1Universitatea de Medicin i Farmacie din Trgu-Mure

Facultatea de MedicinSpecializarea Nutriie i Dietetic

ELEMENTE DE ANALIZ INSRUMENTALCURSURILE 12-14

Prof. Dr. Silvia IMRE

2V. Metode cromatografice de analiz

Aprofundarea noiunilor de curs: capitolele 2.8 i 2.9. din cartea Analiza medicamentului. Ghid practic, autori Muntean D.L., Imre S., (2007)

3V.1. NOIUNI GENERALE

Definiia cromatografiei Clasificarea metodelor cromatografice Procesul cromatografic Cromatograma i importana ei pentru

cromatografia pe coloan

41. Definiie

Cromatografia - procesul de separare n care componentele amestecului prob sunt distribuite diferit ntre dou faze: faza staionar - un solid, un

material poros, o suprafa activ sub forma unor particule mici sau un suport solid acoperit cu un film de lichid

faza mobil - un gaz, un lichid sau un fluid supercritic

Principiul cromatografiei

52. Clasificarea metodelor cromatografice

n funcie de natura fazei mobile, metodele cromatografice se mpart n trei mari categorii:

Cromatografia lichid

Cromatografia gazoas

Cromatografia cu fluide n faz supercritic

6 n funcie de modul de dispunere a fazei staionare: Cromatografia planar faza staionar dispus planar:

Cromatografia pe Hrtie - acronim CH sau PC (Paper Chromatography) -faza staionar este reprezentat de o hrtie special

Cromatografia n Strat Subire acronim CSS sau TLC (Thin-Layer Chromatography) - faza staionar este depus sub forma unui strat subire pe o plac: La presiune obinuit (trecerea fazei mobile prin faza staionar se face

prin capilaritate) La suprapresiune (faza mobil este trecut prin faza staionar sub

presiune) Cromatografia pe coloan faza staionar introdus ntr-o coloan:

Cromatografia de lichide pe coloan

Cromatografia de Lichide pe Coloan Clasic acronim CCLC (Classic Column Liquid Chromatography) - la presiune obinuit, p 1 bar

Cromatografia de Lichide de nalt Performan acronim HPLC (High-Performance Liquid Chromatography) - la presiune nalt, p 500 bari

! NOU Cromatografia de Lichide la Presiune Extrem acronim X-LC(Extreme Pressure Liquid Chromatography) la presiuni p 1000 bari

Cromatografia de gaze acronim GC

Cromatografia cu fluide n stare supercritic combin principiile de separare din cromatografia de gaze i cromatografia de lichide de nalt performan

7Schema unui cromatograf cu fluide

supercritice:1 Surs de CO2 (fluid supercritic)2 Pomp3 Sistem de injectare prob4 Termostat coloan5 Coloan6 Detector 7 Sistem de achiziie i prelucrare a datelor Cromatograf cu fluide

supercritice

8Cromatograf de lichide la

presiune extrem

(p > 1000 bari)

93. Procesul cromatografic

10

Componenii supui procesului cromatografic trebuie s aib coeficieni de distribuie diferii i factori de capacitate, de asemenea, diferii pentru a putea fi separai. Se presupune c un amestec de trei componeni notai A, B i C se aplic pe o coloan. Componentul B are afinitate pentru faza staionar, iar componenii A i C, pentru faza mobil, dar n fiecare moment exist un permanent transfer al moleculelor din faza staionar n faza mobil i invers. O nou poriune de eluent determin stabilirea unui nou echilibru, n acord cu coeficienii lor de distribuie (unele molecule iniial adsorbite de faza staionar, trec n faza mobil, iar locul lor este luat de alte molecule neadsorbite iniial). Procesul se repet de un numr mare de ori aa nct, n final, cei trei componeni sunt separai. Componenii A i C cu afinitate pentru faza mobil migreaz mult mai repede dect componentul B care tinde s rmn n faza staionar. Compuii ies din coloan sub form de benzi.

