Recoltarea sangelui pt examene morfologice

Pt ex morfologice curente ale sangelui periferic se foloseste de obicei sange venos si mai rar sange capilar .Este recomandabil ca recoltarea sa se faca in conditii de repaus ,pe nemancate.Sangele venos ,recoltat prin punctie venoasa ,se amesteca cu un anticoagulant ,care trebuie sa fie uscat ,pt a nu schimba proportia dintre elementele figurate si plasma .Anticoagulantul folosit pt ex morfologice este Na2EDTA (sare disodica a acidului etilendiaminotetraacetic)in proportie de 1 mg /1 ml sange

Pregatirea materialului si recoltarea sangelui pt. hemograma.A.Sangele venos Materiale necesare:- seringa de plastic de unica folosinta sau holder-Ac de unica folosinta (19-20 SWG = 0,9-1 mm)-Vata, alcool, garou-Manusi de latex-Vacutainere (dop mov, albastru, negru, rosu)Conditii generale de recoltare: dimineata pe nemancate Tehnica: -Locul de punctie: o vena antecubitala la adulti (plica cotului); vena jugulara la sugari; o vena dorsala a mainii la obezi -Cu ajutorul garoului se produce o staza venoasa; recomandam pacientului sa stranga usor pumnul. Se dezinfecteaza pielea, apoi se efectueza punctia. Obs: Congestionarea zonei trebuie evitata pt prevenirea hemoconcentrarii: garoul trebuie slabit dupa ce acul patrunde in vena. Pistonul seringii trebuie retras lent: se previne hemoliza. Sangele trebuie repartizat cu atentie din seringa in recipiente,nu prin ac, fara a forma spuma. Daca se folosesc anticoagulanti, amestecul cu acestia trebuie facut imediat, cu grija, fara a forma spuma.

Sangele capilar se recomanda pt:-determinari de urgenta :hemoglobina ,leucograma-numaratoare de trombocite pt verificarea unei trombopenii sau cand trombocitele recoltate pe anticoagulant sunt aglomerate-executarea frotiurilor de sange patologic ,pt a avea morfologia leucocitelor perfect conservata Materiale: -lanteta sau ac de unica folosinta -Vata, tifon sau hartie de filtru; alcool Tehnica: -locul de punctie: pulpa degetului inelar sau mijlociu (la adulti), supraf plantara a calcaiului sau a halucelui (la sugari) -Supraf intepata trebuie sa fie calda si bine vascularizata; daca e rece sau cianozata iar sangele apare lent, se obtin valori crescute pt Hg, nr de L si de Er -Se dezinfecteaza pielea, apoi se inteapa ferm si rapid, suficient de adanc pt ca sangele sa tasneasca de la sine.

-Primele picaturi se sterg cu un tifon uscat sau o hartie de filtru, iar urmatoarele se recolteaza evitand stoarcerea degetului. -Picaturile de sange pot fi folosite pt obtinerea de frotiuri prin depunerea lor pe lame de sticla. Observatii:1. in sangele capilar, Hg, Ht si nr Er sunt mai scazute decat in sangele venos; 2. nr de Tr se apreciaza mai exact prin examinarea unui frotiu de sange capilar (unde nu s-a folosit anticoagulant la recoltare; in sangele venos pastrat pe anticoagulant acesta poate produce gruparea Tr sau fenomenul de satelitism, ceea ce va duce la valori fals scazute ale Tr); 3. anticoagulantul poate produce alterari ale morfologiei celulei sanguine.

Pt un examen morfologic de calitate se prefera frotiul din sange capilar, iar pt examenul cantitativ se prefera sangele venos.

Anticoagulantii folositi in hematology

Anticoagulanti: pt hemoleucograma se folosesc saruri de EDTA (acid etilen diaminotetraacetic). Na2 EDTA, K2 EDTA si K3 EDTA au un efect chelator asupra moleculelor de Ca din sange. Practic, EDTA impiedica formarea cheagului. EDTA-ul e preferat altor anticoagulanti pt ca in proportie adecvata nu modifica volumul Er si nu produce alterari morfologice semnificative ale cel sanguine. Trebuie respectata strict proportia sange – anticoagulant! 0.2 ml solutie anticoagulant -2 ml sange

Prepararea anticoagulantului cu EDTA: se prepara solutie de Na2 EDTA 1% in ser fiziologic; se repartizeaza in tuburi de centrifuga cate 0,2 ml ce se lasa sa se usuce la termostat (370 C) fara dop, pana la evaporarea completa a apei; se recolteaza 2 ml de sange.

Prepararea amestecului anticoagulant Wintrobe:- oxalat de amoniu 1,2 g; -oxalat de potasiu 0,8 g; -apa distilata ad 100 ml; se repartizeaza cate 0,5 ml si se lasa sa se usuce in conditiile de mai sus; se recolteaza 5 ml de sange.

Executia frotiului de sange: -Se pune o picatura mica de sange pe o lama-suport, la 1-2 cm distanta de unul din capete, pe linia centrala. -Se pune in contact picatura cu capatul unei lame slefuite, tinand-o la un unghi de aprox 30-450 fata de lama-suport. Picatura se va intinde de-a lungul liniei de contact dintre cele 2 lame. -Se intinde frotiul cu o miscare de translatie lina, uniforma si rapida a lamei slefuite. -Lama cu care se intinde frotiul trebuie sa fie putin mai ingusta decat lama-suport pt a se putea obtine si examina 2 margini paralele in lungime ale frotiului: se foloseste o lama slefuita cu colturi rupte. -Frotiul se usuca rapid prin agitare in aer.

Observatii:

- un frotiu bine executat trebuie sa indeplineasca urm conditii:Lungime = 3-4 cmSa fie mai ingust decat lamaSa aiba 2 margini drepte, paralele, si franjuri in partea terminalaSa aiba o grosime potrivita, cu o trecere gradata de la gros la subtireCelulele sa fie raspindite uniform, sa nu fie distruse sau deformate

Coloratiile uzuale

Colorarea frotiurilor trebuie facuta imediat sau in cel mult cateva ore dupa executarea lor. Exista: coloranti acizi (eozina)coloranti bazici (albastru/violet/azur de metilen)coloranti neutri (eozinat de albastru/azur de metilen)Cea mai frecvent utilizata coloratie este cea panoptica. 1.Coloratia panoptica May-Grunwald-Giemsa -Solutie May-Grunwald:eozinat de albastru de metilen 1 gGlicerina neutra 50 mlAlcool metilic 100 ml

-Solutie Giemsa: eozinat de azur de metilen 3 gAzur de metilen 0,8 gGlicerina neutra 250 mlAlcool metilic 200 mlMai sunt necesare: apa distilata neutra, pipete Pasteur, pipete gradate

Obs: pH-ul apei distilate trebuie sa fie 7-7,2. Apa distilata fiind de obicei acida, se neutralizeaza prin adaugarea catorva picaturi de solutie slab alcalina de carbonat de sodiu 1% la 500 ml de apa distilata, incercandu-se pH-ul cu indicator universal de hartie. Tehnica: A)Fixarea: se acopera frotiul cu solutia May-Grunwald si se lasa 2-3 min. B)Colorarea: se adauga peste solutia May-Grunwald apa tamponata, si se lasa astfel 2 min. Se varsa solutia de pe lama si se acopera lama cu solutie Giemsa diluata (o picatura sol Giemsa pt 1 ml apa tamponata), apoi repaus 20 minSe spala lama la robinetSe sterge dosul lamei si se lasa lama in stativ pt uscareObs: un frotiu bine colorat prezinta microscopic:-Zonele dintre celule: clare-Er: portocaliu-rosu-Granulatiile neutrofile: purpuriu-Granulatiile eozinofile: rosu-portocaliu-Granulatiile bazofile: albastru-inchis, negru-Citoplasma limfocitelor (Lf): albastru palid-Nucleul leucocitelor (L): albastru-violaceu

2.Coloratia Giemsa Pt colorarea picaturii groase si evidentierea parazitilor malariei si a spirochetei Obermeier (Borrelia recurrentis).

3.Coloratii vitale Sangele se pune in contact direct cu colorantul fara o fixare prealabila, de ex. coloratia reticulocitelor.

Sunt necesare: albastru briliant crezil sol 1% in alcool etilic absolut cutii Petri captusite cu hartie de filtru umezita Se intinde pe o lama un frotiu subtire din sol coloranta, se usuca, apoi se intinde sangele pe aceasta lama ca pt orice frotiu. Se pune in camera umeda timp de 1 min si se usuca la aer. Se examineaza cu obiectivul cu imersie. Reticulocitele apar ca Er ce contin precipitate (pp) albastru inchis de granule sau filamente.

Punctia medulara (punctia maduvei osoase)Biopsia maduvei osoase se efectueaza prin indepartarea unui „miez” cilindric in care se conserva structura medulara, celularitatea globala (cantitatea relativa de celule medulare raportat la celulele grase) si raporturile dintre celule. Aspirarea maduvei osoase indeparteaza doar maduva. Aceste doua teste se efectueaza pentru a descoperi cauza unor boli ale sangelui si pot fi folosite pentru a verifica daca infectia sau cancerul s-a raspandit in maduva osoasa. Aspirarea maduvei osoase permite colectarea unui esantion de lichid cu celule din maduva osoasa cu ajutorul unui ac. Acest esantion se studiaza apoi la microscop pentru a detecta orice problema cu celulele de sange produse in maduva. De asemenea, esantionul poate fi studiat pentru a identifica si probleme cromozomiale dar si infectiile posibile.Biopsia indeparteaza o portiune de os care inca mai contine maduva osoasa pentru a fi studiata la microscop. Mai intai se efectueaza biopsia iar apoi aspirarea. Aspirarea se poate efectua si pentru colectarea de maduva osoasa pentru interventii medicale cum ar fi transplantul de celule stem sau analiza cromozomiala.De ce se face testul? Aspirarea maduvei osoase, biopsia, sau ambele teste sunt efectuate pentru:- identificarea unor eventuale probleme cu eritrocitele, celulele albe in cazul pacientilor care sufera de anemie, prezinta un numar mai mic sau mai mare de celule decat normal;- diagnosticarea unor afectiuni hematologice, precum: leucemia, anumite tipuri de anemii sau afectiuni ale maduvei osoase precum policitemia sau mielom multiplu;- a verifica daca un anumit tip de cancer s-a raspandit si in maduva osoasa;- depistarea tumorilor care incep sau s-au raspandit in maduva osoasa;- identificarea celui mai eficient tratament pentru o afectiune a maduvei osoase (pentru a vedea daca tratamentul pentru leucemie a functionat);- recoltarea unui esantion pentru interventii medicale (transplant de celule stem).Pregatire pacient Pacientul va fi rugat sa semneze o declaratie de consimtamant. Medicul trebuie informat daca pacientul (pacienta):- administreaza medicamente;

- este alergic la anumite medicamente inclusiv anestezice;- prezinta tulburari de coagulare a sangelui;- este insarcinata.Cum se face testul? Primul pas este analizarea testele de coagulare. Daca pacientul este extrem de anxios, se pot administra sedative.Aspirare de maduva osoasaProcedura se efectueaza de obicei la patul pacientului sub anestezie locala. Pentru a putea aborda spina iliaca posterioara se asaza pacientul in decubit ventral sau lateral. Tegumentele supraiacente osului punctionat se acopera cu material textil, se dezinfecteaza corespunzator si se infiltreaza cu lidocaina; se infiltreaza in acelasi timp si periostul. Se introduce lent prin tesutul moale si tablia osoasa externa un ac sfredelitor de calibru mare prevazut cu un stilet. Odata patruns in maduva osoasa, stiletul este indepartat si se ataseaza o seringa. Se aspira 2-5 mL si se biopsiaza cel putin 1 cm de maduva osoasa; se efectueaza frotiuri. Lamelele se usuca si se sprayeaza cu un fixativ. Frotiurile ce urmează a fi examinate histoenzimatic se fixeaza imediat in formol 10%, alcool metilic absolut sau vapori de formol 40%. Se transporta imediat la laborator.BiopsiaSe incizeaza tesuturile moi si tegumentele supraiacente osului examinat.Se "insurubează" in os instrumentul de biopsie si se obtine proba ce va fi trimisa laboratorului. Se presează locul punctionarii pentru a asigura o minimă sangerare.Se aplica un bandaj adeziv. De obicei se recomanda pacientului repaus la pat pentru cel puţin 30-60 de minute. Se monitorizeaza locul punctionarii si se utilizeaza gheata in cazul in care se observa sangerare. Se monitorizeaza semnele vitale ale pacientului.

Cum se simte? Pacientul poate simti o intepatura si arsura in momentul in care anestezicul amorteste pielea unde va fi punctul de aspiratie sau biopsie. De asemenea, in momentul patrunderii acului in os, pacientul poate simti durere sau presiune in acel loc. Durerea dureaza cateva secunde. In timpul aspiratiei pacientul poate simti o durere ascutita de-a lungul piciorului in momentul recoltarii probei. Durerea se opreste in momentul in care proba este recoltata.Zona unde a fost efectuata biopsia va fi sensibila, va dura, si va prezenta o vanataie.Riscuri Efectuarea acestor doua teste nu presupune riscuri majore insa pot aparea unele probleme cum ar fi:- sangerarea la locul unde a fost efectuata biopsia;- infectia pielei sau a osului la locul biopsie;- ranirea inimii, plamanului sau unei artere daca esantionul este prelevat din stern (foarte rar).Rezultate Rezultate normale:- maduva contine cantitati normale de grasimi, tesut conjunctiv si fier. Numarul de celule mature si in crestere este normal.- nu sunt semne ale unei infectii;- nu se despisteaza celule canceroase (leucemie, limfom);- celelule canceroase nu s-au raspandit in organism.Rezultate anormale:- celulele maduvei sunt anormale;

- sunt prea multe sau prea putine celule iar tesutul medular nu are aspect normal;- maduva osoasa contine prea mult sau prea putin fier;- se depisteaza semne ale infectiei;- se depisteaza celule canceroase;- maduva osoasa a fost inlocuita de tesut cicatrizant.Ce poate afecta testul? Conditiile pentru care nu se recomanda efectuarea testelor sau situatii in care rezultatele nu sunt concludente cuprind:- efectuarea unei transfuzii de sange sau administrarea de medicament cu un continut crescut de fier;- tratament cu radiatii asupra zonei unde se efectueaza biopsia;- obezitatea.Alte informatii Daca in locul unde s-a efectuat aspiratia sau biopsia maduva este normala, nu inseamna ca ea este sanatoasa in toate partile corpului.

Diagnosticul de celula sanguina

Celulele sanguine se formeaza in maduva osoasa. Maduva osoasa este o formatiune complexa, de consistenta moale, spongioasa, localizata in centrul oaselor, care produce aproximativ 95% dintre celulele sanguine ale organismului. Exista si alte organe si sisteme din corpul uman care ajuta la echilibrarea productiei de celule sanguine. Printre acestea se enumera ganglionii limfatici, splina, ficatul care au rol in crearea, distrugerea si diferentierea (participand la dezvoltarea unor functii specifice) celulelor.Procesul prin care se produc si se dezvolta noi celule poarta numele de hematopoieza. Celulele de sange formate in maduva osoasa iau forma unei celule stem sau celule hematopoietice - forma primara, initiala a tuturor celulelor sanguine. Pe masura ce se maturizeaza, celulele stem evolueaza in mai multe tipuri distincte de celule sanguine, cum ar fi: ceulele rosii, celulele albe si trombocitie. Celulele sanguine imature sunt denumite blasti. Unele celule de acest tip raman in maduva osoasa pana se maturizeaza iar altele circula in alte parti ale corpului pentru a se maturiza si sa functioneze ca celule sanguine.Functia primara a celulelor rosii ale sangelui sau a eritrocitelor este de a transporta oxigen si dioxid de carbon. Hemoglobina este o proteina importanta din componenta celulelor rosii sanguine care transporta oxigenul de la plamani catre toate partile corpului uman. Principala functie a celulelor sanguine albe sau a leucocitelor este sa lupte impotriva infectiilor. Exista mai multe tipuri de celule albe sanguine si fiecare are propriul sau rol impotriva infectiilor bacteriene, virale, fungice si parazitare.

Cele mai importante tiuri de celule albe sanguine care ajuta la protejarea de infectii si impotriva celulelor straine includ:- neutrofilele;- eozinofilele;- limfocitele;- monocitele;- granulocitele.

Celulele albe din sange au diverse roluri:- nu contribuie doar la lupta impotriva infectiilor ci si ajuta la vindecarea ranilor prin ingerarea a diverse materiale cum ar fi celule moarte, resturi de tesut si celule rosii sanguine imbatranite.- protejeaza organismul uman de corpurile straine care pot patrunde in fluxul sanguin, cum ar fi alergenii.- sunt implicate in protectia organismului impotriva celulelor anormale, cum ar fi cele intalnite in cazul cancerului.Functia de baza a trombocitelor sau plachetelor sanguine este coagularea sangelui.Trombocitele au dimensiuni mult mai mici decat celelalte celule ale sangelui. Acestea se aduna la un loc, se grupeaza impreuna si formeaza o bariera sau un tampon in fisura vasului de sange pentru a opri sangerarea acestuia.

Maduva hematogena contine• Celule stem pluripotente care au urmatoarele caracteristici principale: sunt celulele deorigine ale tuturor liniilor sanguine ,au capacitate de autoregenerare si diferentiere• Celule progenitoare hematopoietice “angajate”, care vor da nastere diferitelor tipuri decelule sanguine. Pot fi de doua tipuri:-Celule progenitoare mieloide, din care deriva eritrocitele, o parte din leucocite(granulocitele neutrofile, eozinofile, bazofile si monocitele) si trombocitele- Celule progenitoare limfoide, din care deriva limfocitele B si TCelulele adulte, apartinând seriei leucocitare, vor actiona împreuna în vederea aparariiorganismului împotriva agresiunii infectioase (virale, bacteriene sau parazitare).

