DÉNES ATTILA-LEHEL STUDIU ASUPRA SPECIILOR BACTERIENE DIN … · istoricul, taxonomia şi...

44
1 UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA ŞCOALA DOCTORALĂ FACULTATEA DE MEDICINǍ VETERINARǍ DÉNES ATTILA-LEHEL STUDIU ASUPRA SPECIILOR BACTERIENE DIN GENUL BORDETELLA IZOLATE DE LA ANIMALE ŞI IMPORTANŢA LOR ÎN PATOLOGIA VETERINARĂ Rezumatul tezei de doctorat Conducător ştiinţific Prof. univ. dr. Gh. Răpuntean CLUJ-NAPOCA 2010

Transcript of DÉNES ATTILA-LEHEL STUDIU ASUPRA SPECIILOR BACTERIENE DIN … · istoricul, taxonomia şi...

1

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ

CLUJ-NAPOCA

ŞCOALA DOCTORALĂ

FACULTATEA DE MEDICINǍ VETERINARǍ

DÉNES ATTILA-LEHEL

STUDIU ASUPRA SPECIILOR BACTERIENE DIN GENUL BORDETELLA IZOLATE DE LA

ANIMALE ŞI IMPORTANŢA LOR ÎN PATOLOGIA VETERINARĂ

Rezumatul tezei de doctorat

Conducător ştiinţific

Prof. univ. dr. Gh. Răpuntean

CLUJ-NAPOCA

2010

2

REZUMAT

Cercetările realizate în cadrul tezei intitulată “Studiu asupra speciilor

bacteriene din genul Bordetella izolate de la animale şi importanţa lor în patologia veterinară”, s-au desfăşurat în perioada 2004-2010 şi au avut ca principale obiective următoarele: izolarea de tulpini de Bordetella bronchiseptica de la diferite specii gazde

(porcine, câini, pisici, cabaline şi şobolani), de Bordetella parapertussisov de la ovine şi Bordetella avium de la păsări cât şi din reţeaua de alimentare cu apă în cazul crescătoriilor de curcani în urma examinǎrii unui numǎr semnificativ de probe;

efectuarea unui studiu privind portajul diferitelor specii de Bordetella la speciile gazdă luate în studiu folosind examene bacteriologice;

identificarea tulpinilor izolate pe baza caracterlor morfologice, culturale şi a celor biochimice;

efectuarea unor observaţii în ceea ce priveşte impactul acestor bacterii asupra speciilor gazdă infectate;

identificarea unuor medii de culturǎ adecvate care sǎ faciliteze izolarea şi identificarea bordetelelor;

verificarea capacităţii de a induce sinteza de anticorpi în urma inoculării la animale de experienţă (la iepuri) şi de a conferi o imunitate protectivă (la şobolani) a unor suspensii de Bordetella bronchiseptica supusă tratamentului cu ultrasunete;

verificarea efectului imunosupresiei indusă artificial prin administrarea unor doze mari de corticosteroizi, în o perioadă prelungită de timp, în exprimarea patogenităţii tulpinilor de Bordetella bronchiseptica, cunoscut fiind faptul că şobolanii imunocompetenţi nu manifestă niciodată simptome clinice în urma infecţiei cu această bacterie;

verificarea posibilităţii de a folosi suspensiile de Bordetella bronchiseptica supuse tratamentului cu ultrasunete în diagnosticul serologic;

diagnosticarea infecţiei cu Bordetella bronchiseptica la porcine şi la câini prin reacţii de aglutinare lentă cât şi prin imunodifuzia dublă în gel de agar şi compararea sensibilităţii acestor teste;

stabilirea posibilităţii de a folosi ID în cazul porcinelor şi technicile de ID cât şi de RAL în cazul câinilor în diagnosticul serologic al infecţiei cu Bordetella bronchiseptica;

testarea in vitro a efectului inhibitor al unor antibiotice asupra tulpinilor izolate de Bordetella bronchiseptica şi Bordetella parapertussisov

testarea capacităţii de supravieţuire a celor două specii de bordetela izolate (Bordetella bronchiseptica şi Bordetella parapertussisov) pentru a evalua

3

posibilitatea existenţei unui rezervor de mediu în cazul acestor specii bacteriene;

Teza redactată cuprinde 301 de pagini şi este structurată în conformitate cu

prevederile legale actuale în două părţi principale: prima parte intitulată „Studiu bibliografic”, cu 6 capitole ce cuprinde 83 de pagini şi reprezintă 27,57% din teză iar partea a doua denumită „Cercetări proprii” are 8 capitole extinse pe 218 de pagini, reprezentând 72,43% din teză. În conţinutul tezei există 90 de imagini şi 22 de tabele, menite să sintetizeze rezultatele obţinute şi să contribuie la o mai bună înţelegere a aspectelor de ordin practic. Bibliografia selectată cuprinde 168 de titluri din literatura de specialitate autohtonă şi străină.

Prima parte, intitulată „Studiu bibliografic”, prezintă date legate de istoricul, taxonomia şi evoluţia speciilor bacteriene din genul Bordetella cât şi relaţiile filogenetice dintre aceste bacterii. Este abordată eco-biologia, posibilitatea de recoltare şi izolare a bordetelelor şi caracterele generale legate de morfologia şi cultivarea speciilor de Bordetella. Patogeneza bordetelelor, mecanismele patogenetice şi descrierea detaliată a factorilor care intervin în patogeneză cât şi structurile antigenice şi imunogenice ale acestor bacterii sunt tratate de o manieră exhaustivă. Modalitatea de apărare a organismelor afectate, inclusiv mecanismele imune au fost abordate, cu prezentarea detaliată a răspunsului imun mediat celular şi umoral. În finalul primei părţi sunt prezentate bolile în etiologia cărora sunt implicate bordetelele patogene pentru animale, fiind abordate şi aspecte legate de profilaxia, terapia şi imunoprevenţia acestor afecţiuni.

Genul Bordetella cuprinde nouă specii bacteriene, unele patogene doar pentru om, altele doar pentru animale. Bordetella bronchiseptica este specia cu implicaţii majore în patologia veterinară, având capacitatea de a produce infecţii la orice specie de mamifere, fiind considerată a fi o bacterie situată între comensal şi patogen. În cazul acestei specii bacteriene se cunoaşte faptul că este implicată în etiologia a trei entităţi clinice bine conturate: rinita atrifică a porcului, complexul respirator infecţios al felinelor şi traheobronşita infecţioasă canină. Bordetella avium produce infecţii respiratorii la păsări (entitatea clinică bine conturată fiind bordeteloza curcanilor) iar Bordetella parapertussisov este un parazit obligatoriu care afectează ovinele, înlesnind în cazul lor invazia aparatului respirator de către Pasteurella multocida.

Partea a doua „Cercetări proprii”, cuprinde 6 capitole, discuţia generală a rezultatelor, concluziile finale şi bibliografia, cu prezentarea şi discuţia rezultatelor investigaţiilor efectuate.

În capitolul 7, intitulat „Cercetǎri privind izolarea şi identificarea bacteriilor din genul Bordetella” au fost prezentate şi dicutate rezultatele obţinute la examenul bacteriologic al probelor recoltate de la porcine, câini, pisici, cabaline şi şobolani în vederea izolării B. bronchiseptica; de la păsări în

4

vederea izolării B. avium, iar de la ovine în vederea izolării B. parapertussisov. Au fost descrise tehnicile de recoltare a probelor, modalitatea de însămânţare, iar după incubare au fost descrise modalităţiile de identificare a bacteriilor din genul Bordetella pe baza caracterelor culturale observate pe mai multe medii de cultură, pe baza vitezei lente de dezvoltare a coloniilor bacteriene şi pe baza caracterelor biochimice. Pentru diagnosticul bacteriologic al infecţiei cu B. bronchiseptica au fost prelucrate în totalitate 543 de probe de la diferite specii gazdă. Din totalul probelor recoltate şi prelucrate, s-au identificat ca pozitive un număr de 58. De la porcine au fost recoltate în total un număr de 302 de probe, de la câini 123 de probe, de la pisici 72 de probe, de la cabaline 26 de probe iar de la şobolani douăsprezece probe. În cazul purceilor sugari ce prezentau jetaj, probele au fost recoltate cu ajutorul unor tampoane nazofaringiene şi prin lavaj nazal. În cazul purceilor sănătoşi am apelat doar la lavajul nazal, iar în cazul tineretului înţărcat probele au fost recoltate doar cu ajutorul tampoanelor nazofaringiene. Din cele 302 de probe prelevate de la porcine au fost izolate 21 tulpini de B. bronchiseptica, procentul de izolare fiind de 6,953%. Dintre acestea 19 tulpini au fost izolate din cele 259 de probe prelevate de la animale vii, iar două tulpini au fost izolate din pulmoni care prezentau leziuni de bronho-pneumonie purulentă. O singură tulpină a fost izolată de la cei 37 de purcei sugari luaţi în studiu fără semne de afectare ale căilor respiratorii, procentul de izolare în acest caz fiind de 2,702%. În schimb în cazul celor 11 purcei ce prezentau simptome de rinită procentul de izolare a fost de 36,363%. Aşadar din cele 48 de probe prelevate de la purcei sugari au fost izolate 5 tulpini de B. bronchiseptica, procentul de izolare în cadrul acestui grup de vârstă fiind de 10,416%. Din cele 208 de probe prelevate de la tineret porcin înţărcat au fost izolate 13 tulpini de B. bronchiseptica, procentul de izolare în acest caz fiind de 6,25%. Au fost recoltate doar trei probe de la tineret porcin înţărcat ce prezenta simptome de afectare ale căilor respiratorii inferioare, iar examenul bacteriologic a demonstrat că într-un caz agentul etiologic a fost B. bronchiseptica. În acest caz examenul bacteriologic a dezvăluit faptul că B. bronchiseptica a alcătuit flora predominantă a probei recoltate (fig.1). Acest animal a fost recuperat complet după un tratament de 7 zile cu enrofloxacină. Au mai fost prelucrate 43 de probe provenite de la animale moarte care prezentau diferite leziuni pulmonare observabile la examenul anatomopatologic (tabel nr.1) Din aceste 43 de probe au fost izolate două tulpini de B. bronchiseptica, izolarea fiind făcută în ambele cazuri din pulmoni cu leziuni de bronhopneumonie acută, leziuni care au şi dus la moartea animalelor. Aceste probe au provenit de la două ferme diferite, una aflată în judeţul Satu-Mare şi cealaltă în judeţul Bihor, iar animalele de la care au provenit probele aveau o vârstă de 4 respectiv 3 luni. În ambele cazuri s-a realizat izolarea B. bronchiseptica în cultură pură.

