Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

76
Universitatea de Medicină şi Farmacie “Gr.T.Popa” Iaşi Facultatea de Farmacie Disciplina de Chimie analitică REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin separare cromatografică şi confirmare spectrală, folosind o librărie de spectre pentru o anumită fază mobilă CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC, Prof. univ. dr. Vasile DORNEANU DOCTORAND, Ing. chim. Jean NEGRU IAŞI 2011

Transcript of Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

Page 1: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

Universitatea de Medicină şi Farmacie “Gr.T.Popa” Iaşi

Facultatea de Farmacie Disciplina de Chimie analitică

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin separare cromatografică şi

confirmare spectrală, folosind o librărie de spectre pentru o anumită fază mobilă

CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC, Prof. univ. dr. Vasile DORNEANU

DOCTORAND, Ing. chim. Jean NEGRU

IAŞI 2011

Page 2: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...
Page 3: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

Universitatea de Medicină şi Farmacie “Gr.T.Popa” Iaşi

Facultatea de Farmacie Disciplina de Chimie analitică

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin separare cromatografică şi

confirmare spectrală, folosind o librărie de spectre pentru o anumită fază mobilă

CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC, Prof. univ. dr. Vasile DORNEANU

DOCTORAND, Ing. chim. Jean NEGRU

IAŞI 2011

Page 4: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...
Page 5: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

i

CUPRINS TEZĂ

CUPRINS 2 INTRODUCERE 8 Scopul şi obiectivele tezei de doctorat 9 CAPITOLUL 1. GENERALITĂŢI. STRUCTURĂ CHIMICĂ. PROPRIETĂŢI CHIMICE ŞI FARMACOLOGICE. 10 1.1. Generalităţi 10 1.2. Mecanismele inflamaţiei 10 1.3. Tratamentul inflamaţiei 11 1.4. Clasificarea AINS 12 1.4.1. Reprezentanţi 12 1.5. Relaţia structură – activitate biologică 14 1.6. Aspecte farmacologice generale 15 1.6.1. Farmacocinetică 15 1.6.2. Farmacodinamie 16 1.6.3. Farmacotoxicologie 16 1.6.4. Farmacoterapie 17 1.7. Reprezentanţi 17 1.7.1. Nimesulid 17 1.7.1.1. Nomenclatură şi structură 17 1.7.1.2. Proprietăţi fizico – chimice 18 1.7.2. Meloxicam 19 1.7.2.1. Nomenclatură şi structură 19 1.7.2.2. Proprietăţi fizico – chimice 19 1.7.3. Piroxicam 19

1.7.3.1. Nomenclatură şi structură 19 1.7.3.2. Proprietăţi fizico - chimice 19 1.7.4. Tenoxicam 20 1.7.4.1. Nomenclatură şi structură 20 1.7.4.2. Proprietăţi fizico – chimice 20 1.7.5. Ibuprofen 21 1.7.5.1. Nomenclatură şi structură 21 1.7.5.2. Proprietăţi fizico – chimice 21 1.7.6. Indometacin 22 1.7.6.1. Nomenclatură şi structură 22 1.7.6.2. Proprietăţi fizico – chimice 22 1.7.7. Diclofenac sodic 22 1.7.7.1. Nomenclatură şi structură 22 1.7.7.2. Proprietăţi fizico – chimice 22 1.7.8. Ketoprofen 23 1.7.8.1. Nomenclatură şi structură 23

Page 6: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

ii

1.7.8.2. Proprietăţi fizico – chimice 23 1.7.9. Ketorolac 23 1.7.9.1. Nomenclatură şi structură 23 1.7.9.2. Proprietăţi fizico – chimice 23 1.7.10. Fenilbutazonă 23 1.7.10.1. Nomenclatură şi structură 23 1.7.10.2. Proprietăţi fizico – chimice 24

CAPITOLUL 2. ABSORBŢIA LUMINII DE CĂTRE COMPUŞII ORGANICI25 2.1. Originea spectrului UV-VIS 25 2.2. Principiile spectrometriei de absorbţie 27 2.2.1. Legea Lambert - Beer 27 2.2.2. Deviaţii de la legea absorbţiei 28 2.2.3. Sumarea absorbanţelor 28 2.2.4. Spectre derivate 29 2.2.5. Acurateţea fotometrică 31 2.2.6. Absorbţia selectivă a luminii 33 2.2.7. Modificări induse de substituenţi în spectrele UV ale substanţelor organice 34 2.2.8. Efectul conjugării asupra spectrelor UV-VIS ale substanţelor organice 34 2.2.9. Deplasări spectrale cauzate de solvent 35 2.3. Aplicaţii ale spectrelor UV-VIS în analiza calitativă 37 2.3.1. Confirmarea identităţii 37 2.3.2. Detecţia în UV–VIS cuplată cu HPLC 38 2.3.2.1. Determinarea lungimii de undă optime de detecţie 39 2.3.2.2. Biblioteci de spectre 42 2.3.3. Identificarea compuşilor separaţi prin tehnica HPLC 42 2.3.3.1. Identificarea prin căutarea în biblioteca de spectre 42 2.3.3.2. Analiza compusului ţintă utilizând un tabel de calibrare 43 2.3.3.3. Analiza compuşilor ţintă utilizând o bibliotecă spectrală 43 2.3.4. Puritatea picului cromatografic 44 2.3.4.1. Tehnici de determinare a purităţii picului 45 2.3.4.2. Curba factorului de prag 46 2.3.4.3. Clasificarea unui pic din cromatogramă ca fiind pur sau impur 47 CAPITOLUL 3. ANALIZA AINS PRIN CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE ÎNALTĂ PERFORMANŢĂ (HPLC) 49 3.1. Generalităţi în cromatografia de lichide 49 3.2. Coloanele cromatografice pentru RP-LC 50 3.3. Aplicaţii ale metodelor HPLC în analiza medicamentelor 51 3.4. Studiu bibliografic 51

Page 7: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

iii

CAPITOLUL 4. EVALUAREA REZULTATELOR – VALIDAREA METODELOR DE ANALIZĂ 57 4.1. Generalităţi 57 4.2. Specificitatea / Selectivitatea 58 4.3. Stabilirea lungimii de undă de detecţie 58 4.4. Identificarea picului corespunzător analitului 58 4.5. Verificarea purităţii picului 60 4.6. Liniaritatea 61 4.6.1. Liniaritatea funcţiei de răspuns 61 4.6.2. Calibrarea răspunsului detectorului 62 4.6.3. Liniaritatea rezultatelor 63 4.7. Limita de detecţie şi limita de cuantificare 63 4.7.1. Limita de detecţie 63 4.7.2. Limita de cuantificare 64 4.8. Intervalul (domeniul) de lucru 65 4.9. Precizia şi exactitatea 65 4.9.1. Precizia 65 4.9.1.1. Repetabilitatea 67 4.9.1.2. Precizia intermediară 67 4.9.1.3. Reproductibilitatea 68 4.9.2. Acurateţea (Exactitatea) 68 4.10. Robusteţea şi stabilitatea metodei 69 CAPITOLUL 5. ALEGEREA PARAMETRILOR METODEI DE SEPARARE A AMESTECULUI DE AINS 70 5.1. Studiu bibliografic 70 5.1.1. Metode HPLC pentru analiza Meloxicamului (MEL) 70 5.1.2. Metode HPLC pentru analiza Nimesulidului (NIM) 71 5.1.3. Metode HPLC pentru analiza Diclofenacului sodic (DIC) 72 5.1.4. Metode HPLC pentru analiza Ibuprofenului (IBP) 73 5.1.5. Metode HPLC pentru analiza Ketorolacului (KET) 74 5.2. Material şi metodă 74 5.3. Studiul caracteristicilor fizico-chimice 75 5.4. Optimizarea lungimilor de undă pentru detecţia AINS 76 5.5. Selecţia lungimii de undă adecvate detecţiei în UV-VIS 81 5.6. Construcţia bibliotecii de spectre individuale 85 5.7. Influenţa debitului fazei mobile asupra separării AINS 88 5.8. Influenţa compoziţiei fazei mobile 90 5.9. Influenţa pH-lui fazei mobile apoase asupra separării 92 5.10. Condiţii finale de separare a amestecului de AINS prin HPLC 93 5.11. Alegerea lungimilor de undă pentru detecţia AINS în UV-VIS 94 5.12. Condiţii finale de determinare a AINS prin HPLC 102

Page 8: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

iv

CAPITOLUL 6. VALIDAREA ANALITICĂ A METODELOR CANTITATIVE PENTRU DETERMINAREA AINS 103 6.1. Caracteristici comune 103 6.2. Validarea metodei HPLC pentru determinarea MEL 103 6.2.1. Stabilirea lungimii de undă de detecţie 104 6.2.2. Identificarea picului corespunzător MEL 104 6.2.3. Linearitatea 106 6.2.4. Date statistice 108 6.2.5. LOD şi LOQ 110 6.2.6. Precizia 110 6.2.6.1. Repetabilitatea 110 6.2.6.2. Precizia intermediară 112 6.2.6.3. Exactitatea (acurateţea) 114 6.2.7. Concluzii referitoare la determinarea MEL prin HPLC 115 6.3. Validarea metodei HPLC pentru determinarea PIR 115 6.3.1. Stabilirea lungimii de undă de detecţie 116 6.3.2. Identificarea picului corespunzător PIR 116 6.3.3. Linearitatea 118 6.3.4. Date statistice 119 6.3.5. LOD şi LOQ 121 6.3.6. Precizia 122 6.3.6.1. Repetabilitatea 122 6.3.6.2. Precizia intermediară 124 6.3.6.3. Exactitatea (acurateţea) 125 6.3.7. Concluzii referitoare la determinarea MEL prin HPLC 126 6.4. Validarea metodei HPLC pentru determinarea TEN 127 6.4.1. Stabilirea lungimii de undă de detecţie 127 6.4.2. Identificarea picului corespunzător TEN 128 6.4.3. Linearitatea 129 6.4.4. Date statistice 131 6.4.5. LOD şi LOQ 133 6.4.6. Precizia 133 6.4.6.1. Repetabilitatea 133 6.4.6.2. Precizia intermediară 136 6.4.6.3. Exactitatea (acurateţea) 137 6.4.7. Concluzii referitoare la determinarea TEN prin HPLC 138 6.5. Validarea metodei HPLC pentru determinarea NIM 139 6.5.1. Stabilirea lungimii de undă de detecţie 139 6.5.2. Identificarea picului corespunzător NIM 139 6.5.3. Linearitatea 141 6.5.4. Date statistice 143 6.5.5. LOD şi LOQ 145 6.5.6. Precizia 145 6.5.6.1. Repetabilitatea 145 6.5.6.2. Precizia intermediară 147 6.5.6.3. Exactitatea (acurateţea) 149

Page 9: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

v

6.5.7. Concluzii referitoare la determinarea NIM prin HPLC 150 6.6. Validarea metodei HPLC pentru determinarea IBP 151 6.6.1. Stabilirea lungimii de undă de detecţie 151 6.6.2. Identificarea picului corespunzător IBP 151 6.6.3. Linearitatea 153 6.6.4. Date statistice 154 6.6.5. LOD şi LOQ 157 6.6.6. Precizia 157 6.6.6.1. Repetabilitatea 157 6.6.6.2. Precizia intermediară 159 6.6.6.3. Exactitatea (acurateţea) 161 6.6.7. Concluzii referitoare la determinarea IBP prin HPLC 162 6.7. Validarea metodei HPLC pentru determinarea IND 162 6.7.1. Stabilirea lungimii de undă de detecţie 163 6.7.2. Identificarea picului corespunzător IND 163 6.7.3. Linearitatea 165 6.7.4. Date statistice 166 6.7.5. LOD şi LOQ 168 6.7.6. Precizia 169 6.7.6.1. Repetabilitatea 169 6.7.6.2. Precizia intermediară 171 6.7.7.3. Exactitatea (acurateţea) 172 6.7.7. Concluzii referitoare la determinarea IND prin HPLC 173 6.8. Validarea metodei HPLC pentru determinarea DIC 174 6.8.1. Stabilirea lungimii de undă de detecţie 174 6.8.2. Identificarea picului corespunzător DIC 174 6.8.3. Linearitatea 176 6.8.4. Date statistice 178 6.8.5. LOD şi LOQ 180 6.8.6. Precizia 180 6.8.6.1. Repetabilitatea 180 6.8.6.2. Precizia intermediară 183 6.8.6.3. Exactitatea (acurateţea) 184 6.8.7. Concluzii referitoare la determinarea DIC prin HPLC 185 6.9. Validarea metodei HPLC pentru determinarea KTP 186 6.9.1. Stabilirea lungimii de undă de detecţie 186 6.9.2. Identificarea picului corespunzător KTP 186 6.9.3. Linearitatea 188 6.9.4. Date statistice 190 6.9.5. LOD şi LOQ 192 6.9.6. Precizia 192 6.9.6.1. Repetabilitatea 192 6.9.6.2. Precizia intermediară 194 6.9.6.3. Exactitatea (acurateţea) 196 6.9.7. Concluzii referitoare la determinarea KTP prin HPLC 197 6.10. Validarea metodei HPLC pentru determinarea KET 198

Page 10: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

vi

6.10.1. Stabilirea lungimii de undă de detecţie 198 6.10.2. Identificarea picului corespunzător KET 198 6.10.3. Linearitatea 200 6.10.4. Date statistice 201 6.10.5. LOD şi LOQ 204 6.10.6. Precizia 204 6.10.6.1. Repetabilitatea 204 6.10.6.2. Precizia intermediară 206 6.10.6.3. Exactitatea (acurateţea) 208 6.10.7. Concluzii referitoare la determinarea KET prin HPLC 208 6.11. Validarea metodei HPLC pentru determinarea FB 210 6.11.1. Stabilirea lungimii de undă de detecţie 210 6.11.2. Identificarea picului corespunzător FB 210 6.11.3. Linearitatea 210 6.11.4. Date statistice 214 6.11.5. LOD şi LOQ 215 6.11.6. Precizia 216 6.11.6.1. Repetabilitatea 216 6.11.6.2. Precizia intermediară 218 6.11.6.3. Exactitatea (acurateţea) 220 6.11.7. Concluzii referitoare la determinarea FB prin HPLC 221 CAPITOLUL 7. DETERMINAREA AINS DIN FORME FARMACEUTICE 222 7.1. Determinarea MEL din comprimate prin HPLC 222 7.1.1. Determinarea uniformităţii masei 222 7.1.2. Prepararea soluţiei de lucru 222 7.2. Determinarea PIR din comprimate prin HPLC 223 7.2.1. Determinarea uniformităţii masei 223 7.2.2. Prepararea soluţiei de lucru 223 7.3. Determinarea TEN din comprimate prin HPLC 225 7.3.1. Determinarea uniformităţii masei 225 7.3.2. Prepararea soluţiei de lucru 225 7.4. Determinarea NIM din comprimate prin HPLC 226 7.4.1. Determinarea uniformităţii masei 226 7.4.2. Prepararea soluţiei de lucru 227 7.5. Determinarea IBP din capsule prin HPLC 228 7.5.1. Determinarea uniformităţii masei 228 7.5.2. Prepararea soluţiei de lucru 229 7.6. Determinarea IND prin HPLC din capsule 230 7.6.1. Determinarea uniformităţii masei 230 7.6.2. Prepararea soluţiei de lucru 230 7.7. Determinarea DIC din comprimate prin HPLC 232 7.7.1.Determinarea uniformităţii masei 232 7.7.2. Prepararea soluţiei de lucru 232 7.8. Determinarea KTP prin HPLC din capsule 233 7.8.1. Determinarea uniformităţii masei 233

Page 11: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

vii

7.8.2. Prepararea soluţiei de lucru 233 7.9. Determinarea KET trometamină din comprimate prin HPLC 235 7.9.1. Determinarea uniformităţii masei 235 7.9.2. Prepararea soluţiei de lucru 235 CAPITOLUL 8. METODĂ HPLC RAPIDĂ PENTRU DOZAREA KETOPROFENULUI DIN PLASMA UMANĂ 237 8.1. Introducere şi obiective 237 8.2. Material şi metodă 237 8.2.1. Soluţiile etalon 237 8.2.2. Echipamentul 238 8.2.3 Soluţii stoc, soluţii de lucru, soluţii de control 238 8.2.4. Pregătirea probei 238 8.2.5. Validarea metodei 238 8.3. Rezultate şi discuţii 239 8.3.1. Studiu bibliografic 239 8.3.2. Metoda HPLC de testare 239 8.3.3. Validarea metodei 240 8.4. Concluzii 242 CAPITOLUL 9. BIBLIOGRAFIE 243 CONCLUZII GENERALE 252 ANEXE 255

Page 12: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

viii

Page 13: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

1

INTRODUCERE

Antiinflamatoarele nesteroidiene (AINS) reprezintă o clasă de medicamente care cuprinde numeroase substanţe active cu structură chimică variată, dar care au efecte comune: analgezic, antipiretic, antiinflamator.

