Filehost_Enzime Si Coenzime - Cristiana Filip

download Filehost_Enzime Si Coenzime - Cristiana Filip

of 108

Transcript of Filehost_Enzime Si Coenzime - Cristiana Filip

CRISTIANA FILIP

ENZTME$r COENZIME

't

Editurapf,ll

rAsr.2007

REFEnnrytt gTm,rT, rc r: rF'

PROF.DR.COJOCARUDUMITRU - Uniuersitatea,Al.I.Cuza" Iasi PROF.DR. NASTASIA EORGHIIA_ U.M. F. " Gr. T.pop a" ragi -GH PORF.DR.MAGDA BADESCU - IJ.M.F."Gr.T.popa" Iagi

EDtruRAtrnSoseaua Stefan Marenr. 11 lasi-7OO49g cel f el. lfax:0232-212740 e-mail :[email protected] www.pimcopy.ro EDITURA ACREDITATA CNCSIS BUCURESTI 66/01.05.2006 Descrierea CIP a Bibliotecii Na{ionalea RomAniei FILIP, CRISTIANA .I Enzime9i coenzime Filip Cristiana. Iagi : pIM, 2007 / Bibliogr. ISBN 978-973-7 16-798-9 577.15

Tehnoredactare computerizatd: Doina R6.$canu

Prefati Enzimele sunt componente esenliale ale vietii. Fdr5. ele reacliile chimice s-ar desfasura cu o viteza atAt de mici probabil, viala nu ar fi sesizabi15.. incAt, Mai mult, f5re capacitatea 1or de a discerne atat intre structuri diferite, cdt qi intre structuri asemdndtoare, in mod sigur hoasul ar fi regula. Surprinzdtor enzimele mai dau dovadd qi de capacitate de adaptare la modificirile ce intervin in mediul 1or, celular. De aceea putem, fard refinere, sI numim aceste molecule, primele molecule inteligente. Manualul de fali se doreqte a fi un material util in primul rdnd studentilor facultalii de medicinS. cAt qi celor ce studiazd biologia qi biochimia. Materialul pune accentul pe elementele de cinetic6 ertzirrraticS', a cSlor utilitate practici in proiectarea medicamentelor, este de necontestat. in p1us, cinetica enzimaticd sti la baza in{elegerii regiirii metabolismelor gi a coreldrii intermetabolice care fac posibild suslinerea vielii. Manualul face qi o prezentare a vitamineior care sunt componente coenzimatice esenlia1e. Rolul lor in activitatea enzimelor este evidenliat prin prezentared mecanismelor reacliilor la care acestea participd. Importanla cunoqterii metabolismului vitaminelor este justificatd de faptul cd deficitul lor duce la insta-larea unor afectiuni severe, caracteristice. Materialul se adreseaze deopotrivd specialigtilor ce lucreazd in laboratorul clinic, unde aproape toli parametrii biochimici sunt determinali prin metode enzimatice. Fere a avea pretenlia de a fi epuizat toate aspectele legate de tema abordati, autorul iqi exprimd speranla cd cei interesali vor gasi suficiente informalii gi rdspunsuri referitoare la acest capitol al biochimiei. in vederea exprimdrii pdrerilor critice qi a eventualeior completdri qi sugestii cu privire 1a conlinutul gi conceplia acestui la adresa de email: disponibil autorul este material, [email protected]. Autor Cristiana Filip

CI'PRINS I. DNZIME INTRODUCERE I.1. DEFINITIE I.2. NOMENCI"{TURA I.2. 1. Oxidoreductaze I.2.2. Transleraze I.2.3. Hidrolaze I.2.4. Liaze l.2.5.Immeraze 1.2.6. Ligaze sau sintetaze I.3. STRUCTURA ENZIMELOR 1.3.1.lzoenzime I.4. SPECIFICITATE I,5. MECANISME DE CATALIZA I.6. CINETICA ENZIMATICA I.6. 1. Noliuni de cinetic+ generale I.6.2. Cineticd enzimaticd I.6.2.1. Cinetica de tip Michaelis-Menten I. 6.2.2. Ecualia Uneweaver-Burk I.6.2.3. Inhibilia activit6lii enzimelor 1.6.2.3.1. Inhibitia reversibild 1.6.2.3.7.7.Inhibitia competitivd I.6.2.3.1.2. Inhibifia necompetitivd 1.6.2 .3 .2 . Inhibitia ireversibil6 I.6.3. Medicamente - inhibitori competitivi L6.4. Cinetica de tip sinusoidal I.7. REGLAREA ACTIVITATN ENZIMELOR I.7. 1. Reglarea alostericd L7. 1. 1. Structura enzimelor alosterice I.7. 1.2. Funcfionarea enzimelor alosterice activitatea enzimelor alosterice I.7. 1.3. Factorii care regleazS.

9 11 13 74 t4 74 15 18 79 2T 26 26 29 40 42 42 44 46 48 52 53J+

58

I

I.7.2. Reglarea cova.lenta I.7.3. Transformarea pro-enzimelor in enzime active I.7.4. Reglarea sintezei de enzime r.8. IMPORTANTA BTOMEDTCALA ENZTMELOR A I .8 . 1. Utilizarea enzimelor in stabilirea unui diagnostic I.8.2. Utilizarea enzimelor in scop terapeutic II. COENZIME VITAMINICE II. 1. VITAMINELE HIDROSOLUBILE [.1.1. Vitaminei Br $i coenzima tiaminpirofosfat II. 1.2. Vitamina Bz (riboflavina) 9i coenzimele flavinice II.1.3. Vitamina Ba (piridoxina) qi coenzimele derivate II.1.4. Biotina (vitamina H) qi rolul ei coenzimatic II.1.5. Vitamina pp (niacina) gi coenzimele nicotinamidice IL 1.6. Acidul pantotenic (vitamina Bx) gi coenzima A IL 1.7. Acidul derivate folic (acidul pteroifgtutamic) I qi coenzimele

60 60 ozOJ

63 68 69 70 77 72 75 77 79 81 83 85 89 90 97 96 101 105 108

II.1.8 Vitamina Brz (cobalamina) qi rolul ei coenzimatic II. 1.9. Vitamina C (acidul ascorbic, factor antiscorbutic) II. 2. VITAMINE LIPOSOLUBILE II.2.1. Vitamina A II.2.2. Vitamina D IL2.3. Vitaminele E IL2.4. Vitaminele K qi rolul lor coenzimatic Bibliogralie

I. ENZIME

INTRODUCERE Existi doud condilii fundamentai.e pentru via!d.: prima ca entitdlile vii s5. se poate multiplica qi cea de a doua ca acestea si se poatd hrdni. Nici unul din cele dou5. fenomene nu este posibil fdr5. enzime deoarece miile de procese care suslin viala ar avea loc cu viteze imperceptibile in absenla enzimelor. Enzimele au o extraordinard putere cataliticd qi o mare specificitate, mai mult capacitatea 1or catalitici poate fl reglati cu multi precizie. t biocatalizatori care maresc viteza reactiilor

I.1. DEFIMTIE Enzimele sunt

chimice care au 1oc in organism, fdrd a suferi modilicdri structurale, regS.sindu-seneschimbate 1a sfArqitul reacliei. Ele catafizeazS. doar reacliile posibile din punct termodinamic, prin micgorarea energiei de activare. Prin energie de activare se inlelege energia necesarS. unei molecule de substrat, pentru a ajunge intr-o stare inalt energeticd numitS. stare de ftanzilie, stare favorabild formdrii produsului. Energia de activare este egal5 cu diferenla dintre energia libera a reactanli1or qi energia unui compus instabil, inalt energetic ce apare in cursul formdrii produsului. Prin substrat se inlelege o moleculd sau un grup de molecule asupra cdruia actioneazd errzirna. de vedere

in reacliile chimice, pentru ca dou6 molecule sa interactioneze ele trebuie sd vind in contact (Iig. l). Nu toate ciocnirile sunt inse eficiente in sensul cd, Iie coliziunea nu are loc dupi un unghi favorabil (figl.a), fre nu este suficient de puternicd. pentru a genera produgi de reactie (fig 1.b), Este nevoie ca moleculele si aibd o anumite incircdturd energeticd incdt ciocnirea sd. fie suficient de putemice ca sa genereze produqi (fig 1,c.), cu arte cuvinte, existd o bariere energetica ce trebuie depiqitd pentru ca reactanlii se se transforme in produqi de reacfie. Aceasti barierd. energetice poarte numeie de energie de activare Si este notatd G (fig. 2).

GP@- - - - - - ) TA ( .@ i l )( ( y (,

u .8\

G\

>b)\-./

l.

+@\--l

\ ",

a r--..,

,.( A) . \ \ \_/

! ^6 [email protected]

s# aetranzltieFig.1 - In situati e a qi b ciocnir e sunt ineficiente deoarece nu duc ra produqi de reactie;'in situalia c ciocnirea a"Jr," ln"r"rrta I:t::: t la rormarea acestora "onducend

In absenla enzimelor puline molecule (uneori nici una) au suficientd energie pentru a depdgi aceasta barierd energetice qi a se tra'sforma in produgi. Deoarece viteza de reaclie este datd de numdrul de molecule de produs format in unitatea de timp, inseamna cE viteza de reac{ie in absenla enzimelor este micd. In faz1, gazoasd sau lichid5 moleculeie pot primi suficientd energie pentru a depdqi aceaste barierd energetici prin cre$terea

1

presiunii sau temperaturii

astfel ca ciocnirile dintre e1e sd devinS.

productive gi sd ducd 1aformarea de compugi. in organismele vii, moleculele nu pot primi energie in acest mod, in schimb bariera energetice poate fi micqorati astfel lncAt un numdr mai mare de molecule sd o poatd depdgi qi sd se transforme in produqi de reactie. Acest lucru este realizat prin prezenla unor "catalizatori" speciali qi anume enzimele. in consecinli, cu cat aceastd barierd energeticl va fi mai micd cu atat un numdr mai mare de molecule vor atinge starea de tranzilie, vor forma produqi de reaclie, deci viteza de reaclie va creqte (fig. 2).

Dire ctia dE darfesnrare

a reactiei

:] Fig. 2 - Varialia energiei libere funclie de direclia de desfe$urare a reacliei S)P. Graficul prezinte pe ordonate modilicdrile suferite de energia de activare in timpul reactiei iar pe abscisd schimbdrile chimice progresive suferite de substrat (rupere, formare de legaturi) in cursul transformSrii in produs. G".."r este diferenta de energie in cazul reacliei necatalizate, AG."t este diferenla de energie in cazul reacliei catalizate elfzi'lj,atic l2l.

