Cursuri Biofizica LP

UNIVERSITATEA "OVIDIUS" CONSTANA

FACULTATEA DE MEDICIN GENERALA

LUCRRI PRACTICE BIOFIZIC MEDICAL

Teren Ovidiu Petcu Lucian Cristian

Vasile Monica

-2009-

Ovidius University Press, 2009

2

Facultatea de Medicin Disciplina Biofizic Aleea Universitatii nr. 2

Constana Romania

Tel/Fax: 0241-605000

Copyright2004

Toate drepturile sunt rezervate Editurii Universitii Constana Ovidius University Press

Lucrri Practice de Biofizic Medical

3

PREFA

Cartea de Lucrri Practice de Biofizic Medical se adreseaz

studenilor Facultii de Medicin General din cadrul Universitii

Ovidius Constana.

Coninutul lucrrilor de laborator a fost adaptat cerinelor

programelor analitice ale facultii ct i la performana aparaturii

existente n dotarea laboratorului.

Tematica lucrrilor practice este n strns legtur cu

problemele teoretice predate la cursul de biofizic i este orientat

spre a dezvolta abilitile studentului de a utiliza aparatura de

laborator, a analiza i interpreta rezultatele obinute.

Lucrarea a fost astfel conceput nct s transmit att

cunotinele teoretice necesare pentru nelegerea lucrrilor

prezentate, ct i descrierea tehnicilor de lucru i a principiului de

funcionare a aparaturii ntlnite n mod curent n acest domeniu.

Sperm c n acest mod lucrarea va fi n acelai timp un

material de lucru ct i un material de documentare. Forma actual

a crii de lucrri practice a fost ntocmit de colectivul Disciplinei

de Biofizic, al Catedrei de Fiziologie Normal i Patologic din

cadrul Facultii de Medicin General, Constana.

Autorii


4


5

CUPRINS

Prelucrarea matematic a datelor experimentale 7

Microscopia de transmisie microscopia de reflexie 17

Tehnici speciale de microscopie 22

Cromatografie i electroforez 31

Sedimentare i centrifugare 42

Spectrofotometria de absorbie n UV-VIS 49

Poteniale de aciune 57

Fenomene de transport 65

Determinarea coeficientului de vscozitate a lichidelor 73

Determinarea coeficientului de tensiune superficial a lichidelor 79

Determinarea densitii lichidelor 86

Determinarea concentraiei unor soluii prin indice de refracie 91

Determinarea concentraiei substanelor optic active 98

Telecobaltoterapia 105

Bibliografie selectiv 122


6


7

Prelucrarea matematic a datelor experimentale

I. Noiuni teoretice

A. Indicatori de tendin central

Indicatorii de tendin central sunt valori ce localizeaz ntr-un

fel oarecare mijlocul setului de date. Dintre indicatorii de tendin

central menionm:

Modul - valoarea care apare cel mai frecvent.

Un set de date poate fi non-modal (dac toate valorile posibile au

aceeai frecven), mono-modal (o singur valoare maximal), multi-

modal (cu mai multe valori ce apar cu aceeai frcven maximal).

Mijlocul - media aritmetic a valorilor extreme ale setului de

date.

Mediana - valoarea ce mparte setul de date n dou grupe egal

populate.

Pentru setul de date S={X1,..., Xn}, ordonat cresctor, cnd

n=2k+1 (numr impar de date), mediana este Me=Xk+1. n cazul aceluiai

set dar pentru n=2k (numr par de date), mediana este:

2

XXM 1kke

Media - cele mai folosite sunt: media aritmetic (Xma),

geometric (XG), armonic (XH) i cuadratic (XQ). Se poate arta uor c

aceste medii se afl n relaia:

QmaGH XXXX


8

B. Indicatori de poziie

Indicatorii de poziie sunt folosii pentru localizarea unui anumit

subgrup de date n relaie cu restul eantionului. Se numesc -cuantile

acei indicatori ce mpart eantionul n pri egal populate. Cele mai

utilizate sunt: cvartila (qk), decila i percentila (pk), valori ce mpart

datele n pri coninnd o ptrime, o zecime, sau o sutime din elemente.

S considerm un set de date ordonat cresctor unde L este

valoarea cea mai mic din set iar H valoarea cea mai mare.

Percentila de ordinul pk este valoarea numeric pentru care k%

din date sunt mai mici dect pk iar (100-k)% sunt mai mari. Se observ

c p50 = q2.

C. Indicatori de mprtiere (dispersie)

Indicatorii de mprtiere descriu variabilitatea datelor. Datele

grupate strns au valori mici pentru indicatorii de dispersie, n timp ce

datele mprtiate au valori mari.

Principalii indicatori de mprtiere sunt: domeniul, variana,

deviaia i momentele.

Domeniul reprezint intervalul de valori al datelor.

=[Xmin, Xmax]

Uneori se indic lrgimea domeniului (amplitudinea mprtierii):


9

x= Xmax - Xmin

Toate deviaiile medii fa de un indicator de tendin central

(media aritmetic, geometric, cuadratic, armonic sau modul, mediana,

notate generic prin ) se definesc n acelai fel, ca medii ale diferenei

ntre valoarea msurat i indicatorul respectiv.

Mai general este momentul centrat de ordin q, mq(x) fa de

media x. n continuare vom analiza semnificaia i utilitatea unora dintre

momentele centrate:

- m1(x)=0, momentul centrat de ordinul 1, nu aduce nici o

informaie, ntruct ia valoarea zero oricare ar fi distribuia datelor; din

aceast cauz nu este folosit.

- m2(x) se numete varian (V); rdcina ptrat a varianei se

numete deviaie ptratic, notat cu . Ambele mrimi arat

mprtierea datelor.

Orice rezultat experimental trebuie prezentat prin media

aritmetic deviaia. Intervalul (-, +) se numete interval de

ncredere sau confiden.

ntruct n biologie i medicin sunt n general puine date de

procesat, trebuie s se nlocuiasc variana V cu variana standard SV

i deviaia n cu deviaie standard n-1 sau SD (se utilizeaz indicatorii

standard n-1 i SV cnd n


10

)x(SKEWm

ac33

Funcie de valorile acestui coeficient exist trei tipuri de

distribuii: cu nclinare pozitiv, nul i negativ, aa cum reiese din

cazurile prezentate mai jos, unde Mo=modul, Me=mediana, =media.


11

- m4(x) se numete exces i arat ct de aplatizat este distribuia.

Se folosete la definirea coeficientului de aplatizare sau boltire,

(numit n englez kurtosis, notat prin KURT):

)x(KURT3m

4

4

II. Parte experimental

A. Determinarea intervalului de confiden

S presupunem c n urma unui experiment se obin n date

experimentale: x1, x2, ...., xn. Pentru acest set de date putem defini

urmtoarele valori:

- media aritmetic: n

x...xX n1med

- eroarea absolut: medii Xx

- deviaia standard: 2n211n ...1n

1

Rezultatul determinrilor (R) n urma prelucrrilor statistice a

datelor, se prezint sub forma:


12

1nmedXR

Dup efectuarea acestor calcule, putem trage concluzia c

valoarea real X a mrimii ctuate se afl n intervalul:

)X,X(I 1nmed1nmed

Acest interval se numete interval de confiden sau interval de

ncredere.

Problem: Pentru etalonarea unui colorimetru s-au realizat un

numr de n = 5 determinri, iar valorile transmisiei au fost urmtoarele:

50.2, 49.1, 49.6, 50.3, 48.9. S se calculeze rezultatul determinrilor (R)

i intervalul de confiden (I).

B. Reprezentarea grafic a datelor

Procesele fizice, chimice, biologice, etc., procese ce depind de

mai muli parametrii, pot fi reprezentate folosind un sistem de referin

format din dou drepte concurente n plan, sau trei drepte concurente n

spaiu, numite axe. Dac axele sunt perpendiculare cte dou, atunci

sistemul se numete rectangular.

Coordonatele (xa, ya) ale unui punct A ntr-un sitem rectangular

avnd originea O msoar proieciile segmentului OA pe ax.

Figura 1.1. Legtura dintre sistemul de referin rectangular i cel polar.


13

n practic se mai utilizeaz i sistemul de coordonate polare. n

acest caz coordonatele punctului A se definesc prin mrimile: r = OA

(raz polar) i unghiul dintre OA i axa OX. Aceast reprezentare se

utilizeaz n momentul cnd funcia reprezentat depinde de unghi.

Legtura ntre cele dou sisteme de coordonate este urmtoarea:

cosrx , sinry

22 yxr , y

xarctg

Pentru ca reprezentarea grafic a datelor n coordonate

rectangulare s fie ct mai clar, se recomand s se in cont de

urmtoatele indicaii:

-asigurarea unei reprezentri grafice ct mai intuitive const n

alegerea scrii corespunztoare att pe scara absciselor ct i pe scara

ordonatelor (atunci cnd valorile variabilelor x sau y ncep de la un

numr oarecare, acest numr se recomand s fie reprezentat ct mai

aproape de originea axei respective).

-indicaiile de pe axele x i y trebuie s fie ct mai simple, adic

cu ct mai puine cifre (de regul indicaiile de pe axe nu trebuie s

conin numere cu mai mult de dou cifre; dac numerele sunt mai mari

trebuie indicat un factor de multiplicare la sfritul axei alturi de

unitile de msur).

-pe fiecare ax trebuie s se indice denumirea sau simbolul

mrimii reprezentate pe axa respectiv i n mod obligatoriu unitile de

msur.


14

S urmrim n continuare un exemplu simplu: presupunem c la

anumite intervale de timp msurm temperatura unui bolnav (datele

obinute se regsesc n tabelul de mai jos) i dorim s reprezentm grafic

acest proces: temperatura = f (timp).

Tabelul 1

Timp

(ore) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Temp.

(C0)

37,1 37,5 37,9 38 38,2 38,4 38,8 39 39,2 39,5

innd cont de precizrile de mai sus se traseaz graficul prin

puncte (dar far a le uni), avnd grij s reprezentm numai zona de

interes (figura 1.2).

36,5

37

37,5

38

38,5

39

39,5

40

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Timp (ore)

Te

mp

era

tura

(g

rd C

)

Figura 1.2. Reprezentarea grafic a datelor din tabelul 1.

Privind graficul de mai sus, ne putem pune urmtoarea ntrebare:

care este valoarea de temperatur a pacientului la un moment de timp la

care nu a fost fcut msurtoarea efectiv?


