Curs Politehnica

7/23/2019 Curs Politehnica

http://slidepdf.com/reader/full/curs-politehnica 1/63

Teoria celulara:

Toate formele de viata sunt formate din una sau mai multe celule

Celulele se formeaza din celule pre-existente (diviziunea celulara)

Celula este cea mai mica forma de viata

Evenimente majore in evolutia biologiei celulare



TIPURI DE CELULE

Unitatea structurala si functionala a organismulul viu

Activitatea biochimica a celulei se desfasoara la nivelul organitelor

Celule conective

Celule epiteliale

Celulele transportatoare de gaze

Fara nucleu la maturitate

Celule motrice

Celule „rezervor”

Celule ale sistemulu imunitar

Celule nervoase

Celule sexuale



1. Membrana Plasmatica

2. Citoplasma (80% apa)

a Contine organite celulare

3. Nucleu



Membrana plasmatica (MP)

Consta intr-un bistrat lipidic

MP este fluida, fosfolipidele sunt capabile sa se deplaseze in bistrat

Regiunea

hidrofila

Regiunea

hidrofoba

Regiunea

hidrofilica

Regiunea hidrofobica

fosfat

glicerol

Acid gras

X



www.highlands.edu

I. Bistratul lipidic

Structura membranei plasmatice

Proteinea) Locatie

-periferice

-integrale (transmembranare)

b) Functie

- transport (canale)

-enzimatica

- structurala (citoschelet)

-recunoastere (receptori)

colesterol

este strabatut de o varietate de proteine, lipide si glicoconjugati



In celula animala:

Colesterolul regleaza fluiditatea si flexibilitatea MP



a) Transport- proteine transmembranare care formeaza canale

selective pentru anumiti ioni sau molecule (transport pasiv/activ)

b) Semnalizare- proteine transmembranare care au situsuri de

expuse pe fata extracelulara, pentru legarea specifica a unor

molecule ( hormoni, molecule de semnalizare= „mesager

chimic”). Legarea ligandului poate determina modificarea

confomatiei receptorului, ducand la initierea unei serii de reactii

in celula

c) Strucural- proteine care formeaza matricea extracelulara si

elementele citoscheletului (in interiorul celulei). Mentin forma

celulei, stabilizeaza localizarea unor proteine membranare, rol inmotilitate si interactii intercelulare.

II. Proteine



d) Activitate enzimatica- proteine transmembranare care catalizeaza

o reactie enzimatica, sau un compex de reactii intr-o anumita cale

metabolica

e) Jonctiuni intercelulare- proteine transmembranare care

interactioneaza apropiind celulele unele de altele; CAMs (cell

adhesion molecules)- importante in migrarea celulara.

f) Recunoastere intercelulara- glicoproteine transmembranare

sunt tinte specifice pentru receptori localizati pe alte celule

II. Proteine



Lanturile glucidice sunt atasate de proteine (glicoproteine) sau lipide membranare

(glicolipide). In numeroase cazuri sunt tinte pentru recunoasterea intercelulara.

Grupele de sange ABO sunt determinate de gruparile glucidice atasate de antigenul H

prezent pe suprafata hematiilor- recunoscute de anticorpi

III. Glucide/oligozaharide/carbohidrati

Enzima A : N-acetilgalactozamintransferaza

Enzima B : Galactosiltransferaza



https://www.youtube.com/watch?v=gFuEo2ccTPA



CURS II



1. Membrana Plasmatica

2. Citoplasma (80% apa)

a Contine organite celulare

3. Nucleu

Structura celulei



Permeabilitatea membranei plasmatice

classes.midlandstech.edu

a) Difuzia simpla-trecerea

moleculelor

liposolubile direct

prin bistratul

lipidic (CO2, O2)

b) Difuzia facilitata de

transportori- proteine care

isi schimba conformatia

dupa legarea ligandului

(glucoza)

c) Difuzia facilitata

de canale proteice

(ioni selectati pe

baza de marime si

sarcina electrica)