Graficul din figura 2 prezintl, varialia energiei libere {cantitatea de energie din totalul energiei interne ce poate fl utilizat de o mo1ecul5. pentru: a forma noi legdturi in produs chimice etc.) in timpul in care conversiei este pe ordonatd

substratului

de reaclie,

reprezentate energia liber5 (G), iar pe abscisd direclia de desfS.qurarea reacliei. Energia liberd a produsului de reaclie P (G P/ este mult mai mic5. decAt cea a substratului S (G I , ca atare diferenla de energie dintre ceea ce din punct de cele doud stdri este negativd, G P - G S < 0,

8

vedere termodinamic

indicd. faptul cd reaclia se poate desfdgura in direcfia formirii produsului S) p. Altfel spus, reaclia este posibili din punct de vedere termodinamic, independent de pre?.enla oricirui catalizator. Cu toate acestea, deqi reaclia este posibild., pentru a se putea transforma in produs, substratul S trebuie mai int6i sd. atingd. starea de tranzlfie. ln aceastd stare atet reaclia directd. S)p cat gi cea inverse P)S sunt Ia fel de posibile. Diferenla de energie AG (intre energia liberi a substratului qi cea a stdrii de tranzilie), cunoscutd. ca energie de activare, reprezintd energia necesari tuturor aranjArilor gi rearanjdriior structurale pe care Ie suferd substratul pentru a se putea in produs. Ea are o valoare mare in cazul reacliei necata-lizate (AG necat). Valoarea mult mai mic5 a lui AG in cazul reactiei cataJizate de enzima (AG cat), indicd faptul ce aceasta ofera o alternativS. prin care toate aceste transformdri se fac mult mai sau uqor. Astfel prin aceasta ,,alternativd." ieaclia decurge mai rapid, fdri ca enzima s5. modifice energiile libere ale substratului sau produsuiui adicd fdr5. s5.intervind in echilibrul reactiei. Nu este obligator ca o reaclie chimicd sd decurgi" intr_o singurd etapd S)P, ci poate avea loc printr-o succesiune de reaclii secventiale (etape de reaclie) in care pot 1ua nagtere intermediari ca de ex. ES, Ep (fig. 2). Un intermediar este orice specie chimicd ce apare intr_o cale d.e reaclie cu o viald foarte scurte mai mare decat vibratia moleculard -1013 sec. Viteza unei astfel de reaclii este data de viteza etapei care necesitd cea mai mare energie de activare, cu alte cuvinte, de etapa ce decurge ce1 mai incet. Aceasti limitanti in de vitezd. concluzie viteza de reaclie este invers proporlionale cu reacfie poarta numele d.e reactie transforma

energia de activare. Enzimele nu fac al.tceva decAt sd micqoreze aceastd energie prin mecalisme speciale care insd nu influenleazd echilibrul chimic a1 reactiei.

I.2. NOMEI{CI"ATUR.A Fiecare enzimS.are dou5. denumiri: - o denumire uzualS. prin care sufixul "a25.' este ataqat denumirii substratului pe care aclioneazd, enzima (ureazd, glucozidazi) sau acliunii exercitate de aceasta (\ipazd,,peptidazdl. - o denumire sistematicd care face referire la tipui de reaclie pe cate enzrrna o cataJizeazd, qi pe baza ceruia aceasta poate fi exact Cr.' i.t-t-t':i:at.t.l)tt* u& ivQ,'ttlu-{t identificati. S"*l A elov 'f " J .: .l stabilit un sistem de clasificare zecirnal.d.care line seama de reaclia ] catlJizate gi d.enatura substratului. in acest sistem fiecare enzimi este I ia pentru-Enzi-"I

""i Uni.r.rli Internallonale de rjloc.rumle

notate cu un numer de cod format din patru cifre, numdr care permite I identificarea enzimei, a substratului asupra cdruia reactiei catalizate: - prima cifr6 a numirului reacliei catalizate. - a doua cifrd a nurpdrului de cod definegte subclasa gi se referS. la tipul grupdrii din molecula substratului enzirrra. a treia cifr5. defineqte subsubclasa qi indicl gruparea asupra cdreia ac\ioneazd. ac\ioneazd qi a 1'-/',/ ;"1' i

de cod indicd clasa qi se referd la tipul

tralsferatd sau natura acceotorului. - a patra cifri reprezinti numdrul de ordine a enzimei in

subsubclasa resoectivd.

Eab cd \ttt\ / / // s1asz subclasa \ numdr de ordine \ subsubclasa

I10

De exemplu enzima cu numdrul de cod E 1.1.1.1. este Alcool:NAD-oxidoreductaza, care catalizeazii dehidrogenarea a_lcoolului etiiic la aceta.ldehidd. Uzual se acceptd acele denumiri ce sunt in acord cu denumirea gtiinlificd ,,Alcool dehidrogenaza,, (ADH). Funclie de reacfia cata)izate, enzimele se clasiltcd in qase clase majore fiecare cu numeroase subgrupe: cataJizeazd. reacliite de oxido_ reducere; in func{ie de acceptorul de electroni se pot distinge: ). dehldrogenaze/ tedtctaze _ transfer5 electronii de la un substrat la alt substrat (altul decdt oxigenul); .2. ortgenaze - incorporeazd.direct oigenul in substrat; 3. oxtdaze - traasferd electronii de la un substrat direct la,,.4. peroxidaze - transferA

/,."t.-0,-"1'- --\ (Td:1.-d":tT:,,,

oxlgen;

acceptor.

electronii de la substrat la HzOz cat.

catalizeazd tralsferul 2 ,-q l. Transferaze de grupdri func!ionale substrat (donor) pe alt substrat (acceptor). ,E CrtransJerqze - transferd unitali d.e un atom de carbon intre substrate (exemplu: metil_transferaze) ; _ transferd gruparea ,Kamino-transferaze amlno de pe un aminoacid pe un cetoacid: .7 . kinqze - tratsfer5 un radical fosfat din ATp pe un substrat; p/.fosforilaze - transferd radicalul fosfat din fosfat anorganic (Pa) pe un substrat.--*--_ cu ajutorul apdi: -

3

4

iiaroU..

) catahzeaz|, scindarea legdturilor chimice

"g. fosJataze - indepdrteazd radicalul pOsHz_ pe un substrat; de trU. fosfodiesterq.ze - cliveazd, legdturile fosfatdiesrence, cum ar fi cele din acizii nucleici; J"'r. proted.ze _ scindeazd legdturile peptidice din proteine.

/

/'1\ -'-.

\I

ll

t aze F catalizeaze, scindarea ":tt nehidrolituce a unei grupari de'!e-6n substrat cu formarea unei duble legAturi sau fixeazd. o grupare la o dubld tegdturd.: d.ecarboxilaze _ indepltteazd, ,LX' COzde pe substrat; fo.rmeazdaldehide in reaclii de eliminare; {>":o:*.y;htaze 4e;cd\A molecule fird implicarea ATp_utui. lzom.etue _Jcatalizeazd, reacliile .pl' de interconverstune t a zomenlor oplldilleometrici qi de catend: racemaze gi epimeraze .,L{ stereoizomerilor L D; 9i 4 xt. geometrici: y6. _ cataJizeazd. interconversiunea

rl

D

transferd grupdri intre atomii aceteiaqi molecute; ::::.cts_trans-izorneraze _ interconversiunea izomerilor

b .q' ll,igaze cataJizeaza unirea a doi Tl_."1151*ge,t compugiutiri;;a- ene;gi; eriberatd prin hidrolizaunei molecure (-'_-- de ATP. r . 5,!;.4| 6, l /i )7.i. , , t {;, ,.* /.(_I.2.l. Oxldoreductaze O Reacliile de oxido_reducere sunt reaclii in care are loc un transfer de H2 sau electroni. Acest transfer este asrgurat de partea coenzimaticd. a enzimei (" structura enz. p.r7). principa.lele coenzime cu rol in oddo.,

izomerq.ze care catalizeazd reacfia de interconversie aldozd ,\ ::et9ze:

e. in multe reaclii transferul electronilor se face concomitent cu transferul protonilor (cu alte cuvlnte are loc transferul de atomi de H), astfel ce acceptarea de H/e(hidrogenarea) este echiva (tabel nr' "":;t;#*I*::o::"o*.oerea 1)' oxidoreductaze re catalizeaz-a oxidoreducerea gruprrilor: "";"-"r*^:oarea -cHz-oH; cHz-cHz_; _cH_NH2;_"n=;:

NADp*- 7e), vezi "..",:;ffi;":- ,ffiT"::il':T:r,T";i: p. acidul lipoic, citocromii, coenzimade H/e-

(dehidrogenarea) este

I12

Tabei 1: Clasificarea generald a fenomenelor de oxido_reducere funclie de elementul transferat. Element transferat Acceptare de c5.treun substrat Hz eOz reducere reducere oxidare

Cedarede cetre unsubstratoxidare

----oxiaarereducere

-.;

Enzime care ,rlucreaza" cu Hz (e-): Dehidrogenaze N-)/ Dehidrogenazele sunt enzime ce ,,scot,, hidrogenul d.e la un substrat transferdndu-l unor ,,transportori" care sunt cunoscuti sub denumirea de NAD (nicotin adenin dinucleotid) si FAD (flavin adenin dinucleotid).FAD -CH:-CH:-

IFADH2 -CH:CH,'1,. \/ NADH+H+

- CH-a r{ OH

t-

-fiH-cHro

Observafie: FAD preia cei doi atomi de hidrogen de 1a acelagi tip de atomi in timp de NAD preia cei doi atomi de hidrogen de Ia atomi diq'rili. /f /{ Reductaze

Reductazele sunt enzime ce ,introduc,, hidrogenul ia un substrat acesta fiind preluat de la un ,,transportor" care este cunoscut sub denumirea de NADpH (nicotin adenin dinucleotid fosfatlNAD|H+H+ -CH:CH-

NADP+ - CH2-CH2-

t3

Enzlme ce ,rlucreazdt' cu Oz: O, ,/ Oxldaan Oxidazele catalizeazS. reaclii in care oxigenul devine acceptor pentru hidrogenul transferat de 1a un substrat: SubstraFH o, -!!@--+ $,,s O*igetaze Oxigenazele cataTizeazd reaclii in care oxigenul este introdus la un substrat: Subsfat-H c)2 Monooxkenaza substrat-oH Hro + > + subsb:at-H o, * 1,2.2. Ttarr,sfetaze CalaJizeazereaclii1e de transfer a unor grup5ri ,,G" (altele decAt H) de la un substrat Sr la qlt substrat 52, conform reactiei: Sr-G* + Sz -----+ Sr + Sz-G Grupirile transferate por fi grupdri ce contin un singur atorn de carbon (meti1, metilen etc), resturi de aldehide, cetone, aci1, alchil, glicozil, amino, fosfat, sulfat. ducort,+ o* hexokinad t ADp + GKp Glncoz6-fosfat I.2.3, Hidrolaze Hidrolazele cataTizeazd ruperea participarea apei, dup5. reaclia: A-B + HzO -----+ AH + BOH Legaturile care pot fi desfdcute prin hidrolizd. sunt legdturile esterice, eterice, peptidice, anhidrice, legdtura peptidicd), C-X, P-N. C-N (altele decdt C-N din unor legdturi organice, cu hdF* t o = subsb:at-oH sub$rat H2O2 +

t4

Caracteristic

pentru

aceastS. clasd

de enzime este lipsa

coenzimelor. Ele necesitd prezeritraunor ioni meta1ici pentru activare. Din aceastd clasd. fac parte, in general, enzimele digestive: amilaza, Iipaza, tripsina, chimotripsina.n T'fl _HN -cH-c ll'-In{-CH-e -e o jl Pepridaza Tn Q I u -HN-CH-C-OH

t"

ll + H2N-CH-C-NHRn+1

() o

Rn+1 Rn+1

lHzol

1.2.4. Llaze Liazele sunt enzime care cataJizeazd indepdrtarea unor grupdri din molecula substratului fdrd" participarea apei, ducAnd 1a formarea unei duble legS.turi:

-c-cXY

ll

------------> x-Y include

+

)":"( ac,tioneazd asupra

enzimele legdturilor C-C, C-O, C-N, C-S, C-X. 'I

Aceastd

clasd

care

1.2,5. lzom,eraze Izomerazele sunt enzimele care caLafizeazd. interconversiunea izomerilor optici, geometrici qi de caten6.CHO |I.lL -(J|-l

'ffpz-iznrrcraza

cHroH IcH2-o-P Dftilroxiaceton-fosfrt

cH2-o-PGliceraldehil- 3-fosfi t

I

c:o I

1.2.6. Ligaze sau sintetaze Ligazele sunt enzime cate cataTizeazS- formarea de legd.turi

chimice cu consum de energie (utiIizeaz6, energia eliberate din ATP pentru realizarea noii legdturi). In acest mod se real.izeazdlegituri C-O; C-S; C-N; C-C. Ex: glutaminsintetaza catalizeazd sintetiza glutaminei:Glutanin-

