Reactii de aglutinare

Aglutinarea reprezinta fenomenul de agregare a unor particule prin intermediul anticorpilor. In aceste reactii antigenul face parte in mod natural din suprafata unor structure particulate care apartin unor agenti infectiosi , eritrocitelor , sau e fixat artificial pe hematii sau particole anorganice.

Anticorpii se adauga la suspensia alcatuita din particulele mentionate mai sus , se combina cu antigenele de suprafata pe care le leaga impreuna costituinde aggregate vizibile numite aglutinate.

1. Aglutinarea directa

Se poate obtine prin doua proceduri : pe lama si in tuburi.

Aglutinarea pe lama : pe o lama curata si degresata se pune o picatura din serul aglutinant standard in care se emulsioneaza o protiune din cultura germenului de identificat pana se obtine o suspensie omogena. Daca exista corespondenta imuna intre atg de identificat si atc standard se constata aparitia unor grunji si reactia e considerata pozitiva. Absenta grunjilor – cu o suspensie omogen-tulbure – reactie negativa. Se realizeaza si un martor : in care se suspensioneaza o ansa din cultura in ser fiziologic , martorul trebuie sa fie negativ.

Aglutinarea in tuburi : Se foloseste atat in Identificare serologica ( IS ) cat si in diagnostic serologic ( DS). In IS – se efectueaza dilutii succesive din serul aglutinant ( de la dilutia 1/10 pana la cel indicat pe fiola ) care se pun in contact cu cantitati constante de atg necunoscut ( din cultura germenului ) . Dupa incubare , se stabileste titrul atc aglutinanti ( ultima dilutie in care se prezinta aglutinarea) iar daca acesta e cel de pe fiola sau cel putin ½ din acesta se concluzioneaza asupra corespondentie atg-atc.

Pentru stabilirea titrului de atc din DS. Se plaseaza intr-o serie de tuburi volume constante din dilutii crescande ale serului de testat , peste care se adauga un volum constant din suspensia de atg standard. Dupa incubare , dilutia cea mai inalta din ser care prezinta grunji de aglutinare stabileste titrul anticorpilor aglutinanti.

Reactia Widal – Evidentiaza aglutininele O si H in serul bolnavilor de febra tifoida si paratifoida produsa de Salmonella typhi si paratyphi.Prezinta 2 martori : de atg si ser , ambii negativi.O crestere pregresiva a titrului acestora pledeaza pentru o febra tifoida. Valoare diagnostica – aglutinine O , cele H persista mult dupa vaccinare.

2. Aglutinarea indirecta – pasiva.

Este o reactie ce foloseste particule naturale sau artificiale ( proteina stafilococica , latex , hematii ) incarcate in vitro cu atg sau atc ( ca elemente standard ) care vor fi aglutinate de atc sau atg corespunzatoare din proba.

Reactia de coaglutinare : e folosita in IS a streptococi , gonococi – se efectueaza pe lama folosind o suspensie in bulion din cultura tulpinii de identificat si o suspensie de stafilococ cu proteina A cuplat cu atc specifici anti streptococi , anti gonococi . Principiul metodei consta in faptul ca FC al atc din s erul imun anti-gonogoc e fixat pe proteina stafilococica in timp ce FAB se leaga de antigenul specific al gonococului producand o aglutinare vizibila.

Identificare factorului reumatoid prin latex-aglutinare.

Tehnica foloseste particule de polistiren-latex invelite cu IgG denaturate care sunt aglutinate de serurile de bolnav care contin factor reumatoid. Se poate efectua pe lama sau in tuburi.

Se folosesc :

Reactiv latex-IgG – particule de latex-polistiren incarcate cu IgG denaturat uman. Control pozitiv : ser ce contine FR. Control negativ : ser fara FR.

Reactia pozitiva : aparitia grunjilor la periferie , mijlocul omogenatului devine clar , aspect ca la control + .

Reactia negativa : aspect laptos al omogenatului , fara aglutinare , ca la control -.

Reactia de precipitare

Precipitare imuna rezulta din punerea in contact a unor cantitati echivalente de atg solubil si atc specifici. Un atg reprezentat de o molecular solubina , in prezenta atc specifici poate produce un precipitat daca atg este multivalent ( exista diferiti epitopi pe suprafata sa , ce induc sinteza de atc speicifici fiecaruia ) . Se formeaza astfel complexe imune mari ce precipita. In acestea fiecare atc leaga 2 molecule de atg , care leaga si ele alte molecule de atc specifici pentru alti epitopi de pe suprafata lor. Deoarece si acesti atc sunt bivalenti , fiecare leaga alte molecule de atg si procesul se repeta rezultand o retea spatiala de molecule de atg si atc care reactioneaza intre ele in cadrul careia legaturile se pot face si desface , rezultand un precipitat.

Curba de precipitare prezinta 3 zone :

Prozona – atg putin , atc multi. Zona de echivalenta – conditii pentru formarea complexelor imune de tip retea Postzona – atc putini , atg mult.

Precipitare in mediul lichid :

In urma reactiei se formeaza complexe care precipita , daca cei doi reactanti se gasesc in anumite proportii. Se cunosc 2 tehnici :

a. Precipitare prin floculare Se poate realiza in 2 variante : tehnica Ramon – si cauta stabilirea titrului unui

antigen , folosind cantitati variabile de atc ; tehnica Dean – foloseste cantitati variabile de atg cu titru cunoscut pentru dozarea de atc.

b. Precipitare in inel Atg si Atc sunt eliberati intr-un tub in asa fel incat cele doua faze ( cea superioara cu

atg , cea inferioara cu atc ) nu se amesteca. Atg coboara lent intrand in contact cu Atc si formand complexe atg-atc.

Formarea inelului = prezenta atg sau a atc de cercetat. Testul e semicantitativ – daca exista mai mult atg , inelul e situat mai jos. Prin acest test au loc : reactia Ascoli – identificarea bacilului carbunos in diag.

retrospectiv al antrax ; Ident. grupei serologice Lancefield a streptococilor , identificarea apartenentei ( animala sau umana ) a petelor de sange ; stabilirea provenientei carnii – Tehnica Uhelehuth.

Precipitarea in mediul solid ( gelificat )

Se bazeaza pe faptul ca daca atg si atc sunt introduse intr-un mediu de gel , vor difuza unul spre celalalt. Daca avem o corespondenta imuna si raport optim de concentratii , reactia de precipitare are loc la locul de intalnire.

a) Tehnica de dubla imunodifuzia Ochterlony. Strat de cativa mm de agaroza in care se decupeaza doua godeuri pentru fiecare

proba de testat. Intr-un godeu se plaseaza atc iar in celalalt atg. In zona de echilibru va aparea un precipitat. Testul poate fi calitativ sau semi-cantitativ. Traseul de precipitare se deplaseaza in

functie de concentratie , fiind mai aproape de godeul in care concentratia elementului e mai joasa.