11

Lungimea coloanei pe care se stabilete echilibrul de distribuie a unui component ntre cele dou faze = taler(platou) teoretic, cruia i corespunde o anumit nlime H

Afinitatea unui component X din amestecul de separat pentru una dintre faze poate fi exprimat prin coeficientul de distribuie K:

unde cS este concentraia componentului X n faza staionar i cM este concentraia lui X n faza mobil.

M

S

c

cK =

12

12

Lrgirea frontului unei substane n timpul

migrrii de-a lungul fazei staionare: (1)

molecule cu traiectorie liniar strbat mai

rapid patul cromatografic, (2) molecule cu

traiectorie ondulat

13

Faza staionar Particule mici Suprafa poroas subire

Solvenii Vscozitate mic

Debitul fazei mobile Valorile mari nu afecteaz rezoluia dac se lucreaz cu

faze staionare cu particule mici

Condiii care trebuie respectate ntr-o analiz cromatografic

14

3. Cromatograma cromatografia pe coloanRspuns detector = f(timp)

15

Coloan tipic pentru cromatografia de lichide

de nalt performan

16

w

tR

Pic cromatografic ideal

tR - timp de retenie, w limea picului la baz

17

Mrimi de retenie : t0 - timp mort: timpul necesar trecerii fazei mobile prin

coloan; dac u este viteza acesteia, n cm/s, L, lungimea coloanei, n cm, atunci:

tR timp brut de retenie: timpul scurs de la introducerea probei n coloan i momentul atingerii concentraiei maxime n detector; ! Este timpul de retenie folosit uzual n analiza cromatografic.

tR timp de retenie corectat sau timp de retenie net:

w limea picului pe linia de baz w0.5 limea la jumtatea nlimii picului cromatografic

)(

)()/(

st

cmLscmu

0

=

0RR tt't =

18

Factorul de capacitate k (sau k)Este definit ca:

i exprim afinitatea pentru faza staionar.

Factor de separareDoi componeni dintr-un amestec pot fi separai dac au valori k diferite. Aceast diferen se exprim prin retenia relativ , cunoscut i sub numele de factor de separare sau selectivitate:

cu k2 >> k1. Dac =1, nu are loc separarea.

01

02

1

2

'

'

tt

tt

t

t

R

R

R

R

==

0

0R

0

R

t

tt

t

t'k'

==

19

Factorul de separare este o msur a capacitii sistemului cromatografic de a separa doi componeni, mai bine spus o msur a selectivitii. Valoarea ei depinde de alegerea fazei staionare i a fazei mobile i nu depinde de parametrii geometrici ai coloanei. Natura fazelor influeneaz separarea prin intermediul constantei termodinamice K.

RezoluiaRezoluia R reprezint msura capacitii efective de separare a dou picuri vecine. Este definit ca raportul dintre diferena timpilor de retenie tR ale celor dou picuri i media aritmetic a limii celor dou picuri w:

unde w0.5 este limea picului la jumtatea nlimii.

2,5.0w1,5.0w1Rt2Rt176.1

2w1w1Rt2Rt2R

+

=

+

=

20

V.2. CROMATOGRAFIA N STRAT SUBIRE

Principiu Faze staionare, faze mobile, echipament Mrimi caracteristice Mod de lucru Aspecte calitative i cantitative n CSS

21

Bacuri cromatografice

22

Mod de lucru n CSS

1. Introducerea fazei mobile n bacul cromatografic

http://orgchem.colorado.edu/hndbksupport/TLC/TLCprocedure.html

23

2. Pregtirea cromatoplcii prin

marcarea liniei de start

24

2. Marcarea liniei de start

25

3. Aplicarea probei sub forma unui

spot cu ajutorul unui capilar de sticl

sau a unei micropipete, urmat de

uscarea spotului

264. Migrarea

27

28

5. Marcarea liniei frontului

6. Marcarea spoturilor dup

uscare - dac sunt colorate

29

6. Marcarea/revelarea

spoturilor prin pulverizarea

unui reactiv specific sau

imersarea plcii n acesta

30

6. Vizualizarea i marcarea

spoturilor n lumin UV

31

7. Calcularea factorului de retenie Rf

32

8. Detecia prin fotodensitometrie

permite obinerea unei fotodensitograme

33

Fotodensitogram

Rf

Absorban

Link-uri utile pentru capitolul de CSS: http://www.chemie.uni-

regensburg.de/Organische_Chemie/Didaktik/Keusch/D-TLC_food_dyes-e.htm Videoclipul se afla in josul paginii care se deschide. Pentru vizualizare avei nevoie de