Seria leucocitara este formata din 3 linii celulare:

1. SERIA GRANULOCITARA cuprinde celule polinucleare, clasificate în:• Granulocite nesegmentate (tinere) au nucleul în forma de potcoava• Granulocite segmentate (adulte) au nucleul segmentat. Cu cât celula este mai matura, cu atât are mai multe segmente.În functie de tipul granulatiilor prezente în citoplasma, exista mai multe tipuri de granulocite:1.1. Granulocitul segmentat neutrofil

are citoplasma slab acidofila (roz palid), cu granulatii neutrofile specifice, mici, punctiforme si numeroase; nucleul este segmentat în 2-5 lobi legati între ei prin punti fine de cromatina. Are urmatoarele roluri:• rol în microfagocitoza ,functia principala în apararea organismului contra infectiilor(reprezinta prima linie de aparare prin înglobarea si distrugerea de particule din mediulextracelular)• rol secretor pentru: transcobalamina I (transporta vitamina B12), interleukine (IL1 tinduce febra), prostaglandine, etc.1.2. Granulocitul segmentat eozinofil-

are în citoplasma granule mari, egale, eozinofile (portocalii), iar nucleul sau prezinta 2 segmente. Are urmatoarele roluri:• rol în fagocitoza - factorii care determina chemotaxia eozinofilului sunt: complexele

imune antigen-anticorp (detin rolul major în reactiile imune), fibrina, enzime proteolitice,histamina. Eozinofilele pot fagocita si bacterii sau fungi, dar sunt mai putin atrase deacestea decât neutrofilele.• rol în apararea antiparazitara - chiar daca nu poate fagocita parazitii, eozinofilul seataseaza de acestia si elibereaza la exterior granulatii care contin o substanta cu oputernica actiune citotoxica (PBM- proteina bazica majora).• rol în bolile alergice

1.3. Granulocitul segmentat bazofil

- contine granulatii caracteristice bazofile care ocupa toata citoplasma, uneori suprapunându-se peste nucleu; nucleul este incomplet segmentat. Are urmatoarele roluri:• rol în fagocitoza, dar la o scara mai redusa.• rol în degranulare, cu eliberarea la exteriorul celulei a numerosi mediatori, fenomen cuimportanta în patogenia si diagnosticul unor afectiuni alergice, dar au si rol chemotacticpentru neutrofile si eozinofile.

2. SERIA LIMFOCITARA. Dupa marime limfocitele pot fi: mici, medii si mari în functie de gradul de maturare si reprezinta componenta celulara majora din tesuturile limfatice.

Forma limfocitelor este rotunda sau usor ovalara, cu diametrul de 6 - 12 µm. Nucleul este

mare si ocupa cea mai mare parte a celulei fiind intens colorat. Citoplasma este slab bazofila (albastru deschis). Limfocitele au urmatoarele roluri:• rol în raspunsul imun, declansat de patrunderea în organism a unor celule straine sau aunor macromolecule proteice. Acest raspuns este caracterizat prin productia de anticorpide catre limfocitele B (imunitate umorala) si de produsi celulari citotoxici eliberati decatre limfocitele T (imunitate celulara).

3. SERIA MONOCITARA. Monocitele sunt cele mai mari celule din seria leucocitara, cu un diametru cuprins între 10 - 25 µm si sunt specializate în apararea organismului.

Nucleul este nesegmentat, reniform si nu prezinta nucleoli. Citoplasma este abundenta si intens bazofila (albastru închis). Seria monocitara include:• precursorii din maduva hematogena• monocitele din sânge• macrofagele din tesuturiMonocitele îndeplinesc urmatoarele roluri:• rol în macrofagocitoza particulelor coloidale, a celulelor degenerate• rol în raspunsul imun ca si celule accesorii (prezentatoare de antigen)

Seria eritrocitara

Parametri cito- morfologici:- numaratoare completa si diferentiata;- diametrele elementelor figurate ;- suprafata (eritrocitara);- volum (eritrocitar- vezi indici);- forma (eritrocit biconcav, sferocit etc);- culoare (rosu aprins).Se analizeaza: dimensiunea, forma si caracterele tinctoriale. Se va nota prezenta resturilor nucleare, a granulatiilor si eventual a parazitilor (malaria). Anomalii eritrocitare de dimensiuni si de forma:- anulocite in anemiile hipocrome;- megalocite in anemiile megalocitare;- sferocite, in anemii hemolitice si unele afectiuni congenitale (sferocitoza ereditara);- ovalocite, in anemii hemolitice;

- hematii in tinta, in talasemii;- anizocitoza si poikilocitoza, in toate formele de anemii

Bolile sângelui

Bolile sângelui au de obicei o localizare principala pe elementele figurate ale seriei rosii, ale celei albe sau ale celei trombocitare, dar ele nu se limiteaza la o serie, ci au ecou si în celelalte serii, în afara de bolile celulelor sângelui se mai pot întâlni si boli ale proteinelor sangvine si în special boli ale coagularii.

In raport cu cresterea sau scaderea numarului globulelor rosii, bolile care afecteaza seria rosie se împart în eritremii si anemii.

Eritremiile sînt boli grave ale celulei rosii, în cadrul lor s-au descris: policitemia, eritroblastozele cronice si eritroblastozele acute.o Policitemia sau poliglobulia se caracterizeaza printr-un sânge vâscos cu peste 6 000 000 globule rosii pe mm3, dar care nu sînt încarcate suficient cu hemoglobina. Boala se asociaza cu cresterea volumului ficatului si splinei, datorita faptului ca aceste organe devin la rândul lor producatoare de hematii, alaturi de maduva oaselor. Boala dureaza în medie 10 ani si este grava daca nu se aplica tratamentul.o Eritroblastozele sînt, de asemenea, boli de sânge grave, care se caracterizeaza prin aparitia în sângele circulant a elementelor tinere nucleate ale seriei rosii. Boala este asemanatoare cancerului seriei albe (leucemie). Forma cronica a eritroblastozei duce la anemie grava, mortala (hematiile normale sînt înlocuite treptat cu celule tinere, care nu pot satisface nevoile respiratorii ale organismului).

Anemiile sînt cele mai frecvente boli de sânge.O trasatura caracteristica a tuturor anemiilor este scaderea în proportii variabile a numarului globulelor rosii, fenomen asociat cu modificari în forma, structura si compozitia chimica a hematiei.o Anemiile posthemoragice se caracterizeaza prin scaderea masiva a numarului delobule, precum si a cantitatii de hemoglobina. O forma grava a anemici acute posthemoragice este însotita de soc sau colaps cardiovascular. Forma cronica apare dupa pierderi mici, dar repetate, de sânge, prelungite deseori timp do luni si ani, ducând la epuizarea maduvei oaselor si a rezervelor de fier ale organismului. Aceasta situatie apare în caz de ulcer duodenal sângerând, hemoroizi, colita ulceroasa, cancer gastric sau intestinal, metroragii, hematurii. Tratamentul acestor anemii consta în înlaturarea cauzei care le-a declansat, medicamente (produse de fier, vitamina Bsi transfuzii cu sânge total sau masa eritrocitara.o Anemia feriprivâ se caracterizeaza prin încarcarea redusa cu hemoglobina a hematiillor si apare la persoanele care primesc prin alimentatie cantitati insuficiente de fier, la cele cu absorbtie defectuoasa de fier prin intestin sau la cele la care consumul de fier este crescut (gravide, fete la pubertate etc.), precum si în utilizarea defectuoasa a fierului, în tumorile maligne si infectii. Tratamentul consta în administrarea pe gura sau prin injectii a preparatelor de fier, îmbunatatirea alimentatiei cu alimente cât mai bogate în proteine si fier.

o Anemia pernicioasa (Biermer) se caracterizeaza prin lipsa de maturizare a globulelor rosii, datorita lipsei sau insuficientei sinteze a factorului antianemic (Castle) în mucoasa gastrica. Prin tratamentul cu vitamina B12 se constata o maturizare rapida a tuturor globulelor rosii. Bolnavii cu tulburari gastrice cronice pot preveni aceasta boala, prezentându-se cu regularitate la controlul medical periodic, în cadrul dispensarizarii.o Anemiile hemolitice apar în urma unei distrugeri exagerate a globulelor rosii, datorita fio calitatii defectuoase a hematiei, fie anticorpilor din plasma sangvina, fie, în sfârsit, distrugerii într-un ritm prea accelerat a globulelor rosii de catre splina. Factorii chimici care pot declansa anemii hemolitice sînt cloratul de potasiu, benzenul, plumbul, fosforul, sulfamidele, fenacetina si chinina, toxinele unor microbi (streptococi, stafilococi), toxinele unor paraziti (hematozoarul palustru), precum si unele toxine provenite din ciuperci sau veninuri de sarpe si paianjen. Factorii imunologici sau anticorpii hemolizei apar datorita incompatibilitatii dintre aglutinogenul aflat pe hematiile sângelui administrat prin transfuzie si aglutininele din sângele bolnavului. Acesti anticorpi distrug hematiile introduse si provoaca o stare grava, numita soc hemolitic posttransfuzional. O boala similara însa aparuta în mod "fiziologic" este boala hemolitica a nou-nascut ului, care apare dupa cum am vazut prin conflict serologic, în special în sistemul sangvin Rh. în acest caz, tatal fiind Rh pozitiv, transmite fatului acest caracter al globulelor rosii. In timpul sarcinii, globulele rosii Rh-pozitive ale fatului trec prin placenta în corpul mamei, producând în sângele acesteia anticorpi specifici anti-Rh. Trecând din nou prin placenta în corpul fatului anticorpii anti-Rh distrug hematiile acestuia, determinând aparitia boli hemolitice.Caracteristica tuturor anemiilor hemolitice este scaderea marcata a numarului de eritrocite, care poate atinge valori severe, sub l 000 000 globule rosii pe milimetru cub. Din cauza efortului la care este supusa, în unele cazuri maduva oaselor nu mai poate compensa pierderile. Aceasta faza grava a bolii poarta numele de panmieloftizie. Urina este colorata în rosu, datorita eliminarii resturilor provenite din cantitatea mare de hemoglobina pusa în libertate prin distrugerea globulara.o Anemiile prin defect de generare a eritrocitelor, numite hipoplastice sau aplastice, sînt datorite incapacitatii maduvei oaselor de a produce hematii. Aceste anemii care apar în special în timpul bolilor maligne ale sistemului hematopoietic (leucemii acute si cronice, reticuloza), sînt asociate si cu o scadere a numarului de trombocite, din care cauza, alaturi de anemie, la bolnavi survin si hemoragii. Forma grava a anemiilor hipoplastice si aplastice se confunda cu panmieloftizia.

Bolile globulelor albe sînt starile morbide în care numarul sau calitatea leucocitelor difera de normal.o Leucopenia, care consta în scaderea leucocitelor sub cifra normala de 5 000-8 000 elemente pe milimetru sub, apare ca un simptom în cursul bolilor date de virusuri, precum si în febra tifoida. Cifrele înregistrate nu scad în aceste cazuri mult sub normal (2 000- 4000 pe mm3), în intoxicatiile maduvei oaselor apare o forma foarte grava de leucopenie, denumita agranulocitoza. Spre deosebire de leucopenie, în care numarul global de globule albe este scazut, în agranulocitoza scaderea generala a leucocitelor este însotita de o scadere mare sau disparitia selectiva a granulocitelor (polinucleare), fie din cauza neputintei maduvei de a le produce, fie prin distrugerea lor masiva în circulatie. Apar ulceratii necrotice pe mucoase. Boala survine în intoxicatia organismului cu substante chimice (benzen) sau medicamente (pyran, atofan, chinina, fenacetina, penicilina, barbiturice, cloramfenicol), precum si în cazul administrarii unor doze mari de raze Rontgen.

Tratamentul consta în primul rând în îndepartarea cauzelor toxice care au determinat aparitia bolii. Lucratorii din industria chimica de sinteza, în care se utilizeaza substantele care dau agranulocitoza, sînt obligati sa respecte în modul cel mai strict masurile de protectie. Bolnavii care utilizeaza medicamente ce pot determina aparitia agranulocitozei au obligatia sa se conformeze întocmai prescriptiei medicale.o Limfocitoza se caracterizeaza printr-o crestere a proportiei de limfocite peste 25% (cât reprezinta acestea fata de celelalte globule albe). Acest simptom hematologic este caracteristic anumitor stari de aparare a organismului, limfocitul considerându-se astazi ca sediul de formare a anticorpilor. în limfocitoza infectioasa, o viroza limfatica acuta caracterizata prin leucocitoza cu limfocitoza, numarul de globule albe poate sa creasca la 40000 - 50 000 elemente pe mm3, din care 50-80% sînt limfocite. Boala nu este grava, evoluând de cele mai multe ori benign.o Mononudeoza infectioasa este de asemenea o boala a sistemului limfatic, data de un virus. Clinic se caracterizeaza prin: amigdalita, febra, umflarea ganglionilor si a splinei, cresterea importanta a leucocitelor, cu predominanta monocitelor. Boala nu este grava. Fiind o boala infectioasa, poate fi prevenita prin masurile generale de profilaxie a contagiunii, în primul rând prin evitarea contactului cu persoanele bolnave.o Leucemia mieloidâ cronica se caracterizeaza prin cresterea masiva a leucocitelor (50000-200000 pe mm3), predominând elementele granulocitare adulte si tinere. Pe masura ce procesul canceros invadeaza întreaga maduva, sînt prinse si celelalte serii de celule: rosie si trombocitara. Apare o anemie grava, însotita de hemoragii, prin scaderea numarului de trombocite. în formele avansate se constata ca si alte organe hematopoietice, care în mod normal nu produc granulocite, devin sedii suplimentare de productie a acestor elemente sanguine (splina). Tratamentul leucemiei mieloide cronice ramâne înca bazat pe chimioterapie si medicatie simptomatica, având scopul sa prelungeasca viata bolnavului.o Leucemia limfatica cronica este localizata pe organele limfatice. Este o leucemie mai benigna decît cea mieloida. Boala se manifesta asemanator cu leucemia mieloida, cu deosebirea ca elementele care predomina în formula leucocitara sînt limfocitele.o Leucemia acuta este cea mai grava forma a leucemiilor, putind evolua mortal în 2-3 saptamâni. în circulatia sangvina, globulele albe sînt înlocuite aproape în totalitate de un singur tip de celule tinere, fara functiile pe care le au de obicei globulele albe. Datorita chimioterapiei moderne, leucemia acuta are astazi o perioada de evolutie mai lunga ca în trecut, putându-se transforma în forma cronica.

Bolile ganglionilor limfatici si ale splineiBolile ganglionilor limfatici, în afara celor care apar în cursul altor boli infectioase si care nu prezinta gravitate, sînt de tip canceros, ca: retieulosarcomul, limfosarcomul si limfogranulomatoza maligna (boala Hodgkin).In afara de bolile comune ale celorlalte organe limfatice pe care le-am enumerat, splina poate fi afectata de o boala numita hipersplenism, o exagerare patologica a functiilor normale ale acestui organ. Pe de o parte se modifica activitatea normala a maduvei oaselor, iar pe de alta parte are loc o actiune de distrugere a globulelor rosii si a trombocitelor, mult crescuta fata de normal. Singurul tratament care se poate aplica în aceste cazuri este scoaterea chirurgicala a splinei

TEHNICI HEMATOLOGICE

Hemoleucograma completa consta din masurarea urmatorilor parametri:1. numar de leucocite;2. numar de eritrocite;3. concentratia de hemoglobina;4. hematocrit;5. indici eritrocitari: volumul eritrocitar mediu (VEM), hemoglobina eritrocitara medie

(HEM), concentratia medie de hemoglobina (CHEM) si largimea distributiei eritrocitare (RDW);

6. numar de trombocite si indici trombocitari: volumul trombocitar mediu (VTM) si largimea distributiei trombocitare (PDW);

7. formula leucocitara;8. numaratoare de reticulocite.

Hemograma este un test screening de baza, fiind unul din cele mai frecvent cerute teste de laborator, reprezentand adesea primul pas in stabilirea statusului hematologic si diagnosticul diverselor afectiuni hematologice si nehematologice. Cuantificarea parametrilor hematologici asociata uneori cu examinarea frotiului de sange aduce informatii pretioase, orientand in continuare spre efectuarea altor teste specifice.Pregatire pacientHemograma se poate recolta à jeun (pe nemancate) sau postprandial (trebuie totusi evitate mesele bogate in lipide care pot interfera cu anumiti parametri ai hemogramei).Sexul, varsta pacientului, precum si anumite conditii cum ar fi: starea de soc, varsaturi incoercibile, administrarea masiva de lichide i.v. etc., care pot duce la deshidratarea, respectiv hiperhidratarea pacientului, precum si anumite tratamente urmate de pacient trebuie comunicate laboratorului.Este de preferat evitarea pe cat posibil a stresului in momentul recoltarii.In cazul monitorizarii regulate (zilnic sau la doua zile) a anumitor parametri, proba de sange pentru efectuarea hemogramei trebuie obtinuta in acelasi moment al zilei (datorita fluctuatiilor fiziologice circadiene ale unor parametri) Specimen recoltat, recipient si cantitate recoltata – sange venos recoltat pe anticoagulant: EDTA tripotassium/dipotasium/disodium (vacutainer cu capac mov/roz – K3 EDTA); la copii mici se poate recolta sange capilar din deget/calcai pe heparina (microtainer).Se amesteca continutul prin inversiunea usoara a tubului de cca. 10 ori.Cauze de respingere a probei

tub incorect; specimen coagulat; specimen hemolizat; cantitate insuficienta.

