Citologie şi Histologie Practică

Curs 2

Diagnosticul citologic• Simplu, ieftin, repetabil.• Scop principal: leziunea este sau nu malignă.• Studiul citologiei exfoliative : la mijlocul

secolului XIX• În 1843 Walshe face referire la mici fragmente

expectorate cu caracter malign (tumori de tract respirator).

• În 1847 Pouchet face primele referiri asupra citologiei vaginale normale.

• În 1860 Beale face primele referiri asupra celulelor descuamate în context diagnostic (sputa la o tumoră faringiană).

• 1864 Sanders : citologia urinară la pacienţii cu tumori vezicale.

• 1927 Babeş arată pentru prima oară că este o metodă utilă pentru diagnosticul cancerului de col uterin înainte de invazie (articol publicat).

• 1928 Papanicolaou publică un articol pe aceeaşi temă.

• 1940 intră în atenţia lumii medicale ajutat de Charles Cameron (directorul medical şi ştiinţific al Societăţii Americane de Cancer) care popularizează testul PAP.

Aurel Babeş

Raportul citologic - principii• Aceleaşi capitole ca şi raportul

patologic• Fără descriere macroscopică.• Date primite de la ginecolog.• Citologia nu substituie patologia.• Citodiagnosticul se referă la caracterul

malign sau benign al celulelor.• Nu face referiri asupra formei

histopatologice de tumoră.• Nu face referiri legate de stadiu şi G

(heterogenitatea tumorală)• Citodiagnosticul negativ nu infirmă

existenţa tumorii.• Nu aduce informaţii prognostice şi

terapeutice.• Metode speciale de coloraţie ?

Principiile de bază ale interpretării şi raportării citologiilor

• Diagnosticul citologic este considerat atât ştiinţă cât şi artă.

• Este adeseori mai dificil decât diagnosticul histopatologic.

• Diagnosticul citologic are la bază o sinteză a întregului ansamblu şi nu doar modificări ale celulelor individuale.

• Datele clinice sunt indispensabile.• Uniformitatea metodelor tehnice din

fiecare laborator.• Diagnosticul citologic se bazează

adesea pe modificări minore (nucleare şi/sau citoplasmatice).

• Sistemul de raportare (sistemul Bethesda) are valoare din punct de vedere epidemiologic şi în cercetare, dar uneori privează patologul de flexibilitate în diagnostic.

• Este foarte importantă cunoaşterea caracterelor celulare normale

Istoric • Georgios Nicolas Papanicolaou

(1883-1962)• Kymi (Grecia)• 1898 – Universitatea din Atena• 1904-1906 asistent medical în

armată• Începe cariera medicală – bolnavii

de lepră• 1907 – Institut de Zoologie din

Munchen• 1910 – obţine doctoratul• 1912 – locotenent în corpul medical

al armetei• 1914 – N.Y. în departamentul de

Anatomie• 1920 – începe studiul citologiei

vaginale• 1943 – publică monografia • Februarie 1962 – insuficienţă

cardiacă cu EPA.

Citologie? De unde?

• Toate zonele anatomice– Citologia exfoliativă– Citologia abrazivă– Puncţie aspirativă cu ac fin – Citologia sanguină şi a

măduvei hematogene

Citologia exfoliativă• Se bazează pe desprinderea

spontană a celulelor, de la suprafaţa unor organe, la nivelul unor cavităţi.

• Celulele exfoliate sunt recoltate prin metode non-abrazive.

• Nu poate fi stabilită vârsta celulelor exfoliate.

• Diagnostic precoce în tumori cu localizare superficială.

• Exemple:– Citologia vaginală– Citologia sputei– Citologia seroaselor– Citologia urinară

Citologia exfoliativă- citologia vaginală-

• Evaluează celule din zona fundului de sac posterior al vaginului care provin din mai multe surse.

• Adesea conţine pe lângă celule epiteliale descuamate şi alte tipuri celulare: – leucocite şi macrofage (cresc numeric în procesele inflamatorii)– diverse microorganisme

• Citologia sputei - colecţie de material mucoid care conţine celule provenite din:– cavitatea bucală– faringe– laringe– trahee– arborele bronşic– alveolele pulmonare

• Citologia urinară• Citologia seroaselor

Citologia exfoliativă

• Citologia exfoliativă se caracterizează de prezenţa celulelor din diverse surse.

