacteriile Gram - pozitive se coloreaz n violet prin aceast tehnic, n timp ce bacteriile Gram - negative primesc culoarea roz sau roie a colorantului secundar utilizat. Peretele celular al bacteriilor Gram - pozitive const ntr-un strat unitar i omogen de peptidoglican, cu grosimea de 20 - 80 nm. n contrast, peretele celular al bacteriilor Gram - negative este mai complex, format dintr-un strat de peptidoglican de 1 -3 nm nconjurat de o membran extern de 7 - 8 nm.

Principiul metodei: Colorarea difereniat a celulelor n funcie de structura peretelui celular, prin metoda Gram, are la baz o tehnic n mai multe etape. n prima etap, celulele sunt colorate cu colorantul bazic cristal-violet, utilizat drept colorant primar. Cea de a doua etap cuprinde tratamentul cu o soluie de I2/KI, cu rol de mordant, care mrete interacia dintre colorant i componentele celulei. A treia etap este reprezentat de splarea cu alcool-aceton, unde se difereniaz cele dou tipuri de bacterii; cele Gram pozitive rein cristalul violet, n timp ce bacteriile Gram - negative pierd colorantul primar i devin incolore. n final, acestea din urm sunt colorate cu un alt colorant, secundar, cum este safranina sau fuxina. n acest mod, cele dou categorii de bacterii rmn colorate diferit, putnd fi difereniate n funcie de structura peretelui lor celular.

Materiale utilizate:- cultur bacterian;

- violet de genian;

- fenol cristalizat;

- iod;

- iodur de potasiu;

- alcool;

- aceton;

- fuxin sau safranin

- ulei de imersie;

- lame de sticl;

- balan;

- pipete;

- baloane cotate;

- sticlue picurtoare.

Mod de lucru:

A. Prepararea soluiilor1. Violet de genian:

- violet de genian.. 1 g

- fenol cristalizat...5 g

- alcool etilic 96 % 10 mL- ap distilat... 100 mLSe tritureaz cristalele n mojar, se adaug cteva picturi de glicerin i treptat, alcoolul, pn devine ca o past, i apoi cantitatea de ap. Se pstreaz 48 ore, dup care se filtreaz i se folosete la colorarea dup Gram.

2. Soluie de Lugol:

- iod metalic.1 g

- iodur de potasiu. .2 g

- ap distilat300 mLSe dizolv iodura de potasiu n 5 mL ap, se adaug cristalele de iod i se dizolv, apoi se adaug restul de ap pn la 300 mL.

3. Fuxina Ziehl:

- fuxin bazic..1 g

- fenol cristalizat...5 g

- alcool etilic 96% 10 mL- ap distilat. ..100 mLSe tritureaz cristalele n mojar, se amestec cu cteva picturi de glicerin, se adaug alcoolul treptat, pn se formeaz ca o past i se adaug ap distilat. Se filtreaz dup un repaos de 48 ore. Pentru soluia diluat se face un amestec cu ap distilat n proporie de 1/10.B. Etapele de obinere a frotiurilor colorate sunt urmtoarele:

Pregtirea lamei: Lama perfect curat se sterilizeaz prin treceri consecutive ale ambelor fee prin flacra becului de gaz i se las s se rceasc pe stativ, n poziie nclinat.

Etalarea suspensiei de celule: Preparatul se realizeaz n pictur de ap steril n care se suspend celulele recoltate cu firul de inoculare. Suspensia de celule se ntinde prin deplasarea firului ansei tangent cu lama, ntr-un strat uniform. Preparatul de pe lama pe care s-a fcut etalarea i uniformizarea materialului biologic poart numele de frotiu.

Uscarea frotiului: Dup uniformizare, frotiul se aeaz pe stativul de uscare sau se menine n curentul de aer cald, la distan de flacra becului de gaz, pentru a se produce evaporarea lichidului i ataarea celulelor bacteriene de suprafaa lamei.

Fixarea frotiului: const n omorrea i aderarea la lam a celulelor microbiene. Fixarea prin cldur se face trecnd frotiul uscat de trei ori, cu o micare lent, prin flacra becului de gaz, cu faa opus celei pe care se afl preparatul.

C. Tehnica de colorare const n urmtoarele: Frotiul uscat i fixat se acoper cu violet de geniana, care se menine 1-2 minute, dup care se scurge i se cltete cu ap.

Frotiul se acoper cu soluie Lugol, cu rol de mordant, timp de 1 minut; se scurge i se cltete cu ap;

Splarea frotiului n 2-3 rnduri, cu picturi din amestecul de alcool-aceton (3/1);

Frotiul se spal cu ap n jet subire i se coloreaz cu o soluie de fuxin diluat (1/10), care se menine pe preparat 1-2 minute, se scurge excesul de colorant, se spal cu ap;

Uscarea frotiului i examinarea preparatului cu obiectiv de imersie.

Celulele Gram pozitive [G(+)] vor apare colorate n violet, celulele Gram negative, [G(-)], n rou.4.5. DETERMINAREA DIMENSIUNII CELULELOR CU AJUTORUL SCALEI MICROMETRICE

Principiul metodei:Msurarea diametrului celulelor, sporilor sau hifelor poate fi efectuat utiliznd un sistem ocular-obiectiv prevzut cu un micrometru ocular i un micrometru obiectiv.

Micrometrul ocular este o plcu rotund din sticl foarte clar, pe care este gravat o scar micrometric. Acesta se introduce n tubul ocularului microscopic, cu faa n jos, dup deurubarea lentilei superioare.

Scara micrometric este divizat n 50 de diviziuni egale notate de la 0 - 50, din 10 n 10. Valoarea unei diviziuni a scrii micrometrice variaz de la microscop la microscop, dar i n funcie de obiectivul folosit la examinare. De aceea este necesar ca aceste valori s fie determinate pentru fiecare microscop n parte i, la acelai microscop, pentru fiecare combinaie ocular - obiectiv.

Etalonarea se face cu ajutorul unei lame speciale numit micrometru obiectiv sau lam micrometric, pe care este de asemenea gravat sau fotografiat o scar lung de 1 mm i divizat n 100 pri. Spre deosebire de scara micrometric a ocularului, valoarea unei diviziuni de pe lama micrometric este cunoscut, fiind egal cu 1/100 dintr-un milimetru, adic cu 10 micrometri. Deci intervalul dintre dou diviziuni de pe lama micrometric este egal cu 10 micrometri.

Materiale utilizate:- micrometru obiectiv (0,01 mm);

- micrometru ocular;

- microscop;

- culturi de drojdii i mucegaiuri;

- lame microscopice;

- lamele microscopice;

- ac de inoculare.

Mod de lucru:

Etalonarea scrii micrometrice

Se aeaz lama cu micrometrul obiectiv pe platina microscopului i se introduce ocularul micrometric n ocularul stng al microscopului, cu faa in jos. Se prinde n cmpul microscopului scara micrometric a obiectivului (cu linii groase) i se pune la punct pn ce apare foarte clar vizibil. Se caut s se suprapun cele dou scri micrometrice aflate acum n cmpul microscopului (aceea cu linii groase i mai mari fiind scara obiectivului i aceea cu linii mai mici i subiri, scara ocularului). Se rotete ocularul cu scara micrometric astfel nct s se suprapun exact peste scara obiectivului. Se caut cte diviziuni ale micrometrului obiectiv sunt acoperite exact de diviziunile micrometrului ocular. Practic se procedeaz astfel: se caut prima diviziune a scrii obiectivului, care se suprapune exact peste una din liniile subiri ale scrii oculare. Se numr a cta diviziune a micrometrului ocular se suprapune din nou exact peste o diviziune a micrometrului obiectiv.