Prelucrare necesara dupa recoltare – daca proba nu este trimisa imediat la laborator trebuie refrigerata.Stabilitate proba - 36-48 ore la temperatura camerei (18-26°C) sau la frigider (2–8°C) – pentru determinarea hemoglobinei si numaratorile de celule. Este recomandat ca probele sa fie analizate in primele 6 ore de la recoltare. Nu se recomanda depasirea acestui interval pentru determinarea

indicilor eritrocitari si hematocritului. Daca proba a fost refrigerata, trebuie echilibrata la temperatura camerei inainte de a fi analizata.Metoda de determinare – analizor automat pe principiul citometriei in flux cu fluorescenta utilizand LASER semiconductor si focusare hidrodinamica. NUMARUL DE ERITROCITE (NUMARUL DE CELULE ROSII)

Numarul de eritrocite reprezinta testul de baza pentru evaluarea eritropoiezei. Eritrocitele sunt investigate in continuare prin masurarea concentratiei de hemoglobina si a hematocritului, iar pe baza lor analizorul calculeaza indicii eritrocitari: VEM, HEM, CHEM si RDW, care caracterizeaza din punct de vedere calitativ populatia eritrocitara.Eritrocitele sunt cele mai numeroase celule din sange, sunt anucleate, fiind necesare pentru respiratia tisulara. Eritrocitele sunt cele mai specializate celule ale organismului, principala functie constand in transportul 02 de la plaman la tesuturi si transferul CO2 de la tesuturi la plaman. Acest lucru se realizeaza prin intermediul hemoglobinei continute in eritrocite. Forma eritrocitelor de disc biconcav confera raportul volum/suprafata optim pentru schimbul de gaze si le asigura acestora deformabilitatea in timpul traversarii microcirculatiei.Indicatii – in combinatie cu hematocritul si concentratia de hemoglobina, numarul de eritrocite este util in detectarea si monitorizarea anemiei si eritrocitozei/policitemiei.Metoda de determinare – eritrocitele sunt numarate de analizorul automat in timpul trecerii acestora printrtun orificiu prin care sunt dirijate intrtun singur rand prin metoda de focusare hidrodinamicaMetoda manuala :Materiale necesare:microscop optic ,pipeta Potain pt hematii ,solutie Hayem ,ace sterile,vata alcool hemocitometru ,lamela de sticlaExaminarea lor se face cu obiectivul uscat mare (60) si ocularul 10 ,cu condensorul coborat ,(lumina slaba).Pipeta Potain pt hematii serveste la diluarea sangelui in vederea numararii eritrocitelor.

Este formata dintr-un tub capilar ,care in portiunea superioara este dilatat ,formand o ampula .Extremitattea lunga a pipetei serveste la aspirarea sangelui si a solutiei Hayem.Pe aceasta portiune se afla gradate cifrele 0.5 si 1.Superior ampulei se gaseste cifra 101 mm3.In ampula se afla o perla de sticla de culoare rosie care serveste la amestecarea si omogenizarea sangelui cu solutia Hayem .La extremitatea scurta a pipetei se afla un tub de cauciuc prevazut cu o piesa bucala .Pt efectuarea dilutiei de 1:200 se aspira sange pana la diviziunea 0.5 si se completeaza cu solutie Hayem pana la diviziunea 101.Dilutia de 1:100 se obtine aspirand sange pana la diviziunea 1.

Dupa intrebuintare pipeta Potain se spala cu apa distilata ,se clateste cu alcool 96grade ,cu eter,si se usuca la pompa de vid .In caz de infundare a capilarului se actioneaza cu un mandren sau cu un fir de par de cal ,dupa care se pune in HCL 15%.Camera de numarat Burker este o lama groasa de sticla pe care la o adancime de 0.1 mm sunt gravate doua retele cu o suprafata de 9 mm2 situate simetric fata de un sant transversal .Are gravate urmatoarele date :inaltime de 0.10mm;suprafata patratului mic 1/400 mm2;suprafata patratului mediu 1/25 mm2.Suprafat retelei (cadrilajului )este subimpartita prin linii triple in 9 patrate mari ,are la randul lor ,acestea se impart prin linii duble la 16 patrate medii .La intretaierea liniilor duble se delimiteaza patrate mai mici .Camera Burker-Turck reuneste elementele camerei Thoma –Burker.Numaratoarea eritrocitelor se face in patratelele mici

Modul de lucru:-Curatati varful degetului cu o bucata de vata imbibata in alcool (degetul trebuie sters viguros ,pt ca astfel pe langa faptul ca se curata corespunzator tegumentul se va produce totodata si o hiperemie –cresterea fluxului sanguin local –-se lasa degetul sa se usuce-Cu un ac steril se face rapid o sg punctie la varful degetului curatat ,suficient de adanca pt ca sangele sa se scurga liber din locul de punctie .Se sterge prima picatura de sange cu un tifon uscat ,iar cand apare a doua picatura ,se aspira in pipeta .Nu se va aspira pana cand la varful degetului nu s-a acumulat suficient sange intrucat pipetele au un lumen foarte mic si sangele coaguleaza extrem de usor in ele .-degetul nu trebuie comprimat-se recolteaza pana la diviziunea 0.5 a pipetei Potain pt hematii si se aspira solutie Hayem pana la diviziunea 101.Aspirarea solutiei de dilutie trebuie facuta cat mai rapid pt a evita coagularea sangelui si pt a mari acuratetea metodei.-se prinde pipeta intre doua degete si se agita timp de 3 min pt a omogeniza continutul .-primele 2 picaturi se indeparteaza deoarece contin numai solutie Hayem .Urmatoarea picatura se aplica la marginea lamei cu care s-a acoperit camera de numarat.-se examineaza la microscopLa microscop ,in conditiile amintite ,se numara hematiile din interiorul a 80 patrate mici din reteaua Thoma.Nu se iau in calcul elementele situate pe doua linii de delimitare ale ariei de numarat ,ci numai cele de pe doua alaturate..

Calculul:Nr er numarate in 5 patrate intre liniile triple din mijlocul crucii x10000/mm3

Valori de referinta – valori diferite in functie de varsta si sex ; se exprima in numar de eritrocite x106/μL (mm3) Semnificatie clinicaNumarul de eritrocite ca singur parametru are valoare diagnostica mica; o evaluare corecta a masei de eritrocite a organismului poate fi obtinuta doar in corelatie cu hematocritul. Numarul de eritrocite este influentat de modificarile volumului plasmatic, ca de exemplu in sarcina sau in tulburari ale echilibrului hidrotelectrolitic.1. Scaderea numarului de eritrocite: determina anemie. Anemia este definita din punct de vedere functional printrto masa eritrocitara insuficienta pentru asigurarea unei cantitati adecvate de oxigen tesuturilor periferice. 2. Cresterea numarului de eritrocite (concentratiei de hemoglobina si/sau hematocritului) determina eritrocitoza. Eritrocitoza poate fi rezultatul cresterii masei eritrocitare totale (policitemie/eritrocitoza absoluta) ori poate fi consecinta reducerii volumului plasmatic (eritrocitoza relativa/falsa).Interferente 1. Recoltarea cu pacientul in pozitie culcata determina scaderea numarului de eritrocite (si hematocritului) cu 5 – 10% (prin redistribuirea lichidului din spatiul interstitial spre circulatie datorita modificarii presiunii hidrostatice la nivelul membrelor inferioare).2. Stresul poate determina cresterea numarului de eritrocite.3. Staza venoasa prelungita >2 minute in timpul venopunctiei determina cresterea numarului de eritrocite cu ~10% (si cresterea semnificativa a hematocritului). De asemenea, recoltarea dupa efort fizic intens determina cresterea numarului de eritrocite cu pana la 10% (ca si cresterea concentratiei de hemoglobina). Toate acestea se datoreaza hemoconcentratiei.4. Deshidratarea cu hemoconcentratie consecutiva (soc, arsuri severe, obstructie intestinala, varsaturi/diaree persistente, abuz de diuretice) poate masca prezenta anemiei. De asemenea, hiperhidratarea pacientului (administrarea masiva de lichide i.v.) poate determina niveluri fals scazute ale numarului de eritrocite.

5. Prezenta aglutininelor la rece in titru mare determina, daca sangele este pastrat la temperatura camerei, niveluri fals scazute ale numarului de eritrocite si un VEM fals crescut; in consecinta hematocritul este fals scazut, iar HEM si CHEM sunt crescute.6. Prezenta de crioglobuline in concentratie mare poate interfera cu determinarea numarului de eritrocite.7. Trombocitele mari/macrotrombocitele (ex.: din trombocitemia esentiala) pot fi numarate ca eritrocite.8. Numeroase medicamente pot determina cresterea sau scaderea numarului de eritrocite:pot scadea numarul de eritrocite aproape toate clasele de medicamente;pot determina cresteri ale numarului de eritrocite: corticotropina, glucocorticoizii, danazolul, eritropoietina, antitiroidienele, hidroclorotiazida, pilocarpina, mycophenolatul. HEMATOCRITUL (VOLUMUL PACHETULUI DE CELULE)

Hematocritul masoara raportul dintre volumul ocupat de eritrocite si volumul sanguin total.

Indicatii – detectarea si monitorizarea anemiei si policitemiei.Metoda de determinare – analizorul automat calculeaza hematocritul prin determinarea numarului de eritrocite/L de sange si masurarea amplitudinii impulsurilor in eritrocite prin metoda luminii dispersate.Metoda manuala:

Procedeul consta in recoltarea sangelui dintr-o vena, apoi sangele se combina cu o substanta antiocoagulanta si se repartizeaza intr-un tub de sticla foarte ingust, care se centrifugheaza puternic intr-o centrifuga. In urma acestei operatii se observa separarea sangelui in stratul superior ( plasma ) si stratul inferior ( format din globule rosii ) care constituie hematocritul.

Hematocritul se defineste ca fiind volumul stratului de globule rosii ( in procente ) fata de volumul total al sangelul din tubul de sticla.

Valori de referinta – diferite in functie de varsta si sex Hematocritul se exprima ca fractie decimala/ca procent.Semnificatie clinicaHematocritul depinde de masa eritrocitara, volumul eritrocitar mediu si volumul plasmatic.1.Scaderea hematocritului:

- anemie; la un Hct <30% (0.30) un pacient este moderat – sever anemic;- cresterea volumului plasmatic (sarcina).2. Cresterea hematocritului:eritrocitoza/policitemie;hemoconcentratie (ex.: soc; aport insuficient de lichide: copii mici, varstnici; poliurie etc.).Valori critice – un Hct <20% poate determina insuficienta cardiaca si deces;- Hct >60% se asociaza cu coagularea spontana a sangelui.Interferente 1. Excesul de anticoagulant (cantitate insuficienta de sange) determina scaderea volumului eritrocitar si in consecinta scaderea Hct determinat manual (efect mai pronuntat pentru K3tEDTA decat pentru K2tEDTA).2. In sangele arterial Hct este cu ~2% mai mare decat in sangele venos.3. In reticulocitoza, leucocitoza marcata, prezenta de crioglobuline sau macrotrombocite analizorul automat poate determina valori fals crescute ale Hct (volumele mai mari ale reticulocitelor si leucocitelor intra in calculul Hct).4. Valori fals scazute ale Hct pot aparea in cazuri de hemoliza in vitro, autoaglutinare, microcitoza. HEMOGLOBINA

Hemoglobina reprezinta componentul principal al eritrocitelor (95% din proteinele citoplasmatice eritrocitare) si serveste ca vehicul pentru transportul O2 si CO2. Hemoglobina este o proteina conjugata constand dintrtun tetramer format din 2 perechi de lanturi polipeptidice (globine), fiecare dintre acestea fiind conjugat cu un grup hem, un complex al unui ion de fier cu pigmentul rosu, porfirina, care confera sangelui culoarea rosie. Formele de hemoglobina prezente in mod normal in circulatie includ: deoxihemoglobina (HHb), oxihemoglobina (O2Hb), carboxihemoglobina (COHb) si methemoglobina (MetHb), toate acestea fiind determinate impreuna in sangele total. In anumite situatii clinice diferitele forme de Hb pot fi determinate individual.Exista 3 tipuri de Hb: Hb embrionara, Hb fetala, Hb de tip adult .

Indicatii -impreuna cu Hct si numarul de eritrocite, este utila pentru detectarea si monitorizarea anemiei si policitemiei.Metoda de determinare – Hb este determinata automat prin metoda fotometrica in urma conversiei in SLS-Hb cu ajutorul unui surfactant Sodium Lauryl Sulfate.

DOZAREA HEMOGLOBINEI SANGUINE. METODA DRABKINPrincipiu. Hb în prezenta unei solutii de cianura de potasiu si fericianura de potasiu setransforma în cianmethemoglobina de culoare galben-roscata. Intensitatea culorii esteproportionala cu concentratia de Hb si se determina spectrofotometric.Materiale necesare• reactiv Drabkin (contine cianura si fericianura de potasiu);• sânge proaspat sau recoltat pe anticoagulant (EDTA-Na2);• spectrofotometru.Tehnica

• în doua eprubete se introduc:Reactiv Drabkin (ml) 5 5Sânge (µl) 20 –si o epubeta numai reactive Drabkin (eprubeta martor)• se omogenizeaza continutul eprubetei proba• se lasa în repaus la temperatura camerei 20 minute• se citeste extinctia probei fata de martor la 540 nm• concentratia de Hb, corespunzatoare extinctiei, se determina din tabeleValori normale• valoare medie: 13-17 g/dl• barbati: 15 ± 2 g/dl• femei: 14 ± 2 g/dlVARIATII PATOLOGICE• poliglobulia defineste valorile crescute ale Hb.• anemie defineste valorile scazute ale Hb.Numarul de eritrocite, Hb si Hct pot fi analizate aplicand “regula lui trei”: daca eritrocitele sunt normocitare/normocrome: nr. Er x3 ~ valoarea Hb.Hematocritul poate fi estimat din hemoglobina utilizand urmatoarea formula:Hct = Hb (g/dL) x 2.8 + 0.8 sau Hct = Hb x 3Daca exista o deviere semnificativa de la aceasta regula trebuie verificata existenta de anomalii ale indicilor eritrocitari si aspectul frotiului de sange.Valori critice – la Hb <5g/dL apare insuficienta cardiaca si poate surveni decesul;- o concentratie de Hb >20 g/dL poate duce la blocarea capilarelor ca urmare a hemoconcentratiei.Interferente1. Turbiditatea serului datorata hiperlipemiei (hipertrigliceridemiei), leucocitozei >50000/μL, trombocitozei >700000/μL sau hiperproteinemiei determina valori fals crescute ale hemoglobinei.2. Prezenta de crioglobuline in concentratie mare poate afecta determinarea Hb (prin fenomenul de floculare).3. Efortul fizic intens poate determina cresterea Hb.4. Interferente medicamentoase

INDICII ERITROCITARI Evaluarea eritrocitelor din punct de vedere al volumului si continutului in hemoglobina se realizeaza prin masurarea sau calcularea urmatorilor parametri:

Volumul eritrocitar mediu (VEM) – reprezinta volumul ocupat de un singur eritrocit.Metoda de determinare – VEM este calculat dupa urmatoarea formula:                 Hct (%) x 10VEM =    ——————–                Nr.Er.(x106/μL)Prin metoda automata VEM este determinat prin impartirea sumei volumelor eritrocitare la numarul de eritrocite.

Valori de referinta VEM se exprima in micrometri cubi sau femtolitri (fL). La adult este cuprins intre 80 – 100 fL (valori mai mari la noutnascuti, precum si la varstnici; valori mai mici la copii pana la 18 ani – Semnificatie clinicaVEM este un indice util pentru clasificarea anemiilor si poate sugera mecanismul fiziopatologic al afectarii eritrocitare. Impreuna cu ceilalti indici eritrocitari, poate permite detectarea precoce a unor procese care vor cauza anemie. VEM depinde de osmolaritatea plasmatica si numarul diviziunilor eritrocitare.1. VEM normal: anemie normocitara (daca se asociaza cu RDW <15).2. VEM scazut (<80 fL): anemie microcitara. Majoritatea anemiilor microcitare se datoreaza sintezei deficitare de hemoglobina, adesea asociata cu deficitul de fier sau cu alterarea utilizarii fierului, precum si cu unele conditii ereditare. 3. VEM crescut (>100 fL): anemia macrocitara. Pe baza criteriilor biochimice si morfologice anemiile macrocitare se pot imparti in doua grupuri: anemii megaloblastice si nontmegaloblastice.Interferente1. Prezenta de dubla populatie eritrocitara (microt si macrocitara, cand se asociaza anemia feripriva cu anemia megaloblastica) poate determina un VEM normal. In aceasta situatie RDW este >15, pe histograma efectuata de analizorul automat se observa aspectul caracteristic de “curba cu doua cocoase”, iar confirmarea prezentei dublei populatii eritrocitare se face prin examinarea frotiului de sange. Dubla populatie este caracteristica pentru anemiile sideroblastice (o populatie microcitara hipocroma si una relativ normocitara) si anemiei feriprive dupa inceperea terapiei de substitutie cu fier.2. VEM fals crescut: reticulocitoza marcata (>50%), leucocitoza marcata (>50000/µL) hiperglicemie marcata (>600 mg/dl), prezenta de aglutinine la rece, intoxicatia cu metanol (si, in consecinta creste Hct, iar CHEM scade).3. VEM fals scazut: hemoliza in vitro, prezenta de eritrocite fragmentate, excesul de EDTA.4. Daca pragul inferior al analizorului este fixat prea sus, este calculat un VEM mai mare deoarece eritrocitele mai mici nu sunt masurate, iar daca pragul superior este prea mare sunt masurate si leucocitele, iar VEM este crescut.

Hemoglobina eritrocitara medie (HEM) – este o masura a continutului mediu de hemoglobina pe eritrocit.Metoda de determinare – HEM este calculat de analizorul automat conform formulei:                   Hb(g/dL) x 10HEM =    ——————–                 Nr.Er.(x106/μL)Valori de referinta – HEM se exprima in picograme (pg/10t12g). Valorile normale la adult sunt 26–34 pg sau 0.4t0.53 fmol (valori mai mari la noutnascut; Semnificatie clinica – in majoritatea anemiilor HEM se coreleaza cu VEM, astfel anemiile microcitare sunt de obicei hipocrome (uneori hipocromia poate preceda microcitoza), cele normocitare sunt de obicei normocrome, iar conditiile care cresc HEM determina in general, daca nu intotdeauna, VEM crescut, deoarece continutul eritrocitar normal de Hb este ~95% din concentratia de Hb maxim posibila (anemiile macrocitare, anemia regenerativa observata de exemplu in timpul substitutiei cu fier a anemiei feriprive, la noutnascut).Interferente

1. Hiperlipidemia, leucocitoza >50000/μL determina HEM fals crescut (Hb fals crescuta).2. Concentratie crescuta de heparina determina HEM fals crescut.3. Prezenta aglutininelor la rece determina HEM fals crescut.