Dupa finalizarea reactiei ( 24-48 ore ) se spala cu ser fiziologic si apoi se coloreaza proteinele complexului imun.

Se poate efectua cu un godeu central , si altele dispuse in coroana in jurul lui. In acest caz : fuziune arcuri – acelasi complex ; arcuri secante – doua complexe diferite .

Metoda de difuzie radiala dubla se utilizeaza pentru decelarea : alfa-fetoproteinei , proteinei Bence-Jones , CRP , atg HBs.

O alta aplicatie – testul Elek – care identifica tulpinile toxigene de bacil difteric . In acest test difuzia atg si atc are loc in unghi drept. Atg de testat este reprezentat de toxina difterica - se insamanteaza

perpendicular pe un sant parcticat in gel in care s-a introdus anterior antiserul cu atc-anti toxina difterica.

R+ e indicata de aparitia unor trasee de precipitare sub forma unor mustati la locul de intalnire a celor 2 reactanti din gel.

Contine control + si control -.

b) Contraimun electroforeza In aceasta tehnica migrarea reactantilor e accelerata datorita curentului electric. CIE se bazeaza pe faptul ca proteninele cu migrare anodica sunt precipitate intr-uun

camp electric de atc specifici. Atc incarcati slab negativi se vor deplasa in gel spre catod , iar atg cu sarcina electrica

mai mare , spre anod . Tehnica e mai rapida si mai sensibila ca dubla difuziune.

c) Imunoelectroforeza Se separa proteinele electroforetic. Se decupeaza un sant central in gel in care se pipeteaza anti-serul policlonal ce va

recunoaste toate fractiunile proteice din serul uman. dupa difuzie se obtin arcuri de precipitare ce pot fi colorate si comparate. Tehnica are loc in 2 timpi : migrarea electroforetica a proteinelor din ser in geloza si

imunodifuzia dubla a atg si atc dupa adaugarea antiserului uman. Initial se utilizeaza antiser polovalent , insa in cele urmatoare se pot folosi mai multe

antiseruri monospecifice. Imunelectroforeza serului unui oblnav se realizeaza in comparatie cu cea a unui ser

uman normal. Tehnica poate stabili in cazul proteinelor umane patologice monoclonale , clasa de Ig

implicata – arcul acela aparand modificatd) Tehnica Mancini-Carbonara

In cadrul acestei tehnici gelul de agaroza inclus in placute contine anticorpii specifici antigenului cautat.

In godeuri se pun probele de testat , in care se cauta antigenul. Acesta va difuza in gel , deplasand zona de echilibru si va reactiona cu atg daca exista

corespondenta imuna. Dupa 24-48 ore apar inele de precipitare , cu diametre in directa proportie cu

cantitatea de atg. Concentratiile se apreciaza conform unei curbe de etalonare obtinute folosind atg std cu concentratii determinate.

Aceasta tehnica se foloseste pentru : dozarea CRP , dozarea Ig ( A , M , D , G ) determinarea fractiunilor complementului , determinarea cantitativa a siderofilinei , dozarea alfa1-antitripsinei umane.

e) Electroimundifuzia ( Tehnica Laurell) E o tehnica prin care atg se deplaseaza intr-un camp electric pe un suport ce contine

atc corespunzatori, dand nasteree la precipitate imune asmenea unor rachete de lungime direct proportionala cu concentratia antigenului.

E mai sensibila ca imunodifuzia radiala . In prima etapa se includ atc intr-o placa de agaroza , apoi se practica godeuri in care

se pun diferite concentratii ale atg care migreaza prin aplicarea unui curent electric. Inaltimea traseelor obtinute e direct proportionala cu cantitatea de atg. Se pot estima prin aceasta tehnica : proteinele serice ( Ig – exceptand IgE ,

componente ale complementului , CRP , transferina , haptoglobina , ceruloplasmina , fibrinogen , etc ) ; proteine in urina ; proteine din LCR.

Dozarea complexelor imune circulante

Complexele imune circulante – au evolutie diferita in raport cu dimensiunile lor. Cele mici sunt epurate prin rinichi , cele mari sunt distruse prin macrofage iar cele intermediare se depun in organe.Ele pot aparea in exces in cadrul reactivitatii imune fata de o serie de antigene persistente.

Cercetarea CIC e de interes in cazul : pacientilor cu afectiuni in care disordinile autoimune se asociaza cu leziuni determinate de reactii de hipersensibilitate imediata ( tip III ) – LES , vasculite , crioglobulinemii , PR dar si in cazul bolilor infectioase – endocardite , lepra , hepatite virale.

Dozarea lor este relevanta intrucat ele pot declansa o varietate de procese inflamatorii dar pot sa si : interactioneze direct cu bazofilele si trombocitele inducand eliberarea de amine vasoactive ; stimuleaza macrofagele in eliberarea de TNF si IL-1 ; fixeaza complementul cu initierea activitatii anafilactice si chemotatice a C4a , C3a si C5a.

In prezent se folosesc 3 metode :

1. Consumarea C1q Consumarea C1q de catre CIC e o tehnica de electie. C1q e marcat cu un izotop

radioactiv sau enzimatic si e captat de complexele imune . Gradul de consul evidentiaza cantitatea de CIC.

2. Fixarea pe celule Raji Se bazeaza pe faptul ca aceste celule exprima receptori pentru C3b deci sunt

capabile sa retina complexele ce prezinta C3b. Se folosesc antiglobuline marcate cu un izotop ce permit evaluarea importantei acestei fixari.

3. Tehnica de precipitare a complexelor imune cu PEG. In prezenta PEG ( polietilenglicol ) CI sunt precipitate. Densitatea optica a mediului e

direct proportionala cu cantitatea de proteine care se gaseste in proba, adica nivelul CI precipitate.

Se lucreaza o proba si un martor. Martorul nu primeste PEG ci doar tampon borat. Ambele se pastreaza peste noapte la frigider ( 4 grade ) apoi se masoara extinctia

probei si a martorului fata de apa distilata la o lungime de unda de 450 nm. E= (EP-EM)x1000 - se masoara in unitati fotometrice . Valori normale intre 0-50 UF.

Identificarea crioglobulinelor

Crioglobulinele – agregate serice constituite fie numai din Ig , fie dintr-o forma speciala de complexe antigen-anticorp care precipita ( reversibil ) la temperaturi scazute si se solubilizeaza la aprox. 37 grade C.