Pentru stabilirea valorii unui interval dintre dou diviziuni ale ocularului micrometric (care se mai numete i indice sau coeficient micrometric), se calculeaz astfel: dac o diviziune a obiectivului micrometric este egal cu 0,01 mm, atunci fiecare diviziune a micrometrului ocular va fi egal cu 0,01/ nr. de diviziuni dup care se suprapun. Etalonarea micrometrului ocular se va face pentru obiectivele 20x i 40x, astfel: dac n gradaii de pe ocular corespund la una sau p gradaii de pe obiectiv, o singur gradaie de pe ocular va avea valoarea 0,01/q sau (p/q)(10-2 mm. Prin acelai procedeu se determin indicele micrometric al fiecrui microscop, pentru toate combinaiile ocular-obiectiv, care se scriu apoi pe o list ce se aeaz n interior, pe ua cutiei microscopului. Pentru msurarea dimensiunilor celulei se va aeza preparatul microscopic proaspt ntre lam i lamel, pe platina microscopului i suport, se va poziiona astfel nct s poat fi determinat numrul de gradaii de pe ocular, corespunztor diametrului mare i diametrului mic, rotindu-se ocularul i dispozitivul de poziionare al platinei-port obiect. Cunoscndu-se valoarea unei diviziuni {(p/q)(10-2} i numrul de diviziuni citite pe scal, se va determina valoarea dimensiunii celulei: (n(p/q)(10-2 mm.

5. PREPARAREA I STERILIZAREA MEDIILOR DE CULTUR

Un mediu de cultur reprezint un substrat nutritiv complex, steril, care trebuie s asigure microorganismelor cantitatea necesar de ap, sursa de carbon, de azot, sruri minerale, factori de cretere, deci care s le furnizeze substanele i energia necesare n procesele de cretere, reproducere i ntreinerea funciilor vitale.

Mediul de cultur trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii:

s corespund din punct de vedere nutritiv,

s aib o concentraie a substanelor dizolvate care s nu influeneze negativ schimburile osmotice ale celulei

s nu conin substane toxice s aib un anumit pH

s fie steril (lipsit de microorganisme vii), astfel nct s se dezvolte numai celulele introduse prin inocul.Sterilizarea mediilor de cultur se poate realiza prin metode fluido-dinamice (filtrare, flotaie, centrifugare, termice, chimice i fizice (unde electroamgnetice)).

Cea mai utilizat metod de sterilizare este sterilizarea cu abur pentru c este uor de realizat i permite obinerea unui nalt grad de sterilitate. Inconvenientele procedeului sunt generate de reaciile secundare pe care le sufer componentele mediului de cultur (hidrai de carbon, aminoacizi, proteine) n timpul sterilizrii i anume:

a) denaturarea proteinelor i inactivarea enzimatic

b) degradarea parial a vitaminelor i a anumii factori de cretere

c) supranclzirile pot iniia reacii de oxidare a fenolilor i a acidului ascorbic, de polimerizare a aldehidelor nesaturate, de caramelizare a hidrailor de carbon, brumificarea mediului sau de condensare a gruprilor aldehidice din zaharuri reductoare cu grupele aminice libere din aminoacizi sau proteine.

Produii rezultai n urma reaciilor secundare sunt toxici pentru majoritatea microorganismelor i trebuie ca formarea lor s fie evitat n timpul sterilizrii. Din acest motiv se recomand sterilizarea separat a hidrailor de carbon i a compuilor cu azot i amestecarea ulterioar a lor.

Mediile de cultur se folosesc n practica de laborator sau n practica industrial i sunt foarte difereniate n funcie de scopul urmrit. n tehnica de laborator mediile se folosesc pentru izolarea din mediul natural a diferitelor microorganisme, pentru obinerea de culturi pure, pentru ntreinerea culturilor selecionate. n scopuri industriale, mediile de cultur sunt utilizate pentru obinere de biomas sau a unor compui de natur microbian.

Cerinele nutriionale ale celulelor de cultur depind de metabolismul lor. Una din ideile de baz ale logicii viului general valabil pe Pmnt este c biochimia tuturor entitilor vii are la baz chimia carbonului.

Nutrienii ce constituie mediul de cultur sunt cunoscui sub denumirea consacrat de substrate. Dup aportul n constituieni celulari se numesc i surse de: C, H, N, O, P, microelemente i altele. Evident c un substrat poate fi concomitent sursa de C i N i similar.

n ceea ce privete microorganismele, majoritatea celor cu aplicaii industriale obin carbonul celular din compui organici (de unde denumirea de heterotrofe). Pe lng rolul lui esenial de constituent major al materialului celular, carbonul din compuii organici este folosit i ca surs de energie.

Ca surs de material celular, carbonul formeaz cca 50% din masa celular uscat a bacteriilor i fungilor. Domeniul compuilor organici cu carbon care pot fi utilizai este vast, iar versatilitatea lumii microbilor se manifest prin faptul c toi compuii cu carbon sintetizai sunt la rndul lor biodegradabili. Zaharurile i n mod special glucoza sunt sursele de carbon i energie cele mai folosite n mediile de cultur ale microorganismelor, dar n funcie de necesitile nutriionale speciale ale altor celule se mai folosesc derivai de zaharuri, alcooli, acizi grai, acizi organici, hidrocarburi i compui organici cu azot.

La rndul su azotul reprezint 8-14% din masa molecular uscat a bacteriilor i fungilor. Majoritatea microorganismelor pot utiliza n primul rnd ionul de amoniu (NH4+) ca surs de N. De aceea n majoritatea mediilor de cultur de laborator sau industriale se folosesc sruri de amoniu ca surs de N. n funcie de nevoile metabolice existente mai pot fi folosite ca surse de N nitraii (dei se acumuleaz adesea nitrai toxici) uneori chiar N gazos sau produi organici cu azot (proteine sau peptide). De obicei mediile de cultur conin o sare de amoniu ca surs de N anorganic i un derivat industrial cu coninut de N organic. Sursele de N organic (derivat de soia, extract de drojdie, extract de porumb, snge uscat, extract de semine de bumbac, fracii solubile de la distilarea alcoolului i altele) aduc i un aport suplimentar n mediul de cultur de factori de cretere, ce vor fi prezentai ulterior.

Sursa de H, este de obicei concomitent cu sursa de C n produsele organice. Sunt foarte rare cazurile de folosire a H gazos.

Oxigenul este prezent i el n toi compuii organici celulari i apa celular. El este obinut din majoritatea compuilor organici ai mediului de cultur, dar n cazul metabolismului aerob este absolut necesar oxigenul din aer.

Prezena P este esenial pentru creterea culturii i pentru o serie de alte procese metabolice, sursa consacrat fiind constituit de fosfai i uneori de unii derivai organici.

S se obine de obicei din sulfai, iar K (principalul cation al celulei) este introdus de asemenea sub forma de sulfai sau de fosfai. Sursa important de Mg este sulfatul respectiv.

n mediul de cultur se introduc adesea microelemente, soluii de sruri minerale care conin ionii metalici de care au nevoie metaloenzimele din celul. Concentraiile acestor sruri sunt extrem de reduse n mediu. n funcie de cerinele unor microorganisme se mai introduc vitamine i uneori aminoacizi.