Concentratia eritrocitara medie de hemoglobina (CHEM) – masoara concentratia medie de Hb dintrtun volum dat de eritrocite (sau raportul dintre masa de Hb si volumul de eritrocite).Metoda de determinare – CHEM este calculat de analizorul automat conform formulei:                  Hb (g/dL) x 100CHEM =    ——————–                        Hct (%)Valori de referinta – CHEM se exprima in g/dL. Valorile normale la adult sunt 32-36 g/dL (320-360 g/L) .Semnificatie clinica – VEM este un indice extrem de valoros in clasificarea anemiilor, dar HEM si CHEM, de obicei, nu aduc in plus informatii relevante clinic. Totusi, au un rol important in controlul de calitate al laboratorului, deoarece acesti indici variaza foarte putin de la o zi la alta pentru un specimen dat, daca pacientul nu este transfuzat.Datorita comportamentului similar al volumului eritrocitar si continutului in Hb al fiecarui eritrocit in parte, CHEM ramane constant in multe afectiuni hematopoietice1. CHEM scazut (<30g/dL): apare in anemiile hipocrome (anemia feripriva, unele talasemii).2. CHEM crescut: cu exceptia sferocitozei ereditare si a unor cazuri homozigote de siclemie si hemoglobina C, CHEM nu depaseste valoarea de 37 g/dL; aceasta valoare este aproape de nivelul de solubilitate a Hb si cresterea in continuare a concentratiei de Hb poate duce la cristalizarea ei. Acuratetea determinarii CHEM depinde de factorii care afecteaza masurarea fie a Hct, fie a Hb.Interferente1. CHEM poate fi fals crescut in hiperlipemie, prezenta de aglutinine la rece in titru mare, prezenta de rulouri.2. In hiperglicemia marcata (>600 mg/dL) CHEM poate fi fals scazut (VEM si Hct fals crescute)

Largimea distributiei eritrocitare (RDW) – este un indice eritrocitar care cuantifica heterogenitatea volumului celular (gradului de anizocitoza).Metoda de determinare – RDW este calculat de analizorul automat in functie de prezenta de anomalii ale frecventei relative la anumite niveluri de discriminare, existenta a doua sau a mai multor “peak”turi si largime de distributie anormala. Distributia VEM intrto proba este prezentata sub forma unui grafic in care pe abscisa se proiecteaza volumul eritrocitar, iar pe ordonata frecventa relativa.                               Deviatia standard a marimii eritrocitelor x 100RDW (CV%) =   ————————————————————t                                                                  VEMValori de referinta – 11.6-14.8 coeficient de variatie (CV) a volumului eritrocitar.Semnificatie clinicaRDW este util in caracterizarea initiala a anemiilor, in particular a anemiei microcitare, desi alte teste sunt de obicei necesare pentru confirmarea diagnosticului. Astfel RDW este util in diferentierea betattalasemiei minore necomplicate, in care VEM este scazut, iar RDW normal de anemia feripriva, in care VEM este scazut, iar RDW crescut (cresterea RDW este un semn precoce in deficitul de fier). RDW este usor crescut in betattalasemia minora cu anemie usoara .

RDW crescut: anemia feripriva, anemia megaloblastica, diferite hemoglobinopatii (S, StC, Stβttalasemia), anemia hemolitica imuna, reticulocitoza marcata, prezenta de fragmente eritrocitare, aglutinare, dimorfism eritrocitar (inclusiv pacientii transfuzati sau cei tratati recent pentru deficiente nutritionale).RDW normal: anemia din bolile cronice, betattalasemia heterozigota, anemia hemoragica acuta, anemia aplastica, sferocitoza ereditara, boala cu Hb E, siclemia.Nu exista o cauza cunoscuta pentru RDW scazut.Interferente:1. Alcoolismul creste RDW.2. Prezenta aglutininelor la rece RETICULOCITELE

Reticulocitele sunt eritrocite anucleate tinere, imature, care contin acizi nucleici reziduali (ARN). Dupa expulzarea nucleului eritrocitele raman in maduva pana la 4 zile, timp in care are loc o scadere continua a numarului de poliribozomi (care contin ARN) si a sintezei de hemoglobina. Aceste eritrocite tinere se maturizeaza complet in circulatia periferica in cca. 1-2 zile dupa ce parasesc maduva osoasa, timp in care pierd complet capacitatea de sinteza proteica (respectiv poliribozomii care contin ARN), iar sinteza de Hb inceteaza. Materialul reticular se coloreaza cu coloranti supravitali ca albastru cresil briliant/albastru de metilen. In mod normal, in absenta anemiei, un numar mic de reticulocite este prezent in circulatie (in fiecare zi ~1% din eritrocite sunt inlocuite cu eritrocite tinere eliberate din maduva). Determinarea numarului de reticulocite ofera informatii despre capacitatea medulara de a sintetiza celule rosii ca raspuns la o suprasolicitare fiziologica, cum este anemia. Indicatii:1. Diferentierea tipurilor de anemii in: neregenerative si regenerative/hipertregenerative.2. Monitorizarea raspunsului la tratamentul de sustitutie cu fier, acid folic / vitamina B12.3. Evaluarea eritropoiezei dupa transplant medular, in anemia aplastica indusa de medicamente citotoxice/sau in tratamentul cu eritropoietina.Metoda de determinare1. Metoda manuala – numarare microscopica. executarea pe lama a unui frotiu colorarea acestuia cu brillant cresyl-blau-coloratie supravitala .examenul la microscopul optic al aspectului morfologic al reticulocitului :aspectul de eritroblast( element din linia eritropoetica ) oxifil care pastreaza dupa ce trece in circulatie (este produs de catre maduva rosie osoasa), circa 1-2 zile , parti de complexe ribonucleoproteice. El are o nuanta albastruie numaratoarea reticulocitelor de pe mai multe campuri microscopice, ca si a numarului de eritrocite dupa aceste campuri. .calculul proportiei numarului de reticulocite la 100 sau la 1000 de eritrocite.2. Numararea automata – analizor automat pe principiul citometriei in flux cu fluorescenta si LASER semiconductor.Valori de referintaAdult: 0.5-2% din nr. total de Er.Nou-nascut: 2.5-6.5% din nr. total de Er (scade la nivelul de la adult din a doua saptamana de viata).

Nr. absolut = 30-120 x 103/μL sau x 109/L.Semnificatie clinica -determinarea nr. relativ sau absolut de Rt reprezinta un indicator important al activitatii eritropoietice medulare, furnizand o apreciere initiala daca anemia se datoreaza alterarii productiei eritrocitare sau pierderii de eritrocite in circulatie (prin sangerare sau hemoliza) 1. Numar crescut de reticulocite (reticulocitoza): este indicator de eritropoieza regenerativa (cresterea productiei eritrocitare medulare sub actiunea eritropoietinei; 2. Numar scazut de reticulocite (reticulocitopenia): apare in anemii nontregenerative, cum ar fi deficitul de fier/folat/vitamina B12, aplazia medulara (deficitul persistent de Rt sugereaza un prognostic prost), anemia din bolile cronice, insuficienta medulara (anemia mieloftizica).Referitor la clasificarea anemiilor, in tabelul de mai jos sunt prezentate modificarile numarului absolut de reticulocite si al FRI in diverse tipuri de anemie:

Conditii clinice Numar reticulocite Fractia reticulocitelor imature

Aplazie medulara, criza aplastica in anemii hemolitice

↓ ↓

Anemii hipoplazice ↓ ↓

Regenerare medulara ↓ ↑ sau N

Boli cronice ↓ sau N ↓

Deficit de fier ↓ sau N ↑

Deficit de folat sau vit. B12 ↓ sau N ↑

Talasemii N sau ↑ N sau ↑

Mielodisplazii Variabil N sau ↑

Anemii hemolitice ↑ ↑

Hemoragie sau anoxie N sau ↑ ↑

 NUMARUL DE TROMBOCITE (NUMARUL DE PLACHETE)  

Trombocitele sunt fragmente citoplasmatice anucleate bogate in granule, rotund-ovalare, plate, in forma de disc, cu diametrul de 2-4μ. Trombopoieza are loc in maduva osoasa incepand cu celula progenitoare multipotenta, continua cu megakariocitopoieza care include proliferarea megakariocitara si maturarea megakariocitelor cu formarea de trombocite. In mod normal, doua treimi din trombocite se gasesc in circulatie, iar o treime sunt stocate in splina. Trombocitele sunt implicate in hemostaza si in initierea proceselor de reparare tisulara si vasoconstrictie dupa injuria vasculara si in timpul proceselor inflamatorii, aderarea si agregarea plachetara avand ca rezultat formarea trombusului plachetar care astupa rupturile din peretii vaselor mici.Indicatii

investigarea unei sangerari neexplicate, unei boli hemoragice sau a unei boli trombotice; in cadrul unui profil de coagulare; monitorizarea bolilor asociate cu insuficienta medulara; monitorizarea in timpul tratamentelor care pot induce supresie medulara (iradiere,

chimioterapie etc.)

Metoda de determinare – trombocitele sunt numarate de analizorul automat prin aceeasi metoda ca eritrocitele, in timpul directionarii lor intrtun singur rand printrtun orificiu, prin metoda de focusare hidrodinamica.Metoda manuala se face ca si la hematii in camera de numarat folosind pipeta potain cu bila alba.O estimare a numarului de trombocite pe un frotiu de sange bine efectuat constituie un control valoros al numarului de trombocite determinat prin metoda automata. In general, cand frotiul este examinat cu obiectivul de 100x fiecare trombocit observat/camp reprezinta ~10000 Tr x106/L. In consecinta, un frotiu normal trebuie sa prezinte in medie cel putin 14 Tr/camp.Valori de referinta-150-450 x 103/μL.Semnificatie clinica1. Cresterea numarului de trombocite (trombocitoza/trombocitemie)2. Scaderea numarului de trombocite (trombocitopenia): este cea mai frecventa cauza de sangerare. Valori critice1. Trombocitoza >1.5×109/μL, precum si trombocitoza la pacienti varstnici si/sau cu boli cardiovasculare prezinta risc de tromboza, mai rar de hemoragie.2.  Trombocitopenia <20×103/μL se asociaza cu risc de sangerari spontane interne/externe (risc 1% de hemoragii intracraniene).Interferente 1. Trombocitele cresc la altitudine, in timpul iernii, dupa efort fizic intens, traume.2. Trombocitele scad inaintea menstruatiei si in sarcina.3. O falsa trombocitopenie poate fi indicata de analizorul automat si se datoreaza unei erori de numarare:Frotiul de sange periferic evidentiaza agregatele trombocitare; pentru o numaratoare exacta a trombocitelor se recomanda recoltarea unei picaturi de sange din pulpa degetului si folosirea modulului capilar al analizorului.4. Prezenta de fragmente eritrocitare, microsferocite, fragmente leucocitare (fragmente nucleare si citoplasmatice limfocitare in leucemia limfoida cronica) poate determina niveluri fals crescute ale trombocitelor5. Interferente medicamentoase:

VOLUMUL TROMBOCITAR MEDIU (VTM)– indica uniformitatea de marime a populatiei trombocitare. Este util in diagnosticul diferential al trombocitopeniei.Metoda de determinare: este calculat de analizorul automat dupa urmatoarea formula:                            PCT (Plachetocrit) (%)VTM (fL) = ————————————t x1000                              Nr. trombocite (x103/μL)De asemenea, analizorul automat calculeaza largimea distributiei trombocitare (PDW) asemanator cu calcularea largimii distributiei eritrocitare.Valori de referinta -VTM = 7.4-13 fL sau μm3.PDW = 8-16.5 coeficient de variatie (CV) a volumului trombocitar.Semnificatie clinica – VTM poate fi utilizat impreuna cu PDW pentru distingerea conditiilor asociate cu productie scazuta de trombocite de cele asociate cu distructie plachetara crescuta.

 NUMARUL DE LEUCOCITE (NUMARUL DE CELULE ALBE) SI FORMULA LEUCOCITARA

Leucocitele se impart in doua grupe principale: granulocite si at/nontgranulocite. Granulocitele sunt denumite astfel datorita prezentei in citoplasma de granulatii distincte si se identifica trei tipuri de granulocite in functie de afinitatile de colorare pe frotiul de sange colorat Wright: neutrofile, eozinofile si bazofile. De asemenea, aceste celule sunt denumite si leucocite polimorfonucleare datorita nucleului multilobulat. Nongranulocitele care constau din limfocite si monocite nu contin in general granulatii citoplasmatice distincte si au nucleul nonlobulat, fiind denumite si leucocite mononucleare.Indicatii

– evaluarea infectiilor, inflamatiilor, necrozelor tisulare, intoxicatiilor, alergiilor, bolilor mieloproliferative si limfoproliferative acute si cronice, tumorilor maligne, depresiei medulare (iradiere, medicamente citotoxice, imunosupresoare, antitiroidiene etc.)

Metoda de determinare– leucocitele sunt determinate de analizorul automat (dupa ce hematiile sunt lizate, iar leucocitele sunt colorate cu o substanta fluorescenta cu afinitate pentru acizii nucleici) prin metoda de citometrie in flux cu fluorescenta utilizand LASER semiconductor. Metoda automata (metoda de impedanta electrica): o suspensie de leucocite dintrtunvolum cunoscut de sânge, trec printrtun orificiu. Un curent electric constant este aplicatîntre electrozii de platina aflati deto parte si de alta a orificiului. Deoarece fiecare celulaeste nonconductoare, ea va produce, la trecerea prin orificiu, o modificare brusca detensiune, denumita puls. Aceste pulsuri vor fi numarate electronic.Metoda manualaMateriale necesare:microscop optic ,pipeta Potain pt leucocite(cu bila alba) ,solutie Turk ,ace sterile,vata alcool hemocitometru ,lamela de sticlaExaminarea lor se face cu obiectivul uscat mare (60) si ocularul 10 ,cu condensorul coborat ,(lumina slaba).Pipeta Potain pt leucocite serveste la diluarea sangelui in vederea numararii leucocitelor.Este formata dintr-un tub capilar ,care in portiunea superioara este dilatat ,formand o ampula .Extremitatea lunga a pipetei serveste la aspirarea sangelui si a solutiei Turk.Pe aceasta portiune se afla gradate cifrele 0.5 si 1.Superior ampulei se gaseste cifra 11 mm3.In ampula se afla o perla de sticla de culoare alba care serveste la amestecarea si omogenizarea sangelui cu solutia Turk .La extremitatea scurta a pipetei se afla un tub de cauciuc prevazut cu o piesa bucala .Pt efectuarea dilutiei de 1:200 se aspira sange pana la diviziunea 0.5 si se completeaza cu solutie Turk pana la diviziunea 101.Dilutia de 1:100 se obtine aspirand sange pana la diviziunea 1.Dupa intrebuintare pipeta Potain se spala cu apa distilata ,se clateste cu alcool 96grade ,cu eter,si se usuca la pompa de vid .In caz de infundare a capilarului se actioneaza cu un mandren sau cu un fir de par de cal ,dupa care se pune in HCL 15%.Modul de lucru:-Curatati varful degetului cu o bucata de vata imbibata in alcool (degetul trebuie sters viguros ,pt ca astfel pe langa faptul ca se curata corespunzator tegumentul se va produce totodata si o hiperemie –cresterea fluxului sanguin local –-se lasa degetul sa se usuce

-Cu un ac steril se face rapid o sg punctie la varful degetului curatat ,suficient de adanca pt ca sangele sa se scurga liber din locul de punctie .Se sterge prima picatura de sange cu un tifon uscat ,iar cand apare a doua picatura ,se aspira in pipeta .Nu se va aspira pana cand la varful degetului nu s-a acumulat suficient sange intrucat pipetele au un lumen foarte mic si sangele coaguleaza extrem de usor in ele .-degetul nu trebuie comprimat-se recolteaza pana la diviziunea 0.5 a pipetei Potain pt leucocite si se aspira solutie Turk pana la diviziunea 11.Aspirarea solutiei de dilutie trebuie facuta cat mai rapid pt a evita coagularea sangelui si pt a mari acuratetea metodei.-se prinde pipeta intre doua degete si se agita timp de 3 min pt a omogeniza continutul .-primele 2 picaturi se indeparteaza deoarece contin numai solutie Turk .Urmatoarea picatura se aplica la marginea lamei cu care s-a acoperit camera de numarat.-se examineaza la microscopSolutia Turk contine :-Apa distilata =100 ml-Acid acetic glacial =1 ml-Albastru de metilen sol 1% =1-2 pic Valori de referinta – la adult = 4000-10000/µL sau 4-10×109/L;- la copii valori mai mari, diferite in functie de varsta Semnificatie clinica1.Variatii fiziologice ale leucocitelor

– cresterea si dezvoltarea: la noutnascuti si copii numarul de leucocite este crescut, cu scaderea treptata a valorilor, cu atingerea valorilor de la adult intre 18-21 ani;

– variatii rasiale: la negrii din Africa numarul de neutrofile si monocite este mai mic, iar numarul de eozinofile mai mare;

– fluctuatii diurne si de la o zi la alta: influentate de lumina; de asemenea activitatea obisnuita determina valori mai mari ale leucocitelor dupatamiaza, dar care tind sa ramana in limite normale;

– variatii climatice si sezoniere: caldura si radiatiile solare intense ar determina leucocitoza, iar rezidenta prelungita in Antarctica determina leucopenie; lumina artificiala si ultravioleta determina limfocitoza;

– anoxia acuta determina neutrofilie;– in primele zile de rezidenta la altitudine crescuta apare leucocitoza asociata cu limfopenie

si eozinopenie, urmate de limfocitoza si eozinofilie usoare;– exercitiile fizice intense determina leucocitoza marcata, de obicei pe seama neutrofilelor

segmentate (se datoreaza trecerii neutrofilelor marginate in circulatie), dar poate fi prezenta si limfocitoza; normalizarea survine in mai putin de o ora; gradul leucocitozei se coreleaza cu intensitatea efortului fizic si nu cu durata sa;

– crizele convulsive determina cresterea numarului de leucocite;– injectiile cu epinefrina determina leucocitoza, in special neutrofilie;– atacurile de tahicardie paroxistica pot determina leucocitoza;

durerea, greata, varsaturile, anxietatea pot determina leucocitoza in absenta infectiei, prin redistribuirea celulelor marginate spre circulatie;

– anestezia cu eter determina leucocitoza, iar narcoza cu compusi barbiturici de obicei scade numarul de leucocite;

– in  perioada ovulatorie poate aparea leucocitoza usoara si eozinopenie;

– in sarcina apare leucocitoza usoara, iar neutrofilia se accentueaza odata cu apropierea termenului; de asemenea, in timpul travaliului apare neutrofilie uneori pronuntata, cu normalizarea valorilor dupa 4t5 zile si asociata cu eozinopenie.