5

Rezultatele examenului cultural în cazul probelor prelevate de la porcine

Tabel nr.1

Felul şi provenienţa

probelor examinate

de la porcine

Nr. total de animale/organe

afectate examinate

Probe pozitive (tulpini izolate)

Probe negative

Procent

de izolare

Porci vii 259 19 240 7,334% Purcei sugari fără afectarea căilor

respiratorii 37 1 36 2,702%

Purcei sugari cu simptome de

rinită 11 4 7 36,363%

Tineret porcin înţărcat

fără afectarea căilor respiratorii

208 13 195 6,250%

Tineret porcin înţărcat ce

prezenta simptome de afectare ale

căilor respiratorii

3 1 2 33,333%

Pulmoni ce prezentau

diferite leziuni 43 2 41 4,651%

Total probe examinate 302 21 281 6,953%

Indiferent de mediul de cultură utilizat izolarea B. bronchiseptica de la

porci vii este foarte dificilă deoarece probele sunt întotdeauna contaminate cu E. coli care acidifiează mediile de cultură şi inhibă dezvoltarea bordetelelor. Din acest motiv examenul bacteriologic nu este unul adecvat pentru realizarea de studii de portaj la porcine, fiind lipsită de sensibilitate (fig.2).

6

Fig. 1. Tulpina 19 de B. bronchiseptica izolată pe agar MacConkey

Fig. 2, Aspectul probelor însămânţate pe mediul Smith-

Baskerville modificat după o incubare de 48 ore, creştere excesivă a contaminantului E. coli (colonii galbene)

Din aceste date reiese că în cazul porcinelor infecţia cu B. bronchiseptica la purceii sugari are o mare probabilitate de a declanşa simptome clinice de

7

afectare a căilor respiratorii iar în cazul tineretului înţărcat predomină starea de portaj. În literatura de specialitate în patologia porcilor B. bronchiseptica este strâns asociată cu rinita atrofică a porcului. Deşi toate efectivele de porcine observate de noi au fost infectate cu B. bronchiseptica, nu a fost observat nici un animal cu simptome tipice de rinită atrofică, explicaţia cea mai plauzibilă pentru acest lucru fiind evitarea instalării acestor leziuni prin utilizarea în masă a antibioticelor care inhibă dezvoltarea bordetelelor. Lavajul nazal a fost principala metodă de recoltare a probelor de la câini. Tampoanele nazofaringiene au fost folosite doar în cazul câinilor de talie mare şi în cazul câinilor care prezentau jetaj. În cazul prezenţei jetajului mucusul a fost recoltat cu un tampon, după care s-a efectuat lavajul nazal. În cazul câinilor numărul probelor recoltate a fost de 123. Dintre acestea, 60 au provenit de la exemplare ce au fost necropsiate la disciplina de Anatomie Patologică a Facultǎţii de Medicinǎ Veterinarǎ din Cluj-Napoca, iar celelalte 63 au fost prelevate de la câini prezentaţi sau chiar internaţi la Serviciul de Urgenţă al USAMV Cluj-Napoca. Diversitatea probelor examinate în vederea izolǎrii de tulpini de B. bronchiseptica de la câini este redată în tabelul 2.

Diversitatea probelor examinate în vederea izolǎrii de tulpini de Bordetella bronchiseptica de la câini

Tabel nr. 2

Provenienţa probelor recoltate de la câini

Câini examinaţi la Serviciul de

Urgenţă

Câini necropsiaţi la disciplina de

Anatomie Patologică

Numărul total de probe

Câini cu afectarea căilor respiratorii cu vârsta sub un an

19

22

41

Câini cu afectarea căilor respiratorii cu vârsta de peste un an

13

9

22

Câini fără afectarea căilor respiratorii cu vârsta sub un an

21

17

38

Câini fără afectarea căilor respiratorii cu vârsta de peste un an

10

12

22

Numărul total de probe 63 60 123 Au fost izolate 12 tulpini de B. bronchiseptica, procentul de izolare pe numărul total de probe fiind de 9,756%. Din cele 63 de probe recoltate de la câinii în viaţă au fost izolate 8 tulpini de Bordetella bronchiseptica, procentul de izolare în cadrul acestui grup fiind de 12,698 %. Patru tulpini de B. bronchiseptica au fost izolate de la câini, toţi cu vârsta sub 12 luni, care

8

prezentau simptome tipice de tuse de canisă (traheobronşită, tuse uscată, răguşită care la palparea traheei a devenit paroxistică, uşor jetaj mucopurulent bilateral, erau afebrili şi aveau starea generală nealterată). În trei cazuri evoluţia bolii a fost favorabilă (simptomele au cedat sub tratament cu Synulox şi codeină după 9-12 zile de la debut). În cazul unui Cocker spaniol de 6 luni după o evoluţie de 2 zile a bolii s-a dovedit coinfecţia cu virusul jigodiei, iar animalul a fost eutanasiat. De menţionat este faptul că în aceste situaţii B. bronchiseptica, de fiecare dată, a fost izolată în cultură constituind flora dominantă, chiar cu aspect de cultură pură (fig.3).

Fig. 3, Cultură de Bordetella bronchiseptica pe agar MacConkey obţinută din proba prelevată de la un câine cu simptome tipice de tuse de canisă;

Alte patru tulpini de B. bronchiseptica au fost izolate de la câini sănătoşi, care au depăşit vârsta de 10 luni şi nu prezentau nici un simptom de afectare a căilor respiratorii. De la câinii necropsiaţi au fost izolate tot patru tulpini. O tulpină de B. bronchiseptica a fost izolată din mucusul recoltat dintr-o bronhie principală. La examenul necropsic acest animal nu prezenta modificări anatomo-patologice la nivelul aparatului respirator. Trei tulpini de B. bronchiseptica au fost izolate de la trei căţei de rasă comună afectaţi de jigodie. Aceşti câini aveau vârste cuprinse între 4 şi 6 luni, în cazul lor fiind afectat atât sistemul nervos central cât şi aparatul respirator, pulmonul fiecăruia fiind invadat de B. bronchiseptica. Izolarea şi identificarea Bordetella bronchiseptica de la câini în viaţă este relativ uşoară, nefiind atât de laborioasă ca în cazul porcinelor. În cazul pisicilor animalele luate în studiu frecventau un adăpost improvizat pentru pisici sau chiar erau rezidenţi pe o perioadă mai lungă a a

9

adăpostului. Pe perioada studiului (mai 2005-august 2009) câteva femele au născut aici, astfel în decursul celor cinci ani de supraveghere a adăpostului au avut loc 8 fătări, fiind produşi în totalitate 39 de pui care au apucat să trăiască cel puţin 3 săptămâni. În totalitate au fost luate în studiu 71 de pisici tinere iar de la acestea au fost izolate 19 tulpini de B. bronchiseptica, pocentul de izolare fiind de 26,761%. Pe perioada în care adăpostul a fost supravegheat au fost observate 13 cazuri tipice de complex respirator infecţios al felinelor (toate pozitive la examenul bacteriologic), de fiecare dată fiind afectate pisici foarte tinere născute în adăpost. Dintre aceste 13 animale au supravietuit doar 7 iar 6 au murit, mortalitatea în cazul pisicilor afectate de complexul respirator felin fiind de 46,153%. În cazul pisicilor probele au fost prelevate preponderent prin lavaj nazal, tampoanele orofaringiene fiind folosite doar la animalele care prezentau jetaj. În cazul pisicilor izolarea B. bronchiseptica este relativ uşoară, în general contaminanţii probelor având o creştere lentă pe agarul MacConkey iar coloniile acestora se pot diferenţia relativ uşor de coloniile de B. bronchiseptica. Au fost prelevate probe şi de la 26 de cai dintre care şase au fost pozitive la examenul bacteriologic, procentul de izolare fiind de 23,076%. Toate tulpinile de Bordetella bronchiseptica izolate de la cabaline proveneau din cele nouă probe recoltate de la cai adulţi din o mică herghelie din Miercurea-Nirajului, portajul în rândul acestor cai fiind de 66,66%, dar aceste animale erau clinic sănătoase. Izolarea şi identificarea B. bronchiseptica de la cabaline prin utilizarea mediului de cultură MacConkey ca mediu de dispersie este foarte laborioasă deoarece speciile bacterie contaminante ale probelor formează colonii foarte asemănătoare ca morfologie şi cromatică cu B. bronchiseptica pe acest mediu cromogen. Totodată şi viteza de creştere a acestor bacterii este lentă, majoritatea lor formând colonii doar după o incubare de 48 de ore, fapt ce îngreunează şi mai mult identificarea coloniilor de B. bronchiseptica. În cazul celor 12 şobolani luaţi în studiu probele recoltate prin lavaj nazal nu erau puternic contaminate; dispersiile au fost efectuate pe suprafeţe mari, oferind şanse reale pentru dezvoltarea bordetelelor, însă nu s-a reuşit izolarea nici unei tulpini de Bordetella bronchiseptica. Pe parcursul izolării şi identificării tulpinilor de B. bronchiseptica acestea au fost cultivate în cultură pură pe agar MacConkey (fig. 4), mediu Smith-Baskerville modificat (fig. 5), pe agar cu adaos de sânge de oaie (fig. 6) şi pe mediu Istrati-Meitert (fig. 7) cât şi în bulion nutritiv. Cultivată pe agar-sânge sau pe agar MacConkey în condiţii de aerobioză la temperatura de 37°C, coloniile de B. bronchiseptica dezvoltă o morfologie tipică după o incubare de 48 ore. Coloniile formate pe agarul MacConkey au diametrul de aproximativ 2 mm, au o culoare roz iar mediul adiacent coloniilor are o culoare chilimbarie. Pe agar-sânge după o incubare de 48 de ore coloniile de B. bronchiseptica au diametrul de aproximativ 2 mm, au o culoare alb-cenuşie, sunt bombate,

