UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE

CRAIOVA

FACULTATEA DE MEDICINĂ GENERALĂ

REZUMAT

TEZĂ DOCTORAT

Rolul celulelor stem progenitoare circulante

şi al receptorilor factorilor de creştere

în diagnosticul şi terapia tumorilor cerebrale

CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC

Prof. Univ. Dr. Dricu Anica

DOCTORAND

Bănicioiu Mihai Daniel

Studiile au fost finanţate din proiectele:

FONDUL SOCIAL EUROPEAN, COD: POSDRU/6/1.5/S/8

PARTENERIATE IN DOMENII PRIORITARE, COD PROIECT: PNI/ 4.1/41-063/2007

CRAIOVA

2011

2

Investeşte în oameni!

FONDUL SOCIAL EUROPEAN

Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

Axa Prioritară: 1. Educaţia şi formarea profesională în sprijinul creşterii

economice şi dezvoltării societăţii

Domeniul Major de Intervenţie: 1.5. Programe doctorale şi postdoctorale în

sprijinul cercetării

Titlu proiect: "Sprijinirea tinerilor doctoranzi cu frecvenţă prin acordarea de

burse doctorale"

Cod Proiect: POSDRU/6/1.5/S/8

Beneficiar: Universitatea de Medicină şi Farmacie din Craiova

3

CUPRINS

PARTEA GENERALĂ (STADIUL CUNOAŞTERII)

1. TUMORILE CEREBRALE

1.1 Consideraţii generale..............................................................................................................................................................................................................................5

1.2 Clasificarea tumorilor cerebrale......................................................................................................................................................................................5

1.3 Epidemiologie........................................................................................................................................................................................................................................................6

1.4 Simptomatologie...............................................................................................................................................................................................................................................6

1.5 Diagnostic şi investigaţii..................................................................................................................................................................................................................6

1.6 Tratamente......................................................................................................................................................................................................................................................................6

1.7 Celulele stem canceroase cerebrale............................................................................................................................. ..............................................7

2. GLIOBLASTOMUL

2.1 Incidenţă............................................................................................................................. .................................................................................................................................................8

2.2 Etiologie şi factori predictivi....................................................................................................................................................................................................8

2.3 Tablou clinic................................................................................................................................................................................................................................................................8

2.4 Biologie moleculară.....................................................................................................................................................................................................................................9

2.5 Rolul celulelor stem progenitoare circulante în diagnosticul glioblastoamelor............10

3. TIPURI DE TRATAMENT ÎN GLIOBLASTOM

3.1 Terapia chirurgicală...................................................................................................................................................................................................................................10

3.2 Radioterapia................................................................................................................................................................................................................................................................10

3.3 Chimioterapia.....................................................................................................................................................................................................................................................11

4. RECEPTORII TIROZIN-KINAZICI ŞI LIGANZII LOR

4.1 Familia IGF ..............................................................................................................................................................................................................................................................11

4.2 Familia EGF..............................................................................................................................................................................................................................................................12

4.3 Familia PDGF........................................................................................................................................................................................................................................................12

4.4 Familia VEGF........................................................................................................................................................................................................................................................12

PARTEA SPECIALĂ (STUDIU EXPERIMENTAL)

5. OBIECTIVE......................................................................................................................................................................................................................................................13

6. MATERIAL ŞI METODĂ..............................................................................................................................................................................................14

6.1 Materiale...........................................................................................................................................................................................................................................................................14

6.2 Celule şi culturi celulare.................................................................................................................................................................................................................14

6.3 Tratarea celulelor...........................................................................................................................................................................................................................................14

6.4 Determinarea viabilităţii celulare............................................................................................................................. ...................................................15

6.5 Determinarea timpului de dublare a celulelor (T2) .............................................................................. ....................15

6.6 Western Blotting.............................................................................................................................................................................................................................................16

6.7 Citometrie de flux.........................................................................................................................................................................................................................................16

6.8 Analiza statistică.............................................................................................................................................................................................................................................17

7. REZULTATE.................................................................................................................................................................................................................................................17

8. DISCUŢII................................................................................................................................................................................................................................................................28

9. CONCLUZII.....................................................................................................................................................................................................................................................31

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ..................................................................................................................................................................................32

4

INTRODUCERE

În ciuda descoperirilor recente din lumea medicală, una dintre principalele cauze de

mortalitate şi morbiditate în intreaga lume o reprezintă cancerul. În ţara noastră, incidenţa

tumorilor cerebrale maligne este de 4,3/100000 locuitori, ele constituind 2% din totalitatea

neoplaziilor la adult, mortalitatea generală fiind de 4,65/100000 locuitori. (Iacob et al. 2004).

În această teză de doctorat, cercetarea a fost restrânsă la studierea unor aspecte

neelucidate încă, referitoare la clasa tumorilor cerebrale. Tumorile cerebrale prezintă o mare

varietate ca tip, localizare, rată de creştere şi sunt extrem de heterogene din punct de vedere

fenotipic şi genotipic. Cea mai frecventă şi cea mai agresivă tumoră cerebrală la adulţi este

reprezentată de glioblastomul multiform, caracterizat de o creştere rapidă şi de capacitatea de a

infiltra ţesuturile adiacente, având o rată medie de supravieţuire de aproximativ 14 luni.

Lucrarea de faţă este un răspuns la necesitatea observată şi prin studierea literaturii de

specialitate în ceea ce priveşte diagnosticul şi terapia tumorilor cerebrale. Acest domeniu este în

continuu cercetat şi are extraordinar de multe aspecte neexploatate încă. În aceste condiţii, am

considerat oportun sa elucidez, măcar în parte, următoarele probleme legate de

- corelaţia dintre gradul tumoral şi numărul de celule endoteliale progenitorii circulante,

- efectul produs de inhibitorul STI571 (Imatinib mesylate) asupra celulelelor de

glioblastom în vitro şi

- evaluarea efectului citotoxic al agentului de metilare S-adenozil-metionina (SAM)

asupra tumorilor cerebrale de grad înalt (high grade glioma, HGG) şi a interferenţei cu expresia

IGF-1R în vitro.

La finalizarea acestei teze, doresc sa menţionez că lucrarea de faţă nu ar fi putut fi dusă la

bun sfârşit fără îndrumarea competentă şi susţinută a doamnei Prof. Dr. Anica Dricu,

conducătorul meu de doctorat, căreia îi adresez sincere mulţumiri.

Cuvinte cheie:tumori cerebrale, celule stem progenitoare circulante, receptori ai

factorilor de creştere.

5

PARTEA GENERALĂ (STADIUL CUNOAŞTERII)

1. TUMORILE CEREBRALE

1.1 Consideraţii generale

Deşi cele mai recente tratamente împotriva cancerelor controlează creşterea şi

proliferarea celulelor tumorale, acestea nu sunt capabile de a eradica în totalitate masa de celule

tumorale (Schulenburg 2006). Metodele terapeutice folosite în tratamentul tumorilor cerebrale

sunt foarte variate şi alegerea lor este dictată de factori precum vârsta pacientului, dimensiunea şi

localizarea tumorii sau rata de creştere estimată postterapeutic. În prezent, biologia tumorilor

cerebrale este incomplet cunoscută, mai ales în ceea ce priveşte relaţia cu parenchimul adiacent

indemn.

1.2 Clasificarea tumorilor cerebrale

În conformitate cu clasificarea WHO, Organizaţia Mondială a Sănătaţii (WHO) a

clasificat tumorile cerebrale astfel:

1. Tumori neuroepiteliale: a) Tumori gliale; b) Tumori neuronale şi neuronal-gliale

mixte; c) Tumori nongliale

2. Tumori meningeale: a) Meningioame; b) Hemangiopericitoame; c) Leziuni

melanocitice

3. Tumori ale celulelor germinale:a) Germinoame; b) Carcinoame embrionare;

c)Tumori ale sinusului endodermal; d) Coriocarcinoame; e) Teratoame; f) Tumori mixte ale

celulelor germinale

4. Tumori ale regiunii selare: a) Adenoame pituitare; b) Carcinoame pituitare;

c)Craniofaringioame

5. Tumori cu histogeneză nesigură:

6. Limfomul primar al SNC

7. Tumori ale nervilor periferici ce afectează SNC:

8. Tumorile metastatice

6

Glioamele maligne reprezintă o clasă de tumori cerebrale care include mai multe entităţi

heterogene cu origine comună, derivând din celulele gliale. Din punct de vedere histopatologic,

glioamele sunt clasificate în astrocitoame, oligodendroglioame, oligoastrocitoame şi tumori

ependimale.

Glioblastoamele sunt stadializate în 4 grade, gradul IV fiind reprezentat de glioblastomul

multiform cu gradul cel mai înalt de malignitate, acesta fiind cea mai agresivă şi cea mai

frecventă formă, fiind caracterizat prin celularitate intensă, activitate mitotică, proliferări

microvasculare şi necroză (Louis et al. 2007).

