evaluare cantitativă a leziunilor hepatice. corelaţii cu scoruri ...

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE “GRIGORE T. POPA” IAŞI

FACULTATEA DE MEDICINĂ

EVALUARE CANTITATIVĂ A LEZIUNILOR HEPATICE.

CORELAŢII CU SCORURI OPERAŢIONALE UTILIZATE

ÎN DIAGNOSTICUL HEPATITELOR CRONICE

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC

PROF. DR. IRINA-DRAGA CĂRUNTU

DOCTORAND

NICUŞOR CORNEL STĂNCULEŢ

2013

1

CUPRINSUL TEZEI DE DOCTORAT

CAPITOLUL 1

HISTOARHITECTONICĂ ŞI HISTOFIZIOLOGIE HEPATICĂ 1

1.1. CARACTERISTICI GENERALE 1

1.2. ELEMENTE DE VASCULARIZAŢIE 2

1.3. HISTOARHITECTONICĂ HEPATICĂ 3

1.4. CORELAŢII ÎNTRE HISTOARHITECTONICA HEPATICĂ ŞI PROFILUL MORFO-

FUNCŢIONAL HEPATOCITAR 4

1.5. HEPATOCITUL 5

1.6. SINUSOIDUL HEPATIC 8

1.7. CĂILE BILIARE INTRAHEPATICE 10

1.8. HISTOFIZIOLOGIA HEPATICĂ 11

CAPITOLUL 2

HEPATITELE CRONICE VIRALE – ETIOPATOGENIE ŞI SUBSTRAT

HISTOPATOLOGIC

12

2.1. DEFINIȚIE, ISTORIC ȘI CLASIFICĂRI 12

2.2. ETIOPATOGENIA HEPATITELOR CRONICE VIRALE 15

2.2.1. VIRUSUL HEPATITIC A 15

2.2.2. VIRUSUL HEPATITIC B 16

2.2.3. VIRUSUL HEPATITIC C 21

2.2.4. VIRUSUL HEPATITIC D 23

2.2.5. VIRUSUL HEPATITIC E 24

2.2.6. VIRUSUL HEPATITIC G 25

2.2.7. VIRUSUL HEPATITIC F 26

2.2.8. VIRUSUL ASOCIAT TRANSFUZIEI 26

2.3. SUBSTRATUL HISTOPATOLOGIC ÎN HEPATITELE CRONICE VIRALE 26

CAPITOLUL 3

MOTIVAŢIA ȘI OBIECTIVELE STUDIULUI DOCTORAL 31

CAPITOLUL 4

SCORURI OPERAŢIONALE ÎN DIAGNOSTICUL HEPATITELOR CRONICE.

EVALUARE SEMI-CANTITATIVĂ

32

4.1. INTRODUCERE 32

4.2. MATERIAL ŞI METODĂ 33

4.3. REZULTATE 38

4.3.1. EVALUARE CALITATIVA 38

4.3.2. EVALUARE SEMI-CANTITATIVA 46

4.4. DISCUŢII 48

CAPITOLUL 5

RELAŢIA CELULE KUPFFER – LEZIUNI INFLAMATORII ŞI FIBROZĂ ÎN

HEPATITELE CRONICE VIRALE B ŞI C

53

5.1. INTRODUCERE 53

5.2. MATERIAL ȘI METODĂ 54

5.3. REZULTATE 57

5.3.1. EVALUARE CALITATIVĂ 57

5.3.2. EVALUARE CANTITATIVĂ 64

5.3.3. CORELAŢII ÎNTRE CELULELE KUPFFER ŞI ACTIVITATEA NECROINFLAMATORIE – SCOR ISHAK 67

2

5.3.4. CORELAŢII ÎNTRE CELULELE KUPFFER ŞI FIBROZĂ – SCOR ISHAK 68

5.3.5. CORELAŢII ÎNTRE CELULELE KUPFFER ŞI SCORUL METAVIR 71

5.4. DISCUȚII 72

5.4.1. CELULELE KUPFFER ŞI ACTIVITATEA NECRO-INFLAMATORIE – SCORUL ISHAK 72

5.4.2. CELULELE KUPFFER ŞI FIBROZA – SCORUL ISHAK 73

5.4.3. CELULELE KUPFFER ŞI SCORUL METAVIR 77

CAPITOLUL 6

RELAŢIA LIMFOCITE T CD4/CD8 - LEZIUNI INFLAMATORII ŞI FIBROZĂ ÎN

HEPATITELE CRONICE VIRALE B ŞI C

79

6.1. INTRODUCERE 79

6.2. MATERIAL ŞI METODǍ 80

6.3. REZULTATE 80

6.3.1. EVALUARE CALITATIVĂ 80

6.3.2. EVALUARE CANTITATIVĂ 94

6.3.3. CORELAŢII ÎNTRE LIMFOCITELE CD4/CD8 ŞI ANI – SCOR ISHAK 98

6.3.4. CORELAŢII ÎNTRE LIMFOCITELE CD4/CD8 ŞI FIBROZĂ – SCOR ISHAK 102

6.3.5. CORELAŢII ÎNTRE LIMFOCITELE CD4/CD8 ŞI SCORUL METAVIR 104

6.4. DISCUŢII 106

6.4.1. ROLUL LIMFOCITELOR T ÎN PATOGENIA HEPATITELOR CRONICE 106

6.4.2. POPULATII LIMFOCITARE IN PARENCHIMUL HEPATIC 107

6.4.3. LIMFOCITELE CD4/CD8 ŞI ACTIVITATEA NECRO-INFLAMATORIE – SCORUL ISHAK 108

6.4.4. LIMFOCITELE CD4/CD8 ŞI FIBROZA – SCORUL ISHAK 109

6.4.5. LIMFOCITELE CD4/CD8 ŞI SCORUL METAVIR 109

CAPITOLUL 7

MORFOMETRIE COMPUTERIZATĂ ÎN EVALUAREA LEZIUNILOR DE FIBROZĂ

– CONCEPEREA ŞI IMPLEMENTAREA UNUI INSTRUMENT OPERAŢIONAL

110

7.1. INTRODUCERE 110

7.2. MATERIAL ŞI METODĂ 111

7.2.1. PREPARATE MICROSCOPICE, IMAGINI DIGITIZATE 111

7.2.2. PROCESAREA IMAGINILOR DIGITALE 113

7.2.3. SEGMENTAREA IMAGINILOR DIGITALE 114

7.3. REZULTATE 114

7.3.1. CONCEPEREA MACROULUI HEPAT 114

7.3.2. CUANTIFICAREA FIBROZEI 116

7.4. DISCUŢII 118

7.4.1. VALOAREA MORFOMETRIEI COMPUTERIZATE ÎN EVALUAREA FIBROZEI HEPATICE 118

7.4.2. CONCEPERE ŞI IMPLEMENTARE DE INSTRUMENTE AUTOMATE DE CUANTIFICARE.

DIMENSIUNI ŞI SCORURI 121

CAPITOLUL 8

CONCLUZII 123

REFERINŢE BIBLIOGRAFICE 124

ANEXA 1 – LUCRĂRI PUBLICATE PE PARCURSUL STAGIULUI DOCTORAL 134

Prezenta teză de doctorat este ilustrată prin 197 figuri şi 18 tabele. Rezumatul

include un număr limitat din totalul acestora, menţinând numerotarea din teză.

3

INTRODUCERE

Conceptul de hepatită cronică virală apare în timpul celui de-al doilea război mondial, când

pentru prima dată sunt descrise, la soldaţii cu episoade de icter, afecţiuni cronice ale ficatului (Kalk,

1947).

Privită inițial ca o ,,etapă intermediară” între hepatita acută și ciroza hepatică, hepatita cronică

(HC) a ridicat de-a lungul timpului numeroase probleme de definire și clasificare. Numitorul comun al

definiției generale constă în leziunile inflamatorii care persistă peste 6 luni la nivelul parenchimului

hepatic, şi care sunt asociate cu o serie de modificări biochimice și serologice, ca rezultat al

modificărilor structurale.

În anii 50 sunt introduşi termenii de hepatită cronică persistentă - ce descrie o variantă non-

progresivă a hepatitei virale, cu evoluţie prelungită, şi hepatită cronică activă (Smetana, 1954, Saint et

al., 1953). Deşi această nouă terminologie apare în monografia „Hepatitele cronice” editată în 1966,

prima clasificare făcută de un grup internaţional de experţi în hepatologie care încearcă să coreleze

aspectele histopatologice ale biopsiei hepatice cu prognosticul afecţiunii este publicată în 1968 (de

Groote et al., 1968). Criteriul histopatologic care a făcut diferenţa între cele două forme este

reprezentat de necroza periportală parcelară, numită „piecemeal necrosis”.

Polimorfismul clinico-biologic de manifestare a acestei boli a făcut ca, pentru o perioadă destul

de mare de timp, să existe numeroase încercări de clasificare a hepatitelor cronice, ce au fost bazate pe

criterii diverse.

Prima lucrare care clasifică hepatita cronică (de Groote et al., 1968), considerată clasică şi citată

ca punct de referinţă în evoluţia cercetărilor asupra hepatitelor, descrie cele două tipuri, hepatită

cronică persistentă (cu potenţial prognostic benign) şi hepatita cronică agresivă – activă (cu potenţial

prognostic sever) în raport de localizarea infiltratului inflamator (Lefkowitch, 2007). Biopsiile

demonstrează că primul tip prezintă un infiltrat inflamator alcătuit din celule mononucleare limitat în

spaţiul port, în timp ce al doilea tip prezintă extinderea infiltratului dincolo de marginea spaţiului

portal, în placa de limitare (periportală) a parenchimului hepatic (Lefkowitch, 2007).

În 1971, Popper şi Schaffner au luat în considerare componenta lobulară ca o formă de hepatită

cronică lobulară (Lefkowitch, 2007). Clasificarea în hepatita cronică persistentă, hepatită cronică

activă și hepatită cronică lobulară a fost aplicată atât pentru etiologia virală, cât și pentru cea nevirală,

ea dominând terminologia peste un sfert de deceniu (Lefkowitch, 2007). Această clasificare a urmărit

o asociere mai precisă între leziunile histopatologice şi prognosticul bolii. Ulterior însă s-au înregistrat

conotații prognostice mult mai complexe decât aspectul lezional surprins la un anumit moment

(Lefkowitch, 2007).

Prin acumularea de date ştiinţifice referitoare la etiologia, patogeneza, clinica şi patologia

hepatitelor cronice, vechea terminologie a devenit o sursă de confuzie prin utilizarea aceluiaşi

diagnostic (de exemplu hepatită cronică activă - CAH) pentru boli de origine diferită (virală,

autoimună, metabolică) sau hepatită cronică persistentă/hepatită cronică activă (CPH/CAH) pentru

diagnosticul hepatitelor virale cronice (Kenneth et al., 1995, Lefkowitch, 2007).

Aceste motive au făcut necesară propunerea şi formularea unei noi clasificări, bazată pe

etiologie, deoarece există diferenţe substanţiale între aspectele clinice, prognosticul şi tratamentul

diferitelor tipuri de hepatite cronice – consens realizat de către Comitetul Asociaţiei Internaţionale de

Studiu a Ficatului (Desmet et al., 1994) şi, respectiv, Congresul Mondial de Gastroenterologie, cu

rezultat în publicarea noii terminologii şi clasificări a hepatitelor cronice, bazate pe criterii etiologice

(Lefkowitch, 2007).

Examenul anatomo-patologic este cel care confirmă intensitatea leziunilor, oferind în același

timp și criteriile hotărâtoare pentru încadrarea diagnostică și prognosticul acesteia. Pentru a fi posibilă

apreciere standardizată a intensității leziunilor decelabile în cursul examenului microscopic, au fost

introduse o serie de scoruri diagnostice. Din multitudinea acestora, cele mai utilizate sunt: scorul

Knodell (Brunt EM, 2000), scorul Metavir (Bedossa, Poynard, 1996), care este aplicabil doar pentru

hepatita cronică cu VHC, scorul Ishak (Ishak, 1994) și sistemul Schauer (Schauer, 1995) (Lefkowitch,

2007).