10

semilucioase şi inconstant se poate observa o zonă de hemoliză de tip beta în jurul coloniilor. Pe mediul Smith-Baskerville modificat după o incubare de 48 de ore Bordetella bronchiseptica poate forma colonii verzi sau albastre cu un diametru de 2-3 mm, iar mediul adiacent coloniilor devine de culoare albastră. Pe acest mediu cromogen unele tulpini de B. bronchiseptica alcalinizează puternic mediul de cultură şi formează colonii albastre, iar o tentă verzuie putând fi observată în centrul coloniilor doar la examinarea acestora cu stereolupa. Pe de altă parte există tulpini de Bordetella bronchiseptica care nu alcalinizează atât de accentuat acest mediu de cultură, formând colonii verzi sau colonii cu centru verde şi margini verzi-albăstrui. Pe mediul de cultură Istrati-Meitert Bordetella bronchiseptica are o creştere mai rapidă, formând colonii vizibile chiar şi după o incubaţie de 24 ore, coloniile fiind mici (diametru de 1-1.5 mm), şi au o culoare albastră deschisă. În zonele unde coloniile sunt aglomerate acestea au o culoare cenuşiu-verzuie. Mediul de cultură este alcalinizat şi devine de culoare albastră, mediul neînsămânţat fiind verde închis ca şi mediul Smith-Baskerville modificat. În schimb toate cele 58 de tulpini izolate prezentau un profil biochimic identic. Toate tulpinile examinate prezentau celule sub formă de cocobacili şi bacili de dimensiuni foarte mici (0,2-0,3/0,4-2µm) coloraţi în roşu prin coloraţia Gram (Gram negativi).

Fig. 4, Cultură pură de Bordetella bronchiseptica pe

agar MacConkey după o incubare de 48 ore

11

Fig. 5, Cultură pură de Bordetella bronchisepticape mediu Smith-Baskerville modificat, tulpină ce formează colonii de culoare albastră cu alcalinizarea puternică a

mediului de cultură

Fig. 6, Cultură pură de Bordetella bronchiseptica pe

agar-sânge

12

Fig. 7, Cultură de 24 ore de Bordetella bronchiseptica pe agar Istrati-Meitert

Chiar dacă au fost prelucrate 263 de probe (68 de probe de mucus traheal

recoltate de la curcani, 30 de probe de mucus traheal recoltate de la găini ouătoare, 45 de probe de apă şi 120 de probe prelevate de la cadavre de pui de găină) în vederea izolării Bordetella avium, nu s-a reuşit izolarea nici unei tulpini. Deoarece probele recoltate de la curcani şi din apa lor de băut au fost prelevate în mod corect (s-au folosit tampoane nazofaringiene care au fost imersate în mediu de transport Amies, probele au fost transportate în condiţii de refrigerare şi au fost prelucrate după 3-5 ore de la prelevare, iar după însămânţarea şi incubarea lor toate coloniile au fost supuse testului de hemaglutinare şi toate tulpinile bacteriene care au aglutinat hematiile de pasăre au fost identificate fără a identifica o singură tulpină de Bordetella avium) putem afirma cu certitudine că efectivele de curcani luate în studiu erau libere de Bordetella avium. Acest lucru este susţinut şi de faptul că în efectivele de curcani cercetate nu a fost raportat nici un caz clinic cu simptomatologie de rinită sau traheită. Din totalul de 121 de probe prelevate de la ovine (printre care 79 probe de jetaj recoltate de la oi în viaţă aparţinând rasei New Hampshire crescute la o fermă din Ciurila care prezentau simptome de traheită şi rinită manifestate prin jetaj mucopurulent abundent bilateral şi tuse, cât şi 25 de probe constituite din pulmoni care prezentau leziuni de bronhopneumonie) în vederea izolării

13

Bordetella parapertussisov. Au fost izolate doar două tulpini din această specie bacteriană, procentul de izolare fiind de doar 1,653%, iar animalele de la care acestea au fost izolate erau aparent sănătoase. Creşterea lentă a acestor bacterii impune folosirea mediilor selective de cultură pentru izolare. Mediul de cultură folosit pentru a izola aceste tulpini a fost Moredum Bordetella Medium care s-a dovedit a fi un mediu foarte selectiv şi foarte util pentru izolarea B. parapertussisov, mediu pe care această bacterie formează colonii vizibile doar după aproximativ 3 zile de incubare, coloniile fiind înconjurate de o zonă mare de hemoliză completă. Identificarea acestei specii de bordetella este foarte uşoară, aspectul culturilor pe mediul solid (fig. 9) corelat cu aspectul culturilor în mediul lichid (fig. 10) şi cu creşterea foarte lentă a acestora permit o identificare pozitivă. În frotiuri colorate prin metoda Gram celulele de B. parapertussisov seamănă foarte mult cu cele de Bordetella bronchiseptica, prezentându-se ca cocobacili sau bacili fini, Gram negativi, de dimensiuni foarte mici (0,2-0,3µm /0,4-1,5 µm) (fig. 8).

Fig. 8, Morfologia celulelor de Bordetella bronchiseptica în frotiu colorat Gram (x 1600)

14

Fig. 8, Cultură pură de Bordetella parapertussisov pe mediul de cultură

Moredum Bordetella Medium

Fig.9, Cultură de trei zile de Bordetella parapertussisov în bulion nutritiv cu formare de depozit discret la fundul

tubului care la agitarea uşoară a tubului prin mişcări circulare se ridică sub forma unei coloane subţiri

(săgeata roşie)

15

În capitolul 8, intitulat „Cercetări privind producţia de anticorpi anti-Bordetella bronchiseptica prin hiperimunizarea iepurilor” obiectivul a fost acela de a demonstra capacitatea bacteriilor din genul Bordetella, specia Bordetella bronchiseptica de a determina formarea de anticorpi prin inoculări repetate şi în cantităţi crescânde de antigen la iepuri. Un alt scop al acestui capitol a fost acela de a vedea dacă soluţiile de antigene acelulare preparate în laboratorul nostru se pot sau nu folosi în diagnosticul serologic al infecţiei cu B. bronchiseptica folosind tehnica ID. S-a urmărit atât dinamica apariţiei anticorpilor per ansamblu pe parcursul imunizării cât şi numărul de structuri imunogene care au contribuit la stimularea sintezei de anticorpi. Pentru aceasta s-a recurs la inocularea a trei iepuri cu o suspensie de antigene obţinute prin ultrasonicare preparate din două tulpini de Bordetella bronchiseptica, una izolată de la câine iar alta izolată de la un porc. Tulpinile bacteriene dezvoltate pe agar-sânge au fost suspendate în ser fiziologic, iar suspensia obţinută a fost supusă dezintegrării, folosind ultrasonicatorul DUS P 150. Durata totală de expunere la acţiunea ultrasunetelor a fost de 90 de minute, la puterea a doua a aparatului. Suspensiile obţinute în urma sonicării au fost apoi repartizate câte 5 ml în tuburi sterile şi apoi s-au centrifugat la 6000 rotaţii/minut, timp de 30 minute, astfel aproape toate particolele suspendate în lichid au sedimentat şi au aderat ferm de fundul tubului sub forma unui depozit cenuşiu, în supernatant rămânând teoretic doar moleculele solubile. Prin această centrifugare energică au fost îndepartate din preparat mai ales detritusurile celulare constituite din fragmente de perete celular care la rândul lor sunt alcătuite din lipopolizaharide, endotoxine bacteriene responsabile de cele mai grave reacţii postvaccinale. Supernatantul obţinut a avut aspectul unui lichid transparent, uşor lactescent cu o tentă cenuşie-galbuie. Cantitatea de proteină totală a acestor soluţii de antigene a fost adusă la 2 mg/ml. Pentru conservare s-a adăugat formol la o concentraţie finală de 0,5%.

