Procese biotehnologice propriu-zise - ETAPE1. Selecia i ameliorarea factorului biologic: 1-substane chimice; 2-esut animal; 3-cromozom animal; 4-gen tiat dintr-un cromozom; 5-microorganism, ca de exemplu E.coli; 6-plasmid; 7-plasmid secionat; 8-plasmid recombinant; 9-introducere n microorganism; 10-multiplicarea plasmidei i expresia genei; 11-diviziune celular; 12 - cultivare n laborator (inocul); 13 - bioreactor de laborator, 14 - bioreactor pilot; 15 - operare la scar industrial; 16 - recuperarea produsului; 17 - condiionare i vnzare.

Etapele unui proces biotehnologicLaboratorPentru situaiile cnd microorganismul nu trebuie modificat genetic, ci doar preluat din natur, se izoleaz tulpinile de microorganisme de pe fructe, cereale, deeuri alimentare, sol (selecie sub microscop)Selecia: se aleg acei indivizi de microorganisme capabili s sintetizeze compusul dorit (aici intervine competena microbiologului, rigoarea sa, migala i experiena n alegerea cea mai bun)Se cultiv pe plci Petri pe medii solidificate de agar-agar; aceste medii sunt foarte prielnice nmulirii microorganismelor, avnd loc o multiplicare eficient a unor microorganisme foarte similare ca performane cu cele selectateSe obine SUA, adic acea colecie de microorganisme care vor fi supuse multiplicrii la scal mai mare pentru a produce metabolitul urmrit n bioreactor

Selecie i ameliorarea genetic LaboratorEtapa ine de competena microbiologului sau a inginerului geneticianSe preleveaz o gen dintr-un cromozom animal, din esut viu, care se implanteaz ntr-un microorganism rezistent i cunoscut ca evoluie n procese de cretere i diviziune celularSe confirm reuita diviziunii celulare, pe un mediu de cultur adecvat nevoilor microorganismului purttor al genei prelevate din esutul animalAmeliorarea genetic a suelor se face prin tratamente mutageneMutanii sunt microorganisme care apar n cursul ameliorrii ca rezultat al tratrii cu diferii factori fizici sau chimici i difer de microorganismele din care provinAgeni fizici: radiaii UV, raze X, radiaii ionizate, radiaii Ageni chimici: alchilani, nonalchilani, baze analoge, ageni de intercalareNumrul de cicluri de mutaie-selecie poate atinge cteva zeci

Sua trebuie s fie nalt productiv:s aib o rat de cretere a microorganismelor nalts fie rezistent la aciunea precursorilors fie rezistent la aciunea produsului sintetizat i la enzimele de degradares fie rezistent la factorii externi (lumin, pH, oxigen, temperatur) n cursul pstrrii pn la evoluia n bioreactor (de la cteva ore la cteva sptmni)

Etapele unui proces biotehnologicLaborator

Etapa de laboratorCultura de inocul (etapa 12 de pe schema general)Inoculul reprezint materialul de nsmnare propriu-zis al mediului de biosintezEste o cultur microbian n curs de multiplicare pe un substrat nutritiv corespunztor, n condiii specifice de dezvoltare (pH, temperatur, agitare, aerare). Transvazarea culturii de inocul se realizeaz n condiii aseptice (sub flacr), dup o perioad de dezvoltare bine stabilit de microbiolog (vrst, cantitate, aspect microscopic)

Operarea n staia-pilotEste o etap intermediar ntre faza de laborator i aplicarea la scal industrialEste necesar pentru a confirma rezultatele obinute la nivel de laborator i optimiza biotehnologia Inoculul se transvazeaz pe un mediu de cultur sterilizat i rcit la temperatura de cultivareDac raportul de inoculare (cantitate de inocul/cantitate de mediu de cultur) este mic, este necesar introducerea unei etape intermediare de cultivare, numit cultur intermediarRaportul volumic ntre inoculator/intermediar/regim este de 1/10/100