Odat stabilit formula mediului de cultur n funcie de cerinele nutriionale ale celulelor, urmtoarea etap este prepararea acestuia. Este numai aparent o operaie simpl, pentru c cere totui elaborarea unei proceduri dedicate, astfel ca fiecare cantitate de mediu preparat s fie identic cu celelalte, deci asigurarea unui nalt grad de reproductibilitate a compoziiei. Aceasta nseamn c trebuie urmrite cu atenie condiiile de conservare i manipulare a componentelor la temperaturi i umiditate controlate. n special n cazul mediilor pentru instalaia industrial, protocoalele de lucru trebuie s conin instruciuni ct mai clare, astfel nct s se evite producerea unor reacii nedorite ntre componentele mediului, cnd ingredientele sunt introduse ntr-o ordine greit (se poate ajunge la precipitarea unor componente, care odat scoase din soluie nu mai sunt accesibile celulelor de cultur, sau la eliminarea unor componente volatile, de exemplu amoniacul; se poate realiza complexarea unor sruri sau reacii de condensare ntre componentele organice, mai ales n timpul sterilizrii mediului).

Este important ca mediul s fie suficient agitat n timpul preparrii, astfel nct s se solubilizeze toate componentele iar limitele de solubilitate ale substanelor s fie avute n vedere cu grij.

Dup scopul utilizrii lor, mediile de cultur se mpart n:

medii de cultur generale care asigur dezvoltarea unui mare numr de specii

medii de cultur selective care permit dezvoltarea unui numr restrns de microorganisme

medii de cultur de difereniere care permit separarea speciilor n funcie de anumite caractere biochimice

medii de mbogire destinate separrii i cultivrii unor microorganisme pretenioase din punct de vedere nutritiv sau care se afl n numr redus

medii de conservare

medii de cultur industriale

Din punct de vedere al compoziiei chimice, mediile de cultur se mpart n 3 categorii:

medii naturale (empirice) de origine animal sau vegetal, cu o compoziie chimic nedefinit n mod exact;

medii sintetice: acestea sunt soluii de substane chimice pure n ap distilat, cu o compoziie perfect determinat;

medii semi-sintetice: sunt constituite din produse chimice bine definite, dar i din produse de origine natural (cu compoziie cunoscut).

Constituenii principali ai mediilor de cultur sunt:

1. Extracte de carne i macerate

Aceste produse, comercializate n form concentrat sub denumirea de extracte de carne, conin n principal proteine puin hidrolizate, glucide, sruri minerale, vitamine hidrosolubile. Compoziia lor variaz n funcie de carnea utilizat pentru preparare.

2. Extracte de drojdie

Aceste extracte, comercializate sub form deshidratat, sunt preparate din drojdia de bere, fiind utilizate ca surs de aminoacizi i de vitamine hidrosolubile (vitamine din complexul B).

3. Peptone i hidrolizate

Peptonele reprezint un amestec de compui solubili n ap care provin n urma aciunii enzimelor asupra materialului proteic. Pot fi: pepton pepsic din carne, pepton tripsic din cazein (cu coninut crescut n triptofan), pepton pancreatic de cazein, pepton tripsic de carne, pepton papainic de soia, peptone compuse.

Hidrolizatele sunt peptone obinute n urma aciunii compuilor anorganici asupra proteinelor (acid clorhidric de ex.). Cel mai des ntrebuinat este hidrolizatul acid de cazein, coninnd aminoacizii constitutivi ai cazeinei din lapte.

4. Agar-agarul sau geloza

Agar-agarul denumit i geloz este un extract de alge roii (Rhodophyceae) din genul Gelidium i Gracilaria, recoltate n mrile Japoniei sau ale Noii Zeelande. Se dizolv n ap la o temperatur n jur de 900C i se solidific sub 450C, fiind utilizat pentru solidificarea mediilor de cultur. Nu este degradat de microorganismele obinuite. Este comercializat n forma sa iniial deshidratat, numit agar fibre (foarte impur), sub form de paiete (mai puin impur), sau sub form de pulbere.

Numeroase firme sunt specializate n producerea i comercializarea mediilor de cultur de laborator (firma Difco, Merck, Biokar, Oxoid).

Mediile fermentative sunt medii de cultur industriale destinate producerii unor cantiti mari de celule sau produi de metabolism. n compoziia acestor medii intr ca surse de carbon: melasa, produs secundar rezultat la fabricarea zahrului i care conine 45 - 55% zaharoz, diferite tipuri de finuri, cereale boabe, zer bogat n lactoz, tre etc. Dintre sursele de azot cel mai des folosite sunt: finurile proteice de soia, sulfatul de amoniu, ureea, ngrmntul complex. Ca sruri minerale se adaug fosfai, sulfai, cloruri etc. Pentru cultivarea microorganismelor care necesit factori de cretere, se adaug extract de porumb (obinut prin concentrarea apelor rezultate la nmuierea porumbului, bogat in aminoacizi, vitamine, acid lactic, microelemente), extract de drojdie, extract din radicele de mal i germeni de gru i porumb.

5.1. PREPARAREA MEDIILOR DE CULTUR PENTRU NTREINEREA BACTERIILOR, DROJDIILOR I MUCEGAIURILOR

Materiale utilizate:

- balan cu precizie de 0,1 g;

- pahare Berzelius;

- sit azbest;

- agar nutritiv pulbere;

- mediu de cultur extract de mal - agar pulbere;

- mediu extract de cartof-dextroz-agar pulbere;

- eprubete cu dop, sterile;

- pipete de 10 mL;

- flacoane Erlenmayer;

- bec de gaz;

- autoclav cu gaze.

Mod de lucru:

Conform indicaiilor de pe flacoanele coninnd mediile de cultur pulverulente, se vor cntri cantitile necesare pentru a obine cte 1 litru din fiecare tip de mediu de cultur pentru eprubete i cte 300 mL mediu pentru baloanele Erlenmayer. n cazul n care nu exist medii deshidratate, procurate de la firme specializate, mediile se vor prepara prin cntrirea componentelor pentru volumul final dorit.

Mediul de cultur se aduce la fierbere n paharele Berzelius de 1 L, pn la completa dizolvare a agarului, apoi se repartizeaz cte 10 mL n eprubete sterile, prevzute cu dop de vat, care se aeaz n couri de srm i se acoper cu hrtie. n mediu se determin pH-ul i, dac este necesar, se ajusteaz la valoarea dorit. Mediile cu agar nu trebuie s fie aduse la un pH mai mic de 6, deoarece agarul este parial hidrolizat n timpul sterilizrii la pH acid i nu se mai solidific la rcire. Cnd sunt necesare astfel de medii, pH-ul trebuie ajustat dup sterilizare.

Baloanele Erlenmayer se astup cu dop de vat nvelit n tifon, se leag la gur cu hrtie i sfoar. Courile i baloanele Erlenmayer se introduc n autoclavul cu gaze, iar sterilizarea se face conform instruciunilor afiate lng aparat.

Se nchide capacul autoclavului, se verific nivelul apei n vasul de nivel, se aprinde gazul i se ateapt apariia jetului de abur viu care este eliminat prin purj.