Fiecare iepure a fost inoculat de trei ori. La prima inoculare s-a folosit un volum de 1 ml soluţie de antigen, urmată la 14 zile de o a doua inoculare cu un volum de 2 ml, iar după a doua inoculare la 14 zile a urmat a treia inoculare cu 3 ml. Nu s-au înregistrat reacţii postvaccinale, nici locale, nici sistemice. Probele de sânge au fost prelevate la 7 zile după prima şi a doua inoculare şi la 14, 28 şi 45 zile după a treia inoculare (tabelul nr. 3).

Tehnicile imunologice aplicate pentru caracterizarea răspunsului imun umoral specific pe parcursul hiperimunizării au fost dubla imunodifuzie în gel de agar (ID) reacţia de aglutinare rapidă (RAR) şi reacţia de aglutinare lentă (RAL), în care am folosit antigen celular inactivat prin formolizare.

16

Protocolul de hiperimunizare

Tabel nr.3

Numărul inoculării

Doza (ml)

Calea de inoculare

Ziua Inoculării

Ziua prelevării de sânge

Numărul recoltării

- - - 0 -7 1 I 1 s.c. 0 7 2 II 2 s.c. 14 21 3 III 3 s.c. 28 42 4 - - - - 56 5 - - - - 73 6

Antigenul obţinut prin sonicare, inoculat la iepuri, după un protocol de

hiperimunizare propriu, s-a dovedit a fi un bun imunogen. Iepurii au suportat bine preparatul inoculat (aseptizat cu formol) şi au răspuns prin sinteză de anticorpi. Aceştia au putut fi puşi în evidenţă prin ID şi RAL chiar şi la 7 zile după prima inoculare, dar cantitativ erau mai reduşi obţinându-se în cazul fiecărui iepure doar o singură linie de percipitare prin ID, iar titrurile obţinute prin RAL au variat între 1/10 şi 1/40 (fig. 10 şi 11), însă în acest moment reacţiile de aglutinare rapide au fost negative. După a doua administrare de antigene RAR a devenit pozitivă în fiecare caz. Odată cu continuarea hiperimunizării, ca urmare a instalării memoriei imunologice, serul s-a îmbogăţit în imunoglobuline atât calitativ cât şi cantitativ, aspect demonstrat de faptul că s-au obţinut mai multe linii de precipitare net exprimate după administrarea repetată a antigenului. Această observaţie ne permite să precizăm că în suspensia obţinută există mai multe fracţiuni imunogene, fiecare inducând activarea unor clone limfocitare specifice, având ca rezultat formarea mai multor clase de imunoglobuline. Cel mai înalt nivel al anticorpilor a fost înregistrat la 28 de zile după ultima inoculare a antigenelor. Astfel prin tehnica ID au fost evidenţiate patru linii de precipitare în cazul iepurilor inoculaţi cu soluţia de antigene preparată din izolatul canin de B. bronchiseptica, iar în cazul iepurelui inoculat cu izolatul porcin au fost evidenţiate 5 linii de precipitare (fig. 12). Titrurile obţinute prin RAL la acest moment se situau între 1/1280 şi 1/2560. Au fost identificate cu mare probabilitate două dintre componentele imunogene ale suspensiilor de antigene, care au şi indus sinteză de anticorpi, acestea fiind reprezentate de hemaglutinina filamentoasă şi lipololizaharidele bacteriene. Tot această tehnică a permis identificarea unei structuri imunogene ale izolatului porcin de B. bronchiseptica care nu se regăsea în celulele izolatului canin, dovedind faptul că B. bronchiseptica nu este unică din punct de vedere antigenic.

Antigenul obţinut în laboratorul nostru prin sonicare este utilizabil în dignosticul serologic al infecţiei cu B. bronchiseptica.

17

Fig. 10, Reacţie de aglutinare

lentă: reacţie pozitivă, cu formarea unui depozit umbeliform

pe fundul godeului;

Fig. 11, Reacţie de aglutinare lentă: reacţie negativă, cu

apariţia unui depozit sub formă de buton pe fundul godeului;

Fig. 12, Reacţia de imunodifuzie dublă în gel de agar în care s-au folosit antigenul preparat din izolatul porcin de Bordetella bronchiseptica şi serurile

hiperimune obţinute din sângele recoltat de la cei trei iepuri la 28 de zile după a treia administrare de antigene (A: godeul cu antigen; 1: godeuri ce conţin ser obţinut de la iepurele 1; 2: godeuri ce conţin ser obţinut de la iepurele 2; 3: godeuri ce conţin ser obţinut de la iepurele 3; săgeţi roşii: cele patru linii de

precipitare care apar în cazul tuturor probelor; săgeţi verzi: reacţii de comunitate antigenică; săgeată galbenă: linia de precipitare adiţională ce apare

în cazul iepurelui 1;)

18

În capitolul 9, intitulat „Diagnosticul serologic al infecţiei cu Bordetella bronchiseptica la porcine şi la câini” obiectivul urmărit a fost diagnosticarea infecţiei cu Bordetella bronchiseptica la porcine şi la câini prin reacţii de aglutinare lentă cât şi prin imunodifuzia dublă în gel de agar şi compararea sensibilităţii acestor teste. Totodată am dorit să stabilim dacă aceste teste serologice pot fi utilizate în practica de laborator pentru depistarea infecţiei cu Bordetella bronchiseptica la porcine şi la câini.

Au fost testate 534 de probe de ser de porc, 50 dintre acestea provenind de la porci în vârstă de 3 luni crescuţi în sistem intensiv la o fermă din judeţul Bihor de la care au fost recoltate şi probe de mucus nazal pentru examen bacteriologic. Dintre cele 534 de seruri de porc testate prin reacţia de aglutinare lentă, în 389 de cazuri titrul anticorpilor anti-Bordetella bronchiseptica a fost mai mare sau egal cu 1:20, aceste probe pozitive reprezentând un procent de 72,846% din totalul probelor prelucrate. Acest procent obţinut prin reacţia de aglutinare lentă este mult mai mare decât procentul de izolare al B. bronchiseptica de la porcine (7,334%).

În cazul celor 50 de purcei crescuţi în sistem intensiv în judeţul Bihor examenul bacteriologic a fost pozitiv în trei cazuri. Titrul anticorpilor anti-B. bronchiseptica în cazul acestor purcei a fost de 1:160, 1:320 respectiv 1:1280. Examenul bacteriologic a fost pozitiv la animale cu titru ridicat de anticorpi, dar totodată au existat multe animale care prezentau nivele de anticorpi mai ridicate sau egale în comparaţie cu cele trei cazuri bacteriologic pozitive, iar în cazul lor examenul bacteriologic a fost negativ. Aşadar izolarea B. bronchiseptica se corelează cu titruri ridicate de anticorpi anti-B. bronchiseptica, dar titrul ridicat de anticorpi nu înseamnă întotdeauna şi succes de izolare al B. bronchiseptica. Pe de altă parte reacţia de imunodifuzie dublă în gel de agar a fost pozitivă doar în cazul a 10 probe, procentul probelor pozitive prin acest test fiind de doar 1,875%. Toate probele pozitive la reacţia de dublă imunodifuzie în gel de agar au fost pozitive şi la testarea prin reacţia de aglutinare lentă, dar se poate remarca faptul că în cazul acestor probe titrul anticorpilor aglutinanţi a variat între 1:20 şi 1:5120. Totodată se poate observa faptul că multe probe cu titru foarte ridiat de anticorpi anti-B. bronchiseptica au fost negative la testarea prin reacţia de dublă imunodifuzie în gel de agar. Din comparaţia făcută rezultă clar că tehnica de imunodifuzie dublă în gel agar nu se poate utiliza în diagnosticul serologic al infecţiei cu B. bronchiseptica la porcine.

În cazul câinilor numărul animalelor care au fost supuse în paralel acestor teste a fost de 63, dintre care patru sufereau de traheobronşită infecţioasă în momentul recoltării probelor. În cazul acestor patru probe nivelul anticorpilor a fost foarte ridicat, înregistrând titruri între 1:640 şi 1:1280, probele fiind clar pozitive şi prin technica imunodifuziei. Aşadar în cazul animalelor bolnave de traheobronşită infecţioasă canină ambele teste se pot utiliza în diagnosticul de laborator. Alte patru probe au provenit de la căţei tineri în vârstă de 2 luni care

19

nu prezentau nici un semn de afectare a aparatului respirator iar examenul bacteriologic în cazul lor a fost negativ. Nivelul anticorpilor anti-B. bronchiseptica în serul acestor animale a fost ridicat, titrul acestora fiind de 1:80-1:160. Cunoscând faptul că aceste animale nu au fost imunizate activ împotriva B. bronchiseptica am suspectat faptul că aceşti anticorpi pot fi anticorpi maternali care au traversat placenta. În cazul câinilor sănătoşi dar pozitivi la examenul cultural izolarea B. bronchiseptica se corelează cu nivele ridicate de anticorpi anti-B. bronchiseptica (1:80-1:320). Totuşi există cazuri în care titrul anticorpilor a atins valoarea de 1:80, sau chiar a depăşit această valoare dar examenul bacteriologic a fost negativ.

Din cele 63 de probe prelucrate titrul anticorpilor determinaţi prin reacţia de aglutinare lentă titrul de 1:10 a fost depăşit în 34 de cazuri (53,968%). În cazul reacţiei de dublă imunodifuzie în gel de agar numărul probelor pozitive a fost de 21. S-a putut observa o corelatie între nivelul ridicat de anticorpi anti-B. bronchiseptica şi prezenţa liniilor de precipitare în cadrul testului de dublă imunodifuzie în gel de agar. Probele cu un titru al anticorpilor anti-B. bronchiseptica de 1:40 au fost inconstant pozitive la testul de dublă imunodifuzie în gel de agar, însă probele cu un titru mai ridicat au fost constant pozitive şi la testul de dublă imunodifuzie în gel de agar.