În raport de aceste scoruri, hepatitele cronice sunt clasificate în trei stadii de gravitate diferită:

hepatită cronică cu activitate uşoară, hepatită cronică cu activitate moderată și hepatită cronică cu

activitate severă.

4

CAPITOLUL 3. OBIECTIVELE ŞI MOTIVAŢIA STUDIULUI PERSONAL

Investigarea specimenului de biopsie pe baza unor criterii de evaluare semicantitativă (scoruri)

contribuie la confirmarea diagnosticului clinic, prin evaluarea, din punct de vedere histopatologic, a

gradului de dezvoltare al necroinflamației și fibrozei; complementar, evidenţiază posibila existență a

unor procese patologice asociate și direcționează intervenția terapeutică.

În utilizarea scorurilor operaţionale pentru cuantificarea leziunilor intervine însă un grad

inevitabil de subiectivitate. De aceea, în ultima perioadă a devenit din ce în ce mai evidentă necesitatea

dezvoltării unor sisteme distincte pentru caracterizarea leziunilor hepatice, cu scopul de a satisface

cerințele perspectivei clinice, pe de o parte, care vizează predominant finalitatea terapeutică, dar și pe

cele ale medicului cercetător, în a cărui investigație sunt necesare detaliile cantitative obiective.

În acest context, cercetarea doctorală a vizat, în hepatitele cronice B şi C:

- evaluarea corespondenţei între activitatea necroinflamatorie şi gradul de fibroză, stabilite prin

scorul Ishak şi scorul Metavir, şi analiza suprapunerilor şi diferenţelor de clasificare;

- evaluarea nivelului hiperplaziei kupfferiene şi a proliferării limfocitare şi corelarea cu

severitatea leziunilor hepatice, urmărind astfel modul în care celulele Kupffer, limfocitele T

CD4+ şi CD8+ modulează modificările necro-inflamatorii şi fibroza specifice substratului

morfologic al hepatitei cronice;

- conceperea şi implementarea unui algoritm de cuantificare automată a leziunilor specifice de

fibroză.

CAPITOLUL 4. SCORURI OPERAŢIONALE ÎN DIAGNOSTICUL HEPATITELOR

CRONICE. EVALUARE SEMI-CANTITATIVĂ

4.1. INTRODUCERE

Toate sistemele de scor au, în mod inevitabil, puncte tari şi puncte slabe (limite) în obiectivul

lor principal – anume clasificarea semicantitativă a necroinflamaţiei şi stadializarea fibrozei. În timp,

numeroase articole au publicat rezultate susţinând sau contestând, prin date concrete, relevanţa

diagnostică şi prognostică a acestor scoruri.

Cercetarea noastră este fundamentată pe tabloul morfologic rezultat prin evaluare semicantitativa

a unui lot semnificativ de puncţii biopsii realizate în hepatite B şi C. Pornind de la cuantificarea

leziunilor specifice, obiectivele urmărite au constat în:

- evaluarea corespondenţei între activitatea necroinflamatorie şi gradul de fibroză stabilite

prin scorul Ishak, în ambele tipuri de hepatite;

- analiza suprapunerilor şi diferenţelor de clasificare scor Ishak versus scor Metavir, în

hepatita cronică C.

Analiza realizată a creat, tototdată, suportul necesar interpretării critice a diferitelor sisteme de

clasificare, posibil aplicabile în evaluarea hepatitelor cronice.

4.2. MATERIAL ŞI METODĂ

Lotul de studiu a fost constituit din 953 cazuri de hepatită cronică virală (202 hepatite cu VHB

şi 751 hepatite cu VHC), diagnosticate în cadrul Laboratorului de Anatomie Patologică şi Prosectură

al Spitalului Clinic de Boli Infecţioase „Sf. Parascheva” Iaşi, în intervalul 2008-2010.

Puncţia biopsie hepatică a fost practicată pacienţilor incluşi în lotul de studiu prin metoda

percutană, cu ajutorul trusei speciale Hepafix (B. Braun Melsungen AG).

Fragmentele de ţesut hepatic recoltate (cu dimensiuni între 10-25 /1-1,4 mm) au fost fixate în

formol, apoi prelucrate conform protocolului standard practicat în Laboratorul de Anatomie Patologică

şi Prosectură al Spitalulul Clinic de Boli Infecţioase ,,Sf. Parascheva” Iaşi. Preparatele microscopice

au fost colorate cu HE, tricromic Szekelly, Gordon – Sweet și interpretate cu ajutorul scorurilor Ishak

și METAVIR.

4.3. REZULTATE

4.3.1. Evaluare calitativă

În lotul analizat, morfologia hepatitelor cronice a variat între forme uşoare şi forme severe,

eventual cu tendinţă spre ciroză. În formele uşoare, infiltratul inflamator (format din limfocite,

5

macrofage, puţine plasmocite şi rare neutrofile şi eozinofile) a fost limitat la spaţiul porto-biliar, cu

menţinerea arhitectoniei hepatice. Hiperplazia în grade variate a celulelor Kupffer a fost remarcată în

ambele tipuri de hepatită cronică – tip B şi tip C.

Imaginile următoare ilustrează o parte din leziunile morfologice semnificative (fig. 4.1-4.6).

Fig.4.1. Hepatită cronică severă – steatoză micro- și

macroveziculară (HE, x 40)

Fig. 4.2. Hepatită cronică moderată – corpi

Councilman la interfaţa cu spaţiul port (HE, x 40)

Fig. 4.3. Hepatită cronică moderată – punţi fibroase

porto-portale (TS, x 20)

Fig. 4.4. Hepatită cronică moderată – fibroză portală

importantă cu tendinţă de extindere la nivel lobular

(TS, x 10)

Fig. 4.5. Hepatită cronică severă – infiltrat limfocitar

portal important (HE, x 20)

Fig. 4.6. Hepatită cronică severă – punţi porto-portale

cu distrugerea histoarhitectoniei hepatice (GS, x 20)

6

Steatoza hepatocitară, mai frecvent macroveziculară, dar şi microveziculară, cu topografie cel

mai adesea nesistematizată, a fost un element morfologic frecvent.

4.3.2. Evaluare semi-cantitativă

Pentru cele 202 cazuri diagnosticate cu hepatită cu virus B, valorile acordate în evaluarea semi-

cantitativă aplicând scorul Ishak, pentru activitatea necro-inflamatorie şi fibroză sunt prezentate în

Tabelul 4.1.

Tabel 4.1. Distribuţia cazurilor de hepatită cronică B în raport de ANI şi fibroză – scor Ishak

Activitatea necro-

inflamatorie

Număr total

cazuri SCOR ANI Număr cazuri

SCOR

FIBROZĂ

Număr

cazuri

Uşoară

SCOR 1-6 48

4 1 1 1

5 38 1 38

6 3 1 3

Moderată

SCOR 7-10 148

7 92

1 82

2 3

3 7

8 4 3 4

9 49 3 49

10 3 3 3

Severă

SCOR 11-18 6

11 5 3 4

4 1

12 1 4 1

Pentru cele 751 cazuri diagnosticate cu HVC, valorile acordate în evaluarea semi-cantitativă

aplicând scorul Ishak (pentru activitatea necro-inflamatorie şi fibroză), precum şi scorul METAVIR

sunt sumarizate în Tabelul 4.2.

Tabel 4.2. Distribuţia cazurilor de hepatită cronică C în raport scorul Ishak (ANI, fibroză) şi scorul METAVIR

Activitatea

necro-

inflamatorie

Număr

total

cazuri

SCOR

ANI

Număr

cazuri

SCOR

FIBROZĂ

Număr

cazuri

SCOR

METAVIR

Număr

cazuri

uşoară

SCOR 1-6 26

2 1 1 1

A1F1 23 5 12

1 8

2 4

6 13

1 4

2 6

3 3 A1F2 3

moderată

SCOR 7-10 672 7 -10 672

1 3 A2F1 3

2 30 A2F1 30

3 606 A2F2 606

4 31 A2F3 3

A3F3 28

6 2 A2F4 1

A3F4 1

severă

SCOR 11-18 53

11 45 4 52 A3F3 53

12 8 5 1

7

4.4. DISCUŢII

Începând cu anul 2000, progresele înregistrate în dezvoltarea tehnicilor biologice şi imagistice

au condus la introducerea unor metode noi, non-invaziv (Lefkowitch, 2007). Aceste metode propun

urmărirea markerilor biochimici serici (Poynard et al., 2003, Lefkowitch, 2007) şi evaluarea imagistică

a ficatului prin elastografie, pentru a măsura rigiditatea sa, în cu corespondenţă în fibroză (Colletta et

al., 2005, Castera et al., 2005, Ghany, Doo, 2005, Lefkowitch, 2007). Biopsia hepatică rămâne însă un

instrument de lucru, nu numai pentru confirmarea diagnosticului clinic, ci şi pentru a estima

prognosticul şi pentru a indica (sau nu) tratamentul antiviral (Almasio et al., 2005, Lefkowitch, 2007).

Expresia histopatologică a hepatitei cronice poate varia considerabil de la caz la caz, dar în

esenţă aceste variaţii sunt datorate raportului dintre cele trei componente posibile: reacţie inflamatorie,

fibroză (sau ciroză) şi modificări hepatocelulare.

Caracteristicile morfologice sunt în general comune tuturor formelor de hepatită cronică, virală

sau de altă origine. Există totuşi elemente distincte, la care vom face referire în raport cu studiul

nostru. La pacienţii cu hepatită cronică cu virus B au fost evidente hepatocitele cu citoplasma având

aspectul de ,,sticlă pisată”, aspect datorat unei producţii ample de AgHBs în hepatocite, învelişul

proteic al VHB acumulându-se în exces în cisternele reticulului endoplasmatic rugos. Tabloul

morfologic pentru al hepatitei cronice cu virus C a fost caracterizat prin prezenţa agregatelor limfoide

din spaţiile porto-biliare – considerată semnătura caracteristică (Lefkowitch, 2007) şi leziuni ale căilor

biliare.

Studiul nostru concentrează o analiză morfologică realizată pe un număr de aproape 1000 de

puncţii biopsii hepatice investigate pe parcursul unui interval de 3 ani. Evaluarea semi-cantitativă a

preparatelor microscopice a fost realizată în baza unei instruiri prealabile riguroase, scorurile acordate

fiind periodic verificate printr-o evaluare diagnostică inter-observatori.

În acest context, rezultatele noastre creează premizele unor discuţii orientate pe trei direcţii:

semnificaţia analizei corelaţiei dintre activitatea necro-inflamatorie şi fibroză, motivarea alegerii şi

aplicării unui anumit sistem de scor, condiţii minime necesare în evaluarea unei puncţii biopsii

hepatice.

● Corespondenţe versus diferenţe între activitatea necro-inflamatorie şi fibroză

Această corelaţie este, în esenţă, elementul principal care permite o evaluare prognostică şi, în

paralel, o decizie terapeutică adecvată.

În hepatita cu virus B, rezultatele noastre relevă faptul că activitatea necro-inflamatorie

moderată (scor 7-10) implică, în paralel, o dezvoltare extrem de variabilă a fibrozei, de la forma

restrânsă, limitată (scor 1), la forma extinsă, caracterizată prin poduri fibroase (scor 4). În schimb,

pentru activitatea necro-inflamatorie uşoară şi, respectiv, severă, corelarea cu un anumit grad de

dezvoltare a fibrozei respectă (oarecum) un pattern mai bine definit. Astfel, forma uşoară (scor 1-6)

asociază fibroză cu scor 1 (uşoară), în timp ce forma severă (scor 11-16) asociază fibroză cu scor 3 şi 4

(severă).

