UNIVERSITATEA DE STAT DIN MOLDOVA

FACULTATEA BIOLOGIE I PEDOLOGIE

Cu titlu de manuscris

C.Z.U.:581.8:575.:633.854.78:582.952.6

ROTARENCO VICTORIA

ASPECTE MORFO-FIZIOLOGICE I GENETICE DE

INTERACIUNE GAZD-PARAZIT

(HELIANTHUS ANNUUS L. - OROBANCHE CUMANA WALLR.)

03.00.12. FIZIOLOGIE VEGETAL

Autoreferatul tezei de doctor n biologie

CHIINU, 2010

2

Teza a fost elaborat n laboratorul Securitate Biologic, catedra Biologie Vegetal,

Universitatea de Stat din Moldova i laboratorul Genomica, Centrul de Cercetare Biologie

Molecular, Universitatea Academiei de tiine a Moldovei.

Conductor tiinific:

Duca Maria, dr. hab. biol., prof. univ., m. cor. al AM

Refereni oficiali:

Dascaliuc Alexandru, dr. hab. n biol., prof. univ., Institutul de Genetic i Fiziologie a

Plantelor, AM

Dru Ala, dr. n biol., conf. univ., Universitatea Agrar de Stat din Moldova

Componena consiliului tiinific specializat:

icanu Gheorghe preedinte, dr. hab. biol., prof. univ., academician

tefr Anastasia secretar tiinific, dr. hab. biol., prof. cercet.

Balaur Nicolae dr. hab. biol., prof. univ., m. cor. al AM

Derendovskaia Antonina dr. hab. agr., prof. univ.

Chirilov Alexandru dr. biol.

Susinerea va avea loc la _30_ __septembrie_ 2010, ora 1000

n edina Consiliului tiinific

specializat DH 10.03.00.12 05, din cadrul Institutului de Genetic i Fiziologie a Plantelor, al

Academiei de tiine a Moldovei, adresa: MD-2002, str. Pdurii 20, Chiinu, tel.: (373 22)

77 04 47, fax: (373 22) 55 61 80

Teza de doctor i autoreferatul pot fi consultate la biblioteca Institutului de Genetic i Fiziologie

a Plantelor i la pagina web a C.N.A.A. (www.cnaa.md).

Autoreferatul a fost expediat la 20 august 2010.

Secretar tiinific al Consiliului tiinific specializat,

tefr Anastasia, dr. hab. biol., prof. cercet. __________

( Rotarenco Victoria, 2010)

Conductor tiinific,

Duca Maria, m. cor. al AM, dr. hab. biol., prof. univ.

Autor

Rotarenco Victoria

http://www.cnaa.md/

3

REPERELE CONCEPTUALE ALE CERCETRII

Actualitatea temei. Problema rezistenei i receptivitii plantelor la boli, n complexul

aspectelor sale, rmne a fi o prerogativ important n cercetrile biologice. Interaciunea dintre

agentul patogen i gazd este ntr-o strns dependen de particularitile fiziologice ale

parazitului (afinitate, agresivitate i virulen), de caracteristicile plantei gazd (rezisten

nespecific, specific i indus), precum i de aciunea factorilor de mediu [8, 12].

Cunoaterea mecanismelor morfo-fiziologice i moleculare de aciune i reaciune pe

parcursul stabilirii raporturilor parazitare va permite amelioratorilor valorificarea eficient a

potenialului genetic cu rezisten sporit n crearea noilor soiuri i hibrizi de culturi agricole.

Descrierea situaiei n domeniu i identificarea problemelor de cercetare. Floarea-

soarelui este una dintre principalele plante oleaginoase cultivate n Republica Moldova, cu un

spectru larg de utilizare n sectorul alimentar i industrial, contribuind astfel la soluionarea mai

multor probleme de valoare economic [3, 4]. n legtur cu frecventele aciunii nefavorabile ale

factorilor de mediu recolta culturilor agricole, inclusiv cea a florii-soarelui, este compromis sub

aspect cantitativ, dar i calitativ. n contextul vizat, cercetrile cu privire la rezisten florii-

soarelui la lupoaie (Orobanche cumana Wallr.) reprezint un obiectiv de actualitate. Aciunea

acestui agent patogen s-a extins n special n zonele centrale i de Sud-Est ale Republicii

Moldova [3]. Atacul florii-soarelui de lupoaie este deseori devastator, determinnd scderi

semnificative ale produciei i calitii uleiului. Astfel, n Europa de Est i de Sud au fost

nregistrate pierderi economice de 50-90% [10, 28]. De aceea, n ultimele decenii au luat o

amploare deosebit cercetrile privind interaciunea gazd-parazit i elaborarea metodelor de

combatere a lupoaiei.

Elucidarea mecanismelor moleculare ce determin relaiile existente dintre planta-gazd i

parazit ar contribui la facilitarea procesului de selecie a formelor rezistente, ceea ce reprezint la

moment una dintre preocuprile de baz ale cercettorilor din domeniul ameliorrii florii-

soarelui.

Scopul prezentei lucrrii const n evidenierea unor particulariti morfo-fiziologice i

genetice ce determin relaia gazd - parazit n baza sistemului model Helianthus annuus L.

Orobanche cumana Wallr.

Obiectivele de cercetare:

evaluarea gradului de atac al genotipurilor de H. annuus n condiiile infectrii artificiale cu

O. cumana.;

studiul nivelului de rezisten fenotipic a diferitor genotipuri de floarea-soarelui expuse

aciunii parazitului;

4

identificarea i analiza molecular a genei Or5 la 53 genotipuri homo- i heterozigote de

H. annuus;

evidenierea unor secvene nucleotidice i proteice implicate n reacia de rspuns la aciunea

fitoparazitului O. cumana.

Metodologia cercetrii tiinifice. Asigurarea metodologiei cercetrilor tiinifice s-a

realizat n baza concepiilor i principiilor expuse n lucrrile: Laemmli U. (1970), Mullis K.

(1983), .. (1985), Doyle J. (1990), Duca M. (2001), Reva V. (2001). n studiu, de

asemenea, au fost utilizate metode bioinformatice cu investigarea bazelor de date ale portalului

NCBI i ExPASy i utilizarea programelor BLAST, Clustal W i Compute pI/Mw.

Noutatea i originalitatea tiinific. S-au efectuat cercetri complexe - morfologice,

fiziologice, biochimice i genetico-moleculare asupra diferitor genotipuri de floarea-soarelui

cultivate n Republica Moldova la aciunea fitoparazitului O. cumana. Analiza comparat a

screening-ului molecular i morfologic a permis s constatm, c populaia de lupoaie utilizat n

cercetare reprezint o ras mai virulent dect rasa E. S-a identificat i analizat secvena genic

amplificat - markerul RTS05, regiune asociat cu gena rezistenei (Or5) la rasa E, fiind

constatat un nivel de omologie de 86% cu gena care codific precursorul proteinei-inhibitor al

poligalacturonazei, astfel fiind adus o nou contribuie n elucidarea mecanismului de rezisten

a florii-soarelui la rasa E de lupoaie.

Semnificaia teoretic. Rezultatele obinute referitor la afinitatea, agresivitatea i virulena

fitoparazitului, precum i la rezistena specific i nespecific a florii-soarelui, contribuie cu noi

informaii n explicarea mecanismului de interaciune gazd-parazit la nivel pre-haustorial i

post-haustorial.

Valoarea aplicativ a lucrrii. S-a constatat c, zece genotipuri de floarea-soarelui (FS9,

FS12, FS17, FS21, FS26, FS27, ASC1, Alcazar F1, Favorit F1, Turbo F1) din cele 53 analizate au

manifestat rezisten la atacul parazitului, cinci au prezentat toleran (FS4, FS8, FS11, ASC2,

Xenia ), iar treizeci i opt au fost susceptibile (FS1, FS2, FS3, FS5, FS6, FS7, FS10, FS13,

FS14, FS15, FS16, FS18, FS19, FS20, FS22, FS23, FS24, FS25, ASC3, ASC4, ASC5, ASC6,

ASC7, ASC8, ASC9, ASC10, ASC11, Olea F1, Oxana F1, Performer F1, Drofa , Drofa ,

Drofa F1, Valentino , Valentino , Valentino F1, Xenia , Xenia F1). Temperaturile ridicate

din sol (21C - 30C comparativ cu 8C - 17C) i atmosfer (23C - 31C comparativ cu 10C -

18C) sporesc gradul de infectare cu 8 - 30%.

Rezultatele tiinifice principale naintate spre susinere.

Analiza PCR-SCAR demonstreaz prezena genei Or5 la 47 dintre cele 53 genotipuri

analizate;

5

Izolarea i secvenierea fragmentului de 650 pb, asociat cu prezena genei Or5, manifest o

similaritate de 86% cu gena care codific precursorul proteinei-inhibitor al

poligalacturonazei;

Screening-ul morfologic i molecular demonstreaz o reacie diferit la nivelul sistemului

radicular afectat de ctre lupoaia colectat din sudul Republicii Moldova, date care relev c

populaia de O. cumana utilizat n cercetare este mai agresiv dect rasa E;

Utilizarea programelor bioinformatice a permis identificarea unor secvene nucleotidice i

proteine (D-fosfolipaza, glucan sintaza; metionin sintaza; glutation S-transferaza; quinon

oxidoreductaza; calcon sintaza i defensina HaDEF1) potenial implicate n reacia

nespecific de rspuns la aciunea fitoparazitului;

Spectrele SDS-PAGE la nivelul sistemului radicular i foliar se caracterizeaz prin

biosinteza timpurie (68,5; 70,3 i 111,0 kDa) i intensificarea expresiei (11,3; 12,0; 16,5;

21,0; 33,8 i 35,5 kDa) unor polipeptide pe fondal de infecie.