2. Leucocitoza: L >10000/µL sau >10×109/L - se datoreaza de obicei unei cresteri a numarului de neutrofile sau limfocite; mai rar celelalte clase de leucocite determina cresterea numarului absolut de leucocite. O crestere proportionala a tuturor tipurilor de leucocite se datoreaza hemoconcentratiei.a. Infectiile reprezinta cauza majora de leucocitoza. b. Alte cauze de leucocitoza: hemopatii maligne;traumatisme/injurii tisulare, de exemplu interventii chirurgicale, necroze tisulare;tumori maligne (in special carcinomul bronsic);toxine, uremie, eclampsie, coma, tireotoxicoza;medicamente: cloroform, chinina, factori de crestere etc.;hemoliza acuta;hemoragie acuta;postsplenectomie.3. Leucopenie: <4000/µL sau <4×109/L (valorile cuprinse intre 2500t4000/µL sunt considerate borderline, in timp ce valorile <2500/µL sunt cert anormale)  se poate datora urmatoarelor cauze:

– infectii virale, unele infectii bacteriene, infectii bacteriene severe;hipersplenism;

– depresie medulara produsa de intoxicatie cu metale grele, benzen, radiatii ionizante, medicamente: chimioterapice, barbiturice, antibiotice, antihistaminice, anticonvulsivante, antitiroidiene, arsenic, diuretice, analgezice si antiinflamatorii;

– boli medulare primitive: leucemie (aleucemica), anemie megaloblastica, sindroame mielodisplazice, anemie aplastica, boli congenitale (anemia Fanconi, discheratoza congenitala);

– boli medulare secundare: granuloame, metastaze.Interferente1. Numar fals crescut de leucocite: prezenta de eritrocite rezistente la liza (la noutnascuti, reticulocitoza), prezenta de eritroblasti circulanti in numar mare, trombocitele gigante (pot fi numarate ca leucocite), prezenta de crioglobuline (la temperatura camerei se formeaza cristale proteice care sunt numarate ca leucocite; dispar dupa incalzirea probei la 37°C), paraproteinemia, prezenta de aglutinine la rece.2. Numar fals scazut de leucocite: prezenta de leucocite alterate (chimioterapie, sepsis) – nu sunt incluse in numaratoareValori critice – numar de leucocite <500/µL, respectiv >30000/µL6.

Formula leucocitara consta in diferentierea numarului total de leucocite circulante in cele cinci tipuri de leucocite, exprimate procentual si respectiv in numar absolut, fiecare dintre acestea indeplinind o functie specifica. Actualmente este de preferat raportarea fiecarui tip de leucocite in valori absolute. Formula leucocitara este efectuata automat de catre analizor. Exista anumite situatii insa in care este necesara efectuarea manuala a formulei leucocitare: numar de leucocite prea mic/prea mare, prezenta de celule anormale semnalizata de analizor prin anumite mesaje de avertizare/chiar esecul analizorului de a indica formula leucocitara. In aceste cazuri se efectueaza numaratoarea microscopica: frotiu de sange venos (recoltat pe EDTA; heparina poate produce deformari ale leucocitelor) sau frotiu de sange capilar. Neutrofilele (granulocitele polimorfonucleare neutrofile) – cel mai numeros tip de leucocite, joaca un rol major in apararea antiinfectioasa primara a organismului prin fagocitarea si digestia microorganismelor, iar activarea lor necorespunzatoare poate duce la lezarea tesuturilor normale

ale organismului prin eliberarea de enzime si agenti piogeni. In momentul aparitiei infectiei sunt produsi agenti chemotactici care determina migrarea neutrofilelor la locul infectiei si activarea functiilor defensive ale acestora, cu fagocitarea agentului respectiv, urmata de eliberarea granulelor in vezicula de fagocitoza si distrugerea agentului infectios. Acest efect este adesea asociat cu cresterea productiei si eliberarii neutrofilelor din maduva osoasa.Valori de referinta: -  la adult = 2000-8000/µL sau 2-8×109/L; 45-80% din leucocite;-  la copii valori mai mici in functie de varsta.Semnificatie clinica 1. Neutrofilia: >8000/µL sau 8×109/L:Pseudoneutrofilia (cresterea numarului de neutrofile circulante pe seama neutrofilelor marginate): efort fizic intens, stres (plansul la copii), travaliu, menstruatie.-Infectii bacteriene acute localizate si generalizate: -Infectii virale, fungice si parazitare: de obicei, neutrofilia este usoara si este prezenta doar in faza initiala.-Sepsis neonatal.-Boli inflamatorii cronice: vasculite, artrita reumatoida, bronsita, colita, dermatita, pielonefrita, pancreatita.-Boli metabolice: coma diabetica, coma uremica, coma hepatica, atacul acut de guta, eclampsia, tireotoxicoza.-Necroza tisulara: arsuri, infarct miocardic.-Toxice si medicamente: corticosteroizi, plumb, mercur, monoxid de carbon, digitala, veninuri.-Hemoragia acuta (neutrofilie pana la 25000/µL in a 3ata 5a zi), proceduri chirurgicale majore, anemia hemolitica, postsplenectomie.-Tumori maligne, in special carcinoame (gastrointestinal, pulmonar): neutrofilia apare ca urmare a reactiei inflamatorii, necrozei tumorale, producerii de factori de crestere granulopoietici de catre tumora.-Boli mieloproliferative cronice (leucemia mieloida cronica, policitemia vera, trombocitemia esentiala, metaplazia mieloida cu mielofibroza)4,6;8;18;19.2. Neutropenia: se clasifica in usoara (1000-1500/µL), moderata (500-1000/µL) si severa (<500/µL); agranulocitoza reprezinta o forma severa de neutropenie cu absenta totala a neutrofilelor circulante. Neutropenia severa se asociaza cu risc crescut de infectii cu localizare orala (ulcere, periodontita), cutaneotmucoasa (piele, perirectal, genital), iar in neutropenia prelungita infectii sistemice (pulmonare, gastrointestinale, hematogene). Cauze de neutropenie: A. Pseudoneutropenia: efectuarea hemogramei dupa un timp indelungat de la recoltare, prezenta paraproteinemiei care produce aglutinarea neutrofilelor, marginarea neutrofilelor. B. Neutropenia dobandita:Infectii bacteriene severe, septicemie in special cu bacterii Gram negative; infectii virale: neutropenia survine in primele 1t2 zile si persista 3t7 zile, de obicei fara semnificatie clinica; neutropenie prelungita poate aparea in infectii cu virusul hepatitic B, virusul EpsteintBarr, HIV; infectii cu protozoare (malarie), fungi, rickettsii.Substante chimice, toxice si medicamente: Neutropenie indusa imun: aminopirina, penicilina, antitiroidiene, aur, quinidina.Inhibitia granulopoiezei dependenta de doza: antibiotice βtlactamice, carbamazepina, acid valproic.

Lezarea directa a micromediului medular sau a precursorilor mieloizi de catre medicament sau metabolitii acestuia.C. Neutropenia congenitala si cronica:Valori critice – numar de neutrofile <200/µL sau agranulocitoza – risc de infectii sistemice fatale. Limfocitele – reprezinta o populatie celulara heterogena care difera in functie de origine, durata de viata, localizare la nivelul organelor limfoide si functie. Desi unele caracteristici morfologice ca: marimea, granularitatea, raportul nucleo-citoplasmatic diferentiaza populatiile limfocitare una de cealalta, ele nu ofera indicii privind tipul si functia lor. Majoritatea limfocitelor din sange sunt mici, desi sunt comune si forme mai mari, cum ar fi limfocitele mari granulare care contin granulatii azurofile in citoplasma.65-80% din limfocite sunt celule T, 8-15% sunt celule B, iar ~10% sunt celule natural killer (NK) (celulele NK sunt morfologic distincte, unele dintre acestea fiind identice cu limfocitele mari granulare). Numai 2% din limfocite sunt prezente in sange. Valori de referinta – adult: 1000=4000/µL sau 1-4×109/L; 20-55% din leucocite;- la copii valori mai mari in functie de varstaSemnificatie clinica1. Limfocitoza: >4000/µL: A. Cauze benigne:Infectii virale:Limfocitoza infectioasa (apare in special la copii).Mononucleoza infectioasa: produsa de virusul EpsteintBarr, afecteaza in special adolescentii si adultii tineri, produce un tablou hematologic caracteristic cu limfotmonocitoza si prezenta pe frotiul de sange de limfocite atipice, activate (celulele Downey).Alte infecti virale: infectii virale ale tractului respirator superior, infectii cu citomegalovirus, rujeola, oreion, varicela, hepatita acuta virala, infectie acuta cu HIV.Alte infectii: infectii cronice (tuberculoza, sifilis), tuse convulsiva, toxoplasmoza, febra tifoida, bruceloza.Numarul de limfocite poate depasi 15000/µL in limfocitoza infectioasa, mononucleoza infectioasa, tusea convulsiva.Sindromul de splenomegalie hiperreactiva din malarie.B. Cauze maligne:Cu celula B: leucemia limfocitara cronica, leucemia prolimfocitara cu celula B, leucemia cu celule paroase, faza leucemica din limfoamele nonhodgkin, macroglobulinemia Waldenström.Cu celula T: leucemia prolimfocitara cu celula T, leucemia/limfomul cu celula T al adultului, sindromul Sézary, leucemia cu limfocite mari granulare.2. Limfopenie: <1000/µL:Imunodeficiente congenitale: sindroame de imunodeficienta combinata. Infectia HIV (scaderea selectiva a celulelor CD4+). Chimioterapia (in special analogii nucleozidici: fludarabina, cladribina – produc scaderea marcata a celulelor CD4+, care poate persista ani de zile), radioterapia, medicatia imunosupresoare. Lupus eritematos sistemic (sunt prezenti anticorpi antitlimfocitari care produc liza complement mediata a limfocitelor); boala mixta de tesut conjuctiv; dermatomiozita.

Tuberculoza avansata (miliara): scaderea marcata a celulelor CD4+. Virusul gripal (limfopenia apare tipic dupa rezolvarea infectiei). Boala Hodgkin si alte malignitati. Anemia aplastica. Administrarea de ACTH/corticosteroizi; tumori hipofizare secretoare de ACTH; boala Cushing. Pierderi crescute la nivelul tractului intestinal prin obstructia drenajului limfatic: tumori, boala Whipple, limfangiectazie intestinala; boli inflamatorii intestinale. Uremia. . Valori critice – numar de limfocite <500/µL creste riscul de infectii, in special virale.

Monocitele – sunt cele mai mari celule din sange; fac parte din sistemul fagocitic mononuclear/reticuloendotelial compus din monocite, macrofage si precursorii lor medulari. Monocitele sunt eliberate in sange si, dupa un scurt timp in circulatie, migreaza in diferite tesuturi, intamplator sau specific, ca raspuns la diferiti factori chemotactici. In tesuturi, ca raspuns la diferiti stimuli solubili, ele se diferentiaza in macrofage tisulare, cu calitati morfologice si functionale caracteristice, proces care a fost denumit activare si care este reversibil (“dezactivare”). Valori de referinta – 0-1000/µL sau 0-1×109/L; 0-15% din leucocite.Semnificatie clinica1. Monocitoza: >1000/µL:Cele mai frecvente cauze sunt infectiile bacteriene, tuberculoza, endocardita bacteriana subacuta, sifilisul, bruceloza.Leucemia mielomonocitara cronica, leucemia monoblastica acuta, boli mieloproliferative cronice.Carcinoame: stomac, san, ovar.Boala Hodgkin, limfoame.Recuperarea dupa neutropenie, chimioterapie, transplant medular (semn favorabil).Boli parazitare (malarie, Kalatazar, tripanosomiaza), rickettsioze, infectii micotice.Boli gastrointestinale: colita ulcerativa, enterita regionala, sprue, ciroza hepatica.Boli de colagen, sarcoidoza.Postchirurgical, postsplenectomie.Reactii medicamentoase.Intoxicatie cu tetracloretan.Tratament cu factori de crestere granulotmonocitari.2. Monocitopenie: <100/µL (conditie extrem de rara):Tratament cu prednison (tranzitoriu). Leucemia cu celule paroase. Infectii severe care determina si neutropenie. Infectie HIV. Anemie aplastica Eozinofilele (granulocitele eozinofile)– au fost initial descrise pentru granulatiile lor intracitoplasmatice caracteristice care manifesta afinitate crescuta pentru colorantii acizi, cum ar fi eozina, si care apar colorate rosu stralucitor in microscopia optica. Eozinofilele sunt celule mobile, cu originea in maduva osoasa, urmand acelasi model de proliferare, diferentiere, maturare si eliberare in sange ca si granulocitele neutrofile; nucleul lor este de obicei bilobat, dar sunt adesea observati si trei sau mai multi lobi.La indivizii sanatosi se gasesc in numar mic in sange, dar devin predominante in sange si tesuturi in asociere cu diferite boli alergice, parazitare sau boli maligne.

Valori de referinta: 0-700/µL sau 0-0.7×109/L (0-7% din leucocite); valori mai mici la copiii pana la 1 an Semnificatie clinica 1. Eozinofilia >700/µL:Boli alergice: Astmul bronsic: exista o corelatie intre hiperreactivitatea bronsica si gradul eozinofiliei; Dermatita atopica, urticaria, edemul angioneurotic, sensibilizarea la aspirina, alergii medicamentoase (trimetoprimtsulfametoxazol, penicilina, tetraciclina, nitrofurantoin), febra fanului.Esofagita eozinofilica (posibil asociata cu alergie la alimente), gastroenterita eozinofilica, proctocolita eozinofilica (asociata cu alergia la laptele de vaca, desi poate aparea si la copii hraniti cu formule de soia sau alimentati la san).In plus, reactiile medicamentoase, sindromul hipereozinofilic si infestatiile parazitare se pot asocia cu eozinofilie si infiltrate pulmonare.Boli neoplazice: Leucemia eozinofilica.Boala Hodgkin si limfoamele maligne.Bolile mieloproliferative cronice.Carcinomul bronsic (prin productie excesiva de IL5).Boli gastrointestinale: boala Crohn, colita ulcerativa.Infectia HIV: se poate datora infestatiilor parazitare intercurente, reactiei la trimetoprimtsulfametoxazol utilizat pentru tratamentul infectiei cu Pneumocystis carinii.Infestari parazitare in special helmintice (trichineloza, chist hidatic, schistosomiaza, fascioloza, toxocaroza – “larva migrans” viscerala, cisticercoza, scabie), in special in timpul fazei de migrare tisulara.Eozinofilia familiala (rara).Rinita eozinofilica nonalergica.!Cele mai mari valori ale numarului de eozinofile (>1500/µL) apar in sindromul hipereozinofilic idiopatic, leucemia cu eozinofile, trichineloza si dermatita herpetiforma.2. Eozinopenia se datoreaza in general unei productii crescute de steroizi, care acompaniaza majoritatea conditiilor de stres si se asociaza cu:Sindromul Cushing.Medicamente: ACTH, corticosteroizi, epinefrina, tiroxina, prostaglandine.Infectii acute. Bazofilele (granulocitele bazofile) si mastocitele – sunt doua populatii de leucocite bazofile care prezinta multe asemanari, dar si unele diferente. Ambele tipuri de celule contin granulatii intracitoplasmatice care se coloreaza metacromatic cu coloranti bazici. De asemenea, ambele exprima pe suprafata lor o isoforma tetramerica (αβγ2) a receptorului cu afinitate mare pentru IgE. Cand acest receptor cu afinitate mare este legat de alergenul sensibilizant sau de anticorpii antitIgE, atat bazofilele, cat si mastocitele sunt activate, fiind indusa sinteza si secretia de mediatori. Prin aceste mecanisme bazofilele si mastocitele sunt factori importanti in inflamatiile alergice si alte fenomene imune si inflamatorii.Bazofilele sunt celule avand kinetica si istoria naturala a granulocitelor, care se matureaza in maduva, circula in sange si retin anumite trasaturi ultrastructurale caracteristice dupa migrarea in tesuturi in timpul proceselor inflamatorii si imunologice (hipersensibilitate cutanata bazofilica, astm

Valori de referinta – bazofile = 0-200/µL sau 0-0.2×109/L (0-2% din leucocite).Semnificatie clinica1. Bazofilia: >200/µL:Numarul de bazofile si precursori mastocitari este crescut in boli alergice: rinita alergica, polipoza nazala, sinuzita cronica, astm, dermatita atopica, alergii medicamentoase.In leucemia megakarioblastica din sindromul Down (trisomia 21) exista diferentiere bazofilica (care poate include mastocitele) din progenitorii leucemici.Leucemia mieloida cronica si alte sindroame mieloproliferative cronice (policitemia vera, metaplazia mieloida cu mielofibroza). Nivelul bazofiliei are valoare prognostica, iar criza bazofilica anunta faza blastica terminala din leucemia mieloida cronica. Hiperhistaminemia din leucemia mieloida cronica si celelalte sindroame mieloproliferative se coreleaza cu numarul si turntoverul bazofilelor (si posibil si al mastocitelor).Leucemie bazofilica.Boala Hodgkin.Anemie hemolitica cronica, postsplenectomie.Postradiatii ionizante.Infectii: tuberculoza, varicela, gripa.Injectarea de particule straine.Hipotiroidism.2. Bazopenia: <20/µL:Infectii in faza acuta.Reactii de stres (sarcina, infarct miocardic).Dupa tratament prelungit cu steroizi, chimioterapie, iradiere.Absenta ereditara a bazofilelor.Febra reumatica acuta la copii.Hipertiroidism.