În schimb, în hepatita cu virus C, analiza corespondenţei activitate necro-inflamatorie – fibroza

a pus în evidenţă un model diferit, cu o variabilitate mai largă. În primul rând, activitatea necro-

inflamatorie uşoară (scor 1-6) a avut în corespondenţă fibroză uşoară (scor 1), medie (scor 2) dar şi

severă (scor 3). Fibroza de scor 1 a fost prezentă şi în cazul unei activităţi necro-inflamatorii

cuantificată cu scor 2, dar şi cu scor 6. În același timp, expresia activităţii necro-inflamatorii

cuantificată cu scor 6 a asociat fibroză uşoară (scor 1), medie (scor 2), dar şi severă (scor 3).

Comparând valorile scorurilor, modul de dezvoltare al fibrozei este asemănător cu tabloul prezent în

activitatea necro-inflamatorie medie (scor 7-10) din hepatita cronică B. Pentru activitatea necro-

inflamatorie medie (scor 7-10), gradul de extindere al fibrozei acoperă scoruri de la 1 la 6 – în

concordanţă cu rezultatele obţinute în forma de activitate necro-inflamatorie uşoară pentru hepatita B –

cu menţiunea că majoritatea covârşitoare a cazurilor (606 din 672) au prezentat scor 3 al fibrozei –

valoarea 3 fiind prima treaptă pe scala de cuantificare a fibrozei severe. De asemenea, rezultatele

obţinute pentru activitatea necro-inflamatorie severă (scor 11-18) au fost similare celor din hepatita B,

fibroza asociată fiind severă – cu menţiunea că în această clasă a clasificării gradul de severitate a fost

mai accentuat (scor 4 si 5).

Comparaţia tabloului activităţii necro-inflamatorii şi al fibrozei în hepatita B versus hepatita C

oferă, prin valorile numerice ale scorului Ishak, dovezi reale care susţin agresivitatea hepatitei C, în

8

patogenia căreia dezvoltarea fibrozei este mai rapidă, fiind iniţiată chiar pe fondul unei activităţi

necro-inflamatorii uşoare.

Rezultatele noastre susţin, de asemenea, faptul că activitatea necro-inflamatorie şi fibrogeneza

nu sunt procese care se desfăşoară într-un model concordant. Variabilitatea extremă a gradului de

fibroză reflectă, în esenţă, individualitatea biologică care defineşte răspunsul la agresiunea virală.

● Alegerea scorului

Scopul final al scorurilor utilizate în interpretarea biopsiei hepatice, prin evaluarea gradului şi

stadiului de activitate a bolii inflamatorii şi al fibrozei, este transmiterea de informaţii clare şi precise

pentru clinicieni (Lefkowitch, 2007). Consecutiv, alegerea şi utilizarea unui scor operaţional trebuie să

se fundamenteze pe: 1) existenţa unui consens între patologi şi clinicieni asupra criteriilor

histopatologice cuantificate în cadrul scorului respectiv; 2) formularea concisă şi consecventă, în

buletinul histopatologic, a informaţiilor referitoare la clasificare şi stadializare; 3) aplicabilitatea

informaţiilor pentru diagnostic şi terapie.

În baza experienţei noastre, în evaluarea semicantitativă a puncţiei biopsii hepatice, atât pentru

hepatita B, cât şi pentru hepatita C, am utilizat scorul Ishak. Alegerea este justificată prin faptul că

scala largă de valori numerice aferente evaluării activităţii necroinflamatorii şi fibrozei ne oferă criterii

mult mai precise pentru a putea evalua statusul afectării parenchimului hepatic la momentul

diagnosticului. Complementar scorului Ishak, pentru hepatita C se realizează în paralel o evaluare cu

scorul METAVIR, deoarece permite o evaluare a activităţii histologice de ansamblu, inclusiv prin

prezenţa hepatitei de interfaţă şi a componentelor necrozei lobulare asociate.

●Condiţii minime în evaluarea unei puncţii biopsii hepatice

Biopsia hepatică are valoarea unui eşantion reprezentativ pentru parenchimul hepatic. Totuşi,

biopsia hepatică, indiferent de lungimea sau lăţimea de bază, este doar o parte finită dintr-un organ cu

o foarte mare variabilitate potenţială în exprimarea bolii (Lefkowitch, 2007). Patologii preferă în mod

evident eşantioane mai mari pentru interpretare (Demetris, Ruppert, 2003), şi datele comparative

indică acum faptul că sunt necesare probe de 20 mm lungime, care să includă cel puţin 11 spaţii

portale pentru a avea o probă optimă pentru gradare şi stadializare (Colloredo et al., 2003, Lefkowitch,

2007).

În lotul nostru, fiecare preparat microscopic a avut între 3 şi 12 spaţii porto-bilare, cu o medie de

6-8 – valoare care poate susţine o evaluare diagnostică corectă.

CAPITOLUL 5. RELAŢIA CELULE KUPFFER – LEZIUNI INFLAMATORII ŞI FIBROZĂ

ÎN HEPATITELE CRONICE VIRALE B ŞI C

5.1. INTRODUCERE

Pentru prima dată în anul 1876, Karl Wilhelm von Kupffer descrie o populație celulară bine

reprezentată numeric la nivelul capilarelor sinusoide hepatice, pe care a intitulat-o ,,Sternzellen" sau

celule hepatice stelate, în raport cu forma acestora (Haubrich, 2004). Se considera atunci că aceste

celule sunt parte integrantă a endoteliului sinusoidelor hepatice și mai mult, că derivă din aceste celule

(Haubrich, 2004).

Celulele Kupffer sunt principalele celule fagocitare şi prezentatoare de antigen de la nivelul

sinusoidului hepatic, fiind în acelaşi timp şi surse importante de citokine cu efect chemotactic local sau

de stimulare a celulelor endoteliale și a celulelor Ito.

Deși microscopia optică standard surprinde fenomenul de creştere a numărului de celule

Kupffer la nivelul sinusoidului hepatic şi chiar ,,aglomerarea” acestor celule în anumite teritorii,

aprecierea mai exactă a intensității acestui fenomen se poate realiza doar prin examene suplimentare,

precum cel imunohistochimic. Pentru examinarea imunohistochimică se pot utiliza mai mulţi markeri

specifici, dintre aceștia evidenţierea antigenului CD68 este cunoscut în literatura de specialitate ca

fiind cel mai fidel marker de identificare a celulelor liniei monocit/macrofag (Mc Guinness et al.,

2000, Cardoso et al., 2004).

Scopul prezentului studiu este acela de a evalua nivelul hiperplaziei kupfferiene în hepatita

cronică virală cu virus hepatitic B (VHB) şi, respectiv, virus hepatitic C (VHC), şi de a corela

hiperplazia kupfferiană cu severitatea leziunilor hepatice, urmărind astfel modul în care celulele

Kupffer modulează modificările necro-inflamatorii şi fibroza specifice substratului morfologic al

hepatitei cronice.

9

5.2. MATERIAL ȘI METODĂ

Lotul de studiu a fost constituit dintr-un număr de 71 de cazuri de hepatită cronică virală (sublot

1 – 33 cazuri cu hepatită cronică B, sublot 2 - 38 de cazuri cu hepatită cronică C), diagnosticate în

cadrul Laboratorului de Anatomie Patologică şi Prosectură al Spitalului Clinic de Boli Infecţioase „Sf.

Parascheva” Iaşi.

Selectarea cazurilor s-a realizat pornind de la diagnosticul histopatologic stabilit conform

scorului Ishak (pentru hepatita cronică B şi C) și, respectiv, METAVIR (pentru hepatita cronică C),

criteriul principal luat în considerare fiind încadrarea într-o clasă de severitate în raport de activitatea

necro-inflamatorie uşoară, moderată şi, respectiv, severă.

Astfel, sublotul 1 a inclus: 10 cazuri cu activitate necroinflamatorie uşoară (scor 1-6), 17 cazuri

cu activitate necroinflamatorie moderată (scor 7-10) şi 6 cazuri cu activitate necroinflamatorie severă

(scor 11-18), iar sublotul 2: 11 cazuri cu activitate necroinflamatorie uşoară (scor 1-6), 18 cazuri cu

activitate necroinflamatorie moderată (scor 7-10) şi 9 cazuri cu activitate necroinflamatorie severă

(scor 11-18).

Lotul de studiu a fost investigat imunohistochimic utilizând un anticorp anti-CD68 (clone KP1,

Novocastra, Leica Biosystems), în diluţie 1:100, şi tehnica HIER (eng. heat-induced epitope retrieval).

Evaluarea cantitativă s-a realizat de către 2 examinatori independenți, pe 5 câmpuri

microscopice/caz, la puterea (x 200). După cuantificarea numărului de celule CD68 pozitive pentru

toate ariile examinate, valoarea medie obținută a fost asociată următorului sistem de scoruri (Boisclair

et al., 2001, Carotenuto et al., 2005, Tokin et al., 2011):

- un număr < 10 celule CD68 pozitive – scor 0;

- între 10-49 celule CD68 pozitive – scor 1;

- între 50-99 celule CD68 pozitive – scor 2;

- 100 de celule CD68 pozitive – scor 3.

Pentru interpretarea rezultatelor a fost utilizat testul t Student.

5.3. REZULTATE


Evaluarea calitativă a distribuției celulelor CD68 pozitive la nivelul capilarelor sinusoide a

permis identificarea următoarelor aspecte:

- prezența unui număr mic de celule CD68 pozitive, localizate în special în ariile sinusoidale

periportale la pacienții cu forme ușoare de activitate a bolii hepatice cronice;

- tendința extinderii la nivelul întregului lobul hepatic și, focal, concentrarea celulelor CD68

pozitive în anumite ,,zone de hiperplazie’’ la nivelul capilarelor sinusoide, evenimente strâns

legate de creșterea severității leziunilor necrotico-inflamatorii și a celor de fibroză atât portală

cât și intralobulară.

Imaginile din fig. 5.1 - 5.4 ilustrează distribuţia celulelor Kupffer, marcate imunohistochimic,

în parenchimul hepatic.

Fig. 5.1. Infiltrat inflamator fagocitar, celule CD68(+),

situate în parenchimul hepatic (x 20)

Fig. 5.2. Infiltrat inflamator fagocitar, celule

CD68(+), situate în parenchimul hepatic (x 20)

http://vet.sagepub.com/search?author1=J.+Boisclair&sortspec=date&submit=Submit

10

Fig. 5.3. Infiltrat inflamator fagocitar, celule CD68(+),

situate în parenchimul hepatic (x 40)

Fig. 5.4. Infiltrat inflamator fagocitar, celule

CD68(+), situate în spaţiul port (x 40)

5.3.2. Evaluare cantitativă

Evaluarea cantitativă a celulelor Kupffer este sumarizată în tabelele 5.3 și 5.4.

Tabel 5.3. Celule Kupffer în corelaţie cu sistemul de scor Ishak (ANI, fibroză) în hepatita cronică B

ANI

Cazuri

(# total)

ANI

scor

Cazuri

(#)

Celule CD68 +

(media SD,

scor)

Fibroză

scor

Cazuri

(#)

Celule CD68+

(media SD,

scor)

uşoară

scor 1-6 10

4 1

24,54 7,94

1

1 1

31.96 14,67

1

5 6 1 6

6 3 1 2

2 1

moderată

scor 7-10 17

7 5

83,45 28,44

2

1 4

2 1

8 4 3 4

107.96 18,87

3

9 5 3 5

10 3 3 3

severă

scor 11-18 6

11 5 126,45 8,28

3

3 3

4 2

12 1 3 1

Tabel 5.4. Celule Kupffer în corelaţie cu sistemul de scor Ishak (ANI, fibroză) şi sistemul de scor Metavir în

hepatita cronică C

Cazuri

(număr

total)

ANI

(scor)

Cazuri

(#)

Celule CD68+

(media SD,

scor)

Fibroz

ă scor

Cazuri

(#)

Celule CD68 +

(media SD,

scor)

Metavir

Scor

Cazuri

(#)

Celule CD68+

(media SD,

scor)

11 uşoară

2 1

30.64 10.09

1

1 1

33.51 14,69

1

A1F1 4

30.64 10,09

1

5 5 1 3

2 2

6 5

2 2 A1F1 4

3 3 94.05 31,37

2 A1F2 3

18 modera

tă

7 5

86.79 21.44

2

2 2 33.51 14,69

1 A2F1 2

76.89 18,36

2 3 3

94.05 31,37

2

A2F2 3

8 5 3 5 A2F2 5

9 4 3 4 A2F2 4

10 4 4 4 A3F3 4 119.62

15,62

3

11

5.3.3. Corelaţii între celulele Kupffer şi activitatea necroinflamatorie – scor Ishak

Pentru ambele tipuri de hepatite cronice, testul t-Student a relevat existenţa de diferenţe

semnificative între numărul de celule Kupffer corespondent celor 3 grade de activitate

necroinflamatorie, în comparaţia uşoară versus moderată (p < 0,001), uşoară versus severă (p < 0,001),

moderată versus severă (p < 0,001).