Operare la scar industrialSe aplic doar dup ce etapa de operare n staia pilot a confirmat c microorganismul conduce ntr-adevr la performana estimat la testele de laboratorPresupune cheltuieli mari cu instalarea bioreactorului de mari dimensiuni i cu prepararea mediului de cultur sterilizat i cu compoziia corectEtapa de biosintez este urmat de procedee fizice de recuperare a produsului, urmate de condiionare, ambalare, depozitare, vnzare

Cinetica proceselor de biosintezFermentaie: procesul de cretere a microorganismelor pe medii de cultur* Creterea este rezultatul interaciunii celulelor individuale cu mediul de cultur La bacterii, creterea are loc prin depunerea uni- sau tridimensional de substan nou, mrirea volumului celular, urmat de diviziunea celularActivitatea microorganismelor este condiionat de existena unui anumit raport ntre volumul celulei i suprafaa ei (n cursul creterii, volumul crete mai rapid dect suprafaa) La bacterii, viteza de multiplicare a numrului de indivizi este extrem de mare (n 20-30 minute, populaia se dubleaz)

BACTERII - Curba de cretereStell: a-b inoculare; b-c cretere logaritmic; c-d cretere ncetinit; d-e - descretereMonod: 1 cretere staionar (lag); 2 - cretere accelerat; 3 cretere exponenial; 4 retardare; 5 faza staionar; 6 distrucie accelerat; 7 distrucie logaritmic

Curba de cretereFaza de lagCuprins ntre momentul introducerii inoculului i debutul multiplicriiEste o faz de adaptare la condiiile de cultivareNumrul de bacterii rmne constant sau scade uorBacteriile viabile i acumuleaz n celule metaboliii eseniali i sistemele enzimatice necesare creteriiDurata este n general de cteva ore; este cu att mai scurt cu ct condiiile de via (mediu nutritiv, aeraie, pH, temperatur) sunt mai apropiate de cele anterioare

Curba de cretereFaza de cretere logaritmic (multiplicare exponenial)- ritmul de cretere se accelereaz- diviziunile celulelor se sincronizeaz; la intervale de timp regulate, numrul de celule viabile se dubleaz brusc- etapa dureaz 2-3 ore- celulele rezultate au dimensiuni mai mari dect cele tipice speciei lor, nu conin materiale de rezerv, au coninut ridicat de ARN (sunt celule specializate pe producie, datorit modului n care au fost selectate, modificate, crescute, multiplicate n etapele precedente)

Curba de cretereFaza staionar maximal- numrul de celule viabile este maxim i rmne constant - faza dureaz de la cteva ore la cteva zile; n aceast etap are loc biosinteza substanelor urmrite ca produi de biosintez- are loc atunci cnd din mediu se epuizeaz substanele nutritive sau se acumuleaz produi toxici- celulele sunt mature i au dimensiuni normale

Curba de cretereFaza de declin- scderea progresiv a numrului de celule viabile, din cauza morii acestora- celulele sunt btrne i cu semne de involuie (sunt deformate, mai mari sau mai mici dect normal, se coloreaz slab), la speciile sporogene apar foarte muli spori- uneori apare fenomenul de autoliz

Curba de cretere la fungi n cazul acestor microorganisme se dezvolt micelii ramificate cu lungimi de pn la 10-15 mFaza de lag: are loc germinarea sporilor (dac se inoculeaz suspensie de spori) sau se regenereaz hifele rupte i lezate (cnd se inoculeaz inocul vegetativ). Faza de lag se poate prelungi mult dac s-a adugat o cantitate prea mic de inocul. Unele bacterii au nevoie de ioni ai metalelor grele n aceast faz (Bacillus Subtilis are nevoie de Mn pentru iniierea dezvoltrii)Faza de cretere liniar: pe suprafaa mediului apare o colonie circular, care crete liniar n timp, sub forma unor reele fine de hife Faza de nvechire viteza de cretere este ncetinit, ca urmare a efectului duntor al produilor de metabolism.