15

n aceast situaie suntem nevoii s determinm, pornind de la

datele noastre, curba ce se potrivete cel mai bine cu punctele experi-

mentale. n cazul graficului reprezentat n figura 1.2, putem presupune o

dependen de tip liniar: xaay 10 , unde coeficienii 10 a,a sunt

necunoscute.

Cea mai simpl variant de determinare a coeficienilor, o ofer

programul de calcul tabelar Microsoft Excel.

Dup introducerea datelor n foaia de lucru i trasarea graficului

se utilizeaz opiunea Insert Trendline. Din fereastra de dialog (figura

1.3) se alege de la grupul Type tipul de Trend dorit (n cazul nostru

liniar), iar de la grupul Options se selecteaz Display Equation on Chart.

Rezultatul este prezentat n figura 1.4.

Figura 1.3. Fereastra de dialog Format Trendline a programului Microsoft Excel.

Facem meniunea c utilizatorul este lsat s aleag, innd cont

de distribuia punctelor, tipul funciei cu care urmeaz s fie fcut

fittarea: liniar, logaritmic, exponenial, putere i polinomial (pn la

gradul 6).


16

y = 0,2521x + 36,973

36,5

37

37,5

38

38,5

39

39,5

40

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Timp (ore)

Te

mp

era

tura

(g

rd C

)

Figura 1.4. Determinarea coeficienilor a0 i a1 cu ajutorul programului Microsoft Excel.

Revenind la exemplul nostru, rezultatul este:

x2521.0973.36y

Aa cum se poate vedea din graficul prezentat n figura 1.4,

punctele experimentale sunt apropiate de dreapa trasat. n cazul n care

exist puncte deprtate de drept, atunci n acea regiune putem avea o

alt dependena i este necesar reluarea procedeului cu alegerea unui

trend adecvat.

Problem: S se reprezinte grafic datele din tabelul de mai jos

y=f(x) i apoi utiliznd programul Microsoft Excel s se traseze curba

ce se potrivete cel mai bine cu punctele experimentale.

x 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

y 37.1 37.5 37.9 38.33 38.4 38.4 38.2 37.85 37.43 36.93


17

Microscopia de transmisie - Microscopia de reflexie

I. Noiuni teoretice

Microscopul reprezint un instrument optic alctuit dintr-un

ansamblu de dioptrii (sferici) i centrai ce are rolul de a forma imagini

mult mrite ale unor obiecte de dimensiuni mici.

Microscopul este alctuit din :

- sistemul mecanic

- sistemul electric

- sistemul optic

Figura 2.1. Schema microscopului de transmisie i de reflexie (sistemul optic).

Microscopia de transmisie: se folosete pentru preparate ce nu

au grosimi mai mari de un micron i prezint un contrast bun.


18

Microscopia de reflexie: se folosete pentru preparate ce nu

permit o transmisie eficient a luminii. Obiectivul poate juca rol de

condensor sau poate exista un condensor special dispus coaxial cu

obiectivul.

Sistemul mecanic (principalele elemente componente):

-msua microscopului prevzut cu doi cavaleri (sau clrei) ce

asigur fixarea preparatului pe msu.

-uruburi de punere la punct a imaginii (macroviza pentru

acordul brut i microviza pentru acordul fin).

-uruburi de centrare a componentelor optice pe acelai ax.

-revolverul cu obiective i diafragmele (fante circulare cu

diametrul variabil ce au rolul de a modifica fluxul de lumin pe preparat).

Sistemul optic (principalele elemente componente):

-condensorul focalizeaz razele de lumin ce vin de la surs, pe

preparat.

-obiectivul format dintr-un ansamblu de lentile convergente ce

formeaz o imagine real, mrit i rsturnat.

-ocularul format dintr-un ansamblu de lentile convergente ce

formeaz o imagine virtual, mrit i dreapt.

Sistemul electric (principalele elemente componente):

-sursa de tensiune.

-aparate de msur.

Mrimi caracteristice microscopului:

mrirea transversal: 1

2

y

y


19

unde: y2 = dimensiunea imaginii (perpendicular pe axa optic)

y1 = dimensiunea obiectului (perpendicular pe axul optic)

grosismentul: ocob1

2 GGtg

tgG

unde: 2 = unghiul sub care se vede obiectul privit prin microscop,

1 = unghiul sub care se vede obiectul atunci cnd este privit cu

ochiul liber i situat la distana optim de citire (0.25m pentru un

ochi normal),

Gob = grosismentul obiectivului, Goc = grosismentul ocularului.

puterea separatore:

22,1

sinn21P

unde: = distana dintre dou puncte ale obiectului care pot fi separate,

n = indicele de refracie dintre preparat i obiectiv,

= lungimea de und a radiaiei utilizate,

= unghiul dintre axa optic i razele cele mai deprtate de ax

care mai ptrund n obiectiv.

Figura 2.2. Reprezentare schematic a elementelor prezentate mai sus.


20


A. Determinarea diametrului eritrocitelor

Materiale necesare:

preparat

microscop

micrometru ocular

Mod de lucru: se aeaz preparatul pe msua microscopului i se

pune la punct imaginea. Se nlocuiete ocularul cu micrometul ocular. Se

localizeaz apoi o celul (eritrocit) i se determin diametrul n diviziuni

(figura 2.3).

.

Figura 2.3. Eritrocitele vzute la microscop prin micrometrul ocular.

Diametrul n microni se calculeaz cu ajutorul formulei:

100G

1

ob

divm , unde ( 40Gob )

Datele experimentale se trec n tabelul de mai jos.

No. div m med n-1 1

....

S se determine intervalul de confiden i s se compare

rezultatul obinut cu intervalul fiziologic admis n literatura de

specialitate pentru hematii.


21

B. Determinarea grosismentului obiectivului

Materiale necesare:

microscop

micrometru obiectiv

micrometru ocular

Mod de lucru: se aeaz micrometrul obiectiv pe msua

microscopului i se pune la punct imaginea. Se nlocuiete ocularul cu

micrometul ocular. Se aliniaz cele doua scale la stnga i se caut

diviziuni ce coincid att pe scala micrometrului obiectiv ct i pe cea a

ocularului (figura 2.4).

Figura 2.4. Determinarea grosismentului obiectivului (n = numrul de diviziuni pe micrometrul ocular, m = numrul de diviziuni pe micrometrul obiectiv).

Grosismentului obiectivului se calculeaz cu ajutorul formulei:

10m

ngob

Datele experimentale se trec n tabelul de mai jos.

No. n m gob gmed n-1

1

......

S se determine intervalul de confiden.


22

Tehnici speciale de microscopie

Aceast lucrare urmrete studierea metodelor de observare a

preparatelor ce nu pot fi vizualizate cu ajutorul microscopului n

transmisie sau n reflexie.

I. Noiuni teoretice

Metodele clasice de microscopie nu pot pune n eviden detaliile

preparatelor atunci cnd acestea au dimensiuni foarte mici (sub 1 m) sau

nu prezint un contrast bun (detaliile au aceeai culoare ca i restul

preparatului). n aceast situaie, la dispoziia observatorului stau

metodele de colorare a preparatului sau tehnicile speciale de microscopie.

Tehnicile de colorare (ce se vor studia n cadrul disciplinei de

Histologie) prezint n anumite situaii cteva dezavantaje: necesit o

cantitate mare de timp, manopera i substane chimice; nu pot fi

observate celule sau organisme vii; imaginea obinut difer mai mult sau

mai puin de structura real.

Pentru nlturarea acestor deficiene pot fi utilizate tehnicile

speciale de microscopie. Dintre acestea amintim:

- Microscopia de imersie

- Microscopia n ultraviolet (UV)

- Microscopia de cmp ntunecat

- Microscopia de polarizare

- Microscopia de fluorescen


23

- Microscopia de contrast de faz

- Microscopia electronic

1. Microscopia de imersie

Cele dou tehnici de microscopie prezentate (transmisie i

reflexie) nu permit o mrire mai mare de 1000 de ori deoarece apare

fenomenul de difracie a luminii pe detaliile preparatului.

Pentru a permite observarea unor detalii mai fine una din soluii

este introducerea ntre obiect i obiectiv a unui lichid omogen,

transparent i izotrop cu indice de refracie ct mai mare, numit lichid de

imersie. De obicei, se utilizeaz ulei de cedru (n=1.3-1.5) sau compui

sintetici (n=1.3-1.6). n acest mod se poate crete mrirea pn la cca.

2000 de ori fr s apar fenomenul de difracie. Un alt avantaj al

folosirii imersiei este mrirea luminozitatii imaginii:

h

1n

)d

h21(

E

E

20

unde:

E - iluminarea imaginii cu lichid de imersie

E0 - iluminarea imaginii n absena lichidului

h - distana obiectiv-obiect

d - diametrul obiectivului

n - indicele de refracie al lichidului de imersie

E=(1.2-4)E0

n cazul utilizrii tehnicii de imersie este necesar ca preparatul s

fie acoperit cu o lamel pentru ca lichidul de imersie s nu modifice


24

structura acestuia. De asemenea, se utilizeaz obiective speciale (de

imersie) ce sunt inscripionate Apo caracterizate prin distan focal

mic, avnd totodat posibilitatea de a culisa, n scopul evitrii

contactului brutal dintre obiectiv i lamel.

Au fost studiate aproape toate tipurile de bacterii. Performanele

microscoapelor cu lumin vizibil merg pana la mrimi de ordinul 2000-

3000 de ori (=0.25m).

2. Microscopia de ultraviolet

O alt modalitate de a crete puterea separatoare este micorarea

lungimii de und a radiaiei folosite pn n domeniul ultraviolet UV

(610-10, 3.810-7)m. n acest mod s-au putut distinge obiecte de

dimensiuni de 0,15m, atingndu-se o mrire de 6000-7000 de ori.

n cazul folosirii radiaiei UV este necesar ca toate componentele

optice ale microscopului s fie realizate din cuartz deoarece sticla

comun este opac la acest tip de radiaii.

Imaginea final va fi obinut pe un ecran de proiecie acoperit

cu o substana fluorescent. n cazul folosirii radiaiei UV este obligatorie

folosirea ochelarilor i a ecranelor de protecie deoarece retina este foarte

sensibil n acest domeniu de lungimi de und.