Dup 10-15 minute de purjare se nchide robinetul purjei, iar presiunea indicat de manometru va urca pn la valoarea 1, unde va fi meninut timp de 20 min. prin micorarea flcrii.

ntre presiune i temperatura din autoclav exist o corelaie, aa cum se prezint n tabelul urmtor:Tabel 3. Corelaie ntre presiunea i temperatura din autoclav Temperatura,

oCPresiunea, kg/m3Presiunea, atm

1000,000,00

1050,200,20

1100,430,42

1120,550,50

1150,690,67

1200,990,96

1211,001,00

1221,331,29

1281,551,50

1301,721,65

1352,162,09

1402,652,56

Dup acest interval se oprete gazul, se ateapt scderea presiunii pe manometru, se deschide purja i dup 5 minute se poate deschide capacul autoclavei.

n general, mediile de cultur trebuie s ofere o suprafa de dezvoltare suficient pentru microorganisme. De aceea , dup sterilizare tuburile cu mediu se nclin pentru ca s rmn cu o suprafa mare de cretere. nclinarea se face prin sprijinirea eprubetelor pe o baghet suficient de groas, innd seama ca mediul negelificat s nu ude dopul de vat, ci s se opreasc la 2 - 3 cm de acesta. Prin rcire, vaporii ce ies din mediul cald, se condenseaz pe pereii mai reci ai eprubetelor i cad sub form de picturi pe mediu, adunndu-se pe fundul eprubetei. Din aceast cauz, eprubetele cu mediul rcit nu se aeaz n poziie orizontal, ci vertical, in couri de srm. Acestea se acoper apoi cu o hrtie i se leag cu sfoar.

Pentru a nu prepara n fiecare zi medii, sau, dac este nevoie de mai multe feluri de medii n acelai timp, acestea se pregtesc o dat i apoi se depoziteaz pentru pstrare. Sticlele cu medii se eticheteaz, notndu-se tipul mediului i data preparrii. Pentru evitarea uscrii se recomand pstrarea mediilor nutritive n frigider.

Sterilizarea mediului de cultur are ca scop ndeprtarea organismelor nedorite care pot avea un efect duntor asupra productivitii. Creterea rapid a contaminanilor poate reduce substanial concentraia nutrienilor disponibili pentru celulele de cultur. Dezvoltarea unor organisme strine poate conduce la consumul masiv al sursei de C i de N, al unor precursori eseniali, poate limita cantitatea de oxigen solubil n mediu disponibil n cazul bioproceselor aerobe, poate induce i alte modificri duntoare modificarea pH-ului, excreia de substane toxice. n aceste condiii se poate ajunge fie la inhibiia creterii celulelor de cultur fie la contaminarea i chiar descompunerea metabolitului de interes. Anumite mucegaiuri contaminante pot produce chiar importante creteri ale vscozitii mediului n detrimentul eficienei amestecrii.

Sterilizarea mediilor se realizeaz n mod uzual prin tratament termic, filtrare, folosirea unor radiaii, tratament chimic sau diverse combinaii ale acestora. Utilizarea radiaiilor i tratamentelor chimice este rar n cazul mediilor industriale. Pentru unele componente ale mediilor labile la temperatur, filtrarea sterilizant prin membrane este cea mai recomandabil.

Metoda cea mai folosit pentru sterilizarea mediilor industriale complexe este sterilizarea cu abur sub presiune. Durata acestei sterilizri, ceea ce implic perioada de nclzire treptat i de meninere a temperaturii de sterilizare sunt de asemenea probleme care trebuie studiate cu grij naintea procedeului industrial, astfel nct s se asigure att gradul avansat de sterilizare, ct i conservarea calitii mediului de cultur.

nclzirea unor amestecuri complexe de substane chimice, anorganice sau organice la temperaturi mai mari de 120 0C i pentru perioade mai lungi de 20 de minute poate cauza distrugerea unor componente de mediu fie prin degradare termic direct, fie prin producerea unor reacii nedorite ntre componente, disprnd cel puin parial unele substraturi i aprnd n schimb produse toxice pentru cultur. Condiiile n care are loc sterilizarea pot afecta nu numai stabilitatea componentelor dar de asemenea disponibilitatea lor pentru organismul de cultur. Microelementele de exemplu pot exercita o influen asupra solubilitii nutrienilor majori. De asemenea temperatura i durata sterilizrii pot afecta solubilitatea unor componente ale mediului.

6. NSMNAREA CULTURILOR DE BACTERII, DROJDII I MUCEGAIURIPrincipiul metodei:

Microorganismele pot fi cultivate pe medii de cultur n plci Petri sau n tuburi, att pentru studiul lor, pentru conservarea lor prin refrigerare, ct i pentru obinerea culturilor stoc i de lucru, n diversele procese biotehnologice. Operaia de trecere a unei culturi dintr-un vas de cultur n altul se numete repicare sau trecere, iar fragmentul de cultur ce se trece pe alt mediu se numete inoculum.

6.1. NSMNAREA N TUBURI

Materiale utilizate:

- culturi de Bacillus subtilis pe agar nutritiv;

- culturi de Saccahromyces cerevisiae pe mediul extract de mal - agar;

- culturi de Monascus purpureus, Aspergillus niger i Penicillium pe mediul extract de cartof - dextroz - agar;

- fir de inoculare;

- bec de gaz;

- eprubete cu mediu sterilizat i nclinat (nutrient-agar, extract de mal-agar, extract de cartof-dextroz-agar);

- termostat la 30 oC;

- lamp bactericid.

Mod de lucru:

nsmnarea cu ansa Se terge suprafaa din interiorul niei de lucru cu un tampon mbibat cu alcool 95%. Se aprinde lampa bactericid i se las 15 minute pentru sterilizarea incintei de lucru. Se spal minile cu spun, apoi se cltesc cu alcool. Se aprinde becul de gaz i se regleaz flacra, care trebuie s aib conul de culoare albastr.

Se ine eprubeta n care exist cultura ce trebuie repicat cu mna stng, n poziie oblic sau chiar orizontal. n mna dreapt se ine acul de repicat. Acesta se arde n flacra becului de gaz, inndu-l n poziie vertical pentru ca flacra s cuprind o poriune ct mai mare din el. Se ine n flacr pn ce mai mult de jumtate din ac se nroete, apoi se plimb de 2 -3 ori i restul acului pn la mner, n flacr.

Dup aceea se apropie gura eprubetei de flacr i, cu degetul mic de la mna dreapt ndoit, se trage afar dopul de vat din gura eprubetei, apucndu-l de captul rmas afar. Nu i se d drumul dopului pe mas ci se ine tot timpul n mn. Se trece gura eprubetei de 2 -3 ori prin flacr. Se introduce acul fierbinte n eprubet i se rcete, nu n cultur, ci alturi, pe o poriune de agar fr cultur. Se ia apoi o foarte mic poriune (de 1 - 2 mm) din cultur pe vrful acului (se alege poriunea cea mai tipic i mai curat a culturii respective).

Se scoate acul din eprubet, se arde din nou gura eprubetei i se astup cu dopul de vat din mna dreapt. Se las jos eprubeta i se ia, tot cu mna stng, o alt eprubet cu mediu steril.

Acul de repicat cu fragmentul de cultur, se ine mai departe n mna dreapt ferindu-l acum de flacr. Se procedeaz cu eprubeta a doua la fel cum s-a procedat cu prima, adic: se ine n poziie orizontal sau puin oblic n mna stng, se scoate dopul cu degetul cel mic de la mna dreapt ndoit, inndu-se tot timpul operaiei de repicare n mn. Se trece gura eprubetei prin flacr, se introduce acul de repicare cu fragmentul de cultur, atingnd uor mediul (n centrul eprubetei), pn ce partea din cultur rmne pe mediu. Uneori este bine ca fragmentul de cultur s fie puin afundat n mediu, pentru a face un contact mai strns cu el.