Lchrtarnat + NI{4+ j\_+ ATP

chramhE ADP + Pa

15

I.3. STRUCTURA ENZIMELOR Din punct de vedere structural enzimele sunt (cu cAteva excepfii) proteine cu structura sau terliare (formate din dintr-un mai singur multe lant polipeptidic) cuaternarS. (formate

lanluri

polipeptidice sau subunitefl). Activitatea cataiiticd a enzimei depinde de integritatea sa structurali; astfel dac5. enzima este denaturat5. sau subunitalile ce o formeazd disociazi, aceasta iqi pierde capacitatea cata-1itici. Structura terfiard/ cuaternare determind o anumita aranjare gnqi spaliald care duce.la apantia ..,,, . ,,buzunar", unde se desfdsoard a4 ., t:z/,J, t.'1,. ...t^ /u(t /.,nji,Ji,,.:!tr ,".,,. reaclia caLalizatd.Acest 1oc (situs) poarte denumirea de centni activ al enzimei. Dupd unii autori centrul activ prezinte doud zone distincte $i ' , anume un situs de legare al substratului qi un situs cata-litic unde are loc cataliza propriu-zisd.. Pentru a inle1ege structura spaliald pe care o adopte centrul activ, se poate imagina mperea unei bare rigide de metal (fig. 3). O barA metalici .r se poate rupe tregand de capete in direclii

opuse, acliune in urma cdreia rezultd doud fragmente. Pentru aceasta este necesar un efort apreciabil, adicd o cantitate mare de energie. Dacd insd bara rigida este indoitd mperea acesteia se reaJizeazd cu un consum mult mai mic de energie. Prin indoire bara metalicd este adus5. intr-o stare intermediard ,,de tranzitje" din care trecerea ln cele doud fragmente separate, adicd ruperea ei se face mult mai ugor. Aceasta stare de tranzi\ie este reaLizatd de interacliile magnetice intre bard qi enzimd, interaclii care sunt de aqa naturd incAt,aduc" bara in starea de tranzilje foarte favorabild formdLriiprodusului/produqilor. Se poate deduce prin analogie ca structura centrului activ al enzimei este complementare nu neaperat cu structura substratului ci mai cur6nd cu structura stdrii de tranzi,tie prin care acesta va trece in transformarea lui in produs/produqi.

(a) Enrima nu ste plpzenti

'- -*'

^

- ,

SubsAat @ara ds metat)

-r ->

{r/tt,tStar de tanzltis Oa$ inddla)

------* ,*i*t*Prodnst (bale rupd)

{},}Enziha romplemsntarl Magneti

cu substntul

tc) Enzima complementar.e cu starea de tranzitib

m.-ffi-*_ffi.g

,

"r v tt

Dir.cria & d.sE eit.n&lilt

tbn

j,-, tl""gir ea o enzima imaginari care catalizeazd ruperea unei _^-^ qe metal (a), ^prezinte oare , ^T: aclionafld asupra ei prin forle magnetice. O structuri a enzimei complementara cu substratul il itabilizeaza p. ingreunand indoirea (b); O ""."i" enzimei complementare cu starea de tranzitiJdestabilizeaza substratul ;strucjYe.a ravorzand ruperea acestuia. Interacliile magnetice sunt cele care furnizeazd aportJ de energie necesar pentru indoire. In diafarnele alaturate-este ilustratd varialia energiei de activare in cazul unei structuri complementare cu substratul gi in cazui unei structuri complementare cu starea de t. rrri1i", i., ca.ul complementaritdlii cu s hstratul complexul ES fiind mai stabil are o energie liberd mar mica decat a -mare substratului, in consecinle necesite o energie de acdvaie mJ dec6.t acesta.[21

Acliunea enzimei asupra unui substrat presupune ma1 tntai fixarea acestuia la centrui activ, adicd formarea comptexului ES. De-a lungul timpului formarea complexului enzim6, substrat ES a fost explicatd.de doud modele: - modelul clasic (Fischer) sau modelul cheie_broascd in care centrul activ al enzimei are o structurd rigida complementari cu cea a substratului, cuplarea acestuia fdcAndu_se dupd. modelul cheie-broascd.

Acest model este pulin cAteva cazuri complementare

eficient (deqi a fost evidenliat il va fixa ferm pe

in

de catalizl. enzimaticd) cu substratul

deoarece o enzime total acesta

ingreunAndu-i transformarea ulterioari.. - modelul "centrului activ indus,, (Koshland) care postuleazd ca centrul activ al enzimei are o conformalie relativ diferiti de a Centrul activ se comportd ca o matrild flexibild care poate lega substratui intr-o formi ce reduce la maxim gradele de libertate ale acestuia, in ceea ce prive$te rotalia, translafia, fapt care favorizeazd atingerea rapidd a stdrii de tranzi\ie, Aceasta activare, observate in cazul reacliilor catalizate de enzime. Pe lAngi structura centrului activ al enzimelor, un alt aspect structural se referi la alcdtuirea 1or. Enzimele in majoritatea 1or sunt heteroproteiene, formate dintr-o parte proteicd. (alcituitd doar din lanluri polipeptidice) numite apoproteind qi o parte neproteica ce este cunoscute sub mai multe denumiri: a. b. cofactor - dacd partea neproteicd este un ion metalic; coenziml. - dacd partea neproteicd este o moteculd reprezinta interpretarea datd. scdderii energiei de substratului.

organicd sau o structura ce conline o vitamind, asociate sau nu cu un ion metalic Ai care este slab legati de partea proteica. Precursorii coenzimelor impiicate in cataliza enzimaticd sunt vitamine hidrosolubile, prezentate pe larg in capitolul ,,Coenzime vitaminice". parte prosteticd _ dacd partea neproteicd este o structurd organicd legatd ferm de partea proteice. c. indepirtarea cofactorului sau a coenzimei duce la pierderea activitS.lii enzimatice. Apoproteina este responsabilE de specificitatea enzimaticd (de acliune, dar mai ales de substrat), in timp ce partea neprotelca este implicatd direct in catalizd.

IIE

I.3.1. Izoenzime Anterior s_a afirmat cd unele

enzimeie sunt proteine cuaternare. Aceasta semnificd. faptul ce ele sunt aic5tuite din mai multe lanfuri potipeptidice (numite subunitdfi) asociate intre ele prin legaturi chimice slabe. posibiiitatea asocierii diferite a subunitdlilor duce hfiaritia unor enzime cu forme moleculare multiple numite izoenzime, IzoenzimeLe cata)izeaz,aaceeaqi reaclie chimicd. dar cu randament diferit qi au localizare tisulard. diferitdIzolarea $i evidentierea acestor izoforme se face pe baza proprietd.filor fizico_chimice diferite. Doud dintre cele mai intAlnite izoenzime in practica medicald, sunt LDH - lactat dehidrogenaza qi CK (CpK) _ creatrn kinaza (creatin fosfokinaza). LDH este un tetramer alcdtuit polipeptidice: unul de din doud tipuri de lanturi

(mu e) subunitatea s . cr l;*,linimii gi in general

lesuturilor cu metabolism aerob, iar subunitatea M (muscle) este caracteristicd muqchiului scheletic Ai_ in general organelor gi fesuturilor cu metaboiism anaerob (excepfie fac ficatul gi eritrocitul). Cele doud tipuri de subunitdli se asociazd cate patru pentru a forma un tetramer ducAnd la aparitia a 5 izoenzime: LDHI LDHZ LDHS LDH+ LDHs - HHH H ) cre$te in infarctul de miocard .HHHM -HHMM -HMMM -MMMM

j',r",I ;""::.::,:l "ti "l ":::"L::

"

) creqte in afectarehepaticA CK este un dimer alcdtuit din doud tipuri de lanluri : unul de tip B (brain) cel de ai doilea de tip M (muscle). Subunitatea de tip B este specificd creierului, cea d.e tip M, muqchiului. Cele doui subunitdli se asociazd. diferit pentru a forma un dimer d6nd naqtere Ia 3 izoenzime.

CKr - BB CKz CKs - MB ) creqte in infarct in primele 6-24 ore. - MM gi funclionale

Se evidentiazd astfel importanfa cunoagterii particularitililor structurale aJe izoenzimelor in stabilirea cu acuratete a sunt asociate in aqa-numite compiexe unui diagnostic. Uneori enzimele

multienzimatice in care enzimele individuale sunt fixate prin Iegdturi slabe pe o proteind. central5, intr-o ordine ce corespunde intrdrii 1or in actiune. Aceaste organizare are ca scop transferul eficient al produqilor de reaclie ai unei enzime la enzima urmetoare, evit6ldu-se pierderile qi imprimAnd procesului o anumiti itezl. IJn exemplu de complex multienzimatic il constituie piruvat dehidrogenaza (pDH), care cataJizeazd, decarboxilarea oxidativd a acidului piruvic, compus ,cheie" in metabolismul glucidic.

I.4. SPECIFICITATE

slfff citatea enzi\:*ic5'^W# dea W#g ?9&7tr\vtft.erzirr5:1ordeosebi intre structuri' diferite. De aceasta ,,capacitate" este responsabild partea proteica a enzimei $i anume apoenzima. Specificitatea enzimelor se poate manipsta_..in trei variante principale: specificitate de reaclie, de substrat (i opti"a) t '-.-.' /lSfspecificitertea de reactie - denotd fapliiT-cd o enzima este ,,corJceputd" sE catalizeze un singur tip de reaclie. pornind de la aceasta treseturd s-a fhcut clasificarea enzimelor in cele qase grupe enzimatice.

fuffipecificitatea prezinta: Jt( "/4

de substrat - care funclie de aria de actriune

specificitateabsolute;specificitate absoluti de grup; specificitate relativd de grup;

I20

Unele enzime actioneaze numai asupra unui singur substrat, catalizdrrd o singurd. reactie, de exemplu uteaza: HrNJ-NH, + H2o-l&33L* 2NH3 + Co2

a) Speclficiteteq

absolutd.

Aceasta enzimd este total inactivi fa{d. de compuQi foarte asemdndtori structural _ tiourea HzN_CS_NHz. De asemenea, arglnaza - enzima care cateJizea2d hidroliza L_argininei la uree gi ornitind nu poate cataliza hidroliza esterului metilic al argininei sau scindarea agmatinei, amina rezultati prin decarboxilarea argininei.HN-CH2 I

-CH2-CH2-CH-COO" NH:

**0,,-

f H: c:o I NHz Uree

NHz Arginind

I

H2N-CH-CH2-{H2-cH rl + COOH rus^

d.e grup - prezt.te enzimere ce catalizeaz1. acelasi tip de reaclie asupra unui numdr restrens de substrate apropiate ca structura chimicd. fac pa_rte gJicozid,azele qi succin_ dehidrogenaza (sDH). sDH catarizeazd. reaclia de trecere a acidurui succinic 1a fumarat, dar cu aproximativ aceeagi vfteze qi dehidrogenarea acizilor L-metil_succinic, L-etil_succinic qi L_clor_ succinic. Hooc -cH2 -cHz-cooHAcil succinb

b)

specilrcitatea

atsotuti.

Din

aceaste

categorie

srcch-d"hid.ogenara'' Hooc _cH:cH_cooHAcid fumarb

de grap - prezlnte enzimele ce catalizeazd. acelaqi tip de reacfie asupra unui numAr relativ mare d.e substrate apropiate ca structura chimicd. Din acest grup fac parte ligazele sau esterazele care fac posibild scindarea mono-, di- trigriceridelor gi chiar arli esten cu structure chimicd mult mai compricata. Enzimeie proteoritice care hidrorizeazi

cl

specificitatea

rerqtrod

Iegdturile peptidice din proteine qi din alti compuqi neproteici, fac parte tot din acest grup. 3) Specificitate opticd sau stereochimicd. Este foarte rdspdnditd dat frind fapful c5. majoritatea substratelor au carboni asimetrici deci se gdsesc sub forma de stereoizomeri. Enzimele catalizeazd transformarea numai a unui stereoizomer (specificitatea opticS. este de obicei absoluti) neputAnd fi prelucrat celAlalt antipod optic de enzima. De exemplu, L-serin-hidroliaza

catalizeazd,numai dezaminarea L-serinei la piruvat, nu gi a D-serinei:

i l_*r, fH'?-oH _I* fH-NH, f cooH H2O COOHLserina

CH,

_i:\H

9H, t\l cooH

Hzo

pHs

\

- l:oNH2cooHAcil piruvi:

Enzimele care recunosc prezirrtd.specificitate geometricd. Ftmaraza,

substrate

cu

izomerie geometrici

de exemplu, permite hidratarea acidului fumaric

(izomer trans) gi nu a aciduhli maleic {izomer cis) cu formarea acidului malic ca orodus final:H Funwaza -

HOOc--c:g-cooHI H Acid turnrt

-H p :H o o c-

cH-cH2-cooH OHAcil malic

I.s. MEcANIsMEDE cATALIZA

dl u

'' "' ')'

AtAt specificitatea cAt gi cataliza p.esupun complexului enzima-substrat ES.