Crioglobulinemia – starea caracterizata prin prezenta anormala de crioglobuline in sange , ele fiind precipitate in vasele mici in urma expunerii la temepraturi scazute si care duc la o scadere a fluxului sangvin in ariile expuse , rezultand uneori necroza.

Determinarea prezentei crioglobulinelor serice

Sangele se preleva a jeun , cu o seringa preincalizta la 37 grade C , si colectat in tuburi uscate mentinute la 37 g celsius . Se pastreaza 3-4 ore pentru a separa cheagul.

Dupa separare , serul e centrifugat si repartizat in 2 tuburi : unul se conserva la termostat celalalt e refrigerat la 4 grade C ( 48-72 ore ) .

Dupa acest interval se compara tuburile – prezenta crioglobulinelor e indicata de un precipitat care apare in tubul mentinut la rece , precipitat ce dispare dupa incalzirea la 37 g C.

Tubul de la termostat , folosit ca martor , nu ar trebui sa prezinte precipitat. Prin procedeul criocrit – se dozeaza cantitativ crioglobulinele , in procente in raport cu proba

totala de sange care a fost centrifugata la 4 g C , in eprubete de hematocrit.

Reactia de seroneutralizare

Reactia de neutralizare face parte din reactiile serologice de inhibare a unor caracteristici biologice si biochimice ale antigenului.

Antigenele care prezinta activitate biologica induc formarea de anticorpi neutralizanti care au capacitatea de a le bloca activitatea. Reactia dintre aceste atg si atc corespunzatori poate duce uneori la formarea de precipitate insa pentru a pune in evidentiere reactiile de neutralizare se prefera teste specifice care pot demonstra blocarea activitatii biologice a antigenului cand e pus in contact cu serul imun.

Reactii de neutralizare in vivo :

Pe animale :

Identificarea toxinei difterice :

Se inoculeaza ser anti-toxina difterica la un cobai test. Cobaiul martor ramane neprotejat Ambii cobai sunt injectati cu filtrat din cultura de bacil difteric

Daca cobaiul test supravietuieste iar cel martor moare , se deduce ca filtratul contine toxina difterica.

Identificarea tipului de toxina botulinica: Se folosesc 4 loturi de animale , care se inoculeaza . Lotul 1 – control pozitiv - produsul patologic. Lotul 2 – control negativ – produsul patologic inactivat la 100 g Celsius. Lotul 3 – produsul patologic in amestec cu ser antibotulinic anti-A. Lotul 4 – produsul patologic in amestec cu ser antibotulinic anti-B. La loturile 3 si 4 amestecul se incubeaza 30 min la 37 g C inainte de injectare.

Pe om :

1. Intradermoreactia Shick

Apreciaza gradul de imunizare a populatiei in urma vacinarii antidifterice. Se cauta evidentierea anticorpilor anti-toxina difterica la subiectul testat.

Se injecteaza intradermic 0.1 ml de toxina difterica purificata. Daca nu se constata efectul dermonecrotic subiectul e imunizat ( Reactie negativa ) . Daca se constata efectul dermonecrotic – subiectul nu prezinta anticorpi iar efectul

toxinei are loc ( reactie pozitiva). Se efectueaza un control pe celalalt brat , cu o cantitate echivalenta dar inactivata de

toxina. Reactia se citeste in primele 24 ore , avand loc o reactie de hipersenzibilizare

imediata.

2. Intradermoreactia Dick Testeaza susceptibilitatea la scarlatina ( data de streptococul B hemolitic de grup A). Se urmareste prezenta anticorpilor antitoxici indusi in organism de toxina eritrogena. Se injecteaza intradermic toxina care produce un eritem cu un diametru de 10mm. La persoanele imune – reactia e negativa- lipsa eritemului in zona inoculata. La persoanele receptive la scarlatina - reactia e pozitiva

Reactii de neutralizare in vitro :

1. Reactia ASLO(diagnostic serologic al infectiilor streptococice)

Reactia ASLO decurge in doua etape : punerea in contact a dilutiilor in serul de testat ( in care cautam atc anti-SLO) cu o cantitate standard de SLO si dupa o scurta incubare etapa a doua : repartizarea unei suspensii de hematii ca mijloc revelator.

Principiul : in tuburile in care dilutiile din ser contin suficienti atc anti-SLO efectul litic va fi inhibat ceea ce se traduce prin lipsa de hemoliza. Daca dilutia contine insuficienti atc anti-SLO efectul litic se observa prin prezenta hemolizei.

Tehnica de lucru vizeaza dilutii succesive din serul de testat : 1/250 , 1/500 , 1/625 etc deasupra carora se adauga antigenul .

Dupa 15 minute de incubare se repartizeaza in fiecare eprubeta 0,5 ml dintr-o suspensie de hematii de iepure 5%.

Citirea se face in doi timpi : o prima citire dupa scoaterea tuburilor din termostat , si o a doua , dupa o noapte de pastrare la 4 g C.

Reactia negativa = prezenta hemolizei. Titru normal atc ASLO – 160-200 unitati/ml. Este necesar urmarirea in timp a evolutiei titrului aestor anticorpi.

2. Diagnosticul serologic al unor viroze

Se bazeaza pe aprecierea efectului neutralizant al unui ser imun fata de infectivitatea virusului in subrstratele gazda pentru care agentul viral respectiv prezinta tropism si determina efecte specifice.

Se efectueaza in 2 etape : efectuarea de dilutii binare din s erul de testat ( in care cautam atc neutralizanti) ; realizarea unor amestecuri echivolum de virus standard si serul de testat.

In paralel se face un martor de virus ( virus + diluent) Amestecurile se incubeaza 60 min la 37g C Apoi se inoculeaza fiecare amestec in cate un tub de cultura celulara. Se incubeaza culturile la 37g C timp de o ora apoi se adauga mediu de sustinere si se

incubeaza 72-96 ore. Titrul atc neutralizanti e dat de dilutia cea mai mare din ser care impiedica aparitia

efectului citopatic la 50% din reactantii inoculati cu amestecul virus-ser in acea dilutie.

Reactia de imunofluorescenta

Tehnica imunofluorescentei se bazeaza pe proprietatea fluorocromilor de a se fixa pe imunoglobuline fara a le modifica proprietatile biologice.

Acesti anticorpi marcati fluorescent vor deveni trasori sensibili pentru antigenele tisulare si in urma legarii lor de un antigen corespunzator confera fluorescenta complexului antigen-anticorp format.

Fluorocromii sunt substante care iradiate de un fascicul de lumina cu lungime de unda mica si frecventa mare emit radiatii cu lungime de unda superioara situate in zona vizibila a spectrului , permitand formarea unei imagini fluorescente a complexului antigen-anticorp.

