Culturi in Vitro

download Culturi in Vitro

of 32

description

vitro

Transcript of Culturi in Vitro

  • UNIVERSITATEA AL. I. CUZA FACULTATEA DE BIOLOGIE

    PROGRAMUL DE INVMNT LA DISTAN

    CULTURI IN VITRO

    LUCRARI PRACTICE

    Smaranda Vantu

  • 2

    CUPRINS

    INTRODUCERE3 LUCRAREA 1

    IMPLICAII TEORETICE I APLICATIVE ALE CULTURILOR IN VITRO5 LUCRAREA 2

    PRINCIPALELE TIPURI DE CULTURI IN VITRO.10 LUCRAREA 3

    INITIEREA UNEI CULTURI IN VITRO LA DAUCUS CAROTA..12 LUCRAREA 4

    INDUCEREA ORGANOGENEZEI IN CULTURI DE CALUS DE

    PAPAVER SOMNIFERUM.14 LUCRAREA 5

    IZOLAREAI CULTIVAREA PROTOPLASTILOR LA PAPAVER SOMNIFERUM...15 LUCRAREA 6

    DETERMINAREA CALITATIV A ALCALOIZILOR IN SUSPENSII CELULARE DE PAPAVER SOMNIFERUM

    PRIN METODA CROMATOGRAFIEI IN STRAT SUBIRE..18 LUCRAREA 7

    METODE DE OBTINERE A PLANTELOR HAPLOIDE.21 LUCRAREA 8

    CULTURA IN VITRO DE ENDOSPERM SI EMBRIONI 24 LUCRAREA 9

    CULTURA IN VITRO DE MERISTEME26 LUCRAREA 10

    METODE CITOLOGICE SI HISTOLOGICE DE

    ANALIZA A MATERIALULUI VEGETAL CULTIVAT IN VITRO...27 BIBLIOGRAFIE.29

  • 3

    INTRODUCERE

    Legitile n conformitate cu care se deruleaz procesele biologice, cu ntreaga lor amplitudine de variabilitate, au suscitat interesul i au polarizat atenia investigatorilor din toate timpurile.

    Treptat dar temeinic, s-a ajuns la concluzia c viaa nu reprezint doar un specific, un stadiu superior n evoluia materiei universale, ci un fenomen aparte. Altfel spus viaa este i altceva dect materie. In ultimele decenii, prin investigaii, experimente i observaii de mare complexitate s-au putut descifra unele dintre caracteristicile specifice vieii.

    S-a definitivat, astfel, concepia n conformitate cu care, n contextul materiei vii, un rol de prim ordin revine informaiei.

    Concomitent s-a conchis c informaia unui sistem este dependent de gradul de organizare intern a acestuia, de nivelul pe care-l atinge integrarea i interconexarea prilor componente. S-a definitivat, astfel, concepia heterogenitii interne optime, ca precondiie a asigurrii integralitii maxime i a coninutului informaional maxim. Dar, spre a surprinde ct mai multe din intimitile structurale i funcionale ale unui sistem viu, metodologiile i aparatura clasic s-au dovedit insuficiente i, deci, ineficiente. Se impunea, ca o necesitate stringent, disocierea unui sistem viu in parile sale componente, dar cu posibilitatea reasocierii lor, concomitent cu modelarea i simularea structural i funcional a ntregului i a prilor componente.

    Disocierea unui sistem din etapa individual de organizare a materiei vii, de pild, n subsistemele componente - celule n cazul de fa, a permis redarea tuturor gradelor de libertate celulelor i cunoaterea comportamentului lor n noua ipostaz (cci nu se pot compara celulele reprezentnd indivizi unicelulari cu celulele "eliberate" dintr-un individ pluricelular), ct i comportarea individului n procesul pierderii integralitii (dediferenierea tisular, celular) sau n cel al reconstituirii integralitii (rediferenierea urmat de organogenez sau embriogenez).

    Deci, fr a face o demonstraie pro domo i fr a prezenta o list a problematicii aferente, am subliniat cauzele care explic, mcar parial, apariia noului i modernului domeniu de investigaii biologice - CULTURILE IN VITRO.

    Funcie de nivelul asupra cruia se exercit intervenia, biotehnologiile se aplic la nivelul organismelor ntregi, organelor, esuturilor, celulelor sau chiar la nivel molecular.

    Utilitatea culturilor de celule i esuturi se poate remarca prin posibilitile pe care le ofer n studiul i valorificarea abaterilor comportamentale ale celulelor, prin fenomenele cu totul particulare care apar n condiiile cultivrii "in vitro". Biotehnologia - noiune complex, reflectnd un domeniu concret al activitii umane, definete ansamblul tehnologiilor neconvenionale i nepoluante de producere a unor substane utile, prin utilizarea intensiv a potenialului genotipic al organismelor vii, fenotipizat n capaciti fiziologo-biochimice de sintez, biotransformare, degradare, fermentaie etc. In fond, totalitatea activitilor umane din agricultur, industria alimentar, zootehnie, farmacie, cosmetic, presupune aplicaii ale metodelor biotehnologice soldate cu obinerea de alcooli, principii active medicamentoase, substane cu rol alimentar, colorani.

    In acest context, culturilor in vitro le revine un rol de prim ordin i li se intrevd i implicaii teoretice dintre cele mai profunde.

    Rolul i implicaiile practice ale culturilor "in vitro" pot fi redate schematic astfel:

  • 4

    CULTURI IN VITRO LA PLANTELE SUPERIOARE

    MICROPROPAGARE CREARE DE NOI GENOTIPURI MULTIPLICARE

    embrioni mutagenez calus

    organe hibridare somatic celule

    esuturi inginerie genetic protoplati

    celule embrioni somatici

    protoplati

    embrioni somatici

    M R M B U E U I L G L O T E T T I N I R P E P A L R L N I A I S C R C F A E A O R R R E E M

    A C R E E L U L A R

    CLONAREA I GENERAREA DE PLANTE SNTOASE

    PLANTE REGENERATE

    MATERIALE NECONVENIONALE

  • 5

    LUCRAREA 1

    1. IMPLICAII TEORETICE I APLICATIVE ALE CULTURILOR IN VITRO

    nc de la debutul cercetrilor din domeniul culturilor in vitro s-a ntrezrit posibilitatea utilizrii lor pentru multiplicarea unor soiuri sau chiar indivizi, cu caliti productive de excepie.

    Primele ncercri n acest sens, au fost efectuate de Morel n 1963 la specii de Cymbidium (orhidee). In orice caz, necesitile horticulturii au impus folosirea pe scar larg a acestei metode i aici s-au obinut cele mai multe i valoroase rezultate.

    Prin culturile de meristeme radiculare, caulinare sau din muguri axilari, urmat de regenerare s-au obinut plante identice cu planta donatoare - adic multiplicarea masiv a unui anumit individ valoros.

    La inceput s-a recurs la micropropagarea unor clone de orhidee, apoi metoda s-a extins i asupra altor specii ornamentale : Begonia, Chrysanthemum, Gerbera. In prezent exist cca 200 specii la care se poate asigura multiplicarea i propagarea prin metoda culturilor "in vitro". Principala problem care a fost rezolvat prin aceast metod este obinerea ntr-un ritm ct mai rapid, la un pre ct mai sczut a unor copii conforme cu planta donatoare (clonarea), deci meninerea calitilor genotipului supus micromultiplicrii, parametrii imposibil de atins prin metodele tradiionale. La pomii fructiferi introducerea unui nou soi n cultur, prin practicile tradiionale, presupunea o durat de civa ani, n timp ce prin micropropagare se realizeaz o scurtare considerabil a perioadei de formare a unui stoc de plante (Morel, 1962).

    Este cunoscut faptul c, prin metodele clasice de nmulire vegetativ exist neajunsul de a vehicula din planta donatoare de material de inmulire, ctre planta nou format o serie de boli, astfel nct planta nou format este chiar de la inceputul vieii tarat de prezena germenilor fitopatogeni. Tehnica culturilor de meristeme, n scopul devirozrii a fost pus la punct, nc din 1962 de ctre Morel i Martin.

    O alt pist pe care se dezvolt cu succes cercetrile i aplicaiile, este aceea a "haploidiei", adic a culturii de antere, polen, ovule. Pe aceast cale se pot produce plante haploide i, ulterior, prin diploidizarea lor, se obin indivizi perfect homozigoi (linii izogene). Pe aceast direcie, sunt rezultate notabile la cartof, tutun, orez.

    Plantele haploide se obin fie pornindu-se de la cultura de polen, fie de la cea de antere. Evident, c prima pist este mult mai eficient n rata de apariie a haploizilor.

    De asemenea, prin culturile in vitro, se constat o revigorare a cercetrilor ce au ca scop obinerea de mutante cu certe valori practice. In timp s-au obinut i selecionat mutante deosebit de valoroase la cartof (caracterizate prin rezistena la atacul cu Phytophtora infestans), la sfecla de zahr (cu rezistena la atacul unor virusuri), mutante auxotrofe (cele ce nu se pot dezvolta pe medii minimale).

    O direcie relativ recent dar deosebit de promitoare i modern totodat, este aceea a crioconservrii (cunoscut i sub numele de crioprezervare).

    Unele linii celulare sau chiar indivizi, care prezint valoare (fie teoretic, fie aplicativ), nu pot fi pstrate un timp prea lung ca atare i nici nu pot fi stocate n stadiul de smn. Fiind foarte utile pentru bancile de gene i indispensabile pentru iniierea unor investigaii ulterioare, ele sunt conservate ca atare, prin meninerea la temperaturi sczute. La ora actual sunt puse la punct metode pentru crioprezervarea protoplatilor, celulelor sau meristemelor.

    Tentativele de manipulare a materialului genetic avnd ca el final obinerea de noi genotipuri, i-au gsit n metoda culturilor "in vitro" un teren extrem de productiv. Incadrate sub genericul de inginerie genetic, respectivele cercetri vizeaz, n principal, transferarea unor gene de la un individ la altul, cei doi indivizi aparinnd la aceeai specie, la specii diferite din acelai gen sau chiar la genuri diferite.

    Pentru ca scopul sa fie atins se impun doua condiii i anume: - gena ce urmeaz a fi transferat trebuie s poat fi integrat n genotipul gazdei; - gena transferat i integrat n noul genotip trebuie s fie functional, adic s fie apt de a

    asigura transcripia i translaia informaiei pe care o conine.

  • 6

    In contextul acestui proces un rol de prim ordin i revine vectorului. In majoritatea cazurilor, drept vectori genici s-au utilizat plasmidele Ti, din Agrobacterium tumefaciens sau virusul mozaicului tutunului.

    Cu utilitate practic imediat este tentativa de a asigura producerea substanelor biologic active, n special din categoria metaboliilor secundari, prin metoda culturilor "in vitro".

    Se tie c plantele sunt un izvor nesecat de produi alcaloidici, terpenici, glicozidici, vitamine , hormoni, produi cu larg utilizare n farmacie, cosmetic sau pur i simplu n alimentaie. In cazul plantelor intacte, acumularea unor astfel de substane este asigurat de prezena unor esuturi sau organe specializate. De pild, chinina se acumuleaz n scoara plantelor (din specii de Cinchona). In cazul culturii de celule sau esuturi in vitro acest lucru nu mai este posibil. In plus, prin cultura in vitro, cu timpul celulele i pierd capacitatea biosintetic pe care o etalau n cazul individului integral. Pe de alt parte ns, n cazul culturii in vitro se poate exercita o presiune selectiv eficient, succesiunea generaiilor fiind mult mai rapid (comparativ cu succesiunea indivizilor in vivo). Se cunosc deja exemple n care, prin selecie, s-au obinut cantiti suficient de mari de substane utile (comparabile, ca pre de cost, cu cele din vivo).

    In acest sens putem cita producerea de acid rosmarinic i antrachinona (Zenk i colab, 1975-1977). In Japonia se produce ubiquinona, medicament folosit n tratamentul bolilor de inim, prin cultivarea unor linii celulare de Nicotiana tabacum, n bioreactoare de mare capacitate (Ikuta i colab, 1976).

    Un alt aspect, deosebit de promitor, al culturilor "in vitro" l constituie realizarea biotransformrii unor compui cu utilitate practic. Spre exemplu, s-a asigurat obinerea metil-digoxinei din metil-digitoxina, prin hidroxilare, n culturi de Digitalis lanata (Reinhard i Alferman, 1980).