Formula leucocitară : Never (neutrofile)Let (limfocite)Monkeys (monocite)Eat (eozinofile)Bananas (bazofile)

Cum îmi amintescprocentul relativ ?

60 + 30 + 6 + 3 +1(60% neutrofile30% limfocite6% monocite3% eozinofile1% bazofile)

VITEZA DE SEDIMENTARE A HEMATIILORÎncepând cu anul 1924, când Westergreen a standardizat metoda de determinare ce-i poarta numele, viteza de sedimentare a hematiilor (V.S.H.) s-a raspândit ca un test paraclinic nespecific utilizat în diagnosticul unor variate stari patologice.

VSH-ul reprezinta rata la care sedimenteaza hematiile dintrto proba de sange anticoagulat intrto ora. Cu cat hematiile sedimenteaza mai repede, cu atat VSH-ul este mai mare, fiind un indicator de raspuns de faza acuta. O crestere a VSH-ului apare la cel putin 24 ore dupa initierea

raspunsului inflamator, iar dupa incheierea raspunsului de faza acuta scade cu un timp de injumatatire de 96-144 ore.In comparatie cu CRP si amiloidul A seric, VSH-ul este crescut si in situatiile in care se produce cresterea concentratiei imunoglobulinelor, complexelor imune si altor proteine.Indicatii-Test screening in suspiciunea de reactii inflamatorii, infectii, boli autoimune, discrazii plasmocitare.-Monitorizarea evolutiei si tratamentului in anumite boli: arterita temporala, polimialgie reumatica, artrita reumatoida, reumatism articular acut, lupus eritematos sistemic, boala Hodgkin, tuberculoza, endocardita bacteriana.-Diagnosticul arteritei temporale, polimialgiei reumatice.VSH-ul nu este un test diagnostic pentru o anumita boala si nu trebuie utilizat pentru screeningtul pacientilor asimptomaticiPregatire pacient - à jeun/postprandial; o masa lipidica poate determina alterari plasmaticeSpecimen recoltat – sange venos.Recipient de recoltare – vacutainer cu citrat de sodiu 3.8% tamponat sau vacutainer cu EDTA K3 (pentru metoda microfotometrica capilara).Cantitate recoltata – cat permite vacuumul; raportul sange/anticoagulant trebuie sa fie 4/13.Cauze de respingere a probei – cantitate insuficienta, specimen coagulat, specimen hemolizat.Stabilitate proba2 ore la temperatura camerei (18t26°C): testul ar trebui efectuat la cel mult 2 ore dupa recoltare. Daca este ratata citirea la 1 ora, sangele nu poate fi remixat si refolosit pentru VSH. Testul trebuie efectuat la temperatura camerei.Metode1.Metoda manuala Westergren: se aseaza tubul in pozitie verticala intr-un suport gradat milimetric si se citeste nivelul de sedimentare a hematiilor in mm dupa 1 ora; in unele teste este citit rezultatul si dupa un interval de 2 ore, dar acesta nu furnizeaza informatii suplimentare.Principiu. În sângele recoltat pe anticoagulant, lasat în repaus, se produce separarea plasmei de elementele figurate care sedimenteaza, în virtutea gravitatiei În sângele circulant elementele figurate se gasesc în suspensie, dispersate în plasma.Mentinerea hematiilor în suspensie si implicit valorile V.S.H.-ului sunt determinate de:• Factori globulari:- încarcatura electronegativa a eritrocitelor, care determina respingerea acestora;- vâscozitatea sângelui conditionata de masa eritrocitara; astfel scaderea numarului dehematii (anemie) determina accelerarea V.S.H.-ului, iar cresterea numarului deeritrocite (poliglobulie) determina scaderea V.S.H.-ului.• Factori plasmatici:- raportul albumine/globuline. Albuminele, care prezinta un grad mare de disociereionica, determina cresterea numarului de sarcini electronegative care se opunsedimentarii. În schimb, globulinele si fibrinogenul, cu un grad de disociere ionicamult mai redus, favorizeaza sedimentarea. Astfel, scaderea raportuluialbumine/globuline fie prin scaderea concentratiei de albumine, fie prin crestereaconcentratiei de globuline sau fibrinogen va accelera sedimentarea si va crestevaloarea V.S.H.-ului.- cresterea fibrinogenului plasmatic favorizeaza sedimentarea prin fenomenul depseudoaglutinare.

Materiale necesare:• seringa de 2 cm3 si ac de punctie venoasa;• pipete Westergreen cu stativul corespunzator;• citrat de sodiu 3,8%, solutie sterila;• materiale necesare recoltarii sângelui prin punctie venoasa.Tehnica• se aspira în seringa solutie de anticoagulant cu care se clateste seringa, retinându-se 0,4ml;• se punctioneaza vena, dupa dezinfectare, si se aspira sânge în seringa pâna la 2 ml;• continutul seringii se amesteca prin cateva miscari de rasturnare;• proba se trece apoi într-o eprubeta din care se aspira cu pipeta Westergreen pâna la diviziunea 0, astfel încât coloana de sânge sa fie continua;• se plaseaza pipeta în stativ în pozitie perfect verticala;• citirea se face dupa o ora, iar rezultatul se exprima în mm coloana de plasma separata deeritrocite în decurs de o ora (mm/ora).Valori normale:• barbat: 1 – 10 mm/ora;• femeie: 2 – 13 mm/ora;• nou-nascut: 0,5 mm/ora (datorita poliglobuliei).Variatii fiziologice:• la femei, V.S.H.-ul creste în timpul menstruatiei;• la femei, V.S.H.-ul creste în sarcina (mai ales în ultimele luni).Variatii patologice:• Cresterea V.S.H.-ului apare în boli infectioase sau inflamatorii (pneumonii, reumatismarticular acut, tuberculoza activa, septicemie, pielonefrite), în anemii, infarct miocardic,leucemii, neoplasme, etc.• Scaderea V.S.H.-ului apare în poliglobulii, etc.Pentru a evita rezultatele eronate trebuie respectate urmatoarele conditii:• sângele se recolteaza dimineata pe nemâncate

• determinarea se face imediat dupa recoltare (în primele 2-3 ore); conservarea sângelui,creste V.S.H.-ul• se utilizeaza ca anticoagulant citratul de sodiu deoarece oxalatul de sodiu creste V.S.H.-ul• pozitia pipetei trebuie sa fie perfect verticala, înclinarea acesteia crescând V.S.H.-ul• temperatura camerei trebuie sa fie cuprinsa între 20 si 27°C deoarece crestereatemperaturii creste V.S.H.-ul• sa se evite hemoliza

2.Metoda automata de citire VSH (cu ajutorul unui sistem de raze infrarosii).3.Metoda microfotometrica capilara: masoara capacitatea de  agregare a eritrocitelor (prima etapa a sedimentarii) in prezenta aglomerinelor, la 37°C.! Un VSH normal nu exclude o boala organica nontinflamatorie, disfunctie de organ/neoplazieValori critice -cresteri extreme ale VSH apar in limfoame, carcinoame maligne de colon/san, mielom multiplu si artrita reumatoida.VSH >100 mm/h apare in: metastaze, boli renale (in special cele cu azotemie), infectii severe (osteomielita, endocardita bacteriana subacuta), polimialgie reumatica.

 Recomandari pentru determinarea concentratului leucocitar -pancitopenia fara o cauza aparenta: detectia de celule imature sau anormale;-leucemia leucopenica: detectia de blasti;-tablou leucoeritroblastic: identificarea de precursori mieloizi, eritroblasti, fragmente de megakariocite.-anemie macrocitara (megaloblastica): identificarea de megaloblasti (precursori eritroizi nucleati) si granulocite hipersegmentate;-mielom multiplu: prezenta de plasmocite.-atunci cand se suspecteaza prezenta de celule tumorale circulante (limfoame in faza leucemica).-prezenta de paraziti sau bacterii intraleucocitare.Pregatire pacient t à jeun/postprandial.Specimen recoltat - sange venos.Recipient de recoltare – vacutainer cu K3-EDTA.Cantitate recoltata – 2 tuburi (cat permite vacuumul.Cauze de respingere a probei – tub incorect, specimen coagulat/hemolizat.Prelucrare necesara dupa recoltare – se aseaza tuburile intr-un stativ in pozitie verticala si se lasa la temperatura camerei 2-3 ore, timp in care elemente celulare sanguine sedimenteaza separandu-se de plasma. Se aduna cu o pipeta plasma supernatanta impreuna cu stratul leuco-trombocitar situat deasupra stratului eritrocitar si o mica portiune din stratul eritrocitar. Se trece plasma colectata intrto eprubeta si se centrifugheaza 10 minute la 2000 rpm, leucocitele si trombocitele depunandu-se pe fundul eprubetei. Se indeparteaza plasma supernatanta cu exceptia unei mici cantitati care va servi ca diluant al sedimentului din care se vor intinde frotiurile ce vor fi colorate May-Grunwald-Giemsa.Metoda de determinare-examinare microscopica initial la putere mica (obiectivul de 20x), apoi cu obiectivul de 100x cu imersie. Se examineaza cu atentie marginile si franjurii frotiului unde se dispun adesea precursorii mieloizi (mielocite, promielocite, blasti) si eritroblastii.Valori de referinta absente elemente celulare anormale.Semnificatie clinica – pe lamele de concentrat leucocitar pot fi prezente celule sanguine care nu apar in mod obisnuit in formula leucocitara curenta, cum ar fi: mielocite, metamielocite.Pe

lamele de concentrat leucocitar nu se pot aprecia cu acuratete morfologia eritrocitara, numarul de trombocite si formula leucocitara. Uneori se poate observa un numar mai mare de monocite. Totusi frotiurile de concentrat leucocitar bine efectuate sunt reprezentative pentru populatia generala de celule nucleate prezenta in sange. In cazurile cu leucopenie se pot examina intrtun timp scurt mult mai multe celule decat pe frotiul obisnuit. Identificarea de celule imature, celule anormale, blasti, celule tumorale circulante sau alte forme nucleate circulante, precum si bacterii sau paraziti intraleucocitari (organisme neobisnuite, cum ar fi infectii severe cu Strongyloides stercoralis la pacienti imunodeprimati, microfilarii)  furnizeaza informatii diagnostice importante si poate reduce necesitatea altor teste mai complexe.

Reactii citochimiceCitochimia se bazeaza pe studiul microscopic al componentilor chimici celulari: nucleoproteine, proteine, hidrati de carbon, lipide si enzime.Coloratiile citochimice ofera informatii in legatura cu linia celulara si diferentierea celulelor hematopoietice si joaca un rol important in evaluarea anomaliilor hematologice, in special in diagnosticul diferential si clasificarea bolilor maligne ale sangelui.Recomandari pentru determinarea PAS-diagnosticul leucemiei acute limfoblastice (LAL) subtipurile L1 si L2;- diagnosticul de sindrom mielodisplazic ori LAM-M6 prin evidentierea eritroblastilor PAS-pozitivi;- diferentierea celulelor Gaucher si a histiocitelor cu granule „albastre ca marea” de alte tipuri de macrofage. Pregatire pacient -à jeun (pe nemancate) sau postprandial (dupa mese).Specimen recoltata) sange capilar si/sau aspirat medular – frotiurib) se recomanda recoltarea simultana de sange venos pentru hemograma.Metoda : examinare microscopica

Recomandari pentru determinarea esterazelor nespecifice-diagnosticul LA monocitare tipurile M4 si M5.Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate) sau postprandial (dupa mese).Specimen recoltata) sange capilar si/sau aspirat medular – frotiurib) se recomanda recoltarea simultana de sange venos pentru hemogramaMetoda - examinare microscopica.

Recomandari pentru determinarea activitatii peroxidazei-  diferentierea leucemiei acute mieloblastice (LAM) de cea limfoblastica (LAL);- demonstrarea corpilor Auer;- detectarea scaderii activitatii, la subiectii cu deficit de MPO congenitala sau dobandita (in mielodisplazii.Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate) sau postprandial (dupa mese).Specimen recoltata) sange capilar si/sau aspirat medular – frotiuri

b) se recomanda recoltarea simultana de sange venos pentru hemograma.Metoda- examinare microscopica

Determinarea activitatii (indicelui) fosfatazei alcaline leucocitare este utilizata in :-diferentierea leucemiei granulocitare cronice de alte boli mieloproliferative (in particular metaplazie mieloida cu mielofibroza si policitemia vera) si  de reactiile leucemoide (infectii, neoplazii);-diferentierea poliglobuliilor secundare de policitemia vera;-parametru de prognostic in LGC, ce reflecta diferitele faze de activitate ale bolii;-diferentierea formelor stabile, benigne de hairy cell leukemia (HCL) cu FAL normal, de formele active de boala, cu neutropenie severa si FAL mult crescutPregatire pacient - à jeun (pe nemancate) sau postprandial (dupa mese).Specimen recoltata) sange capilar si/sau aspirat medular – frotiurib) se recomanda recoltarea simultana de sange venos pentru hemogramaMetoda -examinare microscopica

Alte teste hematologice si imunohematologice

CELULE LUPICE - Fenomenul lupic este un proces de “canibalism celular” (fagocitarea elemnetelor figurate sanguine de PMN neutrofile - PMN - celule polimorfonucleare sau granulocite). Examenul presupune identificarea celulei lupice care este de fapt un leucocit neutrofil al carui nucleu este modificat – in centrul PMNului modificat apare o masa omogena, (corpul  LE - lupus eritematos - ce contine un material amorf, nuclei de limfocite de regula), materialul nuclear al PMN fiind situat excentric si chiar expulzat din citoplasma. In jurul corpului LE, vor aglutina leucocite intacte cu formarea rozetei lupice. In mod normal celulele lupice sunt absente in sange. In lupusul eritematos diseminat evolutiv, proportia de celule lupice este de peste 80 %. Urmarirea celulelor lupice este utila in aprecierea evolutiei tratamentului. Daca tratamentul este eficace atunci celulele lupice dispar. Celula lupica este cel mai des intalnita in lupusul eritematos sistemic insa exista si alte afectiuni unde ea poate fi gasita (poliartrita reumatoida intr-o proportie < de 10% din cazuri,, sclerodermia < 5% din cazuri, intoxicatia hidralazinica, etc). Prezenta in ser a celulelor lupice se interpreteaza asadar in contxtul clinic si nu exclusivist ca semn patognomonic de boala lupica.   Pentru personalul medical – deteminare celule lupice / fenomen LE           Recoltare – vacutainer cu perle fara anticoagulant. Imediat dupa recoltare, eprubeta de recolta este agitat timp de 15 minute pentru defibrinare.           Pregatire pacient: se recomanda recoltarea à jeun (pe nemancate) sau postprandial (peste 4 ore de la ultima masa pentru a atinge criteriul de conformitate al probei recoltate. Probele lipemice/hemolizate/coagulate pot induce modificari ale unor parametrii caz in care laboratorul poate respinge proba sau emite un comentariu referitor la conformitatea produsului).           Tehnica de lucru: examen citologic direct al frotiului colorat cu concentrat leucocitar al sangelui defibrinat. Se urmareste prezenta “canibalismului celular” care se raporteaza procentual ca fiind fenomen LE si respectiv prezenta “rozetelor celulare”.

ELECTROFOREZA Hemoglobinei este un test care masoara diferitele tipuri de hemoglobina din sange. S-au descris mai multe tipuri de hemoglobina. Exista forme normale de hemoglobina pentru viata fetala (conditii de oxigenare redusa a tesuturilor), viata adulta (conditii de oxigenare optima a tesuturilor) precum si forme anormale de hemoglobina (hemoglobinopatii cantitative):           Hb F – forma normala predominanta de hemoglobina din viata fetala prezenta si decursul vietii adultului. Valorile normale ale Hb F sunt 50 – 80 % pentru  nou nascut,  8 % in primele 6 luni de viata,  0.8 – 2% dupa primele 6 luni de viata si in cursul vietii adulte.           Hb A1 – forma normala predominanta de hemoglobina din sangele adultului 95 – 98%           Hb A2 – forma normala de hemoglobina prezenta in sangele adultului 2 – 3%. In beta talasemii (anemii hemolitice frecvent intalnite la populatiile din preajma acumularilor acvatice “thalasa” = mare in greaca veche) exista o productie defectuoasa de HbA1. Aceasta face ca procentul de HbA2 sa creasca o         In beta-thalassemia minima si minora  valorile  Hb A2  sunt crescute (3,2%- 7%), iar Hb F este usor crescuta (0.5-6%) restul fiind reprezentat de Hb A1. o         In beta-thalassemia intermedia, valoarea Hb A2 este crescuta (> 3%), iar Hb F atinge valori de 20-80%, restul fiind HbA1. o         In beta-thalassemia majora, valorile de  Hb F sunt intre 20-90% restul fiind format de  Hb A1 (valori foarte scazute) si HbA2 (valori normale sau crescute); o         Alfa talasemia este expresia fenotipica a defectului genetic ce poate asocia lipsei productiei lanturilor alfa ale HbA1 si Hb A2 (defect genetic situat pe cromozomul 16). Severitatea defectului este variabila; una din extreme este conditia complet asimptomatica - alfa talasemiile tara (purtator defect genetic dar asimptomatic). Altenativ, alfa talasemia majora sau sindromul Bart ce este incompatibil cu viata si asociaza hidrops fetal cu edeme generalizate, efuziuni pleurale si pericardice, hepatosplenomegalie, anemie hipocroma severa iar (fatul moare la scurt timp de la nastere). o         In practica se foloseste indicele Mentzer calculat prin raportul VEM /nr. de eritrocite (x10^6). Valori sub 12 sunt sugestive pentru tarele talasemice, 12- 14 echivoc, peste 14 – sugereaza deficitul de fier. Vezi aici algoritmul de diagnostic al anemiilor.           Hb S – forma anormala de hemoglobina – caracteristica siclemei – anemia cu celule in “secera”. In conditii de hipoxie sau stress celular, aceasta hemoglobina precipita in gramezi, dand aspectul carecteristic de “secera” al eritrocitelor. In mod curent in siclemie valoarea HbS este de 30 – 45%.           Alte forme de hemoglobine anormale : Hb C, Hb Lepore. etc – care in conditii de hipoxie sau stress celular predispun la hemoliza – distrugerea globulelor rosii. Unele forme clinice sunt incmptatibile cu viata, altele sunt compatibile cu viata fiind inregistrate crize hemolitice (distrugerea hematiilor) in donditii de stress (infectii, hipoxie,  stress chirurgical, etc). In anemiile hemolitice compatibile cu viata adulta in mod curent se intalnesc valori de 90-95% ale HbC.   Pentru personalul medical – pregatirea pacient si recoltare electroforeza hemoglobina           Recoltare - vacutainer mov (K3-EDTA) – sange venos (punctie venoasa) / microtainer mov (K3-EDTA) – sange capilar (punctie capilara)           Pregatire pacient: se recomanda recoltarea à jeun (pe nemancate) sau postprandial (peste 4 ore de la ultima masa pentru a atinge criteriul de conformitate a probei recoltate –  probele lipemice/hemolizate/insuficient recoltate/coagulate pot induce modificari ale unor

parametrii caz in care laboratorul poate respinge proba sau emite un comentariu referitor la conformitatea produsului).           Tehnica de lucru: migrare in camp electroforetic al hemolizatului: dupa centrifugare si eliminarea excesului de supernatant hematiile se hemolizeaza.