Fluresceina – lumina verde ; rhodamina - lumina rosie.

De obicei se folosesc atc marcati la nivelul fragmentului Fc.

Pentru a releva prezenta fluorocromilor fixati in cadrul reactiei atg-atc trebuie folosit un microscop cu sursa de UV si filtre de excitatie capabile de a elimina radiatiile cu lungime de unda inutile.

Reactia se realizeaza in doua variante :

Varianta directa :

Se aplica frecvent pentru identificare antigenelor. Se foloseste un ser imun standard marcat cu o substanta fluorescenta. Anticorpii din acest ser , fluorescenti si specifici vor reactiona cu atg de identificat formand

complexe fluorescente ce pot fi observate in lumina UV. Avantajele consta in : rapiditatea tehnicii , si permite evidentierea atg microbiene dupa

inactivarea lor cu antibiotice.

Varianta indirecta :

Se desfasoara in doua etape: In prima etapa preparatul fixat ce contine antigenul , cunoscut sau necunoscut , se

trateaza cu ser nefluorescent rezultand un complex atg-atc nefluorescent. In a doua etapa pentru a face acest complex vizibil , preparatul se trateaza cu ser

antiglobulinic fluorescent , activ fata de specia care a furnizat serul specific din prima etapa.

In aceasta tehnica antigenul e acoperit cu un dublu strat de atc : cei nefluorescenti specifici fata de atg , si cei fluorescenti antigamaglobuline.

Se foloseste atat in IS cat si in DS.

Evidentierea autoanticorpilor antinucleari

Sunt utilizate ca substrat cupe de tesuturi care sunt incubate cu serul pacientului suspectat de o boala autoimuna.

Toate proteinele umane ce nu se fixeaza pe parcursul incubarii printr-o reactie atg-atc vor fi indepartate prin spalare iar autoanticorpii antinucleari fixati pe nuclei vor fi relevati prin xenoanticorpi anti-Ig umane cuplati cu substante fluorescente.

Se efectueaza lame cu amprente de ficat de sobolan. Pe fiecare dintre acestea se pipeteaza o picatura din : serul de testat , martor negativ ;

martor pozitv. Se incubeaza 20 minute Se spala cu o solutie cloruro-sodica Se acopera fiecare amprenta cu o picatura din serul fluorescent anti gamaglobuline umane. Se incubeaza 20 minute Urmeaza o noua spalare. R+ e indicat de un fond usor verzui , pe care apar nucleii fluorescenti ai celulelor hepatice. R- Zone mici , intunecoase – corespund nucleilor necolorati. Fluorescenta e de 3 tipuri : omogena ( Anticorpi anti DNP , nucleu omogen colorat - LES) ;

inelara ( anticorpi anti-ADN nativ si anticorpi anti DNP solubili) ; nucleorala ( colorarea omogena a nucleolului determinat de prezenta anticorpilor antiribonucleoproteina – anti RNP).

Reactii de aglutinare de tip Coombs

Anticorpii neaglutinanti ( incompleti ) desi se fixeaza pe determinantii antigenici omologi nu reusesc sa apropie eritrocitele suficient pentru a forma aglutinate eritrocitare.

Se folosesc astfel diferite artificii tehnice pentru a produce aglutinarea eritrocitelor de catre anticorpii neaglutinanti.

La baza reactiilor Coombs sta urmatorul principiu : hematiile umane pe care se fixeaza atc specifici incompleti , devin aglutinabile in prezenta serului anti-Ig umane , ale carui Ig se ataseaza pe complexele hematii-anticorpi incompleti formate.

R+ se exprima macroscopic printr-un depozit cu marginic crenelate ( in godeuri ) saua prin grunji ( pe lama).

R- da aparitia unui depozit omogen cu margini integre .

Testul Coombs direct

Se evidentiaza prezenta Ig ca anticorpi fixati in vivo pe suprafata eritrocitelor. Sangele se recolteaza pe anticoagulant , din care se elimina proteinele prin centrifugare.

Sange normal grup O , folosit ca martor. Ser anti-proteina umana. Pe o lama se amesteca o picatura de ser anti proteina umana cu o picatura din sedimentul

eritrocitar din sangele de cercetat. Paralel se amesteca o picatura din serul polivanent antiproteina umana cu sangele de control

( grup O ) . R+ = aglutinare la proba. La control reactia trebuie sa ramana negativa Testul Coombs Direct e pozitiv in : anemia hemolitica autoimuna idiopatica, transfuzie

incompativila , boala hemolitica a nou-nascutului , hepatita infectioasa , pneumonia virala , LES , TBC , diabet zaharat , unele tumori , etc.

Testul Coombs indirect

Se cauta anticorpii incompleti din serul bolnavului Se realizeaza in doi timpi :

Sensibilizarea eritrocitelor : serul de bolnav in care cautam atc se incubeaza cu o baterie de eritrocite test de grup cunoscut . Daca sunt prezenti , autoatc din ser se vor fixa pe antigenele acestor eritrocite.

Faza de revelatie : prin adaugarea de ser antiproteina umana se observa daca reactia este pozitiva sau nu , in functie de prezenta aglutinarii.

Testul Coombs indirect e indicat in investigarea : anemiei hemolitice autoimune idiopatice , reactiilor post-transfuzionale , boala hemolitica a nou-nascutului, etc.

Reactia de hemaglutinare pasiva

E o metoda imunoserologica pein care se opt evidentia cantitati minime de anticorpi de diferite tipuri. Ei nu produc reactii vizibile cu antigenele .

In aceasta reactie hematiile sunt utilizate ca suport al antigenelor , se acopera hematiile cu antigene care vor fi facute apoi sa reactioneze cu atc specifici.

Reactia trebuie sa se desfasoare intr-un mediu fara complement , deoparece acesta poate fi activat de reactia atg-atc si poate duce la hemoliza.

HAP are multet aplicatii : DS al rujeolei , in bolile autoimune , DS al tifosului exentematic , etc.

Tehnica :

Reactanti : ser de cercetat in dilutii succesive ; atg standard ; eritrocite te oaie. Inainte de reactia propriu-zisa , se obtine antigenul de lucru prin adaugarea la 4ml de atg

standard a 0,1 ml eritrocite de oaie si incubarea la 37g C timp de o ora. Se efectueaza dilutii binare din serurile de testat Se adauga la fiecare dilutie antigen de lucru Se incubeaza 24 ore la 37g C Se efectueaza : martori pentru : antigen , eritrocite , ser sigur negativ , si ser sigur pozitiv.

Se citeste reactia stabilind titrul atc aglutinanti pasivi prin dilutia cea mai mare a serului la care se mai produce hemaglutinarea.