    In sfrit, dar nu n ultimul rnd, culturile in vitro prezint un mare interes i deosebit importan pentru biologia teoretic. De la cercetrile din acest domeniu se ateapt elucidarea unor aspecte privind procesele fiziologo-biochimice la nivel celular, diviziunea celular, diferenierea celular, rolul fitohormonilor, totipotena celular. Prin investigaii asupra protoplatilor se ateapt elucidarea unor probleme viznd formarea pereilor celulari.

    Evident,toate acestea reprezint doar o parte din problematica pe care o incumb abordarea studiilor pe culturi de celule, esuturi sau organe.

    1.1. RECOMANDARI PRIVIND CONDITIILE DE LUCRU, SUBSTANTELE SI

    APARATURA NECESARE PENTRU INITIEREA CULTURILOR IN VITRO

    In vitro, tradus ad literam, nseamna n sticl. Prin urmare, orice cultur artificial de organe, esuturi sau celule, realizat n condiii de asepsie total, pe medii nutritive adecvate, n vase de sticl (cutii Petri, baloane Erlenmeyer), reprezint o cultur "in vitro". Se impune, deci o precizare: cultura de organe, esuturi sau celule nu se poate realiza dect "in vitro" (cu toate condiiile menionate), fapt pentru care expresia cultura de celule in vitro este o sinonimie ce trebuie evitat.

    Asigurarea asepsiei totale se impune ca o condiie sine qua non deoarece att explantele, ct i mediul nutritiv, sunt surse i condiii propice dezvoltrii bacteriilor, virusurilor, ciupercilor.

    Prin urmare att sursa de material vegetal, din care se vor preleva eantioane, pentru experimente, ct i recipientele de sticl cu mediul nutritiv, trebuiesc supuse unei pregtiri speciale i anume sterilizarea. Deci, fr a pretinde o succesiune strict a operaiunilor (fiecare persoan poate lucra ntr-o concepie proprie) se impun urmtoarele operaiuni:

    a. Pregtirea sticlriei i a instrumentarului Intr-un laborator de culturi de celule i esuturi se pot utiliza toate tipurile de recipiente din sticl.

    Vasele cu capacitate de 1-2 l sunt necesare in prepararea mediilor de cultur. Flacoanele Erlenmeyer de diferite capaciti (50, 100, 150, 200, 500 ml) servesc ca recipiente de cultur. Acestea vor fi bine splate i uscate n etuv. Flacoanele astfel pregtite vor fi obturate cu dopuri de vat, nfurate cu tifon.

  • 7

    In tehnicile de culturi in vitro se lucreaz cu instrumentar de tip chirurgical : pense, bisturie, spatule. Ele sunt sterilizate prin autoclavare nainte de folosire.

    b. Prepararea mediului de cultur i sterilizarea prin autoclavare. Pentru mai mult siguran i mai puine operaiuni, recomandm repartizarea mediului n

    vasele de cultur imediat dup preparare i sterilizarea (autoclavarea) n respectivele vase. Ali autori recomand sterilizarea mediului ca atare, concomitent sau succesiv cu a vaselor, n care va fi repartizat ulterior, n boxa cu flux laminar. Alteori, se recomand sterilizarea mediului, repartizarea n vasele de cultur, si, apoi, resterilizarea. Nu suntem adepii acestui mod de lucru, deoarece prin sterilizri repetate se provoac alterri calitative ale vitaminelor, fitohormonilor i chiar ale glucidelor folosite n compoziia mediului.

    c. Prelevarea i sterilizarea explantelor Sterilizarea explantelor se efectueaz, de obicei cu ageni chimici de tipul hipoloritului de sodiu

    sau calciu (soluie 3%-4%. Durata tratamentului variaz n funcie de specia luat n studiu sau de originea explantului (epiderma, mezofil, esut palisadic). Cnd este posibil se recomand obinerea de plante sterilizate, prin germinarea de semine sterilizate n hipoclorit de sodiu de concentraie 4% timp de 10-12 minute,pe hrtie de filtru, de asemenea sterilizat, plasat n flacoane Erlenmeyer sau cutii Petri.

    Plantulele astfel obinute pot fi plasate ca atare pe mediul de cultur, sau de la caz la caz,pot fi separate n hipocotil i cotiledoane, pot servi pentru obinerea oricrui tip de explant. Se impune nca o meniune. Uneori este imposibil obinerea unui explant steril, pe ambele ci menionate, infecia fungic, bacterian sau viral fiind adnc penetrat n organismul vegetal sau n ntreaga samn. Evident, n respectivele situaii sterilizarea ca proces nu mai are nici un efect. Totui, pentru obinerea de calus liber de infecii exist i n aceste cazuri o cale i anume - utilizarea explantelor din vrful meristematic de cretere al tulpinii. In funcie de tipul de dezinfectant folosit, tipul de tratament, originea explantului i mediul de cultur utilizat,se poate vorbi despre o rat de calusare i o rat de supravieuire a calusului.

    Modaliti de asigurare a asepsiei explantelor

    Nr.

    crt. Tipul explantului Pretratament Sterilizare Postratament

    1. Semine Etanol(96%)

    10sec

    Ca(OCl)10%

    10-20 min

    splare de 3ori cu ap

    distilat steril

    2. Fructe Etanol(96%)

    10sec. NaOCl 3%

    splare cu ap distilat

    steril

    3. Tulpin Etanol(96%)

    10 sec.

    NaOCl 3%

    5-30 min.

    splare cu ap distilat

    steril

    4. Organe de

    depozitare

    splare cu ap de

    robinet

    NaOCl 3%

    10-30 min.

    splare cu ap distilat

    steril

    5. Frunze Etanol(96%) HgCl2 O,1%

    1 min.

    splare de mai multe ori cu

    ap distilat

    Sterilizarea propriu-zis, att a instrumentarului i recipientelor, ct i a mediului, se efectueaz la autoclav, la o temperatur de 1200C i o presiune de o atmosfer, timp de 20-25 min. Se poate efectua i o tindalizare, adic o sterilizare discontinu (fracionat), mai ales pentru mediile agarizate.

  • 8

    In acest caz mediile sunt "topite" de 3 ori consecutiv, la temperatura de 100o C, pe baie de ap. Dup fiecare etap de fierbere, mediile ramn 24 de ore la temperatura camerei pentru a permite germinarea sporilor eventualelor microorganisme care au supravieuit sau au suprainfectat mediul.

    Sunt i procedee prin care sterilizarea se obine prin filtrare.In aceste cazuri, substanele termolabile (n special fitohormonii), sunt sterilizate prin filtre bacteriene.

    Este indicat ca sticlria n care va fi plasat mediul de cultur, pipetele pensetele, ansele, spatulele s fie presterilizate, fie prin autoclavare la 120-130o C, timp de 20-30 minute, fie prin meninerea n etuv, la 1800C timp de o or. Toate se pot pstra n casolete sau tuburi metalice.

    d. Plasarea explantelor sterilizate pe mediul de cultur, n boxa cu aer steril n flux laminar. Lucrul propriu-zis (transferul explantelor, subcultivarea calusului, extragerea de probe pentru

    analiza se efectueaz n boxa steril (boxa n care se asigur aflux de aer, sub presiune, trecut n prealabil prin filtre microbiene). Este ceea ce, n terminologia uzual se cunoaste sub numele de box cu aer n flux laminar.

    Este indicat s se iradieze boxa (din timp n timp i mai ales nainte de a se lucra) cu o lamp UV timp de 20-30 min.

    Un alt aparat, utilizat n cazul culturilor pe mediu lichid, este agitatorul rotativ sau liniar, care se caracterizeaz prin micri oscilatorii (n plan orizontal sau n plan elipsoidal) cu frecvena de 115-120 rot./ min.

    1.2. PREPARAREA MEDIILOR DE CULTURA

    Reactivii utilizai:

    1.apa se recomand s fie dublu distilat; 2.srurile minerale trebuie s fie cu un inalt grad de puritate. Uneori este indicat recristalizarea

    hormonilor de cretere. Spre exemplu, acizii naftalenacetic i 2,4-D, sunt purificai i decolorai cu charcoal, apoi sunt recristalizai din soluie de etanol.

    3.Hidrolizatul de cazein este un supliment organic utilizat, n concentraie de 0,05-0,2 % 4.Aminoacizii nu sunt necesari n mod obligatoriu. 5.Restul ingredientelor, din mediul de cultur(macronutrieni, micronutrieni, vitamine), se

    utilizeaz dup cum urmeaz: Pentru mediul B5 (mediul de baz, stabilit de Gamborg n 1968) se prepar soluii stoc, de

    micronutrieni, n urmtoarele cantiti: Micronutrieni mg/100 ml H2O MnSO4 H2O 1000 H2BO3 300 ZnSO4 7H2O 200 Na2MoO4 25 CuSO4 5H2O 2,5 CoCl2 6H2O 2,5

    Toate cantitile precizate, cntrite la balana analitic, se dizolv, n ordine, n 100 ml ap distilat. Soluia stoc astfel preparat se pstreaz n flacon de culoare nchis, bine nchis, la frigider.

    Vitaminele, se pregtesc asemenea micronutrienilor, n urmatoarele cantiti: Vitamina mg/100 ml ap distilat Acid nicotinic 100 Thiamina HCl 1000 Piridoxina HCl 100 Totul se pstreaz la frigider. Clorura de calciu (CaCl22H2O) se prepar separat, n cantitate de 15 g/100 ml ap distilat. Iodura de potasiu (KI), n cantitate de 75 mg/100 ml ap distilat se prepar, de asemenea

    separat.

  • 9

    Soluia stoc de 2,4D se prepar astfel: Se dizolv 50 mg 2,4 D n 2-5 ml etanol, nclzindu-se uor i dilundu-se cu apa distilat, pn ce se atinge volumul de 100 ml. Se stocheaz la frigider.

    Prepararea mediului Gamborg : In 500 ml ap distilat, se dizolv n ordine: NaH2PO4 H2O 150 mg KNO3 2500 (NH4)2SO4 134 MgSO4 7H2O 250 Sucroza 20-25 g - cte 1 ml din soluiile stoc de clorur de calciu, iodur de potasiu, micronutrieni, vitamine i 2 ml din soluia stoc de 2,4 D i 5 ml din soluia stoc de FeEDTA. Se completeaz cu apa distilat, n balon cotat, pn la 1000 ml. Se regleaz pH-ul la valoarea

    de 5,5 (cu soluii de KOH 0,2 N sau HCl 0,2 N). Se adaug 6-8 g agar i se autoclaveaz, conform precizrilor anteriare. Fr ndoial, att mediul Gamborg, ct i cele de alt formul (MS, White, Erikson) poate fi modificat, n funcie de scopul cercetrii, prin variaii ale concentraiei fitohormonilor (2,4 D, IAA, NAA, BAP).

    Pentru prepararea mediului MS se procedeaz astfel: Micronutrieni mg/100 ml H2BO3 620 MnSO4 4H2O 2230 ZnSO4 4H2O 860 Na2 MoO4 2 H2O 25 CuSO4 5 H2O 2,5 CoCL2 6 H2O 2.5 Toate celelalte soluii stoc se prepar dup formula folosit n cazul mediului B5 Macroelementele se adaug astfel: NH4NO3 1200 mg/l KNO3 1900 mg/l MgSO4 7H2O 370 mg/l KH2PO4 170 mg/l FeEDTA 40 mg/l Sucroza 30 g/l Din soluiile stoc de clorur de calciu, iodur de potasiu, vitamine, micronutrieni se ia cte 1 ml

    iar din soluia stoc de 2,4 D 2 ml. Se execut aceleai operaiuni, n aceeai succesiune, ca pentru pregtirea mediului Gamborg. Se ajusteaz pH-ul la 5,8.

    Pentru pregtirea mediului Erikson, urmndu-se aceleai reguli de preparare, se vor lua urmtoarele cantiti de substane:

    NH4NO3 1200 mg/l KNO3 1900 mg/l MgSO4 7H2O 370 mg/l KH2PO4 340 mg/l FeEDTA 40 mg/l Sucroza 30 g/l Din soluiile stoc de micronutrieni, vitamine, iodur de potasiu se adaug cte un mililitru, iar

    din soluia stoc de clorur de calciu 2 ml. Din soluia de 2,4 D se adaug l ml. Se ajusteaz pH-ul la 5,8.