1.3 Epidemiologie

Etiologia tumorilor cerebrale este necunoscută până în prezent. Totuşi sunt câteva

sindroame ereditare familiale care au fost asociate cu apariţia tumorilor cerebrale primare:

neurofibromatoza 1 şi 2, sindromul Li-Fraumeni şi sindromul Turcot (Louis and von Deimling

1995).

1.4 Simptomatologie

Creşterea masei tumorale determină semnele specifice hipertensiunii intracraniene şi

simptome nespecifice ale tumorilor cerebrale precum: convulsii, hemipareze, dificultăţi de

vorbire, tulburări de personalitate, crize convulsive această simptomatologie depinzând de

localizarea tumorii.

1.5 Diagnostic şi investigaţii

Diagnosticul de certitudine al tumorilor cerebrale este histopatologic şi se pune după

analiza unui fragment de ţesut tumoral în urma unei biopsii. De asemeni, investigaţiile imagistice

au o importanţa deosebită în stabilirea diagnosticului, examinarea tomografiei computerizate

(CT) furnizând date importante în legătură cu diametrele, localizarea şi caracteristicile tumorii,

iar rezonanţa magnetică nucleară (RMN) permite identificarea cu precizie a caracteristicilor

tumorale cât şi raporturile acesteia cu structurile anatomice învecinate. Spectroscopia prin

rezonanţă magnetică (RMS) este o metodă imagistica relativ nouă ce vizualizează distribuţia

regională a substanţelor chimice asociate cu metabolismul tumoral şi modificările biochimice.

1.6 Tratamentul tumorilor cerebrale

Terapia standard pentru patologia tumorală cerebrală este reprezentată de chirurgie,

radioterapie şi chemoterapie, aceste metode având însă o specificitate redusă pentru celulele

7

tumorale precum şi efecte adverse semnificative. În plus, ele pot determina apariţia de novo a

unei alte tumori.

Chirurgia reprezintă în prezent principala modalitate de tratament a tumorilor cerebrale.

Radioterapia s-a dovedit utilă în tratamentul majorităţii tumorilor cerebrale şi a

metastazelor. Radioterapia poate fi utilă ca şi monoterapie, pre- sau postoperator, sau în asociere

cu chimioterapia.

Dezavantajele chimioterapiei sunt reprezentate de rezistenţa intrinsecă la agenţii

chimioterapici şi de dezvoltarea chimiorezistenţei pe parcursul tratamentului. De aceea se

recurge adesea la tratamente care utilizează combinaţii dintre diferiţi agenţi chimioterapici.

1.7 Celulele stem canceroase cerebrale

Conform teoriei moderne, transformarea malignă a celulei normale în celula canceroasă

se petrece la nivelul celulelor stem existente în ţesutul adult. În pofida cercetărilor intense din

ultima perioadă, originea exactă a celulelor stem canceroase (CSC) rămâne necunoscută.

În tumorile cerebrale, celulele stem canceroase se găsesc în procent de 1% până la 30%

şi, conform datelor publicate în literatura de specialitate, prezintă proprietăţi similare celulelor

stem neurale (Beier et al. 2007) .În prezent, markerii de suprafaţă ai celulelor stem canceroase au

fost identificaţi în numeroase tipuri de cancere.

La nivel molecular, o etapă importantă în apariţia celulelor stem tumorale (CST) ar putea

fi reprezentată de alterarea căilor de autoregenerare a celulelor stem adulte existente în tesutul

cerebral. În tumorile cerebrale sunt afectate deopotrivă căile proliferării şi diferenţierii celulare,

cât şi mecanismele morţii celulare. Proto-oncogenele sunt convertite în oncogene şi devin

amplificate sau suferă mutaţii activatoare.

Conceptul ca dezvoltarea şi progresia tumorala să depindă de evoluţia CST schimbă

dramatic posibilităţile prin care boala canceroasă poate fi vindecată. Identificarea şi terapia ţintită

împotriva CST reprezintă o provocare majoră în terapia modernă anticanceroasă, cercetătorii

încercând să găsească noi terapii molecular ţintite împotriva acestor celule.

8

Figura 1. Terapia ţintită împotriva CST. Noul tip de terapie tumorală

2.GLIOBLASTOMUL

2.1.Incidenţa

Glioamele maligne sunt cele mai frecvente tipuri de tumori cerebrale primare la adulţi în

unele studii, fiind relatate ca reprezentând aproximativ 50% din tumorile cerebrale primare,

glioblastomul fiind cel mai întâlnit subtip histologic la adulţi (Lonn et al 2005).

2.2. Etiologie şi factori predictivi

Glioblastomul primar apare cu predilecţie la adulţi, cu vârsta între 40 şi 70 ani, bărbaţii

fiind mai frecvent afectaţi. Radiaţiile ionizante au fost de asemenea asociate cu o probabilitate

crescută de apariţie a acestuia (Ohgaki and Kleihues 2005).

2.3. Tablou clinic

Simptomatologia glioblastoamelor primare se instalează relativ rapid, în mai puţin de 3

luni, în cazul glioblastoamelor secundare istoricul clinic al bolii fiind mai lung - intre 1 şi 5 ani

(Ohgaki and Kleihues 2005). Cele mai frecvente localizări sunt: lobul frontal, lobul parietal,

lobul temporal şi lobul occipital.

Simptomatologia poate fi nespecifică, cuprinzând semnele presiunii crescute

intracraniene sau specifică localizării tumorii. Simptome generale cuprind: cefalee, vărsături,

tulburări vestibulare, crize comiţiale.

9

2.4. Biologie moleculară

Procesul de transformare neoplazică constă în modificări la nivelul oncogenele, genelor

supresoare tumorale, genelor ce sunt implicate în repararea AND-ului celular şi genelor ce

mediază ciclul celular şi apoptoza.

Glioblastoamele primare se caracterizează prin amplificarea sau supraexpresia EGFR

(receptorul factorului de creştere epidermal) şi supraexpresia MDM2, LOH 10q (mutaţii ale

genelor PTEN şi RB1), mutaţii ale genei TP53 fiind găsite mai rar în acest grup de tumori

(Ohgaki and Kleihues 2007). În cazul astrocitoamelor de grad inferior frecvent apar mutaţii ale

genei TP53, acestea fiind cele mai timpurii alterări genetice detectate. De asemenea,

supraexpresia factorului de creştere plachetar (PDGF) este un eveniment timpuriu în dezvoltarea

astrocitoamelor de grad inferior. În progresia către glioblastomul secundar grad IV, LOH 10q

intervine ca un eveniment tardiv.

Mutaţiile genetice pot apărea şi progresiv, de la tumorile de grad inferior, grad II către

cele de grad III şi apoi către glioblastomul secundar, grad IV. Durata până la progresia către

gradul IV poate varia între 1 şi 5 ani.

Figura 2. Progresia de la glioamele cu grad mic de malignitate la glioblastomul primar si

secundar.

10

2.5 Rolul celulelor stem progenitoare circulante în diagnosticul glioblastoamelor

Glioblastoamele sunt caracterizate de o neovascularizaţie bogată, ce joacă un rol deosebit

de important în dezvoltarea şi progresia tumorală. Celulele endoteliale progenitorii (CEP) sunt

celule derivate din măduva hamatogenă şi au proprietatea de a se diferenţia în celule endoteliale

mature. Fenotipul CEP este caracterizat de expresia markerului specific hematopoietic CD34,

markerul specific celulelor stem CD133 şi a markerului endotelial VEGFR2 (Peichev et al.

2000). Eliberarea şi mobilizarea CEP este influenţată de factorii de creştere pro-angiogenici

(Kalka et al. 2000).

Rafat et al. a desfăşurat un studiu în care a inclus pacienţi cu glioblastom (GBM) şi

pacienţi cu metastaze cerebrale, numărul de CEP circulante fiind semnificativ crescut la pacienţii

cu GBM faţă de cei cu metastaze şi faţă de grupul control.

Deşi mecanismele fiziopatologice prin care intervin şi influentează angiogeneza şi

progresia tumorală nu sunt pe deplin cunoscute, CEP s-au dovedit a fi un potenţial marker atât

pentru neoangiogeneza tumorală cât şi pentru răspunsul la terapia antiangiogenică.

3. TIPURI DE TRATAMENT ÎN GLIOBLASTOM

3.1 TERAPIA CHIRURGICALĂ

Intervenţia chirurgicală are un rol important în managementul terapiei glioblastomului.

Scopurile intervenţiei chirurgicale sunt obţinerea materialului bioptic necesar examenului

histopatologic şi extirparea tumorii în scop curativ. Glioblastomul cât şi astrocitomul de grad III

WHO sunt tumori cu caracter infiltrativ, marginile tumorii fiind neregulate şi insotite de edem

peritumoral, astfel o rezecţie totală fiind greu de realizat.

3.2 RADIOTERAPIA

3.2.1 Radioterapia convenţională

Tratamentul standard după rezecţia totală sau parţială a tumorilor de grad III sau IV este

radioterapia externă fracţionată. Recomandările actuale sunt administrarea unor doze totale de

50-60 Gy, în fracţiuni de 1.8-2.0 Gy pe zi, cinci zile pe săptămână, timp de 6 sau 7 săptămâni

(Laperriere et al. 2002).