Parametri care evideniaz cretereaDeterminarea masei celulare - izolarea celulelor i cntrirea lor Determinarea numrului de microorganisme sau a concentraiei celulare prin metode instrumentale Metoda turbidimetric multiplicarea microorganismelor determin tulburarea mediului de cultur direct proporional cu populaia lor Analiza prin IR a concentraiei de CO2 care prsete cultura Numrarea celulelor sub microscop Determinarea concentraiei sursei de carbon din mediu

Efectul pH-ului asupra creterii microorganismelorn general, exist un domeniu de pH n care viteza specific de cretere atinge valoarea maxim (drojdii: 4-5, excepional 2-8)pH-ul influeneaz randamentul transformrii substratului la un anumit produs; n general, domeniul de pH n care are loc bioprocesul este foarte ngust. n caz de schimbare n cursul reaciei biologice a pH-ului, n mediul de cultur trebuie adugai corectori de pH (NaOH, KOH sau NH3 pentru cretere, HCl, HNO3, H2SO4 pentru scdere)

Efectul temperaturii asupra creterii microorganismelorTemperatura este un factor care influeneaz cerinele nutritive ale microoganismelor i viteza de cretere microbianAre de asemenea influen asupra randamentului de transformare a substratului n produsul doritCRIOFILEMEZOFILETERMOFILE

Sunt incinte n care se desfoar reacii intermediate de factori biologiciConstrucia bioreactoarelor este puternic dependent de necesitile de detaliu ale agentului biologic, dar i de proprietile fizice n special ale mediului de culturDintre proprietile mediului de cultur se pot enumera: densitatea, viscozitatea, tixotropia (creterea coeficientului viscozitii n condiii de micare intens), tensiunea superficial, cldura specific, valoarea coeficientului de transfer de cldur prin mecanism de convecie etc.BIOREACTOARE

BIOREACTOARECaracteristici ale sistemelor biochimiceDimensiunea, morfologia i evoluia biomasei influeneaz eficiena amestecrii i vitezele de transfer de mas i cldurDensitatea agentului biologic: este redus n cazul imobilizrii enzimelor pe suporturi inerte sau a folosirii asociaiilor microbieneCelulele i enzimele sunt foarte sensibile la factorii de mediu (temperatur, concentraie)Microorganismele sunt sensibile la forele de frecare create prin amestecarea mecanic (se pot distruge n urma deformrilor majore)Procesele decurg n condiii asepticeInfluena fenomenelor de inhibiie de substrat sau de produs

BIOREACTOARE - ClasificareDup natura proceselor biochimice:Biologice (fermentatoare): transformrile substraturilor se realizeaz n prezena microorganismelor, care parcurg etapele specifice dezvoltrii lorBiochimice: n care au loc reacii catalizate de enzime sau celuleDup modul de curgere:Cu amestecare perfectCu deplasare total

IndicatorBioreactoare discontinueBioreactoare continueCosturi investiii reduse ridicate, datorit costurilor cu automatizareaCosturi manoper mari, datorit numrului mare de personal (pot fi reduse prin automatizare) reduse, ca efect al automatizrii avansateFlexibilitate ridicat redus, datorit domeniului restrns de variaie a parametrilorVolum bioreactor relativ mare relativ micPericol de infectare a culturii redus, datorit currii i sterilizrii dup fiecare arj ridicat, deoarece bioreactoarele funcioneaz continuu mai multe luniCalitatea materiei prime utilizate poate fi diferit de la o arj la alta trebuie s fie aceeaiConversiasubstratului ridicat poate fi redusUzura instrumentelor de msur i control ridicat, datorit sterilizrilor repetate redus, sterilizarea realizndu-se doar la pornireApariia inhibitorilor sau a condiiilor nefavorabile de mediu relativ des, datorit gradului redus de automatizare relativ rar, datorit automatizrii avansate

Dup necesarul de oxigen:AerobeAnaerobeDup modul de amestecareMecanic: agitatoare cu diferite configuraiiAmestecare pneumatic - prin barbotarea unui gazAmestecare hidraulic - bazate pe circulaia lichidului de cultur de ctre o pompAmestecare mixt combinaii ale metodelor de mai susBIOREACTOARE

Bioreactoare cu agitare mecanica, b bioreactoare cu agitatoare tip elice i difuzor; c bioreactor tronconicabc