Mecanismul de acţiune principal al AINS este reprezentat de blocarea ciclooxigenazei (COX), cu inhibarea sintezei de mediatori proinflamatori (leucotriene - LT, tromboxan - TX, prostaglandine - PG). Formarea mediatorilor proinflamatori porneşte de la hidrolizarea glicerofosfolipidelor membranare, sub acţiunea fosfolipazei A2 – PLA2 (dar şi a PLC), care duce la formarea de acid arahidonic. Acidul arahidonic este ulterior metabolizat pe 2 căi: cea a ciclooxigenazei (COX) şi cea a lipooxigenazei (LOX). COX catalizează ciclizarea oxidativă a acidului arahidonic, cu formarea precursori ai prostaglandinelor şi tromboxanilor. Acţiunea LOX asupra acidului arahidonic determină formare de hidroperoxizi (HPETE), din care se vor sintetiza ulterior LT. Toţi aceşti mediatori proinflamatori –PG, LT, TX – sunt grupate sub denumirea de eicosanoide.

Prin blocarea COX, AINS blochează formarea de PG, ceea ce explică efectul lor antiinflamator, analgezic şi antipiretic (inflamaţia, durerea şi febra fiind mediate de PG la nivelul ţesuturilor inflamatorii, nociceptorilor şi respectiv hipotalamusului).

Majoritatea AINS sunt inhibitori neselectivi ai COX, ceea ce reprezintă un dezavantaj deoarece inhibarea COX-1 duce la apariţia de efecte adverse. În ultimele decenii au fost sintetizaţi şi inhibitori selectivi de COX-2 (coxibi), care prezintă mai puţine reacţii adverse digestive, dar nu au efecte antiagregante plachetare.

Pentru separarea, identificarea şi determinarea cantitativă a medicamentelor AINS există numeroase metode de analiză, dar marea majoritate se referă la determinarea unuia singur sau a unui număr restrâns de componenţi.

Page 14: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

2

Scopul şi obiectivele tezei de doctorat Scopul acestei lucrări este de a realiza, valida şi aplica în

practică o metodă unică de determinare cantitativă pentru unele AINS (meloxicam, piroxicam, tenoxicam, nimesulid, ibuprofen, indometacin, diclofenac, ketoprofen, ketorolac, fenilbutazonă) prin cromatografie de lichide de înaltă performanţă.

Obiectivele propuse în cadrul acestui studiu sunt:

1) Efectuarea unui studiu a literaturii de specialitate referitoare la metodele de determinare cantitativă a AINS luate în studiu;

2) Elaborarea metodei de analiză cantitativă prin cromatografie de lichide de înaltă performanţă pentru determinarea AINS studiate astfel încât performanţele metodei analitice să fie maxime (selectivitate, sensibilitate, precizie, exactitate etc.), dar în acelaşi timp metoda să fie cât mai rapidă;

3) Validarea metodelor de analiză a medicamentelor, în conformitate cu reglementările naţionale şi europene; în acest sens vor fi verificaţi o serie de parametri precum: liniaritatea, selectivitatea, precizia, exactitatea, limita de detecţie şi limita de cuantificare. Pentru fiecare metodă validată va fi realizat un raport de validare, în care vor fi consemnate toate caracteristicile şi performanţele metodei analitice

4) Aplicarea metodelor analitice în controlul medicamentelor.

Adaptarea metodologiei pentru determinarea substanţelor medicamentoase din formele farmaceutice introduse în terapie.

Precizăm că numerotarea tabelelor şi figurilor este identică cu

cea din teză de doctorat integrală, cu excepţia tabelelor de date comparative ale rezultatelor validării metodei pentru toate AINS-urile studiate şi ale determinării acestora din forme farmaceutice, care sunt prezentate doar în rezumatul lucrării de doctorat (şi care prezintă litera „R” alături de numărul de ordine)

Page 15: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

3

CAPITOLUL 1. GENERALITĂŢI. STRUCTURĂ CHIMICĂ. PROPRIETĂŢI

CHIMICE ŞI FARMACOLOGICE

Capitolul cuprinde generalităţi privind antiinflamatoarele nesteroidiene (AINS), mecanismele inflamaţiei şi tratamentul acesteia, clasificarea AINS, relaţia structură – activitate biologică, aspecte farmacologice generale, reprezentanţi (descriere generală – structură şi unele proprietăţi fizico - chimice).

CAPITOLUL 2. ABSORBŢIA LUMINII DE CĂTRE COMPUŞII ORGANICI

Capitolul 2 prezintă aspecte privind originea spectrelor UV – VIS, principiile spectrometriei de absorbţie (legea Lambert Beer, deviaţii de la legea absorbţiei, sumarea absorbanţelor, spectre derivate, acurateţea fotometrică, absorbţia selectivă a luminii, modificări induse de substituenţi în spectrele UV – VIS ale substanţelor organice, efectul conjugării asupra spectrelor UV – VIS ale substanţelor organice, deplasări spectrale cauzate de solvent), aplicaţiile spectrelor UV – VIS în analiza calitativă (confirmarea identităţii, detecţia în UV – VIS cuplată cu HPLC – determinarea lungimii de undă optime de detecţie biblioteci de spectre; identificarea compuşilor separaţi prin tehnica HPLC – identificarea prin căutări în biblioteci de spectre, analiza compusului ţintă utilizând un tabel de calibrare, analizarea compuşilor ţintă utilizând o bibliotecă spectrală, puritatea picului cromatografic – tehnici de determinare a purităţii picului, curba factorului de prag, clasificarea unui pic din cromatogramă ca fiind impur).

Page 16: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

4

CAPITOLUL 3. ANALIZA AINS PRIN CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE

ÎNALTĂ PERFORMANŢĂ (HPLC)

Cromatografia de lichide (LC) sau cromatografia de lichide de înaltă performanţă (HPLC) este una dintre tehnicile cele mai folosite în prezent la separarea constituenţilor unui amestec de substanţe. În teza de doctorat sunt prezentate sumar unele dintre cele mai importante metode de analiză prin cromatografie de lichide de înaltă performanţă (HPLC). Se constată faptul că marea majoritate a metodelor de determinare a AINS prin HPLC folosesc ca fază staţionară coloane de tipul C18 (în diverse variante constructive – lungime, diametru intern, mărimea particulelor). Ca fază mobilă se folosesc amestecuri de solvenţi formate în principal din MeOH, ACN sau ambele împreună apă sau cu soluţii apoase a unor săruri (acetat de sodiu, acetat de amoniu, fosfat monosodic, fosfat monopotasic etc.) aduse la valori diverse ale pH-ului cu acizi cum sunt acidul formic, acidul acetic, acidul fosforic. Metodele prezentate lucrează în modul izocrat sau în gradient, în funcţie de numărul şi tipul de componenţi separaţi. În ceea ce priveşte sistemele de detecţie, marea majoritate a metodelor folosesc spectrofotometria în UV, la valori ale lungimii de undă corespunzătoare maximelor de absorbţie, sau la valori intermediare corespunzător maximelor de absorbţie a componentelor separate. În alte metode se foloseşte ca sistem de detecţie spectrometria de masă, fluorescenţa sau detecţia electrochimică.

Metodele prezentate sunt utilizate pentru determinarea AINS din diverse matrici (forme farmaceutice sau medii biologice). În cazul determinărilor din medii biologice (urină, ser, plasmă, ţesut) se folosesc diferite variante de purificare a probei (extracţie în fază solidă, extracţie în fază lichidă – folosind ca sisteme de extracţie diverşi solvenţi cum sunt eterul, cloroformul, diclormetanul etc. – sau deproteinizarea simplă cu ACN, MeOH sau acizi – acid percloric, acid tricloracetic etc.).

Page 17: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

5

CAPITOLUL 4. EVALUAREA REZULTATELOR – VALIDAREA

METODELOR DE ANALIZĂ

Validarea metodelor analitice este o problemă importantă în analiza medicamentelor, ce trebuie rezolvată în conformitate cu reglementările organismelor internaţionale de reglementare, cum ar fi Food and Drug Administration (FDA), European Medicines Agency (EMEA) şi International Conference of Harmonization (ICH). Procesul de validare confirmă că procedura de analiză utilizată este adecvată pentru scopurile prestabilite şi demonstrează fiabilitatea rezultatelor obţinute. Prin urmare, validarea metodei este esenţială în analiza medicamentelor.

În laboratoarele de analiză, validarea are la bază standarde, cum ar fi: Bunele practici de producţie (Good Manufacturing Practices - cGMP), Bunele practici de laborator (Good Laboratory Practices - GLP), Bunele practici clinice (Good Clinical Practices - GCP) etc. Există şi alte condiţii necesare privind calitatea şi acreditarea standardelor prevăzute de Organizaţia Internaţională a Standardelor (International Standards Organization - ISO) seriile 9000 şi 17025, Normele Europene (European Norm - EN 45001), Agenţia de Protecţie a Mediului (Environmental Protection Agency – EPA), FDA etc.

Pentru instituirea unei metode de analiză se au în vedere, de regulă, următorii parametri:

(a) Specificitatea / Selectivitatea; (b) Linearitatea; (c) Limita de detecţie (LOD); (d) Limita de cuantificare (LOQ); (e) Intervalul (domeniul de lucru); (f) Precizia (repetabilitatea şi precizia intermediară); (g) Acurateţea (h) Stabilitatea şi robusteţea.

Page 18: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

6

CONTRIBUŢIE ORIGINALĂ

CAPITOLUL 5. ALEGEREA PARAMETRILOR METODEI DE SEPARARE

A AMESTECULUI DE AINS

În literatura de specialitate nu există o singură metodă cromatografică de separare şi determinare cantitativă pentru AINS. Unele dintre metodele publicate descriu separări de amestecuri de AINS sau AINS împreună cu substanţe medicamentoase din alte clase terapeutice, însă majoritatea separărilor publicate sunt optimizate pentru fiecare compus în parte. Aplicaţiile descrise se pot împărţi în câteva categorii, şi anume: dozarea AINS din materii prime farmaceutice, dozarea AINS din forme farmaceutice, dozarea AINS din probe biologice (în special sânge, plasmă, urină).

În acest capitol, vom prezenta modalitatea de elaborare a metodei pentru separarea unui amestec de AINS prin HPLC. Ne vom axa în principal pe variaţiile spectrale şi ale ariilor picurilor obţinute ce apar în urma modificării unor parametri de lucru, cum sunt debitul şi compoziţia fazei mobile. Un număr de 10 AINS din diverse clase chimice fac obiectul prezentei cercetări, având drept scop crearea unei metode simple de separare cromatografică din amestec (metoda de „screening”), precum şi a validării acestei metode sau a unor alternative optimizate pentru determinări cantitative individuale ale acestora. S-a urmărit crearea unei metode capabile să ruleze pe un sistem cromatografic uzual, având un detector economic (de tip UV-VIS) şi implicând o coloană de separare dintre cele mai răspândite, cum este coloana cu fază staţionară C18.

Cele 10 AINS luate în studiu sunt: 1. Nimesulid – abreviat NIM, obţinut ca donaţie prin amabilitatea S.C. Labormed-Pharma S.A., lot nr. 07000047, produs în 03.2007, valabil până în 03.2010.

Page 19: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

7

2. Meloxicam – abreviat MEL, obţinut ca donaţie prin amabilitatea S.C. Labormed-Pharma S.A., lot nr. ROMXE/80606, produs în 08.2008, valabil până în 05.2012. 3. Piroxicam – abreviat PIR, obţinut ca donaţie prin amabilitatea S.C. Labormed-Pharma S.A., lot nr. PRX2009115, produs în 10.2009, valabil până în 10.2012. 4. Tenoxicam – abreviat TEN, obţinut ca donaţie prin amabilitatea S.C. Labormed-Pharma S.A., lot nr. 920060508, produs în 06.2008, valabil până în 06.2013. 5. Ibuprofen – abreviat IBU, obţinut ca donaţie prin amabilitatea S.C. Terapia Ranbaxy S.A., lot nr. IBU0708801, produs în 08.2007, valabil până în 07.2012. 6. Indometacin – abreviat IND, obţinut ca donaţie prin amabilitatea S.C. Fiterman Pharma S.A., lot nr. T09-104, produs în 08.2009, valabil până în 07.2013. 7. Diclofenac Sodiu – abreviat DIC, obţinut ca donaţie prin amabilitatea S.C. Terapia Ranbaxy S.A., lot nr. 100806-2, produs în 08.2010, valabil până în 08.2014. 8. Ketoprofen – abreviat KTP, obţinut ca donaţie prin amabilitatea S.C. Terapia Ranbaxy S.A., lot nr. 149.530, produs în 01.2009, valabil până în 01.2014. 9. Ketorolac – abreviat KET, obţinut ca donaţie prin amabilitatea S.C. Terapia Ranbaxy S.A., lot nr. ABDH006236, produs în 11.2010, valabil până în 10.2013. 10. Fenilbutazonă – abreviat FB, obţinut ca donaţie prin amabilitatea S.C. Fiterman Pharma S.A., lot nr. BTZ 2008351, produs în 07.2008, valabil până în 07.2011.

Pentru a putea concepe metoda de separare dorită, se vor

folosi informaţiile despre parametrii fizico-chimici disponibile în literatura de specialitate, precum şi experienţa proprie acumulată în cadrul Laboratorului de Cromatografie, Facultatea de Farmacie, Universitatea de Medicină şi Farmacie “Gr. T. Popa” Iaşi.

Urmărind informaţiile relevante pentru separarea cromatografică, şi anume: solubilitatea, caracterul lipofil/hidrofil (nepolar sau polar), caracterul acid, bazic sau neutru, ale moleculelor luate în studiu, şi bazându-ne pe datele din literatura de specialitate, am considerat adecvat să alegem ca modalitate de lucru separarea cromatografică pe fază staţionară inversă (coloană C18), folosind

Page 20: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

8

drept fază mobilă un amestec de MeOH, ACN şi apă sau soluţie tampon acetat, cu detecţie în UV.

După valorile coeficientului de partiţie octanol/apă (logP) citate în literatura de specialitate şi determinate experimental pentru mediu neutru (pH = 7,4) se poate observa cum aceste substanţe se „grupează” în jurul a două valori: 1 (TEN, KTP, KET) şi 3,7 (FB, IBP, IND, DIC). Celelalte trei AINS, respectiv NIM, MEL şi PIR au valori diferite şi împrăştiate între cele două grupuri. Apropierile remarcate conduc la predicţia că analiţii fiecăruia din cele două grupuri, dacă se găsesc împreună în amestec, vor fi foarte greu de separat în condiţii de eluţie izocrată.

Solubilitatea AINS luate în studiu este mai mare în solvenţi polari (metanol, etanol) decât în apă. Având în vedere faptul că spectrul de absorbţie al unei substanţe poate suferi diverse modificări (deplasare batocromă sau hipsocromă, efect hipercromic sau hipocromic), am considerat necesar ca, în ceea ce priveşte alegerea compoziţiei finale a fazei mobile, primul pas să îl constituie studiul spectrelor de absorbţie a antiinflamatoarelor în diverşi solvenţi.

Pentru aceasta, au fost preparate soluţii de concentraţie aproximativă de 0,01mg/mL, în câteva variante de solvent: apă, MeOH, ACN şi soluţie apoasă tamponată (tampon acetat) de pH = 5. Concentraţia de 0,01mg/mL este astfel aleasă încât să permită dizolvarea tuturor AINS şi în apă. După prepararea soluţiilor de lucru, s-a trecut la măsurarea extincţiei în UV-VIS folosind un Spectrofotometru UV-VIS Agilent Technologies, model 8453, Germania. Măsurătorile spectrale şi de absorbanţă (extincţie) au fost efectuate pe domeniul 190 – 500nm, deoarece unele dintre AINS luate în lucru absorb radiaţie luminoasă şi în zona spectrală VIS.