În evaluarea hepatită cronică B versus hepatită cronică C, nu au fost evidenţiate diferenţe

semnificative statistic între numărul de celule Kupffer corespunzător pentru fiecare grad de activitate

necroinflamatorie: uşoară (p = 0,13), moderată (p = 0,70), severă (p = 0,59).

5.3.4. Corelaţii între celulele Kupffer şi fibroză – scor Ishak


semnificative între numărul de celule Kupffer corespondent celor 2 grade de fibroză, uşoară versus

severă (p < 0,001). Pentru hepatita cronică C, diferenţe semnificative statistic au fost înregistrate şi în

analiza numărului de celule Kupffer prezent în fibroza apreciată cu scor 1 şi 2 versus fibroza apreciată

cu scor 3 (p < 0,001) (fig. 5.46), respectiv scor 4 (p < 0,001), şi fibroza apreciată cu scor 3 versus

fibroza apreciată cu scor 4 (p < 0,001).

5.3.5. Corelaţii între celulele Kupffer şi scorul METAVIR

Analiza statistică de corelaţie bazată pe scorul Metavir, aplicată numai pentru hepatita cronică

C, a relevat diferenţe semnificative (p < 0,001) între numărul celulelor Kupffer corespondente

cazurilor evaluate cu scorul A1F1/A1F2 versus scorul A2F1/A2F2 versus scorul A3F3.

5.4. DISCUȚII

5.4.1. Celulele Kupffer şi activitatea necro-inflamatorie – scorul Ishak

Celulele Kupffer desfășoară o activitate fagocitară intensă la nivelul parenchimului hepatic,

fiind un filtru pentru structurile antigenice vehiculate de la nivelul tractului digestiv prin vena portă.

Activitatea fagocitară este susținută de sinteza de cytokine inflamatorii precum: IL-1, IL-6, IL-12,

TNF, GM-CSF, CXCL9, CXCL10, MIP-1 (eng. Macrophage Inflammatory Protein 1 alpha) și

RANTES (eng. Regulated on Activation, Normal T-cell Expressed and Secreted) (Cousens, Wing,

2000, Melgert et al., 2001, Kinoshita et al., 2010). De asemenea, în patologia hepatică virală, celulele

Kupffer activate exprimă pe suprafață o serie de molecule care conferă acestor celule trăsături

asemnănătoare unei celule prezentatoare de antigen, precum CD80, CD40 (Kolios et al., 2006).

Este în prezent tot mai intens susținută ideea existenței unei heterogenități celulare în cadrul

populației kupfferiene, bazată nu numai pe relația clasică dintre dimensiune-localizare la nivelul

sinusoidelor hepatice, conform căreia celulele Kupffer periportale sunt mai mari și mai intens

fagicitare comparativ cu cele situate în jurul venulei centrolobulare, mai mici și implicate în principal

în sinteza de cytokine (Mc Guinness et al., 2000, Bilzer et al., 2006, Kinoshita et al., 2010).

Din păcate datele privind rolul acestor celule în hepatitele cronice virale, atât cu VHB cât și cu

VHC sunt departe de a fi elucidate în prezent (Cardoso et al., 2004, Szabo et al., 2007).

Rezultatele noastre, bazate pe marcarea IHC şi cuantificarea celulelor Kupffer în hepatita

cronică B şi, respectiv, hepatita cronică C, în raport de activitatea necro-inflamatorie, a relevat

creşterea semnificativă statistic (p < 0,001) a numărului de celule Kupffer de la forma cu activitate

necro-inflamatorie uşoară la forma cu activitate activitate necro-inflamatorie moderată şi, respectiv,

severă. Extrem de interesant este însă faptul că analiza statistică nu a evidenţiat diferenţe

semnificative statistic între numărul de celule Kupffer corespondente celor 3 forme diferite de

activitate necroinflamatorie (uşoară, medie, respectiv severă), cuantificate în hepatita virală B şi,

respectiv, hepatita virală C. Acest rezultat poate indica, prin prisma mecanismului patogenic, faptul că

evoluţia diferită a celor două tipuri de hepatite nu depinde de hiperplazia kupfferiană, considerată strict

ca valoare numerică, ci de comportamentul efectiv al hepatocitelor, în raport cu agentul patogenic.

5.4.2. Celulele Kupffer şi fibroza – scorul Ishak

Fibroza hepatică reprezintă în esență un proces caracterizat printr-o depunere în exces de

matrice extracelulară conjunctivă la nivelul parenchimului hepatic, matrice ce are și o compoziție

diferită de cea prezentă în mod normal în această zonă (Benyon, Iredale, 2000). Astfel, în stadiile

12

avansate, la nivelul ficatului se poate găsi o cantitate de 6 ori mai mare de matrice extracelulară decât

normalul.

Implicarea celulelor Kupffer în activarea celulelor Ito, respectiv activitarea fibrinogenică la

nivelul parenchimului hepatic este unanim recunoscută în prezent (Maher, 2001, Ryder et al., 2004,

Friedman, 2005, Heymann et al., 2009, Forbes, Parola, 2011). Cu toate acestea, aspectele moleculare

ale interacțiunii dintre macrofagele hepatice activate și celulele miofibroblaste sunt încă incomplet

cunoscute, constituind un punct de interes în ceea ce privește cercetarea de noi eventuale ținte

terapeutice ale fibrozei hepatice (Tacke, 2012). Studii de ultimă oră au evidențiat că infecția hepatică cronică cu VHB, chiar și în cazurile ce

prezentau o activitate necrotico-inflamatorie redusă, este asociată cu dezvoltarea sintezei de colagen la

nivel sinusoidal și portal. Acest fapt se datorează reactivității celulelor Kupffer, care și în formele cu

agresivitate ușoară produc o serie de citokine pro-fibrinogenetice precum TGF-β1 (Li et al., 2012).

Mai mult, este unanim acceptat faptul că pacienții cu hepatită cronică cu VHC prezintă leziuni

de fibroză mult mai severe comparativ cu pacienţii cu hepatită cronică indusă de VHB (Lefkowitch,

2010, Tokin et al., 2011).

Consecutiv, în cercetarea proprie am urmărit existenţa unei corelații directe între intensitatea

leziunilor de fibroză, dezvoltate în paralel cu activitatea necro-inflamatorie, și hiperplazia celulelor

CD68+.

În mod concret, în sublotul care a inclus cazurile cu hepatită cronică B:

- din cele 10 cazuri cu activitate necro-inflamatorie uşoară, 9 au asociat fibroză apreciată cu scor 1,

iar 1 singur caz - fibroză apreciată cu scor 2;

- din cele 17 cazuri cu activitate necro-inflamatorie moderată, 4 cazuri au asociat fibroză apreciată

cu scor 1, 1 caz a asociat fibroză apreciată cu scor 2, 12 cazuri au prezentat fibroză apreciată cu

scor 3;

- din cele 6 cazuri cu activitate necro-inflamatorie severă, 4 cazuri au asociat fibroză apreciată cu

scor 3, iar 2 cazuri - fibroză apreciată cu scor 4.

În sublotul care a inclus cazurile cu hepatită cronică C:

- din cele 11 cazuri cu activitate necro-inflamatorie uşoară, 4 cazuri au asociat fibroză apreciată cu

scor 1, 4 cazuri au prezentat fibroză apreciată cu scor 2, iar 3 cazuri - fibroză apreciată cu scor 3;

- din cele 18 cazuri cu activitate necro-inflamatorie moderată, 2 cazuri au asociat fibroză apreciată

cu scor 2, 12 cazuri au asociat fibroză apreciată cu scor 3, 4 cazuri au prezentat fibroză apreciată

cu scor 4;

- toate cele 9 cazuri cu activitate necro-inflamatorie severă au asociat fibroză apreciată cu scor 4.

Evaluarea severităţii fibrozei în raport de activitatea necroinflamatorie a relevat că, pentru

hepatita cronică C, leziunile au fost mai importante. Pentru activitatea necroinflamatorie uşoară au

existat, comparativ cu hepatita cronică B, mai multe cazuri cu scor 2 pentru fibroză, precum şi cazuri

în care fibroza a fost cuantificată cu scor 3. Pentru activitatea necroinflamatorie moderată, comparativ

cu hepatita cronică B, cazurile cu fibroză cu scor 1 au fost absente, şi au existat cazuri cu fibroză

apreciată cu scor 4. Pentru activitatea necroinflamatorie, comparativ cu hepatita cronică B, toate

cazurile au prezentat fibroză cu scor 4.

Pentru fiecare tip de hepatită, am înregistrat diferenţe semnificative statistic între numărul de

celule Kupffer asociat cazurilor cu fibroză evaluată cu scor 1 şi 2 şi, respectiv, cazurilor cu fibroză

evaluată cu scor 3 şi 4 (p < 0,001). Notăm, de asemenea, faptul că valoarea de scor corespunzător

expresiei celulelor Kupffer a crescut de la 1 la 3 pentru hepatita cronică B, şi de la 1 la 2 pentru

hepatita cronică C, în corespondenţă cu fibroza uşoară şi, respectiv, severă. Totuşi, în pofida

diferenţelor de scor al fibrozei la aceeaşi intensitate de activitate necro-inflamatorie, semnalate mai

sus, analiza statistică a relevat absenţa diferenţelor semnificative statistic între hepatita cronică B şi

hepatita cronică C, în raport de numărul de celule Kupffer corespunzător cazurilor cu fibroză cu scor 1

şi 2 şi, respectiv, cazurilor cu fibroza cu scor 3 şi 4.

Acest rezultat negativ susţine ideea conform căreia dezvoltarea fibrozei nu este apanajul

exclusiv al celulelor Kupffer. Modificările ,,dramatice”/importante din ultimii 10-15 ani privind

fibroza hepatică au fost în strânsă relație cu descifrarea dinamicii și ultrastructurii matricei

extracelulare, cu elucidarea biologiei miofibroblastelor hepatice și nu în ultimul rând cu integrarea

tuturor acestor noi elemente în procesul complex cunoscut astăzi drept „reparare conjunctivă”

(Friedman, 2008, Iredale, 2008). Este foarte posibil ca celulele Kupffer să intervină şi în procesul

13

rezoluției fibrozei hepatice. Ipoteze relativ recente sugerează că aceste celule ar putea acționa prin mai

multe mecanisme: fie direct, fie prin sinteza unor proteaze ce degradează matricea extracelulară, fie

prin stimularea de alte celule care produc aceste enzime, printre care posibil să se numere și celulele

hepatice stelate (Friedman, 2005).

Consecutiv, deși mult studiată, relația dintre celula Kupffer și fibroza hepatică este încă un

subiect deschis, potențialul său pro-fibrinogenetic dar mai ales cel anti-fibrinogenetic fiind departe de

a fi cunoscut.