Implementarea rezultatelor tiinifice. Lucrarea n ansamblul ei constituie un suport de

referin n ameliorarea i cultivarea genotipurilor respective. De asemenea, reprezint un

material tiinifico - didactic n predarea cursurilor de Fiziologie vegetal, Genetic,

Ecofiziologie i Adaptabilitatea plantelor.

Aprobarea rezultatelor tiinifice. Rezultatele investigaiilor au fost prezentate i

discutate la: Conferina tiinific Internaional nvmntul superior i cercetarea piloni ai

societii bazate pe cunoatere (Chiinu, USM, 28 septembrie 2006); Conferina Internaional

a Tinerilor Cercettori dedicat aniversrii a 60 ani ai AM (Chiinu, 15 noiembrie, 2006);

Conferina Internaional a Tinerilor Cercettori, ediia VI (Chiinu, 6 - 7 noiembrie, 2008).

Cercetrile au fost realizate n cadrul proiectului instituional 06.407.026 F (AM,

Republica Moldova) i dou proiecte internaionale BPP-04-06 (CRDF/MRDA, SUA) i MERL-

1300 (CRDF/MRDA, SUA)

Publicaii la tema tezei. Rezultatele investigaiilor sunt reflectate n 12 lucrri tiinifice

(inclusiv 3 fr coautori), 5 articole n reviste recenzate, 4 n culegeri naionale i 3 n materiale

ale comunicrilor tiinifice.

Volumul i structura tezei. Rezultatele cercetrilor efectuate sunt expuse n cinci capitole

ale tezei cu volumul total de 128 pagini dactilografiate. Lucrarea conine 336 titluri bibliografice,

20 tabele, 41 figuri.

Cuvintele-cheie: Helianthus annuus L., Orobanche cumana Wallr., gazd-parazit,

rezisten, markeri moleculari.

6

CONINUTUL TEZEI

1. ASPECTE PRIVIND INTERACIUNEA GAZD-PARAZIT HELIANTHUS ANNUUS L. - OROBANCHE CUMANA WALLR.

Compartimentul conine analiza detaliat a surselor bibliografice referitor la

particularitile morfo-fiziologice i genetice de aciune a parazitului O. cumana, metodele de

combatere a lupoaiei; tipurile de rezisten i mecanismele reaciei de rspuns a plantelor la

aciunea agentului patogen; genele de rezisten la plante, etc. Datele relatate n tez

argumenteaz actualitatea studiului interaciunii gazd-parazit pe exemplul florii-soarelui i

lupoaiei.

2. OBIECTUL I METODELE DE CERCETARE

Material de studiu. n calitate de obiect de cercetare au servit 53 genotipuri de floarea-

soarelui, inclusiv trei hibrizi i liniile parentale ale acestora (Drofa, Valentino i Xenia), 11 linii

cu androsterilitate citoplasmatic (ASC1 - ASC11), ase hibrizi F1 (Olea, Oxana, Performer,

Alcazar, Favorit, Turbo,) i 27 genotipuri de perspectiv (FS1 - FS27), oferite de dr. hab.

T. Rotaru, Centrul de Cercetri tiinifice AMG-Magroselect SRL, or. Soroca.

Condiii de cultivare. Plantele de floarea-soarelui au fost cultivate n vase de vegetaie cu

capacitatea de 0,2; 1,0 i 10,0 kg, n care s-a introdus mixtura de sol (nisip : turb, v/v) uniform

infectat cu semine de lupoaie (30 - 40 mg semine la 200 g amestec) [7]. Precondiionarea

seminelor de lupoaie s-a realizat timp de 7 zile, dup care au fost plantate seminele de floarea-

soarelui, germinate preventiv n cutii Petri, timp de 2 zile. Dup 14 - 15 zile, plantulele au fost

transferate n vase cu un volum de 1,0 kg, care au fost expuse n camera de cultivare, la dou

regimuri de temperatur: I - 15C / 13C (temperatura medie atmosferic/sol); II - 28C / 25C.

Cultivarea n vase de vegetaie cu capacitatea de 10 kg a fost realizat fr precondiionare.

Tempretaura medie atmosferic n lunile aprilie iulie, 2009 a constituit 16,5; 20,5; 26,5 i

28,7 C respectiv [38].

Metode de cercetare. n scopul realizrii sarcinilor propuse s-au utilizat metode de analiz

a indicilor morfo-fiziologici [1], izolarea proteinelor sumare [2], electroforeza proteinelor n

prezena SDS [22], analiza proteinelor prin tehnologia Protein LabChip n conformitate cu

protocolul propus de productor [26], izolarea ADN-ului [14], identificarea prezenei genei Or5

prin analiza PCR - SCAR [27]. Studiul bioinformatic al secvenelor de gene s-a realizat cu

utilizarea programelor BLAST, Clustal W [35, 36], Compute pI/Mw [37]. Prelucrarea statistic

s-a efectuat n baza urmtorilor parametrilor statistici: X media aritmetic; deviaia

standard; V coeficient de variaie (%); mx eroarea mediei; Smx % eroarea total [6].

7

3. EVALUAREA FENOTIPIC A PROCESULUI DE INFECTARE CU O. CUMANA LA

DIFERITE GENOTIPURI DE FLOAREA-SOARELUI

Procesele morfo-fiziologice depind, n mare msur de reacia de rspuns a plantei la

condiiile nefavorabile ale mediului i de capacitatea de adaptare la factorii de stres. Aspectul

fenotipic al plantelor de floarea-soarelui infectate cu O. cumana reprezint ultima verig n lanul

de rspuns al plantei-gazd la aciunea patogenului i este relevant n evaluarea gradului de atac

i manifestarea rezistenei. Aciunea O. cumana este condiionat de afinitatea, agresivitatea

i virulena agentului patogen.

3.1. Dinamica dezvoltrii fitoparazitului

Rezultatele cercetrilor efectuate demonstreaz un nivel nalt de afinitate a lupoaiei

fa de planta-gazd, precum i tolerana florii-soarelui fa de agentul respectiv. Astfel,

analiza dezvoltrii ontogenetice gazd parazit, realizat n decursul a asezeci zile, precum i

studiul minuios al sistemului radicular la finalul experienei a permis evidenierea mai multor

stadii de dezvoltare a O. cumana: ataamente, tuberculi, tuberculi cu rdcini adventive, lstari

subterani i aerieni (fig. 3.1.).

Dup germinarea seminelor de lupoaie n experiene model cu exsudate radiculare

de floarea-soarelui, se formeaz un filament subire - apresorium (fig. 3.1., A), a crui

extremitate radical ader la rdcina plantei-gazd formnd ataamentele (fig. 3.1., B).

Primele ataamente au fost constatate dup 15 zile de cultivare la liniile parentale ale hibrizilor

Xenia i Valentino (cele mai multe, atestndu-se la linia matern Valentino), lipsind la

Fig. 3.1. Dezvoltarea O. cumana pe rdcinile de H. annuus: A germinarea seminei, B ataarea, C, D tuberculi, E tuberculi cu rdcini adventive i lstari

subterani, F lstari aerieni, C, G, H tuberculi necrotizai.

A

B

F

E

D

C

A B C

F E

D

G H

8

genotipurile heterozigote. Ataamentele se dezvolt i se ngroa, lund forma unui bulb -

tuberculi (fig. 3.1., C, D). Din tuberculi, n interiorul plantei-gazd cresc celule haustoriale n

form de hife, care strbat zona cortical ptrunznd n fasciculele vasculare ale plantei-gazd,

iar la exterior se dezvolt rdcini adventive i muguri (fig. 3.1., E), care se alungesc i

strbat solul ieind la suprafa, formnd tulpina florifer a parazitului (fig. 3.1., F) .

Tuberculii, inclusiv cei cu rdcini adventive au aprut iniial dup 30 zile de cultivare,

fiind constatai n numr maxim la hibridul Xenia i linia patern a hibridului Valentino.

ncepnd cu perioada de 40 zile pe radcinile genotipurilor cercetate au fost observai lstari

subterani, care prevalau la formele parentale a hibridului Valentino ( - 5,2; - 5,6 lstari

subterani/plant). Primii lstari aerieni s-au atestat la suprafaa solului la genotipul Valentino

dup 48 zile i dup 50 zile la hibridul Xenia i forma matern a acestuia.

Analiza sistemului radicular la floarea-soarelui n dinamic a relevat c genotipul patern

Xenia se caracterizeaz printr-o majorare numeric lent a lupoaiei pe parcursul ntregii perioade

de studiu. La linia matern procesul de infectare a fost mai accelerat, atestndu-se n decursul

celor 60 zile de examinare a organului subteran de la 0,17 - 15,00 ataamente/plant.

Cel mai afectat s-a dovedit a fi genotipul heterozigot Xenia, la care creterea fitoparazitului

a fost foarte rapid, numrul maxim de ataamente (23,5 ataamente/plant) fiind nregistrat

dup 40 zile de cultivare pe fon de infecie artificial. O situaie similar, a fost stabilit i n

cazul estimrii hibridului Valentino i a formelor parentale ale acestuia, unde numrul de

ataamente atinge valorile maxime (43,7 ataamente/plant) dup 50 zile.