3. Microscopia de cmp ntunecat

Tehnica de cmp ntunecat este utilizat pentru observarea

preparatelor transparente i se bazeaz pe mprtierea luminii pe

detaliile preparatului. Orice neomogenitate din preparat va determina o

modificare a direciei razelor de lumin. Din punct de vedere constructiv


25

se utilizeaz un condensor special alctuit dintr-o oglind concav i una

convex (figura 3.1) astfel nct doar razele de lumina mprtiate pe

neomogenitile preparatului s ajung n obiectiv.

Figura 3.1. Microscopia de cmp ntunecat.

Condensoarele de cmp ntunecat ofer nclinri diferite razelor

de lumina trimise spre preparat. Cnd se dorete observarea detaliilor

foarte fine, se folosesc condensoare ce produc nclinri mari fascicolului

incident, fiind necesar n acelai timp mrirea intensitii luminoase,

deoarece fluxul de lumin ce ptrunde n obiectiv este foarte mic. Ataate

la microscop, condensoarele de cmp ntunecat trebuiesc centrate foarte

bine pe axul optic al microscopului, n caz contrar obinndu-se imagini

cu umbre.

4. Microscopia de polarizare

Microscopia de polarizare se utilizeaz n evidenierea i

observarea substanelor optic active ce se gsesc n preparat. Substanele

optic active au proprietatea de a roti planul luminii polarizate.


26

Figura 3.2. Microscopia de polarizare.

Pentru utilizarea acestei tehnici este necesar s se ataeze la

microscop un polarizor i un analizor, ambele confecionate din Spat de

Islanda, ce au proprietatea de a lsa s treac doar razele de lumin ce au

un anumit unghi de polarizare.

Aceasta tehnic se utilizeaz att n microscopia de transmisie

ct i n microscopia de reflexie. n cazul montrii corecte a polarizorului

i a analizorului doar razele de lumina ce strbat zonele din preparat ce

conin substane optic active vor ajunge la observator.

5. Microscopia de fluorescen

Fluorescena este proprietatea anumitor substane de a emite

lumin (radiaie vizibil) atunci cnd sunt excitate cu radiaie UV.

Deoarece multe substane de interes medical prezint fluorescen (acizi

nucleici, proteine) aceast tehnic este foarte utilizat n practica de

laborator i de cercetare medical.

Fiecare substan ce prezint fluorescen este caracterizat de o

lungime de und de excitaie (n UV) i de o lungime de und de emisie


27

(n vizibil), astfel nct tehnica poate nu doar pune n evident dar i

identifica substanele respective. n acest scop, se utilizeaz filtre optice

i de UV pentru selectarea radiaiei de excitaie i de emisie a substanei

ce urmeaz a fi observat. Filtrele se dispun ca n figura 3.3.

Figura 3.3. Microscopia de fluorescen.

n cadrul acestei tehnici, pentru observarea substanelor ce nu

prezint fluorescen n mod direct, se utilizeaz markeri de fluore-

scen, substane ce au urmtoarele proprieti:

- fluorescen intrinsec

- aditivitate foarte mare

- deterioreaz minim structura (substana) de care se fixeaz

Cele mai utilizate sunt substanele din clasa flavinelor.

6. Microscopia de contrast de faz

Este o tehnic ce se utilizeaz n special pentru observarea

celulelor i organismelor vii atunci cnd tehnicile de colorare nu pot fi

folosite. Metoda pune n eviden diferena de drum optic pe care o face


28

lumina trecnd prin diferite zone ale preparatului (reamintim c drumul

optic este produsul dintre drumul geometric i indicele de refracie al

mediului pe care l parcurge raza de lumin).

Deci aceast tehnic pune n eviden att diferene de grosime

ntre diferitele zone ale preparatului ct i diferene de indice de refracie

ntre acestea. Sunt utilizate obiective speciale (inscripionate Cf) care au

dispuse n planul focal o placa de faz, ce defazeaz lumina cu o

semilungime de unda (n + se numete contrast de faz pozitiv sau n

contrast de faz negativ), i un inel parial absorbant.

De asemenea, condensorul prezint o fanta inelar ce este

specific fiecrui obiectiv folosit. Pentru punerea la punct a micros-

copului este necesar un ocular special cu ajutorul cruia se pot observa

simultan att inelul parial absorbant ct i fanta inelar n scopul

suprapunerii acestor dou imagini.


Materiale necesare:

1. Microscop de cercetare MC9

2. Microscop Biorom

3. Condensoare de cmp ntunecat

4. Polarizor, analizor

5. Obiective de imersie

6. Obiective de contrast de faz

7. Lame cu diferite preparate


29

Modul de lucru:

A. Observarea nucleilor celulelor

-se aeaz lama cu preparat pe masua microscopului i se

fixeaz cu ajutorul clreilor;

-se aduce pe axul optic obiectivul x40 (sau x25) i se localizeaz

zona cu preparat;

-se coboar msua microscopului fr a deplasa preparatul;

-se aduce pe axul optic obiectivul Apo xl00;

-se aplic o pictur de lichid de imersie pe preparat (n dreptul

obiectivului);

-cu foarte mare atenie se coboar obiectivul pna ce se imer-

seaz n lichid;

-privind prin ocular se pune la punct imaginea.

B. Determinarea depozitelor glucidice

-se monteaz la microscopul MC9 polarizorul i analizorul;

-se fixeaz preparatul pe msu;

-se pune la punct imaginea;

-se deplaseaz n plan orizontal preparatul pe msu pn cnd

se gsete o zona liber;

-se rotete ncet polarizorul pn n momentul n care imaginea

este maxim de ntunecat;

-se aduce din nou preparatul n cmpul vizual; zonele luminoase

reprezint zonele n care se gsesc substane optic active.


30

C. Determinarea ncrcturii biologice a apei

-se monteaz la microscopul Biorom condensorul i obiectivele

de contrast de faz;

-se nlocuiete un ocular cu ocularul de punere la punct;

-din uruburile de punere la punct se centreaz sistemul astfel

nct inelul parial absorbant din obiectiv s corespund cu fanta inelar a

condensorului;

-se monteaz din nou ocularul microscopului;

-pe o lam curat se pune o pictur de ap sttut (24h);

-se fixeaz lama la microscop i se caut observarea germenilor

existeni n ap att prin tehnica de microscopie clasic ct i prin cea de

contrast de faz.


31

Cromatografia si electroforeza

I. Noiuni teoretice

1. Cromatografia

Cromatografia reprezint o tehnic de separare a componentelor

unui amestec, ntre dou faze: una mobil i alta staionar, ca urmare a

deplasrii fazei mobile de-a lungul celei staionare i a antrenrii compo-

nentelor amestecului n micare, cu viteze diferite, ocupnd astfel poziii

diferite de-a lungul fazei staionare. n acest mod componentele sunt

separate i apoi identificate.

n funcie de natura fazelor se disting urmtoarele tipuri de

cromatografie:

Faza mobila Faza staionara Denumire

lichid lichid lichid - lichid (LL)

lichid solid lichid - solid (LS)

gaz solid gaz - solid (GS)

gaz lichid gaz - lichid (GL)

Metodele de separare cromatografice se mpart n:

- metode bazate pe afinitatea diferit a componenilor (repartiie

de faz, adsorbie, absorbie, schimb ionic, afinitate);

- metode bazate pe mrimea diferit a componenilor (excluziune

sferic).

Din punct de vedere practic cele mai utilizate metode de

cromatografie sunt: cromatografia pe coloan, cromatografia pe hrtie,

cromatografia n strat subire, gaz cromatografia.


32

Cromatografia pe coloan Coloanele cromatografice sunt

confecionate din sticl. Pentru o bun rezoluie se folosesc coloane lungi

dar n condiiile n care se dorete separarea unei cantiti mari de

substane se folosesc coloane cu un diametru mai mare.

n interiorul coloanei se introduce faza staionar ce trebuie, ntr-

o prim etap, echilibrat cu solventul de lucru.

Amestecul ce urmeaz a fi separat se pipeteaz n partea

superioara a tubului.

Se conecteaz rezervorul cu solvent (faza mobil) la coloan i se

ateapt pn ce are loc separarea.

Datorit deplasrii fazei mobile de-a lungul celei staionare are

loc antrenarea componentelor din amestec ntr-o micare descendent, n

lungul coloanei astfel nct n timp vor ocupa poziii diferite. Fraciile

sunt colectate n tuburi i apoi analizate.

Figura 4.1. Cromatografie pe coloan.


33

Cromatografia pe hrtie - reprezint una din cele mai simple

metode de analiz. n aceast metod faza fix este reprezentat de o

suprafa de hrtie special sau hrtie de filtru, iar faza mobil (eluentul)

de un lichid ce se deplaseaz de-a lungul fazei fixe datorit forelor de

adeziune i forelor gravitaionale. Se mparte n: cromatografie pe hrtie

vertical (ascendent sau descendent) i orizontal (Pfeiffer). n figura

4.2 se poate urmri diferena dintre aceste metode.

Figura 4.2. Cromatografie pe hrtie vertical ascendent i descendent

Identificarea compuilor izolai n timpul cromatografiei se face

fie cu ajutorul spoturilor martor, fie calculnd timpul de reinere al

fiecrui component separat (Rj), definit ca raportul dintre distana fa de

linia de start pe care a migrat componentul respectiv (notat cu Xj) i

distana pe care a migrat eluentul (notat cu Y):

Y

XR

j

j

Timpul de reinere depinde de: natura fazei fixe, natura fazei

mobile, natura substanei, temperatur; se gsete tabelat pentru diferite

substraturi, elueni i substane, de regul pentru temperaturi de 200C.


34

2. Electroforeza

Reprezint metoda de separare bazat pe migrarea sub influena

cmpului electric a substanelor ncrcate cu sarcin electric.

Eletroforeza poate fi folosit att n scop analitic (separarea

componenilor i dozarea lor), preparativ (obinerea unor componeni n

stare pur) dar i ca metod de studiu a proprietilor superficiale ale unor

celule sau organite celulare.

O particul ncrcata electric, cnd este dizolvat sau suspendat

ntr-un mediu lichid, sub influena unui cmp electric uniform, atinge o

vitez constant de migrare. Speciile ncrcate pozitiv se vor ndrepta

ctre catod, iar speciile ncrcate negativ ctre anod. Viteza de migrare a

ambelor specii va fi determinat de forele care acioneaz asupra lor.