Se scoate acul de repicat din eprubet, se arde din nou gura eprubetei i se astup cu dopul din mna dreapt. Se trece i captul dopului care a fost inut cu mna prin flacr, dar foarte rapid.

Se arde din nou acul n flacr pan la rou. Aceast operaie este absolut necesar i trebuie fcut cu rbdare, pentru a se evita infectarea mediilor urmtoare. Dup arderea acului se ia din nou eprubeta cu cultura ce trebuie repicat i se repet operaia de repicare cu o alt eprubet steril. Toate micrile descrise mai sus, din care const operaia de repicare, trebuie executate destul de repede pentru a nu permite infectarea mediilor sterile din eprubete. Ele trebuie fcute cu o oarecare ritmicitate i nu prelungite prea mult. De asemenea trebuie respectate o serie de indicaii, care la prima vedere par minore, dar de care depinde foarte mult reuita unei repicri.

Astfel, trebuie avute n vedere:

-inerea eprubetei n poziie orizontal n timpul repicrii pentru a evita cderea sporilor de ciuperci i bacterii din atmosfer pe mediu;

-inerea acului de repicat n poziie vertical n flacr i nu orizontal, pentru ca arderea s se fac pe o poriune ct mai mare;

-scoaterea dopului de vat cu degetul mic al minii drepte i inerea lui tot timpul n mn, pentru a-l feri de contaminri secundare;

-arderea gurii eprubetei la scoaterea i introducerea dopului de vat, deoarece pe marginile exterioare ale eprubetei pot exista germeni de infecie secundar.

Dup dezvoltarea culturii se observ aspectul, culoarea, tipul coloniilor, precum i eventuala prezen a contaminrii cu alte microorganisme.

nsmnarea cu pipeta Pasteur sau cu pipeta gradat

Pentru pregtirea pipetei Pasteur, se ia un tub de sticl obinuit, cu diametrul exterior de 6 mm i cel interior de 4 mm, care se taie la o lungime de 25 cm, se rotunjesc marginile la flacr, se astup cu dopuri de vat, se ambaleaz i se sterilizeaz. n momentul utilizrii, partea median a tubului se menine n vrful conului albastru al flcrii, se rotete uor i, cnd sticla s-a nmuiat, se ndeprteaz din flacr i se efileaz dup lungimea dorit. Dup solidificare, se separ n cele dou jumti cu care se poate lucra.

nsmnarea cu pipeta se practic atunci cnd se dorete recoltarea unui inocul lichid. Pipeta se trece rapid prin flacr, iar pipeta Pasteur se sparge n dreptul mijlocului efilat. Din tubul ce conine cultura se preleveaz cteva picturi sau un volum determinat de inocul, care se pipeteaz n mediul proaspt, steril.

Culturile se termostateaz timpul necesar dezvoltrii fiecrui tip de microorganism.

6.2. NSMNREA N PLCI PETRIMateriale utilizate:- plci Petri sterile

- medii de cultur pentru bacterii, drojdii, mucegaiuri, aceleai ca n cazul nsmnrii n tuburi

- culturi de bacterii, drojdii, mucegaiuri

- pipete sterile

- ap steril

- fir de inoculare

- bec de gaz

- termostat

Mod de lucruMediul de cultur steril se topete pe baie de ap, dup care se rcete la 470C i se repartizeaz n mod aseptic n plcile Petri, pentru evitarea unui condens prea mare pe capacul plcii. Se las mediul s se solidifice la temperatura camerei. Pentru economie de spaiu i pentru evitarea formrii unui condens prea abundent, plcile se pot aeza una peste alta, dac este posibil.

Se agit tubul coninnd suspensia de celule n ap steril i se recolteaz cu pipeta aproximativ 2 mL din cultur, care se introduc n placa Petri, pe suprafaa mediului nutritiv. Se repartizeaz omogen, pe toat suprafaa, se scurge excesul de lichid i se termostateaz la temperatura convenabil.

nsmnarea mediului de cultur din plcile Petri se poate face de asemenea, prin ncorporarea suspensiei de celule, astfel: se pipeteaz n placa steril, goal, 1 mL din suspensia de celule, dup care se toarn mediul topit i rcit la 45 47 0C i se omogenizeaz pentru repartizarea uniform a celulelor din cultur. Se las s se solidifice i se incubeaz.

7. STUDIUL CARACTERELOR COLONIILOR DE BACTERII, DROJDII I MUCEGAIURI1. Caractere morfocoloniale ale bacteriilora. Culturi pe medii gelozate n plci PetriSe vor examina coloniile bacteriene care s-au dezvoltat pe suprafaa mediului solidificat n perioada care a trecut de la lucrarea anterioar, avndu-se n vedere urmtoarele caractere:

1. Mrimea coloniilor: - colonii mici < 1 mm

- colonii medii 1,5 pn la 3 mm

- colonii mari 3 mm

2. Forma coloniei la bacterii:

a

b

c

d e f

Figura 2. Forma coloniei la bacterii: - punctiform (a), circular (b), filamentoas (c), neregulat (d), rhizoid (e), fusiform (f)

3. Profilul coloniei la bacterii:

a

b

c

d

e

Figura 3. Profilul coloniei la bacterii: - plat (a), crescut (b), convex (c) , pulvinat (d), umbonat(e)

4. Marginea colonilor bacteriene:

a

b

c

d

e f

Figura 4. Marginea coloniilor bacteriene: - uniform (a), ondulat (b), lobat (c), erodat (d), filamentoas (e), buclat (f)5. Transparena: - colonii transparente

- colonii translucide

- colonii opace.

6. Suprafaa: - colonii lise (uneori strlucitoare)

- colonii rugoase

- colonii mucoide

7. Consistena - nu poate fi apreciat cel mai adesea dect n urma prelevrii de probe:

- colonii grase, cremoase, care dau uor suspensii omogene

- colonii uscate

- colonii mucoide (filante), care dau greu suspensii omogene.

8. Pigmentaia: - coloniile sunt cel mai adesea de culoare crem. O culoare diferit este datorat unor pigmeni, care sunt uneori solubili n mediul de cultur i care nu apar dect la o temperatur determinat.

n final, coloniile bacteriene pot aparine unuia din urmtoarele tipuri:

Tipul 1. Colonii S (engl.Smooth = neted, lucios)

- margini regulate, uneori semi-bombate

- suprafa neted

- consisten cremoas suspensie omogen

Tipul 2. Colonii R (engl. Rough = rugos, aspru, zbrcit)

- margini adesea neregulate

- suprafa rugoas

- consisten uscat suspensie heterogen

Tipul 3. Colonii M (cu consisten mucoid)

- margine uniform, regulat

- colonii bombate

- suprafa neted, strlucitoare

- consisten filant suspensie heterogen

corespund adesea bacteriilor capsulate Gram negative(Klebsiella, Enterobacter etc.)

b. Culturi n medii lichide n tuburi

Dac s-a realizat o cultur ntr-un bulion nutritiv n tuburi, dup o incubare de 48 ore se pot evidenia urmatoarele caractere:

1. Turbiditatea: - tulburare mai mult sau mai puin intens a mediului

2. Formarea unei pelicule: - n cazul bacteriilor aerobe apare la suprafaa mediului o mas de celule care formeaz un voal

3. Formare de depozit: n cazul bacteriilor anaerobe se formeaz un sediment pe fundul tubului, mai mult sau mai puin abundent, colorat sau nu.