    PREGATIREA MATERIALULUI VEGETAL Germinarea seminelor n condiii aseptice

    Se recomand mai multe metode pentru germinarea seminelor n condiii de asepsie, pentru a

    obine plantute sterilizate. Ne vom rezuma la una dintre acestea: se introduc seminele n alcool etilic 70%, pe un agitator (shaker, menionat anterior), timp de 2 min. Se ndeprteaz alcoolul i se introduce hipoclorit de sodiu, 2-3%. Se menine flaconul pe agitator, timp de 10-20 minute. Se

  • 10

    ndeparteaza seminele care plutesc (deoarece, cu siguran sunt goale i, deci, nu vor germina). In cazul n care se presupune c seminele sunt puternic infectate se poate repeta tratamentul cu hipoclorit. Dup aceste operaiuni este indicat splarea seminelor cu ap distilat steril. Ulterior acestei operaii, seminele se disperseaz pe hrtie de filtru, mbibat cu ap distilat, ntr-o cutie Petri sau un flacon Erlenmeyer, totul autoclavat n prealabil. Este bine ca vasul Petri s fie ermetic nchis cu pelicula de parafilm. In unele lucrri de specialitate se precizeaz c germinarea seminelor poate fi asigurat pe vat, n eprubete, nchise cu parafilm. Cele mai multe semine germineaz bine n condiii de ntuneric, la temperatura de 23-25o C. Este avantajos s se utilizeze mai puine semine per flacon, deoarece dac o singur smn este infectat, se va transmite infecia tuturor celorlalte din vasul respectiv. Cnd seminele au germinat, plantutele rezultate pot fi utilizate ca atare, sau se pot fragmenta, utiliznd hipocotilul, cotiledoanele. Alteori, pentru inducerea calusului se pot utiliza explante, din plante crescute n condiii naturale: poriuni din rdcin, tulpin, ramuri, muguri, frunze, flori. Explantele se vor trata cu alcool etilic 7O%, timp de 1-3 minute, apoi se vor spla de 2-3 ori cu ap distilat steril. Dac este vorba de rdcini, tuberculi, bulbi, dup imersare n alcool etilic, se recomand tratarea cu hipoclorit de sodiu, timp de 15-20 minute. Din experienta proprie recomandm tratarea, att n cazul seminelor ct i n cazul explantelor, doar cu hipoclorit de sodiu 3% timp de 15-25 minute (in funcie de mrimea seminelor sau a explantelor).

    LUCRAREA 2

    PRINCIPALELE TIPURI DE CULTURI IN VITRO Cultivarea esuturilor i celulelor vegetale are la baz metode similare celor din microbiologie.

    Primele culturi "in vitro" au fost cele n regim staionar sau, altfel spus, culturile statice, care sunt caracterizate prin utilizarea substratului nutritiv solid, obinut pe seama unor ageni de gelificare ca : agarul, gelatina sau silicagelul. Aceast modalitate de cultivare, de la nceputurile dezvoltrii tehnicilor "in vitro" i pn astzi, ramne de baz, n investigaiile experimentale, cu toate c determin un caracter limitat al reaciei explantului la factorii inductivi ai mediului. In esen este vorba despre contactul redus al calusului sau al explantului cu substratul nutritiv, avnd ca rezultat accesul difereniat al celulelor la substanele mediului de cultur.

    Alternativa pentru acest neajuns este cultivarea esuturilor i celulelor vegetale pe medii lichide, n regim de agitare continu, sistem care asigur utilizarea mai eficient a nutrienilor din mediu, schimburi gazoase mai echilibrate.

    Suspensiile celulare sunt iniiate prin utilizarea fragmentelor de calus friabil i cultivarea lor pe medii lichide.

    Culturile celulare n suspensie sau suspensiile celulare reprezint ansamblul celulelor i agregatelor celulare, care cresc ntr-un mediu nutritiv lichid, n condiii de agitare continu. In timpul incubrii, cantitatea materialului celular crete i ajunge la un punct de maxim acumulare, moment n care este necesar subcultivarea sa. Astfel de culturi pot fi propagate timp nelimitat, prin subcultivri periodice (7 zile). Exprimarea numrului de celule dintr-o suspensie celular funcie de durata incubrii poate fi reprezentat grafic prin modelul creterii exponeniale (Wilson i Street, 1971), care cuprinde o faz lag, urmat de faza de cretere exponenial, faza creterii liniare, faza accelerrii negative a creterii i faza staionar. Tehnica general de pstrare i perpetuare a suspensiei celulare este subcultivarea n faza staionar. Perioada cuprins de la iniierea culturii pan la atingerea fazei staionare, poate fi caracterizat prin : densitatea celular iniial, durata fazei lag i rata de cretere celular. Densitatea iniial a inoculului trebuie s fie cuprins ntre 0,5-2,5 x 105 celule/ ml mediu , valoare care crete n timpul incubrii culturilor ajungand la 1-4 x 106 celule/ ml mediu.

    Principalii indicatori ai creterii unei suspensii celulare sunt estimai prin: numrarea celulelor, determinarea volumului celular total (packed cell volume), greutatea substanei proaspete (cell fresh weight), greutatea subsanei uscate (cell dry weight) i coninutul de proteine.

    Numrul celulelor

    Operaia preliminar numrrii celulelor este separarea lor din agragatele celulare. In acest scop sunt tratate cu acid cromic 5-15% (Street, 1960) sau supuse unui tratament cu pectinaz.

  • 11

    Operaia propriu-zis de numrare se realizeaz cu ajutorul unei camere de numrat celule de tip Fuchs-Rosenthal.

    Volumul celular total

    Este determinat prin transferarea unui volum de suspensie celular ntr-un tub conic gradat, de centrifug, de 15 ml i centrifugarea la o turaie de 2000 rot/min., timp de 5 minute. Se exprim n ml sediment celular/ ml mediu.

    Greutatea substanei proaspete

    Suspensiile celulare sunt filtrate prin sita de nylon, apoi celulele sunt splate i uscate la pompa de vid, dup care urmeaz cntrirea.

    Greutatea substanei uscate Suspensiile celulare sunt filtrate prin sita de nylon, apoi sunt meninute la 60oC, timp de 12 ore.

    Rcirea se execut ntr-un desicator, care conine silicagel, dup care materialul vegetal este cntrit. Att greutatea substanei proaspete. ct i a celei uscate, sunt exprimate n raport cu unitatea de volum i la 106 celule.

    Indicele mitotic

    Durata ciclului mitotic poate fi evaluat prin numrarea celulelor. Intervalul de timp, n care o populaie celular i dubleaz numrul de celule, este considerat durata unei generaii. Sincronizarea parial sau complet a diviziunilor celulare, n culturi de celule vegetale este necesar n scopul studierii metabolismului celular, pentru determinarea lungimii ciclului mitotic total.

    Eriksson(1966) a elaborat o metod bazat pe tratamentul suspensiilor celulare cu 5 aminouracil sau hidroxiuree, ca ageni sincronizatori ai culturii. Tratamentul cu aceste substane inhibitoare ale sintezei ADN ului, se aplic n culturi n vrst de o zi, obinute din linii celulare subcultivate regulat i dureaz 12-14 ore, funcie de agentul sincronizator folosit.

    Dup tratament, celulele sunt splate de dou ori n mediul nutritiv proaspt i transferate n flacoane cu mediu proaspt. Se iau probe pentru fixare, n diferite intervale de timp de la aplicarea tratamentului. Se folosete fixatorul Carnoy. Apoi se ndeprteaz fixatorul prin centrifugare. Urmeaz hidroliza cu HCl 1N, la 60oC,timp de 5 minute. Celulele sunt centrifugate pentru ndeprtarea HCl i sunt colorate cu orcein lactopropionic (1g orcein n 100 ml dintr-un amestec n pri egale de acid propionic/acid lactic.

    Pentru determinarea indicelui mitotic se numr minimum 1000 de celule pentru fiecare prob.

    100 x analizate celule de total Nr.

    mitotice celulelor Nr. = IM

    Agentul sincronizator este eficace cnd produce un indice mitotic cel puin dublu fa de cel constatat la martor.

    Tehnica culturii celulelor n suspensie presupune mai multe sisteme de culturi: sistemul de agregate celulare pe agitator rotativ, sistemul nchis de cultur continu, sistemul deschis de cultur continu.

    1. Sistemul de agragate celulare pe agitator rotativ se realizeaz prin transferul calusului ntr-un mediu lichid, agitat continuu. In cazul acestui tip de cultur, cu volum fix al mediului nutritiv, biomasa crete prin diviziune celular, astfel nct unele substane nutritive, ct i cantitatea de oxigen pot deveni factori limitativi ai culturii. De aceea se impune subcultivarea periodic a suspensiilor celulare, la interval de 7 zile.

  • 12

    2. Sistemul nchis de cultur continu este sistemul n care componenii nutritivi necesari sunt suplimentai printr-un flux continuu de mediu proaspt. Acest tip de sistem se utilizeaz att pentru obinerea metaboliilor primari ct i a celor secundari.

    3. Sistemul deschis de cultur continu implic echilibrarea mediului nou introdus cu recoltarea unui volum egal de cultur. In categoria sistemelor deschise intr chemostatele, n care mediul nutritiv este introdus n doze calculate i turbidistatele, in care densitatea celular este meninut n anumite limite.

    Tehnici ale clonrii celulare

    Culturile celulare n suspensie se caracterizeaz, de obicei, printr-o mare heterogenitate att sub aspect morfologic, ct i biochimic. Diversitatea genetic, reflectat n numrul i morfologia cromosomilor este un fenomen frecvent semnalat la nivelul culturilor celulare n suspensie. n scopul obinerii unor populaii celulare omogene, care s prezinte stabilitate genetic, au fost elaborate diferite tehnici prin care se cultiv celule izolate, a cror evoluie ulterioar poate fi mai bine controlat i dirijat.

    1. Metoda suportului nutritiv (Hildebrandt ,1977) const n plasarea celulelor izolate pe o hrtie de filtru, plasat la rndul ei deasupra unei mase de calus, care acioneaz ca o surs de hran. Celula plasat pe hrtia de filtru se poate divide formnd, dup cteva sptmni, o mic colonie.

    2. Metoda culturii n pictur (Hildebrandt,1977) const n cultivarea unei celule ntr-o pictur de mediu lichid,nconjurat de ulei mineral, pe o lam microscopic. Se pune cte o pictur de ulei de parafin pe fiecare latur a picturii de mediu, iar peste cele dou picturi de parafin se aeaz cte o lamel steril. A treia lamel este plasat peste mediul de cultur care conine celula i face legtura ntre cele dou lamele laterale. Celula crete i se divide n aceast pictur de mediu, fr ca acesta s fie schombat. Parafina permite schimbul de oxigen i mpiedec pierderea apei din mediu.

    3. Metoda "plating-ului" a fost elaborat de Bergmann, n 1960 i const n amestecarea unui mililitru dintr-o suspensie celular cu 9 ml mediu nutritiv, ce conine 0,5 % agar, la temperatura de 40oC. Dup amestec, cei 10 ml sunt trecui n vase Petri . Dup solidificarea mediului, evoluia fiecrei celule din suspensia celular poate fi urmrit prin examinarea microscopic. De regul coloniile celulare ncep s se formeze dup aproximativ 1-2 sptmani de cultur. Plcile Petri sunt incubate la 25oC i ntuneric. Declanarea diviziunii celulare depinde n mare msur de densitatea celulelor etalate n vasele Petri. Densitatea minim este de 1 x 103 celule/ ml.

    LUCRAREA 3

    3. INITIEREA UNEI CULTURI IN VITRO LA DAUCUS CAROTA

    Explante de 0,5-3 cm, prelevate din rdcina de morcov i sterilizate prin tratament chimic, se plaseaz pe mediul B5, care conine 0,1 mg/l 2,4D. Pentru iniierea culturii se utilizeaz mediul agarizat. Flacoanele cu mediu i explante sunt pstrate la ntuneric, n camera de cretere a culturi lor, la o temperatur constant de 23-25o C.

    Dup aproximativ 20-25 zile, biomasa acumulat, constnd din calus, este de 4-5 ori mai mare dect cea de la care s-a pornit (dect mrimea explantului).