Aceste forte sunt:

- fora de atracie electroforetic: EQF1

- fora de frecare Stokes: vr6F2

- fora de frnare electroforetic: ErQF3

- fora 4F datorata efectului de relaxare

Imediat dup aplicarea cmpului electric, suma vectorial a

acestor patru forte este egal cu zero i viteza electroforetic devine

constant (figura 4.3). Neglijnd efectul de relaxare i innd cont de

direciile celor trei forte se obine viteza electroforetic:

6

Ev

unde: - = permitivitatea absolut a mediului

- = potenialul electrocinetic


35

- E = intensitatea cmpului electric

- = coeficientul de vscozitate

Mobilitatea electroforetic se definete ca raportul dintre vitez i

intensitatea cmpului electric:

E

v

Datorit ncrcrii electrice nete de la suprafaa particulelor

biologice, n acest regiune se organizeaz, se structureaz, un strat

dublu electric alctuit dintr-o zon compact de grosime (a) i una difuz,

n care pentru simplitate, suprafaa de demarcare a particulei fa de

mediu este considerat plan (figura 4.3).

Cnd particula este pus n micare de ctre cmpul electric

aplicat, aceasta antreneaz o dat cu ea un strat de lichid mai gros dect

cel compact, notat cu (b). Planul care se afl la distana ba de particul

se numete plan hidrodinamic de alunecare, iar potenialul n acest plan

se numete potenial electrocinetic (). Valoarea potenialului electro-

cinetic se poate determina indirect pe baza msurrii mobilittii

electroforetice a particulei n cmp electric.

Figura 4.3. Forele ce acioneaz asupra unei particule ncrcate cu sarcin electric suspendat ntr-un mediu lichid. Distribuia ionilor n stratul dublu electric de la suprafaa unei particule scufundate ntr-un electrolit.


36

Metoda microscopic de electroforez - acest metod este

singura tehnic disponibil pentru determinarea vitezei electroforetice a

particulelor mari, cum ar fi celulele sanguine, microorganisme, particule

coloidale, etc. Se bazeaz pe observarea direct, la microscop a migrrii

particulelor suspendate ntr-o soluie tampon adecvat ca urmare a

aplicrii unui cmp electric creat de un curent continuu.

Pentru aceast tehnic este necesar o celul electroforetic

(figura 4.4), prevzut cu doi electrozi, un sistem de umplere i golire, ce

se poate introduce n cmpul unui microscop. Celula poate fi plan sau

cilindric (capilar).

Figura 4.4. Electroforeza microscopic: cuva electroforetic folosit i imaginea observat la microscop prevzut cu micrometru ocular.

Electroforeza la joas tensiune Este o metod ce permite

separarea proteinelor plasmatice. Dispozitivul experimental folosit este

prezentat n figura 4.5.

Ca suport al electrolitului (al soluiei tampon) se folosete att

hrtie special pentru electroforez (de tip Whatman) ct i membrane de

celuloz. Dintre avantajele utilizrii membranelor de celuloz amintim, n

primul rnd: rezoluia mult mai bun i un timp de migrare mai mic.


37

Figura 4.5. Electroforeza la joas tensiune dispozitiv experimental.

Dup separarea proteinelor urmeaz un procedeu de fixare i

colorare. n primul rnd, mediul suport este fixat prin introducere n

etanol, metanol sau acid, ori prin nclzire fcnd astfel proteinele

insolubile.

Benzile sunt colorate cu ajutorul unor colorani specifici

proteinelor (albastru de brom fenol), se spal n mai multe bi cu acid

acetic 2% i sunt trecute prin vapori de amoniac pentru regenerarea

colorantului (figura 4.6).

Figura 4.6. Electroforeza mediul suport dup procedeele de fixare i colorare.

Dup aceste procedee benzile sunt scanate cu ajutorul unor

densitometre prin reflexie, transmisie sau combinate, ce permit trasarea

spectrelor caracteristice probelor oferind totodat cantitatea n g/100ml.


38

Electroforeza pe un mediu suport acetat de celuloz a serului

uman este prezentat n figura 4.7.

Figura 4.7. Electroforeza pe un mediu suport acetat de celuloz a serului uman.

Este cunoscut faptul c scderea albuminelor survine de regul n

toate disproteinemiile, fiind ns mai accentuat n cazul unui deficit n

aportul de proteine, n deficitul de sintez (ciroz hepatic), sau n

pierderi de proteine (sindrom nefrotic, arsuri).

Creterea 1, 2 globulinelor se nsoete de regul de o cretere

a fibrinogenului i a glicoproteinelor i de o accelerare a VSH-ului. O

cretere marcat a 2 globulinelor se ntlnete n sindromul nefrotic.

Modificrile globulinelor au o importan mai redus, dar

creterea globulinelor indic prezena unor inflamaii cronice, sau

sugereaz o proliferare reactiv sau tumoral a imunocitelor productoare

de imunoglobuline. Scderea globulinelor survine n sindromul

nefrotic, malnutriie.

Toate aceste modificri au ca rezultat forme diferite ale spectrlor

electroforegramelor analizate (figura 4.8).


39

Figura 4.8. Tipuri de disproteinemie: (A) Inflamaie acut, (B) Inflamaie cronic, (C) Sindrom nefrotic, (D) Enteropatie exudativ, (E) Ciroz hepatic, (F) Mielom multiplu, (G) Hipogamaglobulinemie.

Focalizarea izoelectrica (electrofocusing) - reprezint o metod

de separare a particulelor cu puncte izoelectrice diferite ntr-un gradient

de pH sub aciunea unui cmp electric omogen.

Punctul izoelectric al unei particule (sau molecule) corespunde

valorii pH-ului la care sarcina electrica net este nul.

Dispozitivele de electrofocusing folosesc o coloana n care se

realizeaz un gradient natural de pH prin utilizarea unor amfolii

transportori cu urmtoarele proprieti: bun capacitate de tamponare i

bun conductivitate la punctul izoelectric, mas molecular mic,

solubilitate bun la punctul izoelectric, absorbie mic a luminii peste

260nm, nu reacioneaz chimic cu componenii amestecului ce urmeaz a

fi descompus.

Cei mai utilizai sunt acizii poliaminopolicarboxilici avnd masa

molecular ntre 300-1000D i puncte izoelectrice situate n domeniul de

pH=3-10.


40


A. Separarea clorofilelor prin cromatografie pe hrtie

Materiale necesare: hrtie de cromatografie, vas de croma-

tografie, micropipete, benzen, eter etilic, ciclohexan, alcooletilic 98%,

ap distilat, stativ, mojar.

Mod de lucru: Se mojareaz cteva frunze ntr-o soluie de 80%

alcool etilic i 20% ap dup care se las ntr-un loc ntunecat 30 min. Se

traseaz foarte fin cu creionul linia de start pe hrtie i cu ajutorul unei

micropipete se pun spoturile de substana (o cantitate de 0.1-1l avnd

grij ca aceasta s nu se ntind).

Se pregtete ntr-un pahar Berzelius eluentul format din 50%

eter etilic, 40% ciclohexan, 8% benzen i 2% ap, se agit bine i apoi se

toarn n vasul de cromatografie astfel nct s acopere fundul vasului cu

cel mult 2-3mm.

Se introduce hrtia de cromatografie fixat n stativ 1mm n

lichid. Se acoper vasul i se ateapt 45min dup care se trece la

identificarea componentelor i la calculul timpilor de reinere pentru

fiecare component.

B. Determinarea vitezei electroforetice a eritrocitelor

Materiale necesare: cuv de electroforez, microscop Biorom,

suspensie de eritrocite, surs de tensiune, soluie izotonic, micrometru

ocular, cronometru.

Mod de lucru: Se conecteaz cuva de electroforeza la microscop

i se umple cu soluie izotonic dup care se ateapt 1-5min pn


41

eritrocitele difuzeaz n toat cuva. Se pune la punct imaginea astfel nct

s se observe cu micrometrul ocular o hematie. Se conecteaz sursa de

tensiune i se msoar timpul (t) n care o celul se deplaseaz ntre dou

repere ale micrometrului ocular (d). Datele se trec n tabelul de mai jos.

No. t(s) v (m/s) vmed(m/s) n-1 1

....

Figura 4.9. Imaginea observat prin micrometrul ocular

(dup aplicarea cmpului electric hematiile se afl n miscare cu vitez v)

Deoarece distana (d) vzut pe micrometrul ocular i parcurs de celulele n micare este n diviziuni, trebuie ca aceasta s fie

transformat n microni (m) pentru a putea fi calculat valoarea vitezei de deplasare.

100g

1dD

ob

m

t

Dv

s

m

S se calculeze intervalul de confiden i s se compare valorile

obinute cu cele din literatur.

)v,v(v 1nmed1nmed s

m


42

Sedimentarea si centrifugarea

I. Noiuni teoretice

1. Sedimentarea

Sedimentarea - Este o tehnic de separare ce se bazeaz pe

diferena de densitate dintre componentele amestecului. n practica

medical se utilizeaz nu numai ca tehnic de separare dar i ca o metoda de

analiz (VSH - viteza de sedimentare a sngelui).

Pentru o nelegere mai bun a procesului se poate modela

comportarea unei hematii n cmp gravitaional.

S consideram o suspensie de particule sferice de raz R i

densitate aflate ntr-un lichid de densitate 0 (0). Asupra particulelor

acioneaz urmtoarele forte:

- fora de greutate: gR3

4gmG 3

- fora Arhimedic: gR3

4gmF 0

30A

- fora de frecare cu moleculele lichidului - fora de vscozitate;

pentru particule sferice i viteze mici de deplasare, fora de vscozitate

este dat de legea lui Stokes: vR6FV

unde: v este viteza, coeficientul de vscozitate iar R raza particulei.

La echilibru dinamic rezultanta acestor fore este nul i particula

coboar cu vitez constant (figura 5.1).


43

Figura 5.1. Forele ce acioneaz asupra unei particule

de raz R i densitate aflat ntr-un lichid de densitate 0 ( 0).

vR6gR3

4gR

3

40

33

102 gR

9

2v (1)

Considernd t

Lv unde L este spaiul parcurs n micare

rectilinie i uniform iar t timpul de sedimentare, obinem:

1012 gRL

2

9t

Dup cum se constat din relaia (1) viteza de sedimentare

depinde att de mrimea particulelor (R) ct i de interaciunea acestora

cu lichidul n care se afl, prin coeficientul de vscozitate .

Sedimentarea poate fi deci folosit nu numai ca tehnic de

separare a unor particule de interes dar i ca metod de cercetare n

vederea obinerii unor informaii legate de aceste particule.

De mare importan clinic este determinarea vitezei de

sedimentare a eritrocitelor. n tabelul urmtor sunt prezentate valorile

normale obinute prin metoda Westergreen.