Pentru exemplificare, prezentăm spectrul pentru TEN măsurat în cei 4 solvenţi (figura 5.6).

Se constată mai multe aspecte. În primul rând, pentru toţi compuşii studiaţi se obţin mai multe maxime de absorbţie, cel mai puternic (maximul principal) la lungimi de undă de până la 210nm. Acestea sunt succedate de maxime secundare sau terţiare la lungimi de undă mai mari. Deoarece în domeniul de lungimi de undă 190 – 210nm, specifice maximelor principale, absorb puternic majoritatea solvenţilor organici utilizaţi în HPLC (MeOH, ACN etc.), utilitatea acestora pentru detectarea concentraţiilor mici de analiţi este îndoielnică. Din acest motiv, se vor avea în vedere maximele de

Page 21: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

9

absorbţie ce se obţin la valori mai mari ale lungimii de undă (maximele secundare) la stabilirea parametrilor de detecţie.

Fig. 5.6. Spectrele măsurate pentru TEN în diferiţi solvenţi

În al doilea rând, se poate observa că efectele de deplasare ale

maximelor spectrale (şi ne referim acum strict la maximul secundar) nu au efect semnificativ între apă şi solventul apos tampon (apă + sare + acid) la pH = 5, ceea ce înseamnă că prin corecţia de pH nu s-a alterat maximul secundar de absorbţie. Această constatare permite să tratăm tamponul apos din punct de vedere al influenţei spectrale, similar cu apa. Totuşi, o altă influenţă este notabilă: efectul hipocromic (reducerea intensităţii de absorbţie) este semnificativ la anumite AINS (KET, PIR), nesemnificativ la alte AINS (DIC, MEL, TEN) iar, în cazul IBP, apare efectul invers, de hipercromie (intensificarea intensităţii de absorbţie).

Un alt aspect interesant este specific spectrului oxicamilor. Aceştia prezintă două maxime secundare, unul de intensitate mai mică, în intervalul 240 – 260nm, şi unul de intensitate mai mare, în domeniul 350 – 400nm. Dintre AINS-urile studiate, oxicamii sunt singurii care au această particularitate şi poate fi utilă în situaţiile în care anumite AINS au tendinţa să coelueze (din cauza valorii logP foarte apropiate). O soluţie simplă de decelare este selecţia spectrală: presupunând că KTP sau/şi KET vor coelua cu TEN (toate au logP foarte apropiate de 1), alegerea unei lungimi de undă de detecţie de 350 – 360nm va permite detecţia şi chiar cuantificarea exclusiv a

Page 22: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

10

TEN, deoarece KTP şi KET nu absorb deloc în această zonă spectrală.

Nu în ultimul rând, în cazul folosirii MeOH sau ACN ca solvent, lungimile de undă rămân la aceleaşi valori (pentru IBP) sau se deplasează spre valori mai mari – deplasare batocromă – (pentru DIC) sau mai mici – deplasare hipsocromă – (pentru KTP, PIR, MEL şi TEN). Aceste deviaţii vor fi investigate ulterior, pentru a vedea influenţa amestecurilor apă sau tampon apos/solvent organic (MeOH sau ACN) în diverse proporţii, asupra poziţiilor maximelor spectrale.

În tabelul 5.3 sunt prezentate sinoptic lungimile de undă (poziţiile) ale maximelor spectrale secundare cu utilitate în detecţia cromatografică.

Tabelul 5.3. Lungimile de undă corespunzătoare maximelor

spectrale secundare pentru DIC, IBP, KTP, PIR, MEL şi TEN, în apă, MeOH, ACN şi tampon acetat pH = 5

Solvent Compus studiat Apă Metanol Acetonitril Tampon pH 5

DIC 276 282 284 276 IBP 221 219 219 221 KTP 260 254 252 260 PIR 359 326 324 331

MEL 364 357 346 364 TEN 374 358 355 373

Urmărind abaterile maximelor spectrale secundare pentru

AINS studiate la dizolvarea în solvenţi organici (MeOH şi ACN), în tabelul 5.3, se poate observa că valorile acestora sunt foarte apropiate (cel mult 3nm diferenţă), cu excepţia MEL (maximul secundar în MeOH s-a înregistrat la 357nm, faţă de cel în ACN înregistrat la 346nm). Pentru a putea anticipa lungimile de undă optime pentru detecţia HPLC în domeniul spectral UV-VIS, AINS luate în studiu au fost testate spectrofotometric după dizolvarea în amestecuri tampon apos/MeOH cu procent de modificator organic variabil (0, 30, 50, 70, 100%). În figura 5.12 este reprezentată, pentru exemplificare, modificările spectrale suferite de TEN în funcţie de compoziţia amestecului de solvatare, ce simulează posibile compoziţii ale fazei mobile HPLC.

Page 23: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

11

Fig. 5.12. Spectrele măsurate pentru TEN în amestec

tampon apos/MeOH

Examinând spectrele analizate, se poate concluziona faptul că aceşti compuşi prezintă modificări semnificative ale absorbanţei în funcţie de raportul în care se află solvenţii (tampon apos/MeOH) şi anume valori mai mari ale absorbanţei pentru KTP şi PIR la dizolvare în MeOH 100%, mai mici pentru DIC (50%) şi TEN (30%) şi, respectiv, pentru IBP (0%).

Compuşii menţionaţi au fost studiaţi şi la dizolvare în soluţie tampon acetat 0,1M (pH = 3,6) observându-se o uşoară creştere a absorbanţei faţă de soluţii tampon acetat pH = 5. În acest studiu au fost incluse şi celelalte AINS: NIM, IND, KET şi FB. Urmărind evoluţia modificărilor spectrale în amestecuri similare fazelor mobile HPLC, se recomandă pentru detecţia în UV alegerea următoarelor semnale (canale) de achiziţie: 255nm, 275nm, 360nm şi, cu totul special, 220nm pentru IBP.

Pentru următoarele teste s-a utilizat un cromatograf de lichide model HP 1090, echipat cu detector cu şir de diode. Analizele au fost efectuate pe o coloană de separare cu fază staţionară inversă model Zorbax StableBond SB-C18 4,6 x 150mm, 5μm la un debit de 0,7mL/min şi cu o fază mobilă formată din ACN/tampon acetat 0,1 M (pH = 3,6)/MeOH în raport 35/40/25. Această fază mobilă a fost iniţial aleasă a avea pH = 3,6 pentru a asigura trecerea DIC (forma sodică) în forma acidă. DIC (forma sodică) are un pKa = 4. Ulterior, pH-ul va fi crescut la 5,6, valoare similară studiilor preliminare.

Page 24: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

12

Pentru înregistrarea spectrelor celor 10 AINS în vederea construirii bibliotecii de spectre care va fi stocată de software-ul HPLC-ului pe computerul sistemului cromatografic, s-a procedat la cromatografierea individuală a fiecărui AINS. Soluţia aleasă (construcţia bibliotecii de spectre în condiţii dinamice) are drept scop final apropierea cât mai puternic posibilă de forma reală a spectrelor în timpul separării. Stocarea unor spectre obţinute în condiţii statice ar fi putut avea consecinţe nedorite asupra confirmării identităţii compuşilor separaţi sau asupra purităţii spectrale.

În plus, cromatografierea individuală a AINS în condiţiile metodei ce nu se modifică permite determinarea timpilor de retenţie corespunzători fiecărui component în parte şi stabilirea ordinii de eluţie în timpul separării. Deasemeni, prin compararea timpilor de retenţie se pot anticipa suprapunerile (coeluţiile) nedorite. Această etapă a fost finalizată cu ajutorul unei serii de soluţii etalon de concentraţii cunoscute: TEN (49μg/ml); PIR (49,25μg/ml); MEL (49μg/ml); DIC (49μg/ml); KET (49μg/ml); KTP (53,5μg/ml); IBP (500μg/ml); NIM (50μg/ml); FB (50,75μg/ml); IND (46,75μg/ml).

În figura 5.14 sunt prezentate cromatograma şi spectrul de absorbţie înregistrate pentru DIC. Conform timpilor de retenţie determinaţi, se poate stabili ordinea de eluţie a acestor AINS în condiţiile metodei utilizate.

Fig. 5.14. Cromatograma şi spectrul DIC (49μg/mL)

Pentru studiul influenţei debitului asupra separării

cromatografice a amestecului ce conţine şapte AINS (DIC, PIR, KTP, NIM, FB, IND şi IBP), s-au efectuat analize în aceleaşi condiţii:

min5 10 15 20 25

mAU

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

DAD1 A, Sig=255,4 Ref =450,80 (AINFLAJ\A_INF_04.D)

1.1

26

2.1

05 2

.562

5.0

60

7.9

81

13.

814

26.

222

nm220 240 260 280 300 320 340 360 380

mAU

0

20

40

60

80

100

120

140

160

DAD1, 2.188 (174 mAU,Bln) of A_INF_04.D

Page 25: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

13

coloană cromatografică de tipul Zorbax StableBond SB-C18 (4,6 x 150mm), 5μm, cu o fază mobilă formată din amestec de ACN/Apă/MeOH (35/40/25, v/v/v) şi s-a variat doar debitul fazei mobile. În urma separării cromatografice la valori diferite ale debitului se obţin următoarele cromatograme (figura 5.22).

Fig. 5.22. Separarea unui amestec de şapte AINS la debit de

0,7mL/min şi 0,5mL/min

Spectrele de absorbţie ale PIR şi IND obţinute în această fază mobilă, la cele două debite, sunt reprezentate în figura 5.23. Se observă că, la reducerea debitului, are loc o micşorare a abundenţei semnalului (efect hipocromic), vizibilă şi în reprezentările spectrale exemplificate în figura 5.23.

De asemenea, se mai observă faptul că la scăderea debitului fazei mobile nu apar deplasări batocrome sau hipsocrome, însă fenomenul de “aplatizare” (scăderea înălţimii picului cromatografic) conduce implicit la o scădere a sensibilităţii metodei. Principalul efect negativ se va resimţi la calculul parametrilor de performanţă LOD şi LOQ, dependenţi în mod particular de înălţimea semnalului cromatografic. Un alt efect nedorit este lăţirea la bază a picului cromatografic ce conduce inevitabil la scăderea rezoluţiei separării. Este, de aceea, necesară continuarea optimizării metodei de separare prin alte modificări, nu prin reducerea debitului de fază mobilă.

Page 26: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

14

Fig. 5.23. Spectrele de absorbţie pentru PIR şi IND, la două debite

diferite (în roşu - 0,7mL/min, în albastru – 0,5mL/min)

În tabelul 5.4 sunt centralizate modificările pe care le produce asupra picurilor cromatografice de IND şi PIR scăderea debitului fazei mobile de la 0,7mL/min la 0,5mL/min.

Tabelul 5.4. Influenţa modificării debitului de fază mobilă asupra picurilor cromatografice ale PIR şi IND

Compus Debit (ml/min) Timp de retenţie (min) Lăţime

0,7 4,286 0,2236 PIR 0,5 6,039 0,3054 0,7 12,438 0,4047 IND 0,5 17,298 0,557

În urma interpretării acestor date, se desprind următoarele

concluzii: (1) alura spectrelor şi poziţia maximelor de absorbţie nu se modifică, în schimb absorbanţa scade odată cu scăderea debitului fazei mobile; (2) odată cu scăderea debitului fazei mobile creşte lăţimea picului la baza cromatogramei.

Pentru a studia influenţa compoziţiei fazei organice din faza mobilă asupra separării cromatografice a amestecului celor şapte AINS exemplificate (DIC, PIR, KTP, NIM, FB, IND şi IBP), s-a ales ca fază mobilă un amestec format din ACN, MeOH şi apă. În analizele efectuate, debitul a fost menţinut constant, la o valoare de

Page 27: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

15

0,7mL/min, la fel şi proporţia de apă din compoziţia fazei mobile, la 40%. Au fost modificate doar proporţiile de MeOH şi ACN, astfel încât conţinutul în metanol să crească în paşi de câte 10%, de la 0 la 30%. Cromatogramele obţinute sunt reprezentate în figura 5.24.

Fig. 5.24. Influenţa proporţiei între cei doi modificatori organici din

faza mobilă (ACN/MeOH) asupra separării AINS exemplificate (DIC, PIR, KTP, NIM, FB, IND şi IBP)

Studiind variaţiile spectrale se desprind următoarele concluzii:

(-) indiferent de raportul dintre ACN şi MeOH, poziţia maximului de absorbţie situat în jurul valorii de 320nm este constant; (-) cu cât conţinutul în MeOH creşte, poziţia maximului de absorbţie situat în intervalul 260– 270nm se deplasează treptat spre valori mai mici ale lungimii de undă; (-) indiferent de proporţia dintre cei doi solvenţi organici, în spectrul de absorbţie al IND există un platou relativ constant în intervalul 240–260nm.

O dată cu creşterea conţinutului de MeOH în faza mobilă se constată:

1. creşterea timpilor de retenţie, fapt ce poate fi explicat printr-o solubilitate mai mică a acestor componente în MeOH decât în ACN;

Page 28: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

16

2. pentru primii trei compuşi aria picurilor este relativ constantă în timp ce înălţimea picurilor scade iar lăţimea creşte;

3. pentru cel de al patrulea compus aria şi înălţimea picului scade, în timp ce lăţimea creşte.

4. pentru ultimii doi compuşi separaţi apare o anomalie, şi anume: aria, înălţimea şi lăţimea picurilor nu prezintă o modificare uniformă.

Având în vedere faptul că în această probă există un număr de 7 componenţi şi având în vedere observaţiile (3) şi (4) se poate afirma faptul că din ultimii patru compuşi care eluează, unul suferă o deplasare mai rapidă prin coloană decât ceilalţi trei, în fiecare situaţie în parte obţinându-se picuri suprapuse, deci impure. În consecinţă, metoda în cauză nu poate fi aplicată în situaţia în care în proba de analizat se găsesc toţi aceşti patru compuşi.

Pentru studierea influenţei pH-ului fazei mobile apoase asupra

separării cromatografice, în compoziţia fazei mobile a fost menţinut constant raportul între componenţii acesteia, modificându-se numai pH-ul fazei apoase. Astfel, s-a înlocuit apa din compoziţia fazei mobile cu o soluţie tampon acetat cu o valoare a pH-ului de 4,6. S-a utilizat soluţie de tampon acetat, volatil, ce ar permite utilizarea fazei mobile şi în determinări lichid cromatografice cu detecţie prin spectrometrie de masă.

În exemplul ce urmează, compoziţia fazei mobile utilizate este ACN/tampon acetat (pH = 4,6)/MeOH în raport 30/40/30, debitul fazei mobile fiind de 0,7mL/min. În figura 5.26 sunt reprezentate cele două cromatograme (fază mobilă cu apă vs. faza mobilă cu tampon de pH = 4,6).

Dacă se utilizează soluţie tampon de pH = 4,6 în loc de apă se pot concluziona următoarele: (-) timpii de retenţie scad, ceea ce înseamnă un timp de analiză total mai mic; (-) pentru primii trei compuşi calitatea separării scade, picurile obţinându-se suprapuse, din acest motiv un studiu al modificărilor ariei, înălţimii sau lăţimii picurilor nu este util; (-) pentru compusul 4 apare o scădere semnificativă a ariei, înălţimii şi lăţimii picului; (-) pentru ultimii doi compuşi separaţi aria este relativ constantă, în timp ce se observă o creştere a înălţimii picurilor compensată de scăderea lăţimii acestora.