11

3.2.2 Radioterapia streotactică

Avantajele radioterapiei stereotactice sunt reprezentate de faptul că dozele de radiaţii sunt

mai mici decat cele utilizate în radioterapia fracţionată, datorită direcţionării mai precise a

radiaţiilor pe direcţia masei tumorale. Metoda are eficacitate crescută, iar riscul lezării ţesutului

normal adiacent este mai scazut. Două din metodele de tratament ale radioterapiei stereotactice

sunt Gamma knife şi Cyberknife.

3.2.3 Alte modalităţi de radioterapie

BNCT (boron neutron capture therapy) este o metodă de tratament promiţătoare în terapia

glioblastomului, dar deocamdată este înca la nivel experimental (Joensuu et al 2003). BNCT se

bazează pe capacitatea particulelor de 10B de a capta neutroni termici şi de a determina

dezintegrarea acestora în particule α şi nuclei de litiu.

Radioterapia hiperfracţionată ce utilizează mai multe doze mici de radiaţie pe parcursul

unei zile şi creşterea dozei totale până la 70 Gy, nu a îmbunătăţit supravieţuirea pacienţilor cu

glioame maligne (Prados et al 2001).

3.3 CHIMIOTERAPIA

Trialurile clinice ce au comparat radioterapia versus radioterapie plus chimioterapie au

aratat o creştere a duratei medii de supravieţuire în cazul folosirii radioterapiei şi chimioterapiei

adjuvante (Stewart et al 2002). Cea mai utilizată combinaţie medicamentoasă este numită PCV şi

este formată din procarbazină, lomustină şi vincristină (Stupp et al 2005).

Inhibarea genei MGMT asociată cu rezistenţa la agenţi alchilanţi s-a dovedit a fi un factor

important în creştererea ratei de supravieţuire. (Heigi et al 2004).

4. RECEPTORII TIROZIN-KINAZICI ŞI LIGANZII LOR

4.1 Familia IGF. Liganzii şi receptorii IGF

Factorul de creştere insulinic de tip 1 (IGF-1) este o proteină codificată de gena IGF1

aflată pe cromozomul 12. IGF-1 este sintetizată în principal în ficat şi producerea sa este

stimulată de hormonul de creştere (GH). IGF-1 şi receptorul său specific IGF-1R sunt implicaţi

în stimularea creşterii celulare, proliferare şi inhibarea apoptozei. IGF-1R deţine un rol important

în menţinerea fenotipului malign, supraexpresia sa fiind exprimată în mai multe tipuri de

cancere.

12

4.2 FAMILIA EGF. Liganzii şi receptorii EGF

EGFR (receptorul factorului de creştere epidermal) este un receptor tirozinkinazic,

implicat în stimularea diviziunii celulare, proliferare şi invazie. Gena EGF prezintă amplificări şi

supraexpresie în aproximativ 40% din cazurile de glioblastom, majoritatea primar (Ekstrand

et.al. 1992).

Cea mai comună mutaţie a EGFR este EGFRvIII, mutaţie ce constă în deleţia exonilor 2

– 7, rezultând o variantă de receptor fără domeniul de legare ligand-specific funcţional.

4.3 FAMILIA PDGF. Liganzii şi receptorii PDGF

Liganzii factorului de creştere derivat din plachete: PDGF-A, -B, -C,-D, sunt recunoscuţi

de două tipuri de receptori PDGFR-α (specifici celulelor tumorale) şi PDGFR-β (specifici

vaselor tumorale) localizaţi pe membrana celulara. Supraexpresia PDGFR-α apare frecvent în

glioamele cu grad scăzut de malignitate şi este implicată în progresia acestora către

glioblastomul secundar. Supraexpresia PDGFR-α este frecvent însotită şi de LOH 17p şi deleţia

genei TP53.

4.4 FAMILIA VEGF. Liganzii si receptorii VEGF

Liganzii familiei VEGF (VEGF – A, VEGF – B, VEGF – C, VEGF – D) influentează

răspunsul celular prin legarea de receptorii specifici VEGFR – 1, VEGFR – 2, VEGFR – 3, sunt

activaţi prin transfosforilare. În procesul angiogenezei, cea mai importantă izoformă este VEGF

– A, ce are rol în stimularea migrării şi mitozei celulelor endoteliale, în formarea lumenului

vaselor de neoformaţie şi stimularea migrării monocitelor şi macrofagelor. VEGF – B are rol in

angiogeneza embrionară, iar VEGF – C SI VEGF – D au rol în angiogeneza vaselor limfatice.

Niveluri crescute de VEGF au fost detectate în zonele necrotice cu hipoxie accentuată la

pacienţii cu glioblastom. De asemeni, nivelurile crescute de VEGF au fost asociate cu o

progresie rapidă tumorală şi un prognostic rezervat.

13

PARTEA SPECIALĂ (STUDIUL EXPERIMENTAL)

5. OBIECTIVE

OBIECTIVUL NR. 1 - Evaluarea numărului de CEP circulante la pacienţii cu

glioblastom, comparativ cu pacienţii diagnosticaţi cu tumori cerebrale de grad mic;

Motivaţia studiului: În procesul de neoangiogeneză, proces important în creşterea şi

invazia glioblastomului, un rol important îl joacă eliberarea şi mobilizarea celulelor progenitorii

endoteliale (CEP) circulante derivate din maduva hematogenă. Un nou concept apărut recent ar fi

că celulele tumorale pot produce diverse semnale moleculare ce pot elibera şi mobiliza CEP

circulante la locul tumorii, unde au ca scop stimularea neoangiogenezei. În plus, markerii de

suprafaţa ai celulelor stem canceroase au fost identificaţi în numeroase tipuri de cancere,

evidenţiindu-se importanţa pe care o au în diagnosticarea cancerului

OBIECTIVUL NR. 2 - Determinarea efectului produs de tratamentul cu STI571

asupra celulelor de glioblastom in vitro;

Motivaţia studiului: Ţinte terapeutice specifice în ţesuturile maligne sunt reprezentate şi

de receptorii tirozinkinazici şi receptorii tirozinkinazici constitutiv activi, deoarece aceste

proteine au o expresie înaltă la nivelul ţesutului malign. Există la această oră diferite modalităţi

de inactivare a receptorilor tirozinkinazici cum ar fi: anticorpi monoclonali, inhibitori cu

moleculă mică, peptide sintetice, siRNA etc. Un inhibitor cu moleculă mică, utilizat la aceasta

oră ca tratament în diferite forme de cancer, este STI571 (Imatinib mesylate). STI571 se

foloseşte în tratamentul leucemiei limfoblastice acute, dar şi alte tipuri de cancere cum ar fi

tumorilor stromale gastrointestinale sau cancerul pancreatic. Nu este însă foarte bine elucidat

rolul său în tratamentul glioblastomului.

OBIECTIVUL NR. 3 - Evaluarea efectului citotoxic al agentului de metilare SAM

asupra tumorilor cerebrale de grad inalt (high grade glioma, HGG) şi a interferenţei cu

expresia IGF-1R in vitro.

Motivaţia studiului: Studii anterioare au arătat ca S-adenozil-metionina (SAM),

principalul donor de grupări metil în numeroase procese biologice, induce moartea celulelor

canceroase prin modificarea profilului de metilare ADN. Alte studii ştiintifice sugerează, că

SAM inhibă efectul mitogen al factorilor de creştere în celulele canceroase. De asemenea,

studiile anterioare demonstrează importanţa IGF-1R în supravieţuirea şi proliferarea celulelor de

glioblastom.

14

6. MATERIAL ŞI METODĂ

6.1 Materiale

Materialele utilizate în studiu au avut urmatoarele provenienţe: reactivii utilizaţi pentru

tratarea culturilor celulare -: Invitrogen/Life Technologies, Inc.(Rockville, MD, SUA), Bovine

serum albumin (BSA) - Sigma (St. Louis, MO, USA), STI571 - Novartis Pharmaceuticals Corp.

(Basel, Switzerland). IGF-1, PDGF-BB, VEGF-B, SCF, EGF şi FGF-2 - R&D Systems

(Abington, UK). Kitul MTT - Roche Diagnostics Gmbh (Mannheim, Germany),

S’Adenosylmethyonina (SAM) - New England Bio-labs.

6.2 Celule şi culturi celulare

Linia celulară BT1GB a fost etablată din segment tumoral colectat de la pacient cu

glioblastom în concordanţă cu procedurile standard. Culturile celulare primare 18 şi 38 au fost

etablate din tumori cerebrale cu grad înalt de malignitate (HGG), la Spitalul Universităţii

Uppsala, în concordanţă cu procedurile standard.

Toate liniile celulare au fost cultivate în mediu Minimum Essential Modified (MEM) ce

conţine 10% ser fetal bovin (FBS), 2mM glutamină şi antibiotic (100UI/ml penicilină şi

100UI/ml streptomicină). Celulele au fost cultivate în recipiente de culturi de celule de diferite

dimensiuni, în role Petri, având diametrul de 35mm, 60mm şi 150mm sau în plăcuţe cu 96 de

godeuri (în funcţie de tipul fiecărui experiment), şi au fost menţinute în incubator umidifiat la

37°C , 95%O2 şi 5%CO2.