• O caracteristică importantă: slaba păstrare a unor tipuri celulare exfoliate– unele celule se păstrează

relativ bine (ex. celulele scuamoase)

– Altele se alterează uşor (ex. celulele glandulare, leucocitele)

• Necesară fixarea rapidă

Citologia exfoliativă- caracteristici -

• Metoda este utilizată pentru a obţine prin abraziune, un număr sporit de celule direct de pe suprafaţa unui organ.

• Spatula cervicală a fost introdusă de Ayre în 1947.– Permite recoltarea celulelor de la

nivelul epiteliului exocervical şi endocervical

• Alte instrumente pentru citologia exfoliativă

Citologia abrazivă

Citodiagnosticul exfoliativ-citologia cervico-vaginală-

Citologia seroaselor• Colecţionat în container sterile şi

transferat rapid în laborator.• Stocare posibilă la 4 grade Celsius

(maxim 2 zile)• Volum satisfăcător : aproximativ 50 ml• Se adaugă în container peste lichidul

de evaluat o soluţie fixatoare (etanol 50%).

– Regulă: soluţia fixatoare trebuie sa aibă acelaşi volum (sau puţin mai mare) cu lichidul pentru evaluare

• Dacă sunt lichide cu conţinut hemoragic se adaugă în plus şi un anticoagulant (heparină)

• Necesar 2 frotiuri/caz pentru diagnoastic

• Centrifugare uzual la 600 rotaţii timp de 10 minute.

• Lichidele decelabile clinic/imagistic: patologice

Frotiu de sânge periferic Frotiul de sânge periferic (venos

sau capilar) sânge “capilar“ - arteriolar

Strat subţire, uscare rapidă la temperatura camerei

Colorare Metoda de elecţie: May-

Grünwald-Giemsa (MGG) Alternative: Wright, Romanowsky Metode citochimice: peroxidaza,

fosfatazele, PAS Metode imunocitochimice: markeri

leucocitari de membrană Examinare

Obiectiv x40 sau x100 (imersie) Se urmăreşte:

aspectul general al frotiului morfologia eritrocitelor formula leucocitară

Frotiul de sânge periferic (venos sau capilar) sânge “capilar“ - arteriolar

Strat subţire, uscare rapidă la temperatura camerei

Colorare Metoda de elecţie: May-

Grünwald-Giemsa (MGG) Alternative: Wright, Romanowsky Metode citochimice: peroxidaza,

fosfatazele, PAS Metode imunocitochimice: markeri

leucocitari de membrană Examinare

Obiectiv x40 sau x100 (imersie) Se urmăreşte:

aspectul general al frotiului morfologia eritrocitelor formula leucocitară

Recoltare la nou-născutşi copilul mic

Frotiu de sânge periferic

Frotiul de sânge periferic (venos sau capilar) sânge “capilar“ - arteriolar

Strat subţire, uscare rapidă la temperatura camerei

Colorare Metoda de elecţie: May-

Grünwald-Giemsa (MGG) Alternative: Wright, Romanowsky Metode citochimice: peroxidaza,

fosfatazele, PAS Metode imunocitochimice: markeri

leucocitari de membrană Examinare

Obiectiv x40 sau x100 (imersie) Se urmăreşte:

aspectul general al frotiului morfologia eritrocitelor formula leucocitară

Frotiu de sânge periferic

Sânge venos

Sânge capilar

Frotiu din aspiratul medular şi/sau biopsie

• Aspiratul şi biopsia – cresta iliacă postero-superioară (corticală subţire)– sigură– riscul scăzut de durere– accesibilitate bună

• Alternative:– Creasta iliacă antero-

superioară• Doar aspirat:

– Stern : • peste 12 ani, obeze• Între al 2-lea şi al 3-lea spaţiu

intercostal– Tibie:

• la copii sub 1 an (anestezie generală)

• Suprafaţa proximală anteromedială

Frotiu din aspiratul medular şi/sau biopsie

• Aspiratul şi biopsia – cresta iliacă postero-superioară (corticală subţire)– sigură– riscul scăzut de durere– accesibilitate bună

• Alternative:– Creasta iliacă antero-

superioară• Doar aspirat:

– Stern : • peste 12 ani, obeze• Între al 2-lea şi al 3-lea spaţiu

intercostal– Tibie:

• la copii sub 1 an (anestezie generală)

• Suprafaţa proximală anteromedială

Puncţia aspirativă cu ac fin FNA (Fine Niddle Aspiration)