    Pentru a obine o cultur celular n suspensie, calusul din 2-3 flacoane se transfer n 100 ml mediu lichid (cu aceeai compoziie ca cel pe care a fost cultivat explantul), ntr-un flacon de 500 ml. Flaconul se plaseaz pe un agitator, cu 150 rot/min, la 25o C i lumin continu. Dup 5-7 zile, se nlocuieste mediul uzat cu mediu proaspt, permind o subcultur continu. O bun cultur celular (o suspensie celular care s aib nivelul calitativ dorit, se obine dup 4-6 sptmni. In primele faze de

  • 13

    dezvoltare, adic n primele 1-2 sptmni, este posibil nlocuirea a 1/2 sau chiar a numai 1/4 din mediul de cultur uzat cu unul proaspt.

    In principiu, metodologia utilizat pentru morcov poate fi adaptat, cu unele modificri i la alte specii.

    In cazul n care dorim s obinem culturi celulare de mazre, putem utiliza explante din rdcini sau lstari. De aceast dat este indicat suplimentarea mediului de cultur (formula de baz B5) cu 2 g hidrolizat de cazein i 1 mg/l 2,4 D. Cu toate acestea calusarea este nceat i pot fi necesare i dou luni pentru a iniia o cultur (suspensie celular). Pentru gru, secar i porumb, calusul se obine la ntuneric, din explante de rdcin, pe mediu de formula B5 suplimentat cu 1 mg/l 2,4 D.

    3.1. EMBRIOGENEZA SOMATICA IN SUSPENSII CELULARE DE DAUCUS CAROTA

    Iniierea suspensiei celulare din calus de DAUCUS CAROTA Materiale si reactivi

    - rdcini de morcov; - soluie de NaOCl 3%; - ap distilat steril; - mediul B5 (agarizat i lichid); - bisturiu , spatul, sit metalic;

    Materialul vegetal Rdcina tuberizat de Daucus carota, reprezint materialul ideal pentru iniierea calusului i,

    apoi a suspensiilor celulare. Este indicat s se preleve explante din zona cambial a rdcinii. Acestea se vor plasa pe mediul nutritiv n care este prezent o auxin, de obicei 2,4 D. In timp foarte scurt, pe suprafaa explantului, apar zone cu intens diviziune mitotic. Ulterior ntregul explant se transform ntr-o mas omogen de calus. Acesta constituie punctul de plecare pentru iniierea suspensiei celulare. Calusul se repartizeaz conform indicaiilor date n paginile anterioare, n flacoanele cu mediu lichid.

    Dup aproximativ o sptmn de incubare n mediu lichid, n condiii de agitare, materialul vegetal este transferat pe mediu proaspat cu ajutorul unei site metalice. Este indicat, ca la fiecare subcultivare (transfer pe mediu proaspt), s se procedeze la o examinare microscopic, pentru stabilirea gradului de viabilitate i sterilitate a materialului vegetal.

    Inducerea embriogenezei somatice

    Neoformarea embrionilor este posibil printr-o frecvent repicare a esuturilor cu cretere activ, pe medii cu auxin, apoi transferul inoculilor pe mediu fr auxin. Metoda este utilizat frecvent, att pentru obinerea de embrioni somatici, ct i pentru inducerea organogenezei. Un aspect deosebit de important, n acest context, l constituie creterea procentului de embrioni.

    S-a constatat, de pild, c o plasmolizare puternic, dar de scurt durat a celulelor n suspensie (45 de minute, ntr-o soluie 1 % zaharoza), a indus o cretere de peste 3 ori a frecvenei embrionilor somatici, n mediul lipsit de auxin. Se apreciaz c plasmoliza determin ntreruperea comunicrilor intercelulare la nivelul agragatelor. In acest mod, plasmodesmele intercelulare se ntrerup i celulele devin izolate, situaie care favorizeaz declanarea dezvoltrii independente, adic generarea de embrioni somatici.

    In cazul concret, al speciei Daucus carota, potenialul embriogen optim este atins dup aproximativ 15 sptmni de la iniierea culturii. Potenialul embriogen descrete, n condiiile prelungirii duratei de cultivare. Sunt 3 ipoteze care explic pierderea acestui potenial i anume:

    - cauze de ordin citogenetic - poliploidia, aneuploidie; - cauze fiziologice - alterri ale echilibrului hormonal, sensibilizri celulare la aciunea unor

    factori exogeni (habituaie). Este situaia n care se poate produce o blocare a diferenierii, fr a se pierde potenialitatea;

  • 14

    - cauze combinate, decurgnd din sensibilizarea culturii n prezena auxinei, ct i din creterea ratei diviziunii celulelor neembriogene concomitent cu prelungirea duratei de cultur. In mod practic se produce o "competiie" ntre celulele neembriogene i cele embriogene, care devin din ce in ce mai rare.

    In ceea ce privete embriogeneza somatic la Daucus carota, s-au evideniat 4 etape ale diferenierii i anume:

    - faza de cretere izodiametric, caracterizat printr-o diviziune neorientat a celulelor (cnd se ajunge la stadiul globular);

    - imprimarea treptat a caracterului de polaritate, faza de distribuire polarizat a esterazelor (reacie pus n eviden prin metode histochimice);

    - polaritate progresiv, caracterizat prin diviziuni celulare orientate, cnd se formeaz cotiledoanele i apexul rdcinii, apoi se demarcheaz meristemul apical al tulpinii (stadiul cordiform i torpedo);

    - creterea bipolar, n care meristemele apicale (radicular i caulinar) se constituie i sunt apte de a intra n diviziune.

    Studiile histo-anatomice au reliefat faptul c att n calus ct i n suspensii celulare se pot distinge dou categorii de celule:

    - celule mari, cu vacuol mare, lipsite de potenial embriogenic; - celule mici, cu citoplasm dens, aglomerate ntr-un fel de noduli (noduli embriogeni) care, la

    rndul lor, conin dou categorii de celule: a. celule centrale,cu o singur vacuol mare i nuclei mici, compaci, numr redus de

    amiloplaste i activitate dehidrogenazic sczut; b. celule meristematice,grupate la periferia nodulilor embriogeni, cu vacuole puine, cu

    nuclei mari, citoplasma dens i ribozomi numeroi, intens activitate dehidrogenazic, coninut bogat de ARN i proteine.

    Pe msur ce calusul se acumuleaz se poate observa dezorganizarea nodulilor embriogenici. Celulele meristematice disociate sunt reagregate n grupuri, ce pot genera noi centri embriogenici, deci noi noduli. Dac grupurile de celule meristematice, aprute n subcultur, vor fi separate i transferate pe medii de cultur fr auxin, n zonele lor periferice se vor forma muli embrioni.

    LUCRAREA 4

    INDUCEREA ORGANOGENEZEI IN CULTURI DE CALUS DE PAPAVER SOMNIFERUM

    n inducerea procesului de regenerare prin organogenez, un factor esenial l constituie tipul i

    concentraia regulatorilor de cretere (fitohormonii) din compoziia substratului nutritiv. Schematic, etapele procesului de dedifereniere i redifereniere celular pot fi reprezentate

    astfel: Explant dedifereniere. Calus redifereniere

    rizogenez caulogenez Rdcini Lstari Caulogenez rizogenez Plante regenerate Plante regenerate

    n experimentul de fat, urmrim efectul a doua variante de mediu, respectiv mediul B5 cu 0,5

    mg/l NAA i acelai mediu B5 cu 0,1 mg/l AIA i 1 mg/l BAP,2 mg/l kinetina asupra procesului regenerrii, n culturi de calus de Papaver somniferum (calus primar, adic provenit din dediferenierea plantulelor de 5-7 zile de Papaver somniferum, n decurs de 3-6 sptmni.

    Material vegetal

  • 15

    Calus de Papaver somniferum obinut n decurs de 3-6 sptmni de la iniierea culturii (plasarea plantulelor de 5-7 zile pe mediu de calusare).

    Mod de lucru Calusul obinut ntr-un interval de 3-6 sptmni, poate fi meninut pe perioade nelimitate,cu

    condiia s fie transferat periodic pe medii proaspete. Subcultivarea se face pe mediul de intreinere a calusului, care de regul are aceeai compoziie cu cel de iniiere a culturii (n cazul nostru am folosit mediul Gamborg cu 2,4 D). Inducerea morfogenezei poate fi obinut folosind tot mediul de baz Gamborg, dar variind cele dou tipuri de fitohormoni sub aspectul concentraiei. Auxinele sunt implicate n rizogenez, iar citochininele n caulogenez.

    Mediul de calusare - B5 cu 1 mg/l 2,4 D

    Mediul de intreinere -idem Mediul de regenerare - rizogenez - B5 cu 0,5 mg/l NAA

    - caulogenez - B5 cu 0.1 mg/l IAA,1 mg/l BAP, 2 mg/l kinetina

    LUCRAREA 5

    5. IZOLAREA I CULTIVAREA PROTOPLASTILOR LA PAPAVER SOMNIFERUM

    Manipularea genetic a plantelor a devenit posibil graie perfecionrii unor tehnici care permit izolarea i cultivarea protoplatilor. Protoplatii sunt celule nude, obinute prin ndeprtarea pereilor celulaeri rigizi. Utilitatea culturilor de protoplati pentru ameliorarea plantelor, nu se rezum numai la calitatea lor de sisteme apte pentru ingineria genetica, ci s-au dovedit a avea un enorm potenial n creterea variabilitii genetice a plantelor. Studiile de regenerare a plantelor din culturi de protoplati au condus la decelarea de mutaii spontane i n special a variaiilor somaclonale, care cuprind totalitatea schimbrilor genomice, cromozomiale sau genice, induse n timpul dezvoltrii "in vitro" a celulelor.

    Tehnica obinerii protoplatilor a devenit de mare interes, mai ales prin aceea c ofer posibilitatea hibridrii somatice si, pe calea regenerrii, obinerea unor genotipuri valoroase Tehnicile destinate transferului de nuclei, organite, fragmente mici de ADN n protoplati sporesc ansele de transformare mai rapid a plantelor n sensul obinerii unor genotipuri valoroase.

    Material si metoda Plantule de 5-7 zile, obinute prin germinarea seminelor de Papaver somniferum, n condiii

    aseptice.Tehnica izolrii protoplatilor cuprinde 3 etape: - Plasmoliza materialului vegetal; - Tratamentul enzimatic; - Purificarea protoplatilor.

    Compoziia chimic a soluiilor utilizate pentru izolarea protoplatilor:

    Soluia de plasmoliz

    Soluia enzimatic

    Soluia de splare

    KH2PO4 27,2 mg/l

    Celulaz 0,75g/100ml

    CaCl2 1,3g/l

    KNO3 101 mg/l

    Macerozim 0,2g/100 ml

    NaCl 0,905g/l

    CaCL2.H2O 1480 mg/l

    KCl 0,037g/l

    MgSO4,7H2O 246 mg/l

    Glucoz 0,099g/l

    KI 0,16 mg/l

    CuSO4.5H2O 0,025 mg/l

    Manitol 130 g/l pH-5,8

    pH-5,8

    pH-5,6

  • 16

    Plasmoliza materialului vegetal este prima etap n izolarea protoplatilor. Plasmoliza cu soluia 13% manitol este efectuat n scopul ruperii plasmodesmelor i pregtirii pereilor celulari pentru tratamentul enzimatic. Durata plasmolizei este de 30 minute. Dup ndeprtarea soluiei de plasmoliz, materialul vegetal este tratat cu soluia enzimatic. Durata incubrii n soluia enzimatic variaz n funcie de tipul explantului i concentraia amestecului enzimatic. In cazul de fa am utilizat o soluie enzimatic coninnd 0,75 % celulaz i 0,2 % macerozim. Celulaza este un amestec de hidrolaze, care desfac celuloza pn la glucoz, iar macerozimul, al crui component principal este pectinaza, hidrolizeaz legturile 1,4 galacturonice ale pectinei, elibernd acizii galacturonici. Pectinliaza este o alt component a macerozimului, care catalizeaz eliminarea acizilor nesaturai 4,5 galacturonici din pectin. Incubarea materialului vegetal n soluia enzimatic s-a realizat n condiii de agitare, timp de 16 ore, la ntuneric. Purificarea protoplatilor reprezint urmtoarea etap n izolarea lor.Se pot utiliza dou metode:

    1. Filtrarea prin sita de nylon cu diametrul porilor de 80 m: Protoplatii eliberai n urma tratamentului enzimatic sunt separai de resturile tisulare

    nedigerate, la inceput printr-o sit metalic, apoi prin sita de nylon. Filtratul este centrifugat timp de 5-7 minute (1000 rot/min). Supernatantul este ndepartat, iar sedimentul format din protoplati este resuspendat n soluia de splare. Operaia de splare a protoplatilor se repet de dou ori, n scopul eliminrii totale a soluiei enzimatice.