Totodat, n dinamica dezvoltrii genotipurilor analizate, cu excepia Xenia , s-a constatat

diminuarea numeric a paraziilor pe sistemul radicular la 60 zile postinfecie, care poate fi

determinat de apariia ataamentelor de culoare brun-roietic tuberculi necrotizai (fig. 3.1.

G, H). Necrozele au fost depistate la genotipurile heterozigote (0,6 - 0,63 necroze/plant) i la

una din formele parentale a acestor hibrizi (Xenia - 0,2 necroze/plant i Valentino - 0,7

necroze/plant). Acestea reprezint o consecin a reprogramrii metabolismului n celulele

nconjurate de infecie pentru a stopa rspndirea patogenului, care duce la moartea celular

programat (rspunsul imun hipersensibil - hypersensitive response HR), date relevate i de ali

cercettori, ca reacie de rspuns a plantei-gazd la invazia parazitului [16, 21].

Pornind de la rezultatele obinute putem afirma c n perioada 15 - 60 zile din momentul

cultivrii florii-soarelui au fost atestate cele cinci faze de dezvoltare a parazitului cu nregistrarea

numrului maxim de ataamente la genotipul matern Valentino i minim la genotipul patern

Xenia.

9

3.2. Identificarea agresivitii lupoaiei la diferite genotipuri de Helianthus annuus L.

Frecvena bolii este determinat de agresivitatea lupoaiei capacitatea parazitului de

a infecta i nvinge rezistena gazdei, absorbind substanele nutritive care, ulterior, vor fi

utilizate pentru dezvoltarea i reproducerea proprie.

Analiza celor 53 de genotipuri, incluse n cercetare dup 42 zile de cultivare pe fond de

infecie artificial a scos n eviden o reacie diferit a acestora la atacul O. cumana.

Astfel, n cadrul genotipurilor de perspectiv (FS1 FS27) cea mai mare frecven de atac

(100%) s-a nregistrat la genotipurile FS14 i FS22, iar genotipurile FS9, FS12, FS17, FS21,

FS26, FS27 s-au dovedit a fi rezistente la patogen (fig. 3.2.).

La genotipurile cu androsterilitate citoplasmatic (ASC), liniile ASC3, ASC4, ASC8 i

ASC11 s-a atestat o frecven maxim a atacului, astfel nct, toate plantele cercetate au fost

infectate, avnd 6 - 10 parazii per plant, iar la unele genotipuri mai mult de 15 ataamente.

Linia ASC1 a manifestat rezisten demonstrat de lipsa ataamentelor.

Analiza sistemului radicular a formelor homo- i heterozigote a demonstrat c genotipul

matern Valentino s-a caracterizat printr-o frecven a atacului de 100%, iar hibridul Valentino a

nregistrat un numr maxim de O. cumana per plant (fig. 3.3.). Hibrizii Alcazar, Favorit i

Turbo au manifestat un grad de atac nul, confirmnd datele existente n literatura de specialitate

referitor la rezistena genotipurilor menionate [5, 28].

Fig. 3.2. Frecvena atacului la diferite genotipuri de floarea-soarelui dup ase sptmni de la cultivarea

n condiiile infectrii artificiale

1-27 genotipuri FS, 28-38 linii ASC, 39 Turbo F1, 40 Alcazar F1, 41 Favorit F1, 42 Olea F1,

43 Oxana F1, 44 Performer F1, 45 Drofa , 46 Drofa , 47 Drofa F1, 48 Valentino ,

49 Valentino , 50 Valentino F1, 51 Xenia , 52 Xenia , 53 Xenia F1

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

FS1

FS 2

FS 3

FS 4

FS 5

FS 6

FS 7

FS 8

FS 9

FS 1

0FS

11

FS 1

2FS

13

FS 1

4FS

15

FS 1

6FS

17

FS 1

8FS

19

FS 2

0FS

21

FS 2

2FS

23

FS 2

4FS

25

FS 2

6FS

27

ASC

1A

SC2

ASC

3A

SC4

ASC

5A

SC6

ASC

7A

SC8

ASC

9A

SC10

ASC

11

Tur

bo F

1A

lcaz

ar F

1Fa

vori

t F1

Ole

a F1

Oxa

na F

1Pe

rfor

mer

F1

Dro

fa

Dro

fa

Dro

fa F

1V

alen

tino

V

alen

tino

Val

enti

no F

1X

enia

X

enia

X

enia

F1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 2930 31 32 33

34 35 3637 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 5253

o

Fre

cven

a a

tacu

lui,

%

10

Generaliznd rezultatele screening-ului efectuat am constatat c n baza determinrii

frecvenei atacului cele 53 genotipuri de floarea-soarelui pot fi clasificate n patru grupe (fig.

3.4.): rezistente genotipuri cu frecvena atacului de pn la 5%, care fie posed o imunitate

absolut (n cazul n care nu se relev prezena parazitului pe parcursul creterii i dezvoltrii

acestuia) sau o imunitate relativ (se constat ataarea seminelor de lupoaie i formarea

tuberculilor ntr-un numr mic care n majoritatea cazurilor se necrotizeaz i pier n primele zile

de dezvoltare);

tolerante genotipuri cu frecvena atacului de 5 - 20%, plantele posed o imunitate

condiionat, atestndu-se germinarea, ataarea i dezvoltarea fitopatogenului, dar care nu

afecteaz drastic dezvoltarea i creterea plantei-gazd;

sensibile genotipuri cu frecvena atacului de 20 - 50% i foarte sensibile - peste 50%,

sunt lipsite complet de imunitate, fiind sever afectate, iar la un atac puternic pier.

Astfel, rezultatul evalurii demonstreaz c dintre cele 53 genotipuri investigate, zece au

manifestat rezisten (FS9, FS12, FS17, FS21, FS26, FS27, ASC1, Alcazar F1, Favorit F1, Turbo

F1), 5 au fost tolerante (FS4, FS8, FS11, ASC2, Xenia ), un genotip sensibil (FS10) i 37 -

foarte sensibile la atacul O. cumana.

3.3. Virulena fitoparazitului n sistemul Helianthus annuus L. - Orobanche cumana Wallr.

Lupoaia demonstreaz un nivel de virulen diferit, care se manifest asupra

intensitii bolii, determinnd tulburri de diferite grade ce ajung uneori pn la distrugerea

total a unor organe sau chiar a plantei n ntregime.

Intensitatea atacului la genotipurile de floarea-soarelui utilizate n studiu a variat n limitele

de 0 - 13,3 ataamente per plant i depinde de genotipul plantei (fig. 3.5.).

Fig. 3.4. Repartizarea celor 53

genotipuri de floarea-soarelui n patru

grupuri dup rezisten fa de

O. cumana (rasa E)

Fig. 3.3. Dezvoltarea fitoparazitului pe rdcinile

hibrizilor Xenia (A) i Valentino (B)

dup 42 zile din momentul cultivrii

11

Valorile cele mai mari ale intensitii atacului s-au atestat n special la genotipurile de

perspectiv (FS), comparativ cu liniile androsterile (ASC) i unele forme homo- (, ) i

heterozigote (F1).

Aciunea lupoaiei asupra gazdei poate fi foarte diferit: de la lezarea non-vizibil a

esuturilor vegetale pn la moartea plantei. ns, n general, efectele sesizabile ale intensitii

atacului la genotipurile studiate s-a manifestat prin ofilirea plantelor, nglbenirea frunzelor,

reducerea n dimensiune a organelor subterane i aeriene.

O. cumana este un rizoparazit care se ataeaz i se dezvolt nemijlocit la nivelul

sistemului radicular, afectnd dezvoltarea acestuia. Creterea i dezvoltarea parazitului a

determinat diminuarea lungimii rdcinii la majoritatea genotipurilor cercetate. Cele mai afectate

s-au dovedit a fi genotipurile FS25 i ASC9, unde s-a constatat o diferen de 67,9% fa de

martor (fig. 3.6., A). Diminuarea sistemului radicular s-a observat i la genotipurile rezistente

(37,4 - 53,0%) cu excepia genotipului FS21, la care s-a atestat o sporire a sistemului radicular cu

11,8%.

Influena lupoaiei a fost relevat i la nivelul nlimii plantelor de floarea-soarelui. Astfel,

dintre genotipurile studiate, 47 au nregistrat valori mai mici ale parametrului studiat. Stagnarea

maxim a fost atestat la genotipurile foarte sensibile FS6 (33,8%) i Drofa (36,1%). La

genotipurile tolerante indicele studiat a diminuat cu 15,5 - 23,5% (fig. 3.6., B.), cu exepia FS4 i

FS8 la care s-a observat o uoar stimulare a creterii n nlime (4,4%), acest fapt fiind

constatat i la unele genotipuri rezistente (FS4, FS17, FS21 i FS26) unde valorile obinute au

depit martorul cu 4,2 - 42,5% (fig. 3.6., C).

Fig. 3.5. Intensitatea atacului la diferite genotipuri de floarea-soarelui dup ase sptmni de la cultivarea

n condiiile infectrii artificiale.