6.3 Tratarea celulelor

Celulele de glioblastom BT1GB au fost cultivate în MEM ce conţine 10% ser fetal bovin

(FBS) suplimentat cu 2mM glutamină şi antibiotic (100UI/ml penicilină şi 100UI/ml

streptomicină). Celulele au fost cultivate în sticle de culturi celulare de 200ml. După atingerea

confluenţei, celulele au fost tripsinizate apoi au fost transferate în plăcuţe cu 96 de godeuri (în

funcţie de designul fiecărui experiment) şi menţinute în incubator umidifiat la 37°C, 95%O2 şi

5%CO2. Pentru determinarea dozei-răspuns, celulele au fost cultivate în condiţii standard de

cultură (mediu complet cu 10% FBS şi suplimente) şi tratate cu STI571 0.3125M, 0.625M,

1.25M, 2.5M, 5M, 10M, 20M, 40M, 60M sau 80M, la interval de 24 de ore, timp de

3 zile. STI571 a fost diluat în apă. S-a folosit o soluţie stoc de 100 mM care a fost păstrată la -

20°C. Controlul a constat din celule netratate, cultivate în condiţii standard de cultură.

Viabilitatea celulară a fost apoi analizată după 72h. Pentru determinarea rolul factorilor de

15

creştere asupra efectului citotoxic al tratamentului cu STI571, celulele au fost spălate de două ori

cu fosfat cu soluţie tampon salină şi incubate cu mediu cu 1% ser cu sau fără adaos de 50ng/ml

IGF-1, PDGF-BB, VEGF-B, SCF, EGF şi FGF-2 şi tratate cu 1.25M, 2.5M, 5M sau 10M

STI551 la interval de 24 de ore, timp de 3 zile. Factorii de creştere au fost diluaţi în apă. S-a

folosit o soluţie stoc de 1g/ml care a fost păstrată la 20°C. Controlul a constat din celule

netratate, cultivate în condiţii standard de cultură. După 72h a fost analizată viabilitatea celulară.

Un număr de 15x103celule/godeu/200μl mediu de cultură au fost cultivate pe plăcuţe cu 96 de

godeuri, incubate timp de 8h şi tratate cu diferite concentraţii de STI571 şi/sau factori de

creştere.

Liniile celulare de HGG, 18 şi 38, au fost cultivate în MEM ce conţine 10% ser fetal

bovin (FBS) suplimentat cu 2mM glutamină şi antibiotic (100UI/ml penicilină şi 100UI/ml

streptomicină). Celulele au fost cultivate în sticle de culturi celulare de 200ml apoi au fost

transferate în placuţe cu 96 de godeuri (4x103 celule/godeu) în 0.2 ml de mediu MEM standard

cu diferite concentraţii de SAM (0.1 μM, 1 μM, 10 μM, 25 μM, 50 μM, 75 μM, 100 μM, 150

μM sau 200 μM) şi incubate pe un interval de 7 zile, dupa care a fost analizată viabilitatea

celulară. Viabilitatea celulara a fost determinată şi prin numararea zilnică a celulelor în arii

marcate în prealabil, timp de 7 zile de la tratarea celulelor.

În toate experimentele efectuate în studiu au fost introduse grupuri de control, în care

celulele au fost tratate numai cu substanţele folosite pentru diluţie.

6.4.Determinarea viabilitatii celulare

Viabilitatea celulară a fost determinată şi prin numararea zilnica a celulelor. În acest

scop, celulele au fost cultivate în sticle de culturi celulare de 200ml apoi au fost transferate în

role Petri, având diametrul de 35mm. Pe partea exterioară a fundului rolelor Petri au fost în

prealabil marcate anumite zone, în care apoi au fost numărate celulele la intervale de timp

precizate anterior. Procentul de celule care au supravieţuit la intervalele de timp indicate în

experiment a fost apoi calculat prin raportare la numarul iniţial de celule.

6.5 Determinarea timpului de dublare a celulelor (T2)

Liniile celulare de HGG 18 şi 38, au fost cultivate în MEM ce conţine 10% ser fetal

bovin (FBS) suplimentat cu 2mM glutamină şi antibiotic (100UI/ml penicilină şi 100UI/ml

streptomicină). Celulele au fost cultivate în sticle de culturi celulare de 200ml apoi au fost

16

transferate transferate în role Petri, având diametrul de 35mm, la o densitate de 1000cel/ml.

Celulele au fost cultivate în condiții standard timp de 7 zile, apoi au fost numărate zilnic, iar T2

a fost calculat prin metoda regresiei liniare, utilizând mai multe puncte de timp. La sfârşitul

experimentului, T2 a fost calculate prin utilizarea a două puncte de timp, cu aplicarea formulei:

T2 = txln2/ln(N/N0 + 1) Unde: t = durata experimentului

N0 = numărul iniţial de celule

N = este creşterea numarului de celule pe durata experimentului

6.6. Western Blotting

Separarea şi detecţia proteinelor a fost determinată prin metoda Western Blot, desfăşurată

în trei etape distincte.

Prima etapă este reprezentată de separarea amestecului de proteine prin electroforeză pe

un gel poliacrilamidic (PAGE). Cu ajutorul unui câmp electric, proteinele sunt apoi transferate

pe o membrană de nitroceluloză.

În următoarea etapă are loc tratarea proteinelor din membrană cu o soluţie care conţine

anticorpii primari, specifici pentru proteinele studiate. Proteinele sunt apoi blocate cu anticorpul

secundar, care se leagă de anticorpul primar formând astfel un complex de molecule de anticorp.

Ultima etapă este reprezentată de detecţie, care consta în amplificarea semnalului prin

metoda chemiluminiscenţei.

În cazul experimentelor efectuate pentru actualul studiu, celulele au fost lizate în soluţia

de lizare. Lizatul a fost centrifugat pentru îndepărtarea componentelor insolubile. Proteinele au

fost cuantificate cu ajutorul kit-ului Bio-Rad Dc. Cantităţi egale de proteină au fost separate pe

geluri SDS-PAGE 10% şi ulterior transferate pe membrane Immobilion-P PVDF (Millipore).

Membranele au fost blocate cu lapte praf degresat 5% dizolvat în soluţie salină Tris ce conţine

0,1% Tween 20 (TBST), apoi au fost incubate cu anticorp primar diluat în lapte praf degresat 1%

diluat în TBST, incubate apoi cu anticorp secundar legat de peroxidază diluat la rândul său în

lapte praf degresat 1% diluat în TBST. Ulterior a fost folosit sistemul de detecţie ECL pentru

determinarea Western Blot a anticorpului în conformitate cu instrucţiunile producătorului.

6.7. Citometrie de flux

Pentru identificarea şi cuantificarea celule progenitorii endoteliale (CPE), celulele în

suspensie au fost marcate fluorescent şi apoi au fost analizate prin citometrie de flux. Pentru

17

cuantificarea CPE circulante prin FACS (sortare celulară activată fluorescent), sangele periferic

este incubat cu anticorpi conjugaţi fluorescent împotriva CD45, CD34, CD31, CD133 sau

VEGFR2. Pentru fiecare procedură de izolare vor fi folosiţi markeri de control corespunzători.

Dupa filtrare, numărul de celule CD45-/CD31+/ CD34+ şi CD45-/ CD31-/CD34-/

CD133+/VEGFR2+ au fost cuantificate şi exprimate ca celule/ml de sânge, folosind CyFlow SL

flow cytomoter şi sotware-ul FlowMax. Pentru fiecare măsurare au fost înregistrate 100.000

evenimente.

6.8.Analiza statistică

Toate datele reprezită media ± deviaţia standard. Datele au fost analizate folosind testul t

ANOVA . Valorile p< 0.05 au fost considerate semnificative statistic.

7.REZULTATE

7.1 Numarul de CEP circulante este semnificativ mai mare la pacientii cu

glioblastom comparativ cu pacientii diagnosticati cu tumori cerebrale de grad mic.

În studiu au fost evaluate valorile CEP în sângele periferic colectat de la 12 pacienţi: 4

pacienţi cu glioblastom (grad IV WHO) şi 8 pacienţi cu tumori cerebrale cu grad mic de

malignitate (grad I, II WHO).

Dintre aceştia, 1 pacient a fost diagnosticat cu meningiom meningotelial, 1 pacient cu

meningiom tranziţional, 2 pacienţi cu meningiom microchistic, 1 pacient cu meningiom cu celule

clare, 2 pacienţi cu meningiom şi 1 pacient cu meningiom psamomatos.

Pacienţii incluşi în studiu au fost operaţi la Clinica de Neurochirurgie a Spitalului

Bagdasar Arseni Bucuresti şi au avut confirmat diagnosticul histopatologic.