(, stabilirea unor

' "' t '

I 6

leg5.turi intre enzimd gi substrat ce duc la formarea temporare a Formarea acestor legaturi tg1rrp_o,lqlg(mai mult sau mai pulin

extragerea lgqq"g"" miqc5rii libere a sub_stratului, 1ui din mediul apos etc. Cumulate toate aceste interacfii imprimd substratului o forma corespunzitoare stdrii de tranzitie si oferd

slabe) are ca scop

-

Odate substatul fixat, asupra lui ,,incep" sd acfioneze gruperi funclionale pozitionate adecvat, care permit ruperea sau formarea unor legdturi, printr_o varietate d.e mecanisme: mecanisme acido-bazice gi/sau covalente, mecanisme de tensionare a substratului, mecanisme bazate pe efecte entropice etc. S-a observat ci in cursul catalizei o enzimE. utllizeazd, de reguid mai multe mecaaisme simultarr. Grupdrile funclionale ce participd. la aceste mecanisme sunt: - aminoacizi din lanful polipeptidic; - compu$i organici (coenzime)/ qi ioni metalici: - ioni metalici. Dintre toate aceste mecanisme va fi prezentate cataliza ce se desfdqoard prin mecanism acido-bazic qi catalizd covalentd. cataliza acido-bazicd 4, rn acest tip de catalizd sun{ implicate gruped functionale cu caracter de acid sau bazd slaba, care 1a pH fiziologic pot ceda/primi un H+. in acest tip de reaclie iau naqtere intermediari instabili cu sarcina electricd. Cel mai intA_lnit aminoacid, care ia pH frziologic poate funcliona sub forma perechii acid.-bazdconjugatd. este histidina, care are pKn = 6 $i a carei comportare este prezentata mai jos: -NH-CH-COCH, tHN /.N:+H+_H+

energia necesare catafizei p.oprilr-ri"".

-NH-fH-co-

__J",nrSr-Hzl

Ptn=o tslo a

n t_'44

Cataliza covalentd

ln acest tip de catalizd grup5rile funclionale ale centrului activ aI enzimei atacd nucleofil (in majoritatea cazurilor) sau electrofil (mai ra-r) substratul, ducAnd Ia formarea, intr_o secvenld. de reaclii, unui

intermediar legat covalent de enzimS. Acest intermediar covalent este mult mai labil dec6.tsubstratul inilial. Un mecanism de catalizl enzima.ucd, in care sunt utilizate atAt mecanisme acido-bazice cat $i covalente, il reprezinti nrperea legdturii peptidice sub acliunea chimotripsinei in urma cdreia rezultd. aminoacizii formatori.

-HN-CH-C-!I\-CH-C

ho r

ptl -

H2o

HN-CH-C-oH

S.P r

a+ Ii2N-CH-C-NH I Rn+1

Rn+1

I

Procesul are loc prin combinarea a doud tipuri de catalizd, in cursul reactiei luAnd naqtere at6.t intermediari instabili cu sarcind electricd cAt qi intermediari fixati covalent de enzimd. Centrul activ al enzimei prezintA o triade cataliticd a_lcdtuitd din trei aminoacizi qi anume Asptoz, Hyssz, gsltes.'t

Ser 10i

*o)

Fig.4 - Centrul catalitic al chimotripsinei evidenfiazd pozitionarea aminoacizilor Asp, Hys si ser astfel incat sd lie posibil transferul de protoni fiinia punctate) [6].

CAnd un substrat, care conline legetura peptidicd, se leag[ la centrul activ al chimotripsinei, are loc o uqoard modificare conformalionald care comprimd legatura de hidrogen dintre Hyssz qi Argtoz ducdnd Ia aparilia unei legdturi mai puternice. Aceasta interaclie cre$te pK.-ul Hyssz de 1a valoarea 7 (la histidina liberd) la valoarea 12, permi!6:nd histidinei sd.-gi accentue ze caracterul bazic incat ea devine capabil5 sE atragd protonul aparlinAnd gupdrii hidroxil de Ia Sertes. Deprotonarea imprimd Serles un caracter nucleofil puternic; are loc atacul grupdrii carbonil a substratului, atac in urma cS.ruia se formeazd un intermediar scurte, cu sarcinS.negative. Instabilitatea compusului incarcat cu viatd foarte

negativ

duce

ia

rearanjarea qi formarea unei duble legdturi intre carbon qi oxigen, care dezlocuieqte legd.tura dintre* carbon gi gruparea amino a legiturii peptidice, ducAnd la ruferea acesteia. Gruparea amino este protonate de Hyssz,uqurAndu-i_se astfel indepdrtarea. in aceastd etapa ia naqterea un intermediar legat prin legaturi estericd de enzima, denumit intermediar acil-enzimd. in etapa urmitoare o moleculi de apd este deprotonatd prin mecanism acido-bazic ducAnd la generarea unei grupdri hidroxil cu carater puternic nucleofil. Aceasta atac6 legitura estericd a acil_ enzimei generd.nd un nou intermediar cu sarcind negativi, cu viatd foarte scurt6. Instabilitatea acestuia produce rearanjari care duc la indepirtarea de reacfie, ce contine gruparea carboxil si la protonarea g91r9s regenerarea enzimei. gu produsului

25

Rr.6 Ltirtrtr | rotLld I

-'

t

\/

'*io.

YE])

r*-r'ui^i:

t"

t- s.,'

Fig.s . - Mecairismul detaliat aI reacti, ei catalizate de chimotripsin6. Chimotripsina peptidice la gruparea COOH a cale.Jj?.earA hidroliza legiturii aminoaciZilor. cu radicali aromatici (a). Pe parcursd catalizei se fornieazd in urma transferului unui proton (c), compugi instabili cu sarcina electricd. (d), iar in ufma ruperii legiturii peptidice Si eliberErii po4iunii ce confine gruparea amino, compuQi intermediari legafi covalent (e). Atacul nucleofil af apei (f) genefeaza um nou compus cu sarcine electrice foarte instabil (g), a cErui rupere va elibera o po4iune de la:rt polipeptidic ce contine gruparea carboxil (h) Qi va regenera enzima (i). [6]

26

I.6. CINETICA ENZIMATICA I.6.1. Notiuni de cinetlci generali Cinetica studiazd viteza cu care se desfdqoari diferite fenomene, inclusiv reacliile chimice. Cinetica enzimaticd studiaza viteza reacliilor desfdqoard in organism gi factorii care o influenfeazd. Principiile generale ale cineticii enunld chimice ce se

1egile care permit

calculul vitezei de reaclie in diferite reaclii chimice: 1. presupunAnd o reaclie chimicd ce are loc intr_o singure etape in care este implicat un singur substrat qi care este ireversibild (vezi exemplul barei rigide pC. 16),

S-Pviteza de reaclie este datd de cantitatea de reactant [A] consumate in unitatea de timp (semnul indicd consumul "_,, reactivului) sau cantitatea de produs [p] formatd in unitatea de timp. v=. dar unde: K= constanta de vitezi. dependentd de natura reactaltului condiliile de reactie. [A] = concentralia reactantului [P] = concentralia produsului Unitatea de mdsurd Jrenrnr. M I si de dtAt dtAldt

= dlPldt

V-tAl-V-klAl

semnificalia acestei loislan,l-t;*-"9

indicAnd ,,caltitatea" de timp necesard. transformarii unei ,.unitdti",.

"t""r'rr"i

rrit"r" unitare

Aceastd constantdestestrict specilicd fiec5reimotecut.,ffol"kllA

de natura

gi tiria

legdturilor

ce urmeaz6- a suferi tralsformiri

qi

dependentd de condiliile de reaclie (T, pH, tdrie ionicd., presiune). Pentru a intelege semnificalia constantei de vitezi. K, linAnd cont de expresia ei matematicd (sec-l), vom compara rlrperea unei bare de metal cu ruperea unei bare de material plastic. Ruperea unei bare de meta-l necesitd un timp (exprimat in secunde) mai mare decAt necesitd mperea unei bare de material plastic. Constanta de vitezd, fiind datd. de raportul l/sec, va avea valoare mai micd. in cazul barei de metal decdt in cazul barei de material plastic. Cu a_ltecuvinte viteza unitari pentru ruperea unei bare metalice este mai micd decAt viteza unitard pentru ruperea barei de material plastic. Se evidentiazd faptul cE structura dicteazi, merimea specificd a acestei constante, ce reprezintd viteza unitare, pentru fiecare compus in parte. 2. s5. presupunem o reaclie bimoleculard {vezi exemolul ciocnirii a doud molecule, p. 6) A+B---+ + Q P in mod analog viteza de reaclie este datd de cantitatea de reactivi consumatd in unitatea de timp sau de cantitatea de produsi de reactie formatd in unitatea de timp: rdnl v_ _ [d Al _ _ ldB l _ IdP l =-dt dt - dr -v-tAl.tBl-+V=ktAl.fBl in care : K = constanta de vitez6, dependentd de natura reactantilor si de conditiile de reactie [n] qi [e] = concentraliile reactangilor tpl Si tQl = concentraliile produqilor Unitatea de mdsurS.pentru M .I

Reaclii cu

-,.- _

_.".,

simultand a trei molecule fenomen relativ rar intalnit qi mult mai greu de definit din punct de vedere matematic.

-",.",,-;;;;";il';r:

ll";J0,i",o""

ciocnirea

Dacd se reprezintd. grafrc veiiiafia cantitd.tii de produs format in funcfie de timp se obline o curbd ce prezirrtd o porliune rectilinie (cu panta constante) care apoi se inclind qi in frnal se aplatizeazd (frg.6).

\J !,tuuJ A t u.A {tr'61 . L + t t s W c & C c _ .

Qa-ff

Fig. 6 - Variatia cantiteui de produs format funcfie de timp. Viteza de reaclie, date de dP/dt (care este tangenta la curbd, tgo,), nu este constante pe tot parcursuJ procesului, fapt evidenliat de modificarea targentei la curba (oo*or).

Din punct de vedere matematic tangenta in orice punct aI curbei data de relatia tg c = dP/dt va reprezenta irteza de reacfie, conform relaliei V = dP/dt. Portiunea liniarS. a curbei permite calcularea vitezei reale a procesului (numitd dupd unii autori viteza actuala, dupi ailii viteza Vo) atunci cAnd orice cantitate de reactant se transformi integral in produs, cAnd nu existd. reaclii reversibile, cAnd nu existd impiedicdri sterice generatg {e 4cumularea de prod.gs etc. pe mesure inilial5

cecantitatea ,"""t""t*To* a"Datoritd faptului

il,iA^i Hffi*.k"'o.oo,r"

rormatd se

micqoreazS.qi viteza procesului scade. c6. viteza nu este aceeaqi pe tot parcursul procesului, este indicatd determinarea ei in primele secunde/minute ale procesului gi anume mdsurarea aqa-numitei viteze iniliale ve . in reacliile enzimatice activitatea unei enzime este apreciata funclie de cantitatea de produs formatd in unitatea de timp, prin urmare activitatea enzimatici este similard vitezei de reactie.