2. Caractere morfocoloniale ale drojdiilor

- se va observa forma i profilul coloniei, diametrul acesteia, aspectul (de obicei cremos), suprafaa (lucioas sau mat), culoarea (n general alb-crem).

3. Caractere morfocoloniale ale mucegaiurilor

Vor fi determinate urmtoarele caractere coloniale:

- diametrul coloniei dup un timp cunoscut

- culoarea coloniei i modificarea acesteia n timpculoarea reversului coloniei

- textura suprafeei coloniei: pufoas, psloas

- eventual prezena picturilor de transpiraiepe miceliul aerian- mirosul

8. DETERMINAREA VITEZEI DE CRETERE A COLONIILOR DE MUCEGAIDezvoltarea mucegaiurilor are loc destul de rapid n condiii favorabile, astfel c n interval de 2 - 3 zile pe mediu nutritiv se formeaz colonii vizibile, care cresc n diametru. n cazul mucegaiurilor inferioare caracterizate prin miceliu coenocitic, neseptat, coloniile se dezvolt rapid, sunt extinse, cu tendina de a ocupa tot spaiul disponibil, avnd aspect pslos i culori alb, bej, cenuiu, brun. Mucegaiurile superioare caracterizate prin miceliu septat formeaz colonii cu cretere radiar limitat i culori ce difer de la alb la galben, brun, verde, portocaliu, albastru.

Principiul metodei:

Viteza de cretere a mucegaiurilor se poate determina prin cultivarea acestora n plci Petri, prin nepare central i msurarea zilnic a diametrului coloniei, pn la invadarea complet a suprafeei plcii. Pentru microorganismele cercetate, apariia sporilor coincide cu colorarea zonei respective, ncepnd cu centrul coloniei.

Materiale utilizate:- plci Petri sterile;

- ans microbiologic;

- mediu de cultur: extract de mal - agar n flacoane Erlenmayer;

- soluie acid lactic 5 %, steril;

- hrtie indicatoare de pH;

- material biologic -cultura n slanturi de Pencillum, Aspergillus sau alt mucegai

- baie de ap termostat;

- bec de gaz.Mod de lucru:

Mediul de cultur se topete pe baia de ap, apoi se termostateaz la 45 oC. Se adaug soluia steril de acid lactic pn cnd pH-ul devine 3,5, valoare la care este inhibat dezvoltarea bacteriilor, dar nu i a mucegaiurilor.

Se toarn 15-20 mL mediu de cultur n fiecare plac Petri i se las la temperatura camerei pentru solidificare.

Cu vrful acului de inoculare, se recolteaz o mic poriune din cultur sporulat din eprubeta cu cultura de mucegai i se nsmneaz prin nepare n partea centrala a plcii, cu mare atenie pentru a nu se rspndi sporii pe suprafaa mediului de cultur. Cutia se va nchide cu band adeziv i se termostateaz la temperatura camerei, msurndu-se zilnic diametrul coloniei.

Se determin viteza de cretere, Vcretere, dup formula:

= diametrul maxim al coloniei / nr.zile (ore)

9. ESTIMAREA DENSITII POPULAIILOR MICROBIENE Numrarea microorganismelor se execut n mod frecvent n laboratorul de microbiologie, n vederea aprecierii stadiului de multiplicare a celulelor din diferite culturi folosite n industrie sau pentru determinarea gradului de contaminare a unor produse, n special alimentare. Pentru a asigura o numrare rapid i n acelai timp precis, innd cont c ncrctura microbian a diferitelor produse i culturi poate s fie foarte ridicat, se recomand n prima etap s se efectueze diluri ale produsului supus analizei microbiologice.

TEHNICA OBINERII DILUIILOR DECIMALE

Dup recoltare, la omogenizarea probelor destinate analizei microbiologice, se recomand ca raportul ntre produs i diluant s fie de 1:10, obinndu-se astfel prima diluie (diluie 10-1). Pentru efectuarea urmtoarelor diluii decimale, cu o pipet steril, se barboteaz lichidul pentru omogenizare, se recolteaz 1 mL din diluia I i se scurge lichidul n alt eprubet cu 9 ml ser fiziologic steril, obinndu-se diluia a II-a (diluie 10-2) i se continu procedeul pn la obinerea diluiei necesare. Gradul de diluare este condiionat de numrul presupus de microorganisme din proba de analizat; cu ct numrul este mai mare, cu att se fac mai multe diluii. Pentru majoritatea produselor sunt suficiente 4 - 8 diluii succesive.

Cnd se face numrarea celulelor dintr-o anumit diluie considerat corespunztoare, numrul obinut se multiplic cu coeficientul de diluie k, pentru a obine numrul de celule existent n produsul iniial (pentru d I, k = 10, pentru d II, k = 100 etc).

Pentru evitarea erorilor se recomand omogenizarea coninutului eprubetelor n care s-a fcut diluarea fie prin rotirea eprubetei ntre palme, fie, cu ajutorul pipetei sterile, prin barbotare, nainte de recoltarea volumului de 1 mL destinat urmtoarei diluii. Se iau toate msurile de precauie pentru a evita contaminarea cu microorganisme din mediul ambiant, lucrnd n zona de protecie din jurul flcrii becului de gaz i respectnd regulile de manipulare.

Figura 5. Tehnica obinerii diluiilor decimaleDup efectuarea diluiilor decimale, numrarea microorganismelor se poate realiza prin metode directe, cu ajutorul camerelor de numrare sau prin metode indirecte.

9.1. ESTIMAREA DENSITII POPULAIILOR MICROBIENE CU AJUTORUL CAMEREI THOMA

Estimarea densitii populaiilor microbiene cu ajutorul camerei Thoma este o metod direct de numrare a celulelor, rapid i uor de efectuat, cu utilizri n stabilirea dinamicii de acumulare a celulelor microbiene ntr-un mediu de cultur, n scopul urmririi formrii de biomas, de obinere a unui inocul sau n diferitele procese fermentative. Metoda prezint dezavantajul c nu deosebete celulele vii de cele moarte, este greu de aplicat pentru bacterii de dimensiuni mici, necesit suspensii celulare destul de dese i nu este foarte exact.

Principiul metodei: Camerele de numrat reprezint lame de sticl prevzute cu trei platforme, din care platforma central este denivelat fa de celelalte dou cu 0,10 mm. Camera Thoma prezint o reea cu suprafaa de 1 mm2, divizat n 400 microcelule elementare, numrtoarea fcndu-se n grupuri de 16 microcelule.

Figura 6. ?????

Figura 7. Camera Thoma - reea

Materiale utilizate:

- suspensii de celule de drojdie i spori de muceagi n ap;

- lamele;

- camera Thoma;

- pipete sterile.

- microscop.