Determinarea valorilor celule endoteliale progenitorii (CEP) circulante din sângele

periferic, colectat de la pacienţi cu tumori cerebrale, a fost făcută folosind anticorpi monoclonali

împotriva CD45 (pentru excluderea celulelor hematopoietice) şi markeri endoteliali CD31,

CD34, CD133 şi VEGF R2, conjugaţi direct cu fluorocromii Pacific-Blue, FITC, PE, PercPsi

APC. CEP circulante (definite ca celule CD45-/CD31+/CD34+/CD133+/VEGF R2+ ) au fost

cuantificate şi exprimate ca număr de celule/mL de sânge, folosind “five-colour flow cytometry”.

Analizarea datelor a început după achiziţia a 100.000 de evenimente. Din totalul de celule

a fost izolată populaţia limfocitară (Fig.3.segmentul I), apoi populaţia CD45- (Fig.3 segm..II) a

fost selectată pentru marcarea cu CD31 şi CD34 (Fig.3. segm. III). În final, în Fig.3

18

segmentul.IV, a fost selectată populaţia celulară prezentând coexpresia CD133+ VEGFR2+.

Etapele parcurse au fost aceleaşi, indiferent de tipul de tumora cerebrala, iar pentru exemplificare

a fost selectat doar experimentul ce a folosit meningiomul meningotelial.

Figura 3. .Numarul de CEP circulante pentru pacientul cu meningiom meningotelial

Rezultatele noastre au arătat că nivelurile de CEP au fost semnificativ (p<0.05) mai mici

la toţi pacienţii diagnosticaţi cu tumori de grad mic, faţă de pacienţii cu glioblastom. La pacienţii

cu glioblastom am gasit în medie de 3 ori mai multe CEP decât la tumorile cu grad mic. Totuşi

nu au fost observate diferenţe semnificative între grupurile cu tumori de grad mic (Fig.4)

Figura 4. Comparaţie între numărul de CEP din sângele periferic al pacienţilor diagnosticaţi cu: meningiom

meningotelial, meningiom tranziţional, meningiom microchistic, meningiom cu celule clare, meningiom, meningiom

psamomatos şi glioblastom.

Rezultatele semnificative statistic comparative cu glioblastomul (p 0,005)

I II

III IV

19

7.2 Determinarea efectului produs de tratamentul cu STI571 asupra celulelelor de

glioblastom în vitro

În celulele aparţinând liniei BT1GB, citotoxicitatea produsă de tratamentul cu STI571 a

fost dependentă de doza utilizată. Supravieţuirea celulelor a fost determinată la 3 zile după

tratament.

În primul set de experimente, a fost evaluată doza raspuns după tratamentul cu STI571 (Figura

5). Celulele BT1GB au avut o rată de supravieţuire ce a scăzut constant de la 98% după

tratamentul cu 0.3125M, până la 8.8% după tratamentul cu 40M M STI571. Peste această

concentraţie, rata de supravieţuire a scăzut foarte puţin, până la 7% în cazul concentraţiei 80M

M STI571. Rezultatele sunt prezentate ca procent din control.

0

20

40

60

80

100

120

0 mM

0.3125 m

M

0.625 m

M

1.25 m

M

2.5 m

M

5 mM

10 mM

20 mM

40 mM

60 mM

80 mM

Pro

cen

t d

in c

on

tro

l

STI571

Figura 5. Doza-răspuns după tratamentul cu STI571. Rezultatele sunt prezentate ca procent din control. Datele

reprezintã medie +/- deviaþie standard a douã experimente independente.

Apoi, a fost determinat efectul tratamentului cu STI571 asupra celulelor de glioblastom

cultivate în condiţii standard sau fără nutrienţi (Figura 6). Din grafic, se observă că procentele de

supravieţuire ale celulelor menţinute în condiţii standard au scăzut constant odată cu creşterea

concentraţiei de STI571, dar valorile obţinute au fost mai mari decât cele obţinute în cazul

celulelor tratate cu STI571 si cultivate în mediu cu 1% FBS. Pentru exemplificare, după

tratamentul cu 10M STI571, celulele BT1GB cultivate în mediu cu 1% FBS au supravieţuit în

procent de 32,2%, iar cele cultivate în condiţii standard au supravieţuit în procent de 59,2%.

Datele reprezintă medie +/- deviaţie standard a două experimente independente. Toate rezultatele

obţinute au fost semnificative statistic (p 0,005).

20

Figura 6. Efectul tratamentului cu STI571 asupra celulelor de glioblastom cultivate în condiţii standard sau fără

nutrienţi. Rezultatele sunt prezentate ca procent din control. Datele reprezintã medie +/- deviatie standard a douã

experimente independente.

Rezultatele semnificative statistic fata de tratamentul cu STI571 in conditii standard (p 0,005

În următorul set de experimente, am observat efectul stimulativ al factorilor de creştere

IGF-1, PDGF-BB, VEGF-B, SCF, EGF sau FGF-2 asupra celulelor de glioblastom (Figura 7).

Creşterea celulară a celulelor BT1GB cultivate în mediu cu 10% FBS a fost de 0,98 ori mai mare

decât a celulelor cultivate în mediu cu 1% FBS. Adăugarea factorilor de creştere a indus o

creştere a proliferării celulare, comparativ cu cea celulelor cultivate în mediu cu 1% FBS, dar

mult mai mică decât în cazul celulelor BT1GB cultivate în mediu cu 10% FBS.

Figura 7. Efectul stimulării cu IGF-1, PDGF-BB, VEGF-B, SCF, EGF sau FGF-2 asupra creşterii celulelor

de glioblastom . Rezultatele sunt prezentate ca procent din control. Datele reprezintã medie +/- deviatie standard a

douã experimente independente.

Rezultatele semnificative statistic comparative cu controlul (p 0,005)

Este cunoscut faptul că activarea IGF-1R de către ligandul său, IGF-1, duce la activarea

receptorului, care la rândul său produce un efect anti-apoptotic în celulele maligne.

0

20

40

60

80

100

120

Control 2.5 uM 5 uM 10 uM

Pro

ce

nt

din

co

ntr

ol

1%S

10%S

0

0.5

1

1.5

2

2.5

1%S

10%S

1%S+IF

G1

1%S+PD

GF-B

B

1%S+VEG

F-B

1%S+SC

F

1%S+EG

F

1%S+FG

F-2

Fo

ld

21

Supraexpresia sau creşterea activităţii IGF-1R a fost observată în multe tipuri de cancere,

incluzând: cancer de sân (Almeida et al, 1994; Dricu et al.1999), cancer pulmonar (Cosaceanu et

al. 2007; Kiaris et al. 1999), cancer de colon (Xiao et al. 2007), cancer de prostată (Figueroa et

al. 1995), melanom (Xie et al. 1999) şi tumori gliale (Chakravarti et al. 2002). În glioblastom,

IGF-1R a fost identificat ca potenţial marker genetic (Hui et al. 2001) şi de asemeni este implicat

în rezistenţa la radio şi chimioterapie (Chakravarti et al. 2002; Carapancea et al. 2009;

Carapancea et al. 2007).

Pentru a verifica dacă efectul citotoxic al STI571 este mediat de inhibarea IGF-1R, am

studiat efectul stimulării cu IGF-1 asupra citotoxicitaţii induse de tratamentului cu STI571 în

liniile de glioblastom. Astfel, celulele au fost stimulate cu IGF-1 şi tratate cu diferite

concentraţii de STI51: 2.5 M STI571 (Figura 8a), 5 M STI571 (Figura 8b), şi 10 M STI571

(Figura 8c).

a b c

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4 5

Pro

ce

nt

din

co

ntr

ol

Componente 1 2 3 4 5

10%S +

1%S + + + +

IGF-1 + +

STI571 + +

Figura 8. Rolul stimulării cu IGF-1 asupra efectului citotoxic al tratamentului cu STI571

Rezultatele semnificative statistic fata de tratamentul cu STI571 si 1% ser (p 0,005)

Pentru a verifica dacă efectul citotoxic al STI571 este mediat de inhibarea PDGFR, am

studiat efectul stimulării cu PDGF-BB asupra citotoxicitaţii induse de tratamentului cu STI571 în

liniile de glioblastom. Astfel, celulele au fost stimulate cu PDGF-BB şi tratate cu diferite

concentraţii de STI51: 2.5 M (Figura 9a), 5 M (Figura 9b), şi 10 M (Figura 9c).

22

a b c

Componente 1 2 3 4 5

10%S +

1%S + + + +

PDGF-BB + +

STI571 + +

Figura 9. Rolul stimulării cu PDGF-BB asupra efectului citotoxic al tratamentului cu STI571

Rezultatele semnificative statistic fata de tratamentul cu STI571 si 1% ser (p 0,005)

Este, de asemenea, cunoscut faptul că activarea VEGFR de către liganzii VEGF,

activează receptorii, producând un efect mitogen. Pentru a verifica dacă efectul citotoxic al

STI571 este mediat de inhibarea VEGFR, am studiat efectul stimulării cu VEGF-B asupra

citotoxicitaţii induse de STI571 în liniile de GB. Celulele au fost stimulate cu VEGF-B şi tratate

cu diferite concentraţii de STI51: 2.5M (Fig. 10a), 5M (Fig. 10b), şi 10M (Fig. 10c).

a b c

Componente 1 2 3 4 5

10%S +

1%S + + + +

VEGF + +

STI571 + +

Figura 10. Rolul stimulării cu VEGF-B asupra efectului citotoxic al tratamentului cu STI571

Rezultatele semnificative statistic fata de tratamentul cu STI571 si 1% ser (p 0,005)

23

Ligandul SCF se leagă de receptorul c-Kit şi are ca efect activarea proteinei. Pentru a

verifica dacă efectul citotoxic al STI571 este mediat de inhibarea c-Kit, am studiat efectul

stimulării cu SCF asupra citotoxicitaţii induse de tratamentul cu STI571 în liniile de glioblastom.