Martorii sunt toti fara hemaglutinare , mai putin cel de ser sigur pozitiv.

Reactia de inhibare a hemaglutinarii ( HAI)

Face parte din reactiile care testeaza pierderea capacitatii de manifestare a unor efecte virus-specifice in prezenta unui ser imun specific.

Se utilizeaza frecvent pentru a detecta prezenta anticorpilor fata de un virus hemaglutinant in serul unui pacient suspectat de o infectie.

E folosita in viroze , si se bazeaa pe capacitatea unor virusuri de a determina aglutinarea eritrocitelor printr-o serie de componente din structura lor. In prezenta anticorpilor hemaglutinoinhibanti din serul pacientului cu infectia virala , are loc inhibarea hemaglutinarii.

Dupa amestecul unor cantatitati cunoscute de virus standard cu dilutii in serie de ser de bolanv se adauga suspensia de eritrocite . Daca serul contine atc specifici ei se leaga de particula virala si impiedica aglutinarea hematiilor. Daca serul nu contine anticorpi specifici virusului standard , acesta va produce aglutinarea hematiilor.

Martorul virus standard trebuie sa prezinte hemaglutinare , iar cel de hematii nu trebuie sa o prezinte.

Tehnica reactiei :

Serul de testat se supune unui tratament ce inlatura inhibitorii naturali ai hemaglutinarii. Serul este apoi inactivat la 56 g C. Antigenul standard – tulpini standard de virus gripai , care va fi si titrat inainte de reactie. Eritrocitele folosite sunt de cocos. Initial se efectueaza dilutii binare din serul de cercetat . Peste fiecare dilutie se adauga antigenul reprezentat de virusul standard titrat la 4UHA . Se incubeaza 30 minute. Se adauga in fiecare godeu suspensia de eritrocite. Se incubeaza 60 min la temp camerei. Se citeste : Titrul atc hemaglutinoinhibanti e dat de dilutia cea mai mare din serul de

cercetat la care nu se observa hemaglutinarea. Se efectueaza o serie de martori : martor virus standard ; martor ser normal , martor ser

sigur pozitiv , martor ser sigur negativ , martor eritrocite Reactia se foloseste in DS al unor viroze ( gripa rujeola , oreion ) dar si in IS ( infectii cu

virusuri hemaglutinante-gripale , paragripale - folosind seruri standard adecvate).

Reactia de fixare a complementului

Reactia de fixare a complementului foloseste doua sisteme antigen-anticorp care competitioneaza pentru o cantitate standard de complement.

Complementul se leaga numai de complexul antigen-anticorp.

Primul sistem care competitioneaza pentru complement e reprezentant de atc din serul de bolnav si un atg corespunzator.

Al doilea sistem e un sistem indicator ( sistem hemolitic ) care face vizibil rezultatul reactiei din primul sistem , si e constituit din hematii de oaie in asociere cu ser hemolitic.

Daca serul bolnavului contine anticorpi fata de antigenul standard , complementul se leaga de acest complex antigen-anticorp . In aceste conditii nu mai exista complement liber in reactie care sa se fixeze pe sistemul hemolitic , si hematiile ede oaie vor sedimenta , rezultand absenta hemolizei.

Daca serul de cercetat nu contine anticorpi specifici antigenului folosit , nu se formeaza complexe atg-atc , complementul ramane liber si se fixeaza pe sistemul indicator rezultand hemoliza.

Reactia poate fi calitativa – reactia Wasserman – diagnostic sifilis sau cantitativa – Reactia Ida Bengston – folosita in aprecierea dinamicii atc in numeroase infectii bacteriene sau virale.

Tehnica reactiei :

Serul de testat se inactiveaza prin incalzire la 56g C , timp de 30 minute pentru inactivarea complementului.

Complementul este titrat fata de sistemul hemolitic , pentru a stabili cantitatea maxima de alexina care sa fie introdusa in reactie in vederea fixarii de catre UNUL din cele doua sisteme atg-atc.

Se repartizeaza dilutii binare din serul de testat in tuburi sau godeuri. Se adauga atg standard in fiecare tub. Se pipeteaza in fiecare tub cate 2 unitati de complement. Se incubeaza 18 ore la 4g C. Se adauga sistem hemolitic in fiecare tub sau godeu. Se incubeaza 30 min la 37 g C. Titrul fixator al serului de cercetat e indicat de dilutia maxima a serului care a impiedicat

producerea hemolizei. Reactia se efectueaza in 2 seruri prelevate de la bolnav – la debutul afectiunii si la 3-4

saptamani ( In convalescenta) . Rezultatul reactiei e semnificativ daca intre serul I si II exista o crestere a titrului de anticorpi

cu cel putin 4 trepte binare ale dilutiei. Se efectueaza urmatorii martori : martor de ser de cercetat ; martor de antigen ; martor

pentru alexina ; martor pentru hematii ; martor ser sigur pizitv , martor ser sigur negativ , martor ser de cercetat. Singurul martor fara hemoliza este cel pentru controlul hematiilor.

Reactia ELISA ( Enzyme-linked-ummuno-sorbent-assay)

Tehnicile Elisa reprezinta metode imunoenzimatice sensibile de titrare a atg sau atc , cu aplicabilitate atat in IS cat si in DS .

La baza acestei tehnici sta o inlantuire de reactii in care primul element e imobilizat pe un suport solid iar al doilea element al reactiei e legat de primul printr-o reactie atg-atc. Ultimul element al reactiei este un reactiv marcat enzimatic ( peroxidaza sau fosfataza alcalina) in cadrul unui conjugat , care se va lega de complexul format de primii doi reactanti tot printr-o reactie imuna specifica.

Enzima actioneaza degradativ asupra unui substrat cromogen , incolor. Degradarea substratului de catre enzima antreneaza oxidarea cromogenului care devine colorat , urmand o detectare spectrofotometrica.

Tehnica are diferite variante :

1. Tehnica tip sandwich – varianta 1 Antigenul este plasat pe godeuri (coating) Se inlatura antigenul nefixat ( surcoating) printr-o spalare cu o solutie proteica

( gelatina) Se introduc serurile de testat , care daca contin atc specifici atg de pe godeuri , se vor

lega de acestia. Incubare 2 ore la 20-37g C. Spalare – pentru a indeparta toti atc nespecifici si pe cei nelegati Adaugarea de atc anti-ig umane conjugati cu peroxidaza Spalare pentru a elimina atc conjugati nefixati ( liberi) Adaugarea substratului enzimei care contine si cromogenul. Se produce colorarea in galben daca enzima a ramas in godeu si a degradat

substratul . Intensitatea culorii este proportionala cu cantitatea enzimei , deci cu cantitatea de atc conjugati fixati indirect de antigen.