44

Subiect 1 ora 2 ore

barbat 2 - 8 mm 5 - 18 mm

femeie 4 - 10 mm 6 - 20 mm

nou - nascut 1 - 2 mm -

sugar 5 - 10 mm -

copil mic 7 - 12 mm -

2. Centrifugarea

Centrifugarea - reprezint o tehnic de separare a componentelor

unui amestec cu densiti diferite sub influena unui cmp centrifugal.

Deoarece viteza de sedimentare pentru particule de mrimea

hematiilor, sau mai mici, este deosebit de sczut, este necesar o metod

care s creasc fora activ (greutatea n cazul sedimentarii). Astfel, n

cazul centrifugrii, rolul forei de greutate l joac fora centrifug.

Figura 5.2. Forele ce acioneaz asupra unei particule

de raza R i densitate aflat ntr-un lichid de densitate 0 ( 0).

xR3

16amF 233ccf

Neglijnd fora de greutate i considernd c migrarea duce la

creterea razei traiectoriei circulare, avem urmtoarele relaii:

cfva FFF


45

dt

dxR6Fv

xR3

16F 0

233a

x

dxR

8

9dt

1

0222

Prin integrare obinem timpul necesar separrii:

i

f1

02

cx

xln)R(

8

9t

.

Ultracentrifugarea - Pentru particule foarte mici cum ar fi

proteinele plasmatice sedimentarea prin centrifugarea obinuit este

practic nerealizabil din cauza fenomenelor de difuzie. Sunt necesare n

acest caz turaii deosebit de mari 15000rot/min.

Ultracentrifugele ce realizeaz aceste turaii trebuie s fie bine

stabilizate mecanic (pentru a evita fenomenul de bti care ar duce la

ruperea axului) i bine termostatate (pentru a mpiedica degradarea

termic).

Cnd sistemul este monodispers apare o limit net de separaie

ntre solvent i particulele dispuse la fundul eprubetei.

Cnd sistemul este polidispers apar mai multe cmpuri i este

necesar o ultracentrifugare fracionat. Se centrifugheaz pe rnd la

fiecare turaie de interes i se recolteaz sau sedimentul sau super-

natantul.


46


A. Determinarea vitezei de sedimentare a eritrocitelor

(metoda Westergreen)

Materiale necesare:

-snge venos, 1.6 ml, recoltat pe anticoagulantul citrat trisodic

3.8%, n cantitate de 0.4 ml;

-materiale pentru puncie venoas;

-eprubete de hemoliz;

-hemosedimentrul Westergren, alctuit dintr-un stativ metalic

prevzut cu pipete Westergren, de aproximativ 300mm lungime i 2.5

3mm diametru.

Mod de lucru:

-se aspir cu seringa, n condiii sterile, o cantitate de 0.4ml citrat

trisodic 3.8%;

-se puncioneaz vena pacientului i se aspir snge pn la

diviziunea de 2ml;

-dup omogenizare sngele se pune ntr-o eprubet de hemoliz;

-se aspir sngele n pipetele Westergren pn la diviziunea zero;

-se fixeaz pipetele n stativ (ntr-o poziie perfect vertical), apoi

se noteaz timpul (momentul se start) i numele pacientului.

Citirea rezultatului se face la o or i/sau la dou ore, valoarea

fiind dat de nlimea coloanei de plasm aprut n partea superioar a

tubului exprimat n mm, pe unitate de timp.


47

B. Centrifugarea sngelui

Materiale necesare:

- sering i ac pentru puncie venoas

- eprubete de hemoliz

- stativ

- pipete gradate

- citrat trisodic 3,8%

- balan de echilibrare

- ser fiziologic

- eprubete de centrifugare

Mod de lucru:

-se recolteaz o cantitate de 5-6 ml snge dup metoda descris

anterior;

-se introduce n eprubeta de centrifugare 1ml citrat trisodic 3,8%,

4ml ser fiziologic i 5ml snge dup care se aseaz eprubeta pe balana

de echilibrare;

-pe platanul opus se aseaz o eprubet identic n care se

introduce ap distilat pn la echilibrarea balanei;

-se aeaz cele dou eprubete n centrifug n poziii diametral

opuse una fa de alta, se nchide capacul centrifugii i se regleaz la

2000rotatii/min, dup care se centrifugheaz 2minute;

-se scoate eprubeta i se masoar deplasarea frontului eritrocitar,

apoi se continu centrifugarea.


48

Probleme:

1._Cunoscnd valorile fiziologice ale coeficientului de vscozitate

la brbat B=0,047Kg/ms i la femeie F=0,043Kg/ms, densitatea

eritrocitului =1095Kg/m3 i a plasmei o=1027Kg/m3 calculai din formula

vitezei de sedimentare ct ar trebui s fie raza eritrocitului presupus sferic.

2._Determinai viteza de sedimentare a unor particule de cret

suspendate ntr-un lichid i raza acestor particule presupuse sferice

cunoscnd apa=1 g/cm3, apa=1.05 10

-3Kg/ms, creta=1,545 g/cm3.

3._Cunoscnd raza particulei de cret determinat anterior, evaluai

folosind modelul matematic al centrifugrii, timpul de centrifugare pentru

aceste particule suspendate ntr-un mediu vscos (glicerin). Se cunosc:

- =1000rot/min, (500rot/min)

- glicerina=13,93 10-3Kg/ms

- glicerina=1,26 g/cm3

- ln(x2/x1)=0,143

Verificai experimental rezultatul obinut.


49

Spectrofotometria de absorbie n ultraviolet i vizibil

I. Noiuni teoretice

n aceast lucrare ncercm s prezentm aplicaiile spectro-

fotometriei n ultraviolet i vizibil pentru substane n stare lichid,

lichide pure, amestecuri i n special soluii. Spectrele urmrite sunt

spectre moleculere electronice la care structura de rotaie nu mai apare iar

cea de vibraie se manifest numai n anumite cazuri printr-o structurare a

benzilor de absorbie care, n general, sunt largi i nerezolvate n linii.

Benzile de absorbie din aceste domenii spectrale corespund

tranziiilor de pe nivelul electronic fndamental pe cele mai joase nivele

electronice excitate, pentru care tranziiile sunt permise conform legilor

de selecie. n aceste condiii tranziiile electronice implic cele mai mari

variaii de energie, iar frecvenele cuantelor absorbite se situeaz att n

domeniul vizibil ct i de ultraviolet al spectrului.

La aceste tranziii electronice particip electronii unor anumite

grupri structurale ale moleculelor numite cromofori. n cazul substan-

elor organice asemenea grupri structurale sunt reprezentate de legtura

simpl, dubl i tripl, gruparea bazic, etc.

Interacia cromoforilor ntre ei sau cu alte grupri atomice

provoac importante modificari ale spectru1ui de absorbie atribuit

cromoforului singur. n aceste condiii pot apare urmtoarele efecte:

- efectul batocromic - de deplasare a maximului de absorbie spre

lungimi de und mai mari (deplasarea spre rosu),


50

- efectul hipsocromic - de deplasare a maximului de absorbie spre

lungimi de und mai mici (deplasarea spre albastru),

- efectul hipercromic - de cretere a intensitii de absorbie,

- efectul hipocromic - de descretere a intensitii de absorbie.

Proprietile de absorbie ale mediului pot fi caracterizate prin

mrimile: absorban, trasmitan, extincie, coeficient de extincie.

Legea Bouguer-Lambert exprim relaia cantitativ dintre inten-

sitatea I, a luminii emergente, intensitatea I0, a luminii incidente,

grosimea x a substanei absorbante i natura substanei.

Figura 6.1. Reprezentarea grafic a legii Bouguer-Lambert (X1/2 grosimea de njumtire).

Expresia legii Bouguer-Lambert se poate scrie:

kx0eI)x(I

Prin definiie transmitana (T), sau coeficientul de transmisie al

unei substane este dat de formula:

100I

I(%)T

0

iar extincia natural En, este dat de relaia:

xkI

Iln

T

1lnE n

0n


51

unde kn reprezint coeficientul natural de extincie. Se poate arta uor c

0En.

Avantajul folosirii extinciei este acela al proprietii de

aditivitate pe care o are aceast mrime: un amestec de mai multe soluii

diluate avnd extinciile E1,...,En se comport ca o singur soluie cu

extincia global E, dat de relaia:

n1 E...EE

Prin absorban (A), sau coeficient de absorbie se nelege:

100I

II(%)A

0

0

n practic, deoarece logaritmii naturali sunt mai puin comozi se

folosete o relaie asemntoare n care intervin, ns logaritmii zecimali:

E0

kx0 eI10II

unde k reprezint coeficientul zecimal de extincie iar E extincia

zecimal sau densitatea optic.

Lege Beer este valabil numai pentru soluii diluate i

stabilete o legtur matematic ntre extincia E, concentraia C a

substanei i coeficientul molar de extincie care depinde de natura

substanei i de lungimea de und.

xC)()x,(E

unde C se msoar n mol/dm3.

n aceste condiii legea Bouguer-Lambert-Beer se poate scrie:

xC)(0 10I)x,(I


52

Curbele care dau dependen E=f(), T=f(), A=f(), =f() sau

f(), sunt cunoscute sub numele de spectre de absorbie.Un exemplu de

astfel de spectru este reprezentat n figura 6.2.

Figura 6.2. Spectrul de absorbie de tipul A=f().

Factorii care pot influena spectrul de absorbie al unei substane:

a) natura solventului nivelele energetice electronice ale molecu-

lelor n stare condensat pot fi modificate prin prezena

moleculelor solventului datorit interaciilor ce apar.

b) concentraia soluiei i temperatura cu creterea concentraiei

apar asocieri moleculare care dau un spectru distinct de cel al

monomerului substanei de studiat, temperatura favorizeaz

deplasarea echilibrului dintre concentraiile de monomer i dimer

iar temperaturile ridicate pot produce chiar transformri

ireversibile ale spectrelor de absorbie.

c) valoarea pH-ului soluiei la valori diferite de pH, punctul

izosbestic aprut n spectru indic prezena n amestec a unor


53

specii moleculaare ce se transform una ntr-alta ntr-o proporie

depinznd de pH.

d) iradierea substanelor iradierea optic a probei poate conduce

la polimerizarea unei specii moleculare i de aici modificri n

spectrul de absorbie.

e) formarea de compleci cationii prezeni n solvent pot duce la

formarea complecilor i deci influenarea spectrului probei.

f) fluorescena datorit fenomenului de fluorescen, intensitatea

radiaiei reemise va duce la o valoare aparent mai mic a

absorbiei probei dect cea real.

g) fenomene de oxidare

h) probele nu sunt dizolvate total sau precipit ulterior

i) fenomene de hidroliz

Descrierea instalaiei spectrofotometrice

Un spectrofotometru conine o parte optic i una electric.