Comparând rezultatele obţinute la câini prin cele două metode serologice se poate afirma că titrul de 1:40 obţinut prin RAL în cazul câinilor poate fi considerat în mod cert un rezultat pozitiv. Se poate observa o corelaţie între prezenţa unei linii de precipitare la testul de imunodifuzie dublă în gel de agar şi un titru relativ ridicat (1:40 sau mai mult) al anticorpilor determinaţi prin RAL. În cazul câinilor reacţia de dublă imunodifuzie în gel de agar în care se foloseşte antigenul sonicat şi formolizat este foarte apropiat ca şi sensibilitate de reacţia de aglutinare lentă, putând fi util în diagnosticul infecţiei cu B. bronchiseptica.

În capitolul 10, intitulat „Aspecte privind infecţia experimentală cu Bordetella bronchiseptica la şobolani şi inducerea răspunsului imun prin folosirea unui vaccin acelular anti-Bordetella bronchiseptica”. Principalul obiectiv a fost testarea eficacităţii unui vaccin acelular anti-B. bronchiseptica preparat în laboratorul nostru, acesta fiind identic cu antigenul inoculat iepurilor. Pe de altă parte prin administrarea de prednison la unul din loturile de şobolani luaţi în studiu s-a urmărit dacă B. bronchiseptica poate sau nu să-şi exprime potenţialul patogen la animalele purtătoare aflate timp îndelungat sub corticoterapie, folosind doze mari de corticosteroizi, cunoscut fiind faptul că în cazul şobolanilor sănătoşi la care toate funcţiile imune se încadrează în parametrii normali infecţia cu Bordetella bronchiseptica este întotdeauna asimptomatică.

În cadrul acestui experiment s-a efectuat infecţia cu Bordetella bronchiseptica la trei loturi de şobolani, toate fiind femele adolescente din linia Wistar, fiecare lot fiind constituit din trei şobolani. Astfel s-a lucrat cu un lot

20

martor infectat, un lot vaccinat şi infectat ulterior cu B. bronchiseptica şi un lot infectat la care s-a administrat prednison pe o perioadă de 8 săptămâni.

Examenul bacteriologic a fost negativ pentru toate probele recoltate de la şobolanii vaccinaţi (probe de mucus nazal, trahee, pulmoni), vaccinul având un efect protectiv la aceste animale. Cum era de aşteptat, şobolanii din lotul martor infectat erau purtători de B. bronchiseptica la nivel de trahee şi cavitate nazală, dar nu şi la nivel de pulmon. În cazul şobolanilor din lotul 3 la care s-a administrat prednison B. bronchiseptica a fost izolat atât din cavitatea nazală cât şi din trahee. De menţionat este faptul că în cazul unui şobolan din acest lot lavajul nazal a evidenţiat o colonizare masivă a cavităţiilor nazale cu B. bronchiseptica, mai mult, din mucusul nazal al acestui şobolan bacteria a fost izolată în cultură pură. În cazul unui alt şobolan din acest lot s-a reuşit izolarea B. bronchiseptica şi din pulmon, demonstrând faptul că de şi nu s-au observat simptome de afectare a căilor respiratorii, excesul de corticosteroizi este un factor de risc pentru animalele purtătoare de B. bronchiseptica.

În capitolul 11 intitulat „Testarea sensibilităţii bordetelelor patogene pentru animale faţă de unele antibiotice şi produse chimioterapeutice” s-a efectuat un studiu privind capacitatea unor antibotice şi produse chimioterapeutice de a inhiba în urma testelor realizate „in vitro” dezvoltarea tulpinilor bacteriene din genul Bordetella izolate în laboratorul nostru. Au fost testate comparativ toate cele 58 de tulpini de Bordetella bronchiseptica, izolate din probele prelevate de la animale, precum şi cele două tulpini de Bordetella parapertussisov izolate de la ovine. Pentru testarea eficacităţii „in vitro” a produselor antimicrobiene s-a apelat la technica difuzimetrică Kirby-Bauer.

Din cele 58 de tulpini de Bordetella bronchiseptica izolate 57 au fost sensibile la ciprofloxacină, reprezentând un procent de 98,275%. Enrofloxacina (antibiotic înrudit cu ciprofloxacina) a avut aproape aceaşi eficacitate asupra tulpinilor de Bordetella bronchiseptica ca şi ciprofloxacina, fiind sensibile 54 de tulpini de Bordetella bronchiseptica testate (93,103%), trei tulpini (5,172%) fiind intermediar sensibile, rezistentă fiind doar o tulpină. Fluorfenicolul s-a dovedit la fel de eficient împotriva Bordetella bronchiseptica ca şi enrofloxacina. Neomicina, oxitetraciclina, amoxicilina protejată de acid clavulanic cât şi gentamicina s-au dovedit a fi antibiotice eficiente împotriva Bordetella bronchiseptica, aceste antibiotice fiind eficiente asupra 74,131-91,38% din tulpinile testate. Sulfametoxazolul potenţat de trimetoprim s-a dovedit a fi eficient împotriva a 27 de tulpini de Bordetella bronchiseptica, deci 46,55% din tulpinile testate au fost sensibile la acest produs antimicrobian. Utilizând testul „t” am dovedit că există o corelatie distinct semnificativă din punct de vedere statistic în ceea ce priveşte sensibilitatea bordetelelor la Cosumix Plus şi sulfametoxazolul potenţat de trimetoprim. Tulpinile de Bordetella bronchiseptica sunt producătoare de beta-lactamază, antibioticele beta-lactamice (ceftiofur, cefuroxim, amoxicilină) nefiind eficiente împotriva nici unei tulpini testate (fig. 13), dar majoritatea au fost sensibile la amoxicilina

21

protejată de acidul clavulanic. Tulpinile de Bordetella parapertussisov izolate s-au dovedit a fi sensibile faţă de antibioticele active împotriva Bordetella bronchiseptica şi au fost rezistente la derivaţii beta-lactamici.

58

00

58

00

58

00

58

00

31

0

27

31

0

27

5

10

43

2

12

44

2

12

44

4

8

46

14

53

22

54

13

54

10

57

0

10

20

30

40

50

60

CIPROFLOXACINA

ENROFLOXACINA

FLUORFENICOLGENTAMICINAAMOXICLAVOXITETRACICLINA

DOXICICLINANEOMICINASULFAMETOXAZOL+TRIMETOPRIM

SULFACLOROPIRAZINA + TRIMETOPRIM

CEFTIOFURCEFUROXIMAM

OXICILINALINCO-SPECTIN

SENSIBIL /SENSITIVE

INTERMEDIARSENSIBIL /INTERMEDIARSENSITIVE

REZISTENT /RESISTANT

Fig. 13, Reprezentarea grafică a sensibilităţii la diferite antibiotice a celor 58 de tulpini de Bordetella bronchiseptica izolate;

În capitolul 12 intitulat „Cercetǎri privind rezistenţa în mediu a

bacteriilor din genul Bordetella” s-a efectuat un studiu privind rezistenţa în mediul extern al unei tulpini de Bordetella bronchiseptica şi a unei tulpini de Bordetella parapertussisov. Testarea rezistenţei a fost efectuată atât în mediu uscat cât şi în suspensie, folosind tampon fosfat salin şi apă de robinet

22

declorinată prin fierbere. B. parapertussisov s-a dovedit a fii o bacterie foarte vulnerabilă în mediul extern, fiind puţin probabil ca B. parapertussisov să fie transmisă prin elemente contaminate de mediu. Bordetella bronchiseptica poate rezista la temperatura de 4-6 °C câteva luni în agarul moale parţial deshidratat în care clorura de sodiu se concentrează datorită deshidratării mediului. B. bronchiseptica se poate multiplica în apa de robinet declorinată prin fierbere şi în tampon fosfat salin cu pH de 7,2 la temperaturi cuprinse între 18-24°C cât şi la temperatura de 4-6°C pe suprafaţa agarului moale. B. bronchiseptica poate supravietui 300 de zile în apa de robinet declorinată şi 335 de zile în tamponul fosfat salin cu pH de 7,2 (fig. 14). Datorită faptului că este o bacterie ce poate supravieţui timp îndelungat în mediul extern în prezenţa apei în anumite condiţii, teoretic B. bronchiseptica poate să prezinte şi un rezervor de mediu care poate interveni în transmiterea acestei specii bacteriene de la o gazdă la altul.