    2. Flotarea protoplatilor, ca mijloc de purificare: Purificarea protoplatilor prin metoda filtrrii i centrifugrii prezint dezavantajul distrugerii

    protoplatilor ntr-o proporie destul de mare. De aceea putem recurge la o alt metod, care s inlture acest neajuns.

    Sedimentul de protoplati obinut dup prima splare, este resuspendat ntr-o soluie concentrat de sucroz (40 %). Se centrifugheaz timp de 5 minute, protoplatii se adun la suprafaa ntr-o band verde, care va fi colectat i resuspendat n mediul de cultivare al protoplatilor.

    Mediul de cultivare al protoplastilor Mediul Gamborg (sruri minerale + vitamine) manitol 54,6 g/l glucoz 20,0 g/l hidrolizat de cazein 1,0 g/l 2,4 D 1 mg/l kinetina 2 mg/l pH 5,8

    Protoplatii purificai prin cele dou metode mai sus amintite, sunt resuspendai n mediul

    nutritiv pentru protoplati. Cultivarea lor se face la ntuneric i la temperatur constant (23-24o C). Protoplatii proaspt izolai i refac peretele celular n decursul a 48 ore, iar dup trei zile se pot observa primele diviziuni.

    Pentru cultivarea protoplatilor pot fi utilizate att medii lichide ct i medii agarizate. Cultivarea protoplatilor pe mediul solid prezint avantajul unei mai bune vizualizri a diviziunilor celulare i a agragatelor celulare, care premerg formrii calusului.

    Imediat dup izolare, trebuie s determinm viabilitatea protoplatilor la microscopul optic n contrast de faz. Pe o lam se pune o picatur din suspensia de protoplati i se acoper cu o lamel. Forma sferic i existena unui perete continuu la periferia protoplastului format pe seama cloroplatilor, indic faptul c protoplatii sunt viabili. Protoplatii neviabili au o form neregulat i cloroplatii sunt aglomerai n grmezi dezordonate.

  • 17

    La 7 zile de la izolarea protoplatilor putem determina "capacitatea de regenerare" a celulelor prin numrarea stadiilor de diviziune. Capacitatea regenerativ a fost stabilit ca raport ntre numrul celulelor divizate (dup 7 zile) i numrul total al protoplatilor (dup izolare). Pentru numrarea protoplatilor se poate utiliza o camer de numrare a celulelor de tip Fuchs-Rosenthal 0,2 mm. Densitatea optim a protoplatilor pentru diviziune i implicit pentru regenerare este de 5.104-1.105 protoplati/ml.

    5.1. METODA HIBRIDRII CELULARE LA PLANTE PRIN FUZIUNI DE PROTOPLATI

    Hibridarea somatic este o tehnic de mare actualitate pentru aplicaiile sale n genetic, biologia celular. Prin intermediul nmulirii parasexuate se pot realiza genotipuri noi, care sunt imposibil de realizat prin metodele convenionale de ameliorare.

    Inducerea fuziunii protoplatilor se poate realiza utiliznd o gam foarte larg de ageni de fuziune cum ar fi : nitratul de sodiu, proteine de agregare dar cel mai eficient este polietilenglicolul (PEG). Introdus relativ recent n tehnicile de hibridare somatic la plante (Kao i Michayluk, 1974), polietilenglicolul este un polimer solubil n ap i eficiena sa n aglutinare i fuzionare este datorat capacitii de a forma legturi ionice ntre constituienii de suprafa ai celulei.

    Inducerea fuziunii protoplatilor la Papaver somniferum i Papaver pseudo-oientale cu ajutorul polietilenglicolului Izolarea protoplatilor a fost realizat prin metoda enzimatic descris n capitolul anterior,

    utiliznd dou surse de protoplati: cotiledoanele plantulelor de Papaver somniferum i suspensii celulare de Papaver pseudo-orientale.

    Pentru inducerea fuziunii celor dou tipuri de protoplati s-a utilizat tehnica culturii "n pictur". Protoplatii izolai de la cele dou surse sunt amestecai n raport de 1:1 (aproximativ 100l fiecare) ntr-un vas Petri i se las 10 minute la temperatura camerei. Se adaug apoi 2-3 picturi din soluia de PEG la periferia suspensiei mixte de protoplati, dup care amestecul se incub 30 minute, timp n care are loc aderarea i aglutinarea reciproc a protoplatilor. Dup tratamentul cu soluia PEG , aceasta este nlocuit treptat cu mediul de cultivare al protoplatilor. Att procesul adeziv, ct i cel de fuziune necesit o anumit compoziie a soluiei de fuziune.

    Compoziia soluiei PEG - polietilenglicol 50 g - CaCl2 2H2O 120 mg - KH2PO4 10 mg - glucoza 1 g - pH 5,8 In timpul fuziunii, marginile externe ale protoplatilor se unesc, iar poriunile intermediare

    formeaz vezicule, care se degradeaz treptat. Organitele celulare migreaz ctre periferia celulelor fuzionate. In general, amestecul complet al citoplasmelor are loc dup aproximativ 12 ore. Natura hibrid a produilor de fuziune este evident numai dup fuziunea nucleilor mitotici i parcurgerea mai multor cicluri celulare. Selecia hibrizilor somatici vegetali poate avea loc n diferite faze:

    - imediat dup fuziune, naintea apariiei diviziunii; - dup apariia calusului; - dup regenerarea de hibrizi somatici.

  • 18

    LUCRAREA 6

    6. DETERMINAREA CALITATIV A ALCALOIZILOR IN SUSPENSII CELULARE DE PAPAVER SOMNIFERUM

    PRIN METODA CROMATOGRAFIEI IN STRAT SUBIRE

    Cromatografia reprezint o metod de separare a diverilor componeni ai unui amestec, pe baza migrrii lor difereniate, n funcie de greutatea molecular, pe un substrat specific. Metoda implic repartizarea componentelor amestecului supus analizei, ntre dou faze - lichid i solid (mobil i staionar).

    In timpul deplasrii prin faza staionar solid (silicagel), faza mobil antreneaz componenii amestecului supus analizei, n proporii dependente de interaciunile dintre acetia i cele dou faze,cu care se afl n contact permanent. Tehnica concret de lucru const n urmtoarele:

    Pe o plac de sticl, avnd dimensiunile de 20 x 20 cm, se ntinde un strat subire i omogen de silicagel. Pe respectiva plac de sticl, la distana de 1,5-2 cm de la margine, se pipeteaz amestecul ce trebuie analizat, sub forma unui spot cu diametrul ct mai mic posibil. Cantitatea pipetat este de 50 microlitri. Distana dintre centrii spoturilor este de 2 cm (spre a se evita suprapunerea lor), fapt pentru care pe o plac normal se pot pipeta 8 spoturi. Dup ce s-a picurat ntreaga cantitate de substan ce trebuie analizat, n numrul respectiv de spoturi, placa de sticl se introduce n camera de migrare. In prealabil, cuva cu amestecul pentru migrare a fost bine inchis pentru a se asigura obinerea unei atmosfere saturate n vapori. Migrarea se produce difereniat, n sensul c moleculele cu greutate mare ramn la baza plcii, cele cu masa mai mic migreaz ctre partea superioar a plcii.

    Metoda CSS (TLC-Thin Leyer Chromatography) Metoda cromatografiei n strat subire este larg utilizat pentru analiza calitativ i cantitativ a

    alcaloizilor.

    Pregtirea si analiza probelor

    Suspensiile celulare de Papaver somniferum obinute din cultivarea calusului pe mediul nutritiv lichid reprezint materialul supus analizei. Aproximativ 1 g de calus obinut prin filtrarea suspensiilor celulare printr-o sit metalic, este supus extraciei. Acesta este tratat cu 5 ml ap distilat i 1 ml HCl 1N. Se omogenizeaza amestecul, apoi se adaug 10 ml alcool etilic absolut. Rolul HCl este de a separa morfina sub forma de clorhidrat de morfin. Amestecul astfel pregtit se las, pentru macerare, timp de 24 de ore. Apoi maceratul se filtreaz, cu ajutorul pompei de vid. Extractul se concentreaz, prin evaporare pe baia de ap. Reziduul este preluat cu 2 picturi de HCl 1 N i 1 ml alcool etilic 70%

    Pregtirea plcilor de silicagel

    Pentru asigurarea stratului de silicagel, pe o plac normal (20x20 cm) se utilizeaz, n medie, 2,5 g silicagel. Anterior pipetrii probelor de analizat, plcile sunt activate prin incubarea lor n etuv, timp de 30 minute, la 100oC. Pentru migrare, n baia cromatografic, se utilizeaz o soluie alctuit din: 5O ml aceton + 4O ml xilen + 6 ml metanol + 5 ml amoniac. Pipetarea probelor de analizat pe plci se efectueaz cu ajutorul tuburilor capilare. Migrarea componentelor amestecului supus analizei este urmrit permanent, timpul de meninere a plcii n baia de migrare este cuprins ntre 30-60 minute. Apoi plcile sunt scoase din cuva de migrare i supuse uscrii dup care sunt examinate sub o lamp de ultraviolete la lungimile de und de 254 i 366 nm.

    Viteza de migrare a probei, notat cu Rf, poate lua valori cuprinse ntre zero (cnd pictura din prob rmne n poziia de start) i egalul distanei de migrare.

    Separarea componentelor din proba de analizat se realizeaz n ordinea descresctoare a dimensiunilor moleculare. Evaluarea cantitativ se face direct pe placa cromatografic, pe criteriul morfologiei spotului migrat sau prin raclarea i extragerea spoturilor i citirea la un spectrofotometru.

  • 19

    6.1. OBINEREA METABOLIILOR SECUNDARI IN SUSPENSII CELULARE TRATATE CU ELICITORI

    O nou metod de cretere a produciei i acumulrii de metabolii secundari, n suspensii

    celulare, o constituie inducerea reaciilor chimice de aparare. Multe plante reacioneaz la invazia microbian, ct i la toi ceilali factori din mediu, care provoac un stres celular (radiaii UV, ioni de metale grele, substane toxice) prin producerea unor compui, cunoscui sub numele de fitoalexine. Alturi de aceste substane chimice de aprare, a cror biosintez este limitat cantitativ i temporal, stresul celular poate fi premiza unor variaii cantitative i calitative considerabile n biosinteza unor metabolii secundari.

    Aceast metod asigur utilizarea biotehnologic a culturilor vegetale, realiznd premizele sporirii producerii i acumulrii de metabolii secundari de importan n industria chimic, alimentar, farmaceutic. In culturile celulare acioneaz, n principiu, aceeai ageni de elicitare, ca i n plantele intacte. Compuii care declaneaz reacii chimice de aprare n organismele asupra crora acioneaz, sunt cunoscui sub numele de elicitori i pot fi de dou categorii: biotici i abiotici.

    In categoria elicitorilor biotici se ncadreaz att organismele intacte ca: bacterii, ciuperci patogene sau nepatogene, ct i molecule organice, izolate din aceste organisme ca: oligozaharide, glicoproteine.

    Printre elicitorii abiotici se numr srurile unor metale grele ca HgCl2, CuSO4, detergeni, actinomicina D.

    Elicitorii, n general, induc n culturile celulare oactivitate enzimatic, care catalizeaz producerea unor substane antimicrobiene, de tipul fitoalexinelor (acumulate n esuturile necrotice).

    Intregul proces poate fi reprezentat ca un complex: stimul - rspuns - produs. Efectul acestui stimul l constituie creterea producerii de metabolii secundari n culturile vegetale. In ultimii ani, majoritatea eforturilor se concentreaz spre aceast metod, culturile celulare reprezentnd un sistem model pentru studiul mecanismelor de control al acumularii fitoalexinelor i a altor metabolii de stres.

    SISTEMUL MODEL AL INTERACIUNII ELICITOR - SUSPENSIE CELULAR

    ELICITOR

    RECUNOATEREA ELICITORULUI LA NIVELUL CULTURII IN SUSPENSIE

    ACTIVAREA GENIC I SINTEZA ENZIMELOR IMPLICATE IN LANURILE METABOLICE

    FORMAREA FITOALEXINELOR I A ALTOR METABOLII DE STRES

    ACUMULAREA DE METABOLII SECREIA DE METABOLII DE STRES IN SUSPENSII CELULARE DE STRES DIN CELULE IN MEDIUL NUTRITIV

    Acumularea metaboliilor secundari n suspensii celulare tratate cu elicitori

    Nr.