Componentele de baz ale prii optice sunt: sursa, monocromatorul,

compartimentul probelor i detectorul mpreun cu sistemul de

nregistrare (figura 6.3).

Figura 6.3. Principalele componente ale unui spectrofotometru.

Spectrofotometrele se pot clasifica att dup sistemul dispersiv

ct i dup sistemul constructiv. Astfel, n funcie de primul criteriu


54

exist spectrofotometre cu prism, spectrofotometre cu reea, spectro-

fotometre mixte, iar n funcie de al doilea criteriu spectrofotometre cu

monofascicul i cu dublu fascicul.

Spectrofotometrul Camspec M330 are ca element dispersiv o

reea de difracie cu 1200 linii/mm i este de tipul monofascicul. M330

poate trasa spectre UV-VIS n intervalul de lungimi de und cuprins ntre

190-900nm, cu o acuratee de 1nm. n absorbie poate balea pe

intervalul -0.3 la 2.5Abs, iar n transmisie de la 0 la 200%. M330 poate fi

accesat fie direct utiliznd tastatura acestuia, fie prin intermediul unui

calculator.


Trasarea spectrelor de absorbie ale diferitelor tipuri de Hb

(A) Pentru obinerea hemoglobinei:

se centrifugheaz sngele uman la 5000 rot/min

se ndeprteaz supernatantul

se suspend celulele roii n tampon izoton 0.9% NaCl.

se centrifugheaz 10 min la 5000 rot/min (supernatantul trebuie

s fie ct mai limpede)

se lizeaz globulele roii astfel: se adaug la un volum de

eritrocite 1.5 volume de ap i 0.5 volume cloroform

se ndeprteaz cloroformul

se folosete soluia de hemoglobin pentru citire la spectro-

fotometru.


55

(B) Pentru obinerea methemoglobinei (de culoare brun):

se trateaz o parte din soluia de hemoglobin cu soluie de

fericianur de potasiu 3%

(C) Pentru obinerea hemoglobinei reduse:

se adaug la soluia iniial de hemoglobin ditionit de sodiu n

exces pn la observarea culorii violete.

Mod de lucru: O posibilitate simpl i rapid de trasare a unui

spectru este utilizarea programului n varianta de lucru Immediate mod.

Acest mod permite scanarea probei ntre dou lungimi de und, mrirea

i micorarea unor zone prestabilite, deplasare cursorului n zonele dorite

obinndu-se valorile de absorbie i de lungime de und, afiarea datelor

sub form de tabel, derivatele 1-4 ale spectrului, salvare i printare a

graficului.

Primul pas l constituie selectarea tipului de grafic dorit absorbie

sau transmisie; acest lucru fcndu-se foarte uor prin selectarea cu

ajutorul mouse-lui a butoanelor Abs sau %T.

Se selecteaz apoi Scan , pe ecran aprnd o fereastr Enter

scan wavelengths pentru selectarea intervalului de lungimi de und.

Dup introducerea datelor se apas OK. Se ateapt cteva secunde pn

spectofotometrul i atinge lungimea de und de start. Fr prob n

compartimentul cuvelor sau de preferat cu o cuv coninnd numai

solventul n care a fost preparat soluia, se traseaz zeroul prin apsarea

butonului Set Zero.


56

Dup obinerea zeroului i primirea mesajului de confirmare se

trece la trasarea spectrului propriu-zis prin apsarea butonului Start.

Folosind butonul ID se poate face o fi de identitate a probei iar apsnd

butonul Disk graficul poate fi salvat pe disk n zona dorit. Butonul Data

permite listarea valorilor obinute, Zoom(+-) mrire i micorare a unor

zone prestabilite iar Deriv trasarea derivatelor spectrului.

Se traseaz spectrele de absorbie ale diferitelor tipuri de hemo-

globin (A), (B), (C) preparate i se compar cu datele din literatur.

Figura 6.4. Spectrele de absorbie ale diferitelor tipuri de hemoglobin.


57

Potenialul de aciune

I. Noiuni teoretice

n starea normal (numit stare de repaus) membrana celular

este polarizat, avnd faa intern mai negativ dect cea extern. n mod

uzual se ia faa intern drept referin.

Potenialul de membrana, Vm numit potenial de repaus, ia valori

de la minus civa milivoli, pentru majoritatea celulelor, pana la 60mV

pentru axo1ema, 90mV pentru sarcolema si chiar 200mV pentru

membranele, celulelor din organul electric al petelui torpila, Torpedo

californicum.

Figura 7.1 prezint ceea ce se ntmpl cnd axolema este

excitat de un stimul electric depolarizant. Dac depolarizarea depeste

o valoare critic (sau liminar), atunci membrana se depolarizeaz n

continuare din proprie iniiativa (pana la 0mV) i chiar se repolarizeaz

dar n sens contrar pana pe la +50mV. Apoi potenialul iniial este

restaurat.

Aceasta oscilaie de tensiune de circa 120mV n amplitudine i

1ms durat se numete potenial de aciune. Depolarizarea extern este

de fapt doar un declanator (trigger) al fenomenului ntruct energia

rspunsului specific al membranei provine de la metabolismul celular i

nu de la stimul.


58

Figura 7.1. Simularea potenialului aciune.

Dup potenialul de aciune apar o serie de oscilaii mici i lente,

numite postpoteniale (pozitive i negative, n funcie de sensul depirii

potenialului de repaus). n timpul potenialului de aciune, membrana

este complet inexcitabil (perioada refractara absoluta). Pe durata

derulrii postpotenialelor, membrana este mai puin excitabil dect n

mod normal (perioada refractara relativa). Membrana are nevoie de

aproximativ zece durate ale potenialului de aciune, fr nici un stimul

pentru a-i reface complet potenialul de repaus i excitabilitatea

anterioar.

Potenialul de aciune se propag far decrement (atenuare) n

lungul axonului sub forma aa-numitului impuls nervos. Impulsul nervos

satisface legea totul-sau-nimic, ceea ce nseamn c nici un fel de

excitaie nu se transmite dac stimulul are o valoare inferioar pragului

de excitabilitate, i nici o modificare ca form, amplitudine i durat nu

apare dac stimulul este superior pragului. Pragul depinde de ampli-


59

tudinea, durata, frecvena i forma stimulului. Influena frecvenei devine

important peste 1000Hz, cnd excitabilitatea descrete rapid dac

frecvena de stimulare crete. La frecvene joase (sub 100Hz) nu se

observ nici o modificare a potenialului de aciune.

Un stimul cu o rampa mai lung, d posibilitatea membranei s

se acomodeze la excitaie i s i refac (cel puin parial) starea

perturbat de depolarizare, deci s i scad excitabilitatea. Scurtarea

timpului de stabilire a pulsului depolarizant las nemodificat capacitatea

de reacie a membranei. n cele ce urmeaz se consider numai pulsuri

rectangulare.

Pentru astfel de stimuli, caracteristicile de prag, adic intensitatea

liminar I (indiferent de natura pulsului: tensiune sau curent electric, oc

mecanic, chimic, etc.) i durata liminal t satisfac legea intensitate-

durat:

t

BA)t(I

reprezentat grafic n figura 7.2. Legea este de tip hiperbolic i are dou

asimptote: una vertical i una orizontal.

Figura 7.2. Legea intensitate-durata pentru un puls rectangular


60

Intensitatea minim a unui stimul rectangular ce excit

membrana (avnd o durat infinit) se numete reobaz (notat cu R).

RA)t

BA(lim)t(Ilim

tt

Cea mai mic durat a unui puls rectangular, cu amplitudinea

egal cu dublul reobazei, care nc excit membrana, a fost denumit

cronaxie (). Cronaxia este cea mai utilizat mrime n caracterizarea

excitabilitii unui esut. Cu ct este mai mic cronaxia, cu att mai mare

este excitabilitatea membranei. O membran mai excitabil are nevoie de

mai puin energie de stimulare.

Cronaxia poate fi determinat nlocuind valoarea intensitii

I=2A (A=R) n legea intensitate-durat:

BB

RR2 R

Se poate rescrie acum legea prin nlocuirea constantelor A si B:

t1R)t(I

Reobaza i cronaxia depind de aciunea unor chimicale: hormoni,

toxine, anestezice etc., ce pot fi utilizate n scop medical, att n

diagnostic ct i n terapie. Uneori este necesar creterea excitabilitii,

alteori, din contr, este nevoie s fie sczut. Din aceast cauz studiile

electrofiziologice ale efectelor unor liganzi asupra bioelectrogenezei

membranei sunt o practic curent de peste un secol.


61

Au fost fcute numeroase ncercri de explicare a potenialului

de aciune. Cea mai productiv pentru o lung perioad de timp (fapt

pentru care e considerat clasic) a fost Teoria ionic, propus ntre

1949-1952 de doi cercettori britanici, laureai ai Premiului Nobel pentru

medicin n 1963, Hodgkin i Huxley.

Considernd c:

- exist blocani diferii pentru cele mai importante fluxuri ionice

active (TTX pentru Na+ i TEA pentru K+),

- membrana celular este un dielectric (izolator) ce separ dou

medii conductive (citoplasma i lichidul interstiial sunt

electrolii),

- axonul perfuzat cu soluie salin izoton, avnd aceleai

concentraii de sodiu, potasiu i clor ca i axoplasma, are o

comportare electric similar celui integral, deci impulsul nervos

este un fenomen de membran,

Hodgkin i Huxley au propus modelul electric al membranei prezentat n

figura 7.3 i teoria aferenta lui.

Figura 7.3. Circuitul echivalent al unei poriuni de membran axonal


62

Citoplasma i lichidul interstiial, medii conductoare, sunt

reprezentate prin rezistori electrici conectai n serie. Membrana este

conceput ca fiind compus din celule electrice independente.

Fiecare celul conine un condensator i trei ramuri pentru

transportul selectiv al ionilor: una pentru sodiu, una pentru potasiu, i una

de scurgere pentru toi ceilali ioni la un loc.

Din cauza gradienilor de activitate chimic a ionilor implicai

ntre cele dou fee ale membranei, fiecare ramur conine o baterie

Nerst, a crei for electromotoare E este proporional cu logaritmul

raportului activitilor chimice.