3.7

6.8

9.1

24 24

1.62

0 0

10.3 10.2 9.759

8.107

3.8

2

00.1

0.20.4

0.6

7.63

8.5

0

5

10

15

20

25

30

Ziua 1 Ziua 7 Ziua 14 Ziua 21 Ziua 28 Ziua 35 Ziua 60 Ziua 160 Ziua 300 Ziua 335 Ziua 400

Num

arul

de

celu

le b

acte

rien

e pe

un

mili

litru

de

susp

ensi

e ex

prim

at in

mili

oane

/ml

Apă de robinet / Tape water Tampon fosfat salin/Phosphate Buffer Saline

Fig. 14, Dinamica multiplicării Bordetella bronchiseptica în apa de robinet şi

în tampon fosfat salin;

23

UNIVERSITY OF AGRICULTURAL SCIENCE AND VETERINARY MEDICINE

CLUJ-NAPOCA

DOCTORAL SCHOOL

FACULTY OF VETERINARY MEDICINE

DÉNES ATTILA-LEHEL

Summary of the Ph-d thesis

STUDY REGARDING BACTERIAL SPECIES

FROM GENUS BORDETELLA ISOLATED FROM ANIMALS AND THEIR IMPORTANCE IN THE

VETERINARY PATHOLOGY

Scientific coordinator

Prof. dr. Gh. Răpuntean, PhD

CLUJ-NAPOCA

2010

24

SUMMARY

The investigations conducted under the thesis „Study regarding

bacterial species from genus Bordetella isolated from animals and their importance in the veterinary pathology” were performed between the period of 2004-2010 and had the following main objectives: Isolation of Bordetella bronchiseptica strains from diferent host species

(pigs, dogs, cats, horses and rats), isolation of Bordetella parapertussisov from sheeps and Bordetella avium from birds (hens, chickens and turkeys), testing a semnificative amount of samples;

To conduct a carrier status study of these Bordetella species using bacteriological tests;

Identification of Bordetella strain isolated from animals using bacteriological, bacterioscopical and biochimical tests;

Observation regarding the impact of the Bordetella species on diferent naturally infected host species;

Identification of adecvate culture medias for isolation of diferent Bordetella species;

Verification on the capacity to induce antibody syntesis after inoculation in rabbits and the capacity to induce a protective immune response in rats of an antigene solution obtained from sonicated Bordetella bronchiseptica cultures;

Verification regarding the posibility to use sonicated Bordetella bronchiseptica antigene solutions in serological diagnosis of Bordetella bronchiseptica infection;

To verify if a prolonged therapy with high dosis of corticosteroids in rats can produce deep immunosupression; Bordetella bronchiseptica carrier rats were treated with prednisone and they were monitorised for any signs of respiratory distress;

Serological diagnosis of Bordetella bronchiseptica infection in pigs and dogs using slow agglutination test and double immunodiffusion test; we compared the sensitivity of these tests to establish if they can be used or not in current laboratory diagnostic of Bordetella bronchiseptica infection in pigs and dogs;

To determine the inhibitory efect of some antibiotics on the isolated Bordetella bronchiseptica and Bordetella parapertussisov strains;

To performe test regarding the capacity of Bordetella bronchiseptica and Bordetella parapertussisov to survive in different enviromental conditions, knowing that high enviromental resistence can show that the bacteria has an enviromental reservor;

25

The thesis contains 301 pages and it is structured according to the current legal demands in two main parts: the first one entitled “Bibliographic studies”, contains 83 pages structured on 6 chapters an it represents 27,57% of the thesis. The second part „Personal research” has 218 pages structured on 8 chapters, representing 72,43%. The thesis contains 90 images and 22 charts, designed to help synthesize the results and to contribute to a better understanding of the practical aspects. The Bibliography contains 168 titles of literature from Romania or other countries.

The first part, entitled „Bibliographic studies” presents information about taxonomy and evolution of Bordetella species. Further in this part are described filogenetic relationships among Bordetella species and eco-biology of these bacteria. There are presented the methods of sample collection for isolation of bordetelleae, methods of isolation and identification of different species among genus Bordetella. Patogenesis, immunogenic structures and the patogenetic structures of these bacteria are described in an extended chapter. This part contains information about the immune response of the host species and in the end of this part is a chapter dedicated for the description of the clinical affections developed by host species after infection with different species of bordetella. This chapter also contains information about terapy and imunoprevention of these afections.

Genus Bordetella contains nine species, one of them are human patogen, others has implication in the veterinary pathology. Bordetella bronchiseptica is the most important animal pathogen. It has the capability to infect any mamallian species and it is involved at least in three well documented clinical affections: atrophic rhynitis in pigs, kennel cough in dogs and Upper Respiratory Tract infection in cats. Bordetella avium produces respiratory infections in birds and turkey bordetelosis is the most common afection produced by this bacteria. Bordetella parapertussisov infects the respiratory tract of sheeps, enhancing the developement of pneumonia due to Pasteurella multocida.

The second part „Personal research” contains 6 chapters, a general discussion of the results, final conclusions and bibliography.

In the seventh chapter, entitled „Aspects regarding isolation and identification of animal pathogen bacterial species among genus Bordetella” were presented and subdued to discution the results obtained after sample collection from pigs, dogs, cats, horses, rats, sheeps and birds and sample submission to bacteriological tests. Description regarding sample collection, sample submission to bacteriological tests, insemination methods, and bordetelae identification are presented. A total number of 543 samples were collected for isolation of B. bronchiseptica. The number of isolated strains was 58. The number of samples collected from pigs was 302, from dogs was 123, from cats was 72, from horses was 26 and 12 samples were collected from rats.

26

In small animals sample collection was performed by nazal cavity washing and in large animals (large piglets, large dogs and horses) nasopharingial swabs were used. The two methods were combined in cases when animals presented nasal discharges. From the 302 samples collected from pigs 21 strains of B. bronchiseptica were isolated, the percent of isolation was 6,953%.Nineteen strains of B. bronchiseptica were isolated from alive pigs and the number of sampled alive pigs was 259. Two strains were isolated from pneumonic lungs collected from weaned pigs, in these cases B. bronchiseptica was isolated in pure culture. Only one strain of B. bronchiseptica was isolated from the 37 samples collected from healthy neonate piglets, isolation percentage in this case beeing only 2,702%. In case of neonate piglets presenting respiratory distress (11 samples collected) isolation succeded in 5 cases, leading to the highest isolation percentage: 36,363%. The overall results in neonate pigs showed 6 isolated strains from 48 samples (isolation percentage:10,416%). In case of the 208 samples collected from weaned piglets the number of isolated strains were 13, with an isolation percentage of 6,25% (table 1). Only three samples were collected from weaned pigs presenting signs of respiratory distress, but even in this cases a strain of B. bronchiseptica was isolated. In this case B. bronchiseptica was isolated from a pneumonic piglet and the bacteriological exam revealed a great number of bordetella in the nasal mucus (image 1), probably the pneumonia was caused by B. bronchiseptica. This piglet was fully recovered after a parenteral treatment with enrofloxacin. Fourtyfree samples were collected from pneumonic pig lungs. Two strains of B. bronchiseptica were recovered, isolation of this strains were made in pure culture on MacConkey agar. One sample was collected from a 4 months old pig and the other from a 3 months old pig, both of them died becouse of a severe bronchopneumonia.

27

The results of the cultural exam for samples collected from pigs Table nr.1

Type and origin of

the examined samples

collected from pigs

Total samples number

Positive samples

Negative samples

Isolation

percentage

Alive pigs 259 19 240 7,334% Piglets with age under 6 weeks

without respiratory

distress

37 1 36 2,702%

Piglets with age under 6

weeks with signs of

respiratory distress

11 4 7 36,363%

Weaned pigs without

respiratory distress

208 13 195 6,250%

Weaned pigs with signs

of respiratory distress

3 1 2 33,333%

Pneumonic lungs 43 2 41 4,651%

Total examined samples

302 21 281 6,953%

Regardless of the culture media isolation of B. bronchiseptica from alive

pigs is very difficult becouse samples are always contaminated with E. coli. This bacteria acidifies the culture medias and made imposible the developement of B. bronchiseptica colonies, so the bacteriological test lacks sensitivity. This is the reason why bacteriological exam is not adecvate for B. bronchiseptica carrier status study in pigs (image 2).

28

Image 1, Strain 19 of B. bronchiseptica isolated on MacConkey agar

Image 2, Overgrowth of E. coli (yelow colonies), acid reaction in the culture media; only a few colonies of non-fermenting bacteria developed colonies in

these samples (green colonies) We can conclude that in neonate piglets infection with B. bronchiseptica has the highest chance to develop clinical simtoms while older animals tend to be carriers of the bacteria. B. bronchiseptica is asociated with athrophic rhinitis, but during this research we have never observed a single pig with caracteristic simptoms of this clinical condition. Even if B. bronchiseptica was isolated from many pigs we believe that in pig farms the abuse of the large

29

spectrum antibitics prevents the extensions of the lesions due to B. bronchiseptica. Samples were collected from 123 dogs. Sixty samples were collected from disected animals and 63 samles came from alive dogs (table 2). Alive dogs were also submitted to blood sampe collection for serological diagnosis of B. bronchiseptica infection.

The diversity of the examined samples for Bordetella bronchiseptica strains isolation

Table nr.2 Source of samples collected from dogs

Alive dogs examinated in

the Emergency Care Unit

Necropsied dogs

Total sample number

Dogs presenting respiratory tract affections

with age belowe one

year

19

22

41

Dogs presenting respiratory tract affections with

age above one year

13

9

22 Dogs without respiratory

tract affections with age belowe

one year

21

17

38 Dogs presenting respiratory

tract affections with age above one year

10

12

22 Total sample

number

63

60

123 Isolation of B. bronchiseptica from dogs was sucesfull in 12 cases, isolation percentage regarding the number of the overall samles was 9,756%. In case of the alive dogs 8 strains of Bordetella bronchiseptica were isolated, isolation percentage in this group was 12,698 %. Four strains were isolated from dogs presenting typical simptoms of kennel cough. These dogs were under 12 months of age, presenting tracheobronchitis, dry cough, paroxistical cough when the trachea was examined, slight bilateral nasal discharge. Thei did not presented fever and their general condition was good. In three cases the animals were recovered completely in 9-12 days after treatement with Synulox and codeine. One dog developed distemper after 2 days of evolution of the kennel cough and it was euthanasied. In these cases B. bronchiseptica was isolated almost in pure culture (image 3).