Page 29: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

17

Fig. 5.26. Separarea cromatografică a unui amestec de şapte AINS (a) faza mobilă: ACN/Apă/MeOH, şi (b) faza mobilă ACN/tampon

acetat (pH = 4,6)/MeOH raport 30/40/30 (v/v/v), debitul fazei mobile: 0,7mL/min

Conform datelor experimentale prezentate în cadrul acestui

capitol, se pot desprinde unele concluzii, cum ar fi: A. În compoziţia fazei mobile este indicat să se folosească un tampon de pH în loc de apă, obţinându-se o scădere a timpului total de analiză şi simetrie mai bună a unor picuri; B. În compoziţia fazei mobile este indicat să se folosească drept modificator organic un amestec de MeOH şi ACN, nu doar un singur solvent, deoarece astfel creşte rezoluţia separării; C. Debitul fazei mobile trebuie să fie de 0,7 – 0,8mL/min; la valori mai mici creşte timpul total de analiză, iar la valori mai mari scade rezoluţia, apărând coeluţii. D. Analizele se vor efectua la mai multe lungimi de undă (corespunzătoare maximelor de absorbţie); în acest mod se vor obţine sensibilităţi maxime pentru fiecare component separat, creşterea rezoluţiei şi a simetriei picurilor.

Următoarele teste s-au realizat pe o coloană Eclipse XDB C18 (150 x 4,6mm, 5μm). Faza mobilă (debit 0,8mL/min) este constituită din amestec ACN/MeOH/tampon acetat pH = 5 (30/30/40, v/v/v).

Din cromatogramele înregistrate s-a determinat timpul de retenţie pentru fiecare compus în parte şi s-a înregistrat spectrul de absorbţie în UV-VIS. Prin analiza spectrală s-a determinat lungimea de undă corespunzătoare maximului de absorbţie pentru fiecare component în parte. Spectrul de absorbţie înregistrat pentru fiecare

Page 30: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

18

component a fost inclus într-o bibliotecă de spectre, ce va servi la identificarea acestora din amestecuri sau din probe reale. În 5.36 se exemplifică cromatograma şi spectrul pentru FB.

Fig. 5.36. Cromatograma şi spectrul de absorbţie pentru FB în condiţiile metodei

Analizând datele experimentale astfel obţinute, se aleg

lungimile de undă la care se va face detecţia (tabelul 5.7).

Tabelul 5.7. Lungimile de undă corespunzătoare maximelor de absorbţie şi lungimile de undă alese pentru detecţia în HPLC

Nr.crt. Component analizat λmax (nm) λ detecţie (nm)

1 IBP 230 230 2 KTP 259 270 3 FB 268 270 4 IND 270 270 5 DIC 280 280 6 NIM 300 300 7 KET 320 320 8 PIR 360 370 9 MEL 364 360

10 TEN 372 370 În continuare, au fost analizate amestecuri de mai mulţi

componenţi, la lungimi de undă corespunzătoare, pentru a evidenţia mai bine ordinea de eluţie a componenţilor separaţi.

În figura 5.37 au fost înregistrate cromatograme la lungimile de undă de detecţie pentru TEN (370nm), MEL (360nm), KTP (270nm), DIC (280nm), IND (270nm) şi IBP (230nm).

Page 31: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

19

Fig. 5.37. Ordinea de eluţie: TEN (1), MEL (2), KTP (3),

DIC (4), IND (5) şi IBP (6).

În vederea obţinerii de informaţii asupra performanţei separării, au fost analizate soluţii ce conţin un amestec al celor 6 componenţi la aceeaşi valoare a concentraţiei (10μg/mL), obţinându-se informaţii asupra performanţei separării (tabelele 5.8 – 5.13).

Tabelul 5.8. Performanţa separării la 230nm

Compus Tr (min) Arie pic Înălţime

pic Lăţime

pic Rezoluţie Simetrie Selectivitate

TEN 2,125 15,8 3,1 0,0811 - 0,466 - MEL 2,587 33,1 4,6 0,1089 2,92 0,585 1,22 KTP 3,345 60,6 6,8 0,1296 3,67 0,58 1,29 DIC 6,027 53,9 3,3 0,1979 8,44 0,591 1,80 IND 7,241 135,5 7,3 0,2574 2,76 0,622 1,20 IBP 9,28 39,9 2 0,2531 3,98 0,558 1,28

Page 32: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

20

Tabelul 5.9. Performanţa separării la 270nm

Compus Tr

(min) Arie pic Înălţime pic

Lăţime pic Rezoluţie Simetrie Selectivitate

TEN 2,126 52,1 7,8 0,1032 0,586 MEL 2,587 34,3 4,9 0,1077 2,59 0,603 1,22 KTP 3,345 88 10,3 0,1287 3,73 0,614 1,29 DIC 6,026 39,6 2,6 0,1963 8,61 0,59 1,80 IND 7,241 108,5 6 0,27 2,79 0,619 1,20

Tabelul 5.10. Performanţa separării la 280nm

Compus Tr

(min) Arie picÎnălţime pic

Lăţime pic Rezoluţie Simetrie Selectivitate

TEN 2,126 50,2 7,3 0,1087 0,577 - MEL 2,586 30,4 4,2 0,1125 2,55 0,591 1,22 KTP 3,346 50,3 5,8 0,1297 3,71 0,62 1,29 DIC 6,027 50,5 3,3 0,2134 8,62 0,584 1,80 IND 7,24 90,1 4,9 0,2542 2,80 0,619 1,20

Tabelul 5.11. Performanţa separării la 300nm

Compus Tr

(min)Arie pic

Înălţime pic

Lăţime pic Rezoluţie Simetrie Selectivitate

TEN 2,126 40,5 6 0,1081 - 0,569 - MEL 2,588 24,5 3,4 0,1119 2,56 0,617 1,22 KTP 3,347 13,4 1,6 0,118 3,74 0,657 1,29 DIC 6,024 28,1 1,8 0,1945 8,64 0,583 1,80 IND 7,246 39,8 2,1 0,2513 2,82 0,658 1,20

Tabelul 5.12. Performanţa separării la 360nm

Compus Tr

(min)Arie pic

Înălţime pic

Lăţime pic Rezoluţie Simetrie Selectivitate

TEN 2,126 58,3 8,6 0,1012 - 0,589 - MEL 2,587 64,5 9 0,1093 2,56 0,59 1,22 IND 7,242 17,7 0,94 0,2392 12,98 0,617 2,80

Page 33: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

21

Tabelul 5.13. Performanţa separării la 370nm

Compus Tr (min)

Arie pic

Înălţime pic

Lăţime pic Rezoluţie Simetrie Selectivitate

TEN 2,126 63,9 9,5 0,1107 - 0,571 - MEL 2,587 63,9 8,9 0,1064 2,55 0,588 1,22 IND 7,22 12,4 0,64 0,2372 14,55 0,454 2,79

Analizând datele experimentale prezentate în tabelele 5.8 –

5.13 se constată rezoluţia dintre picurile separate este mai mare ca 2,5. Aceasta înseamnă că metoda propusă conduce la o separare bună, cel puţin în ceea ce priveşte aceşti 6 compuşi (figura 5.38).

Fig. 5.38. Cromatogramele înregistrate la lungimile de undă folosite

la detecţie, pentru TEN (1), MEL (2), KTP (3), DIC (4), IND (5) şi IBP (6)

Pentru a obţine sensibilitatea maximă pentru fiecare compus

în parte, se impune o comparaţie între datele experimentale la diverse

Page 34: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

22

lungimi de undă. Astfel, în tabelul 5.14 se prezintă variaţia ariilor picurilor pentru fiecare component în parte la valori diferite ale lungimii de undă.

Tabelul 5.14. Variaţiile ariilor picurilor pentru TEN, MEL, KET, DIC, IND şi IBP la valori diferite ale lungimii de undă

Lungime de undă (nm) Compus Tr

(min) 230 270 280 300 360 370 TEN 2,1 15,8 52,1 50,2 40,5 58,3 63,9 MEL 2,5 33,1 34,3 30,4 24,5 64,5 63,9 KTP 3,3 60,6 88,0 50,3 13,4 9,1 3,4 DIC 6,0 53,9 39,6 50,5 28,1 N.A. N.A. IND 7,2 135,5 108,5 90,1 39,8 17,7 12,4 IBP 9,2 39,9 16,0 N.A. N.A. N.A. N.A.

Analizând datele experimentale prezentate în tabelul 5.14 se

constată că cele mai mari valori ale ariilor picurilor înregistrate se regăsesc la următoarele lungimi de undă: TEN (370nm), MEL (360nm), KET (270nm), DIC (280nm), IND (270nm) şi IBP (230nm). Aceste valori ale lungimii de undă vor fi folosite ulterior pentru validarea metodei şi pentru determinările cantitative din probe.

Un studiu similar a fost efectuat şi pentru celelalte AINS luate în studiu (PIR, KET, NIM, FB) (tabelul 5.15). Tabelul 5.15. Variaţiile ariilor picurilor pentru PIR, KET, NIM şi FB

la valori diferite ale lungimii de undă

Lungime de undă (nm) Compus Tr (min) 230 270 280 300 360 370

PIR 2,4 605,1 546,1 521,2 N.A. 893,2 810 KET 2,3 117,9 140 410 753,7 109,4 43,4 NIM 6,9 267,2 320,3 415,7 N.A. 250,9 190,3 FB 4,2 7770 6350 878,4 11,8 6,1 5,2 Din datele prezentate în tabelul 5.15 se observă că valorile

maxime ale ariilor picurilor se regăsesc la următoarele lungimi de undă: PIR (360nm), KET (320nm), NIM (300nm) şi FB (270nm). Acestea vor fi folosite ulterior pentru validarea metodei şi pentru determinările cantitative din probe.

Page 35: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

23

Având în vedere testele prezentate anterior, condiţiile finale propuse pentru determinarea prin HPLC a celor zece AINS luate în studiu sunt: (1) coloană cromatografică Eclipse XDB C18 (150 x 4,6mm, 5μm); (2) faza mobilă (debit 0,8mL/min) constituită din amestec ACN/MeOH/tampon acetat pH = 5 în raport volumic de 30/30/40; (3) detecţia se realizează în UV-VIS, concomitent, la următoarele valori ale lungimii de undă:

230nm – IBP 270nm – KTP, IND şi FB 280nm – DIC 300nm – NIM 320nm – KET 360nm – PIR şi MEL 370nm – TEN

Page 36: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

24

CAPITOLUL 6. VALIDAREA ANALITICĂ A METODELOR CANTITATIVE PENTRU

DETERMINAREA AINS

Pentru determinarea AINS am dezvoltat o metodă de analiză prin RP-HPLC utilizând un cromatograf de lichide model Agilent Technologies Seria 1100 echipat cu detector spectrofotometric (UV-VIS) cu şir de diode. După stabilirea condiţiilor optime de analiză (fază staţionară, caracteristicile fazei mobile, debit, lungime de undă de detecţie), s-a procedat la validarea metodei, calculând următorii parametri: identificarea AINS, linearitatea funcţiei de răspuns, linearitatea rezultatelor, LOD, LOQ, precizia (precizia sistemului, precizia metodei, precizia intermediară) şi exactitatea.

Aparatură:

cromatograf de lichide tip Agilent Technologies 1100 prevăzut cu detector cu şir de diode

coloană cromatografică tip Eclipse XDB C18 (150 x 4,6mm, 5µm) balanţă analitică tip Kern 770 baie de ultrasonare agitator magnetic sticlărie de laborator (pipete, baloane cotate etc.).

Reactivi:

ACN de puritate cromatografică (Merck); MeOH de puritate cromatografică (Merck); acetat de sodiu anhidru; acid acetic glacial; AINS – etaloane de referinţă (a se vedea în Capitolul 5). apă bidistilată.

Metodă

Soluţiile standard s-au obţinut prin dizolvarea unei cantităţi de 25mg AINS (substanţă de referinţă) în 25mL MeOH (1mg/mL) şi diluare cu fază mobilă, după dizolvare completă (aproximativ 5min.

Page 37: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

25

în baie de ultrasonare). Orice diluţie ce survine în cadrul pregătirii soluţiilor standard se realizează cu fază mobilă.

Temperatura coloanei este menţinută constantă la 25°C. Faza mobilă: amestec de tampon acetat 0,1M (pH =

5)/ACN/MeOH în raport de 40/30/30. Pentru prepararea unui volum de 1L fază mobilă se procedează astfel: se amestecă 300mL ACN cu 300mL MeOH şi cu 400mL soluţie tampon acetat 0,1M (pH = 5).

Debitul fazei mobile este de 0,8mL/min. Volumul de probă / soluţie etalon injectată în HPLC este de 20µL. Detecţia se realizează la lungimea de undă specifică AINS

cromatografiat. Deoarece validările tuturor celor 10 antiinflamatoare luate în

studiu au fost efectuate urmând aceeaşi procedură, în rezumatul tezei prezentăm modul de efectuare a validării metodei pentru unul singur urmând ca pentru ceilalţi să prezentăm doar rezultatele obţinute, sub formă de tabele de date.

Validarea metodei HPLC pentru determinarea MEL

Sistemul cromatografic a fost pregătit conform descrierii din subcapitolul 6.1. Reactivii, faza mobilă, etaloanele şi probele au fost pregătite conform metodei de lucru exprimate general în subcapitolul 6.1 şi particularizate în continuare. Detecţia se realizează la lungimea de undă 360nm specifică MEL.

După cum s-a menţionat în Capitolul 5, referitor la identificarea picurilor cromatografice, o anumită substanţă se comportă identic la analiza prin HPLC dacă toate condiţiile de lucru sunt identice. Astfel, pentru identificarea MEL din diferite probe, se compară timpul de retenţie al picului din cromatograma probei cu cel obţinut în cromatograma substanţei de referinţă (valori ce trebuie să fie apropiate – se acceptă o diferenţă, adesea, de ± 5%). Astfel, în cromatograma soluţiei de referinţă s-a obţinut un timp de retenţie de 2,544min.; cum se acceptă o abatere de ± 5% (0,127min.) – valorile timpului de retenţie trebuie să fie în intervalul 2,417 – 2,671min.

În figura 6.1 se prezintă comparativ cromatogramele pentru soluţia de referinţă şi respectiv pentru o probă. Aşa cum se observă pentru soluţia probă, timpul de retenţie este de 2,564min., valoare ce se încadrează în limita de abatere impusă (± 5%).

Page 38: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

26

Fig. 6.1. Cromatograma MEL: soluţie standard (sus) vs. probă (jos)

Pentru a creşte precizia identificării, în afara comparării

timpilor de retenţie din cromatograma probei şi, respectiv, a soluţiei de referinţă, se compară şi spectrul de absorbţie al picului din cromatograma probei cu cel al soluţiei de referinţă (care este salvat în biblioteca de spectre). Pentru aceasta, este foarte important ca soluţia probă şi soluţia de referinţă să fie analizate în aceleaşi condiţii (fază staţionară, compoziţia fazei mobile, debit, temperatură, lungime de undă de detecţie, lungime de undă de referinţă etc.).

În figura 6.3 se prezintă comparativ spectrul de absorbţie al MEL din soluţia probă faţă de cel din soluţia de referinţă.

Pentru prepararea soluţiei stoc de MEL se procedează astfel: o cantitate de 25mg MEL a fost dizolvată în 20mL MeOH pe baie de ultrasonare şi, după dizolvare completă, soluţia a fost diluată la 25mL cu MeOH. Din soluţia astfel preparată s-a mai realizat o diluţie de 1/10, obţinându-se în final o soluţie de concentraţie 100µg/mL. Calcularea concentraţiei soluţiei finale se face după formula de calcul descrisă prin ecuaţia 6.1.

Page 39: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

27

Fig. 6.3. Compararea spectrelor de absorbţie a MEL

(probă vs. soluţie de referinţă)

( )( )

( )( ) mLgmL

mLxmLmg /100

505

2525 μ= (6.1)

Pornind din aceeaşi soluţie stoc, s-au preparat (prin diluare cu

faza mobilă) un număr de 3 seturi de soluţii de lucru pentru studiul linearităţii pe intervalul de concentraţie 0,5 – 100µg/mL. Fiecare dintre aceste probe a fost analizată în condiţiile menţionate şi, din cromatogramele obţinute, s-a determinat aria picurilor corespunzătoare MEL.

Se reprezintă grafic variaţia ariei medii în funcţie de concentraţie şi se determină intervalul de concentraţie pentru care această variaţie este lineară. Se trasează dreapta de regresie pentru acest interval şi se determină coeficientul de corelaţie (r), deviaţia standard a pantei dreptei de regresie (s) şi ecuaţia dreptei Arie pic = f(c) (ecuaţiile 6.2, 6.3).