Activitatea enzimatica se exprime in: >::>2)/1J.I (unitdli internalionale) 1 Unitate Internafionali. reprezintl, cantitatea de enzimd. ce catalizeazl. tra-nsformarea unui pM de substrat/min in condilii standardizate pentru fiecare enzimd (temperaturd, pH optim etc.). - 7kat. reprezintd cantitatea de enzimi -=- )-Katal transformarea unui mo1 de substrat/sec. maxime. Kcat este numdrul ce catafizeazd.

2=. 3) Turnover - IG"t reprezintd o mesurd a activitdlii de molecule de

cata_litice

substrat transformat pe moleculd de enzimd qi in unitatea de timp cAnd enzima este saturate cu substrat. T\rrnoverul reprezintd. deci activitatea moleculard a enzimei. L6.2. Cinetica etrzimatici Conceptul de bazE al cineticii enzimatice consideri c6 formarea produsului de reac{ie este condilionatd. de formarea in prealabil a complexului enzima substrat ES, concept redat de relatia:l

g .1,_ 5

___j_

gS _

E + p

Factorii care influenfeaz1. iteza de reaclie sunt, dupd cum se observS. din relalia de mai sus, concentralia substratului, concentralia enzimei la care se adaugd parametri ca temperatura qi pH_u1, la care se desfEgoardreaclia. a) Influenta pH-ului asupra actlvitegl enzimatice Varialiile de pH pot avea efecte atdt la nivelul enzimei, cat qi la nivelul substratului. Astfel, se poate modifica gradul de ionizare a unor grupdri funclionale de pe enzimi, a cdror sarcind (pozitivd sau negativS.)este necesard fie formdrii complexului enzimi._substrat, fie menlinerii conformaliei tridimensionate native a protein_enzimei, fie activitefli catalitjce propriu-zise (fig. 7). De asemenea, pH_ul mediului poate modifica gradul de iorizare al substratului, impiedicAnd sau

30

favorizAnd formarea complexului enzimd-substrat. Valoarea pH_ului 1a care reaclia enzimaticd se desfdqoara.cu vitezd maximd se numeste pH optim.

Influenla pH-ului asupra activitdlii enzimei. Structurile in care - .Itg 1gruparile bazice qi cele acide sunt fie ambele protonate, fie ambete neprotonate n,-i corespund ioniziri.i necesare activitSlii enzimatice. Intervalul de actlvitate al enzimei este cel in care formele bazice s tgttt Ptotott"te iar cele acide neprotonate' adica pHul optim este cuprins intre 6 gi

Figura 7 prezinti varialia activitdlii enzimatice a unei enzime lpotetice, funcfie de pH, pentru care ionizarea reziduurilor din centru activ este esenliale pentru catalizd. Cu alte cuvinte pentru ca enzima sd fie functionald centrul activ trebuie sd prezinte grLlparea bazici {B) in forma protonata (BH+), iar cea acidd (A) in formd neprotonate (A ); pK-ul formei bazice este 8; pK-ul formei acide este 6. La pH 7 in jur de 9Oo/o ambele grupe (A si B) sunt prezente din in formd activd., pe mdsurd ce pH-ul scade sau cregte, una sau a-1tadin cele doud. forme trece progresiv in forma inactivd. Cu alte cuvinte pentru enzima de fald pH-ul optim este situat in jurul valorii 7. pH_ul optlm pentru cele mai multe enzime are valori cuprinse intre 6_ g.

}cepfie r . 5 - i 0) . b)

fac enzimele digestive, pepsina (pH = 1,5-2), arginaza (pH = Influenta temperaturii asupra activitifii

enzimatice

Influenla temperaturii asupra activitdfii enzimatice derivi. din ::rtul ce odate cu cregterea temperaturii cre$te agitalia termicd gi prin '::=rare gi viteza de reactie. Peste o anumite temperaturd. enzimele ::r-in instabile qi ca urmare a denatur5rii iqi pierd activitatea intr-un :::erva.1foarte ingust de temperaturS.. Temperatura optimd a enzimelor -: organismele superioare nu depS.qeqte4OoC; eistd insd bacterii ::-nofile a ciror enzime prenntE- activitate optimd 1a 10OoC.

0.8 EiJ- -

0.4

0.0 0 Temperaturd("()

f,nzimi denaturata

Fig.S - Influenla temperaturii asupra activitelii enzimei. Structura enzimei este menlinute intre anumite limite de temperature bana in jur de 4OoC) dupa care cre$terea agitaliei termice favoizeazd denaturarea. Aceasta cauzeazd distrueerea aranjarii spatiale esentiale pentru capacitatea catajitice a enzimei J3l.

cl enzimatice

Influen{a

cantitilii

de

enzimi

asupra

acti\rititii

influenla

concentraliei

enzimei asupra activitdlii

enzimatice

derivd din faptul cd odate cu mdrirea cantitelii de enzimd se md,reste

cantitatea de complex ES gi deci cantitatea de produs formatd, prin urrnare iteza de reactie cre$te. Spre exemplu, sub actiunea unei enzime, intr_un preparat biologic se formeazd X mg de produs p intr_un timp dat. Daca, repetandu-se experimentul, cu acelasi preparat, in acelaqi interval de timp, se formeazd.o cantitate de doud. ori mai mare de produs 2X mg p, inseamna cd in a doua situalie cantitatea de enzimd, care catafizeazdformarea de produs p, a fost de doud ori mai mare (fig.9). Proporlionalitatea dintre viteza de reaclie si cantitatea de enzimi are importanld practic5., deoarece permite determinarea concentraliei enzimelor din preparate biologice, determinare utili in diagnosticarea unor stari patologice.

Fig.g - Cinetica unei rea4ii enzimatice in prezen a unor concentratii crescetoare de enzimd. Addusarea, ra o cantitate n*a d" a unor cantita! crescdtoare de enzima Es r E2 , Er duce 1a f"r*;;" ",ruJi."t, il;iitaii crescetoare de produs P3> Pr > Pr, in acelaqiinterval de timp,

dl enzimatice

Influenla

concentratiei

substratului

asupra activititii

Dacd in organism cantitatea d.e enzimd (cu exceplia enzimelor inductibile) poate fi consideratd relativ constanta, concentralia substratelor variaze inse in fimite foarte largi. De aceea se poate afirma

-:-::

cu relative corectitudine ce viteza reactiei enzimatice depinde 1n principal de concentralia substratului. Dupd felul in care enzimele iqi modifici activitatea Ia in cregterea/scdderea cantitelii de substrat, acestea pot fr impirfite doud mari grupe: ce z.t/. - enzir.rre respectd cinetica Michaeiis -Menten; 4. - enzirne ce prezinte o activitate sinusoidalS., a$a numitele-1 enzime alostericel,ff, 't-.2,/t

Comportarea diferitd a enzimelor qi diferenfele dintre cele doud categorii, vor fi prezentate pe laig in cele ce urmeazd. 1.6,2,1. Cinetlca de tip Michaelis-Menten Michaelis substratului $i Menten au studiat enzimatice influenla realizAld concentratiei urmitorul

asupra

activitefli

experiment: la o ca,ntitate constanta de enzimd au addugat cantitali crescatoare de substrat $i au inregistrat vitezele de reaclie mesurate. Cu datele oblinute au trasat un grafic in care pe abscisd sunt trecute concentraliile de substrat iar pe ordonatd vitezele de reaclie corespunzatoare (figura 10).

':l i-

[5] {mN)

Fig.10 - Variatia vitezei de reaclie, functie de concentratia substratului

34

AnalizAnd acest grafic se desprind urmdtoarele concluzii: concenttalii mici de substrat viteza este direct proporfionald ,!l7a cu concentratia acestuia (porfiunea liniard a curbei); '2f ra concentralii crescute de substrat viteza devine independenta de concentralia acestuia, adicd oricAt substrat am ad5uga viteza de reaclie nu mai cregte gi devine egald. cu viteza maximd (Vmax);

platoului indicd existenla fenomenului de saturatie adicd )faparilia indici o capacitate limitatd. a enzimei de a fixa substraful, irecAt oricdt substrat am adduga nu mai existd. centre active disponibile care sA-l accepte pentru prelucrare ulterioard. De aici concluzia este precedata obtgator de formarea unui complex intre enzimi" Si substrat si anume ES. pe grafic se poate determina jumdtate din viteza maximd. adicd Ymax/2; acestei viteze ii corespunde o concentratie de substrat cunoscute drept constanta |-Iichaelis_Menten (Km). Altfel spus Km reprezintd o concentratie de substrat pentru care viteza ;reactiei este egald"cu Vmax/ 2. nn aa informafii asupra afinitdtii enzimei pentru substrat: 14 astfel valori mari ale Km-ului indicd o alinitate scdzuti pentru substrat in timp ce valori mici ale Km_ului indicd o a-finitate crescuta pentru substrat. Acest lucru este vizibil din grafic unde enzima 1 are un Krnl (valoare micd), ceea ce indicd. faptul cd are nevoie de o cantitate micd de subshat pentru a atinge Vmax/2, in timp ce enzima 2 are nevoie de o cantitate mai mare de substrat pentru a atinge acelagi randament adicd. Vmax/2. Km are valori cuprinse intre 10-6 - t0rM. M cd formarea produsului

6fu'#j'u' 1l,U '-i.\'t n ltt lr2 k JJMichaelis gi Menten au stabilit o .et"iie matematica care exprimS" varialia vitezei de reaclie funclie de concentratia de substrat.E+ S--

KrK2

+

ES ----i-----+

K,

F . D ;-'

(1)

Conceptul de bazd al cineticii enzimatice (1) postuleazS. cd :eac{ia de formarea a produsului este una ireversibilS.. Viteza de ibrmare a acestuia este data de dP/dt (cantitatea de produs formatS. in 'rritatea de timp) care este insi proporlionale cu cantitatea de complex 'ESl. Aitfel spus viteza inilialn Vo $ezi p. 28\ este egale cu produsul dintre K: 9i concentralia complexului ES, produsul formAndu-se atAt iimp cat se formeazd complexul ES. V = dP/dt- [ES] adiaaV - [ES] deciVo = K3[ES1 Q)

I

aIt

e a

Complexul ES reprezintd o stare in care probabilitatea formdrii produsului este egali cu probabilitatea revenirii la compugii iniliali E respectiv S. De aceea concentralia reald a complexului [ES] este care se stabileqte intre reaclia de formare a

5 rtls a

dictate de raportul

complexului gi reaclii1e in care acesta se consume, atAt prin reaclia reversibild cAt gi prin trecerea in produs de reaclie: 1) reaclia de formare a complexului este dati de:Vlo.r*," = K1[E]. [S]

(3)

b1 at2\

I

reaclia de disfaritie

a complexului [ES] (4)

teL1 de

= Vde disparitiecauza6de reacda reversibila Kz[ES]

Vde dispariliecauza6de trecerea p.o6u, = K3IESJ (5) in Din punct de vedere strict matematic cantitatea de enzima E nu apare in ecuafie deoarece, prezentl, in ambii termeni ai ecualiei 1, ea se anuleazd; din punct de vedere biochimic este acelaqi lucru pentru cd- enzirr,a se regS.seqteneconsumatd la sfdrqitul procesului. Relalia

ce laISe

tre t.

matematicd in condiliile acestea arati ci compusul S trece integral in P, cu alte cuvinte viteza de formare a complexului ES este egald"cu cea de consum.

0)

+ KrfEl.tsl = KztFSl K3[BS] sau KrtEl tsl = [Es] (Kz + K:)

(6) (7)

de unde:

= KJ t?;;tsl sau[ES] = tESl r\.2+^3

tEt. ts1K 2+ K 3

rrsr=ftfl rrr\KM

a\este intru totul utild deoarece atAt

Relafia obtinutS. nu

concentratia enzirrrei [E] rdmash liberd. c6t $i concentralia substratului [S] la un moment dat, sunt dificil de determinat. Cantitatea d.e enzima rdmasa liberd poate fi insd calculatd ca diferenla intre cantitatea totald de enzimd. [Er] $i cea care este implicatS. in formarea complexului ES:

.tEl=tsrl_fEslt.