• Diagnosticul tumorilor palpabile• 1853 James Paget – diagnosticul

tumorilor mamare.• Menetrier (1886) şi Kronig (1887)

diagnosticul tumorilor pulmonare.• Câteva centre specializate.• În 1925 Martin şi Coley se implică

în diagnosticul preoperator (peste 1000 cazuri)

– Mamare– Ganglion limfatic– Plămân– Os

• Institutul Karolinska (Suedia) – Nils Soderstrom şi Josef Zajicek

• Tumori mamare, prostatice, tiroidiene, glande salivare, pulmonare

• Prezent: tumori localizate profund• Ghidaj: eco, CT

FNA: avantaje• Nu impune pregătire specială• Fără anestezie specifică• Elimină perioadele de

“aşteptare”• Rapidă, sigură• Nedureroasă• Ieftină• Raportarea FNAB:

– nesatisfăcător– benign– malign– suspicios

FNA: limite• Inabilitate de a diagnostica

tumori “neobişnuite”• Probleme majore în

clasificarea tumorilor• Material insuficient sau fără

elemente diagnostice.• Rezultat negativ: nu exclude

neapărat malignitatea.• Implantarea de celule tumorale

pe traiect de puncţie?

Imunocitochimia • Are un mare potenţial de utilizare.• Cazuri selectate.

– Imunocitochimia este utilă în 70% din cazuri.

• Lichid pleural: pentru diferenţierea celule mezoteliale vs tumori metastatice (utilă în 82% din cazuri).

• Carcinom urotelial vs carcinom prostatic invadant în vezică/uretră.

• În cazul FNA este utilă la 69% din cazuri.

• Fixarea optimală impune:– uscare preparatelor,– apoi plasarea în soluţie de formol

salin 0,1% peste noapte la 27grade C

– plasare în etanol 100% timp de 10 minute

Realizarea preparatelor citologice

• Fixarea este o etapă foarte importantă– Pentru cele mai multe cazuri preparatele bine fixate şi colorate adecvat

sunt mai uşor de interpretat decât cele care sunt uscate la aer.• Trebuiesc preparate frotiuri în strat subţire şi cu material uniform

întins.• Prepararea materialelor citologice prin periere sunt mai dificil de

efectuat.• Exceptând cazurile când este necesară uscarea preparatului la aer

(ex. frotiurile sanguine), restul preparatelor necesită fixare rapidă.• Cel mai utilizat fixator pentru coloraţia Papanicolaou: alcool 95%• Durata optimă a fixării: 15 minute• Există şi fixatori tip spray.• În cazul frotiurilor uscate se poate realiza rehidratarea acestora:

– soluţie apoasă de glicerină – 3 minute– 2 băi de alcool etilic 95%– etapele coloraţiei Papanicolaou

Coloraţiile fundamentalecoloraţia Papanicolaou (1942)

• Fixare în alcool etilic 95% - 15 min• Apă distilată – 1 min• Hematoxilină Harris – 6 min• Apă distilată – 2 minute• Se scufundă de 6 ori în soluţie apoasă

de acid clorhidric 0,25%• Apă curgătoare – 6 minute• Limpezit în apă distilată (câteva

secunde)• Soluţie alcol etilic de 50%, 70%, 80%

şi 95% (câte 1 min)• Colorare cu OG6 – 1,5 min• Alcool 95% (2 băi a 0,5 min)• Colorare cu EA – 1,5 min• Limpezire în alcool 95% (3 băi a câte 1

min)• Deshidratare cu alcool etilic 100% - 1

min• Amestec alcool-xilen (1:1) – 1 min• Xilen – 1 min• Montare balsam de Canada

• Durata totală : – 45 min preparatele nefixate– 30 min preparatele fixate

Coloraţiile fundamentalecoloraţia APT-Drăgan (1968)

1. Colorare cu soluţia AP (albastru policrom) – 15 sec

2. Spălare în două băi de apă distilată sau de robinet – 15 sec

3. Diferenţiere în soluţia T (tanin 1%) – 15 sec

4. Spălare în apă distilată sau de robinet – 15 sec

5. Montare balsam de Canada

Carte : Citodiagnostic cu metoda de colorare rapida APT-Drăgan; Editura de Vest, 2004

• Durata totală : 60 sec

Criterii de malignitate celulară• Se bazează pe:

– modificările structurale ale celulelor– interrelaţiile perturbate dintre celule

• Diagnosticul histopatologic : se bazează în primul rând pe modificările arhitecturale.

• Diagnosticul citologic : se bazează pe modificări ale celulelor individuale.