Arie pic = a x Concentraţia + b (6.2)

Arie pic = 6,3558 x Concentraţia – 0,8216; r2 = 0,9996 (6.3)

Aşa cum se observă, pe domeniul de concentraţie considerat

metoda este liniară (r2 = 0,9996).

Page 40: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

28

Aşadar, domeniul de linearitate al metodei este 0,5 – 100µg/mL.

Pe de altă parte, având în vedere faptul că există posibilitatea ca metoda dezvoltată să fie aplicată şi pentru determinarea MEL din probe biologice (unde concentraţia acestuia este mult mai mică), ne-am propus să îngustăm domeniul de lucru. Astfel, am considerat ca domeniu de lucru intervalul 0,5 – 30µg/mL. Pentru acest interval de concentraţie am validat metoda.

În figura 6.4 este prezentată dreapta de calibrare obţinută pentru MEL, pe domeniul de lucru.

Fig. 6.4. Dreapta de calibrare la determinarea MEL prin HPLC

Calculul statistic al dreptei de regresie (ecuaţia 6.2) este redat

sumar în tabelul 6.3.

Tabelul 6.3. Calculul statistic al dreptei de regresie

Calculul statistic al regresiei Coeficient de corelaţie (r) 0,9999 Coeficient de regresie (r2) 0,9998

Eroare standard a dreptei de regresie (SE) 1,1860 Intercept 0,6774

Pantă 6,2136

Ecuaţia dreptei de calibrare este redată mai jos (6.4):

Arie pic = 6,2136 x Concentraţia + 0,6774R2 = 0,9998

0.0020.0040.0060.0080.00

100.00120.00140.00160.00180.00200.00

0 5 10 15 20 25 30 35

Concentraţie (ug/mL)

Arie

pic

Page 41: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

29

Arie pic = 6,2136 x Concentraţia (µg/mL) + 0,6774 (6.4)

sau, ecuaţia 6.5:

Concentraţia (µg/mL) = Arie 0 ,67746 ,2136− (6.5)

Pentru evaluarea linearităţii rezultatelor, se reprezintă grafic

variaţia concentraţiei calculate (utilizând ecuaţia dreptei de calibrare) în funcţie de concentraţia teoretică.

După cum se observă din figura 6.5, între concentraţia introdusă teoretic şi cea calculată folosind ecuaţia dreptei de calibrare există o corelaţie liniară, panta acestei drepte fiind egală cu unitatea iar interceptul având valoarea 0,0002. Coeficientul de regresie al acestei drepte are valoarea r2 = 0,9998.

Fig. 6.5. Liniaritatea rezultatelor la determinarea MEL prin HPLC

Având în vedere faptul că interceptul are o valoare extrem de

mică, se poate afirma că această dreaptă trece prin origine. Pe de altă parte, dreapta ce trece prin origine şi are panta egală cu unitatea este prima bisectoare. Aceasta înseamnă că între concentraţia introdusă (teoretică) şi cea calculată utilizând ecuaţia dreptei de calibrare corelaţia este foarte bună.

Concentraţie calculată = Concentraţie teoretică + 0,0002R2 = 0,9998

0

5

10

15

20

25

30

35

0 5 10 15 20 25 30 35

Concentraţie teoretică

Conc

entraţie

cal

cula

Page 42: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

30

În ceea ce priveşte linearitatea metodei de determinare prin HPLC a MEL, în urma prelucrării statistice a datelor experimentale, se obţin următoarele rezultate: metoda este liniară în domeniul de concentraţie ales (0,5 – 100µg/mL); domeniul de lucru ales este 0,5 – 30µg/mL; pe domeniul de lucru ales, ecuaţia dreptei de regresie este dată de relaţia 6.4:

Arie pic = 6,2136 x Concentraţia + 0,6774

pe acest interval, coeficientul de regresie (r2) are valoarea 0,9998 iar eroarea standard a curbei de regresie (SE) are valoarea 1,1860.

LOD reprezintă cantitatea minimă de MEL ce se poate pune în evidenţă. Pentru determinarea LOD există mai multe variante, în cazul de faţă am folosit metoda de calcul a acesteia utilizând deviaţia standard şi panta dreptei de regresie (LOD = 0,63μg/mL).

LOQ reprezintă cantitatea minimă de MEL ce se poate cuantifica cu certitudine. Pentru determinarea LOQ există mai multe variante, în cazul de faţă am folosit metoda de calcul a acesteia utilizând deviaţia standard şi panta dreptei de regresie (LOQ = 1,91μg/mL).

Precizia. Repetabilitatea Repetabilitatea injecţiei (Precizia sistemului) Pentru a examina precizia sistemului, aceeaşi soluţie

conţinând MEL în concentraţia de interes (20µg/mL) s-a injectat de 10 ori obţinându-se tot atâtea cromatograme. Din cromatogramele rezultate s-au extras ariile picurilor, calculându-se valoarea medie, deviaţia standard şi deviaţia standard relativă. Rezultatele numerice ale analizelor repetitive se regăsesc în tabelul 6.6.

Concluzie: având în vedere valoarea deviaţiei standard relative obţinute (RSD = 1,0999%) comparativ cu limita admisă de 2%, se poate afirma că la determinarea prin HPLC a MEL, sistemul este precis.

Page 43: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

31

Tabelul 6.6. Repetabilitatea injecţiei (Precizia sistemului) pentru o concentraţie de 20µg/mL

Nr. determinării Arie pic

1 123,61 2 127,37 3 125,65 4 127,96 5 125,53 6 127,01 7 126,63 8 125,22 9 127,95

10 127,24 Media 126,42

SD 1,3905 RSD 1,0999%

Repetabilitatea analizei (precizia metodei) Pentru stabilirea preciziei metodei de determinare a MEL s-a

ales varianta de lucru cu un minim de 9 determinări acoperind domeniul specific de concentraţie (de exemplu 3 determinări la 3 valori ale concentraţiei). Soluţiile standard de validare sunt preparate ca mai jos, prin diluţii din soluţia stoc. Soluţia stoc este preparată ca în subcapitolul 6.2.3. Din soluţia stoc se prepară soluţiile de lucru prin diluare cu fază mobilă:

Pentru fiecare nivel de concentraţie se prepară şi se analizează un număr de trei probe, măsurându-se experimental aria picurilor.

Utilizând ecuaţia dreptei de calibrare şi valorile ariilor corespunzătoare picurilor MEL, se calculează concentraţia (în µg/mL) pentru fiecare probă în parte. Se determină concentraţia calculată ca procent din valoarea concentraţiei teoretice. Valorile obţinute sunt prelucrate statistic. Astfel, sunt calculate: valoarea medie, deviaţia standard, RSD şi intervalul de încredere pentru fiecare valoare individuală ca şi pentru valoarea medie. RSD trebuie să aibă o valoare mai mică de 5%. Valorile experimentale obţinute la studiul preciziei metodei de determinare a MEL prin HPLC sunt prezentate în tabelul 6.7.

Page 44: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

32

Tabelul 6.7. Precizia metodei de determinare a MEL prin HPLC

Nr. det. Concentraţie teoretică(µg/mL) Arie pic Concentraţie calculată

(µg/mL) %

1 96,32 15,39 102,6 2 93,01 14,86 99,1 3

15 95,44 15,25 101,7

4 125,47 20,08 100,4 5 127,48 20,41 102,0 6

20 123,00 19,69 98,4

7 152,78 24,48 97,9 8 154,83 24,81 99,2 9

25 153,20 24,55 98,2

Media 99,94% SD 1,7833 Date statistice

RSD 1,7843%

Concluzie: conform datelor experimentale, după prelucrarea statistică a acestora se observă că pe un interval de ± 25% faţă de valoarea de interes, metoda este precisă, RSD fiind sub limita impusă de 5%.

Precizia intermediară Pentru calculul preciziei intermediare la determinarea MEL

prin HPLC, întregul experiment s-a efectuat a doua zi, utilizând reactivi diferiţi, modul de lucru fiind identic ca şi în cazul determinării preciziei metodei.

Pentru fiecare nivel de concentraţie se prepară şi se analizează un număr de trei probe, măsurându-se experimental aria picurilor.

Utilizând ecuaţia dreptei de calibrare şi valorile ariilor corespunzătoare picurilor MEL se calculează concentraţia (în µg/mL) pentru fiecare probă în parte. Se determină concentraţia calculată ca procent din valoarea concentraţiei teoretice. Valorile obţinute sunt prelucrate statistic. Astfel, sunt calculate: valoarea medie, deviaţia standard, RSD şi intervalul de încredere pentru fiecare valoare individuală ca şi pentru valoarea medie. RSD trebuie să aibă o valoare mai mică de 5%. Datele primare folosite la calculele detaliate anterior se regăsesc centralizate în tabelul 6.8.

Page 45: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

33

Tabelul 6.8. Precizia intermediară la determinarea MEL prin HPLC - date primare -

Nr.det. Concentraţie teoretică

(µg /mL) Arie pic Concentraţie calculată(µg /mL) %

1 92,36 14,76 98,4 2 91,28 14,58 97,2 3

15 94,50 15,10 100,7

4 127,15 20,35 101,8 5 127,47 20,41 102,0 6

20 126,12 20,19 100,9

7 152,14 24,38 97,5 8 153,10 24,53 98,1 9

25 156,84 25,13 100,5

Media 99,68% SD 1,8747 Date statistice

RSD 1,8807%

Concluzie: conform datelor experimentale obţinute, după prelucrarea statistică a acestora se observă că pe un interval de ± 25% faţă de valoarea de interes, metoda este precisă, RSD fiind sub limita impusă de 5%.

Exactitatea (acurateţea) Exactitatea (acurateţea) este o caracteristică ce reflectă

apropierea rezultatelor analitice de valoarea adevărată. Exactitatea este deci o măsură a deviaţiei valorii medii găsită prin analiză, faţă de valoarea adevărată.

Pentru determinarea acurateţei metodei de determinare a MEL se lucrează prin metoda adaosului: într-o soluţie ce conţine o cantitate cunoscută de standard, se introduc volume de soluţie de MEL astfel încât să se obţină concentraţii de 75%, 100% şi 125% din concentraţia soluţiei ce va fi testată (20µg/mL). Procedeul s-a repetat de trei ori utilizând soluţii etalon preparate separat.

S-a preparat mai întâi o soluţie stoc de MEL din care, prin diluţie s-au obţinut soluţiile de lucru. Soluţia stoc se prepară ca în subcapitolul 6.2.3 (ecuaţia 6.1). Soluţiile preparate pentru studiul exactităţii au fost injectate şi analizate prin cromatografie de lichide de înaltă performanţă în condiţiile metodei. Cromatogramele obţinute au fost integrate, determinându-se astfel aria picurilor.

Page 46: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

34

Utilizând ecuaţia dreptei de calibrare şi valorile ariilor picurilor corespunzătoare MEL s-a calculat concentraţia (în µg/mL) pentru fiecare probă în parte. S-a determinat regăsirea, calculată ca procent din valoarea concentraţiei teoretice, regăsirea medie precum şi domeniul în care variază regăsirea (tabelul 6.10).

Tabelul 6.10. Exactitatea metodei de determinare a MEL prin HPLC

Nr.det. Concentraţie teoretică

(µg/mL) Arie pic Concentraţie calculată(µg/mL) Regăsire %

1 93,25 14,90 99,3 2 95,75 15,30 102,0 3

15 96,38 15,40 102,7

4 123,56 19,78 98,9 5 122,93 19,68 98,4 6

20 122,37 19,58 97,9

7 159,73 25,60 102,4 8 155,95 24,99 100,0 9

25 154,56 24,77 99,1

Regăsire medie 100,08% Minim 97,90% Date statistice Maxim 102,70%

Concluzie: regăsirea medie în studiul exactităţii metodei de

determinare a MEL prin HPLC are valoarea de 100,08% pe intervalul 97,90 – 102,70%.

În urma validării metodei de analiză pentru toate cele 10 antiinflamatoare luate în studiu s-au obţinut valorile prezentate în următoarele tabele (R1 – R6).

După cum se observă cu uşurinţă din datele prezentate în tabelul R1, durata analizei este de aproximativ 10 minute, timp în care se pot separa toţi cei 10 componenţi.

Pe de altă parte, deoarece este puţin probabil ca toţi cei 10 compuşi să se afle simultan într-o probă, această metodă unică poate fi aplicată cu succes pentru separarea, identificarea şi determinarea cantitativă a oricărui compus dintre cei 10 studiaţi.

Page 47: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

35

Tabelul R1. Timpi de retenţie şi lungimi de unde de detecţie

AINS Timp de retenţie (minute)

Lungime de undă de detecţie (nm)

TEN 2,09 370 KET 2,27 320 PIR 2,35 360

MEL 2,54 360 KTP 3,21 270 FB 4,07 270

DIC 5,77 280 IND 6,97 270 NIM 7,29 300 IBP 8,94 230

Cercetări preliminare denotă faptul că există şi alte

medicamente din această clasă ce pot fi separate prin această metodă. Metoda de analiză este liniară pentru toate cele 10 AINS

studiate, coeficienţii de regresie fiind în toate cazurile mai mari de 0,9990 (tabelul R2). Pentru KET, DIC, NIM şi IBP, domeniul de lucru porneşte de la o concentraţie mai mare decât în celelalte cazuri deoarece pentru compuşii menţionaţi ariile picurilor la concentraţii mai mici de 1μg/mL sunt mai mici decât limita de detecţie, în unele cazuri având valori comparative cu zgomotul de fond.

Tabelul R2. Liniaritatea metodei

Domeniu (μg/mL) AINS liniaritate lucru

Coeficient de regresie (r2) Pantă Intercept

TEN 0,5 – 100 0,5 – 30 0,9997 6,4225 -1,7089 KET 0,5 – 100 1 – 40 0,9995 6,8197 2,4048 PIR 0,5 – 100 0,5 – 30 0,9996 8,7939 -2,4259

MEL 0,5 – 100 0,5 – 30 0,9998 6,2136 0,6774 KTP 0,5 – 100 0,5 – 30 0,9995 8,871 -0,436 FB 0,5 – 100 0,5 – 30 0,9998 79,172 -5,551

DIC 1 – 100 1 – 40 0,9994 5,0394 -0,3782 IND 0,5 – 100 0,5 – 30 0,9993 10,494 0,8599 NIM 1 – 100 1 – 40 0,9993 4,0922 1,1131 IBP 1 – 100 1 – 40 0,9998 3,7781 0,1342

Page 48: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

36

Conform datelor experimentale prezentate în tabelul R3, rezultatele calculate sunt în bună corelaţie cu valorile teoretice, la reprezentarea grafică a acestei dependenţe se obţin drepte cu pantă unitară sau foarte apropiată de unitate, cu intercept foarte mic şi cu valori ale coeficienţilor de regresie foarte buni (mai mari de 0,9990).

Tabelul R3. Liniaritatea rezultatelor

AINS Pantă Intercept Coeficient de regresie (r2)TEN 0,9835 0,2166 0,9998 KET 1,0000 0,0002 0,9995 PIR 1,0000 0,00004 0,9996

MEL 1,0000 0,0002 0,9998 KTP 0,9683 0,102 0,9991 FB 1,0001 -0,0007 0,9998

DIC 1,0000 -0,0003 0,9994 IND 1,0000 -0,000005 0,9993 NIM 1,0000 -0,000005 0,9993 IBP 1,0000 -0,0002 0,9998

Analizând datele prezentate în tabelul R4 se concluzionează

ca în toate cazurile se obţin valori bune pentru limita de detecţie (0,31 – 1,48μg/mL) şi limita de cuantificare (1,57 – 4,50μg/mL).

Tabelul R4. Limita de detecţie şi limita de cuantificare

AINS Limita de detecţie (μg/mL)

Limita de cuantificare (μg/mL)

TEN 0,63 1,91 KET 1,19 3,61 PIR 0,63 2,47

MEL 0,63 1,91 KTP 0,89 2,71 FB 0,52 1,57

DIC 0,31 3,98 IND 1,10 3,33 NIM 1,48 4,50 IBP 0,75 2,26

Metoda de separare şi determinare cantitativă a celor 10

antiinflamatoare prezintă o bună precizie, valorile experimentale

Page 49: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

37

obţinute pentru precizia sistemului încadrându-se în intervalul RSD = 0,5400 – 1,0999%, pentru precizia metodei în intervalul RSD = 1,2329 – 2,9573% şi pentru precizia intermediară în intervalul RSD = 1,1444 – 2,3410% (tabelul R5).