Astfel, celulele au fost stimulate cu SCF şi tratate cu diferite concentraţii de STI51: 2.5 M

(Figura 11a), 5 M (Figura 11b), şi 10 M (Figura 11c).

a b c

Componente 1 2 3 4 5

10%S +

1%S + + + +

SCF + +

STI571 + +

Figura 11. Rolul stimulării cu SCF asupra efectului citotoxic al tratamentului cu STI571

Rezultatele semnificative statistic fata de tratamentul cu STI571 si 1% ser (p 0,005)

Legarea ligandului EGF de l receptorul sau, EGFR, activează acestă proteină

membranară , producând un efect mitogen. Pentru a verifica dacă efectul citotoxic al STI571 este

mediat de inhibarea EGFR, am studiat efectul stimulării cu EGF asupra citotoxicitaţii induse de

STI571 în liniile de GB. Celulele au fost stimulate cu EGF şi tratate cu diferite concentraţii de

STI51: 2.5 M (Figura 12a), 5 M (Figura 12b), şi 10 M (Figura 12c).

a b c

24

Componente 1 2 3 4 5

10%S +

1%S + + + +

EGF + +

STI571 + +

Figura 12. Rolul stimulării cu EGF asupra efectului citotoxic al tratamentului cu STI571

Rezultatele semnificative statistic fata de tratamentul cu STI571 si 1% ser (p 0,005)

Efectul mitogen al factorului FGF este mediat de receptorul său FGFR. Pentru a verifica

dacă efectul citotoxic al STI571 produce inhibarea FGFR, am studiat efectul stimulării cu FGF

asupra citotoxicitaţii induse de tratamentul cu STI571 în liniile de glioblastom. Celulele au fost

stimulate cu FGF şi tratate cu diferite concentraţii de STI51: 2.5 M (Figura 13a), 5 M (Figura

13b), şi 10 M (Figura 13c).

a b c

Componente 1 2 3 4 5

10%S +

1%S + + + +

FGF + +

STI571 + +

Figura 13. Rolul stimulării cu FGF-2 asupra efectului citotoxic al tratamentului cu STI571

Rezultatele semnificative statistic fata de tratamentul cu STI571 si 1% ser (p 0,005)

Analizând rezultatele obţinute, s-a observat că adăugarea factorilor de creştere în mediu a

dus la o creştere semnificativă a proliferării celulare de la aprox. 50% în condiţii 1%S până la

aprox. 70% în condiţii 1%S+IGF-1, fiind uşor diminuată la adăugarea agentului inhibitor STI51

până la aprox. 60%. Comparativ cu o rată a proliferării de aprox. 50% în condiţii de 1%S,

adăugarea de STI51 a condus la o scădere a proliferării până la aprox. 25%.

25

7.3. SAM induce citotoxicitate în celulele de GB printr-un mecanism independent de

IGF-1R

Studii anterioare au arătat că S-adenozil-metionina (SAM), principalul donor de grupări

metil în numeroase procese biologice, ar induce moartea celulelor canceroase prin modificarea

profilului de metilare ADN. Alte studii ştiintifice sugerează că SAM inhibă efectul mitogen al

factorilor de creştere în celulele canceroase. De asemenea, studiile noastre anterioare

demonstrează importanţa IGF-1R în supravieţuirea şi proliferarea celulelor de GB.

În acest studiu, a fost investigat efectul citotoxic indus de SAM în doua linii celulare de

GB (18 şi 38). Celulele în cultură au fost expuse timp de 7 zile la diferite concentraţii de SAM,

iar viabilitatea celulară a fost analizată prin numărarea celulelor viabile în arii marcate.

Un parametru important în determinarea dinamicii creşterii celulare este parametrul

numit “Timpul de dublare celulară” (T2). T2 arată care este timpul necesar unei diviziuni

celulare complete.

În cazul bolilor maligne, valoarea T2 este o indicaţie importanţa în prognosticul bolii şi

permite să se evalueze eficienţei medicamentelor utilizate în radio şi / sau chimioterapie. De

aceea, am determinat T2 pentru cele două linii celulare HGG (18, 38) luate în studiu., T2 a fost

determinat prin metoda regresiei liniare, utilizând mai multe puncte de timp şi prin utilizarea a

două puncte de timp. Rezultatele obţinute prin metoda regresiei liniare, arată că T2 are valoarea

79,5±5,54 pentru linia celulară 18 şi 75,25±6,02 pentru linia 38. Valorile T2 obţinute prin

metoda care ia in calcul doua puncte de timp, nu difera semnificativ de cele obtinute prin metoda

regresiei liniare, astfel: valoarea T2 pentru linia celulară 18 este 66,5±7,778, iar valoarea T2

pentru linia celulară 38 este 59,5±6,3634 (Figura 14).

y = 0,262x + 6,875R² = 0,961

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 20 40 60 80 100 120 140 160

cell

nu

mb

er

time (h)

18 HGG

y = 0,895x + 10,41R² = 0,877

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

0 20 40 60 80 100 120 140 160

cell

nu

mb

er

Time (h)

38 HGG

Figura 14. Valoarea T2 pentru liniile celulare 18 HGG şi 38 HGG

26

Efectul citotoxic indus de SAM in doua linii celulare de GB (18 si 38), a fost apoi investigat.

In urma tratamentului cu 0,1 M SAM, linia celulara 18 prezinta o usoara crestere a

viabilitatii celulare in primele 4 zile de la inceperea tratamentului, proliferarea celulara crescand

cu 7% 17 % si 5% in a doua, a treia si respectiv a patra zi de tratament. Tratamentul cu 0,1

M SAM produce inhibarea proliferarii celulare si o nesemnificativa moarte celulara a celulelor

apartinand liniei celulara 18, la 5 zile dupa tratament, acest efect persistand pana la sfarsitul

perioadei de tratament, astfel, aprox. 97% din celule au supravietuit la sfarsitul perioadei de 7

zile de tratament (Fig 33). In linia celulara 38, efectul citotoxic al tratamentului cu 0,1 M

SAM apare abia dupa 7 zile. In primele 6 zile de tratament, viabilitatea celulara creste cu 12% in

a doua zi, 19% in a treia zi, 24% in a patra zi, 27% in a cincea zi su cu 8% in a sasea zi.

Tratamentul cu 200 M SAM a produs un efect citotoxic mult mai mare in cele doua linii

celulare luate in studiu. Celulele apartinand liniei celulare 18 au supravieţuit în procent de 91%

in a doaua zi, 77% in a treia zi, 59% in a patra zi, 52% in a cincea zi, 43% in a sasea zi, iar in

utima zi a tratamentului s-a inregistrat o scadere a viabilitatii celulare cu 32%. Tratamentul cu

200 M SAM are efect citotoxic si asupra celulelor apartinand liniei celulare 38, astfel,celulele

au supravieţuit în procent de 93% in a doua zi, 85% in a treia zi, 77% in a patra zi, 70% in a

cincea zi, 59% in a sasea zi, iar numai 45% in a saptea si de tratament (Fig. 15).

TAM 0,1µM

0

20

40

60

80

100

120

140

1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d

Time (days)

% o

f C

on

tro

l

18

38

TAM 200 µM

0

20

40

60

80

100

120

1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d

Time (days)

% C

on

tro

l

18

38

Figura 15. Efectul tratamentului cu SAM asupra viabilităţii celulelor de glioblastom la concentraţiile extreme TAM

IGF-1R este un receptor tirozin kinazic, codat de către oncogena igf-1r, localizată pe

cromozomul 15q25-q26, promovând transformarea oncogenica, creşterea şi supravieţuirea

celulelor canceroase (Yu et al. 2000). Pentru explicarea citotoxicităţii observate în urma

tratamentelor cu diferite doze de SAM, s-a analizat posibilitatea ca efectul citotoxic indus de

SAM să fie cauzat de hipermetilarea oncogenei igf-1r şi inhibarea expresiei proteinei IGF-

27

1R.Rezultatele obtinute dupa tratamentul cu SAM au aratat, insa, ca aceata substanta nu are efect

asupra expresiei membranare a IGF-1R, in concentratia cea mai mare utilizata in studiu (200

µM), sugerand faptul ca efectul citotoxic indus de SAM nu este relationat cu modificarea

profilului de metilare ADN al genei igf-1r (Figura 16),

Figura 16. Efectul SAM asupra expresiei IGF-1R in liniile celulare 18 şi 38 Proteina β-actina a fost

utilizata drept control.