d) Osmoza-difuzia

apei printr-un canal

strict specific-

(aquaporin) sau

direct prin bistratul

lipidic



Liza celulara

https://www.youtube.com/watch?v=OYoaLzobQmk

Sare pe melci

Injectarea substantelor in organism



Component E.coli Celula

mamifere

apa 70 70

Ioni 1 1

metaboliti 3 3

proteine 15 18

ARN 6 1.1

ADN 1 0.25

lipide - 2

fosfolipide 2 3

polizaharide 2 2

Volumul

total al

celulei

2x10-

12cm3

4x10-9cm3

Compozitia chimica a unei celule

20%

70%

apa

E coli

ARN

Prot



GENA

Transcript ARN(ARNm)

Transcriptia

ADN

Translatie

Proteina

(1)

(104 copii)

(105 copii)

(TOT-109 copii)

Transmiterea informatiei genetice in celula



În funcţie de comportamentul în mediul apos, aminoacizii suntclasificati astfel:

•

1) – aminoacizi cu grupări R nepolare: Ala, Val, Leu, Ile,Met, Pro, Phe, Trp

• 2) – aminoacizi cu grupări R polare, dar neîncărcate electric:Gly, Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, Cys

• 3) – aminoacizi cu grupări R polare, dar încărcate electric la pH fiziologic

- încărcare pozitivă: Lys, His, Arg

- încărcare negativă: Asp, Glu.

Structura proteinelor

Reactia de condensare intre doi AALegatura peptidica

În funcţie de capacitatea de sinteza a celulei, aminoacizii

sunt clasificati astfel



Forma proteinei- determinata de

secventa de aminoacizi

Legaturipeptidice

•In principiu-un nr.nelimitat de conformatii

•Lantul adopta conformatia stabila

•Majoritatea proteinelor se pliaza spontan

in conformatia stabila

•Plierea este determinata de distributia

lanturilor laterale polare si nepolare

Conformatie pliata in

mediu aposPolipeptid nepliat

Resturi

nepolare

Resturi

polareMiez hidrofob

(Resturi nepolare)

Legaturi de H intre resturile polare

si moleculele de apa



Structura proteinelor



Structura 3D nu se poate prezice din structura primara

Structura 3D- difractie de raze X a cristalelor de proteina sau prin RMNPeste 100 paterne de pliere descoperite

sheet(structuri pliate )-

extensiv in proteinele globulare

Model IgG1(anticorp) Model mioglobina

Structuri secundare comune in proteine

alpha helix- keratina, domeniile TM



Denaturarea proteinelor

• http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/nonmajorsbiology/proteinstructure.html

Codul genetic



CURS III



CITOSCHELETUL

Asigura :-forma celulei

-modificarea formei celulare

-motilitatea celulei

Microscopie fluorescenta



COMPONENTELE CITOSCHELETULUI

Microfilamente Filamente Intermediare Microtubului



Polimerizarea actinei

Monomer ActinaG Legare ATP Polimerizare Actina F

Microfilamente



MICROFILAMENTE

Un filament are doua lanturi de actina polimerizata

Microscopie electronica

Polaritate polimerizare/depolimerizare



• Microfilamentele sunt prezente in intreaga celula, dar mai concentrate in

apropierea MP

• Sunt importante in miscarea, contractia, adeziunea celulara

• Pot fi identificate in celula prin reactia cu faloidina- un compus fluorescent

care leaga doar actina F



MICROFILAMENTE IN ADEZIUNEA CELULARA

Focar de adeziune



FILAMENTE INTERMEDIARE (FI)

Compozitia proteica a filamentelor intermediare depinde de specie si variaza

in functie de tipul de tesut

In celule epidermale si axoni neuronali, FI sunt de cel putin 10 ori mai abundentedecat microfilamentele sau microtubulii

Principala functie este structurala, de sprijin mecanic pentru membrana plasmatica

cand celulele sunt in contact intre ele, sau cu matricea extracelulara

Spre deosebire de microfilamente si microtubuli, FI nu participa la motilitatea

celulara

FI sunt extrem de stabile, raman intacte chiar dupa extractii in detergent sau

solutii saline, in timp ce microfilamentele si microtubulii depolimerizeaza in

subunitatile constituente.