1-27 genotipuri FS, 28-38 linii ASC, 39 Turbo F1, 40 Alcazar F1, 41 Favorit F1, 42 Olea F1,

43 Oxana F1, 44 Performer F1, 45 Drofa , 46 Drofa , 47 Drofa F1, 48 Valentino ,

49 Valentino , 50 Valentino F1, 51 Xenia , 52 Xenia , 53 Xenia F1

Nr.

de

ata

amen

te p

er p

lant

0

2

4

6

8

10

12

14

FS1

FS 2

FS 3

FS 4

FS 5

FS 6

FS 7

FS 8

FS 9

FS 1

0FS

11

FS 1

2FS

13

FS 1

4FS

15

FS 1

6FS

17

FS 1

8FS

19

FS 2

0FS

21

FS 2

2FS

23

FS 2

4FS

25

FS 2

6FS

27

ASC

1A

SC 2

ASC

3A

SC 4

ASC

5A

SC 6

ASC

7A

SC 8

ASC

9A

SC 1

0A

SC 1

1

Turb

o F1

Alc

azar

F1

Favo

rit F

1O

lea

F1O

xana

F1

Perf

orm

er

Dro

fa

Dro

fa

Dro

fa F

1V

alen

tino

V

alen

tino

Val

entin

o F1

Xen

ia

Xen

ia

Xen

ia F

1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34

35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53

12

Generaliznd rezultatele obinute, putem constata c fitoparazitul a manifestat o aciune

negativ asupra genotipurilor sensibile de H. annuus, iar afectarea celor rezistente, probabil se

datoreaz faptului c planta-gazd include unele mecanisme de rezisten pre-haustoriale i post-

haustoriale, avnd ca consecin diminuarea creterii i dezvoltrii plantelor de floarea-soarelui.

3.4. Analiza interrelaiilor gazd parazit temperatur la unele genotipuri de

Helianthus annuus L.

Starea de boal este considerat ca rezultat al raportului: plant-gazd agent patogen

mediu. Temperatura reprezint indicele cheie, care influeneaz interaciunea gazd-parazit la

floarea-soarelui [29]. Temperaturile ridicate stimuleaz germinarea seminelor de O. cumana i

respectiv contribuie la creterea nivelului de infectare, ns creterea temperaturii determin

declanarea mecanismelor de rezisten a plantei-gazd ntr-o corelaie polinom, cauznd

degradarea i moartea parazitului [15], date care ne-au determinat s modelm i s analizm

dezvoltarea patosistemului n dou regimuri de temperaturi:

experiena I a fost realizat la temperatura medie (Tm) a aerului de 15C, care a variat

ntre 10-18C i Tm a solului de 13C, cu o variaie de 8-17C;

experiena II s-a efectuat la Tm a aerului de 28C, variind de la 23-31C i Tm a solului

de 25C, variind ntre 21-30C.

Dezvoltarea ontogenetic a florii-soarelui i a parazitului a fost influenat semnificativ de

cele dou regimuri de temperatur (fig. 3.7.). Temperaturile joase, au determinat att ntrzierea

germinrii i rsririi genotipurilor de floarea-soarelui studiate, ct i apariia primei perechi de

frunze adevrate. Plantele crescute n condiiile variantei I au atins faza de 4 - 5 frunzulie

adevrate timp de 11 sptmni, n timp ce n varianta II dup 6 sptmni.

A B C

Fig. 3.6. Manifestarea aciunii O. cumana asupra dezvoltrii plantelor de

H. annuus: la genotipuri sensibile (A), tolerante (B) i rezistente (C)

13

Temperaturile joase au reinut i dezvoltarea parazitului. Astfel, n prima experien

apariia parazitului la suprafaa solului nu s-a observat pe parcursul creterii plantelor timp de 11

sptmni, fiind depistat doar pe sistemul radicular. n experiena II, lupoaia a aprut la

suprafaa solului la cea de-a 4 sptmn (dup 31 zile) la hibridul Xenia, mai trziu (dup 35

zile) - la linia patern a acestuia i la linia matern a hibridului Valentino.

S-a stabilit, c temperaturile joase rein dezvoltarea parazitului, astfel nct acesta nu

afecteaz planta-gazd, n timp ce temperaturile nalte, dimpotriv grbesc creterea i

dezvoltarea parazitului, i respectiv diminueaz valorile parametrilor morfo-fiziologici ale florii-

soarelui.

Gradul de infectare la hibrizii Xenia i Valentino la temperaturile joase i ridicate, s-a

meninut la acelai nivel, ceea ce denot o labilitate i adaptare a genotipurilor heterozigote la

condiiile mediului. Totodat, s-a constatat c Valentino F1 comparativ cu Xenia F1 a fost mai

sensibil la atacul parazitului, fiind atestate cele mai multe ataamente per plant.

Tem

per

atu

ra,

C

t aerului t solului

Nr. zilelor

Tem

per

atu

ra,

C

t aerului t solului

7 14 21 28 35 42 zile

B

A

Fig. 3.7. Regimurile de temperatur (A regimul I, B regimul II) utilizate n studiul

patosistemului H. annuus - O. cumana.

- rsrirea plantulelor, - faza de dou frunzulie,

- apariia parazitului la suprafaa solului, - faza de butonizare

7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 zile

19

17

15

13

11

9

7

5

33 31

29

27

25

23

21

19

17

15

14

4. ASPECTE GENETICO - MOLECULARE ALE REZISTENEI LA OROBANCHE

CUMANA WALLR.

Rezistena plantelor la lupoaie reprezint un proces complex multifactorial, determinat de

mecanisme de protecie specifice, strns asociate cu recunoaterea gen pentru gen R-gene

(R-resistance), precum i de mecanisme generale, sau constitutive, mediate de un numr mare de

gene minore, care sunt nespecializate, au efect individual slab i acioneaz aditiv.

4.1. Evidenierea genei Or5 n diverse genotipuri de H. annuus L.

n vederea evidenierii locusului lincat cu gena Or5 s-a utilizat markerul SCAR RTS05

cartat la distana de 5,6 cM proximal de gena rezistenei, care genereaz un produs de

amplificare de 650 pb [25].

Rezultatele reaciei PCR cu primerii specifici asupra ADN-ului genomic extras din cele 27

genotipuri de perspectiv a demonstrat prezena ampliconului cercetat la 23 dintre acestea. n

cadrul genotipurilor FS7, FS14, FS16 i FS24 s-a constatat lipsa secvenii de 650 pb (fig. 4.1.,

trecurile 1-27). Ampliconul de 650 pb a fost analizat i la 11 linii cu androsterilitate

citoplasmatic (fig. 4.1., trecurile 28-38), fiind identificat la liniile ASC1, ASC2, ASC3, ASC5,

ASC6, ASC10, printr-un profil destul de pronunat i la liniile ASC4, ASC8, ASC9, ASC11 -

mai slab. Linia ASC7 nu a demonstrat prezena ampliconului ateptat. Testarea hibriziilor la

prezena/absena locusului lincat cu gena Or5 a permis vizualizarea produsului de amplificare la

toate cele 7 genotipuri heterozigote (fig. 4.1., trecurile 39-44), iar analiza molecular a celor trei

hibrizi (Valentino, Xenia i Drofa) i formele lor parentale au pus n eviden produsul teoretic

ateptat de 650 pb la toate genotipurile heterozigote i paterne, ceea ce denot motenirea

dominant a acestuia (fig. 4.1., trecurile 45-53). La liniile materne Valentino i Xenia ampliconul

s-a evideniat foarte slab, iar la genotipul matern al hibridului Drofa markerul respectiv nu a fost

depistat.

Lipsa ampliconului 650 pb la genotipul matern Drofa, ASC7 i genotipurile de perspectiv

FS7, FS14, FS16, FS24 demonstreaz c genotipurile respective nu conin gena de rezisten la

aceast ras de lupoaie i deci sunt susceptibile. Celelalte genotipuri au fost clasate n grupul

celor rezistente.

15

Analiza comparat a rezultatelor screening-ului molecular i cel morfologic demonstreaz,

c cele 6 genotipuri susceptibile au manifestat aceiai reacie, n timp ce dintre cele 47

genotipuri, care au demonstrat prezena ampliconului 650 pb, 37 au fost afectate la nivelul

sistemului radicular de O. cumana (fig. 4.2.). Aceasta ne permite s presupunem c fitopatogenul

colectat din regiunea de Sud a Republicii Moldova reprezint o ras mai agresiv dect rasa E.

M 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 M

100

500

pb 1000

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

650 pb

12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

650 pb 650 pb

39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53

Fig. 4.1. Electroforeza produsului de amplificare cu primerul specific RTS05

M marker, 1-27 genotipuri FS, 28-38 linii ASC, 39 Turbo F1, 40 Alcazar F1, 41 Favorit F1,

42 Olea F1, 43 Oxana F1, 44 Performer F1, 45 Valentino , 46 Valentino , 47 Valentino F1,

48 Xenia , 49 Xenia , 50 Xenia F1, 51 Drofa , 52 Drofa , 53 Drofa F1

Screening-ul MORFOLOGIC

(ras necunoscut)

Screening-ul GENETIC

(rasa E)

53

genotipuri

10 Rezistente

(FS9, FS12,

FS17, FS21,

FS26, FS27,

ASC1, Alcazar

F1, Favorit F1,

Turbo F1)

5 Tolerante

(FS4, FS8, FS11, ASC2, Xenia )

32 Sensibile (FS: 1-3, 5, 6, 10, 13, 15, 18-20, 22, 23,

25; ASC: 3-6, 8-11;

Xenia: , F1; Valentino: , , F1; Drofa:

, , F1; Hibrizii: Olea, Oxana,

Performer)

6

Susceptibile (Drofa ; ASC7; FS7;

FS14; FS16; FS24)

47

Rezistente

0

Rezistente

0

Tolerante

6 Sensibile

(Drofa ; ASC7; FS7;

FS14; FS16; FS24)

Fig. 4.2. Clasificarea genotipurilor de H. annuus n rezultatul screening-ului genetic i morfologic

16

4.2. Analiza structural i funcional a ampliconului 650 pb

Secvenierea ampliconului de 650 pb i identificarea succesiunii nucleotidelor (fig. 4.3.) a

relevat o similaritate de 100% a acestora la genotipurile analizate, ceea ce denot caracterul

filogenetic conservativ al fragmentului genomic.