5.4.3. Celulele Kupffer şi scorul Metavir

Deşi scorul Metavir asigură o evaluare specifică şi reproductibilă pentru hepatita virală C

(Standish et al., 2006), fiind larg utilizat în formularea diagnosticului histopatologic, trecerea în revistă

a fluxului principal de publicaţii a relevat absenţa completă a cercetărilor direcţionate asupra relaţiei

dintre celulele Kupffer şi severitatea leziunilor, în corespondenţă cu categoriile de scor Metavir, în

acest tip de hepatită. Există, după cunoştinţele noastre, un singur studiu care cuantifică celulele

Kupffer şi analizează dinamica lor în raport de parametrul F al scorului Metavir, în contextul patologic

al hepatitei cronice induse de consumul de alcool şi al fibrozei dezvoltate în evoluţia acestei entităţi

(Chedid et al., 2004).

Studiul la care facem referinţă indică existenţa unei corelaţii directe între expresia CD68, ca

marker al celulelor Kupffer, şi gradul de severitate al bolii, progesiv din stadiul I spre stadiul III

(Chedid et al., 2004).

În acest context, considerăm că datele noastre au un grad de noutate susţinut de diferenţele

observate prin comparaţia rezultatelor obţinute utilizând cele două scoruri, Ishak şi Metavir. În opinia

noastră, cele 3 clase de severitate, A1F1/A1F2, A2F1/A2F2 şi A3F3 ale scorului Metavir reflectă mai

corect evoluţia leziunilor, inclusiv prin corespondenţa activitate necro-inflamatorie – fibroză, decât

clasele de severitate definite separat prin activitate necro-inflamatorie, respectiv fibroză, în scorul

Ishak. Argumentul cel mai convingător este dat de cele 4 cazuri care, conform scorului Ishak, au fost

încadrate în categoria ANI moderată, scor 10, şi fibroză scor 4, dar care conform scorului Metavir au

fost încadrate într-o categorie de severitate superioară, prin scorul A3F3. Diferenţele semnificative

statistic între numărul celulelor Kupffer (medie şi SD) în cele 3 clase de severitate Metavir indică

implicarea celulelor Kupffer deopotrivă în creşterea inflamaţie şi a fibrozei, în evoluţia severităţii

leziunilor în hepatita C.

CAPITOLUL 6. RELAŢIA LIMFOCITE T CD4/CD8 - LEZIUNI INFLAMATORII ŞI

FIBROZĂ ÎN HEPATITELE CRONICE VIRALE B ŞI C

6.1. INTRODUCERE

În literatura de specialitate sunt disponibile numeroase studii care au vizat analiza compoziției

infiltratului inflamator periportal și sinusoidal prin metode imunohistochimice, în raport de etiologia și

gradul de activitate necro-inflamatorie (ANI) a hepatitelor cronice virale.

Ȋn cadrul populației celulare inflamatorii de la nivelul parenchimului hepatic, cele mai

numeroase celule sunt limfocitele T (75%). În structura populației limfocitare T, raportul dintre

celulele CD4+/CD8+ este mai mare de 1,5 (Walewska-Zielecka et al., 2008). Într-o proporție

semnificativ mai mică se găsesc limfocitele B (15%), restul (10%) fiind reprezentat din alte tipuri

celulare: macrofage și celule NK (Walewska-Zielecka et al., 2008). Numeroase studii au demonstrat că

răspunsul imunologic specific susținut al gazdei asigură clearance-ul viral, atât în infecția cu virus

hepatitic B, cât și în cea cu virus hepatitic C (Thimme et al., 2002, Rehermann, 2009, Fafi-Kremer et al.,

2012). Ca urmare, eșecul clearance-ului viral, cel puțin în cazul infecției cu virus hepatitic C, se

datorează în parte unui răspuns imun specific al organismului gazdă inadecvat sau insuficient (Thimme

et al., 2012).

Scopul prezentului studiu este acela de a evalua populaţia limfocitară T CD4+/ CD8+ în

hepatita cronică virală cu virus hepatitic B şi, respectiv, virus hepatitic C, şi de a corela expresia

acesteia cu severitatea leziunilor hepatice, urmărind astfel modul în care limfocitele CD4+ / CD8+

modulează modificările necro-inflamatorii şi fibroza specifică substratului morfologic al hepatitei

cronice.

14

6.2. MATERIAL ȘI METODĂ

Lotul de studiu, protocolul de lucru imunohistochimic, principiile de evaluare cantitativă şi

instrumentele statistice au fost prezentate în Capitolul 5, capitol care include cercetarea axată asupra

celulelor Kupffer, în relaţie cu activitatea necro-inflamatorie şi fibroză.

Diferenţele care trebuie subliniate sunt legate de anticorpii utilizaţi, anume anti-CD4, respectiv

anti-CD8. Pentru fiecare tip de marker evaluat, valoarea medie raportată a rezultat ca urmare a

cuantificării celulelor prezente în 10 câmpuri microscopice cu densitate celulară crescută, la

magnificaţie x 200.

6.3. REZULTATE


Evaluarea calitativă a distribuției limfocitelor T CD4+ şi CD8+ la nivelul parenchimului

hepatic a permis identificarea următoarelor aspecte:

- prezența unui număr mic de limfocite CD4+, CD8+, localizate în special în ariile periportale,

la pacienții cu forme ușoare de activitate a bolii hepatice cronice;

- tendința concentrării limfocitelor CD4+, CD8+ la nivelul ariilor periportale, evenimente strâns

legate de creșterea severității leziunilor necrotico-inflamatorii și a celor de fibroză atât portală

cât și intralobulară.

Imaginile din fig. 6.1 - 6.8 ilustrează o parte din rezultatele obținute în ceea ce privește

distribuţia limfocitelor CD4+ și CD8+, marcate imunohistochimic, în cadrul lotului studiat.

Fig. 6.1. Infiltrat inflamator limfocitar, celule CD4(+),

situate în parenchimul hepatic (x20)

Fig. 6.2. Infiltrat inflamator limfocitar, celule

CD4(+), situate în spaţiul port (x40)


situate în spaţiul port (x40)


CD4(+), situate în spaţiul port (x40)

15




CD8(+), situate în parenchimul hepatic (x40)




CD8(+), situate în parenchimul hepatic (x20)

6.3.2. Evaluare cantitativă

Tabel 6.4. Celule CD8+/CD4+, în corelaţie cu sistemul de scor Ishak (ANI, fibroză) în hepatita cronică B

ANI

Cazuri

(#total)

ANI

Scor

Cazuri

(#)

Celule

CD8+

(media

SD)

Celule

CD4+

(media

SD)

Fibroză

scor

Cazuri

(#)

Celule

CD8+

(media

SD)

Celule

CD4+

(media

SD)

Uşoară

Scor 1-6 10

4 1

43,12 8,27 76,65

20,68

1 1

50,32

13,83

84,28

22,10

5 6 1 6

6 3 1 2

2 1

Moderată

Scor 7-10 17

7 5

68,28

11,40

97,44

14,14

1 4

2 1

8 4 3 4

89,06

28,61

119,00

34,55

9 5 3 5

10 3 3 3

Severă

Scor 11-

18

6 11 5 120,23

20,04

121,25

18,08

3 3

4 2

12 1 3 1

16

În baza rezultatelor obţinute pentru fiecare caz în parte, tabelele 6.4 şi 6.5 sumarizează relaţia

dintre prezenţa limfocitelor CD8+, respectiv CD4+ şi intensitatea activitătii necro-inflamatorii

(stabilită, în raport de scor, ca uşoară, moderată şi severă), respectiv gradul de fibroză (apreciat ca uşor

pentru scorul 1-2 şi sever pentru scorul 3-4) – scor Ishak, iar tabelul 6.6 – în raport de scorul Metavir.

Ȋn ansamblul cazurilor de hepatită cronică B, valoarea numerică pentru CD8+ a fost 70,16 29,50,

iar pentru CD4+ - 95,46 22,55.

Pentru hepatita cronică C, valoarea numerică pentru CD8+ a fost 89,43 26,44, iar pentru CD4+ -

116,47 33,87.

Tabel 6.5. Celule CD8+/CD4+, în corelaţie cu sistemul de scor Ishak (ANI, fibroză) în hepatita cronică C

Cazuri

(#total)

ANI

(scor)

Cazuri

(#)

Celule

CD8+

(media

SD)

Celule

CD4+

(media

SD)

Fibroză

scor

Cazuri

(#)

Celule

CD8+

(media

SD)

Celule

CD4+

(media

SD)

11 uşoară

2 1

60.32

13.01

82.14

16.24

1 1

63.78

16.99

85.00

20.25 5 5

1 3

2 2

6 5

2 2

3 3 98.59

23.04

127.71

30.62

18 moderat

ă

7 5

91.03

16.50

112.19

13.15

2 2 63.78

16.99

85.00

20.25

3 3

98.59

23.04

127.71

30.62

8 5 3 5

9 4 3 4

10 4 4 4

9 severă 11 5 121.81

9.65

166.89

8.76

4 5

12 4 4 4

Analiza statististică de corelaţie a evidenţiat diferenţe semnificative statistic între numărul de

limfocite T CD8+ şi, respectiv, CD4+, atât pentru lotul 1 – hepatită cronică B, cât şi pentru lotul 2 –

hepatită cronică C (p < 0,0001).

Tabel 6.6. Celule CD8+/CD4+, în corelaţie cu sistemul de scor Metavir în hepatita cronică C

Cazuri

Cases

(#total)

Metavir

Scor

Metavir

score

Cazuri

Cases

(#)

Celule CD8+

CD8+ cells

mean SD,

score

(media SD)

Celule CD4+

CD4+ cells

mean SD, score

(media SD)

11

A1F1 4

60.33 13.02 82.15 16.25 A1F1 4

A1F2 3

18

A2F1 2

87.90 15.23 113.32 12.38 A2F2 3

A2F2 5

A2F2 4

A3F3 4

115.72 15.35 148.92 30.33 9 A3F3 9

17

De asemenea, au fost prezente diferenţe semnificative în corelaţia limfocite T CD8+, respectiv

T CD4+, în hepatită cronică B versus hepatită cronică C (p = 0,005, respectiv p = 0,002).

6.3.3. Corelaţii între limfocitele CD4/CD8şi ANI – scor Ishak


semnificative între numărul de celule CD4+corespondent celor 3 grade de activitate necroinflamatorie,

în comparaţia uşoară versus moderată (p < 0,0001), uşoară versus severă (p < 0,0001), moderată

versus severă (p < 0,0001).

Ȋntre numărul de celule CD8+, pentru hepatita cronică B, au fost obţinute diferenţe

semnificative între ANI uşoară versus moderată (p=0,01), uşoară versus severă (p=0,0007), moderată

versus severă (p=0,02). Rezultate similare au fost înregistrate în hepatita cronică C, cu un grad înalt de

semnificaţie statistică (p < 0,0001) între cele 3 tipuri de ANI.

6.3.4. Corelaţii între limfocitele CD4/CD8 şi fibroză – scor Ishak

În ambele tipuri de hepatite, au fost înregistrate diferenţe semnificative statistic între limfocitele

T CD8+, respectiv limfocitele T CD4+ şi forma de fibroză uşoară versus severă (în toate cazurile p <

0,0001, cu excepţia hepatitei cronice B, limfocite T CD4+ în fibroza uşoară versus severă, unde p =

0,001).

6.3.5. Corelaţii între limfocitele CD4/CD8 şi scorul METAVIR

Pentru hepatita cronică C, evaluată prin scorul Metavir, diferenţe înalt semnificative statistic (p

< 0,0001) s-au înregistrat în evaluarea comparativă a limfocitelor T CD8+ în raport de scorurile

A1F1+A1F2 versus A2F1+A2F2, A2F1+A2F2 versus A3F3 şi A1F1+A1F2 versus A3F3, precum şi

în evaluarea comparativă a limfocitelor T CD4+ în raport de scorurile A1F1+A1F2 versus

A2F1+A2F2 şi A1F1+A1F2 versus A3F3, pentru scorul A2F1+A2F2 versus A3F3 notându-se p =

0,001.