- Celule epiteliale contin FI formate din keratine (peste 50 de tipuri)

- Celule mezenchimale sunt bogate in FI alcatuite din vimentina

- Celulele musculare au FI formate din desmina

- Neuronii si celulele gliale au FI compuse din peripherina si proteina fibrilara acidica gliala

(GFAP).

- FI din lamina nucleara care formeaza reteaua fibroasa de proteine pe partea interna a

membranei nucleare. Laminele participa la atasarea cromozomilor de membrana nucleara

nuclear



DEFECTE GENETICE IN LAMINA NUCLEARA

Mutatie punctiforma la nivelul genei LMNA- codifica lamina A

>90% dintre pacienti mor din cauza complicatiilor date de ateroscleroza (stop

cardiac) inainte de varsta de 13 ani.



MICROTUBULI (MT)

Sunt formati prin asocierea dimerilor de alfa si beta tubulina



Polimerizarea microtubulilor incepe de la centrozom, localizat langa nucleu



Microtubulii sunt esentiali in miscarea organitelor



Microtubulii sunt esentiali in miscarea cililor si flagelilor



CURS IV



Microscopia clasica Arhitectura celulara

Metode de investigare celulara la nivel molecular

Imagini de microscopie electronica



Molecule de interes

Ioni anorganici (Ca, Na, etc)

ARN, ADN

Macromolecule mari Proteine

-Cum identificam moleculele specifice implicate in reactii celulare ?



-Cum identificam moleculele specifice implicate in reactii celulare ?

Importante pentru caracterizarea cailor metabolice/de semnalizare, etc in stare

normala si patologica

-Cum determinam cantitativ moleculele implicate ?

Important pentru patologii. Ex. (titrul viral in infectii)

Leziuni

hepatice

Markeri cuantificati in cursul



-Cum aflam daca sinteza sau localizarea lor celulara se schimba ?

Important in patologii. EX. Fibroza cistica, mutatie la nivelul CFTR (cystic fibrosis

transmembrane conductance regulator) care conduce la sinteza unui canal nefucntional sau

blocarea acestuia in RE urmata de degradare.

Celula pulmonara

Normal Fibroza cistica

Acumulare de mucus „uscat”- blocheaza caile respiratorii

Infectii pulmonare

Acumulare de mucus blocheaza caile pancreatice

Po>>



Fibroza cistica: speranta de viata 37-40 ani

Maladie genetica autozomala recesiva

Incidenta 1:2500 nasteri

Metode de detectie a proteinelor



Metode de detectie a proteinelor

Electroforeza in gel

Suport pentru migrare (gel): poliacrilamida, agaroza

Metoda analitica de separare in camp electric a proteinelor in amestec in functie de masa lor

Structura gelului de poliacrilamida

Structura gelului de agaroza

Polimerizare

Gelificare



Mobilitatea moleculelor biologice depinde de incarcarea electrica si de masa

Proteinele sunt supuse unui tratament care sa le asigure o incarcare electrica uniforma

astfel incat mobilitatea electroforetica sa depinda doar de marimea lor.

Denaturare termica in prezenta de detergenti (SDS)



Electroforeza denaturanta in prezenta de agenti reducatori



p g

Electroforeza proteinelor serice

Variante de electroforeza



Blue Native PAGE (BN-PAGE)

Pentru separarea complexelor proteice largi in forma lor nativa. SDS este inlocuit cu Coomassie (Brilliant) Blue G-250

(Incarcat negativ)

Zymogram PAGE

Pentru identificarea unor proteine active enzimatic (colagenaze sau alte proteaze). Substratele ( gelatina sau cazaina)

sunt inglobate in gel. Migrare in conditii nereducatoare . Colorare cu Coomassie (Brilliant) Blue R-250.

Focusarea izoelectrica

Separare in gradient de pH gradient pentru separarea proteinelor in functie de punctul isoelectric (pI).