Analiza hrii de restricie a succesiunii nucleotidice de 650 pb a permis s constatm

prezena a 39 site-uri de restricie pentru 39 enzime de digestie, unde prima restrictaz (PpII) se

constat la cea de-a 25 nucleotid, iar ultima la a 630-a nulceotid (BccI).

Autenticitatea produsului de amplificare, obinut la cele 47 genotipuri, s-a realizat cu una

dintre enzimele identificate - Taq I (site-ul de recunoate 5' T/CGA 3'), care a permis punerea n

eviden, n rezultatul digestiei, a dou produse de restricie de 530 pb i 120 pb (fig. 4.4.),

rezultate obinute anterior i de ali cercettori [25].

Studii bioinformatice ample asupra succesiunii identificate a permis evidenierea mai

multor cadre deschise de citire - ORF posibile, ceea ce indic c secvena respectiv, ar putea

avea caracter codificator. Totodat, a fost relevat o similaritate nalt (85%) pe un nivel de

acoperire de 19% cu markerul ORS 427 de tip STS (Sequence Tagged Site ), identificat la

floarea-soarelui [32] i un grad de similaritate de 100% pe un nivel de acoperire de 17% - cu

ADN-ul plastidic.

Fig. 4.4. Electroforeza produselor de restricie la diferite genotipuri de floarea-soarelui

M marker (100-1000 pb), a amplicon, r produsele de restricie

530 pb

120 pb

650 pb

a r a r a r a r a r

M FS27 Alcazar F1 Favorit F1 Turbo F1 ASC1

500 pb

Fig. 4.3. Succesiunea nucleotidelor din produsul de amplificare cu primeri SCAR

GAGAGAGAGTGTTCTAGGGTTTCTAAAATGATTTCTCAGTAGTTGGGCCGGCGAAACCC

TCTTGGGCCGAAGCCCATTCCCGACGAAACCTCCACCTCGACGGAACCTCAAGGTTTCG

CCATGAAGATAGTGGCGAAACTCCCTAGTTTCGTCACCTAGGGTTTCGTTGAGTGACAT

GAGTTATGTTATAAGTTTACAATTCTAGATTTCCAACAATTACGTAAACATTATAACAG

TAATTAATCAATCAATAAGACAGTTTATACATCATCTAGCAAAGTGCACACAATACAAC

ATAACAGATCCTGAAAAACGCAACTAGAATACAAGTAACGTGTCGGGGAAAGACCTTG

GAAAGTCGGGTTTTCACAAATTTCATTCTTTTTATGTTTTAAATCCGTTTCATGGATTCA

AACCTTTCTTTCATACTTTTCATTCTTTTTATGTTTTGAATCTGTTTCGTGGATTCAAACA

TATCATCCATATTTTTCATTCATGCCTTTCGTTTTTACAAGTTTGATCCGTACATCAACTA

CGGATTCAAACTTTTCGTTCATGCTTTTTTTCTTATAGAATACTCTCAATTTCTTGAGAGT

CTTACAACTCCTTTCACCCACACGTCCATCTGCGACCAAAAAA

17

Asocierea acestei gene cu mecanismele moleculare ale rezistenei la lupoaie ar putea fi

determinat de similaritatea de 86% cu gena ce codific precursorul proteinei inhibitor a enzimei

poligalacturonaza (PIPG), care ar bloca poligalacturonazele secretate de parazit [11] i ar stopa

ptrunderea haustoriei printre celulele epidermale n cortexul plantei-gazd dup ataarea

O. cumana [31].

4.3. Gene implicate n rezistena nespecific a florii-soarelui la Orobanche cumana Wallr.

La floarea-soarelui se disting apte gene dominante ale rezistenei - R (Or1 - Or7) pentru

cele apte rase fiziologice ale lupoaiei (A - G), dar ntruct genomul florii-soarelui la momentul

actual nu este n totalitate secveniat este dificil de a depista secvenele acestor gene i de a

explica rolul lor funcional n mecanismele de rezisten a plantei-gazd la fitoparazitul

respectiv.

Aplicarea instrumentelor bioinformatice de cercetare i caracterizare a secvenelor ne-a

permis identificarea altor secvene nucleotidice i proteine, potenial implicate n mecanismul

rezistenei florii-soarelui fa de lupoaie. Investigarea bazelor de date NCBI (National Center for

Biotechnology Information) a scos n eviden 20 de referine la diverse succesiuni nucleotidice

(10 secvene ADN i 10 - ARNm) pentru rezisten la Orobanche (Orobanche Resistance) i

ase fragmente complete sau pariale de ARNm, pentru defensina florii-soarelui (Sunflower

Defensin). Una dintre cele mai importante secvene Orobanche Resistance poate fi considerat

proteina D- fosfolipaz, codificat de gena EF575487 cu rol n degradare a fosfolipidelor din

membrana citoplasmatic, iar mai specific dintre defensine s-a dovedit a fi secvena

polipeptidic AAM27914 (secvena ARNm AF364865), care a fost identificat ca HaDef1 cu rol

activ n mecanismul rezistenei la lupoaie.

Astfel, prin metode bioinformatice au fost evideniate unele gene nespecifice ce codific

proteinele: D-fosfolipaza, glucan sintaza; metionin sintaza; glutation S-transferaza; quinon

oxidoreductaza; calcon sintaza i defensina HaDEF1 cu diverse funcii n procesele de oxido-

reducere la nivelul membranelor biologice, implicate n mecanismul de rezisten al H. annuus la

O. cumana.

5. METABOLISMUL PROTEIC N PATOSISTEMUL

HELIANTHUS ANNUUS L. OROBANCHE CUMANA WALLR.

Conform ipotezei gen pentru gen, interaciunea gazd-parazit este determinat de genele

pentru rezisten/susceptibilitate (R/r) i cele pentru avirulen/virulen (Avr/avr). Astfel,

18

ntruct proteinele R-, direct sau indirect recunosc i interacioneaz cu elicitori specifici

sintetizai de genele de avirulen a patogenului blocnd invazia acestuia [17, 18].

Astfel, atacul patogenului afecteaz metabolismul celular al plantelor, cauznd modificri

calitative i cantitative semnificative n complexul proteic, schimbri ce reflect intensitatea

rspunsului defensiv al plantelor.

5.1. Spectrul electroforetic al polipeptidelor sistemului radicular la diverse genotipuri

de floarea-soarelui, neinfectate i infectate cu lupoaie

Rezultatele analizei a 72 spectre electroforetice ale proteinelor extrase din sistemul

radicular la ase genotipuri de floarea-soarelui cu sensibilitate diferit la atacul lupoaiei au pus n

eviden spectre individuale n funcie de reacia de aprare a plantei i durata infeciei.

Fiecare dintre etapele analizate (15, 20, 30, 40, 50, 60 zile de cultivare) s-au caracterizat

prin prezena n gel aproximativ a 30 - 40 componeni proteici cu masele moleculare cuprinse n

diapazonul 10,0 120,0 kDa.

Infecia cu O. cumana modific nesemnificativ numrul de benzi polipeptidice a

genotipurilor studiate. Dar, la diferite etape de analiz, au fost evideniate polipeptide, cantitatea

crora a variat la probele infectate, manifestndu-se prin intensificarea/diminuarea coloraiei

benzilor electroforetice. Astfel, n cadrul genotipului hibrid Xenia i formele parentale ale

acestuia, la etapele de 15 i 20 zile de la inocularea parazitului s-a constatat intensificarea

sintezei fraciilor cu Mr 16,5; 26,8; 28,5 i 36,2 kDa. ncepnd cu etapa de 30/40 zile de cultivare

pe fond infectat, intensificri vdite au fost caracteristice doar genotipului matern, la care pe

parcursul creterii n condiii de stres biotic predomin intensificarea acelorai benzi

polipeptidice - 16,5; 26,8 i 35,5 kDa cu excepia celei cu Mr 28,5 kDa (fig. 5.1.).

Spre deosebire de genotipurile homo- i heterozigote Xenia, care s-au caracterizat prin

modificri la nivel polipeptidic ncepnd cu primele zile de infectare, cele care formeaz grupul

Valentino au prezentat o reacie de sensibilitate mai mic la aciunea patogenului, acestea fiind

observate n perioada a dou de studiu (30 40 zile) i care atenueaz n intensitate deja peste

zece zile.

Intensificarea unor proteine la atacul parazitului, constatat n cercetrile noastre sunt n

acord cu datele altor cercettori privind investigarea interaciunii O. cumana cu diverse specii de

plante, care relev acumularea proteinelor asociate cu patogeneza din grupul PR (PR-

pathogenesis-related). Biosinteza accelerat a acestora fiind indus de mecanismele rezistenei

sistemice dobndite, ca rezultat al reaciei defensive generale [12].

19

De asemenea, atacul parazitului la anumite etape a determinat biosinteza timpurie

comparativ cu varianta martor a unor benzi polipeptidice (68,5; 70,3 i 111,1 kDa), acestea fiind

evideniate la etapele mai avansate att la martor, ct i la plantele cultivate pe fond de infecie.