conexiune la internet i Real Player instalat pe calculator. In josul paginii avei trimiteri i la alte videoclipuri de CSS.

http://orgchem.colorado.edu/hndbksupport/TLC/TLCprocedure.html

35

Aspecte calitative i cantitative n CSS

Identificarea Identificarea compuilor dintr-o prob se face pe baza

corespondenei Rf a spotului separat din soluia prob cu cel din soluia de referin.

Determinarea cantitativ Metoda direct se msoar absorbana A a

spoturilor soluiilor etalon prin fotodensitometrie, se construiete curba de calibrare A n funcie de concentraia c i concentraia probei se determin prin raportare la curba de calibrare.

Metoda indirect (eluiei) se rzuiesc spoturile aplicate n band corespunztoare soluiilor etalon i prob, se dizolv analitul din pulberea rzuit, soluiile se filtreaz i se analizeaz prin metode spectrale, electrochimice etc. Se construiete curba de calibrare semnal msurat (de exemplu, absorban) n funcie de concentraie.

Determinarea semicantitativ Aria spotului este direct proporional cu log c. Se

procedeaz ca la determinarea cantitativ folosindu-se aria spoturilor msurate manual.

36Test de sarcin

Teste pentru

verificarea glicemiei

Aplicaii

Numeroase, n aproape toate domeniile:

- Analiz de laborator

-Teste rapide de laborator

37

Separarea prin CSS a unor

colorani alimentari

38

V.3. CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE NALT PERFORMAN (HPLC)

CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE NALT PERFORMAN = High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Principiu Faze staionare, faze mobile, echipament Mrimi caracteristice Mod de lucru Aspecte calitative i cantitative

39

Principiu

Faza staionar Solid Introdus ntr-un tub metalic (coloan)

Faza mobil amestec de lichide miscibile Faza mobil este vehiculat sub presiune n coloana

cromatografic HPLC clasic presiunea n coloan 400-450 bari UPLC Upper Pressure Liquid Chromatography presiunea n

coloan pn la 1000 de bari

Compuii separai ies pe rnd din coloana cromatografic i intr ntr-un modul numit detector care, de regul, msoar o proprietate fizico-chimic (absorbana, fluorescena, potenialul electrochimic, conductivitatea etc.)

40

Schema general a unui sistem HPLC

41

Analiza calitativ

A. DIN DATE CROMATOGRAFICE

42

Soluie standard

Soluie prob

Semnal

Timp

Identificare pe baza timpului de retenie

43

Metoda adausului standard

Soluii prob cu adaus standard

Soluia prob iniial

Semnal

Timp

44

B. IDENTIFICARE PRIN METODE SPECTRALE

Cromatograful de lichide poate fi n prezent cuplat cu toate tipurile de spectrometre: UV-VIS, IR cu transformat Fourier, spectrometru de mas, spectrometru de rezonan magnetic nuclear, etc. Prin aceste cuplaje se pot obine spectre caracteristice, pe baza crora se poate face identificarea.

45

Analiza cantitativ

Etapele determinrii cantitative constau n msurarea:

1. Ariei picului: metode electronice

2. Calcularea concentraiei probei: calibrare cu standard extern metoda standardului intern metoda adausului standard

Link-uri utile HPLC: http://www.youtube.com/watch?v=_0A9IiCqDSs

http://www.youtube.com/watch?v=I-CdTU5X4HA&feature=related

http://www.youtube.com/watch?v=BYg2xcESAKs&NR=1