De asemenea, au fost obţinute diferenţe semnificative între numărul celulelor CD8+ versus

CD4+ corespondente cazurilor evaluate cu scorul A1F1/A1F2 (p = 0,0002), scorul A2F1/A2F2 (p =

0,001) şi scorul A3F3 (p = 0,0008).

6.4. DISCUȚII

6.4.1. Rolul limfocitelor T în patogenia hepatitelor cronice

Prin complexitatea sa funcţională, fundamentată pe micromediului imunologic particular, ficatul

are capacitatea de a ,,tolera” anumite structuri antigenice, sau de a iniţia un răspuns imunologic, în

special împotriva structurilor virusurilor hepatitice.

Parenchimul hepatic este caracterizat prin prezenţa constantă a unui infiltrat inflamator cronic,

atât la nivel portal, cât și sinusoidal. Populația celulară inflamatorie portală este dominată de prezența

limfocitelor T CD4+, în timp ce limfocitele B, respectiv limfocitele T CD8+ sunt predominat

concentrate în sinusoidele hepatice, iar la nivelul spațiilor porto-biliare sunt dispuse în zona periferică

(Walewska-Zielecka et al., 2007). Mai mult, infecția cu virus hepatitic C este uneori asociată cu

apariția de noduli limfoizi secundari la nivelul spațiului port, prezența acestora fiind semnificativ mai

rară la pacienții cu infecție cronică hepatică indusă de virus hepatitic B (Murakami et al., 1999).

6.4.2. Populaţii limfocitare în parenchimul hepatic

Pe parcursul documentării aferente acestui subiect am identificat foarte puţine raportări de date

numerice rezultate prin cuantificarea populaţiei limfocitare la nivelul parenchimului hepatic (Mariani

et al., 1984, Onji et al., 1988, Walewska-Zielecka et al., 2007, Carmack et al., 2008) şi, consecutiv,

absenţa relativă a unor corelaţii între între numărul de limfocite şi gradul de severitate al bolii, stabilit

prin utilizarea sistemelor de scor.

În acest context, considerăm că studiul nostru constituie o contribuţie importantă la întregirea

profilului morfologic al hepatitelor cronice, prin prisma caracterizării numerice a infiltratului

inflamator limfocitar.

Trebuie subliniat faptul că valorile numerice obţinute pentru ambele subtipuri limfocitare au fost

mai mici în hepatita cronică B comparativ cu hepatita cronică C, cu diferenţe semnificative statistic,

18

rezultat care confirmă prin criterii cantitative, obiective (respectiv cifre), diferenţele morfologice

descrise prin caracterizarea calitativă a hepatitei cronice B şi, respectiv, C.

În ambele tipuri de hepatită cronică au fost identificate ambele subtipuri de limfocite T, valoarea

numerică globală (medie SD) a limfocitelor T CD4+ (95,46 22,55 în hepatita cronică B, respectiv

116,47 33,87 în hepatita cronică C) fiind mai mare comparativ cu cea a limfocitelor T CD8+ (70,16

29,50 în hepatita cronică B, respectiv 89,43 26,44 în hepatita cronică C), diferenţele fiind

semnificative statistic.

În baza rezultatelor obţinute, considerăm că valorile numerice corespunzătoare subtipului

limfocitar T CD4+ reflectă procesul de proliferare limfocitar care susţine un răspuns imun benefic

dezvoltat la nivelul gazdei - reacția CD4+ necorespunzătoare fiind însoțită de creșterea viremiei la

câteva luni de aparent control a acesteia (Gerlach et al., 1999, Nascimbeni et al., 2003) şi fiind asociată

cu cronicizarea bolii.

6.4.3. Limfocitele CD4/CD8 şi activitatea necro-inflamatorie – scorul Ishak

Rezultatele noastre, bazate pe marcarea IHC şi cuantificarea limfocitelor T CD8+ în hepatita

cronică B, în raport de activitatea necro-inflamatorie, au relevant creşterea semnificativă statistic a

numărului acestora între activitatea necro-inflamatorie uşoară versus moderată (p = 0,01), uşoară

versus severă (p = 0,0007) şi moderată versus severă (p = 0,02). În paralel, şi limfocitele T CD4+ au

prezentat diferenţe înalt semnificative statistic între cele 3 grade de activitate necro-inflamatorie (p <

0,0001). Rezultate similare au fost înregistrate în hepatita cronică C, pentru ambele subtipuri

limfocitare, cu un grad înalt de semnificaţie statistică (p < 0,0001). Aceste date demonstrează că

proliferarea graduală a ambelor subtipuri limfocitare se corelează direct cu severitatea graduală a

leziunilor hepatice reflectate prin activitate necro-inflamatorie definită evolutiv, prin valorile scorului

Ishak, ca uşoară, moderată şi severă.

Absenţa diferenţelor semnificative statistic între populaţia limfocitară T CD4+ din hepatita

cronică B şi hepatita cronică C, în cazul unei activităţi necro-inflamatorii uşoare, relevă debutul relativ

similar, sub aspect histopatologic. Ulterior însă, în leziunile caracteristice activităţii necro-inflamatorii

severe, sunt absente diferenţele semnificative între populaţia limfocitară CD8+. Interpretarea acestor

date, în condiţiile în care evoluţia clinică a hepatitei virale C este mult mai agresivă comparativ cu

hepatita cronică B, face apel la funcţionalitatea limfocitelor, şi nu la numărul acestora – astfel încât

citotoxicitatea limfocitelor T CD8+ constituie doar o verigă în mecanismul patogenic al leziunilor

specifice hepatitei C.

6.4.4. Limfocitele CD4/CD8 şi fibroza – scorul Ishak

În cercetarea proprie am urmărit existenţa unei corelații directe între intensitatea leziunilor de

fibroză, dezvoltate în paralel cu activitatea necro-inflamatorie, și expresivitatea CD4+ / CD8+.

Faptul că atât în hepatita cronică B, cât şi în hepatita cronică C, ambele subtipuri limfocitare diferă

semnificativ statistic între gradul de fibroză uşoară şi fibroză medie indică corelaţia existentă între

numărul limfocitelor şi intensitatea activităţii fibrinogenice.

Analiza comparativă a subtipurilor limfocitare, în hepatita cronică B versus C a relevat existenţa

de diferenţe semnificative pentru limfocitele T CD4+ în fibroza uşoară, şi absenţa oricăror diferenţe

semnificative statistic, atât pentru limfocitele T CD4+, cât şi pentru limfocitele T CD8+, în fibroza

severă. Aceste rezultate numerice se suprapun peste fibrilogeneza marcată specifică hepatitei cronice

C, sugerând rolul subtipului limfocitar T CD4+ în faza iniţială.

6.4.5. Limfocitele CD4/CD8 şi scorul Metavir

Rezultatele obţinute în evaluarea limfocitelor T CD4+ şi CD8+ în hepatita cronică C, în raport

de gradarea leziunilor conform scorului Metavir, au confirmat datele obţinute în analiza statistică

aplicată în raport cu scorul Ishak. În esenţă, datele au indicat existența unei corelaţii între cele două

subtipuri limfocitare şi intensitatea leziunilor, precum şi valoarea raportului existent între CD4+ şi

CD8+, în fiecare clasă de severitate în parte.

19

CAPITOLUL 7. MORFOMETRIE COMPUTERIZATĂ ÎN EVALUAREA LEZIUNILOR DE

FIBROZĂ – CONCEPEREA ŞI IMPLEMENTAREA UNUI INSTRUMENT OPERAŢIONAL

7.1. INTRODUCERE

Infiltratul inflamator, necroza parcelară periportală, necroza în punţi şi fibroza sunt leziunile

morfologice care caracterizează hepatitele. În baza acestor leziuni identificate calitativ şi folosind

scoruri unanim acceptate (Knodell, Ludgiw, METAVIR), care permit o evaluare semicantitativă,

anatomo-patologul stabileşte stadiul evolutiv, gradul de severitate/agresivitate a bolii şi, eventual,

precizează etiologia virală.

În prezent, o tendinţă modernă în cercetarea ştiinţifică la nivel internaţional este dezvoltarea

unor tehnici de analiză cantitativă (sau de morfometrie interactivă şi/sau automată) prin care să se

obţină informaţii mult mai precise, obiective, referitoare la gradul de afectare hepatică în hepatite şi

ciroze.

Literatura de specialitate sumarizează, în ultimele 3 decenii, un număr redus de articole (sub 30)

dedicate acestui subiect (Manabe et al., 1993, Kage et al., 1997, Duchatelle et al., 1998, Pilette et al.,

1998, Masseroli et al., 2000, O’Brien et al., 2000, Bedossa et al., 2003, Dioguardi et al., 2005).

Pornind de la fondul raportărilor existente în literatura de specialitate în acestă direcţie,

obiectivul urmărit a constat în conceperea şi implementarea unui algoritm de cuantificare automată a

leziunilor specifice de fibroză, aplicabil în hepatita cronică B şi C.

7.2. MATERIAL ŞI METODĂ

7.2.1. Preparate microscopice, imagini digitizate

Materialul studiat a fost reprezentat de 16 preparate microscopice de puncţie biopsie hepatică, în

coloraţie tricromică Szekelly, corespunzătoare unui număr de 8 cazuri de hepatită cronică B şi 8 cazuri

de hepatită cronică C.

În alegerea preparatelor microscopice pentru morfometrie computerizată am urmărit să ilustrăm

evoluţia leziunilor de fibroză, reflectată prin încadrarea în clase de severitate diferită, notate în

conformitate cu scorul Ishak.

Preparatele microscopice au fost utilizate pentru realizarea de imagini digitizate corespondente,

prin facilităţile mediului KS400 (Kontron Elektronik, 2002) existent în cadrul laboratorului Disciplinei

de Histologie, Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” Iaşi.

Aplicaţia de morfometrie computerizată a fost realizată pe imaginile digitizate obţinute.

Conceperea şi implementarea acestei aplicaţii au rezultat în urma integrării studiului propriu în cadrul

direcţiei de cercetare asumată în cadrul colectivului Disciplinei de Histologie.

7.2.2. Procesarea imaginilor digitale

Imaginile digitale obţinute au fost procesate pentru a accentua vizibilitatea unor elemente

morfologice de interes, prin operaţii de ajustare a contrastului şi a luminozităţii, filtrare, şi

reducerea zgomotului. Suportul matematic al acestor operaţii este prezentat succint în cele ce

urmează, în conformitate cu conceptele specifice care fundamentează vederea computerizată

(eng. computer vision) (Shapiro, Stockman, 2001, Gonzales, Woods, 2002, Căruntu, 2003).

7.2.3. Segmentarea imaginilor digitale

În limbajul specific procesării de imagini, entităţile morfologice de interes reprezintă regiuni din

imaginea digitală. Regiunile pot fi definite drept grupuri de pixeli caracterizate de un anumit grad de

omogenitate în raport cu o anumită proprietate: nivel de gri (sau culoare), sau modulul gradientului

funcţiei nivel de gri (Căruntu, 2003). Operaţia prin care se realizează separarea automată a unor regiuni

(ce prezintă similarităţi) din imaginea digitală se numeşte segmentare. Când separarea se referă la un

singur tip de regiuni, rezultatul segmentării este o imagine binară în care pixelii au valoarea 1 (alb) dacă

sunt situaţi (din punct de vedere al poziţionării) în regiunile considerate şi, respectiv, valoarea 0 (negru)

dacă sunt situaţi în afara acestor regiuni (Căruntu, 2003). Au fost selectaţi numai acei pixeli ai căror

coordonate de culoare s-au încadrat într-un paralelipiped cu vârfurile date de LR, LG, LB şi,

respectiv, HR, HG, HB, din interiorul cubului RGB. Astfel, prin alegerea valorilor prag, şi,

implicit, prin delimitarea unui interval specific pentru fiecare culoare (între 0 şi 255), am stabilit

20

care dintre elementele morfologice din imagine, corespunzătoare unui anumit domeniu RGB,

sunt păstrate sau nu în imaginea rezultată.