Modificrile depistate reflect intensitatea rspunsului defensiv a genotipurilor cercetate,

demonstrnd c sinteza proteinelor de stres manifest un caracter tranzitoriu, de o intensitate mai

mare la prima treapt de infectare, direcionat spre reorganizarea metabolismului biochimic n

funcie de nivelul de rezisten a plantelor infectate.

5.2. Spectrul electroforetic al polipeptidelor din frunze

SDS - electroforeza proteinelor extrase din frunze, similar celor obinute la nivelul

sistemului radicular, a pus n eviden o diversitate molecular a componenilor proteici cu un

anumit grad de specificitate determinat att de genotip, ct i de stresul biotic. n aspect general,

spectrele electroforetice ale tuturor genotipurilor studiate au relevat prezena a 30 - 40

polipeptide n funcie de etapa de dezvoltare a plantei-gazd, repartizate ntr-un diapazon cu Mr

11 - 130 kDa. Majoritatea fraciilor au fost comune pentru ambii hibrizi i liniile parentale.

La formele parentale la anumite etape de cretere i dezvoltare s-a atestat apariia unor

componeni polipeptidici (20,0 kDa Xenia dupa 20 zile, 42,0 kDa la Xenia dup 60 zile ) i

lipsa altora (65,4 kDa Xenia dup 15 zile), cele mai multe schimbri de genul acesta fiind

nregistrate la genotipul patern al hibridului Xenia.

Plantele infectate ale hibridului Valentino, similar hibridului Xenia i formelor parentale, a

prezentat o intensificare a colorantului la majoritatea fraciilor polipeptidice (30 zile de cretere

13,4 kDa

Fig. 5.1. Spectrele polipeptidelor din rdcinile plantelor martor i infectate a hibridului

Xenia i liniilor parentale (, ) examinate peste 20 (A), 30 (B), 40 (C) i 60 (D) zile M- proteine cu masa molecular cunoscut, c control, i infectat.

21,0 kDa

12,0 kDa

35,5 kDa

68,7 kDa 76,5 kDa

B C D

c i c i c i c i c i c i c i c i c i c i c i c i

F1 F1 F1

16,5 kDa

36,2 kDa

A

M F1

kDa

68

45

25

13,4

20

pe mediu infectat). Dup 40 zile, polipeptidele cu masa molecular mica (13,6 - 20,0 kDa)

diminueaz n intensitate cu excepia fraciei 11,3 kDa care n continuare se intensific.

Impactul O. cumana asupra metabolismului proteic la nivelul sistemului foliar,

comparativ cu cel radicular este mai slab evideniat.

5.3. Polimorfismul polipeptidic asociat cu interaciunea gazd-patogen

Variaia cantitativ a anumitor componeni proteici la etapele critice de infecie, identificat

n SDS - PAGE a fost confirmat prin analize de cuantificare a componenilor, utiliznd

tehnologia - Protein LabChip.

Astfel, componentul cu Mr 28,2 kDa al crui coninut la martor (frunze, planta neinfectat)

a fost de 2327,8 ng/l s-a micorat dup infectare pn la 12,61 ng/l (185 ori) n cazul liniei

paterne a hibridului Xenia, iar fracia de Mr 58,5 kDa prezent la linia matern a aceluiai hibrid

a sczut dup infectare de la 389,79 ng/l pn la 111,9 ng/l.

Formele parentale ale hibridului Valentino au demonstrat modificri cantitative i calitative

mai atenuate n intensitate, dar a unui numr mai mare de benzi. Astfel, variabilitatea benzilor

polipeptidice la linia matern infectat n raport cu martorul este exprimat prin lipsa i prezena

unor polipeptide specifice. Aceeai tendin de variaie a coninutului i a diversitii moleculare

a fost observat i la genotipul patern infectat (fig. 5.2.).

Electroforegramele polipeptidice ale hibrizilor F1 au relevat un grad mai mare de

homeostazie fiziologic, ceea ce indic i asupra unui nivel de adaptabilitate mai nalt.

Acest tablou al variaiilor cantitative / calitative ale complexului polipeptidic care este

diferit n cadrul liniilor parentale i a acestora fa de hibrid ar putea fi rezultatul unor efecte

compensatorii asigurate de interaciuni aditive ale genelor care controleaz rezistena - fenomene

caracteristice heterozigoiei i care decurg prin diverse mecanisme biochimice i fiziologice n

funcie de norma de reacie a organismului, n cazul nostru la parazitul O. cumana.

Particularitile temporale n afectarea patternului polipeptidic la liniile parentale ale

hibridului Valentino se asociaz cu rezultatele analizei morfologice a plantelor infectate cu

lupoaie, prezentnd un grad de infecie mai nalt comparativ cu formele parentale ale hibridului

Xenia.

Astfel, putem considera, c reacia de hipersensibilitate observat la genotipurile Xenia

prin reorganizarea metabolismului proteic n primele zile de infectare pe fonul unui nivel mai

slab de afectare fenotipic a plantelor n comparaie cu cele din grupul Valentino este

21

determinat de generarea unui nivel mai nalt de rezisten fa de patogen nu numai n zona de

contact (rdcini), dar i n esuturile mai ndeprtate (partea aerian).

Generaliznd cercetrile efectuate propunem o schem ipotetic privind mecanismele

genetico-moleculare i fiziologice ce stau la baza interrelaiei H. annuus - O. cumana.

Rezistena florii-soarelui fa de lupoaie este determinat preponderent de capacitatea de a

se opune procesului de ataare a parazitului pe sistemul radicular al plantei-gazd i de penetrare

a haustorilor prin esuturile vegetale. Astfel, un aspect important n includerea mecanismului de

rezisten la nivel de perete celular ar reveni glucan sintazei (fig. 5.3.), cu funcii n sinteza

calozei i proteinei inhibitor a enzimei poligalacturonaza, care aparine familiei de proteine

bogate n resturi de leucin [19] i blocheaz degradarea poligalaturonazei - una dintre primele

enzime ce particip n degradarea peretelui celular, polipeptide identificate de noi n cadrul

polipeptidelor Orobanche Resistance.

Procese mult mai complexe au loc la nivelul membranelor biologice i sunt asociate n cea

mai mare parte cu destabilizarea/permeabilizarea acestora, determinat de formarea speciilor

reactive de oxigen - SRO [18] modificarea statutului redox celular [25] i peroxidarea lipidelor

structurale n celula gazd infectat.

Fig. 5.2. Analiza cantitativ a polipeptidelor utiliznd tehnologia Protein LabChip

la forma matern i patern a hibridului Valentino Fu intensitatea fluorescenei; *concentraia proteinei calculat la BioAnalyzer.

150,0

95,0

63,0

46,0

15,0

28,0

7,0

4,5

Valentino martor

infectat

1638,55 ng/l*

1122,7 ng/l

887,38 ng/l

62,85

ng/l 64,81 ng/l

kDa

150,0

95,0

63,0

46,0

15,0

28,0

7,0

4,5 M martor infectat

7,0

15,0

28,0

46,0

63,0

95,0

150,0

4,5 M martor infectat kDa

Valentino

783.15

martor

783,15 ng/l

infectat

91,22 ng/l

1496

ng/l 463,14

ng/l 1314,13 ng/l

500

ng/l

1638,99 ng/l*

Valentino

22

Abordnd ideea c glutation-S-transferaza, metionin sintaza i quinon oxidoreductaza, se

acumuleaz la unele plante rezistente de Arabidopsis [34] i H. annuus [20] n primele zile dup

infecie, acestea ar putea fi implicate, de rnd cu enzimele oxido-reductoare [24], n inducerea

detoxificrii SRO n cadrul mecanismelor asociate cu rezisten. Acest proces poate fi asociat i

cu activitatea D-fosfolipazei, care de rnd cu calcon sintaza, contribuie la degradarea lipidelor

i includerea lor n cile metabolice secundare, ce duc la formarea compuilor ciclici (fenolii,

fitoalexinele i acidul salicilic), care fie acioneaz direct asupra parazitului [18 30] sau induc

activarea unor factori de transcripie ai genelor asociate cu patogenez (PR proteine )[20].

Un rol mai activ n mecanismul rezistenei la lupoaie ar reveni defensinei HaDEF1,

expresia creia este indus puternic n primele zile dup ataare parazitului. Acesta

interacioneaz cu lipidele membranare specifice, determinnd astfel destabilizarea permeabilitii

membranelor int, iar fluxurile de ioni (K+, Ca

2+) cauzeaz inhibarea creterii parazitului [33].

n concluzie remarcm, c n rezultatul infectrii plantei de ctre patogenul biotrof se induc

un ir de reacii de aprare, de diferit natur, care sporesc rezistena plantelor la infectarea

curent sau ulterioar. Cunoaterea factorilor genetici de rezisten la lupoaie precum i a

mecanismelor fiziologice de protecie ar facilita eforturile amelioratorilor n obinerea formelor

mai rezistente la O. cumana.