    Crt Elicitori biotici

    Suspensii

    celulare

    Metabolii secundari

    Autorii

    1. Bacterii

    Pseudomonas syringae Nicotiana tabacum

    Fituberol

    fituberina Tanaka,1985

    2. Alge brune

    Laminaria, Fucus

    Lithospermum erythrorhizon

    shikonina Fukui, 1983

  • 20

    3.

    Alge roii Gelidium amansii

    (alginat de Ca)

    Glycyrrhiza echinata

    echinatina Ayabe,1986

    4. Oomycetae

    Phytophtora megasperma

    Nicotiana tabacum

    capsidiol Chapell,1985

    Petroselinum crispum

    cumarine Kombrink,1985

    5. Zigomycetae

    Rhyzopus errhisus

    Discorea deltoidea

    diosgenina Rokem,1984

    6. Ascomycetae

    Saccharomyces cerevisiae Sclerotina sclerotiorum

    Thalictrum rugosum

    berberine Funk,1987

    Papaver somniferum

    sanguinarina Eilert,1985

    7.

    Deuteromycetae

    Aspergillus niger Trichoderma viridae Verticillium dahliae Fusarium moniliforme

    Cinchona ledgeriana

    antrachinone Wijusma,1985

    Nicotiana tabacum

    capsidiol Threlfall,1988

    Papaver somniferum

    morfina Heinstein,1985

    Papaver somniferum

    codeina Heinstein,1985

    8. Spermatophyta Phaseolus vulgaris (extract)

    Phaseolus vulgaris

    faseolina Hargreaves,1978

    9.

    Elicitori abiotici crbune activ CuSO4 HgCl2

    Lithospermum erythrorhizon

    echinofuran Fukui,1984

    Apium graveolens

    bergapten

    Medicago sativa

    medicarpina Gustine,1982

    In reuita acestei metode se impune crearea condiiilor pentru o interaciune optim ntre elicitor i suspensia celular. Este foarte important alegerea unui elicitor adecvat, cci aceeai molecul de elicitor nu activeaz, la diferite specii aceeai cale metabolic. Pe lng tipul de elicitor, se are n vedere i doza n care este el administrat. Pe de alt parte, suspensia celular trebuie s fie aptde a reaciona adecvat la tratamentul cu elicitor. Se are n vedere originea explantului, care a generat cultura, vrsta culturii, starea ei fiziologic. Elicitorul este recunoscut de celulele cultivate, prin intermediul receptorilor de la nivelul membranei plasmatice, urmnd apoi un ntreg lan de procese fiziologice i biochimice, la finele cruia se acumuleaz o cantitate nsemnat de metabolii secundari. Pe lng metabolii secundari de tipul fitoalexinelor, se pot acumula i substane fr efect antimicrobian. Vom exemplifica cteva reuite ale acestei metode. Suspensii celulare de Glycine max tratate cu preparate fungice, sintetizeaza cantiti nsemnate de izoflavone, iar suspensii celulare de Daucus carota, tratate cu spori de Chaetomium globosum sintetizeaz cantiti nsemnate de izocumarina. Compui de tipul terpenelor au fost obinui n suspensii celulare de Gosypium arboreum tratate cu conidii de Verticillium dahliae.

    In ciuda rezultatelor satisfctoare i de perspectiv, metoda tratrii suspensiilor celulare cu elicitori, ridic o serie de probleme cum ar fi distrugerea unei cantiti mari de celule dup aplicarea tratamentului.

    Actualmente "strategiile" de producere a metaboliilor secundari "in vitro" se axeaz pe studierea tuturor factorilor care duc la moartea celulelor i se ncearc limitarea acestui proces, fcnd posibil o elicitare de lung durat a culturii. Utilizarea sistemului experimental elicitor-suspensii celulare, ramne o alternativ de perspectiv n obinerea metabiliilor secundari "in vitro".

  • 21

    LUCRAREA 7

    7. METODE DE OBTINERE A PLANTELOR HAPLOIDE

    Obinerea "in vitro" a plantelor haploide (organisme care posed numrul gametic de cromozomi n) este posibil prin tehnica cultivrii "in vitro" a anterelor si polenului izolat. Androgeneza a fost indus pentru prima dat prin cultura "in vitro" a anterelor la specia Datura inoxia, de catre Guha i Maheshwari, 1964. O prim cerin pentru succesul culturii "in vitro" de antere o constituie stadiul de dezvoltare a grunciorilor de polen n momentul recoltrii i compoziia mediului de cultur.

    Tehnica de lucru cuprinde urmtoarele etape: - recoltarea mugurilor florali; - dezinfectarea mugurilor florali cu soluie de hipoclorit de calciu 1%, timp de 10 minute, urmat

    de splarea lor cu ap distilat steril; - dup tratament, anterele nernite, cu o poriune mic din filamentul staminal se trec pe

    mediul nutritiv solid, n vase Petri sau eprubete; - culturile se pstreaz la temperatura de 26-27O C i se expun la lumin timp de 12-14 ore pe

    zi; - aproximativ, dup 3-8 sptmni, microsporii din antere genereaz embrioni din care se

    dezvolt plantule.

    Mediul de cultur i rolul lui n inducerea androgenezei

    Mediul de cultur este un factor esenial pentru succesul cultivrii "in vitro" a anterelor i este specific pentru diferite specii de plante. Acesta trebuie s conin n principal macroelemente, microelemente, aminoacizi eseniali, vitamine, fitohormoni, zaharoz i uneori suplimente organice.

    Pentru cultura anterelor "in vitro" se utilizeaz fie mediul White (1943), fie Murashige-Skoog (1962).

    Medii nutritive folosite pentru cultura anterelor "in vitro

    COMPOZIIA CHIMIC MEDII DE CULTUR White Nitsch

    Macroelemente mg/l mg/l Ca(NO3)2 ,4H2O 288 950 KNO3 80 950 NH4NO3 _ 720 KCl 65 _ KH2PO4 _ 68 NaH2PO4, 4H2O 19 _ CaCl2 . 2 H2O _ 166 MgSO4 7 H2O 737 185 Na2SO4 200

    Microelemente Fe2(SO4)3 2,5 - FeSO4 7 H2O - 27,8 Na2EDTA - 37,3 MgSO4 4 H2O 6,7 25 H3BO3 1,5 6,2 ZnSO4 4 H2O 2,2 10 KI 0,75 - Na2MoO4 2 H2O - 0,25 CuSO4 5 H2O - 0,025

  • 22

    Substane organice Biotina - 0,05 Glicina 3 2 Inozitol - 100 Acid nicotinic 0,5 5 Piridoxina 0,1 0,5 Tiamina 0,1 0,5 Acid folic - 5 Zaharoza 20 000 20 000

    Obinerea de plante haploide prin culturi de antere

    Mugure floral Antere Microspori

    Embriogenez Calus haploid Plante haploide Mutagenez Dublarea cromozomial Selecie ( tratament cu colchicin) Regenerare Plante homozigote 2n (linii izogene) Mutante haploide

    7.1. CULTURA IN VITRO DE MICROSPORI IZOLATI

    In cazul culturii de microspori izolai posibilitatea de obinere a populaiilor omogene de plante haploide sunt mai mari n raport cu utilizarea culturilor de antere. Acest fapt s-ar explica prin influena negativ a esutului anterei asupra dezvoltrii microsporilor (n cultura de antere). Astfel, pe de o parte, esutul degenerativ al anterei, prin substane inhibitoare de cretere, limiteaz dezvoltarea microsporului, iar pe de alt parte, esutul diploid al anterei crete foarte activ formnd calus care inund microsporii. Plantele haploide obinute prin cultura de microspori prezint o mai mare stabilitate genetic fa de cele obinute prin cultura de antere.

    Metoda include dou etape importante: - prima, influenarea microsporilor n vederea schimbrii evoluiei normale sexuale cu o evoluie

    pe cale vegetativ. Inducerea dezvoltrii microsporului pe cale vegetativ are la baz inhibarea formrii nucleului generativ, astfel ca nucleul vegetativ s se poat dezvolta similar unei celule somatice

    - a doua, direcionarea dezvoltrii microsporilor ctre embriogenez. Dezvoltarea polenului poate fi indus prin tratarea anterelor cu diferii ageni fizici sau chimici, care au rolul de a produce modificri n mitoza polinic. Dintre acetia amintim:

    - ocurile de temperatur, care aplicate la polen au ca rezultat formarea a doi nuclei identici nedifereniai;

    - centrifugarea polenului la temperaturi sczute; - utilizarea colchicinei pentru alterarea mitozelor polinice.

    Tehnica izolrii microsporilor

    Pentru izolarea microsporilor au fost elaborate mai multe metode: 1. Tehnica lui Sunderland N. i Roberts M. (1977) de izolare a microsporilor. Mugurii florali (recoltai dup prima diviziune mitotic, la tutun, cnd corola are 21-23 mm) se

    pstreaz 12 zile la 7-8 0C apoi anterele se extrag din muguri i se trec n mediu lichid (cte 15 antere n 5 ml mediu) cu urmtoarea compoziie:

  • 23

    mg/l

    KNO3 950 NH4NO3 825 MgSO4 7H2O 185 CaCl2 220 KH2PO4 85 FeSO4.7H2O 27,8 Na2EDTA 37,3 Sucroza 20 000 pH 5,5

    Vasele Petri se izoleaz cu Parafilm i se incubeaz la 28 0C , la ntuneric primele 14 zile. Apoi

    se trec la 25 0C i lumin, timp de 12 ore pe zi. Polenul eliberat n mediu dup 6,10, 14 zile continu s creasc i s germineze, genernd embrioni haploizi.

    2. Tehnica lui Nitsch (1974), de izolare a microsporilor Metoda se bazeaz pe extracia polenului n mediul de cultur prin presarea anterelor, cu ajutorul unui piston de sering. Urmeaz operaia de filtrare, printr-o sit de nylon n scopul ndeprtrii esuturilor anterei. Suspensia de polen se centrifugheaz la 100 turaii, timp de 5 minute. Polenul este splat de dou ori, dup care suspensia final este pipetat n vase Petri mici, cu diametrul de 5 cm. Vasele Petri sunt izolate cu parafilm i sunt incubate la 27-30oC

    7.2. CULTURA IN VITRO DE OVARE

    Cultura in vitro de ovare a fost realizat pentru prima dat de La Rue C.D, n anul 1942, care a utilizat n experimentri 92 de specii de mono i dicotiledonate. Succesul culturii de ovare este limitat la speciile care posed o morfologie simpl i fructele ajung rapid la maturitate. Vom prezenta metoda folosit de Rao P.S., Rangaswamy N.S. (1965) pentru cultura ovarelor de Nicotiana rustica. Mediul de cultur are urmtoarea compoziie:

    mg/l

    Ca(NO3)2 4H2O 500 KNO3 125 MgSO4 H2O 125 KH2PO4 125 MnSO4 4H2O 3 ZnSO4 7H2O 5 H2BO3 5 CuSO4 5H2O 0,25 Na2MoO4 0,25 CaCl2 0,25 citrat de Fe 10 glicina 7,5 acid nicotinic 11,25 tiamina 25 pantotenat de Ca 0,25 piridoxina 0,25 hidrolizat de casein 500 zaharoz 40,0 agar 8,0 pH 5,8

    Mediul de cultur se sterilizeaz prin autoclavare la 121o C, timp de 15 minute. Apoi se repartizeaz n eprubete, cte 25 ml/eprubet.

  • 24

    Prepararea explantului i plasarea sa pe mediul de cultur 1. Se recolteaz florile sau mugurii florali, iar pedunculul, staminele i petalele se indeprteaz ;

    2. Ovarele se dezinfecteaz cu etanol 70%, apoi, se imerseaz n 0,5 % hipoclorit de sodiu timp de 10 minute i se spal cu ap distilat steril ; 3. Se transfer pistilele pe mediul nutritiv cu agar. Culturile se in la 27o C i la lumin fluorescent 10 000 lucsi, timp de 16 ore/zi.