DETERMINARE GRUP SANGUIN ABO - Sistemul antigenic ABO se refera la prezenta sau absenta antigenelor A sau B de pe membrana eritrocitelor (globulele rosii). Exista trei gene alele in sistemul ABO (A, B si O) cu transmitere mendeliana; A si B sunt alele codominante, iar O este o alela recesiva. Aceste trei gene determina patru fenotipuri: O. A, B si AB. Toti indivizii imunocompetenti produc anticorpi naturali (izoaglutinine sau izohemolizine) fata de antigenele de grup ABO. Nou-nascutii nu au de obicei o cantitate semnificativa de anti-A si anti-B in plasma, cu exceptia celor nascuti din mame aloimunizate, la care pot fi prezenti in circulatie anticorpi IgG de la mama care au traversat placenta. Anticorpii ABO nu reprezinta o cauza majora de boala hemolitica a nou-nascutului: hemoliza poate fi luata in calcul daca mama este grup O, cu copil grup A sau AB. Investigatia este recomadata inaintea unei transfuzii, inaintea unei proceduri invazive sau chirurgicale potential asociate cu complicatii hemoragice care ar putea necesita transfuzii, monitorizarea imunohematologica antepartum si postnatala a mamei si copilului, la donatorii de sange, pentru compatibilitatea de grup ABO in transplantul de rinichi si inima.   Conditii de recoltare determinare grup sanguin ABO  – pentru personalul medical           Recoltare – vacutainer cu anticoagulant :eprubeta dop mov/– sange venos (punctie venoasa) cat permite vacumul, sange capilar (punctie capilara).           Pregatire pacient: se recomanda recoltarea à jeun (pe nemancate) sau postprandial (peste 4 ore de la ultima masa pentru a atinge criteriul de conformitate al probei recoltate. Probele lipemice/hemolizate/insuficient recoltate/coagulate pot induce modificari ale unor parametrii caz in care laboratorul poate respinge proba sau emite un comentariu referitor la conformitatea produsului).           Tehnica de lucru: metoda aglutinare pe lama (Beth – Vincent) folosind seruri anti A, anti B, anti AB

DETERMINARE FACTOR RH - Sistem antigenic exprimat de memmbrama eritrocitelor (globulele rosii) codificate de doua gene situate pe cromozomul 1: gena Rh D si gena Rh CE. Antigenul Rh D este cel mai puternic si corespunde factorului Rh clasic.  Functia antigenelor Rh nu este cunsocuta. Un individ este considerat Rh pozitiv daca eritrocitele sale exprima antigenul D, iar termenul Rh negativ se refera la absenta antigenului D. Absenta antigenului D este intalnita la 15-17 % din indivizii populatiei albe si este mai putin frecventa in alte populatii. Importanta clinica a fenotipului Rh apare in sarcina sau in cazul transfuziilor imcompatibile atunici cand se pot produce imunizari si apar anticorpii anti Rh. Individul cu Rh negativ daca este imunizat formeaza aloanticorpi care interactioneaza cu toate eritrocitele exceptandu-le pe cele Rh nul. Aceasta situatie are importanta majora in sarcina in cazul mamei Rh negativ si imunizata care face anticorpi anti Rh ce pot afecta fatul (posibil Rh pozitiv) generand boala hemolitica a nou nascutului. Frecventa acestora a scazut semnificativ o data cu profilaxia anti-D la gravidele Rh negativ cu fat Rh pozitiv. Testul este indicat: iaintea unei transfuzii, inaintea unei proceduri invazive sau chirurgicale potential asociate cu complicatii hemoragice care ar putea necesita transfuzii, in monitorizarea

imunohematologica antepartum, in evalualrea prenatala a mamei si copilului si la donatorii de sange. Testul Coombs direct si indirectTestul Coombs direct

identifică anticorpii antieritrocitari fixaţi pe eritrocite

Testul Coombs indirect

identifică anticorpii antieritrocitari liberi din ser, care reacţionează împotriva eritrocitelor

Teste de hemostaza

D-dimerii sunt astfel considerati un marker al starii de hipercoagulabilitate si al fibrinolizei endogene, niveluri crescute fiind inregistrate la pacientii afectati de tromboze.Testul are valoare predictiva negativa pentru tromboza venoasa profunda a membrelor inferioare si tromboembolismul pulmonar in sensul ca obtinerea unui rezultat negativ la pacientii suspectati de aceste afectiuni exclude prezenta acestora intrtun procent de >90%. La pacientii din ambulator acest test constituie un instrument suplimentar, inclus in majoritatea algoritmelor, pentru excluderea  diagnosticului de tromboza venoasa profunda. O mentiune speciala trebuie facuta cu privire la utilitatea markertlui in timpul sarcinii. D-dimerii constituie un marker sensibil pentru coagularea intravasculara diseminata (CID), fiind recomandati pentru confirmarea/ infirmarea unei suspiciuni de diagnostic, estimarea riscului potential la pacientii cu CID existent cat si pentru monitorizarea terapiei initiate.Testul poate fi util pentru monitorizarea gradului de liza a cheagului in cursul terapiei trombolitice;determinarea D-dimerilor reprezinta o analiza utila in investigarea pacientilor cu suspiciune de disectie acuta de aortaPregatire pacient- nu este necesara.Specimen recoltat - sange venos. Recipient de recoltare - vacutainer cu citrat de Na 0.105 M (1/9),capac bleu/verde.Cantitatea recoltata -cat permite vacuumul.Cauze de respingere a probei-specimen hemolizat-specimen coagulat-vacutainer care nu este plin-specimen care nu a sosit la laborator in maxim 4 ore de la recoltare-specimen contaminat cu heparina.Prelucrare necesara dupa recoltareSe separa plasma prin centrifugare si se lucreaza imediat.  Daca acest lucru nu este posibil, plasma se poate stoca la t20°C.Metoda - latextaglutinare automata cu detectie fotometrica (test cantitativ)Valori de referinta - <0.5 μg/mL FEU.Interpretarea rezultatelorCresteri ale Dtdimerilor sunt asociate cu: CID (fibrinoliza secundara); tromboze arteriale sau venoase; insuficienta renala sau hepatica; embolism pulmonar; preeclampsie; infarct miocardic; tumori; inflamatii; infectii severe; terapie cu activator tisular al plasminogenului.

 Fibrinogenul (factorul I al coagularii) este o glicoproteina dimerica cu greutate moleculara de aproximativ 340kD, prezenta in plasma si in αtgranulele plachetare.Recomandari pentru determinarea fibrinogenului  - detectarea deficitului congenital sau dobandit al fibrinogenului (at/hipot/disfibrinogenemii); - monitorizarea terapiei trombolitice; - ca indicator al reactiilor consumptive cu/fara fibrin(ogen)oliza; - evaluarea riscului de aparitie a evenimentelor trombotice cardiovasculare (de ex. IMA, AVC); - procese inflamatorii acute. Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate).

Specimen recoltat – sange venos.Recipient de recoltare – vacutainer cu citrat de Na 0.105M (raport citrat de sodiu – sange=1/9)Presiunea realizata de garou trebuie sa fie intre valoarea presiunii sistolice si cea a presiunii diastolice si nu trebuie sa depaseasca 1 minut. Daca punctia venoasa a esuat, o noua tentativa pe aceeasi vena nu se poate face decat dupa 10 minute.Cantitate recoltata - cat permite vacuumul; pentru a preveni coagularea partiala a probei se va asigura amestecul corect al sangelui cu anticoagulantul, prin miscari de inversiune a tubului.Cauze de respingere a probei - vacutainer care nu este plin cel putin 90%; proba intens hemolizata, intens lipemica sau coagulata.Prelucrare necesara dupa recoltare - proba va fi centrifugata 15 minute la 2500tur.Metoda - coagulometrica (Clauss): in prezenta unui exces de trombina, timpul de coagulare al unei plasme citratate, diluate (1/10), saraca in trombocite este invers proportional cu concentratia de fibrinogen. Testul determina nivelul functional de fibrinogen (activitatea) .Valori de referinta t variaza in functie de varsta:

Varsta Valori de referinta (mg/dL)

0-1 an 160-390

2-10 ani 140-360

11-18 ani 160-390

> 18 ani 200-400

Valori critice t <100mg/dL! La valori <50mg/dL pot aparea evenimente hemoragice dupa interventii chirurgicale traumatice.Valorile >700mg/dL (determinari repetate  dupa remiterea procesului inflamator acut) indica un risc crescut pentru aparitia bolilor coronariene si cerebrovasculare.

Retractia cheagului reprezinta ultima etapa a coagularii in care cheagul se retracta eliminand o mare parte din ser, fenomen care rezulta in consolidarea trombusului si posibil in favorizarea vindecarii plagii.Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate).Specimen recoltat – sange venos, recoltat in vacutainer fara anticoagulantSe recomanda recoltarea simultana de sange venos pentru determinarea numarului de trombocite, in vacutainer cu EDTA K3 (capac mov/roz).Metoda -manuala, conform tehnicilor de lucru din laborator.Dupa coagulare ,cheagul de fibrina se retracta expulzand serul .In mod normal ,dupa 3 ore,cantitatea de ser reprezinta 30-50 % din volumul total al sangelui .Retractia cheagului este in functie de cantitatea si calitatea trombocitelor .Este intarziata in trombopenii;in trombopenii severe ,cheagul nu se retracta nici dupa 24 ore la 37 ◦

Timpul  de protrombina (PT)-Timpul Quick evalueaza activitatea factorilor  implicati pe calea ”extrinseca” si “comuna” a coagularii : FVII-proconvertina, FX-factorul Stuart-Prower, FV-proaccelerina, FII-protrombina si FI-fibrinogenul.PT evalueaza atat activitatea factorilor de coagulare  dependenti de vitamina K (mai putin FIX), a factorului V si a fibrinogenului, cat si functia de sinteza proteica a ficatului, cu implicatii diagnostice si terapeutice

Recomandari pentru efectuarea testului  • PT este testul cel mai comun utilizat pentru monitorizarea terapiei anticoagulante orale (sintron ,trombostop), acesta fiind sensibil la trei din cei patru factori de coagulare dependenti de vitamina K • screeningul deficientelor congenitale sau dobandite ale factorilor II, V, VII, X si fibrinogenului;• disfibrinogenemii;• prezenta inhibitorilor fata de factorii de coagulare;• deficit de vitamina K; • monitorizarea functiei de sinteza proteica a ficatului;• screeningul preoperator al hemostazei.Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate).Specimen recoltat - sange venos.Recipient de recoltare – vacutainer cu citrat de Na 0.105M (raport citrat de sodiu – sange=1/9).Presiunea realizata de garou trebuie sa fie intre valoarea presiunii sistolice si cea a presiunii diastolice si nu trebuie sa depaseasca 1 minut. Daca punctia venoasa a esuat, o noua tentativa pe aceeasi vena nu se poate face decat dupa 10 minute.Cantitate recoltata - cat permite vacuumul; pentru a preveni coagularea partiala a probei se va asigura amestecul corect al sangelui cu anticoagulantul, prin miscari de inversiune a tubului (5-6 inversiuni blande).Cauze de respingere a probei -vacutainer care nu este plin (cel putin 90%); proba hemolizata sau coagulata, proba recoltata in alt tub decat cu citrat .Prelucrare necesara dupa recoltare - proba va fi centrifugata 15 minute la 2500tur.Stabilitate proba - proba este stabila 8 ore la temperatura camerei (dupa 8 ore incepe inactivarea factorilor V si VIII); Metoda – coagulometrica.Exprimarea rezultatelor            – ca timp de coagulare – in secunde;           – ca procent (%) din activitatea normala = activitatea protrombinica (AP); domeniul masurabil = 10-100%;           – ca raport protrombinic (PR=PT pacient in sec/PT plasma normala in sec);           -ca INR (International Normalized Ratio). Activitatea protrombinica (AP) = TQ martor/TQ bolnav X 100 - valori normale: 70%-

120% INR (international normalised ratio) = TQ bolnav/TQ martor – valori normale: 0.9-1.2Interpretarea AP (activitatii protrombinice) AP = 50-60% - prudenta -risc de sangerare prelungita la manevre parenterale (punctii

venoase/arteriale, in.j IM) AP = 40%- risc crescut de sangerare la manevre parenterale ; se contraindica punctii, biopsii,

extractii dentare. AP =30% - reprezinta limita terapeutica pentru tratamentul cu ACO. AP = sub 30% risc crescut de singerare spontana (in special AP=10%)

Numeroase studii internationale au aratat ca in faza stabila a terapiei cu anticoagulante orale (ACO) rezultatele pot varia semnificativ in functie de tesutul de origine a tromboplastinei cat si de instrumentul folosit pentru determinarea acestora. Pentru a rezolva aceasta problema,

Organizatia Mondiala a Sanatatii a introdus din 1982 o procedura internationala standardizata de validare a tromboplastinelor. Rezultatele obtinute prin aceasta procedura, in timpul unui tratament anticoagulant stabilizat, nu depind de reactivul folosit. Astfel raportul protrombinic este convertit in INR (International Normalized Ratio) conform formulei:    INR = (PTpacient/PTplasma normala)^ISIISI = indice international de sensibilitate (International Sensitivity Index) a tromboplastinei folosite, calculat in raport cu tromboplastina de referinta pentru care ISI=1. Valorile ISI ale tromboplastinelor folosite in lume variaza intre 1 si 3 si sunt stabilite de producatori pentru fiecare lot de reactivi. Cu cat valoarea ISI este mai apropiata de 1, cu atat sensibilitatea reactivului la terapia cu ACO este mai mare.! INR este util numai pentru pacientii cu terapie anticoagulanta orala stabila si nu are nici o valoare pentru diagnosticul sau tratamentul celor cu PT prelungit din alte motive.INR are acuratete mai mica atunci cand este utilizat la debutul tratamentului cu ACO. Totusi acesta este mai de incredere decat raportul PT neconvertit si se recomanda a fi folosit atat  la initierea cat si intimpul tratamentului de intretinere cu ACO.Valori de referinta           – normal, activitatea de protrombina > 70%; valorile > 100% nu prezinta semnificatie clinica.          – interval terapeutic:INR=2.0–3.0 (2.5): pentru majoritatea situatiilor clinice: profilaxia si tratamentul trombozei venoase; tratamentul embolismului pulmonar; profilaxia emboliei sistemice la pacientii cu fibrilatie atriala, infarct miocardic (daca se asociaza aspirina), boala valvulara mitrala reumatica, prolaps de valva mitrala, calcficare inelara mitrala, trombus mobil de arc aortic, valve cardiace biologice sau proteze mecanice bivalvulare aortice; chirurgia soldului si genunchiului; tromboza de sinus venos; sindrom antifosfolipidic.INR=2.5-3.5 (3.0): valve cardiace mecanice, episoade tromboembolice repetate la pacienti anticoagulati cu INR terapeutic.INR=3.0-4.0  (3.5): infarct miocardic, pacienti cu tromboza remisa de proteza valvulara mecanica aortica.INR=3.5-4.5 (4.0): pacienti cu tromboza remisa de proteza valvulara mecanica mitrala.INR=1.5-1.9: pacienti cu un prim episod neprovocat de tromboza venoasa profunda sau embolism pulmonar, dupa primele 3 luni de tratament, in cazul in care nu este posibila testarea INR la interval de 4 saptamani pentru monitorizarea tratamentului; preventia primara a infarctului miocardic la pacienti cu risc crescut.Tratament anticoagulant-control de laboratorEfectul anticoagulant se stabilizeaza la 4-5 zile de la initierea tratamentului. Conform recomandarilor ACCP, monitorizarea PT/INR trebuie sa inceapa dupa primele 2-3 doze de anticoagulant oral si PT trebuie masurat zilnic pana cand rezultatele PT/INR se stabilizeaza in intervalul terapeutic. Dupa obtinerea unei doze stabile se recomanda monitorizarea la un interval nu mai mare de 4 saptamani. Frecventa determinarilor trebuie crescuta de cate ori se introduc sau se intrerup medicamente care ar putea influenta eficienta anticoagularii.Se recomanda ca o singura metoda de laborator sa fie utilizata pentru monitorizarea tratamentului fiecarui pacient in parte.Valori critice: INR>6 – risc hemoragic (mai ales la pacientii cu boli gastro-intestinale, HTA, boli renale, cerebro-vasculare, tratament antiagregant, alte medicamente potentiatoare).Interpretarea rezultatelor