7.3. REZULTATE

7.3.1. Conceperea macroului HEPAT

Macroul HEPAT a fost conceput prin scrierea directă a instrucţiunilor, fără a mai face apel la

cutiile de dialog – reflectând astfel o exploatare profesionistă a mediului KS400, în baza experienţei de

utilizare dezvoltată pe parcursul stagiului doctoral.

7.3.2. Cuantificarea fibrozei

Valorile numerice procentuale ale ariilor de fibroză ocupate în suprafaţa totală a puncţiei relevă

o creştere progresivă în raport de gradul de fibroză. Pentru hepatita cronică B, valoarea minimă,

corespunzătoare scorului de fibroză 1, a fost 2,6%, iar valoarea maximă, corespunzătoare scorului de

fibroză 4, a fost 12%.

Pentru hepatita cronică C, valoarea minimă, corespunzătoare scorului de fibroză 1, a fost 3,1%,

iar valoarea maximă, corespunzătoare scorului de fibroză 4, a fost 21,5%.

Tabelul 7.4 sumarizează informaţiile numerice procentuale corespunzătoare celor 4 grade de

fibroză, comparativ pentru hepatita cronică B şi hepatita cronică C.

Compararea valorilor procentuale ale ariilor de fibroză ocupate în aria totală de suprafaţă a

puncţiei nu a putut fi realizată prin instrumentele specifice analizei statistice, datorită numărului mic

de cazuri investigate pentru fiecare grad de fibroză (respectiv 2 cazuri).

Totuşi, cifrele indică diferenţe mici între procentul ocupat de fibroză în cazurile apreciate cu

grad de fibroză 1 şi 2, între hepatita cronică B şi, respectiv C, o diferenţă moderată pentru cazurile

încadrate în gradul de fibroză 3, şi o diferenţă considerabilă, de peste 4,5%, pentru cazurile cu grad de

fibroză 4.

Tabel 7.4. Dimensiuni corespunzătoare fibrozei în raport de scor, în ambele tipuri de hepatite

Scor fibroză

Dimensiuni fibroză

(% arie totală PBH)

Hepatită cronică B Hepatită cronică C

1 2.57 3.15

2 3.50 3.65

3 4.90 6.5

4 10.75 15.15

7.4. DISCUTII

7.4.1. Valoarea morfometriei computerizate în evaluarea fibrozei hepatice

Practica clinică în domeniul patologiei hepatice relevă, din ce în ce mai mult, faptul că

evaluarea fibrozei este un element extrem de important în aprecierea evoluţiei şi prognosticului

hepatitelor cronice. În status de normalitate, parenchimul hepatic conţine aproximativ 5,5 mg/g de

colagen, iar în leziunile cirotice - 30 mg/g (Rojkind, Ponce-Noyola, 1982). În evoluţia unor procese

patologice diferite se depun cantitaţi diferite de colagen, în corespondenţă cu stadiile de severitate ale

bolii.

Din păcate însă, sistemele de scor operaţionale în gradarea leziunilor hepatice – inclusiv a

fibrozei au limite din ce în ce mai evidente. Ca urmare, eforturile specialiştilor în domeniu sunt

direcţionate, în ultimii ani, spre identificarea şi implementarea unei metode adecvate pentru măsurare.

Au fost propuse metode biochimice, bazate pe măsurarea cantităţii de colagen din omogenate tisulare

(Lee et al., 2005).

Astfel de metode necesită, însă, distrugerea fragmentului tisular recoltat, astfel încât accesul la

alte informaţii, prin analiza puncţiei biopsii hepatice, nu mai este posibil – diagnosticul histopatologic

fiind compromis (Standish et al., 2006).

21

Studiile de morfometrie computerizată publicate în fluxul principal acoperă numeroase entităţi

de diagnostic din patologia hepatică (Manabe et al., 1993, Kage et al., 1997, Duchatelle et al., 1998,

Pilette et al., 1998, Masseroli et al., 2000, O’Brien et al., 2000, Bedossa et al., 2003), raportând de la

1-4% ţesut fibros în ficatul normal, la 15-35% ţesut fibros în ciroză. Parte dintre aceste studii au

urmărit corelarea rezultatelor măsurătorilor fibrozei, obţinute prin morfometrie computerizată, cu

scorurile care definesc stadii diferite.

Implementarea analizei de imagine asistată de calculator, pentru evaluarea fibrozei prin

morfometrie computerizată, este un proces dificil, cu valenţe direcţionate predominant spre partea de

cercetare, şi nu spre cea de diagnostic. Grupurile de cercetare de interes pledează pentru uniformizarea

metodologiei de lucru, astfel încât morfometria computetizată să poată fi utilizată în mod real în

evaluarea fibrozei hepatice (Lazzarini et al., 2005, Hui et al., 2004, Wright et al., 2003).

În acest sens, orice detaliu este important din punct de vedere tehnic (stabilitatea sursei de

lumină, caracteristicile camerei, pragul pentru segmentare), cât şi medical – histopatologic

(dimensiunile puncţiilor biopsii hepatice, grosimea secţiunilor, tehnicile de colorare, eliminarea unor

structuri colagenice normale, fără legătură cu procesul de fibroză) (Wright et al., 2003).

În studiul nostru am utilizat preparate microscopice în coloraţia tricromică Szekelly, care au

permis o bună identificare a colagenului prezent în ariile de fibroză, prin operaţia de segmentare de tip

thresholding. Intervalul de valori în sistem RGB (eng. red – green – blue), determinat prin încercări

succesive pe un preparat microscopic, a fost ulterior introdus în textul macroului HEPAT şi aplicat

pentru analiza computerizată a tuturor celorlaltor preparate microscopice.

Consecutiv, considerăm că o coloraţie tricromică tip verde lumină bine realizată permite

aplicarea unui algoritm de morfometrie computerizată în mod repetitiv. Rezultatele obţinute în studiul

nostru deschid perspective reale în cuantificarea automată a leziunilor de tip fibroză, validarea efectivă

necesitând un lot de analiză extins.

7.4.2. Concepere şi implementare de instrumente automate de cuantificare. Dimensiuni şi

scoruri

Macroul HEPAT conceput şi implementat a permis obţinerea unor rezultate numerice valoroase

în principal prin corespondenţa lor cu stadii diferite ale severităţii procesului de fibroză dezvoltat în

hepatita cronică B şi, respectiv hepatita cronică C. Această abordare este relativ absentă în fluxul

principal de publicaţii, existând puţine studii similare la care ne putem raporta – fapt care reflectă, în

esenţă, şi elementul de originalitate al prezentei investigaţii.

Rezultatele noastre sunt importante ca şi contribuţie la stadiul actual al cunoaşterii, oferind

comparaţii între aria de fibroză ocupată în ansamblul suprafeţei puncţiei în hepatita cronică B şi,

respectiv, C. După cunoştinţa noastră, în baza trecerii în revistă a literaturii de specialitate axate asupra

acestui subiect, singurele valori ale procentului de fibroză raportate în corespondenţă cu scorurile sunt

1,9% pentru ficatul normal, 3% pentru fibroza grad 1, 3,6% pentru fibroza grad 2, 6,5% pentru fibroza

grad 3, 13,7% pentru fibroza grad 4, 24,3% pentru fibroza grad 5, 27,8% pentru fibroza grad 6

(Standish et al., 2006) – determinările fiind realizate pe preparate microscopice colorate Roşu Sirius.

Deşi nu ne-am propus să evaluăm, în paralel cu ariile de fibroză, şi ariile corespondente

infiltratului inflamator, acest tip de investigaţie poate fi realizat – în condiţia în care puncţiile biopsii

hepatice sunt colorate imunohistochimic, asigurând astfel posibilibitatea de identificare automată, prin

particularităţi de culoare, a macrofagelor şi limfocitelor.

În baza experienţei personale, considerăm că toate aceste rezultate indică necesitatea de a

dezvolta tehnici de morfometrie computerizată şi de a le implementa în practica curentă. Fără a evalua

transformările calitative, histo-arhitectonice (septurile fibroase între spaţiile portale, fibroza în punte,

portal-centrală, nodulii), care fudamentează valoarea numerică a scorurilor, morfometria

computerizată asigură măsurarea precisă a ariei de fibroză. Cele două metode nu se exclud reciproc, ci

trebuie privite ca instrumente complementare în evaluarea biopsiei hepatice.

Ca limitare importantă, trebuie subliniat faptul că identificarea colagenului, care permite

delimitarea şi măsurarea ariei de colagen şi raportarea acestor măsurători ca procent de fibroză sau aria

proporţionată de colagen, în raport de aria totală a puncţiei, se realizează printr-o operaţie de

segmentare pentru care trebuie foarte bine stabilite intervalele de valori ale pragului, pentru a asigura

reproductibilitatea; această operaţie este laborioasă, necesită timp şi o foarte bună cunoaştere a

elementelor histopatologice specifice patologie hepatice, eliminarea structurilor colagenice fără

22

semnificaţie pentru substratul morfologic al bolii fiind obligatorie. Ca avantaj major, trebuie subliniat

faptul că morfometria computerizată nu interferă cu alte evaluări necesare diagnosticului

histopatologic, produsul biologic fiind prezervat.

CAPITOLUL 8. CONCLUZII

1. Comparaţia tabloului activităţii necro-inflamatorii şi al fibrozei în hepatita B versus hepatita

C oferă, prin valorile numerice ale scorului Ishak, dovezi reale care susţin agresivitatea hepatitei C, în

patogenia căreia dezvoltarea fibrozei este mai rapidă, fiind iniţiată chiar pe fondul unei activităţi

necro-inflamatorii uşoare. Valorile concrete ale scorului Ishak indică faptul că activitatea necro-

inflamatorie şi fibrogeneza sunt procese care nu se desfăşoară într-un model concordant. Variabilitatea

extremă a gradului de fibroză reflectă, în esenţă, individualitatea biologică care defineşte răspunsul la

agresiunea virală. Avantajele aplicării scorului Metavir în hepatita cronică C sunt contrabalansate de

posibilitatea acordării unui scor identic pentru leziuni cu intensitate diferită.

2. Hiperplazia progresivă a celulelor Kuppfer în paralel cu intensitatea activităţii necrotico-

inflamatorii și cu amplitudinea leziunilor de fibroză, dar fără diferenţe semnificative statistic între

hepatita cronică B şi hepatita cronică C, indică faptul că progresia leziunilor specifice hepatitei cronice

C este influenţată prin comportamentul diferit al celulelor Kupffer prezente, şi nu prin numărul efectiv

al acestora.

3. Profilul numeric al populaţiei limfocitare T CD4+ indică implicarea similară în leziunile

necro-inflamatorii din debutul hepatitei cronice B şi, respectiv, al hepatitei cronice C, în timp ce relaţia

cu leziunile de fibroză este confirmată numai pentru stadiilor iniţiale ale hepatitei cronice C.

4. Profilul numeric al populaţiei limfocitare T CD8+, fără diferenţe semnificative statistic între

hepatita cronică B şi hepatita cronică C, reflectă faptul că citotoxicitatea limfocitelor T CD8+

constituie doar o verigă în mecanismul patogenic al leziunilor specifice hepatitei C.

5. Aprecierea fibrozei prin morfometrie computerizată oferă informaţii obiective, de tip

numeric, care reflectă cu o precizie ridicată gradul de afectare al parenchimului hepatic, depăşind

nivelul informaţiei obţinute prin valorile de scor. Evaluarea prin morfometrie computerizată nu

exclude aplicarea scorurilor semi-cantitative, cele două două metode constituind instrumente

complementare în evaluarea biopsiei hepatice.

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

Almasio PL, Niero M, Angioli D et al. Experts’ opinions on the role of liver biopsy in HCV infection: a Delphi

survey by the Italian Association of Hospital Gastroenterologists (A.I.G.O.). J Hepatol 2005; 43: 381e387.

Bedossa P, Dargere D, Paradis V. Sampling variability of liver fibrosis in chronic hepatitis C. Hepatology 2003;

38: 1449–57.