    LUCRAREA 8

    CULTURA IN VITRO DE ENDOSPERM

    Endospermul este un esut unic din punct de vedere genetic, fiind triploid la cele mai multe angiosperme, rezultnd din fuziunea a trei nuclei haploizi. Endospermul este esutul nutritiv al embrionului i n acelai timp centrul dinamic al influenei de dezvoltare a acestuia. Cercetrile din ultimii ani au bsolute potenialul organogenetic al endospermului cultivat in vitro. Dat fiind faptul ca esutul endospermic este triploid, plantele formate prin cultura acestuia in vitro sunt triploide.

    Primele cercetri privind cultura de esut endospermic au fost efectuate nc din 1933 de Mills R, Lamp C. Acetia au plasat endosperm de la boabele tinere de Zea mays pe mediu nutritiv, coninnd extract de cartof i au obinut o uoar proliferare a celulelor nvecinate embrionului. Mai trziu, n 1949, La Rue, extinde cercetrile privind creterea i diferenierea endospermului in vitro, reuind s obin o cretere continu de esut endospermic, imatur provenit de la porumb.

    Tehnica culturii in vitro de endosperm O importan deosebit pentru tehnica culturii endospermului o constituie momentul optim de

    excizare a endospermului. Astfel, la Zea mays, timpul optim este la 8-11 zile dup polenizare iar la Cucumis sativus la 7-10 zile dup polenizare.

    In scopul realizrii unei bune proliferri a endospermului, mediul de cultur se suplimenteaz cu diferii factori de cretere : suc de tomate, extract de drojdie. Cele mai adecvate medii nutritive pentru cultivarea endospermului sunt mediul White (1943) i mediul MS (Murashige-Skoog,1962). Indiferent de compoziia mediului de baz, prezena auxinei (2,4D sau IAA), a citokininei (BAP sau kinetina) i a extractului de drojdii sau hidrolizatului de cazein (sursa de azot organic) este esenial pentru iniierea unei culturi de endosperm.

    Organogeneza indus n calusul bsolute din culturile de endosperm

    Specia Autorii

    Euphorbiaceae Jatropha panduraefolia

    Putranjiva roxburghii

    Srivastava, 1973 Srivastava, 1973

    Gramineae Oryza sativa

    Bajaj et al., 1980

    Loranthaceae Scurrula pulverulenta

    Taxillus vestitus

    Bhojwani, 1970 Nag si Johri, 1971

    Santalaceae Santalum album

    Lakshmi Sita et al,1980

    Rutaceae Citrus grandis

    Wang si Chang, 1978

    Rosaceae Prunus persica

    Pyrus malus

    Shu-quiong si Jia qu, 1980 Mu et al, 1977

  • 25

    Endospermul cultivat pe medii nutritive adecvate poate genera plantule direct prin embriogenez sau indirect prin formarea mai nti a calusului i apoi, prin diferenierea acestuia. Pentru formarea mugurilor direct din tesut endospermic este absolut necesar prezena n mediu a unei citokinine.

    CULTURA IN VITRO DE EMBRIONI

    Embriocultura constituie o metod eficient de obinere de plante fertile de la hibrizi neviabili sau de la semine care i-au pierdut capacitatea de a germina. Metoda culturii de embrioni const, din izolarea aseptic a embrionului i transferul lui pe mediu nutritiv.

    Ovulele intacte, seminele sau capsulele care conin ovule se sterilizeaz iar embrionii sunt extrai n condiii aseptice. Sterilizarea seminelor se poate face cu etanol, timp de 3 minute, sau cu clorura mercuric 0,1%, timp de 15 minute. In condiiile n care se lucreaz cu semine de dimensiun i reduse, toate operaiile de excizare a embrionilor din semine se efectueaz sub microscop.

    Mediile de cultur folosite pentru cultivarea embrionilor variaz funcie de specia de la care provin embrionii si de vrsta acestora. Embrionii maturi pot crete pe un mediu cu sruri minerale i zaharoz, iar proembrionii necesit suplimentarea mediului de cultur cu vitamine, aminoacizi, fitohormoni.

    Prepararea mediului de cultur

    Mediul nutritiv complet prezint urmtoarea compoziie : mg/l

    KH2PO4 910 KCl 750 MgSO4 7H2O 740 MnSO4 H2O 3 H2BO3 5 ZnSO4 7H2O 5 CoCl2 0,25 CuSO4 5H2O 0,25 citrat de Fe 10 inozitol 50 tiamin 25 pantotenat de Ca 25 piridoxin 25 glutamin 400 alanin 50 cistein 20 arginin 10 leucin 10 fenilalanin 10 tirozin 10 acid malic 1 zaharoz 30000

    Tehnica culturii in vitro de embrioni la gru (Triticum aestivum) Boabele de gru sunt splate n alcool etilic 70 %. Apoi, sunt sterilizate cu hipoclorit de calciu 5

    %, timp de 5-10 minute, dup care urmeaz excizia embrionului cu ajutorul unui bisturiu. Embrionii excizai sunt plasai n vase Petri mici, fiecare coninnd 5 ml din mediul de cultur. Probele sunt meninute la o temperatur de 25oC, n condiiile unei fotoperioade de 16 ore.

  • 26

    Compoziia mediului nutritiv utilizat pentru cultivarea embrionilor de gru (Triticum aestivum)

    Macroelemente mg/l KNO3 1900 CaCl2.2H2O 880 NH4NO3 825 MgSO4.7H2O 370 KCl 350 KH2PO4 170

    Microelemente mg/l H3BO3 12,4 MnSO4.H2O 33,6 ZnSO4.7H2O 21 KI 1,66 Na2MoO4 0,5 CuSO4.5H2O 0,5 CaCl2.6H2O 0,5

    LUCRAREA 9

    METODA CULTURII IN VITRO DE MERISTEME

    Cultivarea "in vitro" a meristemelor urmrete n principal dou aspecte: obinerea plantelor sntoase i multiplicarea clonal rapid. Cerinele pentru cultura "in vitro" de meristeme variaz n funcie de dimensiunea explantului, scopul culturii i genotipul din care provine explantul. Astfel, explantul de meristem apical necesit un mediu nutritiv suplimentat cu hormoni, n timp ce acela format din mici poriuni de primordii foliare nu necesit un astfel de mediu. Explantul de tip meristem, utilizat pentru obinerea plantelor libere de viroze poate fi mic de 0,1-0,3 mm, iar cel folosit pentru multiplicarea clonal poate avea civa mm.

    In cazul explantului meristematic de dimensiuni reduse, se recomand cultivarea lui pe unul din mediile nutritive: Murashige-Skoog (1962), White (1954), Morel i Martin (1955).

    Tehnica cultivrii meristemelor

    Zonele meristematice situate n varful de cretere al tulpinii, n zona axilar a mugurilor foliari sau n varful rdcinii reprezint sursa de iniiere a culturii.

    Prelevarea zonelor meristematice este realizat n condiii aseptice, n boxa cu flux laminar, dup ce n prealabil explantele au fost dezinfectate prin imersarea lor ntr-o soluie de hipoclorit de sodiu 6-7 %, timp de 10 minute urmat de splarea repetat cu ap distilat steril.

    Explantele meristematice sunt plasate pe medii nutritive adecvate, n scopul regenerrii plantelor ntregi. Pe lang natura substratului nutritiv, un rol important l prezint i factorii fizici n declanarea proceselor regenerative. Culturile de meristeme sunt pstrate la o temperatur de 22-26o C, intensitatea luminii este cuprins ntre 3000-4000 luci, fotoperioada 16/8 ore.

    Fitohormonii constituie factorii decisivi n regenerarea plantelor ntregi. Combinaiile de citokinine i auxine se folosesc pentru inducerea lstarilor.

  • 27

    Medii nutritive pentru cultivarea meristemelor

    Compoziia chimic White Martin i Morel Macroelemente mg/l mg/l Ca(NO3 )2 4H2O 288 500 KNO3 125 125 KCl 65 - KH2PO4 - 125 NaH2PO4 4H2O 19 - MgSO4 7H2O 737 125 Na2SO4 200 -

    Microelemente mg/l mg/l Fe2(SO4)3 2,5 2,5 MnSO4 4H2O 7,7 0,8 H2BO3 1,5 0,025 ZnSO4 4H2O 2,2 0,04 KI 0,75 0,25 CuSO4 5H2O _ 0,025 NiCl2 6H2O _ 0,025 CoCl2 6H2O _ _

    Substane organice mg/l mg/l biotina _ 0,001 pantotenat de calciu _ 0,001 cisteina _ 0,01 glicina 3 _ inozitol _ 0,001 acid naftalenacetic _ 0,01 acid nicotinic 0,5 _ piridoxina 0,1 _ tiamina 0,1 0,001 glucoza _ 40000 zaharoza 20000 _

    LUCRAREA 10

    10. METODE CITOLOGICE SI HISTOLOGICE DE STUDIERE A

    MATERIALULUI VEGETAL IN VITRO

    10.1. METODA DE COLORARE A CROMOSOMILOR DIN CELULELE IN SUSPENSIE

    Perpetuarea unui genotip valoros depinde, n esen, de succesiunea ordonat a proceselor de replicare cromosomial i diviziune. Imperfeciunile ocazionale, aprute n derularea acestor procese, constituie baza material a variabilitii, i implicit, a evoluiei. Celulele i esuturile vegetale, n condiiile cultivrii "in vitro" sunt expuse mai mult dect n ipostaza integrat, manifestrii unor procese deviante . Modificrile nucleare pot fi apreciate prin semnalarea mutaiilor cromosomiale sau genice. Evidenierea mutaiilor cromosomiale este realizat prin intermediul preparatelor microscopice. Mutaiile cromosomiale sunt markerii principali ai schimbrilor genetice.

    Culturile celulare conin, adesea, celule cu grad diferit de difereniere. Legat de acest aspect, grosimea i consistena pereilor celulari variaz, ceea ce creeaz dificulti n observaiile microscopice. De aceea, operaia preliminar efecturii preparatelor microscopice este tratarea celulelor cu pectinaz sau celulaz, n scopul distrugerii pereilor celulari. Metoda care va fi prezentat

  • 28

    n cele ce urmeaz, a fost aplicat n cazul multor specii : Triticum aestivum, Daucus carota, Phaseolus vulgaris, Vicia hajastana, Haplopappus gracilis.

    Materialul vegetal Suspensii celulare

    Reactivi 1. Soluia acid acetic/alcool etilic 1:3 2. Soluia de carbol fuxin modificat 3. Soluia tampon de acetat de sodiu 0,1 M, pH 4,5 4. Soluia enzimatic:celulaz Onozuka 0,5% i pectinaz Sigma 0,5%, in 0,1 M soluie

    de acetat de sodiu, pH 4,5

    Metoda de lucru I. Pretratarea 0,5 ml suspensie celular se pstreaz la temperatura de 1-2oC, timp de 12-24 de ore II.Fixarea Suspensia celular (0,5 ml) este tratat cu soluia de fixare (acid acetic/alcool etilic). Se

    pastreaz la 4oC timp de 12-14 ore. Durata mazim de pstrare n soluia fixatoare este de dou sptmni.

    III. Tratamentul enzimatic Celulele sau agragatele celulare meninute n soluia fixatoare, sunt transferate ntr-

    untub de centrifug i centrifugate timp de 6 minute la 1000 rot/min. Se ndeprteaz supernatantul i celulele sunt splate de dou ori cu soluia tanpon 0,1 M. Urmeaz tratamentul cu soluia enzimatic, durata acestui tratament fiind de 1-2 ore. Celulele sunt splate i suspensionate n acid acetic 45%.

    IV. Pregtirea preparatelor microscopice Pe o lam microscopic se pipeteaz 20 l din suspensia de celule n acid acetic, peste

    care se adaug 50 l carbol fuxin modificat 5%. Timpul de colorare al lamei este cuprins ntre 10 i 30 minute. Lama este aezat ntre dou straturi absorbante de hrtie de filtru, iar lamela este presat cu un b de chibrit, pentru obinerea preparatului tip squash. Preparatul astfel pregtit este observat la microscop pentru evidenierea cromosomilor.

    10.2. METODE HISTOLOGICE DE STUDIERE A MATERIALULUI VEGETAL IN VITRO

    Celulele cultivate "in vitro" pot evolua spontan sau indus pe calea formrii : traheidelor, primordiilor de organe sau a embrionilor. Investigarea acestor procese ale dezvoltrii "in vitro", presupun studii comparative, pe baza preparatelor histologice. Exist diverse metode, prin care esuturile vegetale pot fi pregtite pentru examinarea microscopic. Procedeul care va fi prezentat const ntr-o succesiune de operaiuni : includerea, seciunea, colorarea calusului.