Se adauga o solutie de blocare a reactiei enzimatice , pentru a stopa reactia. Se calculeaza concentratia elementului cercetat spectrofotometric.

2. Tehnica tip sandwich – varianta 2 Aceasta tehnica permite dozarea unui antigen care prezinta 2 epitopi recunoscuti de

2 tipuri de anticorpi. Godeul e tapetat cu un anumit tip de atc monoclonali pe care se fixeaza specific

interactionand , un epitop al atg de dozat Se introduc apoi in reactie anticorpii monoclonali conjugati , care se leaga de celalalt

epitop , fiind prinsi in sandwich.

3. Tehnica directa

Se fixeaza pe godeurile placii ser anti-IgA. Se incubeaza cu serul pacientului , care daca prezinta IgA , acesta se va fixa pe atc anti IgA.

Se adauga antigenul marcat cu peroxidaza , recunoscut de eventualele igA din serul de testat specific de antigen.

Adaugarea substratului specific enzimei. Aparitia reactiei colorate daca serul de testat contine IgA specifice antigenului conjugat. Se evalueaza spectrofotometric. Prin tehnica directa se evidentiaza anticorpii anti-HIV1 si anti HIV2 din serul sau LCR

prelevate de la bolnavul suspectat cu SIDA. In acest caz ( testarea pentru SIDA ) varianta tehnicii este calitativa . Pentru a se aprecia

rezultatele se compara absorbanta probelor cu absorbanta controlului cut-off. Absorbanta > decat abs medie a controlului cut-off rezulta un test pozitiv. Absorbanta < decat abs medie a controlului cut-off rezulta un test negativ. Absorbanta = cu abs medie a controlului cut-off suspectam un bolnav in perioada de sero-

conversie ( repetam reactia dupa 6 sapt ) sa uin perioada de declin , cand sistemul imun e considerabil afectat.

Dupa testare , in cazul uni rezultat pozitiv , probele se vor trece prin testul de confirmare Western-Blot.

4. Tehnica competitiva Are la baza acelasi mecanism ca si tehnicile directe Se fixeaza in godeuri atg cunoscut , incubat 1 ora la 37g C. Se adauga concomitent serul bolnavului si un ser monoclonal specific antigenului cu

o incubare la 37g C timp de o ora. Daca exista atc specifici in serul pacientului acestia vor competitiona cu cei

monoclonali. Se pipieteaza conjugatul – anticorpi anti-anticorpi monoclonali cuplati cu enzima. se adauga substrat enzimatic si cromogen , se incubeaza iar o ora la 37g C. Se efectueaza 3 spalari pentru a indeparta elementele nefixate. Se adauga o substanta pentru stoparea reactiei enzimatice si se efectueaza citirea

spectrofotometrica. Test pozitiv = atc de test se leaga de atg , deci nu se fixeaza atc marcati cu enzima ,

astfel nu se degradeaza substratul si nu apare culoarea. Test negativ – aparitia culorii – citire absorbanta.

Western- Blot

Proteinele din amestecul studiat se separa electroforetic in gel de agaroza in functie de greutatea lor moleculara. Dupa migrare , sunt transferate pe o membrana de nitroceluloza . Apoi se aplica serul te testat , anticorpii care pot fi prezenti in serul bolnavului se fixeaza specific pe atg pe care le recunosc.

Fixarea lor e relevata dupa adaugarea de atc anti imunoglobulina umana cuplati cu o enzima si un cromogen.

R+ = aparitia de benzi orizontale colorate cu intensitate diferita , in zonele unde a avut loc reactia atg-atc.

Tehnica permite detectarea nivelului unor atg sau atc necunoscuti dintr-un amestec complex.

Asa se evidentiaza fractiunile antigenice ale virusului HIV 1 sau HIV2 ( se separa electroforetic in PAAG).

Etapele tehnicii pentru detectarea atc specifici diferitelor proteine virale HIV :

Separarea fractiunilor antigenice ale virusului HIV1 sau HIV2 sub forma de electroforeza in PAAG si transferarea pe membrana de nitroceluloza

Incubarea cu serul de cercetat si cu seturile martor ( negativ , pozitiv ) timp de 2 ore la temp camerei , urmata de o spalare.

Incubarea benzilor cu conjugatul – 2 ore la temp camerei , se repeta spalarea. Incubarea benzilor cu solutie revelatoare- 20 min. Aparitia benzilor colorate , ce identifica atc specifici subfractiunilor antigenice virale.

RIA – Radioimmunosorbentassay)

Reactia RIA e folosita in cadrul unor tehnici sensibile , ce masoara titrul unui atg sau atc , folosind reactanti marcati radioactiv.

Se bazeaza pe afinitatea unui atg necunoscut pentru atc sau specific , si pe posibilitatea formei radioactive antigenului de a intra in competitie cu antigenul dozat , nemarcat , dar de acelasi tip.

In timpul acestei competitii de legare cu anticorpul specific , atg radioactiv e diluat de cantitatea necunoscuta de atg ce urmeaza a fi determinat.

Cantitatea de complexe atg marcat – atc care se stabileste prin masurarea radioactivitatii prezente la nivelul unui filtru ce nu lasa s treaca decat elemente izolate ale reactiei este o functie inversa a concentratiei de antigen nemarcat care se determina.

Se citeste la un scintilator pentru radiatii gama.Prin aceasta reactie se evalueaza prezenta in ser a : atg carcioembrionar , alfa-fetoproteina , hormoni, enzime , medicamente , etc.Se pot doza si anticorpi antibacterieni – atc anti toxine-bacteriene

Intradermoreactii care investigheaza reactivitatea imuna mediata celular.

Intradermoreactia tuberculinica :

Se bazeaza pe faptul ca limfocitele sensibilizate anterior la un antigen reactioneaza la administrarea aceluiasi antigen , dand un raspuns local caracterizat prin eritem , induratie si de o infiltratie polimorfa.

Tehnica reactiei :

Pe fata anterioara a antebratului se injecteaza intradermic 0,1 ml solutie tuberculina sau PPD.

Reactia se citeste dupa 48-72 ore fiind o reactie de hipersensibilitate intarziata.

R- e indicata de absenta modificarilor cutanate – sugerand o imunitate celulara absenta deci o receptivitate inalta fata de o posibila infectie tuberculoasa. Se intalneste la pacienti cu imunodeficienta ( congenitala / dobandita ) sau la cei nevaccinati , care nu au intrat in contact cu agentul microbian.

R+ poate avea intensitate diferita :

Moderat pozitiva – zona eritemului e redusa dar depaseste 10mm in diametru si insotita de papula- dovedeste existenta imunitatii celulare.