30

Image 3, Bordetella bronchiseptica culture on MacConkey agar; Sample was collected from a dog suffering of kennel cough;

Other four Bordetella bronchiseptica strains were isolated from healthy dogs that exceeded the age of 10 months. In case of the necropsied dogs also four strains of Bordetella bronchiseptica were isolated. Three of them were isolated from joung dogs (aged between 4-6 months) that died of distemper and their lungs were invaded by Bordetella bronchiseptica. In one ocasion isolation was made from a mucus sample collected from a major bronchiae. Isolation and identification of Bordetella bronchiseptica from samples collected from dogs is easy. The studied cats attended a shelter or they lived a period in this place. A few cats gave birth at this shelter. In the period of the study (May 2005-August 2009) a total of 39 kitten that lived at least 3 weaks were born here. The total number of animals included in this study was 71 young cats and the number of isolated B. bronchiseptica strains was 19. Isolation percent was 26,761%. In the period of the study 13 cats born at the shelter developed typical simtoms of Upper Respiratory Tract Disease. Out of thirteen survived only 7, the mortality among these kittens was 46,153%. Isolation of Bordetella bronchiseptica from cats is relatively easy because sample contaminants grows slowly on MacConkey agar, allowing B. bronchiseptica to form typical colonies on this culture media. Samples were taken from 26 horses and six strains of B. bronchiseptica were isolated, the isolation percent reaching 23,076%. Al strains were isolated from the same place, from a small horseclub in Miercurea Nirajului.Nine samples were taken here, so the isolation percentage in these animals reached

31

66,66%. In spite of the fact that these horses were B. bronchiseptica carriers, they did not presented any clinical signs of infection. Isolation of B. bronchiseptica in horses with the use of MacConkey agar is very laborious becouse sample contaminants are slow growing too and they form colonies with morfology similar to B. bronchiseptica. In case of the twelve rats taken in study samples were B. bronchiseptica free. During isolation and identification of B. bronchiseptica observation were made regarding cell morphology, the colonies morphology on MacConkey agar (image 4), on modified Smith-Baskerville agar (image 5), on sheep blood agar (image 6) on Istrati-Meitert culture media (image 7) and liquid nutrient broth. Cultivated on MacConkey agar or on blood agar the colonies of B. bronchiseptica develops a typical morphology after an incubation of 2 day at 37°C. The colonies are 2 mm in diameter, pink with a discoloration of the adiacent medium in amber like colour on MacConkey agar and colonies are slight gray coloured on blood agar with the prezence of a hemolitic zone under the colonies. On modified Smith-Baskerville culture media after an incubation period of 48 hours the colonies of B. bronchiseptica can be green or blue, depending on the capacity of the strain to have a slight or powerfull alcaline reaction on this culture media. On Istrati-Meitert agar B. bronchiseptica manages to form vizibile colonies after 24 hours of incubation. These colonies are small (1-1,5 mm in diameter) and usualy are blue, but they can be gray too. Agglomerated colonies have a greenish-greey colour. All isolated B. bronchiseptica strains had the same biochemical profile. Gramm staining of B. bronchiseptica revealed small (0,2-0,3µm /0,4-1,5 µm) rod shaped bacterial cells coloured in red, very similar to B. parapertussisov cells (image 8).

32

Image 4, Pure culture of Bordetella bronchiseptica on MacConkey agar after an incubation of 48 hours at 37°C;

Image 5, Pure culture of Bordetella bronchiseptica on MacConkey agar after an incubation of 48 hours at 37°C;

33

Image 6, Pure culture of Bordetella bronchiseptica on blood agar after an

incubation of 48 hours at 37°C;

Image 7, Pure culture of Bordetella bronchiseptica on Istrati-Meitert agar after an incubation of 48 hours at

37°C; Even after 263 samples taken and carefully examined Bordetella avium could not be isolated from birds. It seems that birds population taken in study were B. avium free.

34

Bordetella parapertussisov was isolated from sheeps. A total number of 121 samples were tested but only two strains were isolated (isolation percent was 1,653%). The bacteriolgical positive sheeps were only carrier of the bacteria, they did not showed any signs of respiratory distress. Bordetella parapertussisov is a very slow growing bacteria so it’s isolation can be performed only on highly selective culture medias. Moredum Bordetella Medium proved to be an excelent culture media for isolation and identification of this bacteria. B. parapertussisov develops little colonies on this culture media after an aerobic incubation period of 3 days at 37°C. These colonies are sourranded by a wide zone of complete haemolisis. After an additional two days of incubatin the colonies reaches at 2 mm in diameter. Identification of B. parapertussisov is easy. Cultural aspects on Moredum Bordetella Medium (image nr.9) and in liqid culture media (image nr.10) corelated with the slow growth makes easy to identify this bacterial species. B. parapertussisov cells looks like Bordetella bronchiseptica cells after Gram staining. They are rod shaped Gram negative small(0,2-0,3µm /0,4-1,5 µm) bacteria (image 8).

Image 8, Bordetella bronchiseptica after Gram staining (x 1600)

35

Image 9, Bordetella parapertussisov culture on Moredum Bordetella Medium

Image 10, Three days culture of Bordetella parapertussisov in liquid culture media

36

In the eight chapter entitled „Researches regarding anti-Bordetella bronchiseptica antibodies production by rabbits hyperimmunisation” the main goal of the studies was to observe the capacity of disrupted and subcutaneously injected Bordetella bronchiseptica cells to induce a measurable humoral immune response. An another obiective of the study was to determine if the obtained antigene solutions and hyperimmun serums are appropriate for laboratory use in serological detectin of the Bordetella bronchiseptica infection using double immunodiffusion test. After antigen inoculation (every time we used a higher quantity) the dinamic of antibody synthesis was observed and the use of the double immunodiffusion test allowed us to make observation regarding the minimal number of immunogenic structures that induced a humoral response after each inoculation og antigene solutions.

In this study we used four rabbits, a control rabbit injected with phisiological saline and three rabbits used for antigene solution administration.

We used two antigene solutions, one prepared from a dog isolate of Bordetella bronchiseptica and an other prepared from a pig isolate of Bordetella bronchiseptica. Isolates were grown on blood agar and suspendede in phisiological saline. These suspensions were used for bacterial desintegration using a DUS P 150 ultrasound desintegrator. Total desintegration of the bacterial cells was achived after 90 minutes. The obtained solutions were centrifuged 30 minutes at 6000 rpm. The result was a clear, yellow-gray solution. Antigene solutions were diluted to a protein content of 2 mg/ml, formaldehide was added to a final concentration of 0,5 %. These antigene solutions were used in rabbit inoculation and in double immunodiffusion tests.

Rabbits were inoculated three times. At first inoculation we used a volume of 1 ml antigene solutions, at second inoculation (14 days after first inoculation) the volume used was 2 ml, and the final inoculation (14 days after the second inoculation) was made with 3 ml of antigene solutions. The rabbits tolerated well the antigene solutions, without any local or general reactions. Blood samples were collected after 7 days in case of the first two inoculations and after 14, 28 and 45 days after the third inoculation (Table nr.3).

Hyperimmunization protocole Table nr.3

Inoculation number

Dosage (ml)

Inoculation path

Inoculation day

The day of blood collection

Collection number

- - - 0 -7 1 I 1 s.c. 0 7 2 II 2 s.c. 14 21 3 III 3 s.c. 28 42 4 - - - - 56 5 - - - - 73 6

37

Antibody production during the hiperimmunization was monitored with double immunodiffusion in agar gel, slide agglutination test and slow agglutination test. Agglutination tests needed a cellular antigen, obtained with formaldehide inactivation of a Bordetella bronchiseptica suspension. Antigenes obtained from desintegrated Bordetella bronchiseptica cells were highly immunogenic. Anti-Bordetella bronchiseptica antibodies could be detected in the rabbit’s serum even in 7 days after the firs antigene administration using double immunodiffusion and slow agglutination tests. At this moment the double immunodifusion test showed a single precipitation line in all three cases and anti- Bordetella bronchiseptica antibody titre determined with slow agglutiantion tests varied between 1/10 and 1/40 (image 10 and 11). During the hiperimunization protocole the humoral imune responses of the rabbits grew in intensity and diversity, but in all three cases the immune response followed the same pattern. After the second antigen administration slide agglutination tests turned positive. The highest level of anti-Bordetella bronchiseptica antibodies was achieved after 28 days following the third antigene administration. At this moment in the double immunodiffusion test could be observed 4 precipitation lines when sera obtained from the two rabbits inoculated with the dog isolate of Bordetella bronchiseptica were used. In case of the rabbit inoculated with antigene solution obtained from the pig isolate of Bordetella bronchiseptica the number of observed precipitation lines were five (image 12). The antibody titres at this moment were between 1/1280 and 1/2560. Double immunodiffusiontest allowed to identify two immunogenetic componemts of the antigene solutions: the filamentous haemagglutinin and lipopolisacharides. This technique also showed that there are differences between the antigenic structures of the two isolate of Bordetella bronchiseptica so this bacterial species presents differences regarding their immunogenetic structures. Laboratory tests showed that antigene solutions preparedin our laboratory as well the serums obtained from the rabbits can be used in the serological diagnosis of Bordetella bronchiseptica infection.