    A. Reactivii I. Fixatorii 1. Glutaraldehida 4%,n soluie fosfatic tampon 0,025 M, pH- 6,8.pstrat la temperatura de 0-4o C. 2. FAA formalin 5 ml acid acetic glacial 5 ml alcool etilic 70% 90 ml II.Ageni de deshidratare 1. alcool etilic absolut 2. 2-metoxietanol III.Material de includere 1. xilen

  • 29

    2. parafin IV. Colorani

    1. Hematoxilin Delafield 2. Albastru de metilen 1% 3. Rou ruteniu- soluie apoas 0,1%

    B. Metoda de lucru I. Fixarea 1. Fragmente mici de calus (5 mm) sunt introduse ntr-un recipient de sticl, care

    conine soluia fixatoare (glutaraldehida). Se pstreaz la temperatura de 4oC, cel puin 36 de ore. Glutaraldehida este folosit ca fixator pentru conservarea citoplasmei, iar FAA este utilizat ca fixator, n cazul efecturii preparatelor histologice. In acest ultim caz, fixarea se realizeaz la temperatura camerei i dureaz 24 de ore.

    2. Splarea materialului vegetal este realizat prin nlocuirea soluiei fixatoare cu ap. Au loc dou splri, fiecare dureaz o or.

    II. Deshidratarea 1. Materialul vegetal este trecut succesiv n etanol 30%, 50% i 70% i meninut la rece

    (0-4oC). Timpul de incubare n fiecare baie de etanol este de 30 de minute. 2. Se continu deshidratarea materialului vegetal, prin treceri succesive ale acestuia

    prin bi de etanol 89%, 90% i 95%, la temperatura camerei. 3. Urmeaz tratarea materialului vegetal cu alcool etilic absolut, operaie care se repet

    de 3 ori, fiecare baie dureaz o or. 4. Materialul vegetal este tratat apoi cu o soluie etanol-xilen 1:1 i apoi cu xilen, fiecare

    tratament dureaz 30-60 minute. 5. Se topete parafina la 60-70oC. 6. Materialul vegetal este introdus n xilen -parafin 1:1 i se pstreaz peste noapte la

    temperatura de 60-70oC. 7. Se nlocuiete amestecul xilen:parafin cu parafin pur, aceast schimbare este

    fcut de dou ori, n decursul unei zile. 2-Metoxietanolul este un alt agent de deshidratare. Materialul vegetal fixat cu FAA, poate fi deshidratat la temperatura camerei.

    III. Includerea n parafin 1. Materialul vegetal este transferat n blocul de parafin lichid. 2. Parafina se va solidifica n decurs de cteva ore. IV. Secionarea 1. Se efectueaz seciuni rectangulare de 10-15 m grosime, cu ajutorul microtomului. 2. Se aleg cte 4-5 seciuni i se transfer pe o lam, ntr-o pictur de ap. 3. Lamele se nclzesc i se usuc la 30-40oC. V. Colorarea 1. Preparatele perfect uscate, sunt trecute prin xilen (de 3 ori), alcool etilic absolut (de 3

    ori) i alcool etilic 95, 90, 80, 70, 50 i 30%. Preparatele sunt lsate n fiecare soluie cte 2-3 minute. 2. Lamele sunt plasate ntr-un vas, care conine hematoxilin, timpul de colorare este de 15-30

    minute. Dac se utilizeaz albastru de metilen, timpul de colorare este de 10 minute. 3. Preparatele sunt splate cu ap. 4. Se revine la etapele bilor cu etanol i xilen, durata fiecrei bi este de 1-2 minute. Prin

    utilizarea hematoxilinei, pereii celulari i nucleul, se coloreaz albastru, iar n cazul albastrului de metilen i a roului de ruteniu, lamela median i pereii primari se coloreaz rou, iar pereii celulari lignificai se coloreaz albastru.

    BIBLIOGRAFIE

    1. Alberts, B.; Bray, D.; Lewis, J.; Raff, J.; Roberts, K.Watson, J. (1983)-Special Features of Plant Cells In: Molecular Biology of the Cell, Garlland Publishing, 1100-1110

  • 30

    2. Ammirato, P. V. (1985) - Patterns of development in culture In: Tissue Culture in Forestry and Agriculture, Plenum Press, 9-29

    3. Ayers, A.; Ebel, J.; Valent, B.; Albersheim, P.(1976) -Host- Pathogen interactions. Fractionation and biological activity of an elicitor isolated from the mycelial walls of Phythophthora var. sojae, Plant Phisiol. 57:760-785

    4. Bra, I. (1989) -Reproducerea, factor al evoluiei plantelor, Ed.Academiei Romne 5. Beiderbeck, R.; Reichling, J. (1989) -Pflanzenzellkulturen in Forschung und Praxis, 188-193

    6. Bhojwani, S.; Razdan, M. K. (1983)-Plant Tissue Culture: Theory and Practice In: Developments in Crop Science, vol. 5, Elsevier, Amsterdam, Oxford, NewYork

    7. Bigot, C. (1987)-Cell Culture Techniques Applied to Plant Production and Plant Breeding, Bocconcibod, J. et al. (Eds), ENITHP, Angers, 5-10

    8.Bengochea,T.;Dodds,J.N.(1986)-Plant Protoplasts- A Biotechnological Tool for Plant Improvement, Chapmann, Hold (Eds), 3-24

    9. Botnariuc, N. (1976)-Concepia i metoda sistemic n biologia general, Ed.Acad. 10. Cachi Cosma, D. (1984)-Tehnica cultivrii "in vitro"a celulelor i esuturilor vegetale In: Culturi de celule i esuturi vegetale Aplicaii n agricultur, Edit. Ceres, Bucureti 11. Cantrel, C.; Guallot-Salomon, T.; Brown, S.; Dubocq, M, Dubocq,J.B. (1991)-Isolation and biochemical characteristics of Protoplasts of Jojoba (Simmondsia chinensis), Plant Cell Phisiol.,12 (7),959-967

    12. Constabel, F. (1975)- Histological Methods In: Plant Tissue Culture Methods, Gamborg, O.L.; Wetter, L.R.(Eds.), 50-54

    13. Coocking, C. E. (1984) -Plant Cell Fusion:Transformation Using Plant and Bacterial Protoplasts In: Cell Fusion: Gene Transfer and Transformation Roland F.M., Beers J., Bassett P.D. (Eds), Raven Press, 140-150

    14. Coocking, C. E. (1987) -Plant Cell Biology in the 21.Century: The Neede of Plant Cell and Tissue Culture In: Plant Tissue and Cell Culture,3-15

    15. Dale, P. J.; Cheyne, V. A.; Dalton, J. (1980)-Pathogen elimination and in vitro plant storage in forage grasses and legumes In:Tissue Culture methods for plant pathologists, Ingram D.S., Helgeson Y.P.(Eds), 119-124

    16. D'Amato, D. (1978) -Chromosome number variation in cultured cells and regenerated plants In: Frontiers of plant tissue culture, Thorpe T.A. (Ed), Calgary Canada, 287-295

    17. Debergh, P.; Maene, L. (1981)-A schema for comercial propagation of ornamental plants by tissue culture, Scientia Horticulturae 14, 335-345

    18. Dixon, R. A.; Lamb, C. L. (1990) -Molecular communication in interactions between plants and microbial pathogens, Ann. Rev. Plant Physiol. 41, 339-367

    19. Dodds, J. H.; Roberts, L. W. (1982)-Experiments in Plant Tissue Culture, University Press Cambridge, 133-144

    20. Dougall, D. K.; Johnson, J. M.; Whitten, G. H. (1980)-Clonal analysis of anthocianin accumulation by cell cultures of wild carrot, Planta 49,292-297

    21. Demarly, Y.(1977)-Genetique et amelioration des plantes, Edit. Masson

    22. Eriksson, T. (1965) - Studies on the growth requirements and growth measurements of cell cultures of Haplopappus gracilis, Physiologia Pl., 18, 976-993

    23. Evans, D. A.; Flick, C. E.; Jensen, R. H. (1981)-Disease rezistance incorporation into sexually incompatible somatic hybrids of the genus Nicotiana, Science 213, 907-909

    24. Evans, D. A.; Sharp, W. R.; Flick, C. E. (1981)-Growth and behaviour of cell cultures. Embriogenesis and organogenesis In: Plant tissue culture Methods and applications in agriculture,Thorpe T.A. (Ed), Academic Press,45-115

    25. Fitzsimons, P. J.; Weyers, J. D. H. (1985)- Properties of some enzymes used for protoplasts isolation In: The Physiological Properties of Plant Protoplasts, Pilet P. E. (Ed.)

    26. Fujimura, T.; Komamine, A. (1984)-Fractionation of cultured cells In : Cell Culture and somatic cell genetics of plants, Vasil I. K. (Ed.), Academic Press,159-166

    27. Furuja, T.; Nakano, M.; Yoshikawa, T (1978)-Biotransformation of RS-reticuline and morphinan alkaloids by cell cultures in Papaver somniferum, Phytochemistry 17, 891-893

    28. Galun, E.; Aviv, D. (1986)-Cell Culture and Tansformation In: Plant Molecular Biology,Weissbach A., Weissbach H. (Eds.), Academic Press, 595-611

    29. Gamborg, O. L.; Wetter, I. D. (1975)-Plant Tissue Culture Methods, Ed. N. R. C. Canada Saskatoon

    30. Gautheret, R. (1959)-Le culture des tissus vegetaux. Techniques realisations, Ed.Masson Paris

    31. George E. F, Hall , M.A. De Klerk Geert-Ja- 2008- Plant Propagation by Tissue Culture, Springer

    32. Gleba, Y.; Sytnik, K. M. (1984)-Protoplast Fusion -Genetic Engineering in Higher Plant, Shoenan, R. (Ed.), Springer Verlag, 7-20

  • 31

    33. Glimelius, K. (1984)-High growth rate and regeneration capacity of hypokotyl protoplasts in some Brassicaceae, Plant Physiol. 61, 38-44

    34. Green, C. E.; Phillips, R. E. (1975)-Plant regeneration from tissue cultures of maize, Crop Sci. 15, 417-420

    35. Gyerese, A.; Racs, G. (1973)-Neuen Fliessmittel zur Trennung der Hauptalkaloiden des Opiums, Pharmazie 28, 271-275

    36. Heinstein, P. F. (1985)-Future approaches to the formation of secondary natural products in plant cell suspension cultures, J. Nat . Prod. 48, 1-9

    37. Hodges, C. C.; Rapoport, H. (1982)-Morphinan alkaloids in callus cultures of Papaver somniferum, J. Nat. Prod. 45, 481-485

    38. He, G. Y.; Korbuly, E.; Barnabas, R. (1993)-High frequency of callus formation and regeneration of fertile plants from haploid cell suspensions derived from anther culture in wheat (Triticum aestivum L.), Plant Science 90, 81-87

    39. Ikuta,A.(1974)-Alkaloids of callus, tissues and redifferentiated plantlets in the Papaveraceae , Phytochemistry 13, 2157-2179

    40.Jain, S.M. ; Hggman, H, (2007) - Protocols for Micropropagation of Woody Trees and Fruits 41.Jain, M.S.; Saxena, P.K. (2009) -Methods in Molecular Biology, Protocols for In Vitro Cultures and Secondary Metabolite Analysis of Aromatic and Medicinal Plants, vol. 547, Springer Science

    42.Kao, K.N.(1975)- A chromosomal staining method for cultured cells In: Plant Tissue Culture Methods, Gamborg, O.L.;Wetter, L.R.(Eds), 63-64

    43.Kao, K.N. (1975)- A nuclear staining method for plant protoplasts In; Plant Tissue Culture Methods, Gamborg, O.L.; Wetter, L.R (Eds), 60-61

    44. Krens, F. A.; Schilperoort, R. A. (1984)-Ti-Plasmid, DNA Uptake and Expression by Protoplasts of Nicotiana tabacum In : Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vasil I.K (Ed.), 523-533

    45. Larquin, P. J.; Scowcroft, W. R. (1981)-Somaclonal variation -a novel source of variability from cell culture, Theor. Appl. Genet. 60, 197-214

    46. Lazzeri ,P. A.; Lorz, H. (1988) -In vitro genetic manipulation of cereals and grasses In : Advances in Cell