Mod de lucru:

Se execut un preparat umed, plasnd suspensia de celule pe suprafaa reelei. Se aeaz lamela, care, sprijinindu-se pe cele dou platforme laterale, va delimita nlimea stratului de lichid, egal cu adncimea camerei (0,1 mm). Preparatul astfel obinut se fixeaz cu cleme de platina microscopului i se caut imaginea reelei. n cmpul microscopic, prin deplasarea platinei se pot aduce grupe de cte 16 microcelule elementare i se face numrarea celulelor de drojdii. Se exclud de la numrare celulele care se afl cu mai mult de jumtate din suprafaa celulei n exteriorul careului de 4 x 4. Se fac numrri din mai multe cmpuri microscopice (minimum 5) i se calculeaz numrul mediu de celule dintr-o microcelul. Cunoscnd suprafaa unei microcelule i volumul su (), n funcie de diluia folosit la numrare, se poate calcula numrul de celule prezente ntr-un cm3 lichid de analizat.

cu formula:

N = n 4000 1000 k

n care:

n = numrul mediu de celule pe microcelul;

4000 = volumul microcelulei, n cm3;1000 = factor de transformare n cm3;

k = coeficientul de diluie.

9.2. ESTIMAREA NUMRULUI DE CELULE MICROBIENE PRIN METODA CULTURAL

Principiul metodei:Metoda cultural Koch const n nsmnarea unui volum cunoscut din suspensia de celule n/sau pe medii de cultur solidificate n plci Petri i, dup o perioad de incubare, se face numratoarea coloniilor considernd c fiecare colonie este rezultat prin multiplicarea unei singure celule. Metoda cultivrii n plci este foarte adesea folosit pentru determinarea numrului de microorganisme vii dintr-un produs i permite, n acelai timp, o analiz calitativ prin studiul caracterelor morfologice ale coloniilor dezvoltate. De obicei se utilizeaz diluiile decimale ale produsului de analizat.

Rezultatul se exprim n UFC (uniti formatoare de colonii), deoarece pot exista mai multe celule aglomerate care formeaz o colonie, iar n cazul mucegaiurilor exist fragmente multicelulare de hife; n plus, exist destule celule izolate care nu formeaz colonii. Se vor alege plcile care conin ntre 30 i 300 colonii.

Figura 8. Estimarea numrului de celule microbiene prin metoda cultural Materiale utilizate:- mediu de cultur: agar nutritiv sterilizat n flacoane Erlenmayer de 500 mL;

- plci Petri sterile;

- pipete sterile;

- eprubete cu cte 9 ml ap steril;

- probe de ap din diferite surse;

- baie de ap la 45 oC;

- termostat la 37 oC;

- dispozitiv de numrat colonii.

Mod de lucru:

Mediul de cultur coninut n balonul Erlenmayer se pune la topit pe baie de ap. Dup fluidificarea complet, se termostateaza, tot pe baie de ap la 45 oC.

Folosind pipeta steril, se pregtesc cte 3 diluii din probele de ap i apoi se recolteaz cte 1 cm3 din aceste diluii i, prin desfacerea plcii Petri sterile, se las s treac numai pipeta i se scurge coninutul.

Peste volumul de suspensie se toarn mediul de cultur steril la 42-45 oC i, imediat, prin rotirea n plan orizontal a plcii, se face omogenizarea cu mediul i se las n repaos pentru solidificarea mediului i fixarea celulelor. Se recomand ca din aceeai diluie s se fac nsmnari n cte dou plci paralele.

Plcile cu mediile nsmnate se introduc n termostat, reglat la temperatura de 37 oC, pentru dezvoltarea microorganismelor. Numrarea coloniilor se va face dup 72 ore. Pentru numrare se aleg plcile n care numrul de colonii este cuprins ntre 30 - 300, acolo unde este posibil. n cazul n care coloniile sunt dese, pentru a nlesni numrtoarea, placa Petri se inverseaz i se aeaz pe numrtorul de colonii TITRIPLAQUE.

La metoda culturii, toate operaiunile se execut cu mult atenie evitndu-se orice surs de infectare cu microorganisme strine, care, ajungnd n plac ar influena rezultatul analizei.

Numrul de uniti formatoare de colonii este dat de formula:

UFC/mL = nr. colonii coeficientul de diluie

9.3. DETERMINAREA NUMRULUI DE MICROORGANISME N MEDII LICHIDE

Aceast metod se bazeaz pe efectuarea de diluii cu care este nsmnat mediul de cultur lichid. Diluiile se efectueaz din 10 n 10, pornind de la suspensia iniial pentru care se determin numrul de germeni.

Mediul de cultur ales convenabil este repartizat steril cte 9 ml n fiecare tub. Serii de 3 sau 5 tuburi vor fi nsmnate cu cte 1 mililitru din suspensia iniial, apoi din diluiile decimale n ordine descresctoare a densitii celulelor (fiecare nou serie antreneaz un nou factor 10 de diluie). Dup incubare se procedeaz la citirea rezultatelor, considerndu-se pozitive tuburile n care este vizibil creterea (sau este vizibil o activitate biologic: virajul unui indicator de pH, degajare de gaz sau altele) i negative celelalte.

Pentru fiecare serie de culturi provenite din aceeai diluie, se numr tuburile pozitive, care pot fi:

1. - 0, 1 sau 2 pentru 2 tuburi;

2. - 0, 1, 2 sau 3 pentru 3 tuburi;

3. - 0, 1, 2, 3, 4 sau 5 pentru 5 tuburi.

Se compune astfel un numr caracteristic, format din cifrele corespunztoare pentru trei diluii succesive (pentru cazul 2), prima diluie utilizat fiind cea mai concentrat. Numrul este alctuit din trei cifre i anume: prima cifr reprezint numrul de eprubete din ultima diluie n care s-a observat creterea n toate eprubetele nsmntate, urmtoarele dou cifre reprezint numrul de eprubete pozitive din urmtoarele dou diluii succesive. Interpretarea acestui test se bazeaz pe date statistice. Tabelele elaborate dau pentru fiecare numr caracteristic, numrul de celule cel mai probabil dintr-un mililitru din tubul corespunztor primei cifre din numrul caracteristic.

Numrul de microorganisme dintr-un gram sau mililitru din produsul iniial se calculeaz nmulind numrul din tabel (corespunztor cifrei caracteristice) cu coeficientul de diluie corespunztor primei cifre din caracteristic.

Concentraia iniial se calculeaz innd cont de diluiile efectuate. De exemplu, pentru numrul caracteristic 210 (care nseamn 2 tuburi pozitive pentru cea mai mare densitate de celule, un tub pozitiv pentru cea medie i toate tuburile negative pentru densitatea cea mai mic), n tabel corespunde numrul cel mai probabil de celule 1,5 / ml, care se va nmuli cu coeficientul de diluie. Dac, de exemplu, diluia a fost 10-2, au fost iniial 150 celule / mL.

n tabelul urmtor (numit tabelul lui Mac Grady) se prezint relaia ntre numrul caracteristic corespunztor pentru trei tuburi nsmnate i numrul cel mai probabil de celule:

Tabel 3. Tabelul lui Mac Grady

Lipseste tabel..tot zboara il pun la final

10. DETERMINAREA BACTERIILOR COLIFORME DINTR-UN PRODUS ALIMENTARPentru a reflecta calitatea microbiologic a produselor alimentare n timpul fabricaiei, n timpul conservrii, ct i pentru a asigura protecia fa de microorganismele patogene transmisibile prin alimente, se efectueaz analize microbiologice n scopul de a garanta sigurana igienei pentru consum.

Bacteriile coliforme fac parte din categoria microorganismelor indicatori igienico-sanitari, fiind bacterii Gram negative nesporulate, aerobe sau facultativ anaerobe, ce pot s se nmuleasc n prezena srurilor biliare, capabile de a fermenta lactoza cu producere de gaze.