• Aspectul morfologic al celulelor de pe preparatele citologice diferă semnificativ de cele evaluate pe preparatele histopatologice.

• Din acest motiv sunt necesare criterii de diagnostic citologic• Criterii de malignitate:

– generale• modificări structurale ale celulei şi nucleului• modificări ale interrelaţiei cu alte celule (pentru grupuri de celule)• criterii indirecte

– specifice

Criterii generale de malignitate1- modificări structurale ale nucleului şi citoplasmei

- modificări nucleare -• Creştere disproporţionată a

nucleului cu alterarea raportului N/C

– Normal: celule endocervicale, din pelvisul renal

• Hipercromazia– modificări degenerative– supracolorare

• Pattern cromatinian aberant:– Elongat– Contur neregulat– Identaţii profunde– Lobulaţie

• Creşterea dimensiunii şi a numărului nucleolilor

• Multinucleere• Activitate mitotică cu mitoze

atipice– Normal: eroziuni cervicale,

exudat• Îngroşarea membranei nucleare• Modificări degenerative:

vacuolizări anormale

Criterii generale de malignitate 1- modificări structurale ale nucleului şi citoplasmei

- modificări citoplasmatice -• Accentuarea bazofiliei sau

acidofiliei– acidofilia în special pentru

carcinomul scuamocelular

• Incluziuni citoplasmatice: pigment, leucocite, resturi celulare– Melanina (melanom malign)– Incluziuni leucocitare

(adenocarcinoame)

• Vacuolizări atipice în special în adenocarcinoame– observate şi în celule non-

maligne (normale sau patologice) (ex: celule endometriale)

• Creşterea dimensiunii celulare peste limita normală acceptată– Hipertrofia celulară se poate

întâlnii şi în condiţii normale (ex: celule endocervicale, pelvisul renal, celule prostatice)

• Aspecte aberante ale formei celulare cu elogări şi forme bizare– celula fibră

• Modificări necrotice şi degenerative

Criterii generale de malignitate1- modificări structurale ale celulei şi nucleului

- modificări generale celulare -

• Iregularităţi de pattern – lipsa uniformităţii în ceea ce priveşte orientarea celulei şi a nucleilor

• Anizokarioză şi anizocitoză– Se referă la variaţii ale

dimensiunilor nucleare şi celulare de acelaşi tip dintr-un grup celular

– nu se referă la variaţiile de mărime ale celulelor individuale de pe frotiu

• Lipsa limitei celulare distincte– prezentă şi în celulele normale

(ex: celule endometriale)– fixarea improprie

• Aglomerări de celule şi nuclei– Normal în celulele endometriale

• Canibalismul celular• Formare de pattern-uri particulare

– Rozetă (adenocarcinoame)

Criterii generale de malignitate2- bazate pe interrelaţii celulare

• Prezenţa sângelui cu eritrocite degenerate– Absent în stadiile iniţiale ale

proceselor maligne

• Excesul de limfocite (specimenele de spută şi lavajul bronhoalveolar)– În agregate largi

• Număr crescut de histiocite– Adenocarcinomul

endometrioid– şi în condiţii normale

Criterii generale de malignitate

3- indirecte

Clasificarea frotiurilor(clasificarea Papanicolaou)

• C I : - absenţa celulelor normale şi atipice• C II : - citologie atipică dar fără evidenţa aspectelor de

malignitate• C III : - citologie sugestivă dar nu concluzivă pentru

malignitate• C IV : - citologie puternic sugestivă pentru malignitate• C V : - citologie concluzivă pentru malignitate

Clasificarea frotiurilor cervico-vaginale

(clasificarea Bethesda)• Frotiu normal (corespunde C I)• ASCUS (celule atipice scuamoase fără semnificaţie

cunoscută); AGUS (celule atipice glandulare fără semnificaţie cunoscută) (corespunde C II)

• LGSIL (neoplazia intraepitelială de grad scăzut)(corespunde C III)

• HGSIL (neoplazia intraepitelială de grad crescut) (corespunde C IV)

• Cancer (corespunde C V)

Surse de erori

• Citologia exfoliativă şi prin periaj:– Deteriorarea specimenului datorită întârzierea procesării– Fixare defectuoasă– Uscarea preparatului înainte de fixare

• Deformări şi creşterea dimensiunii celulare şi nucleare

– Colorare improprie• Nucleu hipercromatic

– Contaminarea preparatelor

• FNAB: – Efectuare sub control eco/CT– Aspirare de ţesut normal– Traversarea leziunii