-PT prelungit (AP scazuta): tratament cu anticoagulante orale, deficit congenital sau dobandit de factori II, V, VII, X, deficit de vitamina K la nou nascuti, diateze hemoragice la nou nascuti, afectiuni hepatice, obstructie biliara, tulburari de absorbtie intestinala a grasimilor (de ex.: sprue, boala celiaca, diaree cronica), malnutritie, CID, sindrom ZollingertEllison, hipofibrinogenemie (fibrinogen <60mg/dL), disfibrinogenemie, prezenta de anticoagulanti circulanti (inhibitorii specifici fata de factorii caii extrinseci sunt foarte rari), unii pacienti cu anticoagulant lupic cu Ac care leaga si cresc clearencetul FII, amiloidoza (prin niveluri scazute de FX).Limite si interferente -  Reactivul folosit in laborator nu este influentat de niveluri ale heparinei nefractionate ≤1UI/mL si de niveluri ale heparinei cu greutate moleculara mica ≤1.5 antitXa UI/mL.-Calitatea punctiei venoase: manevrele traumatice care duc la eliberarea de tromboplastina tisulara si vacutainerele recoltate insuficient, prin modificarea raportului sange-citrat, au ca rezultat scurtarea PT.-  Mentinerea prelungita a plasmei la 4-8ºC poate produce activarea la rece cu cresterea activitatii factorului VII, scurtand PT.-  Recoltarea probei pe cateter venos periferic sau central  pe care a fost administrata solutie hipertona de NaCl va prelungi PT si APTT (la adulti trebuie indepartati primii 5t10 mL sange pentru a preveni contaminarea sau dilutia cu alte fluide)-  Prezenta in proba a produsilor de degradare a fibrinei  duce la prelungirea PT.-  Nivel crescut de antitrombina sau prezenta anticoagulantilor antitrombinici (hirudin, argatroban) pot prelungi PT. De asemenea anticoagulantii lupici pot afecta PT nereflectand nivelul real de anticoagulare.- Plasma congelata transportata pe gheata carbonica in containere inchise poate prezenta o falsa prelungire a PT datorita acidifierii plasmei prin absorbtia de CO2; expunerea plasmei dezghetate la aerul atmosferic pentru cateva minute de obicei elimina acest efect.• Medicamente si alti factori de influenta:

TS(Timp de sangerare) este un test de investigare a hemostazei primare, fiind astfel un indicator al eficientei fazelor vasculara si plachetara. TS depinde de functia si numarul trombocitelor, prezenta proteinelor plasmatice de adeziune, integritatea matrixului peretelui vascular.Pregatire pacient - pacientul nu va lua medicamente care contin aspirina timp de 7 zile inainte de test si se va abtine de la consumul de bauturi alcoolice.Tehnica de efectuare a. Metoda Duke

– se inteapa lobul urechii cu un ac special care provoaca o leziune de 1 mm lungime si 1 mm adancime

– la temperatura normala, nu frecam lobul urechii cu alcool in cursul asepsiei– se adsorb picturile de sange cu o hartie de filtru din 30 in 30 sec– timpul de sangerare normal :2-4 min

b.Metoda Ivy se fixeaza tensiometrul pe brat la 40 mmHg (realizeaza o staza venoasa moderata) se realizeaza o incizie pe fara anterioara a antebratului 10 mm lungime 1 mm adancime se adsorb picturile de sange cu o hartie de filtru din 30 in 30 sec timpul de sangerare normal: 6-10 min

Valori critice – TS>15 minute.Semnificatie clinica TS crescut:1.  Trombocitopenii: 2.. Afectari ale functiei trombocitare-  ereditare: boala von  Willebrand, trombastenie Glanzmann, sindrom BernardtSoulier, sindrom WiskotttAldrich, sindrom ChediaktHigashi;- dobandite: uremie, paraproteinemii (mielom multiplu, macroglobulinemia Waldenstrom), sindroame mieloproliferative acute si cronice, infectii virale, insuficienta hepatica severa, medicamente.3.  Tulburari ale hemostazei secundare: la 20% din pacientii cu hemofilie, 30% din pacientii cu deficit de factor V, in unele cazuri de afibrinogenemie.4.  Unele boli de tesut conjunctiv: sindrom EhlerstDanlos.TS scazut poate fi observat la unii pacienti cu hiperlipoproteinemie, diabet zaharat sau ateroscleroza. La acesti pacienti semnificatia clinica nu este precizata. Limite si interferente TS trebuie efectuat de persoane experimentate.Factorii analitici care pot fi standardizati sunt: lungimea, adancimea, orientarea si localizarea inciziei. Factorii analitici greu standardizabili sunt temperatura, gradul de irigare si textura pielii. La copii adancimea si lungimea inciziei trebuie sa fie mai mici decat la adult.La nou nascuti (in prima saptamana de viata) TS este mult scurtat.TS poate fi fals crescut in cazul consumului excesiv de alcool.Prezenta unui timp de sangerare normal nu exclude un defect al hemostazei primare atunci cand exista in antecedente episoade hemoragice, iar testele de coagulare plasmatica sunt normale.  Un singur TS prelungit nu dovedeste prezenta unei afectiuni hemoragice. Deoarece o incizie incorecta poate leza miniarteriole din profunzimea lobului urechii, TS se va repeta si la celalalt lob

Investigarea hemostazei secundare

1. Timpul de coagulare Definitie : masoara timpul necesar coagularii sangelui total in vitro in contact cu o suprafata

nesiliconata (ar inactiva F.XII). Evalueaza coagularea declansata pe calea intrinseca si calea comuna dar este influentat

si de trombocite (fp3). Avantaje : usor de efectuat , se poate urmari si evolutia cheagului (*retractia cheagului

incepe la 30 minute, la aproximativ 1 ora diametrul cheagului trebuie sa ajunga la jumatate fata de diametrul initial, investigheaza hemostaza primara/functia Tc.

Dezavantaje : sensibilitate si specificitate scazute.

A. Tehnica Lee-White valori normale  : 6-12 minute

punctie venoasa ; recoltarea a 1-2 ml sg. in eprubeta de sticla cu mentinerea la 37 grade Celsius

se masoara timpul pana cand eprubeta poate fi rasturnata fara ca sangele sa curga. cheagul se poate urmari la intervale diferite pina la 24 ore urmarindu-se retractia cheagului si

fibrinoliza.B. Tehnica Millan

valori normale  : 10-12 minute utila cind nu se poate realiza punctia venoasa (copii, soc hipovolemic, etc.) ; se inteapa pulpa

degetului se lasa o picatura de sange sa cada liber peste o picatura de ser fiziologic pe o lama de sticla se masoara timpul pana cand picatura de sange nu se mai deformeaza la inclinarea lamei

Timp de coagulare prelungit   tulburari ale factorilor de coagulare apartinand caii intrinseci si comune (XII, XI,

IX,VIII,X,V,II,I) trombocitopenii/trombocitopatii tratamente anticoagulante (heparina/ACO)

2. Timpul Howell (timpul de recalcifiere) Definitie : timpul de coagulare al plasmei anticoagulate cu oxalat/citrat (cu rol chelator de

Ca) bogata in trombocite dupa recalcifiere cu clorura de calciu (Ca Cl2). Evalueaza coagularea declansata pe calea intrinseca si calea comuna dar este influentat

si de trombocite. valori normale   :60-120 sec.

Tehnica   : plasma mentinuta la 37 grade Celsius timp de 60 sec. se urmareste la 2-3 secunde prin inclinarea usoara a tubului. cronometrul se opeste cind apar primele filamente de fibrina

Timp Howell prelungit tulburari ale factorilor de coagulare apartinand caii intrinseci si comune. trombocitopenii/trombocitopatii tratamente anticoagulante (heparina/ACO)

Teste de corectie pt. Timpul Howell adaugarea de plasma proaspata normala : corectie obligatorie

adaugarea de plasma adsorbita pe BaSO4 (fara FIX -vit K dep) = nu se corecteaza => deficit de F IX (hemofilia B)

adaugarea deplasma/ser vechi (fara F VIII) = nu se corecteaza => deficit de F VIII = hemofilia A/ boala VW

APTT (Testul de tromboplastina partial activata)este un test functional care evalueaza “calea intrinseca” Recomandari pentru efectuarea testului-detectarea deficientelor congenitale sau dobandite ale factorilor de coagulare mentionati mai sus; suspiciunea de hemofilie sau boala von Willebrand;folosit in monitorizarea terapiei cu heparina.Observatii: deficitul de factor XII, prekalikreina sau HK nu se insoteste clinic de manifestari hemoragice. Pe de alta parte, aproximativ 95% din sindroamele hemoragice congenitale se insotesc de prelungirea aPTT.-monitorizarea tratamentului cu heparina nefractionata si inhibitori trombinici (hirudin, argatroban);-suspectarea prezentei de inhibitori factortspecifici sau nespecifici ai coagularii (ex. anticoagulant lupic).Observatie: prezenta anticoagulantilor lupici se asociaza cu tendinta clinica spre tromboza si nu cu hemoragie.-evaluarea preoperatorie a riscului hemoragic.Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate).In heparinoterapie, proba se recolteaza cu o ora inainte de urmatoarea administrare. Nu se recolteaza proba de pe un cateter heparinizat.Specimen recoltat - sange venos.Recipient de recoltare – vacutainer cu citrat de Na 0.105M (raport citrat de sodiu – sange=1/9).Presiunea realizata de garou trebuie sa fie intre valoarea presiunii sistolice si cea a presiunii diastolice si nu trebuie sa depaseasca 1 minut. Daca punctia venoasa a esuat, o noua tentativa pe aceeasi vena nu se poate face decat dupa 10 minute.Cantitate recoltata -cat permite vacuumul; pentru a preveni coagularea partiala a probei se va asigura amestecul corect al sangelui cu anticoagulantul, prin 5-6 miscari blande de inversiune a tubului.Cauze de respingere a probei - vacutainer care nu este plin (cel putin 90%); proba intens hemolizata, coagulata sau recoltata in alt tub decat cu citratPrelucrare necesara dupa recoltare - proba va fi centrifugata 15 minute la 2500 tur.Stabilitate proba – proba este stabila 4 ore la temperatura camerei (stabilitatea se reduce la 2 ore in cazul pacientilor aflati sub heparinoterapieMetoda – coagulometrica.Exprimarea rezultatelor - in secunde; domeniul masurabil: 20-40s.Valori de referinta -normal: 26-40s-interval terapeutic: in cursul heparinoterapiei: 1.5-2.5 ori valoarea nivelului de control.Heparina administrata intravenos potenteaza efectul inhibitor al antitrombinei asupra factorilor XII, XI, IX, X si II (efectul se exercita mai ales asupra factorilor Xa si a trombinei). Efectul anticoagulant apare imediat. Deoarece timpul de injumatatire al heparinei este de 3 ore, proba de sange pentru APTT se recolteaza la 3 ore dupa sau cu o ora inainte de administrarea heparinei.Valori critice – APTT >70s (risc de sangerare spontana).

Interpretarea rezultatelorPrelungirea APTT: toate deficitele congenitale ale caii intrinseci (inclusiv hemofilia A si B, boala von Willebrand), tratament cu heparina nefractionata, inhibitori trombinici (hirudin, argatroban), streptokinaza, urokinaza, tratament cu anticoagulante orale, deficit de vitamina K, malnutritie, hipofibrinogenemie, afectiuni hepatice, CID, prezenta produsilor de degradare a fibrinei, prezenta anticoagulantilor circulanti factortspecifici (sunt observati cel mai adesea la 5t10% din pacientii cu hemofilie ca antitfactor VIII sau antitfactor IX; de asemenea Ac antitFVIII pot aparea la varstnici sau in sarcina) sau nespecifici – anticoagulantii lupici (primari sau secundari in: LES si alte boli autoimune, boli maligne, ca reactie la medicamente, dupa transfuzii multiple, in tuberculoza, glomerulonefrita cronica).Rezultatele APTT se coroboreaza cu  valorile PT:-PT normal cu APTT prelungit: sugereaza deficitul HK, prekalikreinei sau unuia din factorii VIII, IX, XI si/sau XII.-PT prelungit cu APTT normal: sugereaza un posibil deficit de factor VII. FVII avand un timp de injumatatire scurt comparativ cu factorii dependenti de vitamina K ai caii intrinseci, deficientele nutritionale sau terapeutice ale factorilor dependenti de vitamina K pot determina uneori PT prelungit cu aPTT normal.-PT si APTT prelungite: sugereaza deficitul unuia din factorii I, II, V sau X.Scurtarea APTT: poate aparea in cazul unor nivele crescute ale unui singur factor, cel mai adesea FVIII, in neoplasme diseminate (mai putin cand este afectat ficatul), imediat dupa o hemoragie acuta, in stadiile initiale ale CID.In timp ce valori prelungite ale APTT sugereaza o boala hemoragica, un APTT scurtat sta dovedit a fi un predictor independent pentru un risc crescut de deces, tromboza, hemoragie si morbiditate.Limite si interferente-APTT depinde de varsta pacientului: la noutnascuti limita superioara a APTT este prelungita pana la 55s si scade treptat la nivelul de la adulti pana la varsta de 6 luni; valori prelungite ale aPTT la copiii sanatosi se datoreaza unei combinatii de reduceri usoare ale mai multor proteine coagulante. La varstnici APTT poate fi scurtat.-Plasma hemolizata scurteaza APTT la pacientii neheparinizati, dar nu si la cei heparinizati.-La pacientii heparinizati, centrifugarea si separarea plasmei trebuie facute cat mai repede (intr-o ora) pentru a evita pe cat posibil inactivarea heparinei de catre trombocite.-Valori ale hematocritului foarte mari sau foarte mici, vacutainere recoltate insuficient, prin modificarea raportului sangetcitrat pot interfera cu testul.-Recoltarea probei pe cateter venos central  pe care a fost administrata solutie hipertona de NaCl va prelungi PT si aPTT.-Probele intens lipemice pot interfera cu mecanismul analizorului de detectie a formarii cheagului.

Testul Koller efectuat cind se suspicioneaza un deficit de vit. K se efectueaza TQ initial, apoi se administreaza vit. K - 10 mg i.m/zi. 3 zile consecutiv se repeta TQ : corectarea cu peste 15% din valoarea initiala = > deficit de vitamina K

EXPLORAREA TIMPULUI VASCULO-PLACHETAR

1. EXPLORAREA REZISTENTEI VASCULARE• PROBA VENTUZEI

• Tehnica: decompresiune a unei suprafete cutanate cu ajutorul unei palnii de sticla sau ventuze conectate la o pompa aspiratoare si manometru cu mercur - se determina momentul de aparitie si numarul de petesii aparute ca rezultat al decompresiunii.

• Rezistenta capilara normala ® nu apar petesii pana la o decompresiune de 20-25 mm Hg la adult, 30 mm Hg copil.

• PROBA RUMPELL-LEEDE • Tehnica: tensiometru aplicat deasupra cotului si se ridica presiunea la o valoare

intre presiunea sistolica si cea diastolica timp de 5 minute.• Rezistenta capilara normala ® nu apar petesii. Fragilitate capilara cu atat mai

mare cu cat numarul si intinderea petesiilor sunt mai mari.

Intrucat rezistenta si permeabilitatea capilara depind de integritatea morfologica si functionala a vasului dar si de numarul si calitatea trombocitelor, proba ventuzei si Rumpell-Leede sunt pozitive atat in vasculopatii cat si in afectiuni plachetare.

TESTUL DE TOLERANTA LA HEPARINA (TTH) ® timp coagulare plasma oxalatata + dilutii succesive heparina - heparina creste sensibilitatea timpului de coagulare plasma recalcificata provocand dezechilibru factori coagulanti/anticoagulanti (dificultati tehnice) - indice coagulabilitate: IC= timp coagulare martor/timp coagulare plasma cercetat (0,8-1,2 ® coagulabilitate normala) < hipocoagulabilitate; > hipercoagulabilitateTESTE SCREENING:

Numar trombociteTimp partial tromboplastina activata / PTT, aPTTINR, timp protrombina/TQTimp trombinaTimp sangerareFibrinogen, dimeriRetractia cheagului

Teste de trombofilie

Anticoagulantii de tip lupic sunt anticorpi indreptati impotriva complexelor fosfolipidetproteine. Acestia interfera in vitro cu testele de coagulare dependente de fosfolipide, determinand prelungirea lor (cel mai frecvent folosit fiind timpul de tromboplastina partiala activat APTTTestarea pentru detectarea LA trebuie sa fie limitata la pacientii care au o probabilitate semnificativa de a avea sindrom antifosfolipidic (APS) sau care prezinta o prelungire neexplicata a APTT la un control de rutina.Trombozele venoase profunde neprovocate sau trombozele arteriale fara explicatie aparute la pacienti tineri (<50 ani), trombozele cu localizare neobisnuita, pierderile de sarcina survenite

tardiv, orice episod trombotic sau complicatie a sarcinii la persoane avand boli autoimune (lupus eritematos sistemic, artrita reumatoida, trombocitopenie autoimuna, anemie hemolitica autoimuna) indica o probabilitate mare de APS; subiectii asimptomatici depistati intamplator cu aPTT prelungit, pacientele cu avorturi spontane recurente survenite precoce in sarcina si persoanele tinere cu tromboze venoase profunde provocate au o probabilitate medie de APS, in timp ce trombozele venoase profunde sau tromboembolismul arterial survenite la varstnici se asociaza cu probabilitate redusa de APS.

Proteina C este o glicoproteina sintetizata in ficat (printrtun mecanism dependent de vitamina K), care circula in plasma si are rol in prevenirea trombozelor. Functia sa de anticoagulant se exercita prin inactivarea factorilor V si VIII. De asemenea, actioneaza ca un agent profibrinoliticRecomandari pentru determinarea proteinei C:• investigarea unor complicatii tromboembolice neexplicabile, in special la pacienti <50 ani si cu istoric familial pozitiv de evenimente trombotice;• inaintea administrarii contraceptivelor orale la paciente cu  episoade trombotice in antecedente sau cu istoric familial pozitiv.

Proteina S este o glicoproteina dependenta de vitamina K sintetizata in ficat, celule endoteliale si megakariociteRecomandari pentru determinarea proteinei S• investigarea unor complicatii tromboembolice neexplicabile, in special la pacienti <50 ani si cu istoric familial pozitiv de evenimente trombotice;• inaintea administrarii contraceptivelor orale la paciente cu  episoade trombotice in antecedente sau cu istoric familial pozitiv

Profil trombofilie-screening: Anticoagulant lupic, Antitrombina III, Proteina C, Proteina S, HomocisteinaProfil trombofilie ereditara (I): Antitrombina III, Proteina C, Proteina S, Mutatia factorului V Leiden, Mutatia factorului IIProfil trombofilie ereditara (II): Profil trombofilie ereditara (I) + Gena MTHFR (mutatii C677T; A1298C)