Conductanele ionice selective sunt reprezentate de rezistori, a

cror rezisten poate varia datorit unui puls de tensiune a membranei

sau/i aciunea unor liganzi.

Efectul TTX

Adugarea de tetrodotoxin, TTX (o neurotoxin puternica

extras din ficatul i ovarele unui peste din Marea Japoniei, Sphoeroides

rubripes, i unii tritoni), n soluia de imersie a axonului, blocheaz

transportul de sodiu i nu are efecte directe notabile asupra transportului

de potasiu.

Figura 7.4 prezint efectul TTX asupra probabilitilor n, m, h, a

conductanelor de sodiu i potasiu, a potenialului de aciune. Toxina are

nevoie de ceva timp pentru a difuza n structur i a da efect. Cnd

conductana maxim a sodiului scade sub o valoare critic, membrana nu

mai rspunde.


63

Figura 7.4. Efectul TTX.

Figura 7.5. Efectul cesiului asupra bioelectrogenezei membranei.


64

Efectul cesiului

Datorit competiiei la legarea de componentele proteice ale

membranei cu ceilali cationi monovaleni (n special cu ionii de K+)

prezenta cesiului n soluia de imersie afecteaz dinamica probabilitatilor

n, m si h i duce la o scdere semnificativ a conductanei superficiale a

potasiului i la o foarte mic cretere a conductanei de sodiu. Aceste

schimbri modific potenialul de aciune, crescndu-i puin durata dup

cum se observa n figura 7.5.


Utiliznd programul de simulare din dotarea laboratorului de

biofizic s se determine valoarea reobazei, a cronaxiei, perioadei

refractare i s se urmareasc efectele TTX i Cs. Comentai rezultatele

obinute.


65

Fenomene de transport

I. Noiuni teoretice

1. Difuzia

Difuzia pasiv reprezint fenomenul de transport pasiv, datorat

agitatiei termice, a unor particule din zonele de concentratie, densitate

mai ridicate, spre zonele cu valori mai mici ale acestor mrimi, printr-un

mediu suport omogen.

Fenomenul de difuzie pasiv este cel mai intens la gaze, unde

viteza termic este foarte mare i cel mai lent n cazul solidelor, unde

moleculele (sau ionii) au poziii relativ fixe n spaiu.

nainte de a prezenta legile difuziei, vom face unele precizri n

legatur cu anumii termeni folosii: flux i gradient.

Fluxul reprezint cantitatea de substan, sarcin, energie

transportat printr-o suprafa n unitatea de timp.

Prin gradient se ntelege variaia unei mrimi (concentraie,

densitate, potenial electric etc.) ntre dou puncte ale spaiului, raportat

la distana dintre cele dou puncte.

n aceste condiii definim difuzia ca cel mai general tip de

transport pasiv (spontan), produs de gradientul de concentraie (pentru

gaze), sau de gradientul de activatate chimic (pentru materia conden-

sat).

Difuzia pasiv ntr-un mediu omogen se supune la dou legi,

cunoscute sub numele de legile lui Fick:


66

(1) Cantitatea de substan difuzat printr-o suprafa , n

unitatea de timp este proporional cu aria suprafeei, cu gradientul de

concentraie i depinde de condiiile de mediu. Factorul de proporiona-

litate se noteaz cu D i reprezint coeficientul de difuzie.

dx

dcSD

dt

dm

m=masa de substan, S=supraa de difuzie, D=coeficientul de difuzie,

dx

dc= gradientul de concentraie, t = timpul.

(2) Viteza de variaie a concentraiei este proporional cu

variaia spatial a gradientului de concentratie.

x

c

xD

x

cD

dt

dc2

2

Reprezentare grafic a variaiei de concentratie cu distana (ntr-

un solvent) ofer o imagine a gradientului sub forma unei pante de-a

lungul creia "coboar" solvitul.

Figura 8.1. Reprezentarea schematic i grafic a dependenei concentraiei unui solvit (molecule difuzante) care se injecteaz n partea stng a unui solvent (faza omogen).


67

Transportul de substan prin difuzie conduce la modificarea

concentraiei n fiecare punct al spaiului ocupat de ansamblul solvit-

solvent, n final ajungndu-se la o egalizare a concentraiei.

Figura 8.2. Distribuia spaial a concentraiei la diferite momente de timp (t0t1t2...t) dup nceperea procesului de difuzie, n urma contactului dintre solvit i solvent.

Prima lege a lui Fick permite calcularea cantitii de substana ce

strabate o membrana permeabil:

tcSPm

unde: c = diferena de concentraie, t = intervalul de timp.

Fie dou vase de volume V1 si V2 desprite de o membran

semipermeabil, ce conin solvent, respectiv o soluie de concentraie C0

cunoscut.

n timpul difuziei lichidul din vasul V2 trece de la concentraia C0

la concentraia C2 (mai mica), iar n vasul V1 concentraia crete de la

C01(=0) la C1. Conform legii conservrii masei se poate scrie relaia:

221102 CVCVCV

din care explicitnd variaia masei:

11 VCm

se ajunge la coeficientul de permeabilitate al membranei:


68

tCV

VVCS

VCP

1

2

210

11

Problema n aceasta situatie o reprezint determinarea

concentraiei C1. Pentru aceasta se folosete metoda conductometric

deoarece pentru substanele ionice, ntre anumite limite ale concentraiei,

aceasta este proportional cu conductivitatea solutiei ().

Conductana este inverul rezistenei i se msoar n -1 (mho):

R

1G

2. Osmoza

n unele situaii solvitul este mpiedicat s difuzeze ntre

compatimente datorit existenei unei membrane semipermeabile. n

aceast situaie sistemul tinde spre o stare stationar (steady state) i nu

spre o stare de echilibru, prin difuzia solventului prin membran.

Osmoza duce la apariia unei asimetrii a presiunii hidrostatice n

sistemul considerat. Diferena de presiune hidrostatic ce blocheaz

difuzia solvitului se numete presiune osmotic.

Figura 8.3. Procesul de osmoz.


69

Pentru soluii diluate presiunea este dat de legea lui Van't Hoff:

TRnV

unde: = presiunea osmotic

n = numrul de moli de substan osmotic activ dizolvai

R = constanta universal a gazelor

T = temperatura absolut

n cazul soluiilor de electrolii se introduce un factor de corecie (i)

dependent de gradul de disociere al electrolitului:

TRniV


A. Determinarea concentraiei unor soluii ionice prin conductometrie

Materiale necesare:

- sursa de tensiune 12V cc

- punte Wheastone

- electrozi

- soluii ionice de concentraie cunoscut

Mod de lucru: Se realizeaz montajul experimental ca n figura

8.4. Se introduce prima soluie pn ce aceasta acoper complet

electrozii, dup care se apas butonul (K) punii; dac acul deviaz se va

ajusta valoarea rezistenei pn la atingerea echilibrului punii. Valoarea

rezistenei se introduce n tabelul de mai jos. Se procedeaz analog i

pentru celelalte soluii.


70

No. C (mol/l) R () G (-1)

1

....

Se traseaz graficul conductan = f (concentraie), iar cu ajutorul

metodei celor mai mici ptrate se traseaz curba ce se potrivete cel mai

bine datele experimentale (vezi prelucrarea matematic a datelor).

Figura 8.4. (1) surs de tensiune, (2) punte Wheastone, (3) cuv cu electrozi.

B. Determinarea coeficientului de permeabilitate al unei membrane

Materiale necesare:

- sursa de tensiune 12V cc

- punte Wheastone

- electrozi

- membrane sintetice

- vas de difuzie

- cronometru

Mod de lucru: Se realizeaz montajul experimental ca n figura

8.5. Se umple compartimentul din stnga al cuvei cu o soluie concentrat

de NaCl iar cel din dreapta cu ap distilat. Se masoar conductana


71

soluiei din cuva cu electrozi la fiecare 3 minute. Datele obtinute se trec

n tabelul de mai jos.

Figura 8.5. (1) surs de tensiune, (2) punte Wheastone, (3) vas de difuzie.

No. t (min) R () G (-1) P (m/s)

1.

.....

S se traseze garficele G = f(t) i R = f(t).

C. Determinarea presiunii osmotice a unor soluii

Materiale necesare:

- osmometru

- membrane semipermeabile

- soluii de glucoz

- vas de 500ml

- ap distilat

Mod de lucru: Se monteaz la osmometru prima membran, dup

care se introduce n vasul cu ap distilat pn cnd suprafaa lichidului

din vas se afl la diviziunea 0 a osmometrului. Se introduce prima soluie

de analizat n osmometru tot pana la diviziunea 0. Dupa 5 minute se

msoar diferena de nivel i se calculeaz presiunea osmotic a


72

soluiilor. Datele se trec n tabelul de mai jos. Se goleste osmometrul, se

spal cu ap distilat i se reia procedeul pentru soluiile urmtoare.

Figura 8.6. Determinarea presiunii osmotice cu ajutorul osmometrului.

No. Soluia h (mm) (atm)

1.

...


73

Determinarea coeficientului de vscozitate a lichidelor biologice

I. Noiuni teoretice

Vscozitatea este fenomenul de frecare intern ce apare n

sistemele lichide. Fenomenul de vscozitate se manifest n dou

ipostaze: cnd o particul se mic n raport cu un lichid staionar

vscozitate static i cnd straturile adiacente de lichid se mica unele n

raport cu altele vscozitate dinamica.

Vscozitatea static face obiectul unei alte lucrri practice de

tehnici de separare (sedimentarea).

Vscozitatea dinamic n cazul lichidelor reale care curg se

constat c acest proces are loc n straturi subiri vecine, moleculele din

acelai strat avnd aceeai vitez, n timp ce moleculele din straturile

vecine au viteze diferite.

ntre moleculele straturilor vecine (ca i ntre moleculele

aceluiai strat) se exercit fore de atracie, forte ce se opun deplasrii

relative a acestor straturi, determinnd apariia unei frecri interne n

lichide numit vscozitate.

Dac n timpul curgerii straturile de lichid rmn paralele,

curgerea este cunoscut sub numele de curgere laminar. Pentru

curgerea laminar, fora de vscozitate este dat de legea lui Newton:

dx

dvSFv

unde: = coeficientul de vscozitate dinamica a lichidului


74

dx

dv = gradientul de vitez

S = aria comun a celor doua straturi

Coeficientul de vscozitate depinde de natura lichidului i de

temperatur (scznd cu creterea temperaturii). Lichidele pentru care

este valabil relaia de mai sus se numesc lichide Newtoniene. Marea

majoritate a lichidelor de interes medical (lichidul cefalorahidian, plasma

sangvin, serul sangvin, urina) sunt lichide Newtoniene.