Tabelul R5. Precizia sistemului, metodei şi precizia intermediară Precizie (%)

Sistem Metodă Intermediară AINS RSD RSD Interval

încredere RSD Interval încredere

TEN 1,2867 2,9573 96,54 – 101,32 2,3410 97,18 – 100,97 KET 0,5400 1,2329 99,03 – 100,93 1,1981 99,33 – 101,18 PIR 0,9328 1,4965 98,91 – 101,22 1,4337 98,76 – 100,97

MEL 1,0999 1,7843 98,49 – 101,40 1,8807 98,15 – 101,21 KTP 0,5668 2,0637 97,71 – 100,87 1,9085 98,06 – 101,0FB 0,8287 1,1765 99,39 – 101,21 1,1444 98,77 – 100,52

DIC 0,8282 1,5080 98,49 – 100,80 1,5047 98,81 – 101,12 IND 0,6732 1,3233 98,37 – 100,39 1,3651 98,79 – 100,89 NIM 0,9876 1,3872 97,22 – 99,36 1,3148 98,25 – 100,27 IBP 0,8967 1,8375 97,83 – 100,64 1,7300 99,67 – 103,36

Metoda de separare şi determinare cantitativă a celor 10

antiinflamatoare este exactă, datele experimentale arătând o regăsire medie în intervalul 98,31 – 100,43% cu minime în intervalul 96,3 – 98,5% şi maxime în intervalul 101,1 – 103,0% (tabelul R6).

Tabelul R6. Exactitatea metodei

Regăsire (%) AINS Medie Minimă Maximă TEN 100,43 97,9 103,0 KET 98,89 98,2 101,8 PIR 100,41 97,7 101,7

MEL 100,08 97,9 102,7 KTP 100,52 98,1 101,9 FB 100,20 98,5 101,4

DIC 99,52 98,0 101,8 IND 99,80 98,3 101,5 NIM 98,31 96,3 101,1 IBP 99,61 97,4 101,4

Page 50: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

38

CAPITOLUL 7. DETERMINAREA AINS DIN FORME FARMACEUTICE

Având în vedere faptul că pentru determinarea compuşilor studiaţi din forme farmaceutice (comprimate sau capsule) se aplică acelaşi tipic, în rezumatul tezei se prezintă modalitatea de determinare a conţinutului în meloxicam / comprimat, iar pentru alte 9 antiinflamatoare (PIR, TEN, NIM, DIC, IND, IBP, KTP şi KET) se prezintă doar rezultatele obţinute.

Determinarea MEL din comprimate prin HPLC Prepararea soluţiei de lucru După determinarea masei medii, un număr de 20 comprimate

au fost triturate. Din pulberea obţinută s-a luat în lucru o cantitate de aproximativ 0,7g (a grame – corespunzător la 4 comprimate), echivalentă la 60mg MEL.

Pulberea de comprimate s-a dizolvat într-un volum de 90mL MeOH timp de 30min pe baie de ultrasonare, amestecul fiind filtrat prin hârtie cantitativă. Hârtia de filtru se spală cu aproximativ 5mL MeOH. Soluţia filtrată este adusă cu MeOH la un volum de 100mL. Din soluţia astfel obţinută, un volum de 2,5mL se aduc cantitativ la 50mL cu fază mobilă. În continuare, se mai efectuează o diluţie de 2/3 cu fază mobilă. Se obţine astfel o soluţie conţinând MEL în concentraţie de aproximativ 20µg/mL (relaţia 7.1):

( )( )

( )( )

( )( )

60 2,5 620 /

100 50 9mg mL mL

x x g mLmL mL mL

μ= (7.1)

Din soluţia astfel obţinută, un volum de 20µL se injectează în

condiţiile descrise. Au fost preparate un număr de trei soluţii de probă, fiecare din

acestea fiind analizate prin HPLC. Utilizând ecuaţia dreptei de regresie (6.4):

Page 51: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

39

Arie pic = 6,2136 x Concentraţia (µg/mL) + 0,6774

s-a calculat concentraţia MEL pe soluţiile probă analizate cromatografic (Cp în µg/mL) (relaţia 7.2).

pArie 0 ,6774C

6 ,2136−

= (µg/mL) (7.2)

Ţinând cont de toate diluţiile efectuate în cadrul pregătirii

probei pentru analiză, concentraţia în MEL / comprimat va fi (conform relaţiei 7.3):

0,6774 9 50 1100

6,2136 6 2,5 1000Arie MC

a−

= × × × × × (mg/cp) (7.3)

unde: C – mg MEL / comprimat;

A – aria picului măsurată; M – masa medie a comprimatelor; a – cantitatea de pulbere de comprimate luată în lucru.

Rezultatele obţinute sunt reprezentate în tabelul 7.2.

Tabelul 7.2. Date experimentale obţinute la analiza MEL din

comprimate de 15mg

Nr. det.

Masa mediecp (g)

a(g) pulbere

Arie pic

mg MEL/cp determinat (masa medie)

Regăsire (%)

Acceptat (%)

1 137,9 15,05 100,32 2 134,7 14,7 97,98 3

0,1807 0,7956137,6 15,01 100,10

Medie 14,92 99,47 7,5% Concluzie: din datele experimentale prezentate în tabelul 7.2

se constată că valoarea medie a conţinutului în MEL / comprimat (14,92mg/cp) se încadrează în limitele impuse de FR X (15mg ± 7,5 %, adică între 13,875 – 16,125mg).

Rezultatele obţinute în cazul determinării celorlalte AINS din forme farmaceutice se prezintă în tabelul R7.

Page 52: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

40

Tabelul R7. Rezultate experimentale obţinute la determinarea unor antiinflamatoare nesteroidiene din forme farmaceutice prin HPLC

Cantitate (mg) AINS Denumire comercială /

Producător Formă declarată determinată

TEN Tenoxicam Neo-endusix,

Anfarm Hellas S.A., Pharmaceutical Industry

comprimat filmat 20 20,70

KET Ketorol, Dr. Reddy′s Laboratoires

comprimat filmat 10 9,83

PIR Piroxicam LPH – LaborMed PHARMA comprimat 20 20,76

MEL Meloxicam LPH – LaborMed PHARMA comprimat 15 14,92

KTP Ketoprofen SR, Terapia capsulă 200 196,71 DIC Diclofenac, Terapia comprimat 50 49,17

IND Indometacin, Arena Group SA capsulă 50 49,42

NIM Nimesulid LPH – LaborMed PHARMA

comprimat filmat 100 102,50

IBP Paduden, Terapia capsulă 200 198,72

Conform datelor experimentale obţinute, toate formele farmaceutice analizate se încadrează în limitele de abateri prevăzute de FR X, atât în ceea ce priveşte uniformitatea masei cât şi în ceea ce priveşte conţinutul de substanţă activă.

Page 53: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

41

CAPITOLUL 8. METODĂ HPLC RAPIDĂ PENTRU DOZAREA KETOPROFENULUI

DIN PLASMA UMANĂ

Scopul acestui studiu a fost de a dezvolta şi valida o metodă HPLC nouă, simplă şi eficientă pentru cuantificarea KTP în plasma umană, pentru monitorizarea la nivel clinic.

Material şi metodă Soluţiile etalon Substanţa etalon de referinţă de KTP a fost furnizat gratuit de

S.C. Terapia Ranbaxy SA (Cluj-Napoca, România). Solvenţii utilizaţi (ACN – grad HPLC, acid trifluoroacetic şi MeOH grad analitic) au fost produşi de Merck KGaA (Darmstadt, Germania). Apa bidistilată, deionizată pentru injecţii au fost produse de Unitatea (laboratorul) de perfuzii al Universităţii de Medicină şi Farmacie Cluj-Napoca (România). Plasmă umană martor a fost furnizată de Centrul de Transfuzie a Sângelui (Cluj-Napoca, România), de la voluntari sănătoşi, bărbaţi şi femei.

Echipamentele utilizate au fost următoarele: balanţe standard de precizie analitică (Mettler-Toledo, Elveţia), vortex (Scientific Industries, New York, SUA), baie de ultrasonare Elma Transsonic 700 / H (Singen, Germania), sistem Sistemul HPLC serie 1100 Agilent Technologies (Darmstadt, Germania). Separarea cromatografică a fost efectuat pe o coloană Zorbax® SB-C18 (100 x 4.6 mm id, faza staţionară cu particule de 3,5µm), în condiţii izocrate, folosind o fază mobilă de 55:45 (v/v) amestec de ACN şi 1% (v/v) acid trifluoroacetic în apă la 45°C, la un debit de 1,5mL/min. Detecţia KTP a fost efectuat la 257nm, utilizând un detector UV.

Soluţia stoc de KTP (1,27mg/mL) a fost preparată prin dizolvarea unei cantităţi corespunzătoare de KTP în MeOH. Soluţia de lucru (15,32µg/mL) a fost pregătită printr-o diluţie corespunzătoare în plasma umană fără medicamente. Această soluţie a fost folosită pentru a pregăti standardele de calibrare în plasmă, cu concentraţii de 0,153; 0,306; 0,613; 1,226; 1,532; 2,299; 4,597; 7,662 şi, respectiv, 19,155µg/mL. Probele de control, cu concentraţii de

Page 54: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

42

0,460µg/mL (mică), 1,839µg/mL (medie) şi 6,130µg/mL (mare), au fost preparate prin adăugarea volumelor corespunzătoare de soluţie de lucru la plasma umană fără medicamente. Etaloanele de calibrare în plasmă şi soluţiile de control rezultate au fost pipetate în tuburi din polipropilenă de 15mL şi stocate -20ºC până în momentul analizei.

Soluţiile pentru validarea diluţiilor (VAL-DILconc – 38,310µg/mL) au fost proaspăt preparate în ziua analizei, prin adăugarea de 150µL de soluţie stoc la 4850µL plasmă martor.

Etaloanele şi probele de plasmă (0,2mL) au fost deproteinizate cu MeOH (0,6mL). După amestecare în vortex (10s) şi centrifugare (6min la 6000rpm), supernatantul (0,15mL) a fost transferat în flacoane de autoinjector şi, din acestea, alicote de 20µL au fost apoi injectate în sistemul HPLC.

Specificitatea metodei a fost evaluată prin compararea

cromatogramelor obţinute din probele de plasmă cu conţinut de KTP faţă de cele obţinute din diferitele probele de plasmă martor (n = 6). Concentraţia de KTP a fost determinată în mod automat de sistemul de date al instrumentului HPLC utilizând ariile picurilor şi metoda de calibrare cu standard extern. Curba de calibrare a fost determinată cu ajutorul analizei de regresie liniară (ecuaţia 8.1):

Arie pic = a x Concentraţia + b (răspuns ponderat liniar) (8.1)

unde: Concentraţia - concentraţia de analit (µg/mL) Arie pic – aria picului analitului a - panta curbei de calibrare b - interceptul.

Precizia intra-zi (exprimată ca şi coeficient de variaţie, CV%)

şi acurateţea (exprimată ca diferenţa relativă dintre concentraţia obţinută şi ce teoretică, eroare %) au fost determinate prin analiza a cinci injecţii diferite (n = 5) din fiecare probă de control (concentraţie mică, medie şi mare), în aceeaşi zi. Precizia inter-zile şi acurateţea au fost determinate prin analiza unei probe de control de la fiecare nivel de concentraţie (scăzut, mediu si ridicat), în cinci zile diferite (n = 5).

Limita inferioară de cuantificare (LLOQ) a fost stabilită ca fiind etalonul de calibrare cel mai mic care poate fi obţinut cu o acurateţe şi o precizie mai mici de 20%.

Page 55: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

43

Recuperările absolute au fost măsurate prin compararea răspunsului etalonului de plasmă contaminată controlat cu KTP cu răspunsul etalonului în solvent ce are aceeaşi concentraţie de KTP ca şi plasma.

Pentru validarea diluţiei probelor, o probă de VAL-DILconc a fost diluată 1:10 (v/v) cu plasmă martor şi analizată în timpul testelor inter-probe, în cinci zile diferite (n = 5). Cel puţin într-o zi, cinci probe de VAL-DILconc (n = 5) au fost ulterior diluate 1:10 (v/v) şi analizate în scopul de a evalua precizia şi acurateţea pe parcursul aceleaşi zile.

Ulterior a fost studiată stabilitatea KTP în plasmă la nivelele inferioare şi superioare (n = 5). Pentru testul de stabilitate pe termen scurt la temperatura camerei (RTS), probele au fost pregătite şi se păstrează la temperatura camerei timp de 4h, apoi prelucrate şi analizate prin HPLC. Pentru testul de stabilitate post-preparare (PPS), probele au fost pregătite, prelucrate şi termostatate la 25°C în suportul de probe ale autosampler-ului HPLC timp de 12-24 ore înainte de a începe testarea cromatografică. Pentru studiul stabilităţii pe termen lung (LTS), probele au fost depozitate la o temperatură mai mică de -20°C şi analizate pe parcursul a două luni. Pentru studiul stabilităţii la îngheţ - dezgheţ (FTS), probele au fost supuse la trei cicluri de operaţii de îngheţ - dezgheţ în trei zile consecutive (n = 3). Cerinţa pentru stabilitatea medicamentului este ca diferenţa dintre concentraţiile medii ale probelor analizate în diferite condiţii şi concentraţiile nominale să se încadreze în intervalul ± 15%.

Rezultate şi discuţii Prin prezentul studiu se propune o pre-tratare simplă şi rapidă

a probelor de plasmă, care include precipitarea proteinelor (PP) cu MeOH, centrifugare şi injecţie directă LC a unei porţiuni (alicote) de supernatant.

Deoarece nivelurile plasmatice terapeutice de KTP sunt foarte mici (20µg/mL), LLOQ stabilită în metoda noastră poate fi acceptată în scopuri de rutină pentru monitorizarea KTP la concentraţii terapeutice, în plasma adulţilor şi copiilor.

Condiţiile cromatografice, în special compoziţia fazei mobile, au fost optimizate prin mai multe încercări pentru a obţine un semnal bun, timp de retenţie scurt şi, în consecinţă, o productivitate ridicată. Cele mai bune rezultate au fost obţinute cu amestec de ACN şi acid

Page 56: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

44

trifluoroacetic 1% în apă (55:45, v/v) în condiţii izocrate. În condiţiile cromatografice alese, timpul de retenţie al KTP a fost de 1,7 min şi durata analizei a fost de 2,1 min.

Validarea metodei Metoda a fost validată în conformitate cu reglementările

internaţionale. Cromatogramele reprezentative pentru plasmă fără KTP şi plasma contaminată controlat cu KTP la LLOQ sunt prezentate în figura 8.2. Nu au existat compuşi (picuri) care să interfereze dintre componentele endogene plasmatice, la şi în jurul timpului de retenţie al KTP.

Fig. 8.2. Cromatogramele pentru plasmă fără KTP (imaginea de sus),

plasma contaminată controlat cu KTP la limita inferioară de cuantificare (0,153µg/mL) (mijloc) şi o probă de plasmă obţinută de

la un pacient la 2 ore după administrarea a 50mg KTP (concentraţie găsite: 4,428µg/mL) (imagine jos)

Page 57: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

45

Curbele de calibrare au fost liniare în intervalul de concentraţie 0,153 - 19,155µg/mL în plasmă umană, cu un coeficient de corelaţie mai mare de 0,9997. LLOQ a fost 0,153µg/mL. Valorile obţinute în timpul procesului de validare al probelor de plasmă (pentru precizie şi acurateţe intra- şi inter-zi) sunt prezentate în tabelele 8.2 şi 8.3.