(e)

inlocuind [E] in relalia 8 aceasta devine:

= Km.[ES] ( tstl - tEsl).tsl Km. [ES] + tEsl.tsl= tE"Il. tsl Km+tsl ) = tE'Il.tsl [ES].(tEr'l . l'Sl Km+ [S] Relalia 13 permite ca1culu1cantitilii de determinat stabilite experimental) din experimental) adicd din

(10) (1 1 )

(r2)(1 3 )

de complex ES (foarte greu (care sunt

elemente cunoscute

cantitatea totald. de enzimd si

carutatea totala. de substrat. Dacd inmullim ambii termeni cu IG (care reprezintd. contanta de vitezd pentru formarea produsului) se obfine: K,'tESl = K3' [E'I] Km+ [S] (14)

-:::de: & . [ES] este viteza initiald, Vo, a procesului conform ecua{iei 2. IQ . [Er] reprezintd viteza maxima Vmax.a procSului, atunci c6nd toate cantitatea de enzima este ocupatd de substrat, conform aceleaqi ecuafii. in aceastS.situatie relatia 14 devine:

v o= Vnnx.S

Km+ [S]

(15)

Relalia 15 este cunoscuta sub numele de ecualia Michaelis_ \fenten qi stabile$te influenla concentraliei substratului asupra vitezei '-:nei reaclii cata-lizatede o enzimi. Ecualia stabilitd de Michaelis-Menten confirmd matematic :bservaliile lEcute prin analiza curbei oblinute experimental gi anume: 1) Ia concentralii mici de substrat, [S] Kz predomind tendinia de formare a compiexului ES, deci enzima are o afinitate crescutd pentru substrat, K,,' in aceasta sltuafie are valori foa_rte mici (raport subunitar). Se obfine confirmarea ::::1:::: r2lnl rlrqg.4

vitezd mai cea micd,.,",."'::;T;i::i:;i::":" :",*,l:ff: :; reactia inversd"

Din punct de vedere biochimic atunci cAnd IG are valori mici, reaclia de formare a produsului

=atematice a afirmaliei: ,,valori mici ale Km-ului indici a-finitate mare --e:tru substrat". ,-- -+cAnd Kr< Kz predomind tendinla de disociere a complexului

deci enzima are o a-finitate micd pentru substrat. in aceastd. -S. --::::afle K- are valori mari (raport supraunitar). Se obline confirmarea 8) :-atematicS. a afirmaliei: substrat". -:tru in concluzie ecualiile matematice oblinute confirmi concluziile :eCuse experimental. Utilitatea practicd a ecualiei stabilitd "valori mari ale Km-ului indicd a-finitate micd

de Michaelis-Menten

=:]ste in faptul cA aceasta permite: a) calculul turnoverului enzimei Relatia V"'". = K:. [Er] indicS. faptul c5" toate centrele active ale ::zimei sunt ocupate. Ks in aceastd situatie devine IG"t sau turnoverul ::-zimei care aratd numirul -.: se exprimd in sec-l. :1or diagnostice. in situafia in care concentralia substratului [S] este foarte mare, .:teza inilia15.este independentd de concentralia substratului qi devine cu ==a15. Vmax. Vo = Vmax sau Vo = K"", [Er] Aceasta inseamna c5. mS.surAnd iteza de molecule de substrat transformate pe :cl de enzimi (de toate centrele active a-leacesteia) in unitatea de timp t b) calcului concentrdtiei serice de enzirr.d-in scopul stabilirii

la saturatie {atunci c6nd

=:zima este saturate cu substrat) mdsurdm de fapt cantitatea totala ie enzimd [Er] prezentS.intr-o proba biologicd (sAngede exemplu) la un :oment dat. c) studierea influenlei inhibitorilor asupra vitezei de reac{ie. "Inhibifia activitdtii -{ceasta va fi prezentatd pe larg in capitolul-=zirn-lar' ln 4C\

40

1.6,2.2. Ecualla Lineweaver-Burk Relalia oblinutd de Michaelis_Menten este ,incomod.d.,,atAt din punct de vedere matematic fiind o functie hiperbolicl (a cdrei proportionalitate este limitati), cAt 9i din punct de ved.ere practic Iiind necesare un numdr foarte mare de determindri practice pentru trasarea ei. O formd mai avantajoasd. a hcestei relalii a fost oblinutd. de Lineweaver qi Burk prin liniarizare. Liniarizareaa fost facute prin inversarea ecuatiei Michaelis-Menten obfinAndu_se ecuafia Lineweaver-Burk (ecuafia 22), in coordonate 1/Vs $i t/S . Trasarea graficului in coordonate reciproce,l /V6 funclie de 1/S, are avantajul de a permite determinarea cu mai multa precizie a vilezei maxime. care poate fi doar aproximatd in graficul in. coordonate directe Vo functie de S. Ecualia Michaelis 9i Menten f15) poate fi scrisi gi sub forma:_, = - Vrnax.S vn - Km+ [S]t- tf,)

sau

1

I

Km + [Sl Vunx [Sl sau

vo

Vrnax'S Km+S

lKmll

V

Vunx tSl

Vnrax

(22)

Scrisd sub aceastd ultimd formd ecualie 15 devine o ecuatle de tipul y=ax + b in care _L $i _l_ sunt variabileie y respectiv x , iar K. tsl .l 91 "*" sunt constantele a $ ib ReprezentAnd inversul vitezei j_ in funclie de inversul concentraliei substratului * se obfine o dreaptd care taie axa y in punctul i* axa X in punctul a$a cum rerese dJn graficul * { alAturat (fig.11).

lr

Fig.ll - Reprezentarea gralicd a ecuafiei Lineweaver-Burk. axa x este data de - 1 y'K-, intersectia cu axa Y este data de 1/V*

Intersectia

cu

Intersec{ia cu cele doud axe se face la x = 0 (intersectia cu ordonata) respectiv y = 0 (intersecfia cu abscisa). Interseclia cu abscisa: y=g Hipovltaminoza

defectuoasd a altor vitamine, datoritd competiliei pentru compugi de fosforilare-

.-

\,rlrarnina

u'r'3' Viteoiaa Br (piridorina) si coenzimere derivate!6 (piridoxina, adermina, factor

prin natura radicalului cH2oH

includetrei compuqi natura.li,derivalide piridini,din pozilia 4: QHO

"-"Ti:TTj::fH2NH,

oFrf)fcr,orHrc\,./

ou/-ycw,onH3c\.j

oHf\p-cH,onHrc\-./Piridoxamin6

o Rolul metabolic Piridoxalul $i piridoxamina intervin in metabolism sub formd coenzimaticd. de piridoxal_S_fosfat, respectiv piridoxamtn_S-fosfat (p5p), ln care gruparea de alcool primar din pozilia Seste fosforilatd in urma reacfiei cu ATp.

otfy"rz-GporH:Hrc\..r1Trans '*Pfidoxalfosfat

tzHo-(CH2-NH2)

- f*J "-c{oos]f c-HOH H:C

\--

p""arboxilare

transsurfurare (transferul i:'ffi;J1Tll;,^1.""1".1 ":,ff,t;.

Bo intervine in multe reaclii metabolice la care participd aminoacizii: transarninare, decarboxilare a c_arrrlno _acizilot (tirozina, arginina, acid eluta'11in Aa-^^:-^-_ , I

Vitamina

r-

1"i"t"ir.a qi homocisteind), in absorbfia din intestin gi intrarea aminoacizilor in celuld.. . Tulburiri de aport witaninlc

sinteza cisteinei), desulfurar.

Ca semne ale delicienfei se pot menliona: stirile de nervozitate, insomnie, tulburdri de mers, afecfiuni cutanate in jurul nasului, ochilor, gurii, limfocitopenie. Carenla vitaminei Ba favorizeazd aparifia cariilor dentare, conduce la modifrcdri in metabolismul triptofanulu i, printr-o excrelie excesivd.de acid xanturenic.

caracteizat

Medicamentul ISONIAZID (hidrazida acidului izonicotinic), uzual utilizat in tratamentul tuberculozei, reactioneazd.cu Bo pentru a forma un derivat hidrazonic, care inhibd enzimele ce con{in piridoxal_5_p. Pacienlii tratali mult timp cu isogriazid denoltl o neutropenie perifericS.,care rdspunde foarte bine 1d terapia cu 86.

Q*o-*r-NH2

+ Fc

UOH srontan ----,/l

I "'"" l?'r",\__/

IPiriloxal hklrazona

co--NH-N:crr5N

6"ron

uz:ual utilizatd in tratamentul pacienlilor cu boala Wilson, cistinurie qi artritd reumatoidi, reaclioneaze cu 86, pentru a forma un derivat tiazolidinic

De

asemenea, peniciiinamina

(beta-dimetii-cisteina)

inactiv. Pacienlii tratali

cu penicilamind

dez'olte. ocazional convulsii,

care pot fi prevenite prin tratament cu vitamind Bo. IL1.4. Blotina (witamlna Hl qi rolul ei coenzimatic Molecula biotinei este constituitd din doud nuclee condensate, un nucleu tetrahidro-imidazolic (A) qi unul tetrahidro-tiofenic (B) la care este grefatd. o catend laterald de acid n-valerialic. Se cunosc doi izomeri natura.li, alfa qi beta-biotina, izolali din ficat qi lapte, respectiv din gdlbenugul de ou:

?,,,H_N-;\N_H^ H-t-C"--+{ t Bl H2C\^_,.c H-(cHrr-cooHlD z

o

,l

lr

r-f=1-tDl

H-N-:-N-H t^l

H2C\-,.cIFqrrcH-cHr

f",

cooH

Beta-biotina

Alh-biotina

in

produsele natufale -

biotina

apare combinati

cu lizina,

compus numit biocitine:

Biotina-CO-NH-(CHr4-CH-COOH

NHz

Biocitinaza, enzimS. evidenliatd. in plasmd, ficat, pancreas, hidrolizeazl compusui, eliberAnd biotind. Enzimele care contin biotind au in centrul catalitic, resturi de lizind, prin care se fixeazd vitamina. Cu auidina, glicoproteind termolabild din albuqul de ou crud, forrlreazl- biotin_auidina, compus stabil, rezistent la acliunea enzimelor proteolitice, nedisociabil prin dia1iz6. sub aceasta formd., vitamina nu se absoarbe in tractul disestiv.

18

o Rol metabolic Biotina transporta grupdri COz active, in calitate de grupare prosteticd a unor sisteme enzimatice de carboxilare (carboxilaze) care catafizeazE. fixarea COz pe diferite substrate. in reacliile de carboxilare, COz activat de citre enzime: ATP, participd sub form5. de carboxi-biotin-

Hcot+ArP-l----+-d ,i_#" i J" TfFEnz. oon o:5__-i,_-l t,b--r"-irnc't4-co iAnhidridd-PcarbonicaBiotin-Enzimi

*u,. - oiX"il"'",:-r"

---r*

coolr ^o e ,,\.'ootAcil retinoic

92

In organism, vitamina A se formeazS. in special la nivelul mucoasei intestinale, prin transformarea provitaminelor A (cl, I Ci fcarotenii) - prin oxidare 1a Crs. Randamentul cel mai bun este obtinut din p-caroten, care avAnd 1a ambele capete cicluri de p-ionond. va conduce la doud molecule de vitamina A.