Vscozitatea dinamic este un fenomen foarte important n

circulaia sngelui.

S consideram un vas de snge de lungime L i raza R la capetele

cruia acioneaz o diferen, de presiune p=p1p2>0 (unde p1 este

proiecia presiunii sistolice pn n acel teritoriu iar p2 rezistena

periferic). La peretele vasului ader o pelicul fin de lichid ce rmne

n repaus. Dac diferena de presiune nu este foarte mare, atunci curgerea

are loc n pturi cilindrice paralele, cu viteze din ce n ce mai mari de la

periferie spre ax (figura 9.1).

Figura 9.1. Curgerea unui fluid printr-un tub cilindric de lungime L i raza R; p1, p2 sunt

presiunile ce acioneaz la capetele tubului (p = p1 p2>0)

Se poate determina n acest context fluxul de snge (volumul

ce trece n unitatea de timp) prin seciunea transversal a vasului:


75

L8

)pp(R 214

(1)

Pentru lichidele care curg n conducte se introduce aa numitul

numr Reynolds:

rvRe

unde: r = raza conductei

= densitatea fluidului

v = viteza de curgere

= coeficientul de vscozitate dinamic a lichidului

Pentru sngele din arterele mari exist o valoare critic a

numrului Reynolds (ReCR

) egal cu 1000. n funcie de aceast valoare

exist mai multe regimuri de curgere a sngelui :

a) pentru Re< 1000, curgerea este laminar

b) pentru 1000< Re 2000, curgerea devine turbulent (cu vrtejuri)

n sistemul cardiovascular uman, curgerea turbulent poate s

apar n aorta, imediat deasupra valvulelor sigmoide, n perioada de

expulzie a sngelui (cnd viteza sngelui atinge cea mai mare valoare).

Aceast curgere turbulent este caracterizat prin zgomote caracteristice.

Turbulena (consumatoare de energie) poate s apar i n alte vase, n

stri patologice, cnd vscozitatea sngelui este mult mai sczut

(anemie, sau n cazul scderii CO2 din snge).


76

Vscozitatea sngelui

Vscozitatea sngelui, la temperatura de 37oC, este de

aproximativ 4 ori mai mare dect cea a apei, sngele fiind un lichid

nenewtonian. Mai mult, sngele nu constituie o faz omogen, ci un

sistem dispers heterogen, mai precis, o suspensie de elemente figurate n

plasm.

Tot lichidele nenewtoniene sunt i soluiile coloidale i

macromoleculare, pentru care coeficientul de vscozitate depinde de

concentraia particulelor dispersate, conform legii lui Einstein:

=d(1+KV)

unde: d = coeficientul de vscozitate dinamic al mediului respectiv,

V = volumul fazei dispersate din unitatea de volum a suspensiei,

K = constant ce depinde mrimea i natura particulelor

dispersate (pentru proteine globulare K=4-10)


Determinarea coeficientului de vscozitate a unor lichide

Principiul metodei: Determinarea vscozitii cu vscozimetrul

Ostwald se bazeaz pe msurarea timpului de scurgere a unui volum

determinat de lichid printr-un tub capilar etalonat sub aciunea unei

diferene de presiune cunoscut.

Pornind de la relaia (1) i innd cont c diferena de presiune

este de tip hidrostatic p1-p2=gh se poate arta c expresia coeficientului

de vscozitate se poate scrie sub forma:

= Kt


77

unde: K = o constant ce depinde numai de vscozimetrul utilizat.

Dac un volum V de lichid al crui coeficient de vscozitate

este necunoscut curge n timpul t printr-un tub capilar ntre doua repere i

dac acelai volum de apa V avnd coeficientul de vscozitate cunoscut

0 parcurge aceeai distan n timpul to putem determina vscozitatea

relativa a lichidului rel:

0o00

relt

td

t

t

(2)

unde: 0

d

reprezint densitatea relativ.

Dac cunoatem ns i 0 se poate calcula vscozitatea absolut

a lichidului .

Dispozitivul experimental:

Pentru determinarea vscozitii unor lichide se folosete

dispozitivul Ostwald. Acesta este confecionat dintr-un tub de sticl n

forma literei "U" avnd o ramur (A) cu un diametru de aproximativ 2cm

prevzut cu un rezervor de 3ml capacitate i respectiv o ramur (B)

avnd un diametru de aproximativ 0.8cm cu un rezervor de 2ml

capacitate situat n partea superioar. Acest rezervor este delimitat de

dou tuburi capilare i este prevzut cu dou repere R1 si R2.

Ramura (B) continu cu sistemul de aspiraie alctuit dintr-un tub

de cauciuc, un tub de sticl prevzut cu un orificiu lateral i o pomp de

cauciuc.


78

Figura 9.2. Vscozimetrul Ostwald.

Mod de lucru:

Se introduce apa distilat n ramura A. Cu ajutorul sistemului de

aspiraie se ridic apa n ramura B undeva deasupra reperului R1. Se

elibereaz pompa iar n momentul cnd suprafaa lichidului se afl n

dreptul reperului R1 se pornete cronometrul i se msoar intervalul de

timp necesar apei s curg ntre R1 si R2.

Se nlocuiete lichidul de referina (ap distilat) cu lichidul de

studiu i se repet procedeul prezentat mai sus. Pentru calcul

coeficientului de vscozitate se va folosi relaia (2).

Se vor efectua 15 determinri pentru fiecare lichid n parte iar

datele experimentale se vor introduce n tabelul de mai jos.

No tapa

(s) tapa mediu

(s) t lichid

(s) d rel

(Ns/m2)

rel med (Ns/m

2)

n-1 (Ns/m

2)

1.

....


79

Determinarea coeficientului de tensiune superficial a lichidelor biologice

I. Noiuni teoretice

_O substan lichid este separat de atmosfera nconjurtoare

(n care se gsesc i vaporii si) printr-o ptur superficial. Moleculele

din ptura superficial se gsesc n condiii care se deosebesc de cele din

interiorul lichidului astfel:

Figura 10.1. Moleculele din ptura superficial se gsesc n condiii diferite dat de moleculele din interiorul lichidului: (a1) molecul situat n interiorul lichidului,

(a2) molecul situat n stratul superficial.

- fiecare molecul din interiorul lichidului este nconjurat

complet de moleculele lui. Corespunztor, forele de interaciune care se

manifest ntre aceast molecul i moleculele vecine sunt repartizate

aproximativ simetric. Rezultanta acestor fore este apropiat de zero i

influeneaz puin micarea moleculelor n interiorul lichidului.

- moleculele de la suprafa se gsesc la limita de separare ntre

starea lichid i atmosfera nconjurtoare. Ele interacioneaz

concomitent cu moleculele din cele dou stri astfel nct rezultanta

forelor de interaciune este ndreptat spre interiorul lichidului.


80

Fore de tensiune superficial apar ca rezultat macroscopic al

forelor de interaciune ntre moleculele lichidului. Forele de tensiune

superficial sunt tangente la suprafaa lichidului i acioneaz n sensul

micorrii ei.

Mrimea fizic care caracterizeaz lichidul din acest punct de

vedere se numete coeficient de tensiune superficial (). Acesta se poate

defini n dou moduri:

- coeficientul de tensiune superficial este numeric egal cu

lucrul mecanic efectuat de forele de tensiune superficial

pentru a mrii suprafaa lichidului cu o unitate:

S

W

sau

- coeficientul de tensiune superficial este numeric egal cu

fora de tensiune superficial care se exercit asupra unitii

de lungime:

l

F

_La suprafaa de contact solid lichid apar de asemenea fore

de atracie molecular care au fost denumite fore de adeziune. Din

experien se tie c unele lichide ud pereii solidelor cu care intr n

contact iar altele nu, aceasta depinznd de valorile forelor de coeziune i

de adeziune.


81

Figura 10.2. Forma pe care o ia o pictur de lichid, pentru un lichid care nu ud pereii vasului i pentru un lichid care ud pereii vasului.

Dac forele de coeziune Fc sunt mai mari dect forele de

adeziune Fa atunci lichidul nu ud solidul cu care este n contact, unghiul

de racordare (900,1800). Dac forele de coeziune Fc sunt mai mici

dect forele de adeziune Fa atunci lichidul ud solidul cu care este n

contact iar (00,900).

Valoarea unghiului depinde de compoziia chimic a solidului,

lichidului si gazului; de puritatea celor trei componeni; de temperatur.

_Dac turnm un lichid ntr-un vas marginea suprafeei

lichidului o s primeasc o form determinant. Se numete menisc

suprafaa liber curbat a unui lichid n vecintatea unui corp solid.

Pentru un lichid care nu ud pereii vasului suprafaa meniscului este

convex, iar pentru un lichid care ud pereii vasului suprafaa meniscului

este concav.

Figura 10.3. Forma suprafeei meniscului n cazul a dou lichide: mercur - suprafa convex (stnga), ap - suprafa concav (dreapta).


82

_n cazul unui tub capilar, ascensiunea capilar (h), adic

nlimea la care urc lichidul este dat de urmtoare relaie:

rg

2h

unde: = este densitatea lichidului

= coeficientul de tensiune superficial

r = raza capilarului

h = ascensiunea capilar

Figura 10.4. Lichid care urc ntr-un tub capilar.


Determinarea coeficientului pentru lichide biologice

A. Metoda stalagmometric

Este o metod dinamic de determinare a tensiunii superficiale a

unui lichid biologic constnd n numrarea picaturilor ce se formeaz la

curgerea unui volum bine determinat de lichid printr-un orificiu capilar.

Pornind de la condiia de desprindere a unei picturi se poate determina

expresia coeficientului de tensiune superficial:


83

GF gn

Vr2

gv=gm=G

r2=F

nr2

gV

nK

(1)

unde: K = constant ce depinde de tipul stalagmometrului utilizat

= densitatea lichidului

n = numr de picturi

Dispozitivul experimental folosit (stalagmometrul) este prezentat

n figura 10.5. Este alctuit dintr-un tub de sticl prevzut cu dou

poriuni capilare, una vertical (A) i una orizontal

Cursuri Biofizica LP

Documents

Transcript of Cursuri Biofizica LP