Intens pozitiva – zona eritemului extinsa , edem local , adenopatie satelita – pledeaza pentru o infectie activa.

Fenomenele focale sunt consecinta interactiei antigen-limfocite T deja sensibilizate , prezente in tesuturile unde se cantoneaza atg. Se observa actiunea dermonecrotica a citokinelor limfocitelor T.

Aceasta reactie are multiple aplicatii : depistarea starilor de hipersensibilitate ; testarea imunoreactivitatii pe linie celulara in unele viroze , parazitoze , sau micoze.

Citometria in flux ( Flow Citometry)

Este o tehnologie noua caracterizata printr-o fiabilitate inalta ce permite determinarea simultana a mai multor parametri fizici ai unei celule.

Flowcitometrul analizeaza proprietatile unei singure celule ce trece cu o viteza mare printr-un orificiu. Ofera date privind : marimea , volumul ,indice de refractie , vascozitate , trasaturi chimice – continut ARN , ADN , enzime.

Proprietatile sunt relevate prin masurarea luminii dispersate , coulter de volum si fluorescenta.

Citometria in flux are ca obiectiv cuantificarea celulelor in functie de talia lor si / sau demarkerii pe care ii exprima la suprafata lor. Se pot analiza aproximativ 5000 cel/ secunda ,dintr-o suspensie celulara.

Parametrii fiecarei celula sunt determinati prin folosirea unui sistem optoelectronic care inregistreaza modul in care fiecare celula interactioneaza cu o raza laser.

Celula care interactioneaza cu raza imprastie lumina sau emite fluorescenta. Raza difractata si refractata este imprastiata in mai multe directii , fiind preluata de diferiti detectori care analizeaza caracteristicile fiecarei cuante de lumina ( lumina detectata post difractie e proportionala cu aria celulei , cea detectata post refractie proportionala cu granularitatea ) si apoi genereaza semnale electrice de intensitate proportionala cu intensitatea luminii care vor fi amplificate si analizate ulterior.

Marcarea fluorescenta –implica legarea unei subst fluorescente si / sau a unui atc monoclonal conjugat cu fluorocrom intr-o cantitate proportionala cu cant. receptorului celular. Intensitatea fluorescentei e proportionala cu densitatea structurii celulalre specifice.

Flowcitometrul are 3 sisteme componente :

Sistemul fluidic – rol de a prezenta razei laser celulele din proba succesiv. Sistemul optic – care include sursa de lumina pentru excitatie si detectorii pentru colectarea

semnalelor luminoase. Sistemul electronic – transforma semnalele optice in semnale electrice ce vor fi ulterior

digitalizate si analizate pe calculator.

Principiul tehnicii :

Un fascicul de laser traverseaza un curent fluidic sub presiune formand un cilindu gol prin care trec rand pe rand picaturile dintr-un lichid ce contine suspensia de limfocite marcate sau nu cu fluorocromi.

Fasciculul e fragmentat prin difractie frontala ( forward scatter ) determinand talia celulei si prin side scatter – care determina gradul de granulozitate a celulei.

Fotomultiplicatorii masoara fluorescenta celulelor , combinarea a mai multet filtre permite analiza a mia multet semnale : rosii , oranj ,verzi , etc.

Rezultatele se masoara procentual . E de asemenea posibila cunoasterea numarului de exemplare al moleculelor cercetate ce se exprima la suprafata.

Avantajele tehnicii : Rapiditatea analizei , evaluarea numerica a populatiilor si subpopuulatiilor minoritare , asigurand reproductibilitatea si fiabilitatea rezultatelor , separarea subpopulatiilor celulare pe baza proprietatilor functionale , posibilitatea analizei multiparametrice.

Aplicatiile imunologice sunt numeroase :

investigarea capacitatilor functionale a diferitelor tipuri de celule implicate in mecanismul imun.

imunofenotiparea populatiilor limfocitare. studiul moleculelor de diferentiere leucocitare. determinarea naturii si gradului de maturare a clonei tumorale in caz de hemopatii maligne. studiul specificitatii atc monoclonali necunoscuti. etc

Separarea limfocitelor din sangele periferic

Se realizeaza din sangele periferic , cu ajutorul sepcelului.

Se face prin centrifugare , intr-o singura etapa , conform schemei :

Se introduc intr-o eprubeta 3 ml de mediu de separare deasupra caruia se introduce cu grija proba de sange heparinizat.

Eprubeta e centrifugata. Se inlatura stratul de plasma clara , de deasupra stratului de limfocite. Se recolteaza cu o pipeta pasteur banda de limfocite impreuna cu stratul de plasma de

deasupra si un minim din lichidul separator inferior. Lichidul recoltat se dilueaza in TFS si se centrifugheaza iar. Sedmimentul se resuspenda in mediu si se mai face o centrifugare , apoi se resuspenda

sedimentul la concentratia dorita.

Testul de viabilitate

Se bazeaza pe capacitatea celulelor vii de a exclude colorantii vitali si de a ramane necolorate atunci cand sunt puse in contact cu acestia. Cele neviabile pierd integritatea membranara si permit colorarea cu colorantul vital.

Se pun in contact cantitati egale dintr-o spsuensie de celule pe care le testam si un colorant vital.

Dupa 5 minute de incubare se spala cu TFS si apoi se efectueaza preparate ce se evalueaza microscopic.

Reactia se poate citi calitativ sau cantitativ , celulele moarte fiind cele ce se coloreaza , cele vii ramanand necolorate.

Testul se foloseste pentru urmarirea viabilitatii limfocitelor obtinute dupa separarea cu sepcel sau cu alt mediu de separare.

Se mai pot utiliza si teste radiometrice pentru a testa viabilitatea.

Testul de transformare blastica limfocitara

Se bazezaza pe faptul ca limfocitele unui subiect sensibilizat la un antigen pot fi stimulate in cultura cu acelasi antigen. Limfocitele B sau T sensibilizate au capacitatea de a elibera in vitro factori mitogeni care introduc activarea altor limfocite cu declansarea proliferarii lor celulare si aparita de limfoblasti.

Raspunsul proliferativ al limfocitelor sensibilizate la un atg si cultivate in vitro in prezenta acestui atg constituie un model de reactie imuna secundara , dovedind un proces de recunoastere specifica a atg.

In cursul testului proba obtinuta dupa tehnica de mai sus e cultivata in prezenta atg. sensilbilizat 2-3 zile la 37g C.

Paralel se face un martor din limfocitele bolnavului stimulate cu un mitogen ( fitohemagltuinina ) in vederea controlarii capacitatii de raspuns a celulelor.