B iononn

p caroten

B ionona

Ea se depoziteazd in principa.l la nivel hepatic; depozitul de vitaminS. A din ficat poate asigura necesarul organismului pentru o perioadS. lung5. de timp (chiar peste 1 an). Iipsa vitaminei E. Ingerarea indelungatd de alimente bogate in caroten duce la depozitatea acestora in lesuturi, apdrdnd xantodermia - ingilbenirea pielii, in special a palmelor qi tdlpilor, cu exceplia sclerelor care, rimAnAnd a1be, permit diferenlierea de icter. Hipercarotenemia nu atrage Si hipervitaminoza A. Vitamina A se gdseqte in produsele de origine animald in cantitate mai mare decet in cele vegetale: ficatul unor pegti de apd dulce, gdlbenuq de ou, lapte. Aceste depozite scad in

Rolurile eitaminei A F Vitamina A (retinol -CHzOH) este indispensabila vielii qi cre$terii norma-le (in privinla staturii qi greut6!ii). Retinolul exercitd acliune protectoare asupra epiteliilor, asupra mucoaselor, impiedicAnd pd.trunderea microorganismelor (acliune antiinfecfioasd), are rol in funclionarea aparatului genital gi de reproducere (spermatogenezd).

) Vitamina A, sub formd a" oxidarea retinoluiui,

.etinoic (-COOH), rezultatS. din ^cia aclioneazh in calitate de hormon prin legarea de

receptori nucleari responsabili de activarea unor gene. Acidul retinoic poate inlocui retinolul in cre$terea qi diferenlierea epiteliilor, fiind considerat chiar mai activ, dar nu poate substitui retinalul in procesul vederii. F Vitamina A (retinal) sub forma 1 1-cis-retinal (-CHO) este implicatd in procesul vederii. Clclul vlzual Vitamina A constituie gruparea prosteticd a tuturor existente in retind. este alcatuite dintr-o proteinS. specificS.numitd opsind sau "scotopsind" (scotos = intuneric), la care Rodopsina, pigment fotosensibil, este legatd vitamina A forma 1 1-cis-retinal. in procesul vederii, atunci cAnd, rodopsina este expusi lumind, au loc o serie de izometiz.Eti reversibile cis sunt convertite in impulsuri creier. la pigmenlilor fotosensibili vizuali, din celulele fotoreceptoare (conuri gi bastonaqe), retinolul sau

trans, ce + nervoase transmise de nervul optic la

11-cis-Retinal

A1l-trans-Retinal

Izomerizarea retinalului la lumind qi neglijabild

cis in trans are loc cu intensitate, mare Aceasta izomerizare in care se

la intuneric.

reaJizeazS. trecerea de la o stare bogat energetici, cis-retinal, la o stare saracS. energetic, trans-retina1, este insotita de degajare de energie convertita in miqcare atomicd care, amplificatI,, nervos. genereazS, impulsul

Izomerizatea cis-trans altereaz| geometria labili a moleculei de rodopsind, producdld desprinderea opsinei. Maximul de absorblie al rodopsinei se deplaseazd de la 500 nm (roqu) spre spectrul retinalului liber (380 nm) cu formarea unor intermediari cu maxime de absorbtie gi culori diferite. La intuneric, au 1oc reacliile de refacere a rodopsinei, care in 11-cis-retinal qi legarea necesitS"transformarea all-trans-retinalului

lui spontanS. de opsinS. in aceastS. etape sunt implicate reactii de reducere / oxidare 1a care participd ca acceptor respectiv donor de H, sistemul NAD./NADH+H-, in ca-litate de coenzimA a alcool dehidrogenazei (retinol dehidro genazdl., Rodopsina \

Opsina

(-cHo)NADHAlcool-dehidrogenaza NAD+

alCCHo) l(-oH)

l (-oH)

,lltlSange g lssuhrri

In retind se p[streazd un echilibru intre retina-l qi retinol care implicd schimburi continue ctt rezerva generald de vitamini A a + organismului (ochi sAnge + lesuturi). Instalarea rapidd a tulburirilor vizuale (hemera-1opie) carenta in de vitaminS. A se explicd prin scdderea refacerii rodopsinei din cauza aportului insuficient de precursori, ceea ce are drept consecinld. scdderearodopsinei din retind. Existenla hemeralopiei independent6 de carenla de vitamind A (albinism, la bdtrAli in glaucomul cu cataracte, diabet, graviditate,

boli hepatice, intoxicalii

cu alcool, Pb, As etc.) s-ar putea datora +

retinoltr 9i faptului cd in procesul vederii participi gi alte vitamine (Br qi Bz) qi a1!i factori, hormonal.i sau alter5rii echilibrului "retinal de altd naturd, factori mai pulin cunoscuti. . Necesarrrl de vitamind A este in funclie de greutatea corporald, vArst6, climat, stare fiziologicd.. Necesarul este mai mare in regim bogat in lipide. o Tulburirile imprejurdri: de aport vitaminic se pot insta.la in diferite de a in absorbtia lipidelor, lipsa din alimente, incapacitatea organismului

transforma carotenii in vitamina A, tulburdri

carotenilor gi a vitaminei, depozitarea insuficientS. (boli hepatice), defrcienlA de Zn (necesar mobilizdrii vitaminei A din ficat), ma-inutrilie proteicS.. Deficienta de vitamin5. A, la copii 9i animale tinere: Y afecteaz\, sistemul osos (oprirea creSterii oaselor, erupfii dentare intdrziate, rdddcini rdu implantate, alterarea emailului dentar) gi apoi a lesuturilor moi. ) duce la oprirea divizipnii celulare qi atrofia celulelor deja formate, Ia interzierea severd a creqterii inclusiv a sistemului nervos. F duce 1a keratinizarea epiteliilor, indiferent de originea 1or, ceea ce conduce 1a tulburdri a1e glandelor exocrine, lacrimale, pie1e, tractusul digestiv, respirator, urogenital. Carenta de vitamind A se manifestd in principal la nivelul ochilor prin: sciderea capacitelii de adaptare de Ia lumind la intuneric (nictalopie) qi sciderea acuitdlii vizuale cu ingustarea spectrului vizual pentru albastru-galben precum $i oboseala la citit (hemeralopie). Dacd avitaminoza se accentueaze qi este de lunge durate apar leziuni a1e epiteliului conjunctiv (xeroftalmie), manifestatd prin uscarea epiteliilor (xerozd), atrofra glandelor lacrimale (cu scS.derea lacrimilor qi umectare insuficienti) qi lipsa de lizozirn (factor de proteclie antimicrobiand). Corneea se opacifiazd, continuAnd cu perforarea purulentd a ochiului

96

(keratomalacie), proces care d.uce la orbire (cecitate). Carenta de vitamind. A poate fi insofltd de infeclii sponta-ne. > Hipervitaminoza A

Dozele excesive de vitamini. A produc fenomene de intoxicatie acutd., manifestatS. prin amefeli, cefalee, somnolenta sau intoxicare cronicS. (anorexie, tegumente uscacte, buze uscate, ragade comisurale). Megadozele de vitamind A produc reabsorbfia oaselor prin stimularea activite$i proteolitice lizozomale, stimuiarea secre(iei de parathormon (PTH) 9i efecte teratogene la femeile gravide. Consumul exagerat de caroteni produce ,,icterul carotenic,,. CAnd se depdQe$tecapacitatea de fixare a proteinei de legare a retinolului (retinol binding protien - RBC) are efecte litice asupra membranelor biologice. Lezarea membranelor eritrocitare de cdtre retinol este inhibatd de vitamina E (tocoferol). I IL2.2. Vitamina D (colecalciferol, vitamina arltirahitici) Grupul vitaminelor D este reprezentat de cinci vitamine cu structurd. chimicS. 9i acfiune asemenetoare notate de Ia 2 la 6. Provitaminele D sunt derivali sterolici cu structura urmatoare: ciclopentaloperhidrofenantren. radica-1ului R.\,.J | ,.'"3

Ele se diferenfiazd dupd structura

K

-CIHH

^- ^-- ^ a2 -a activaresecundara 1.15-1oH12_D zJ_\Jn_u----------------

o,.{

Activatea

primari.

Transformarea

provitaminei

in vitamina

prin deschiderea, sub acliunea razelor ultraviolete, a D se reaJizeaz1. inelului B intre Cs $i Cro cu apari{ia unei duble legdturi intre Cro gi Crq. Rezulta o trien5., care constituie structura de bazd, ce conferd activitate biologicd comund (antira}ritica), catenele laterale fiind resposabile de intensitatea pctivitelii vitaminice. Suprairadierea duce la compugi toxici. . Activarea secundari conste din dou6. procese de hidroxilare succesive ce au loc in ficat gi rinichi. Prima hidroxilare a vitaminei Ds are 1oc in ficat, in pozi{ia 25 a catenei laterale, formdndu-se 25-hidroxi-Dg. A doua hidroxilare are loc in rinichi, unde forma hidroxilatd in pozifr.a25 suferd o noud hidroxilare in pozitia o la carbonul 1. Rezultd 1,25-dihidroxi-colecalciferolul sau 1,25-dihidroxi-Dg care este forma vitaminicd cu activitate maximi in metabolismul calciului. Derivatul monohidroxilat (25-OH-D:) este de 4-5 ori mai activ decdt vitamina D3, in prevenirea rahitismului, iar derivatul dihidroxilat 1,25-(OH)z-Ds este de 2O-30 ori mai eficient decd.t D: in transportul intestinal de Ca** Si respectiv, in prevenirea rahitismului.

98

7-Dehidrocolesterol

u.v.l(niele)

,^.fl,!rf I

.^-ATI | Y ficat

YR

!7,fcllfteror (viraminaD3)

'../W

oH

25-OH-D3

d'^.."o.,/

al )r-

"?*a$ *

r' ' .-a>

1,25-Dihidroxi-D3 (calcitriol)

24,25-Dihidroxi-D3 (inactiv)

.

Rolul metabolic d vltamlnel

D

Vitamina Da este privitd astdzi mai mult ca un hormon decdt ca o vitamind. 1,2S-(OH)z-Dssau calcitriolul regleazd metabolismul fosfo-ca.lcic prin acliunile exercitate asupra tesuturilor tint5.: intestin, os, rinichi (fig 28).

Fig-28. Metabolismul Si acliunea vitaminei D. Forma activa a vltamlnei Ds, 1,25_ (OH)r-D:, aclioneazd la nivel intestinal ai osos stimuland absorblia respecti" 'n""."^ calciului, iar la nivel renal impiedicAnd eliminarea lui I1l.

calcitriolul este transportat la locul de acliune unde se fixeazd pe proteine receptoare citoplasmatice qi > apoi este translocat la nucleu unde printr-un acliunii unui hormon steroid induce mecanlsm similar unei proteine sinteza

La niuelul intestinului

I100

transportoare

de calciu

(Calcium

Binding

protein

-

CBp) care

favoizeazi absorbtia de Ca** contra gradientului de concentrafie. Le nilur.tut htbilor renall I,2S-(OH)z-Ds stimule azE sinteza :> CaRP renale qi deci reabsorbfia, preintAmpindnd excretia de Ca**. nive1atl osului actiunea 1,25-(OH)z-Ds este mai )> ta compiicatd qi mai pulin clar6. Vitamina asiguri. fixarea Ca** qi pO+s-in spaliile libere dintre capetele nespiralate ale moleculelor de colagen gi stimuleazi" sinteza unei proteine specifice care leagi Ca**, osteocalcina. Calciul se fixeaz1. in faza minerald a osului, sub formE de hidroxiapatita, Caro(pO+)o(OH)2, aleturi de cantitdti mici de citrat, Na*, Mg** qi CO3z-. u ;y'?Fu :Arutdrl de aport vitamlnic Htpottttaminozq. D >r Formarea defectoase in piele a vitaminei Dg, aportul alimentar scdzut gi/sau defecte intestinale de absorblie a vitaminei pot duce la stdri de hipouitaminozd D. Hipovitaminozele D conduc la stdri de boali" care se manifestd prin: - defecte in mineralizarea osului. - perturbari in metabolismul mineral (Ca.. gi pOa:J Si a secretiei de parathormon (PTH); in deficienla de vitamind D absorblia de Ca2* fiind perturbatd apare hipocalcemia, insolitd secundar gi compensatoriu de cre$terea secretiei de PIH, care determini mobilizarea Ca2* din oase pentru normalizarea calcemiei. Din caracteizatd, punct prin de vedere biochimic hipocalcemie hipovitaminoza sau D este

moderatd

normocalcemie,

hipofosfatemie, activitate crescutS. a fosfatazei alcaline. nivele crescute de parathormon gi scdzute de 1,25-(OH)z-Ds. Din punct de vedere clinic, hipovitaminoza D este caracterizata de scdderea rezistenlei Hipovitaminoza D la mecanice a oaselor (inmuierea oaselor). copii se nume$te rahitism iar 1a adult

l0l

osteomalacie.