Fig. 5.3. Schema ipotetic a proceselor asociate cu rezistena H. annuus la O. cumana

CITOPLASMA

Patogenlignificare

Canal de Ca2+

Potenial redox

Acid

salicilic

Acid

benzoic

Membrana

plasmatic

Nucleu

Peretele celular

Glutation

Ca2+

Ca2+

Ca2+

Ca2+

Activarea

genelor

apoptozei

Defensine

-fenialalanin

amonialiaza

-chalcon

sintaza

Genele-asociate cu

patogeneza

-glucanazei

-chitinazei

Activarea-tioninelor

-lipoxigenazelor

-inhibitorilor de

proteaze

Amplificarea

semnalelor-aminociclopropan

carboxilat oxidaze

Activarea genelor de

protecie-glutation

S-transferaza

-glutation peroxidaza

-peroxidaze

Activarea factorilor de transcripie

D-- fosfolipaza

Qinonreductaza

Metionin

sintaza

Glutation

S-transferaza

Glucansintaza

peroxidarea lipidelor

SRO

SRO

HaDef1

HaDef1

Transmiterea

semnalelor

Acumularea

fitoalexinelor

Acumularea

fenolilor

Chalcon sintaza

23

CONCLUZII GENERALE

1. Screening-ul fenotipic al afinitii, agresivitii i virulenei parazitului (frecvena i

intensitatea infeciei) a permis clasificarea celor 53 genotipuri de H. annuus n patru grupe

distincte: rezistente (FS9, FS12, FS17, FS21, FS26, FS27, ASC1, Alcazar F1, Favorit F1,

Turbo F1); tolerante (FS4, FS8, FS11, ASC2, Xenia ); sensibile (FS10) i foarte sensibile

(37 de genotipuri).

2. Analiza SCAR a demonstrat prezena genei Or5 la 47 dintre cele 53 genotipuri analizate.

Lipsa ampliconului de 650 pb i, respectiv, lipsa genei Or5 la genotipul matern Drofa, ASC7;

FS7; FS14; FS16; FS24 permite s presupunem c aceste genotipuri sunt susceptibile la

atacul O. cumana, rasa E.

3. Corelarea datelor privind screening-ul morfologic i molecular demonstreaz c genotipurile

lipsite de gena Or5, se claseaz ca genotipuri sensibile n testul experimental n vase de

vegetaie, iar genotipurile care conin gena Or5 manifest o reacie diferit la nivelul

evalurii acestora pe fondalul lupoaiei colectate din sudul Republicii Moldova, date care

relev c populaia de O. cumana utilizat n cercetare este mai agresiv.

4. A fost izolat i pentru prima data secveniat regiunea de 650 pb, asociat cu prezena genei

Or5 la ase genotipuri de H. annuus. S-a constatat c fragmentul respectiv manifest o

similaritate de 86% cu gena care codific precursorul proteinei-inhibitor al

poligalacturonazei.

5. Rezultatele investigrii bazelor de date au permis sa evideniem o serie de secvene

nucleotidice i proteine (D-fosfolipaza, glucan sintaza; metionin sintaza; glutation S-

transferaza; quinon oxidoreductaza; calcon sintaza i defensina HaDEF1), potenial implicate

n reacia de rspuns la aciunea fitoparazitului i s elaboram o schem ipotetic privind

mecanismul fiziologic i genetico-molecular al rezistenii H. annuus la O. cumana.

6. Spectrele SDS-PAGE la nivelul sistemului radicular i foliar au pus n eviden sinteza

timpurie a unor polipeptide (68,5; 70,3 i 111,0 kDa) i intensificarea produilor de expresie

(11, 3; 12,0; 16,5; 21,0; 33,8 i 35,5 kDa) pe fondal de infecie cu lupoaie.

RECOMANDRI PRACTICE

1. Genotipurile de perspectiv FS9, FS12, FS17, FS21, FS26, FS27 i linia androsteril ASC1,

rezistente la fitoparazitul lupoaia pot fi utilizate pentru ameliorarea floarea-soarelui.

24

2. Hibrizii rezisteni Alcazar, Favorit i Turbo de origine romn sunt recomandai de a fi

utilizate n zonele afectate de parazitul O. cumana n Republica Moldova.

BIBLIOGRAFIE:

1. Duca M., Savca E., Port A. Fiziologia vegetal. Tehnici speciale de laborator. Chiinu, 2001. 174 p.

2. Reva V., Ciobanu V., Mueller-Uri F. Strategia i tactica izolrii i purificrii proteinelor. Chiinu, 2001. 186 p.

3. Siminel V. Ameliorarea general a plantelor de cmp. Chiinu: Ed. Tipografia Central, 1998. 600 p.

4. tefan I. . a. Floarea-soarelui. Buzu: Alpha MDN, 2008. 266 p.

5. Vrnceanu A. Floarea-soarelui hibrid. Bucureti: Ed. Ceres, 2000. 520 p.

6. . . : , 1985. 351 c.

7. .

. - ., 1975. . 2.

8. . . : , 2001. 170 c.

9. Atanasova R., Batchvarova R., Christov M. Characterization of sunflower lines with different resistance to broomrape.

In: Biotechnol. And Biotechno. Eq. 2004, p. 69-74.

10. Ciuc M., Pcureanu-Joia M., Iora M. RAPD markers for polymorphism identification in parasitic weed

Orobanche cumana Wallr. In: Romanian Agricultural Research. 2004, no. 21, p. 29-32.

11. De Lorenzo G., DOvidio R., Cervone F. The role of polygalacturonase-inhibiting proteins (PGIPs) in defense

against pathogenic fungi. In: Ann. Rev. Phytopathology. 2001, vol.39, p. 313-335.

12. Dickinson M. Molecular plant pathology. In: Bios scientific publisher. 2003. 258 p.

13. Dominguez J., Melero-Vera J., Refoyo A. Virulence groups of Orobanche cernua in Andalusia (Southern

Spain). In: Advances in Parasitic Plant Research, Sixth Intern, Parasitic Weed Sym., Cordoba, Spain. 1996, p.

633-637.

14. Doyle J., Doyle J. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. In: Phytochem Bull.

1987, vol. 19, p. 11-15.

15. Eizenberg H. et al. Resistance to broomrape (Orobanche spp.) in sunflower (Helianthus annuus L.) is

temperature dependent. In: Journal of Experimental Botany. 2003, vol. 54, no. 385, p. 1305-1311.

16. Fernandez-Martinez, J. et al. Update on breeding for resistance to sunflower broomrape. In: Helia. 2008, vol.

31, no. 48, p. 73-84.

17. Flor H. Current status of the gene-for-gene concept. In: Annu. Rev. Phytopathol. 1971, vol. 9, p. 275-296.

18. Hammond-Kosack K., Jones J. Plant disease resistance genes. In: Annu. Rev Plant Physiol. Plant Mol. Biol.

1997, vol. 48, p. 2-45

19. Jones D. et al. Isolation of the tomato Cf-9 gene for resistance to Cladosprium fulvum by transposon tagging. In:

Science. 1994, vol. 266, p. 789-793.

20. Jorrn J., Prats E. Allelochemicals, phytoalexins and insect-feeding deterrents: different definitions for a family

of plant phenolic compounds, the simple 7-hydroxylated coumarins. In: Macas FA, et al. eds. Recent advances

on allelopathy. A science for the future. Cdiz: Universidad de Cadiz. 1999, p. 179-192.

21. Labrousse P. et al. Several mechanisms are involved in resistance of Helianthus to Orobanche cumana Wallr.

In: Annals of Botany. 2001, vol. 88, p. 859-868.

25

22. Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. In: Nature.

1970, vol. 227, no. 5259, p.680-685.

23. Lamb C. and Dixon R.A. The oxidative burst in plant disease resistance. In: Annu. Rev. Plant Physiol. Plant

Mol. Biol. 1997, vol. 48, p.251275.

24. Larson R. Plant defenses against oxidative stress. In: Arch. Insect. Biochem. Physiol. 1995, vol. 29, p. 175-186.

25. Lu Y. et al. Development of SCAR markers linked to broomrape Orobanche cumana Wallr. resistance gene

Or5 in sunflower. In: Theor. Appl. Genet. 2000, vol. 100, p. 625-632.

26. Kuschel M. Protein sizing and analysis using the Agilent 2100 Bioanalyzer and Protein 200 LabChip kit. In:

Agilent Technologies. 2000, no. 5988-0975EN, p. 1-8.

27. Mullis K. et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. In: Cold

Spring Harbor Symposium in Quantitative Biology. 1986, vol. 51, p. 263-273.

28. Pcureanu-Joia M. et al. The impact of the new race of broomrape (Orobanche cumana Wallr.) parasite in

sunflower crop in Romania. In: Proceeding 17th International Sunflower Conference, Cordoba, Spain. 2008, p.

225-229.

29. Sauerborn J. The influence of temperature on germination and attachment of the parasitic weed Orobanche spp.

on lentil and sunflower. In: Angewandte Botanic. 1989, vol. 63, p. 543-550.

30. Serghini K. et al. Sunflower (Helianthus annuus L.) response to broomrape (Orobanche cernua Loefl.)

parasitism: induced synthesis and excretion of 7-hydroxylated simple coumarins. In: Journal of Experimental

Botany. 2001, vol. 52, p. 2227-2234.

31. Shomer-Ilan A. Germinating seeds of the root parasite Orobanche aegyptiaca Pers. excretes enzymes with

carbohydrase activity. In: Symbiosis. 1993, vol. 15, p. 61-70.

32. Tang S. et al. Simple sequence repeat map of the sunflower genome. In: Theor. Appl. Genet. 2002, vol.105, p.

1124-1136.

33. Velasco L. et.al. Inheritance of resistance to broomrape (Orobanche cumana Wallr.) race F in a sunflower line

carrying resistance genes from wild sunflower species. In: Plant Breed. 2006, vol. 126, p. 67-71.

34. Vieira Dos Santos C. et.al. Defense gene expression analysis of Arabidopsis thaliana parasitized by Orobanche

ramosa. In: Phytopathology. 2003b, vol. 93, p. 451-457.

35. http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (vizitat 09.04.2009).

36. http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2 (vizitat 14.04.2009).

37. http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html (vizitat 09.04.2009).