Tabelul 8.2. Precizia intra-zi (CV%), acurateţea (eroare %) şi

gradul de recuperare - determinarea KTP în plasma umană (n = 5) -

Concentraţia găsită

(medie) Grad de recuperare Concentraţie nominală (µg/mL) µg/mL ± SD

CV (%)

Eroare (%)

(%) ± SD 0,1532 0,1524 3,57 2,3 -0,5 101,1 2,1 0,4597 0,4416 17,47 4,0 -3,9 96,5 3,9 1,8389 1,7864 24,68 1,3 -2,9 100,3 1,3 6,1296 5,9327 28,72 0,5 -3,2 99,2 0,5

Tabelul 8.3. Precizia inter-zi (CV%), acurateţea (eroare %) şi

gradul de recuperare - determinarea KTP în plasma umană (n = 5) -

Concentraţia găsită

(medie) Grad de recuperare Concentraţie nominală (µg/mL) µg/mL ± SD

CV (%)

Eroare (%)

(%) ± SD 0,1532 0,1606 9,61 6,0 4,8 103,6 3,5 0,4597 0,4448 5,13 1,2 -3,2 97,9 0,7 1,8389 1,7808 19,84 1,1 -3,2 99,6 1,5 6,1296 5,9578 88,27 1,5 -2,8 99,2 1,5

Toate valorile pentru acurateţe şi precizie au fost în limitele

recomandate. Valorile gradului de recuperare au fost cuprinse între 96,5 – 103,6%. Diluţiile din plasmă au putut fi făcute cu un CV% mai mic de 1,8% şi o acurateţe mai mică de 2,6% pentru determinările în cadrul analizelor şi printre analize (tabelul 8.4).

KTP a arătat o bună stabilitate în probele de plasmă la temperatura camerei timp de 4h (CV -5,0% la nivelul inferior şi -3,5% la nivelul superior), precum şi o bună stabilitate post-preparare în autosampler pentru cel puţin 17 ore la 25°C înainte de testarea

Page 58: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

46

cromatografică (CV de -3,2% la nivelul inferior şi -2,9% la nivelul superior).

Tabelul 8.4. Precizia (CV%), acurateţea (eroare %) şi gradul de recuperare

- validarea diluţiei (n = 5) -

Concentraţia găsită (medie)

Concentraţie nominală (µg/mL) µg/mL ± SD

CV (%)

Bias (%)

Intra-zi 3,831 3,889 69,3 1,8 1,5 Inter-zi 3,831 3,932 29,3 0,7 2,6 KTP are o bună stabilitate pe termen lung în plasma stocată

sub -20°C timp de 5 săptămâni (CV de -2,1% la nivelul inferior şi 0,1% la nivelul superior), precum şi o bună stabilitate la succesiunea îngheţ - dezgheţ în plasma trecută prin trei cicluri de îngheţ - dezgheţ (CV de -7.5% la nivelul inferior şi -2,2% la nivelul superior).

Metoda validată de analiză ce a fost dezvoltată s-a aplicat într-un studiu de farmacocinetică a KTP la voluntari sănătoşi. O cromatogramă reprezentativă al unei probe de plasmă obţinută de la un voluntar sănătos la 2 ore după administrarea KTP, este prezentată în figura 8.2 (concentraţia găsită: 4,428µg/mL).

8.4. Concluzii Metoda dezvoltată în prezentul studiu este simplă, rapidă,

precisă şi nu implică un cost deosebit. Prin comparaţie cu alte metode de analiză HPLC publicate, pentru determinarea cantitativă a KTP în plasma umană sau animală, metoda propusă de doctorandul în farmacie se comportă mai bine în ceea ce priveşte viteza şi costurile, atribute esenţiale pentru metodele utilizate în analize de rutină. Această metodă a fost validată în intervalul de concentraţie 0,153-19,155µg/mL, care acoperă concentraţiile plasmatice terapeutice (< 20µg/mL) de KTP. Această metodă se pretează pentru o productivitate crescută şi a fost aplicată cu succes într-un studiu farmacocinetic, dar poate avea aplicaţii pe scară largă în monitorizarea KTP la concentraţii de nivel terapeutic, a interacţiunilor medicamentoase şi în studii toxicologice.

Page 59: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

47

CONCLUZII GENERALE

Lucrarea de doctorat, în afara capitolului introductiv şi a scopului şi obiectivelor tezei, este structurată în două parţi majore, o parte teoretică ce conţine un număr de 4 capitole şi o parte personală ce conţine un număr de 4 capitole, concluziile generale, perspectivele de cercetare şi bibliografia utilizată.

Partea teoretică prezintă: În Capitolul 1 se prezintă unele generalităţi asupra

medicamentelor AINS, mecanismele inflamaţiei, tratamentul acesteia, clasificarea AINS, relaţia structură – activitate biologică, unele aspecte farmacologice generale (farmacocinetică, farmacodinamie, farmacoterapie) precum şi unele aspecte privind cele 10 medicamente antiinflamatoare studiate (MEL, PIR, TEN, NIM, IBP, IND, DIC, KTP, KET şi FB) cum sunt: structura chimică, unele proprietăţi fizico – chimice sau aspecte farmacologice particulare.

Capitolul 2 este dedicat prezentării modului de absorbţie a

luminii de către compuşii organici. Se discută aspecte privind originea spectrului UV-VIS, principiile generale ale spectrometriei de absorbţie şi unele aplicaţii ale acesteia în analiză, ca de exemplu confirmarea identităţii substanţelor, spectrofotometria în UV-VIS ca modalitate de detecţie în HPLC, identificarea compuşilor separaţi prin HPLC, puritatea picului cromatografic.

Capitolul 3 al tezei prezintă aspecte asupra analizei

medicamentelor AINS prin HPLC (generalităţi ale metodei HPLC, coloane cromatografice utilizate în HPLC, aplicaţii ale HPLC în analiza medicamentelor şi un studiu bibliografic asupra determinării substanţelor studiate prin această tehnică).

Ultimul capitol al părţii teoretice, capitolul 4 prezintă modul

de evaluare a rezultatelor obţinute, anume validarea metodei analitice. După o prezentare generală a noţiunilor de validare, se prezintă informaţii asupra specificităţii / selectivităţii metodei, modul

Page 60: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

48

de stabilire a lungimii de undă, identificarea picului corespunzător analitului studiat, verificarea purităţii picului, linearitatea metodei, linearitatea rezultatelor, limita de detecţie, limita de cuantificare, intervalul de lucru, precizia şi exactitatea, robusteţe şi stabilitatea metodei.

Partea personală a tezei este constituită din următoarele

capitole: În Capitolul 5 se prezintă modul în care a fost elaborată

metoda de separare prin HPLC. Se discută pentru început aspecte privind solubilitatea AINS studiate în diverşi solvenţi, optimizarea prin spectrofotometrie în UV-VIS a lungimilor de undă pentru detecţia în HPLC, înregistrându-se spectrele de absorbţie în diferiţi solvenţi (MeOH, ACN, apă, soluţii tampon, soluţii apoase de metanol de diferite concentraţii). În continuare, se arată modalitatea prin care se construieşte o bibliotecă spectrală pentru a fi folosită la determinări calitative în cadrul analizei prin HPLC. În ceea ce priveşte separarea propriu-zisă prin HPLC, se prezintă influenţa pe care o are debitul fazei mobile şi compoziţia acesteia asupra performanţelor separării cromatografice. Odată stabilite condiţiile de separare se discută modul de alegere judicioasă a lungimilor de undă de detecţie pentru fiecare compus studiat în parte.

Capitolul 6 al tezei de doctorat este dedicat validării metodei

unice de analiză elaborate pentru fiecare din cei 10 AINS studiaţi. Pentru fiecare compus studiat se prezintă modul prin care se

face identificarea acestuia din soluţii de probe, studiul linearităţii (atât linearitatea metodei cât şi linearitatea rezultatelor), limitei de detecţie, limitei de cuantificare, preciziei (precizia sistemului, precizia metodei, precizia intermediară) şi exactitatea. La final, toate aceste date sunt grupate ca şi concluzii ale validării, pentru a scoate mai repede în evidenţă toţi aceşti parametri.

După cum s-a observat din datele experimentale obţinute în urma validării metodei pentru cele 10 medicamente AINS, durata analizei este de maxim 10 minute, timp în care se pot separa toţi cei 10 componenţi (dacă se află în concentraţie mică, deoarece în acest caz lăţimea la bază a picurilor este mică având astfel valori suficient de bune pentru rezoluţie). Pe de altă parte, deoarece este puţin probabil ca toţi cei 10 compuşi să se afle simultan într-o probă,

Page 61: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

49

această metodă unică poate fi aplicată cu succes pentru separarea, identificarea şi determinarea cantitativă a oricărui compus din cei 10 menţionaţi. Cercetări preliminare denotă faptul că există şi alte medicamente din această clasă ce pot fi separate prin această metodă.

În ceea ce priveşte linearitatea metodei, conform datelor experimentale obţinute, pentru toate cele 10 medicamente antiinflamatoare studiate, metoda este liniară, coeficienţii de regresie fiind în toate cazurile mai mari de 0,9990. Pentru KET, DIC, NIM şi IBP, domeniul de lucru porneşte de la o concentraţie mai mare decât în celelalte cazuri deoarece pentru compuşii menţionaţi ariile picurilor la concentraţii mai mici de 1μg/mL sunt mai mici decât limita de detecţie, în unele cazuri având valori comparative cu zgomotul de fond.

În acelaşi timp, în toate situaţiile rezultatele calculate sunt în bună corelaţie cu valorile teoretice, la reprezentarea grafică a acestei dependenţe se obţin drepte cu pantă unitară sau foarte apropiată de unitate, cu intercept foarte mic şi cu valori ale coeficienţilor de regresie foarte buni (mai mari de 0,9990).

Metoda elaborată şi validările efectuate confirmă faptul că în toate cazurile se obţin valori bune pentru limita de detecţie (0,31 – 1,48μg/mL) şi limita de cuantificare (1,57 – 4,50μg/mL).

De asemenea, metoda de separare şi determinare cantitativă a celor 10 AINS prezintă o bună precizie, valorile experimentale obţinute pentru precizia sistemului încadrându-se în intervalul RSD = 0,5400 – 1,0999%, pentru precizia metodei în intervalul RSD = 1,2329 – 2,9573% şi pentru precizia intermediară în intervalul RSD = 1,1444 – 2,3410%.

Metoda de separare şi determinare cantitativă a celor 10 AINS este exactă, datele experimentale arătând o regăsire medie a acestor medicamente în intervalul 98,31 – 100,43% cu minime în intervalul 96,3 – 98,5% şi maxime în intervalul 101,1 – 103,0%.

Capitolul 7 al tezei prezentă o serie de aplicaţii ale metodei de

determinare prin HPLC a medicamentelor antiinflamatoare studiate şi anume determinarea: MEL din comprimate (Meloxicam LPH – LaborMed PHARMA, 15 mg), PIR din comprimate (Piroxicam LPH – LaborMed PHARMA, 20 mg), TEN din comprimate filmate (Tenoxicam Neo-endusix, Anfarm Hellas S.A., Pharmaceutical

Page 62: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

50

Industry, 20 mg), NIM din comprimate (Nimesulid LPH – LaborMed PHARMA, 100 mg), IBP din capsule (Paduden, Terapia, 200 mg), IND din capsule (Indometacin, Arena Group SA), DIC din comprimate (Diclofenac, Terapia, 50 mg), KTP din capsule (Ketoprofen SR, Terapia, 50 mg), KET din comprimate filmate (Ketorol, Dr. Reddy′s Laboratoires, 10 mg).

Conform datelor experimentale obţinute, toate formele farmaceutice analizate se încadrează în limitele de abateri prevăzute de FR X, atât în ceea ce priveşte uniformitatea masei cât şi în ceea ce priveşte conţinutul de substanţă activă.

În Capitolul 8 este exemplificată o aplicaţie practică în domeniul clinic, respectiv o validare de metodă analitică HPLC rapidă, de înaltă productivitate (durata analizei foarte mică, de ordinul minutelor) pentru dozarea KTP din plasma umană a unui lot de voluntari sănătoşi. Metoda de separare este optimizată din punctul de vedere al fazei mobile, dimensiunilor coloanei şi pre-tratamentului probelor din plasmă.

Perspective de cercetare Având în vedere faptul că metoda de determinare prin HPLC,

dezvoltată şi validată, a fost concepută pentru un număr restrâns de medicamente AINS, un lucru ce merită continuat constă în modificarea parţială a compoziţiei fazei mobile astfel încât să se rezolve coeluţia parţială sau totală a unor componenţi. În acest mod se poate mări rezoluţia determinării, în special în situaţiile în care timpii de retenţie ai compuşilor separaţi sunt apropiaţi.

O altă perspectivă de cercetare constă în introducerea şi a altor medicamente din grupa AINS în lista celor care pot fi separaţi, identificaţi şi determinaţi cantitativ prin această metodă. În acest fel se poate obţine o metodă unică care să furnizeze rezultate viabile pentru un număr crescut de AINS.

De asemenea, faptul că în compoziţia fazei mobile am introdus tampon acetat, MeOH şi ACN este un argument în plus în cazul posibilităţii de a folosi aceleaşi condiţii de separare prin HPLC dar cu modificare a sistemului de detecţie şi anume folosirea unui detector spectrometru de masă (cuplaj LC – MS). Acest lucru este

Page 63: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

51

util, deoarece astfel s-ar putea mări sensibilitatea detecţiei şi astfel metoda se pretează şi pentru determinarea AINS din matrici complexe (de exemplu, medii biologice) unde concentraţia acestora este mult mai scăzută. Investigarea apariţiei metaboliţilor, permisă de tehnica de detecţie propusă (MS), va conduce la evaluări ulterioare cu privire la capacitatea metodei HPLC propuse de a rezolva separarea acestora, precum şi separarea acestora de impurităţile din matrice.

Nu în ultimul rând, o posibilitate modernă de rezolvare a coeluţiilor, fără modificarea fazei mobile sau utilizarea unui program de gradient complex, constă în aplicarea cromatografiei ortogonale, respectiv folosirea a două (rareori, mai multe) coloane cu faze staţionare de selectivităţi diferite, dar complementare faţă de scopul metodei. Prin această tehnică, compuşii ce coeluează din prima coloană sunt rezolvaţi total pe a doua coloană, înseriată sau intercalată în fluxul fazei mobile prin selecţia controlată automat de către sistemul HPLC.

Page 64: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

52

BIBLIOGRAFIE

1. Pitea M, Ghiran D, Mureşan A. Medicamente antiinflamatoare nesteroidiene. Cluj-Napoca: Editura Dacia; 1997. ISBN: 973-3506796. 2. Pavelescu M. Medicamente antiinflamatoare nesteroidiene (AINS) şi antireumatice specifice. În: Cristea AN. Tratat de farmacologie. Ediţia 1. Ed. Medicală. Bucureşti; 2000. p. 617-638. ISBN: 973-3905356. 3. Wagner W, Khanna P, Furst DE. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs, disease-modifying antirheumatic drugs, nonopioid anagesics, & drugs used in gout. În: Katzung BG (editor). Basic and Clinical Pharmacology. 9th ed. New-York: McGraw-Hill; 2004. p. 576-603. ISBN: 007-1440976. 4. Morrow JD, Roberts II LJ. Lipid – derived autacoids. Eicosanoids and platelet – activating factor. În Hardman JG, Limbird LE, Goodman Gilman A, editors. Goodman and Gilman’s the pharmacological basis of therapeutics. 10th ed. New-York: McGraw-Hill; 2001. p. 669-686. ISBN: 0071354697. 5. Roberts II LJ, Morrow JD. Analgesic – antipyretic and antiinflammatory agents and drugs employed in the treatment of gout. În Hardman JG, Limbird LE, Goodman Gilman A, editors. Goodman and Gilman’s the pharmacological basis of therapeutics. 10th ed. New-York: McGraw-Hill; 2001. p. 687-732. ISBN: 0071354697. 6. Cuculici GP (editor). Lippincott farmacologie ilustrată. Ediţia a 2-a. Ed. medicală Callisto; 2000. ISBN: 973-9861253. Traducere în limba română: Mycek MJ, Harvey RA, Champe PC, Fischer BD. Lippincott’s illustrated review: Pharmacology. 2nd ed. Baltimore: Lippincott Williams and Wilkins; 1997. 7. Mogoşan C, Pop C. Mecanisme de acţiune ale medicamentelor utilizate în farmacoterapia durerii. În: Zaharia V. (coord.). Rolul farmacistului în terapia durerii. Cluj-Napoca: Ed. Medicală Universitară “Iuliu Haţieganu”; 2010. p. 26-57. ISBN: 978-9736933639. 8. Brittain HG (editor). Analytical profiles of drug substances and excipients. Vol.28. Orlando: Academic Press; 2001. p.197. ISBN: 978-0122608285. 9. Council of Europe (editor). European pharmacopoeia. 6th edition; 2007. ISBN: 978-9287160546. 10. Florey K (editor). Analytical profiles of drug substances and excipients. Vol.15. Orlando: Academic Press, Inc; 1986. p. 509-531. ISBN: 012-2608151. 11. Vane JR. Inhibition of prostaglandin synthesis as a mechanism of action for the aspirin-like drugs. Nature. 1971;231:232–235. 12. Hanch C, Sammes PG, Taylor JB. Comprehensive Medicinal Chemistry. Vol.6. Oxford: Pergamon; 1990. p.711. 13. Piel B, Pirotte B, Delneuville I, Neven P, Labres G, Delarge J et al. Study of the influence of both cyclodextrins and L-lysine on the aqueous solubility of nimesulide; isolation and characterization of nimesulide-L-lysine-cyclodextrin complexes. J Pharma Sci. 1997;86(4):475-480. 14. Budavari S, O’Neil M, Smith A, Heckelman P, Obenchain J. The Merck Index. Twelfth Edition. CRC Press; 1996. ISBN: 978-0911910124.