38

Image 10, Positive slow

agglutination test: the agglutinin pattern was judged as positive when only definite granules of

antigen were seen in a layer covering the bottom of the wells;

Image 11, Negative slow agglutination test: the agglutinin pattern was judged as negative

when a button shaped deposit could be

observed in the bottom of the wells;

Image 12, Double immunodiffusion in agar gel with use of sera samples obtained from rabbits after 28 days from the third antigen inoculation and

antigen solution prepared by use of pig isolate of Bordetella bronchiseptica (A: well containing antigen solution; 1: wells containing serum obtained from rabbit number 1; 2: wells containing serum obtained from rabbit number 2; 3:

wells containing serum obtained from rabbit number 3; red arrows: four constant precipitation lines observed in all cases; green arrows: antigenic

community reactions; yellow arrow; additional fifth precipitation line in case of rabbit number 1;)

39

In chapter nine entitled „Serological diagnosis of Bordetella bronchiseptica infection in swine and dogs” the aims of the studies were to diagnose Bordetella bronchiseptica infection in pigs and dogs using double immunodiffusion and slow agglutination tests. Also a study was made regarding the sensitivity of these tests in dogs and pigs, meaning that we studied the posibility to use these tests as a routine serological test for Bordetella bronchiseptica infection in dogs and swine.

A total of 534 pig’s serum samples were taken in study. Fifty samples came from 3 months old healthy pigs raised in a farm in Bihor district. For these pigs also bacteriological test were performed to compare the results with serological tests.

A number of 389 samples were positive at the slow agglutination test (72,846%). In case of the 50 pigs from Bihor district three strains of Bordetella bronchiseptica were isolated. Bacteriological positive animals had high but various antibody titre (1:160, 1:320 and 1:1280). Also there were animals with high antibody titre that came out negative at bacteriological test. These results suggest that isolation of Bordetella bronchiseptica from pigs can be corelated with high antibody titre, but high antibody titre does not always mean positive bacteriological test.

Immunodiffusion tests were positive in 10 cases (procentage of positive samples was only 1,875%). Al these samples were positive in the slow agglutination test but anti -Bordetella bronchiseptica titres ranged between 1:20 and 1:5120. Also many samples with high antibody titre were negative in the immunodiffusion test. Comparing the results obtained in these two tests we can conclude that there is no corelation between these results and the imunodiffusion test can not be used for diagnose Bordetella bronchiseptica infection in pigs because it lacks sensitivity.

In case of the 63 dogs serum samples and nasal mucus were collected to compare results obtained in bacteriological tests whith those obtained in serological tests. Four dogs taken in study suffered of infectious canine tracheobronchitis and in their case the bacteriological exam was positive. They had high anti- Bordetella bronchiseptica antibody titres (1:640-1:1280) and the samples taken from these animals were clearly positive in the immunodiffusion tests too.

These findings showes that infectious canine tracheobronchitis can be diagnosed wery easy with both of the serological tests used in our study. With 8 strains of B. bronchiseptica isolated isolation percentage of B. bronchiseptica among the 63 dogs was 12,698%. Four samples were collected from two months old healthy dogs, but in spite of the fact that they did not presented any signs of respiratory distress the anti- B. bronchiseptica antibody titre in these cases were between 1:80 and 1:160. Cultural exam was negative in all four cases. In these cases the antibodies probably has a maternal origin. In case of bacteriological positive but healthy dogs antibody titre always reached titres of

40

1:80, but relatively high titre (1:80-1:320) does not mean positive culture in healthy dogs.

From the total of 63 serum samples anti- Bordetella bronchiseptica antibody titres were higher than 1:10 in 34 cases (53,968%). The immunodiffusion method showed 21 (33,333%) positive samples. There was a corelation between titres equal or above 1:40 and positive reaction in the immunodiffusion test. Samples with titre of 1:40 were inconstant positive but higher titre meaned positive result in the immunodifusion test.

Comparison of these results shows that titre of 1:40 of anti- Bordetella bronchiseptica antibodies can be considered a certenly positive result in dogs, so slow agglutination test can be used as an imunological test for Bordetella bronchiseptica infection in this host species. Immunodiffusion test can be also used in serological diagnosis of this infection, but it is less sensitive than the slow agglutination test. Anyway both tests are more sensitive than the bacteriological test. Interpretation of these serological tests must be performed with precaution brcause they can show false positive results in young animals as well as in vaccinated animals.

The tenth chapter is entitled „Research regarding experimental infection with Bordetella bronchiseptica and an acellular anti-Bordetella bronchiseptica vaccine efficiency test in rats”. In this chapter we had two obiectives. The firs one was to test the efficiency of an acellular anti-Bordetella bronchiseptica vaccine prepared in our laboratory in Wistar rats. The second obiective of this study was to observe the outcome of the intranasal infection with B. bronchiseptica in three groups of rats of 3 rats each (a control group of immunocompetent rats, a second group of rats treated with prednisone and the group of the vaccinated rats). We know that immunocompetent rats never develop clinical signs after infection with Bordetella bronchiseptica but they will be long term carriers. We suspected that rats treated long time (8 weeks) with high doses of prednisone (5 mg/kg/day) may become immunosupressed and they may develop clinical signs after infection.

Rats from the control group and the group treated with prednisone were infected in the first day of the experiment. The remaining rats were vaccinated subcutaneously in the first and the fifteenth days of the experiment and they were infected only in 15 days after the second vaccine administration. Rats were constantly observed to notice any signs of respiratory distress. The experiment ended after 90 days. The rats were euthanasied, anatomopathologic exam was permormed in all rats, blood, nasal mucus and tissue samples (trachea, lung) were collected for serological, bacteriological and histopatological exams

The vaccine used in this study was prepared exactly as the antigen solutions for the hyperimmunisation of the rabbits.

Clinical, anatomopathological, bacteriological and serological tests showed that that the waccine had a protective efect. Vaccinated rats were B.

41

bronchiseptica free and they had high antibody titre as determined with the use of slow agglutination test.

As we expected the rats from the control group were B. bronchiseptica carriers, the bacteria could be isolated from their nasal cavity and trachea. In case of the prednisone treated rats B. bronchiseptica was isolated from lung tissue in one case and in the case of an another rat B. bronchiseptica was isolated in pure culture from the nasal cavity. Even if histopathologycal exams did not showed exudative lung lesions, our findins suggest that long term treatement with high doses of coricosteroids is a risc factor in case of B. bronchiseptica carrier animals.

In chapter 11, entitled „Antibiotic susceptibility tests of the Bordetella strains isolated from animals” a research was made regarding the capacity of 15 antibacterial products to inhibit the growth of the 58 isolated Bordetella bronchiseptica and the two isolated Bordetella parapertussisov strains. These in vitro tests were performed using the Kirby-Bauer difusimethric technique.

In case of Bordetella bronchiseptica strains ciprofloxacine and enrofloxacine proved to be highly effective with efficiency percent of 98,275% and 93,103%. Beta-lactam antiobotics had no inhibitory efect on Bordetella bronchiseptica.

42

58

00

58

00

58

00

58

00

31

0

27

31

0

27

5

10

43

2

12

44

2

12

44

4

8

46

14

53

22

54

13

54

10

57

0

10

20

30

40

50

60

CIPROFLOXACINA

ENROFLOXACINA

FLUORFENICOLGENTAMICINAAMOXICLAVOXITETRACICLINA

DOXICICLINANEOMICINASULFAMETOXAZOL+TRIMETOPRIM

SULFACLOROPIRAZINA + TRIMETOPRIM

CEFTIOFURCEFUROXIMAM

OXICILINALINCO-SPECTIN

SENSIBIL /SENSITIVE

INTERMEDIARSENSIBIL /INTERMEDIARSENSITIVE

REZISTENT /RESISTANT

Image 13, Graphic representation of the sensitivity of the isolated Bordetella bronchiseptica strains to different antibiotics;

Bordetella parapertussisov strains had the same sensitivity to antibiotics

as the tested Bordetella bronchiseptica strains. In chapter 12, entitled „Research regarding enviromental resistence of

the isolated Bordetella species” we made a study on the survival capacity of Bordetella bronchiseptica and Bordetella parapertussisov in different enviromental conditions. We tested both dry and wet enviromental conditions. In dry conditions both species showeh low resistance. Differences appeared in wet conditions (semisolid agar, declorinated tape water and Phosphate Buffer Saline, pH 7,2). In dry conditions Bordetella parapertussisov resisted only a

43

few ours and maximum 21 days in wet, optimal survival conditions. Bordetella bronchiseptica can survive 9 months and even multiply in semisolid agar at4-6 °C. In declorinated water this bacteria is able to multiply and survive 300 days. In Phosphate Buffer Saline Bordetella bronchiseptica multiplied and resisted 335 days (image 14). These results shows that only Bordetella bronchiseptica could have an enviromental reservoir.

3.7

6.8

9.1

24 24

1.620 0

10.3 10.2 9.75 98.107

3.82

00.1

0.2 0.4

0.6

7.63

8.5

0

5

10

15

20

25

30

Day1

Day7

Day14

Day21

Day28

Day35

Day60

Day160

Day300

Day335

Day400

Num

ber o

f bac

teria

l cel

ls in

one

mili

liter

of s

uspe

nsio

n (m

illio

n/m

l)

Tape water Phosphate buffere saline

Image 14, Dinamic of Bordetella bronchiseptica cell multiplication in tape water and

Phosphate Buffer Saline;

44