38. http://www.meteo.md (vizitat 02.10.2009).

LISTA LUCRILOR TIINIFICE PUBLICATE LA TEMA TEZEI

Articole n reviste recenzate:

1. Duca M., Glijin A., Savca E., Rotaru T., Popescu V., Begu T., Antohi M. Variaia parametrilor

morfo-fiziologici la interaciunea gazd-parazit (Helianthus annuus L. - Orobanche cumana

Wallr.). n: Buletinul Academiei de tiine a Moldovei. tiinele vieii. 2007, nr. 1(301), p. 34-41.

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgihttp://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.htmlhttp://www.meteo.md/

26

2. Duca M., Lupacu V., Popescu V. Aspecte ale statutului oxido-reductor la diferite genotipuri

de floarea-soarelui atacate de lupoaie. n: Studia Universitatis. Seria tiine ale naturii. 2007, nr.7, p.

68-73.

3. Popescu V. Evaluarea gradului de infecie la unele genotipuri de floarea-soarelui (Helianthus

annuus L.) la interaciunea cu trei populaii de lupoaie (Orobanche cumana Wallr.). n: Studia

Universitatis. Seria tiine ale naturii. 2007, nr.7, p. 125-128.

4. Savca E., Popescu V., Duca M. Influena Orobanche cumana Wallr. de divers origine asupra

coninutului de acizi nucleici la floarea-soarelui. n: Studia Universitatis. Seria tiine ale naturii.

2007, nr.7, p. 147-152.

5. Duca M., Glijin A., Popescu V. Identificarea gradului de rezisten la lupoaie (rasa E) n cadrul

unor genotipuri de floarea-soarelui. n: Studia Universitatis. Seria tiine ale naturii. 2008, nr.2 (12),

p. 5-10.

6. Duca M., Port A., Brsan A., Popescu V. Aciunea lupoaiei (Orobanche cumana Wallr.) asupra

componenilor proteici la diverse genotipuri de floarea-soarelui. n: Buletinul Academiei de tiine a

Moldovei. tiinele vieii. 2008, nr. 1 (304), p. 58-67.

7. Duca M., Savca E., Popescu V. Influena temperaturii asupra indicilor morfo-fiziologici la

diferite genotipuri de floarea-soarelui n sistemul gazd-parazit. n: Buletinul Academiei de tiine a

Moldovei. tiinele vieii. 2008, nr. 3 (306), p. 30-37.

8. Duca M., Levichi A., Popescu V., Popa E. Aspecte genetico-moleculare ale rezistenei florii-

soarelui la Orobanche cumana Wallr. n: Buletinul Academiei de tiine a Moldovei. tiinele vieii.

2009, Nr. 2 (308), p. 49-57.

9. Duca M., Glijin A., Lupacu V., Rotarenco V. Screening-ul molecular al rezistenei florii-

soarelui la lupoaie (Orobanche cumana Wallr.) rasa E. n: Buletinul Academiei de tiine a

Moldovei. tiinele vieii. 2009, Nr. 3 (309), p. 81-88.

Teze ale comunicrilor tiinifie:

10. Popescu V. Genetica rezistenii florii-soarelui la Orobanche cumana Wallr. n: Conferina

tiinific internaional nvmntul superior i cercetarea-piloni ai societii bazate pe

cunoatere 28 septembrie 2006. Rezumatele comunicrilor. Chiinu, 2006, p. 291.

11. Glijin A., Popescu V., Ababii V. Aspecte morfo-fiziologice ale interaciunii gazd-parazit pe

exemplu sistemului biologic Helianthus annuus L. Orobanche cumana Wallr. n: Conferina

internaionala a Tinerilor Cercettori, dedicat aniversrii a 60 ani ai AM. Chiinu, 2006, p. 93.

12. Popescu V. Efectul temperaturii la interaciunea parazitului Orobanche cumana Wallr. cu

unele genotipuri de floarea-soarelui (Helianthus annuus L.). n: Conferinei Internaionale a Tinerilor

Cercettori, ediia VI, 6-7 noiembrie. Chiinu, 2008, p. 67.

27

ADNOTARE

Rotarenco Victoria Aspecte morfo-fiziologice i genetice de interaciune gazd-

parazit (Helianthus annuus L. - Orobanche cumana Wallr.), tez de doctor n biologie,

Chiinu, 2010. Teza include introducere, cinci capitole, concluzii generale i recomandri,

bibliografia din 336 numere, volumul total de 128 pagini, 20 tabele, 41 figuri. Rezultatele

obinute sunt publicate n 12 lucrri tiinifice.

Cuvinte cheie: Helianthus annuus L., Orobanche cumana Wallr., gazd-parazit, rezisten,

markeri moleculari.

Domeniu de studiu: 03.00.12 - Fiziologie vegetat.

Scopul prezentei lucrri const n evidenierea unor particulariti morfo-fiziologice i

genetice ce determin relaia gazd - parazit n baza sistemului model Helianthus annuus L.

Orobanche cumana Wallr.

Obiectivele de cercetare: evaluarea gradului de atac al genotipurilor de H. annuus n

condiiile infectrii artificiale cu O. cumana; studiul nivelului de rezisten fenotipic a diferitor

genotipuri de floarea-soarelui expuse aciunii parazitului; identificarea i analiza molecular a

genei Or5 la 53 genotipuri homo- i heterozigote de floarea-soarelui; evidenierea unor secvene

nucleotidice i proteice implicate n reacia de rspuns la aciunea fitoparazitului O. cumana.

Noutatea i originalitatea tiinific. S-au efectuat cercetri complexe - morfologice,

fiziologice, biochimice i genetico-moleculare asupra diferitor genotipuri de floarea-soarelui

cultivate n Republica Moldova la aciunea fitoparazitului O. cumana.

Semnificaia teoretic. Datele obinute contribuie cu noi informaii n explicarea

mecanismului de rezisten a florii-soarelui la lupoaie la nivel pre-haustorial i post-haustorial.

Valoarea aplicativ a lucrrii. n rezultatul cercetrilor s-au evideniat ase genotipuri de

perspectiv (FS9, FS12, FS17, FS21, FS26, FS27) i linia androsteril ASC1 rezistente la

fitoparazitul lupoaia, care pot fi utilizate pentru ameliorarea i selecia formelor rezistente de

floarea-soarelui.

Implementarea rezultatelor tiinifice. Lucrarea n ansamblul ei constituie un suport de

referin pentru ameliorarea plantelor i material tiinifico-didactic n predarea cursurilor de

Fiziologie vegetal, Genetic, Ecofiziologie i Adaptabilitatea plantelor.

28

ABSTRACT

Rotarenco Victoria Morpho-physiologic and genetic aspects of host-parasite

interaction (Helianthus annuus L. - Orobanche cumana Wallr.), PhD thesis in Biology,

Chiinu, 2010. The thesis consist of introduction, five chapters, conclusions and

recommendations, 336 sources of bibliography, a total of volume 128 pages, 20 tables, 41

figures. The obtained results were published in 12 scientific papers.

Key words: Helianthus annuus L., Orobanche cumana Wallr., host-parasite, resistance,

molecular markers.

Direction of investigation: 03.00.12 - Plant physiology.

Research goals. The purpose of this work was to study the morpho-physiological and

genetic aspects of host-parasite interaction, based on sunflower and broomrape.

Objectives: estimation of the degree of infection in H. annuus genotypes under artificial

infection with O. cumana; identification and molecular analysis of Or5 gene in 53 homo- and

heterozygous genotypes of sunflower; revealing some nucleotide and protein sequences which

are implicated in defense response to O. cumana.

Scientific novelty and originality. Complex studies, morphologic, physiologic and

genetic, have been carried out in different sunflower genotypes infected with broomrape.

Theoretical significance. The obtained data bring a new contribution in explication of

physiological and genetic mechanism of resistance to broomrape, at pre-haustorial and post-

haustorial level.

Applicative value of the work. Seven sunflower genotypes resistant to broomrape (FS9,

FS12, FS17, FS21, FS26, FS27 and one androsteril line ASC1) have been identified, which can

be used in further research and breeding.

Implementation of scientific results.

The results of the study represent a scientific and methodological support for teaching

courses of Plant physiology, Genetics, Ecophysiology and Plant adaptability, and also as a

theoretical tool in the creation of sunflower lines and hybrids resistant to broomrape.

29

-

- (Helianthus annuus L. - Orobanche cumana Wallr.),

, , 2010.

, , ,

336 , 128 , 20 , 41 .

12 .

: Helianthus annuus L., Orobanche cumana Wallr., -,

, .

: 03.00.12 - .

.

-

-.

:

H. annuus. O. cumana;

Or5 53- -

;

.

. -

, , -

,

.

.

-

.

.

(FS9, FS12, FS17, FS21, FS26, FS27) (ASC1),

,

.

.

- ,

, ,

,

.

30

ROTARENCO VICTORIA

ASPECTE MORFO-FIZIOLOGICE I GENETICE DE

INTERACIUNE GAZD-PARAZIT

(HELIANTHUS ANNUUS L. - OROBANCHE CUMANA WALLR.)

03.00.12. FIZIOLOGIE VEGETAL

Autoreferatul tezei de doctor n biologie

Aprobat spre tipar: 16.06.2010 Formatul hrtiei 60x84 1/16

Hrtie ofset. Tipar ofset. Tirajul 60 ex.

Coli de tipar: 1,60 Comanda nr. 337

Centrul Editorial-Poligrafic al USM

Str. Al. Mateevici 60, MD 2009, Chiinu