Principiul metodei: Metoda pentru determinarea bacteriilor coliforme include teste prezumptive i de confirmare, bazate pe capacitatea bacteriilor coliforme de a fermenta lactoza cu producere de acid lactic, CO2 i H2, n timp de 48 ore la 370C.

Testul prezumptiv const n inocularea probei n mediul nutritiv de mbogire cu lactoz, favorabil att coliformilor ct i altor bacterii capabile s foloseasc lactoza drept surs de carbon. Aprecierea probelor pozitive se face fie n funcie de acumularea de gaze n tubul Durham (plutitor), fie ca urmare a modificrii pH-ului datorit acumulrii de acizi.

Testul de confirmare const din inocularea culturilor din eprubetele pozitive ale testului prezumptiv, pe medii selective care inhib dezvoltarea bacteriilor nsoitoare i evideniaz bacteriile coliforme.

Materiale utilizate:

- proba de analizat (ap, carne tocat, produse lactate etc)

- eprubete n care a fost introdus tubul Durham

- bec de gaz

- termostat

- stativ pentru eprubete- mediul pentru testul prezumptiv:

bulion lactozat - pepton ...10g

-NaCl..5 g

- extract de carne..3g

- lactoz ...5g

- ap distilat1000 mL

Mod de lucru: Mediile lichide de cultur se introduc n eprubetele ce conin tuburile Durham rsturnate, astfel nct s nu rmn aer n acestea, n volum de aproximativ 10 mL, n funcie de grosimea eprubetei. Se sterilizeaz prin autoclavare, dup indicaiile de pe flaconul cu mediu deshidratat.

Din proba de analizat i din diluii decimale succesive se inoculeaz cte 1 mL n cte 3 eprubete cu mediu pentru testul prezumptiv (ce conin tuburile Durham inversate) i se incubeaz 24 - 48 ore la 37 0C, dup care se citesc rezultatele, conform tabelului de mai sus. Se consider pozitive eprubetele n care se nregistreaz tulburarea mediului de cultur, acumulare de gaz n plutitor (mai mult de 1/3 din volum) i, unde este cazul, virarea indicatorului de pH.

Pentru testul de confirmare, din eprubetele pozitive se recolteaz cte o ans (fir cu bucl) i se face inocularea n mediul pentru confirmare. Se termostateaz 48 ore la 37 0C, se citesc rezultatele.

Dup nmulirea numrului citit n tabel cu factorul de diluie, se obine numrul cel mai probabil de coliformi /g sau mL prob de analizat (MPN = most probable number).

11. METODE DE IZOLARE I OBINERE A CULTURILOR PURECultura pur reprezint o mas de celule rezultate prin reproducere dintr-o singur celul aflat ntr-un mediu nutritiv steril. Cultura pur este considerat i colonia care se formeaz ca rezultat al izolrii unei celule sau a unei uniti formatoare de colonie, atunci cnd aceasta este localizat pe un mediu nutritiv solid.

n practica de laborator se cunosc numeroase metode prin care se poate realiza separarea unei singure celule din microbiota heterogen a mediilor naturale. Aceste tehnici permit izolarea unui germen dat plecnd de la medii complexe, separarea unor germeni diferii dintr-un amestec, purificarea unei sue contaminate, precum i efectuarea studiului calitativ i cantitativ al florei unui produs, (de exemplu un produs alimentar). Scopul final este obinerea de tulpini pure care pot fi astfel identificate, studiate i eventual numrate.

A. Metode prin rspndire - se folosesc pe scar larg, fiind uor de executat, avnd ca principiu rspandirea celulelor din mediile naturale unde acestea se afl n numr mare.

Metode scarificate sau n strii n placa Petri se repartizeaz un mediu de cultur solidificat i, cu firul metalic se recolteaz celule din mediul natural i se execut trasri pe suprafata mediului, astfel nct diversele celule s rmn distanate ntre ele. Prin termostatare 48 - 72 ore, din colonia care corespunde microorganismului ce trebuie izolat, se execut o repicare n eprubete cu mediu solid nclinat (eprubete cu slant - agar) i astfel se obine o cultur pur.

O tehnic similar folosete drept suprafa de rspndire mediul nclinat din 2 -3 eprubete, prin transferul de celule din mediul natural, prin realizarea de striuri, n mod succesiv.

Aceste dou metode se folosesc i n cazul n care o cultur pur este contaminat cu microorganisme strine n perioada de pstrare i trebuie salvat.

B. Metode prin diluare. n cazul acestor metode, n prima etap, din mediul natural se execut diluii decimale n ser fiziologic steril, astfel nct numrul de celule s fie relativ redus, permind obinerea de colonii izolate pe suprafaa mediului de cultur. O metod simplificat pentru separarea sporilor fungici const n inundarea suprafeei plcii Petri din diluia convenabil. Sporii care au rmas ataai de mediu vor da colonii izolate. n general, mucegaiurile nu ridic probleme la izolare, deoarece cresc sub form de colonii mari pe diferite substraturi, iar pentru obinerea n cultur pur se face repicarea de spori situai n centrul coloniei.

Metoda de izolare cu ajutorul micromanipulatorului - este o metod precis i se realizeaz cu ajutorul unui aparat prevzut cu tuburi capilare cu care se poate face selecia celulelor dorite din preparate studiate la microscop. Cu ajutorul micromanipulatorului se poate face recoltarea de ascospori din celule ascogene i este folosit n cercetarea genetic, n dirijarea proceselor de fuziune a protoplatilor, pentru conjugare .a.

Metode biologice de obinere a culturilor pure - sunt foarte diverse i se bazeaz pe proprietile fiziologice ale microorganismelor de izolat care permit diferenierea clar a acestora de restul microorganismelor nsoitoare din acelai biotop. Prin metode biologice pot fi selectate bacteriile sporogene din medii naturale, pe baza termorezistenei deosebite a endosporilor. Numeroase metode de izolare se bazeaz pe introducerea n mediile de cultur a unor substane chimice cu rol de inhibitor asupra microorganismelor de care trebuie separat cultura dorit.

11.1. IZOLAREA MICROORGANISMELOR DIN SOL DE GRDIN

Principiul metodei: cnd o celul microbian ajunge pe un mediu favorabil de cultur, aceasta se multiplic formnd o colonie: din coloniile suficient de separate i distanate se pot izola culturi pure.

Materiale utilizate:

- plci Petri

- pipete sterile

- probe de sol de grdin

- tuburi cu ser fiziologic steril sau ap steril

- penicilin

- fir de inoculare

- termostat

- bec de gaz

- baie de ap

- mediu de cultur - agar nutritiv

Mod de lucru:

Repartizarea mediului de cultur n plcile Petri:

- se lichefiaz coninutul unui flacon cu mediu gelozat ntr-o baie de ap la fierbere, se rcete la 470C ( 20C, apoi se toarn coninutul n plcile Petri sterile innd seama de urmtoarele precauii:

se terge cu grij flaconul la scoaterea din baia de ap

se ndeparteaz dopul n zona steril a flcrii i se flambeaz gtul vasului pentru distrugerea microorganismelor

n timpul ct se toarn mediul, se deschid plcile Petri n imediata apropiere a flcrii; nu se atinge placa cu flaconul

dup introducerea mediului, placa Petri se nchide rapid

se repartizeaz geloza prin agitare uoar, da