28

8. DISCUŢII

Studiul 1. Glioblastoamele sunt tumori cerebrale heterogene, caracterizate prin

celularitate intensă, activitate mitotică, necroză şi proliferări microvasculare. Datorită acestor

proliferări microvasculare accentuate ce nu apar în glioamele de grad mic, fiind specifice

glioamelor maligne şi în special glioblastomului, s-a concluzionat că procesele de angiogeneză şi

neoangiogeneză joacă un rol esenţial în creşterea şi invazia glioblastomului. În procesul de

neoangiogeneză un rol important îl joacă eliberarea şi mobilizarea celulelor progenitorii

endoteliale (CEP) circulante derivate din maduva hematogenă. Recent, CEP circulante izolate

din sângele periferic au atras atenţia ca posibile ţinte terapeutice. Date din diverse studii

experimentale şi clinice au arătat că utilizarea inhibitorilor angiogenezei reduce vascularizaţia şi

progresia tumorală. Conceptul apărut recent ar fi că celulele tumorale pot produce diverse

semnale moleculare ce pot elibera şi mobiliza CEP circulante produse de maduva hematogenă la

locul tumorii unde au ca scop stimularea neoangiogenezei.

CEP circulante au fost studiate în diverse tipuri de cancere: pulmonar, mamar, gastric,

ovarian, iar valorile acestora au fost depistate semnificativ crescute în sângele periferic faţă de

normal. De asemeni şi în cazul glioblastomului, studiile au arătat o creştere importantă a CEP

circulante faţă de indivizii normali.

În cadrul experimentelor realizate am încercat să determin şi să compar nivelurile de CEP

circulante din sângele periferic la pacienţi cu tumori cerebrale de grade diferite. Numărul de CEP

circulante a fost semnificativ mai mare la pacienţii cu tumori cerebrale înalt maligne

(glioblastom) comparativ cu pacienţii diagnosticaţi cu tumori cerebrale de grad mic, sugerând că

CEP circulante pot deveni un potenţial biomarker în glioblastom, dar şi o ţintă terapeutică pentru

viitoarele noi tratamente ale glioblastomului

Studiul 2. Ţinte terapeutice specifice în ţesuturile maligne sunt reprezentate şi de

receptorii tirozinkinazici şi receptorii tirozinkinazici constitutiv activi, deoarece aceste proteine

au o expresie înaltă la nivelul ţesutului malign. Multiple studii ştiinţifice au evidenţiat faptul că

glioblastoamele supraexprimă numeroşi receptori tirozinkinazici precum EGFR, PDGFR,

VEGFR, SCFR şi FGFR. Pornind de la acest concept, se poate spune că receptorii tirozinkinazici

sunt consideraţi ţinte terapeutice specifice în tratamentul glioblastomului.

STI571 (Imatinib mesylate) este un inhibitor cu moleculă mică, utilizat la aceasta oră ca

tratament în diferite forme de cancer. Mai multe studii de specialitate care au evaluat efectul

29

citotoxic al STI571 asupra celulelor tumorale în vitro, au demonstrat că acest inhibitor este mai

activ în absenţa nutrienţilor.

Datele obţinute în studiul actual sunt în concordanţă cu cele publicate de alte studii.

Rezultatele noastre arată că citotoxicitatea indusă de STI571 în celulele BT1GB a fost

dependentă de doza folosită. Concentraţia la care se obţine CI50 a fost de aproximativ 12,5 M.

Efectul citotoxic indus de tratamentul cu 1.25M STI571 a fost cu 35% mai mare în celulele

cultivate în mediu cu 1% FBS comparativ cu celulele de glioblastom cultivate în mediu cu 10%

FBS, putându-se observa deci efectul chiar de la cele mai mici concentraţii de STI571.

Se presupune că acţiunea antitumorală a STI571 este dată de inhibarea oncoproteinei

Bcr-Abl şi a receptorilor tirozinkinazici PDGF şi cKit, mecanismul de acţiune al acestei

molecule nu este însă complet cunoscut până în prezent. Studii clinice şi experimentale din

ultimii ani au arătat efectul citotoxic al STI571 poate fi influenţat de nivelul factorilor de

creştere. Este deja cunoscut faptul că tumorile cerebrale secretă o mare varietate de factori de

creştere care stimulează proliferarea, supravieţuirea, migrarea şi angiogeneza tumorală, printr-un

sistem de acţiune autocrin sau paracrin. Mai mult, cercetări recente au arătat ca potenţialul

citotoxic al STI571 este afectat de prezenţa unor factori de creştere. În conformitate cu

rezultatele publicate de alte grupuri de cercetare, rezultatele noastre arată că stimularea cu

factorii de creştere IGF-1, PDGF-BB, VEGF-B, SCF, EGF sau FGF-2 a crescut proliferarea

celulele de glioblastom de aproximativ 0.5 ori .

Inhibitorul cu moleculă mică STI571, s-a dovedit a fi mai eficient în tratamentul

glioblastomului în absenţa nutrienţilor. Concentraţia STI571 care determină un efect citotoxic de

50% la celulele fără nutrienţi este de 4 ori mai mică (aprox. 2.5 M STI571) decât cea la care se

atinge efect citotoxic de 50% în condiţii standard (aprox 12,5 M STI571).

Prezenţa factorilor de creştere în mediu are ca efect reducerea efectului citotoxic al

tratamentului cu STI571, acesta observându-se chiar de la cele mai mici concentraţii de STI571

de 2.5 M astfel: stimularea cu IGF1 a fost redusă cu 7.4%, cea cu PDGF-BB a fost redusă cu

8.8%, stimularea cu VEGF-B a fost redusă cu 6.9%, stimularea cu SCF a fost redusă cu 12.8%,

stimularea cu EGF aa fost redusă cu 7.1%, iar stimularea cu FGF-2 a fost redusă cu 7.5%.

Studiul 3. Studii anterioare au arătat ca S-adenozil-metionina (SAM), principalul donor

de grupări metil în numeroase procese biologice, ar induce moartea celulelor canceroase prin

modificarea profilului de metilare ADN. Alte studii ştiintifice sugerează, că SAM inhibă efectul

30

mitogen al factorilor de creştere în celulele canceroase. De asemenea, studiile noastre anterioare

demonstrează importanţa IGF-1R în supravietuirea şi proliferarea celulelor de GB.

În ultima parte a studiului, am analizat efectul SAM asupra celulelor de glioblastom.

Astfel, efectul indus de SAM fost investigat în două linii celulare de GB (18 şi 38), iar rezultatele

obţinute au arăt că tratamentul cu SAM este citototxic pentru ambele linii celulare investigate.

De asemenea, SAM în concentraţia cea mai mare utilizată în studiu (200 µM), nu are efect

asupra expresiei membranare a IGF-1R.

Pentru explicarea citotoxicităţii observate în urma tratamentelor cu diferite doze de SAM,

s-a analizat posibilitatea ca efectul citotoxic indus de SAM să fie cauzat de inhibarea expresiei

proteinei IGF-1R, ca urmare a efectului de hipermetilare a genei igf-1r . Rezultatele obţinute

după tratamentul cu SAM au arătat că această substanţă nu are efect asupra expresiei

membranare a IGF-1R, în concentraţia cea mai mare utilizată în studiu (200 µM), sugerând

faptul că efectul citotoxic indus de SAM nu este relaţionat cu modificarea profilului de metilare

ADN al genei igf-1r, care ar fi trebuit să se reflecte în inhibaraea trancripţiei genei şi în final, în

diminuarea cantităţii de receptor IGF-1R produsă de celulă.

31

9. CONCLUZII

Studiul 1: 1. În cazul primului experiment realizat am încercat să determinăm şi să

comparăm nivelurile de CEP circulante din sângele periferic la pacienţi cu tumori

cerebrale de grade diferite. Rezultatele obţinute conduc la concluzia că numărul de

CEP circulante este semnificativ mai mare la pacienţii cu tumori cerebrale înalt

maligne (glioblastom) comparativ cu pacienţii diagnosticaţi cu tumori cerebrale de

grad mic. Totuşi nu au fost observate diferenţe semnificative între grupurile cu tumori

de grad mic. Aceste rezultate sugerează că CEP circulante pot deveni un potenţial

biomarker în glioblastom, de asemeni CEP pot reprezenta o ţinta terapeutică pentru

viitoarele noi tratamente ale glioblastomului.

Studiul 2: 2. În urma investigării potenţialului rol al inhibitorului STI571 în

tratamentul glioblastomului, am obţinut rezultate care arată că citotoxicitatea indusă

de STI571 în celulele BT1GB a fost dependentă de doza folosită. Concentraţia la care

se obţine CI50 a fost de aproximativ 12,5 M. Efectul citotoxic indus de tratamentul

cu 1.25M STI571 a fost cu 35% mai mare în celulele cultivate în mediu cu 1% FBS

comparativ cu celulele de glioblastom cultivate în mediu cu 10% FBS, putându-se

observa deci efectul chiar de la cele mai mici concentraţii de STI571. Înhibitorul cu

moleculă mică STI571, s-a dovedit a fi mai eficient în tratamentul glioblastomului în

absenţa nutrienţilor.