Bedossa P, Poynard T. An algorithm for the grading of activity in chronic hepatitis C. The METAVIR

Cooperative Study Group. Hepatology 1996; 24(2): 289-93.

Bilzer M, Roggel F, Gerbes AL. Role of Kupffer cells in host defense and liver disease. Liver Int 2006; 26:

1175–1186.

Boisclair J, Doré M, Beauchamp G et al. Characterization of the inflammatory infiltrate in canine chronic

hepatitis. Vet Pathol 2001; 38: 628-635.

Brunt EM. Grading and stagig the histopathological lesions of chronic hepatitis: the Knodell histopathology

activity index and beyond. Hepatology 2000; 31: 241-246.

Cardoso EM, Duarte MA, Ribeiro E et al. A study of some hepatic immunological markers, iron load and virus

genotype in chronic hepatitis C. J Hepatol 2004; 41: 319-326.

Carmack S, Taddei T, Robert ME et al. Increased T-cell sinusoidal lymphocytosis in liver biopsies in patients

with chronic hepatitis C and mixed cryoglobulinemia. Am J Gastroenterol 2008; 103(3): 705-11.

Carotenuto P, van Riel D, Pontesilli O. Antiviral treatment with alpha interferon up-regulates CD14 on liver

macrophages and its soluble form in patients with chronic hepatitis B. Antimicrob Agents Chemother 2005;

49: 590–599.

Căruntu ID. Morfometrie computerizată în histologie şi histopatologie, Ed. “Gr. T. Popa”, Iaşi, 2003.

Castera L, Vergniol J, Foucher J et al. Prospective comparison of transient elastography, Fibrotest, APRI, and

liver biopsy for the assessment of fibrosis in chronic hepatitis C. Gastroenterology 2005; 128: 343-350.

http://vet.sagepub.com/search?author1=J.+Boisclair&sortspec=date&submit=Submit

http://vet.sagepub.com/search?author1=M.+Dor%C3%A9&sortspec=date&submit=Submit

http://vet.sagepub.com/search?author1=G.+Beauchamp&sortspec=date&submit=Submit

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Carmack%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17970837

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Taddei%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17970837

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Robert%20ME%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17970837

23

Chedid A, Arain S, Snyder A et al. The immunology of fibrogenesis in alcoholic liver disease. Arch Pathol Lab

Med 2004; 128: 1230-1238.

Colletta C, Smirne C, Fabris C, et al. Value of two noninvasive methods to detect progression of fibrosis among

HCV carriers with normal aminotransferases. Hepatology 2005; 42: 838-845.

Colloredo G, Guido M, Sonzogni A, Leandro G. Impact of liver biopsy size on histological evaluation of chronic

viral hepatitis: the smaller the sample, the milder the disease. J Hepatol 2003; 39: 239-244.

Cousens LP, Wing EJ. Innate defenses in the liver during Listeria infection. Immunol Rev 2000; 174: 150–159.

de Groote J, Desmet VJ, Gedigk P et al. A classification of chronic hepatitis. Lancet 1968; 2: 626-628.

Demetris AJ, Ruppert K. Pathologist’s perspective on liver needle biopsy size? J Hepatol 2003; 39: 275-277.

Desmet VJ, Gerber M, Hoofnagle JH et al. Classification of chronic hepatitis: diagnosis, grading and staging.

Hepatology 1994; 19: 1513-1520.

Duchatelle V, Marcellin P, Giostra E et al. Changes in liver fibrosis at the end of alpha interferon therapy and 6

to 18 months later in patients with chronic hepatitis C: quantitative assessment by a morphometric method.

J Hepatol 1998; 29: 20–8.

Fafi-Kremer S, Fauvelle C, Felmlee DJ et al. Neutralizing antibodies and pathogenesis of hepatitis C virus

infection. Viruses 2012; 4(10): 2016-30.

Forbes SJ, Parola M. Liver fibrogenic cells. Best Pract Res Clin Gastroenterol 2011; 25(2): 207-217.

Friedman SL. Mac the knife? Macrophages- the double-edged sword of hepatic fibrosis. J Clin Invest 2005;

115(1): 29-32.

Gerlach JT, Diepolder HM, Jung MC et al. Recurrence of hepatitis C virus after loss of virus-specific CD4(+) T-

cell response in acute hepatitis C. Gastroenterology 1999; 117: 933–941.

Ghany MG, Doo E. Assessment of liver fibrosis: palpate, poke or pulse? Hepatology 2005; 42: 759-761.

Haubrich WS. Kupffer of Kupffer cells. Gastroenterology 2004; 127: 16.

Heymann F, Trautwein C, Tacke F. Monocytes and macrophages as cellular targets in liver fibrosis. Inflamm

Allergy Drug Target 2009; 8: 307-318.

Hui AY, Liew CT, Go MY et al. Quantitative assessment of fibrosis in liver biopsies from patients with chronic

hepatitis B. Liver Int 2004; 24: 611–18.

Ishak KG. Chronic hepatitis. Morphology and nomenclature. Modern Pathol 1994; 7: 690-713.

Kage M, Shimamatu K, Nakashima E et al. Long-term evolution of fibrosis from chronic hepatitis to cirrhosis in

patients with hepatitis C: morphometric analysis of repeated biopsies. Hepatology 1997; 25: 1028–31.

Kalk H. Die chronische verlausform der hepatitis epidemica in ihrer beziehung zu ihren anatomischen

grundlagen. Dtsch Med Wochenschr 1947; 72: 308-313.

Kenneth PB, Ludwig J. Chronic hepatitis. An update on terminology and reporting. Am J Surg Pathol 1995; 19:

1409-1417.

Kinoshita M, Uchida T, Sato A et al. Characterization of two F4/80-positive Kupffer cell subsets by their

function and phenotype in mice. J Hepatol 2010; 53: 903-910.

Kolios G, Valatas V, Kouroumalis E. Role of Kupffer cells in the pathogenesis of the liver disease. World J

Gastroenterol 2006; 12: 7413-7420.

Lazzarini A, Levine R, Ploutz-Snyder R et al. Advances in digital quantification technique enhance

discrimination between mild and advanced liver fibrosis in chronic hepatitis C. Liver Int 2005; 25: 1142–9.

Lee HS, Shun CT, Chiou LL et al. Hydroxyproline content of needle biopsies as an objective measure of liver

fibrosis: Emphasis on sampling variability. J Gastroenterol Hepatol 2005; 20: 1109–14.

Lefkowitch JH. Liver biopsy assessment in chronic hepatitis. Arch Med Res 2007; 38: 634-643.

Li H, Zheng HW, Chen H et al. Hepatitis B virus particles preferably induce Kupffer cells to produce TGF-β1

over pro-inflammatory cytokines. Dig Liver Dis 2012; 44: 328-333.

Maher JJ. Interactions between hepatic stellate cells and the immune system. Sem Liver Dis 2001; 21: 417-426.

Manabe N, Chevallier M, Chossegros P et al. Interferon-alpha 2b therapy reduces liver fibrosis in chronic non-A,

non-B hepatitis: a quantitative histological evaluation. Hepatology 1993; 18: 1344–9.

Mariani E, Facchini A, Miglio F et al. Analysis with OKT monoclonal antibodies of T-lymphocyte subsets

present in blood and liver of patients with chronic active hepatitis. Liver 1984; 4(1): 22-8.

Masseroli M, Caballero T, O’Valle F et al. Automatic quantification of liver fibrosis: design and validation of a

new image analysis method: comparison with semi-quantitative indexes of fibrosis. J Hepatol 2000; 32:

453–64.

Mc Guinness P, Painter D, Davies S, Mc Caughan GW. Increases in intrahepatic CD68 positive cells, MAC387

positive cells and proinflammatory cytokines (particularly interleukin 18) in chronic hepatitis C infection.

Gut 2000; 46: 260-269.

Melgert BN, Olinga P, Van Der Laan JM et al. Targeting dexamethasone to Kupffer cells: effects on liver

inflammation and fibrosis in rats. Hepatology 2001; 34: 719-728.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Li%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22177317

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Zheng%20HW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22177317

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Chen%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22177317

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22177317

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Mariani%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=6230498

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Facchini%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=6230498

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Miglio%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=6230498

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6230498

24

Murakami J, Shimizu Y, Kashii Y et al. Functional B-cell response in intrahepatic lymphoid follicles in chronic

hepatitis C. Hepatology 1999; 30: 143–150.

Nascimbeni M, Mizukoshi E, Bosmann M et al. Kinetics of CD4+ and CD8+ memory T cell responses during

hepatitis C virus rechallenge of previously recovered chimpanzees. J Virol 2003; 77: 4781–4793.

O’Brien MJ, Keating NM, Elderiny S et al. An assessment of digital image analysis to measure fibrosis in liver

biopsy specimens of patients with chronic hepatitis C. Am J Clin Pathol 2000; 114: 712–18.

Onji M, Kondo H, Ohta Y. Serial observation of lymphocyte subpopulations and interleukin 2 production of T

cells from patients with acute viral hepatitis and chronic active hepatitis. Hepatogastroenterology 1988;

35(1): 10-3.

Pilette C, Rousselet MC, Bedossa P et al. Histopathological evaluation of liver fibrosis: quantitative image

analysis vs semi-quantitative scores. Comparison with serum markers. J Hepatol 1998; 28: 439–46.

Poynard T, McHutchison J, Manns M et al. Biochemical surrogate markers of liver fibrosis and activity in a

randomized trial of peginterferon alfa-2b and ribavirin. Hepatology 2003; 38: 481-492.

Rehermann B. Hepatitis C virus versus innate and adaptive immune responses: a tale of coevolution and

coexistence. J Clin Invest 2009; 119: 1745–1754.

Rojkind M, Ponce-Noyola P. The extracellular matrix of the liver. Coll Relat Res 1982; 2: 151–75.

Ryder SD, Irving WL, Jones DA et al. Trent Hepatitic C Study Group – Progression of hepatic fibrosis in

patients with hepatitis C: a prospective repeat liver biopsy study. Gut 2004; 53: 451-455.

Saint EG, King WE, Joske RA, Finckh ES. The course of infectious hepatitis with special reference to prognosis

and the chronic stage. Aust Ann Med 1953; 2: 113-127.

Schauer PJ. The nomenclature of chronic hepatitis: time for change. J Hepatol 1995; 22(112): 112-114.

Standish RA, Cholongitas E, Dhillon A et al. An appraisal of the histopathological assessment of liver fibrosis.

Gut 2006; 55: 569-578.

Szabo G, Dolganiuc A. Subversion of plasmacytoid and myeloid dendritic cell functions in chronic HCV

infection. Immunobiology 2005; 210: 237-247.

Tacke F. Functional role of intrahepatic monocyte subsets for the progression of liver inflammation and liver

fibrosis in vivo. Fibrogenesis Tissue Repair 2012; 6: S27.

Thimme R, Binder M, Bartenschlager R. Failure of innate and adaptive immune responses in controlling

hepatitis C virus infection. FEMS Microbiol Rev 2012; 36: 663–683.

Tokin IB, Tokin II, Filimonova G. Quantitative morphometric analysis of liver biopsy: Problems and

perspectives. In: Takahashi H editor. Liver Biopsy, InTech, 2011, 137-154.

Walewska-Zielecka B, Madalinski K, Jablonska J et al. Composition of inflammatory infiltrate and its

correlation with HBV/HCV antigen expression. World J Gastroenterol 2008; 14(25): 4040-6.

Wright M, Thursz M, Pullen R et al. Quantitative versus morphological assessment of liver fibrosis: semi-

quantitative scores are more robust than digital image fibrosis area estimation. Liver Int 2003; 23: 28–34.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Onji%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=3129350

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kondo%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=3129350

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ohta%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=3129350

evaluare cantitativă a leziunilor hepatice. corelaţii cu scoruri ...

Documents

Transcript of evaluare cantitativă a leziunilor hepatice. corelaţii cu scoruri ...