Probele se controleaza zilnic in priviinta starii de viabilitate , utilizand tehnica colorantilor vitali.

Testul de transformare blastica poate fi interpretat corect doar in cazul obtinerii unei activitati optime pentru martori .

Se interpreteaza prin doua metode :

Metoda citologica – permite aprecierea procentuala a limfoblastilor pe preparate microscopice colorate Giemsa. In mod normal valoare este 10-20% la 3-4 zile dupa stimularea cu atg sensibilizant testat si 90-95% dupa 48 ore de stimulare cu mitogen nespecific ( martor ) . Limfoblastii – celule mari , nucleu reticulat , bazofile , bogate in ARN.

Metoda radiometrica – deceleaza cresterea sintezei de ADN premergatoare proliferarii celulalre. In acest sens se stimuleaza limfocitele recoltate cu atg de testat , dupa care se introduce in cultura un precursor ADN ( timidina tritiata ) marcata cu un izotop radioactiv. Se masoara apoi rata de incorporare a izotopului ( se masoara cat izotop ramane liber in mediul de cultura ) .Se stabileste deci o corelatie intre nivelul incorporarii timidinei si proportia celulelor transformate blastic.

Evaluarea limfocitelor prin tehnici de rozetare

Se face in baza existentei pe suprafata limfocitelor a unor markeri specifici cu functii de receptori.

Rozetarea – fenomen de imunocitoaderenta care constsa in legarea unui atg la receptorii membranari ai limfocitului . Aceasta proprietate fiziologica a limfocitelor se poate studia in vitro prin testul rozetarii care permite determinarea numerica a populatiilor limfocitare B si T ca si a subpopulatiilor acestora.

Limfocitele B :

Exprima la suprafata receptori pentru fragmentul Fc al IgG si receptori pentru subfractiunea C3b.

Aceste limfocite vor fixa pe receptorii respectivi eritrocite de oaie acoperite cu IgG ( rozete EA – erythrocite antibody ) si eritrocite invelite cu molecule de C3b – care au fost fixate prin intermediul unor atc de IgM ce servesc ca element de legatura ( EAC - Erythrocite , antibody , complement).

Rozeta – e constituita dintr-un limfocit si cel putin 3 hematii care au aderat.

Limfocitele T:

Pentru aprecierea limfocitelor T totale se urmareste detectarea receptorului E de mica afinitate prin rozetare E . Formarea rozeetelor in acest caz e mediata de 2 molecule : CD2 de pe limfocitul T si LFA ( lymphocite function associated antigen ) de pe membrana eritrocitelor de oaie.

Pentru proportia de limfocite Th - se urmareste detectarea receptorului E de mare afinitate prin rozetare.

Se demonstreaza prezenta receptorului Fc pentru fragmentul Fc al atc anti-eritrocitari ( clasa IgM) prin rozetare EAM , folosind eritrocite bovine acoperite de atc IgM anti-eritrocitari in concentratii subaglutinante.

Testul de inhibitie a migrarii macrofagelor

Principiul tehnici se bazeaza pe faptul ca macrofagele mentinute in condtii corespunzatoare in vitro , parasesc locul in care se afla si migreaza in diferite directii . Anumite limfokine eliberate de limfocitele care au reactionat specific cu un anumit antigen inhiba migrarea acestor celule.

Prin acest test se cauta evidentierea limfokinei numita MIF – factorul de inhibare a migrarii macrofagelor. Testul se realizeaza in vitro , si inhibarea MM se bazeaza pe memoria imunologica a celulelor T de a recunoaste in cultura atg cu care au mai venit in contact inaintea investigarii si pe capacitatea lor de a elibera factorul solubil cu rol in impiedicarea MM.

Reactia se efectueaza in camere de cultivare a celulelor in care se introduc tuburi capilare ce contin macrofage de la un animal hipersensibilizat , sedimentate prin centrifugare.

Intr-o camera se introduce mediul de cultura simplu ( martor ) iar in altele acelasi mediu in care se adauga antigenul fata de care au fost sensibilizate animalele de la care au fost recoltate celulele ( proba) .

Dupa incubare – in camera cu mediul simplu – macrofagele ies din capilar si migreaza in evantai. In camera in care s-a introdus si atg , migrarea e oprita.

Eliberarea MIF e un fenomen precoce – decelabil in cateva ore de cultivare .

Tehnica de lucru :

Se obtine un concentrat leucocitar din sangele prelevat de la pacient , folosind un mediu de separare.

Celulele sunt suspensionate in mediul de cultura , si introduse in tuburu capilare de 1mm care sunt inchise la un capat cu plastilina.

Se centrifugheaza , si se sectioneaza tuburile la nivelul interfetei sediment celular – supernatant

Tuburile cu sediment se introduc in camere de migrare si se fixeaza orizontal de marginea cutiei cu portiunile inchise , partile libere orientate spre centrul ei.

Dupa o incubare de 16-24 la 37 g C macrofagele vor migra prin extremitatea libera a tubului formand o coroana in jurul orificiului .

Tubul care prezinta migrarea normala a macrofagelor , in absenta atg , este tubul martor. Paralel se incubeaza leucocitele intr-o alta camera , in prezenta atg fata de care banuim ca

limfocitele subiectului au fost sensibilizate ( PPD , atg streptococice , etc ) . La acest tub – tubul proba – se observa o diminuare a suprafetei de migrare raportata la tubul martor.

Se calculeaeza indicele de inhibitie al MM dupa formula : suprafata coroana macrofage proba / suprafata coroana macrofage martor x 100.

R+ cand IIMM este < 70.

Testul citotoxicitatii imune - functia efectoare a celulelor citotoxice CD 8.

Limfocitele subiectului investigat , puse in contact in vitro cu acelasi atg ce le-a sensibilizat in vivo elaboreaza un factor solubil – limfotoxina ( TNF –B ) care determina pe culturi efecte citotoxice.

Tehnica consta in punerea in contact a limfocitelor sensibilizate de la pacient cu atg corespunzator(cel tumorale , celule de alt allotip decat donatorul) . Daca exsita un raspuns imun celular indreptat fata de celulele-tinta ( atg) in monostratul celular apar modificari citotoxice sau chiar plaje cauzate de actiunea limfotoxinei eliberate de limfocitele sensibilizate , dovedint reactia imuna mediaca celular.

Se apreciaza citotoxicitatea prin teste de viabilitate celulara sau prin masurarea eliberarii de izotop radioactiv. Uzual , se marcheaza celulele din celula cu Crom radioactiv . Prin liza lor Cromul se elibereaza in mediul de cultura , intensitatea radioactivitatii masurand deci gradul de citotoxicitate.