La

adult,

rezerva

de

calciu

fiind

mai

mare,

hipovitaminoza se instaleazS.mai greu. Hipocalcemia dezvoltd 1a adult osteoporoza (reducerea masei osoase pe unitate de volum la un nivel situat sub cel necesar funcliei normale). Osteoporoza apare la femei postpartum sau dupa instalarea menopauzei, ceea ce dovedegte dependenta hormonalh a acesteia. Tratamentul cu estrogeni previne instalarea osteoporozei (se pare c5. estrogenii protejeazd osul impotriva agentilor care determind. resorblia osului, in special pTH). Sunt descrise boli genetice datorate unui defect i:r sinteza renald a 1,25-(OH)z-Ds,care produc rahitismul dependent de vitamina D (tip I) gi mai rar boli cavzate de deficienle ale receptorului citoplasmatic pentru 1,25-(OH)z-D:, care produc rahitism independent de vitamina D (tip II). ) Htperuita ndnoza D Dupa ingestia cronicd, oral5., a unor doze mari de vitamind D pot apare intoxicatii cu vitaminE D caracterizate prin anorexie, v5rshturi, diaree, astenie, mialgie, pierderi in greutate, hipercalcemie, hipercalciurie. Patologic are 1og calcifierea lesuturilor moi qi in special la nivel renal (nefroca-lcinoza), cornee, aortd, pldmdni, inimd.. Suprimarea administrdrii de vitamind" D, prin aplicarea unui regim sdrac in Ca, produce o mobilizare lentd. a Ca din lesuturile moi qi revenirea la normal a calcemiei. Atunci cdnd nu este compromisi. grav, functia renali se normalizeazd,, IL2.3.

Vltaminele

E (tocoferolii, vitaminele

antisterilitdtii,

vitaminele de reproducere) Numele de tocoferol provine de la funclia biologicd de a favoriza fertilitatea (tokos - na$tere; phesein - a purta). Vitaminele E sunt un grup de vitamine - tocoferoli - formati dintr-un nucleu de croman substituit qi o catend lateral5" ramificati _rtfll-

r02

cr,Tocoferol Sunt patru tocoferoli importanli: d, p, T, 6 - care se diferenliazb. intre ei prin numdrul de grupiri metil din nucleul cromanic; proprietSlile vitaminice sunt proporlionale cu numSrul grupelor -CHs, deci o-tocoferolul va fi ce1mai activ biologic, avend trei grupdri metil, 5, 7, 8-trimetil tocol. Absorbtia vitaminelor intestinului liposoiubile. ,tocoferolii trec in se,nge unde sunt vehiculali de p-lipoproteinele plasmatice, apoi sunt repartizafi in toate organele, depozitele fS.cAndu-sein lesutul adipos. Intracelular, vitaminele E se acumuleazd- in membranare citoplasmatice gi mitocondriale 9i De 1a intestin, pe cale limfaticd, sublire, in E din a1imentalie are loc la nivelul ca qi celelalte vitamine

aceleagi condilii

fosfolipidele in reticulul

endoplasmatic. Concentralia vitaminelor E in aceste organite este in funclie de aportul vitaminic, de peroxidanli, antioxidanfi, de seleniu alimentar gi de aportul de aminoacizi cu sulf. in procesele metabolice, tocoferolii sunt tralsformafi in compuqi chinonici, hidrochinonici care se elimind prin bild, 8Oo/o, restul prin iar urind, sub formd conjugatd cu acidul glicuronic. O E nol biochimic. Vitamina E nu are o functie biologicd specificd pentru a explica numeroasele consecinfe care apar in carenla de vitamind E la animalele de experien{5 (este vitamina in ceutarea unei boli). Acliunea qntioxidantd. Vitamina E este consideratd ce1mai / eficace antioxidant liposolubil nafural. Substanlele cele mai sensibile la peroxidare sunt lipidele celulare gi lipidele din membranele

103

organitelor nesaturate. Sub

subcelulare,

Si

dintre

acestea in

special,

lipidele

acliunea

oxigenului

molecular,

acizii

polinesaturali

formeazS peroxizi lipidici prin peroxidare, proces autocatalitic, care se desfhgoard dup5. un mecanism radicalic, prin reaclii inldnfuite:(QtL J9-qJJr,,. p. * H. R-OO + R. + A

Initierc:

a-H

R'+ 02Propagare: intrerupere:

R-H+ R-OO.-=+R_OOH AH + R-OO.-->R-OOH

A' este un radical stabil, provenit din tocoferol, capabil sd inhibe propagarea reacfiilor radicalice in lanf din peroxidarea lipidicd..

cl- Tocoferol -->

,.CHz

Radical tocoferil putin reaotiv

Tocoferil-chinond stabile

Acliunea pentru viala

antioxidantd

a vitaminei impreund

E are o importantd cu vitamina

mare

C $i alti antioxidantri alimentari ar fi implicali in protejarea cdilor respiratorii qi mai ales a tesutului pulmonar de acliunea nocivd a aerului poluat (Os, NzO). Efectele nocive ale oxidanlilor pot fi ilustrate prin schema urmatoare:

celulei, intrucat

I104

Acizi gragi polinesaturati fosfolipidemembranare din AntioxldalF Ql @ Oxidanri (v{arruuE) (Fe2+, Cu2+, 02) I Y Peroxizilipidici

I

I vDegradarea acizilor gra;r din fosfolipidele membranare

I

I

f^--.--.--- _ r urobule ro$u

/''

-''

t\Reticul endoplasmatic

I

IFragilitate_crescutil 5ihemolizn Pemreabilitate crescuE | I Eliberarea enzimelor hidrolitice { Modificiri la nivel tisular

IDezintegraxea struch.uilor necesare acliriii enzimelor prezente la acest nivel I n"ctivarea enzimelor

eE 2-

T:ulb:uteri de aport vltaminlc E --' gilooltatnlftoza Efectele carenlei de vitamind

E sau hipovitaminozei E se de perioada de deficit

manifestd gradat $i progresiv in funclie vitaminic.

Semnele deficienfei de vitamind. E la om se manifesti paralel cu perturbarile absorbliei de grdsimi qi constau in: slhbiciune musculare, fragilitate eritrocitarS., fenomene care dispar prin administrarea vitaminei E. Independent de gradul de alterare a lipidelor, la animale, s-au evidenfiat tulburdri a1ecapacitdlii de reproducere la ambele sexe.

105

Nu sunt dovezi care se ateste cd vitamina E, la om, este necesard pentru fertilitate. Totugi, sunt unele date conform cd.rora concentraga sanguina de tocoferoli cre$te progresiv in sarcin5 p6ld la 50-100% sau chiar mai mult in ultima lund fald de primul trimestru de sarcind. Aceasta constituie o condifie pentru evolu{ia qi dezvoltarea Revenirea la valori normale se face in primele 2_5 tuni de la na$tere, insd concentratlia ei creqte in lapte. La femeiie cu avort habitual, concentratia tocoferolului in s6'ge este de 2_4 ori mai sc6zut decAt la femeile cu sarcind normald. ) Elpteruttannlnoza Administrarea duce la involulia inferioare. E gi abuzivd de vitamind E, Ia om. indelungati lhtului.

ovarelor, tulburdri

nervoase qi dureri ale membrelor

II.2.4. Vitaminele K (Fllochlnona) si rolul lor coenzimafic Grupul vitaminelor K (Filochinona, vitamina coaguldrii, vitamina antihemoragicd, factor protrombinic) sunt derivafi de nafiochinond care la Cs conlin.sau nu un radical variabil de atomi de carbon.

R=

"rr"*oxlt"-,"r,-"",-lxlcHr3-Hfin]l

R=

(CH'{H{_CH,-H dihmesil

cH" t-

Vitamina Kr (filochinona) are la Cs un larlt lateral de litit (20 atomi de carbon). Vitamina I{z (farnochinona) conline un radical difarnesil {30 atomi de carbon).

I106

Vitamina IG (menadiona) - in care radicalul R este H, este sinteticd qi este solubild in apd spre deosebire de Kr Si Kz. Vitamina K este produsd in intestin de bacterii intestinale sau adusd prin aport alimentar. Absorblia vitaminelor Kr qi Kz (natura-1e)se face impreuna cu lipidele, apoi pe cale limfaticd trec in se,ngeqi de aici in ficat. Cea mai mare cantitate a vitaminelor K naturale se depoziteazd temporar in Iicat; vitaminele K sintetice frind solubile se absorb in absenla sdrurilor biliare. Ele nu se acumuleazi, excesul find eliminat prin glucurono- sau sulfo-conjugare. e ,.Y Rohtl metabolic al vitaminei K Principalul ro1 al vitaminei K este in modificarea post transcripfionali a unor proteine in principal a factorilor coagulirii, unde in calitate de coenzirrrd,participi,la 1-carboxilarea unor resturi glutamil prezente in aceste proteine. I. (factorul iI), proconvertina Proteinele coaguldrii: protrornbina

(factorul VII), factorul Christmas (factorul IX), factorul Stuart (factorul X), sunt sintetizate in ficat sub formd de precursori inactivi (zimogeni). Pentru ca aceqti factori sd fie transformali in formele biologic active este necesard carboxilarea posttranscdplionald a resturilor glutamil, din precursori, la acid 1.- carboxi glutamic, carboxilare catalizate de vita-rnina K.

qooCH,,I

-OOCI_--:________-__>

I-c-cH-NlF ll

CH,

t-

co,

TCOOCH/alr r'

I

VitaminaK

i _C-CH_NIF

o

tl oGla Acid T-carboxi-glutamic

Glu Acid glutamic

Resturile carboxil au o mare capacitate de chelatare a ionilor de Ca2* care servesc la legarea fosfolipidelor cu protrombina interacliune

107

specifice pentru activarea protrombinei la trombina, factorul activ al coaguiSrii (fig 28).

Fig 28. Rolul vitaminei K in coagulare. precursorii factorilor coagderii sunt sinteti"ali in formi inactivd, caractirizatn de prezenla .*Li- g*pa.i carboxil. Ei sufere procesul de activare sub acliunea ,iil;"i K, ;;!"" conste in -pr*i.riu"""to, introducerea_ unei g.upari carboll. !,,ffi-*i".". ""r" doue grupari carboxil (incdrcate nesativl in pozilie adiacentd, fi*;;;; u5urinta ionii Ca2*, ducr6nd la formarea lomolexului protromUinJcJcif*ii*sange. Acesta leage fosfolipidele de pe suprafal-a plachetilor, in p"-"""r.,t de coagulare "*pa-;;H;

Si warfarina (derivali cumarinici) inhibd reaclia de carboxilare.a acidului glutamic $t sunt folosili ca agenti anticoagulanli atunci cAnd existd primejdia coaguErii sAngelui la nivelul vaselor sanguine (tromboze). o T\rlburiri de aport wltaminic K se instaleazd cand existd. tulburdri in absorbtia de lipide (deficit de bild), afecliuni intestinale, alterarea florei intestinale, afecliuni hepatice, boli infeclioase. K duce la scdderea protrombinei. prelungirea timpului de coagulare Si aparilia de fenomene hemoragice spontane. in perioada imediat postnatale, nou n5sculii sunt predispugi la hemoragii deoarece se nasc f6r1. rezewe de vitamind K, av6nd intestinul sterii. Careanla de vitamind Carenla de vitamind

Antivitaminele

K, dicumarolul