3. Analizând rezultatele obţinute din experimentul în care s-a efectuat

stimularea viabilităţii celulare cu diferiţi factori de creştere (IGF1, PDGF-BB, VEGF-

B, SCF, EGF, FGF-2), am ajuns la concluzia că prezenţa factorilor de creştere în

mediu are ca efect reducerea efectului citotoxic al tratamentului cu STI571.

Studiul 3: 4. În ultimul studiu în care am evaluat efectul agentului de metilare SAM

asupra tumorilor cerebrale de grad inalt (high grade glioma, HGG) şi a interferenţei

cu expresia IGF-1R in vitro, am ajuns la concluzia că SAM induce citotoxicitate, dar

nu afectează expresia membranară a IGF-1R, sugerând faptul că efectul citotoxic

indus de SAM nu este relaţionat cu modificarea profilului de metilare ADN al genei

igf-1r.

32

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

BeierD, HauP, Proescholdt M, Lohmeier A, Wischhusen J, Oefner PJ, Aigner L,

Brawanski A, Bogdahn U, Beier CP. (2007) CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived

cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles. Cancer Res.

67(9):4010-5.

Carapancea M, Alexandru O, Fetea AS, Dragutescu L, Castro J, Georgescu A, Popa-

Wagner A, Bäcklund ML, Lewensohn R, Dricu A. (2009) Growth factor receptors signaling în

glioblastoma cells: therapeutic implications. J Neurooncol. 92(2):137-47. Epub 2008 Nov 30.

Carapancea M, Cosaceanu D, Budiu R, Kwiecinska A, Tataranu L, Ciubotaru

V, Alexandru O, Banita M, Pisoschi C, Bäcklund ML, Lewensohn R, Dricu A. (2007) Dual

targeting of IGF-1R and PDGFR inhibits proliferation în high-grade gliomas cells and induces

radiosensitivity în JNK-1 expressing cells. J Neurooncol. 85(3):245-54. Epub 2007 Jun 14.

Cosaceanu D, Carapancea M, Alexandru O, Budiu R, Martinsson HS, Starborg

M, Vrabete M, Kanter L, Lewensohn R, Dricu A. (2007) Comparison of three approaches for

inhibiting insulin-like growth factor I receptor and their effects on NSCLC cell lines in vitro.

Growth Factors. 25(1):1-8.

Chakravarti A, Loeffler JS, Dyson NJ. (2002) Insulin-like growth factor receptor I

mediates resistance to anti-epidermal growth factor receptor therapy în primary human

glioblastoma cells through continued activation of phosphoinositide 3-kinase signaling. Cancer

Res. 62(1):200-7.

Dricu A, Kanter L, Wang M, Nilsson G, Hjertman M, Wejde J, Larsson O. (1999)

Expression of the insulin-like growth factor 1 receptor (IGF-1R) în breast cancer cells: evidence

for a regulatory role of dolichyl phosphate în the transition from an intracellular to an

extracellular IGF-1 pathway. Glycobiology. 9(6):571-9

Ekstrand AJ, James CD, Cavenee WK, Seliger B, Pettersson RF, Collins VP. (1991)

Genes for epidermal growth factor receptor, transforming growth factor alpha, and epidermal

growth factor and their expression în human gliomas in vivo. Cancer Res. 51(8):2164-72.

33

Figueroa JA, Lee AV, Jackson JG, Yee D. (1995) Proliferation of cultured human

prostate cancer cells is inhibited by insulin-like growth factor (IGF) binding protein-1: evidence

for an IGF-II autocrine growth loop. J Clin Endocrinol Metab. 80(12):3476-82.

HegiME, Diserens AC, Godard S, Dietrich PY, Regli L, Ostermann S, Otten P, Van

MelleG, de TriboletN, Stupp R.(2004) Clinical trial substantiates the predictive value of O-6-

methylguanine-DNA methyltransferase promoter methylation în glioblastoma patients treated

with temozolomide. Clin Cancer Res. 10(6):1871-4

Iacob G, Constantinescu AI – Conceptii actuale de tratament în tumorile cerebrale

maligne. Conferinta nationala de neurooncologie, martie 2004.

JoensuuH, Kankaanranta L, Seppälä T, Auterinen I, Kallio M, Kulvik M, Laakso

J, Vähätalo J, Kortesniemi M, Kotiluoto P, Serén T, Karila J, Brander A, Järviluoma

E, Ryynänen P, Paetau A, Ruokonen I, Minn H, Tenhunen M, Jääskeläinen J, Färkkilä

M, Savolainen S. (2003) Boron neutron capture therapy of brain tumors: clinical trials at the

finnish facility using boronophenylalanine. J Neurooncol 62(1-2):123-34

Kalka C, Masuda H, Takahashi T, Gordon R, Tepper O, Gravereaux E, Pieczek

A, Iwaguro H, Hayashi SI, Isner JM, Asahara T. (2000) Vascular endothelial growth factor(165)

gene transfer augments circulating endothelial progenitor cells în human subjects. Circ

Res. 86(12):1198-202.

Kiaris H, Schally AV, Varga JL, Groot K, Armatis P. (1999) Growth hormone-releasing

hormone: an autocrine growth factor for small cell lung carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S

A. 96(26):14894-8.

LaperriereN, Zuraw L, Cairncross G; Cancer Care Ontario Practice Guidelines Initiative

Neuro-Oncology Disease Site Group. (2002) Radiotherapy for newly diagnosed malignant

glioma în adults: a systematic review. Radiother Oncol 64(3):259-73.

Lönn S, Klaeboe L, Hall P, Mathiesen T, Auvinen A, Christensen HC, Johansen

C, Salminen T, Tynes T, Feychting M. (2004) Incidence trends of adult primary intracerebral

tumors în four Nordic countries. Int J Cancer. 108(3):450-5.

Louis DN, Ohgaki H, Wiestler OD, Cavenee WK, Burger PC, Jouvet A, Scheithauer

BW, Kleihues P. (2007) The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system.

Acta Neuropathol. 114(2):97-109.

34

Louis DN, von DeimlingA. (1995) Hereditary tumor syndromes of the nervous system:

overview and rare syndromes. Brain Pathol. 5(2):145-51.

OhgakiH, Kleihues P. (2005) Epidemiology and etiology of gliomas.

ActaNeuropathol. 109(1):93-108.

OhgakiH, Kleihues P. (2007) Genetic pathways to primary and secondary glioblastoma.

Am J Pathol. 170(5): 1445-53.

Peichev M, Naiyer AJ, Pereira D, Zhu Z, Lane WJ, Williams M, Oz MC, Hicklin

DJ, Witte L, Moore MA, Rafii S. (2000) Expression of VEGFR-2 and AC133 by circulating

human CD34(+) cells identifies a population of functional endothelial precursors.

Blood. 95(3):952-8.

PradosMD, Wara WM, Sneed PK, McDermott M, Chang SM, Rabbitt J, Page M, Malec

M, Davis RL, Gutin PH, Lamborn K, Wilson CB, Phillips TL, Larson DA. (2001) Phase III trial

of accelerated hyperfractionation with or without difluromethylornithine (DFMO) versus

standard fractionated radiotherapy with or without DFMO for newly diagnosed patients with

glioblastoma multiforme. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 49(1):71-7.

Schulenburg A, Ulrich- PurH, Thurnher D, Erovic B, Florian S, Sperr WR, Kalhs P,

Marian B, WrbaF, Zielinski CC, Valent P. (2006) Neoplastic stem cells: a novel therapeutic

target în clinical oncology. Cancer. 107(10):2512-20.

Shinkaruk S, Bayle M, Laïn G, Déléris G. (2003) Vascular endothelial cell growth factor

(VEGF), an emerging target for cancer chemotherapy. Curr Med Chem Anticancer Agents; 3(2):

95-117

Stewart LA. (2002)Chemotherapy în adult high-grade glioma: a systematic review and

meta-analysis of individual patient data from 12 randomised trials. Lancet. 359(9311):1011-8.

StuppR, Pavlidis N, Jelic S. (2005) ESMO Minimum Clinical Recommendations for

diagnosis, treatment and follow-up of malignant glioma. Ann Oncol 16Suppl 1:i64-5

Xiao XY, Zhou XY, Yan G, Sun MH, Du X. (2007) Chromosomal alteration în Chinese

sporadic colorectal carcinomas detected by comparative genomic hybridization. Diagn Mol

Pathol. 16(2):96-103.

35

Xie Y, Skytting B, Nilsson G, Brodin B, Larsson O. (1999) Expression of insulin-like

growth factor-1 receptor în synovial sarcoma: association with an aggressive phenotype. Cancer

Res. 59(15):3588-91

Yu H, Rohan T. (2000) Role of the insulin-like growth factor family în cancer

development and progression. J Natl Cancer Inst. 92(18):1472-89.