Curs V

D t ti t i l i



Detectia proteinelor prin

Western blotting

Principiu: identificarea specifica a proteinelor pe baza interactiei cu anticorpi

- -

+



Ag imobilizat

Ac primari fata de

AgAc secundari(marcati):

Ac fata de Ac primari

Anticorpi : Proteine produse de sistemul imun ca reactie de aparare fata de infectii

Anticorp (Ac) Antigen (Ag)

Specificitatea interactiei Ag-Ac des folosita in biologia celulara

epitopi

Reactia antigen-anticorp

i i i li l li



Anticorpi mono-si policlonali

Anticorpii recunosc

mai multi epitopi ai Ag

Ac-recunoaste

1 singur epitop

Cum migreaza in electroforeza in conditii

reduse/nereduse? Lant H-55 KDa, Lant L-25 kDa

Proteina HIV



Policlonal

Monoclonal



Ag

Celule B Ac

Celule B

Tumorale’’imortalizate’’

I Fuziune

AcII Expandare

III Clonarea celulelor

prin dilutie seriala

IV Selectarea clonelor pozitiveAc monoclonal

Anticorp monoclonali

Propagarea unei clone

-1 singura celula B

-Obtinere de hibridoame--celule hibride

Ac-recunoaste

1 singur epitop

Anticorpi policlonaliAg

Antiserul contine Ac

Amestec heterogen de Ac, fiecare

produs de cite o celula B secretoare



Detectia proteinelor poate fi colorimetrica sau prin chemiluminiscenta



Avantaje:

Foarte specifica pentru identificarea unei anumite proteineDetecteaza proteine si mai putin peptide

Poate confirma prezenta (determinare calitativa) dar si cantitatea unei proteine intr-o

proba data

Procesare minimala a probelor

Dezavantaje:

Proteina de interes trebuie sa fie cunoscuta

Anumiti detergenti pot da interferente

Nu este foarte ieftina (nu se aplica in teste de rutina).

Premise: VEGF (vascular endothelial growth factor) este un agent angiogenic,implicat in permeabilitatea vasculara



implicat in permeabilitatea vasculara

VEGF creste in hipoxie si ischemie vasculara (reducerea fluxului sanguin)

Concluzii

experimentale??





IMUNOFLUORESCENTA

Presupune utilizarea unui anticorp primar, monoclonal sau policlonal, fata de o proteina specifica

Anticorpul primar poate fi direct marcat cu un fluorofor

Se pot folosi anticorpi secundari marcati cu un fluorofor

Fluorescenta emisa de proba este vizualizata cu microscopul de fluorescenta

In cazul in care detectia se face prim microscopie electronica anticorpii sunt legati de un atom metalic

greu (Au)

Aplicatii: in diagnostic clinic Identificare de celule canceroase prin evidentierea unui anumit marker;

cercetare (prezenta sau absenta unei proteine, distributia celulara, modificari de sinteza si degradare

Fluorofori excitatie-emisie



Fluorofori excitatie emisie

Izotiocianat de fluoresceina (FITC)

Evidentierea mai multor proteine in aceeasi



Evidentierea mai multor proteine in aceeasi

proba

E id ti t i l l



Radiatiile UV produc leziuni la nivelul ADN.

Se declanseaza un proces de reparare a leziunilorcare genereaza mutatii

Celula epiteliala mutata induce un proces de

proliferare necontrolata

cancer de piele.

Piele normala

CD95

UV

Marcare cu- anticorpi primari iepure anti- CD95

-anticorpi secundari de capra anti-IgG iepure marcati fluorescent

Clusterele de CD95 semnalizeaza celulei

declansarea apoptozei celulare.

Uniform –

suprafata celulei Clustere

Evidentierea apoptozei celulare

Evidentierea tesutului malign



Sectiune prin tesut pancreatic, in verde celule

pancreatice tumorale- marker specific

Celule hepatice infectate cu HCV, identificarea unei

proteine virale nestructurale

Evidentierea infectiei virale

Curs Politehnica

Documents

Transcript of Curs Politehnica