Page 65: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

53

15. Pirotte B, Piel G, Neven P, Delneuville I, Geczy J. PCT Int. Appl. WO 95, 34, 533; Chem.Abs. 124, 242309d; 1996. 16. Macnaughton SJ, Kikic I, Foster NR, Alessi P, Cortesi A, Colombo I. Solubility of antiinflammatory drugs in supercritical carbon dioxide. J Chem Eng Data. 1996;41:1083-1086. ISSN: 0021-9568. 17. Fallavena PRB, Schapoval EES. pKa determination of nimesulide in methanol-water mixtures by potentiometric titrations. Int J Pharm. 1997;158:109-112. ISSN: 1873-3476. 18. Magni E. Nimesulide – an overview. Drug Invest. 1991;3(2):1-3. 19. Singh S, Sharda N, Mahajan L. Spectrophotometric determination of pKa of nimesulide. Int J Pharm. 1999;176:261-264. ISSN: 1873-3476. 20. British Pharmacopoeia Commission. British Pharmacopoeea. Stationery Office Books; 2001. ISBN: 978-0113224463. 21. Mihalic M, Hofman H, Kajfez K, Kuftimek J, Blazevic N, Zinic M. Physicochemical and analytical characteristics of piroxicam. Acta Pharm. 1982;32:13. ISSN: 1846-9558. 22. Mesecar L. Principles of drug action and therapeutics VIII. Lecture 2- Chemistry of non – steroidal anti – inflammatory drugs (NSAID’s). Pharmacy 408. University of Illinois at Chicago.2001. 23. Alteraş I, Cajan N, Comorşan S, Dăncescu P. Manual de laborator clinic. Editura Medicală; 1962. p. 67-73. 24. Comisia Farmacopeei Române. Farmacopeea Română. Ediţia a X-a. Bucureşti: Ed. Medicală; 1993. ISBN: 973-3902268. 25. Padmakumar B. NSAID – An overview with special reference to COX-2 inhibitors. Medical College. Alappuzha. 26. Mehanna A. NSAIDs: chemistry and pharmacological actions. Am J Pharm Educ. 2003;2:67. ISSN: 1553-6467. 27. Thomas AT, Sibin AK, Vinu MJ. A drug utilization study to evaluate the rationality in the use of NSAID and anti ulcer agents. Calicut Medical Journal. 2003;1(1):e9. ISSN: 0972-9518. 28. Brittain HG (editor). Analytical profiles of drug substances and excipients. Vol.22. San Diego: Academic Press; 1993. p. 433-459. 29. Mederos A, Dominguez S, Orlandini A, Ghilardi CA, Cecconi F, González-Vergara E. Speciation study of the anti-inflammatory drug tenoxicam (Htenox) with Cu(II): X-ray crystal structure of [Cu(tenox)2(py)2]•EtOH, J Inorg Biochem. 2003;95(2-3):131-140. ISSN: 1873-3344. 30. Shingbal DM, Sarjyotishi S. Quantitative determination of piroxicam in a new formulation. Indian Drugs. 1988;25(12):531-532. ISSN: 0019-462X. 31. Lednicer D, Mitscher L, George G. Organic chemistry of drug syntesis. Vol.4. New York: John Willey and Sons, Inc; 1990. p.173. 32. Uverferth K, Laban G, Waltraud G, Lofamann D. On the preparation of 4-hydroxy- 2-methyl- 3-N- (2-pyridyl)- 2H-1,2 -benzothiazinecarboxamide-1,1-dioxide. Pharmazie. 1989;44(9):641-42. ISSN: 0031-7144. 33. Windholz M (editor). The Merck index. Ninth edition. New York: Merck Co.1976.

Page 66: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

54

34. Pavia DL, Lampman GM, Kriz GS Jr. Introduction to Spectroscopy. Philadelphia: W.B. Saunders Company; 1979. 35. Owen T. Fundamentals of modern UV – visible spectroscopy. Hewlett-Packard Company; 1996. 36. Olsen ED. Modern optical methods of analysis. New York: McGraw–Hill; 1975. p. 1–155. 37. Harris DC. Quantitative Chemical Analysis. Fourth Edition. New York: W.H. Freeman and Company; 1995. p. 122–154, 523–556. 38. Tănase IG. Tehnici şi metode spectrometrice de analiză. Ed. Ars Docendi, Universitatea Bucureşti; 2001. p. 1– 232. 39. Bojiţă M, Săndulescu R, Roman L, Oprean R. Analiza şi controlul medicamentelor. Vol.2. Metode instruemntale în analiza şi controlul medicamentelor. Deva: Ed. Intelcredo; 2003. p. 65-76. ISBN: 973-8197153. 40. Skoog DA, Leary JJ. Principles of Instrumental Analysis. Fourth Edition. Tokyo: Saunders College Publishing; 1992. ISBN: 978-0030233432. 41. Skoog DA, West DM. Principles of Instrumental Analysis. 3rd revised edition. Thomson Learning; 1985. ISBN: 978-0030012297. 42. Dorneanu V, Stan M, Musteaţă MF. Chimie analitică. Iaşi: Ed. Gr. T. Popa - UMF Iaşi; 2003. 43. Ewing GW. Instrumental Methods of Chemical Analysis. Tokyo: McGraw-Hill Koga Kusha Ltd; 1985. 44. Rothe M, Pragst F, Kohn A. Identifying Toxins Using an Extensive Fast and Automated HPLC Spectral Library. Agilent Technologies. Disponibil la: http://www.chem.agilent.com/temp/rad94E67/00033841.pdf, consultat: Ianuarie 2006. 45. Bogusz M, Wu M. Standardized HPLC/DAD system, based on retention indices and spectral library, applicable for systematic toxicological screening. J Anal Toxicol. 1991;15(4):188–197. 46. Papadoyannis IN, Samanidou VF. Validation of HPLC, Encyclopedia of Chromatography. Marcel – Deckker, Inc; 2003. Disponibilă online la: www.dekker.com. 47. Wells M, Dantus M. Validation of chromatographic method. In Cazes J. (editor). Ewing’s Analytical Instrumentation Hadbook. 3rd edition. Marcel Dekker; 2005. p. 1015–1033. 48. Papadoyannis IN, Gika HG. Peak purity determination with a diode array detector, Encyclopedia of Chromatography. Marcel – Deckker, Inc.2003. Disponibilă online la: www.dekker.com. 49. Center for Drug Evaluation and Research. Reviewer guidance. Validation of chromatographic methods. CEDER.1994. Disponibilă la: http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM134409.pdf 50. Brittain HG (editor). Profiles of drug substances, excipients and related methodology. Vol.32. First edition. New Jersey: Elsevier; 2005. ISBN: 978-0122608322. 51. Nemeth T, Haghedooren E, Noszal, Hoogmartens J, Adams E. Three methods to characterize reversed phase liquid chromatographic columns applied to

Page 67: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

55

pharmaceutical separations. J Chemometrics. 2008; 22:178-185. DOI: 10.1002/cem.1108. 52. Weston A, Brown PR. HPLC and CE. Principles and practice. San Diego: Academic Press; 1997. p. 1-23. ISBN: 978-0121366405. 53. Wang Y, Lehmann R, Lu X, Zhao X, Xu G. Novel, fully automatic hydrophilic interaction/reversed-phase column-switching high-performance liquid chromatographic system for complementary analysis of polar and apolar compounds in complex samples. J Chromatogr A. 2008;1204:28-34. 54. Hendriks MMWB. Chapter 1. Chromatographic introduction. În: Nonlinear retention modeling in liquid chromatography. Teza de dizertaţie. Universitatea din Groningen.1996. Disponibilă la: http://dissertations.ub.rug.nl/FILES/faculties/science/1996/m.m.w.b.hendriks/c1.pdf.. 55. Ardrey RE. Liquid chromatgraphy – mass spectrometry: an introduction. Chichester: John Wiley and Sons Ltd; 2003. p. 7-31. 56. Niessen WMA. Liquid chromatography – mass spectrometry. Third edition. Boca Raton: CRC Press; 2006. p. 3-22. ISBN: 978-0824740825. 57. Starek M, Krzek J. A review of analytical techniques for determination of exicams, nimesulide and nabumetone. Talanta. 2009;77:925-942. ISSN: 1873-3573. 58. Louw S, Pereira AS, Lynen F, Hanna-Brown M, Sandra P. Serial coupling of reverse-phase and hydrophilic interaction liquid chromatography to broaden the elution window for the analysis of pharmaceutical compounds. J Chromatogr A. 2008;1208:90-94. 59. Gao LQ, Wu D, Tao XL, Gang YY. Study on the relative bioavailability of tenoxicam capsules. Yaowu Fenxi Zazhi. 2006;26(5):589-591. 60. Nakamura A, Nakashima MN, Wada M, Nakashima K. Semi-micro column HPLC of three oxicam non-steroidal anti-inflammatory drugs in human blood. Bunseki Kagaku. 2005; 54(9):755-760. 61. Doliwa A, Santoyo S, Campanero MA, Ygartua P. Sensitive LC determination of piroxicam after in vitro transdermal permeation studies. J Pharm Biomed Anal. 2001;26(4):531-537. ISSN: 1873-264X. 62. Brum Jr. L, Ceni DC, Fronza M, de Oliveira PR, Dalmora SL. Validation of an LC-tandem MS/MS method for the determination of etoricoxib in human plasma and pharmaceutical formulations. J Liq Chrom Relat Tech. 2006;29(1-4):123-135. ISSN: 1520-572X. 63. Savaser A, Karatas A, Ozkan Y, Yuksel N, Ozkan SA, Baykara T. Validated LC determination of the piroxicam -.beta.#NAME?. Chromatographia. 2004;59(9-10):555-560. ISSN: 1612-1112. 64. Dasandi B, Shivaprakash, Saroj H, Bhat KM. LC determination and pharmacokinetics of meloxicam. J Pharm Biomed Anal. 2002;28(5):999-1004. ISSN: 1873-264X. 65. Malliou ET, Markopoulou CK, Koundourellis JE. Simultaneous determination of clobutinol together with some anti-inflammatory drugs in urine by HPLC. J Liq Chrom Relat Tech. 2004;27(10):1565-1577. ISSN: 1520-572X.

Page 68: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

56

66. Huang Y, Liang MZ, Yu Q, Qin YP, Zou YG. RP-HPLC determination of meloxicam in human plasma. Yaowu Fenxi Zazhi. 2002; 22(3):183-185. 67. Baeyens WRG, van der Weken G, D'haeninck E, Garcia-Campana AM, Vankeirsbilck T, Vercauteren A et al. Application of an alkyl-diol silica precolumn in a column-switching system for the determination of meloxicam in plasma. J Pharm Biomed Anal. 2003;32(4-5):839-846. ISSN: 1873-264X. 68. Pavan Kumar VV, Vinu MCA, Ramani AV, Mullangi R, Srinivas NR. Simultaneous quantitation of etoricoxib, salicylic acid, valdecoxib, ketoprofen, nimesulide and celecoxib in plasma by high-performance liquid chromatography with UV detection. Biomedical Chromatography. 2006;20(1):125-132. ISSN: 1099-0801. 69. Rao RN, Meena S, Nagaraju D, Rao ARR. Development and validation of a reversed-phase liquid chromatographic method for separation and simultaneous determination of COX-2 inhibitors in pharmaceuticals and its application to biological fluids. Biomedical Chromatography. 2005;19(5):362-368. ISSN: 1099-0801. 70. Maltese A, Maugeri F, Bucolo C. Rapid determination of nimesulide in rabbit aqueous humor by liquid chromatography. J Chromatogr B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 2004;804(2):441-443. 71. Ganhimathi M, Ravi TK, Renu SK. Determination of repaglinide in pharmaceutical formulations by HPLC with UV detection. Analytical Sciences. 2003;19(12):1675-1677. 72. Nagaralli BS, Seetharamappa J, Gowda BG, Melwanki MB. Liquid chromatographic determination of cetirizine hydrochloride and paracetamol in human plasma and pharmaceutical formulations. J Chromatogr B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 2003; 798(1):49-54. 73. Chmielewska A, Konieczna L, Plenis A, Bieniecki M, Lamparczyk H. Determination of diclofenac in plasma by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. Biomedical Chromatography. 2006;20(1):119-124. ISSN: 1099-0801. 74. Wu AT, Massey IJ. Simultaneous determination of ketorolac and its hydroxylated metabolite in plasma by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr Biomed Appl. 1990; 99:241-246. 75. Kumar TR, Shitut NR, Kumar PK, Vinu MCA, Kumar VVP, Mullangi R et al. Determination of rosuvastatin in rat plasma by HPLC: validation and its application to pharmacokinetic studies. Biomedical Chromatography. 2006;20(9):881-887. ISSN: 1099-0801. 76. Kocyigit-Kaymakcoglu B, Unsalan S, Rollas S. Determination and validation of ketoprofen, pantoprazole and valsartan together in human plasma by high performance liquid chromatography. Pharmazie. 2006;61(7):586-589. 77. Chawla S, Ghosh S, Sihorkar V, Nellore R, Kumar TRS, Srinivas NR. High-performance liquid chromatography method development and validation for simultaneous determination of five model compounds, antipyrine, metoprolol, ketoprofen, furosemide and phenol red, as a tool for the standardization of rat in situ intestinal permeability studies using timed wavelength detection. Biomedical Chromatography. 2006;20(4):349-357. ISSN: 1099-0801.

Page 69: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

57

78. Gallo P, Fabbrocino S, Vinci F, Fiori M, DaneseV, Nasi A et al. Multi-residue determination of non-steroidal anti-inflammatory drug residues in animal serum and plasma by HPLC and photo-diode array detection. J Chromatogr Sci. 2006;44(10):585-590. ISSN: 0021-9665. 79. Espinosa-Mansilla A, Munoz de la Pena A, Gonzalez Gomez D, Canada-Canada F. HPLC determination of ciprofloxacin, cloxacillin and ibuprofen drugs in human urine samples. J Separ Sci. 2006;29(13):1969-1976. ISSN: 1615-9314. 80. Kim CK, Jae JP, Hwang HR, Ban E, Maeng JE, Kim MK et al. Simple and sensitive HPLC method for determination of gemfibrozil in human plasma with fluorescence detection. J Liq Chrom Relat Tech. 2006;29(1-4):403-414. 81. Charoo NA, Ali Shamsher AA, Kohli K, Pillai KK, Rahman Z. Simple and sensitive high-performance liquid chromatographic method for determination of transdermally applied flurbiprofen in rat plasma and excised skin samples. Chromatographia. 2005;62(9-10):493-497. 82. Shen HR, Li ZD, Zhong MK. RP-HPLC determination of atorvastatin in beagle dog plasma. Yaowu Fenxi Zazhi. 2006; 26(6):718-720. 83. Shen HR, Li ZD, Zhong MK. HPLC assay and pharmacokinetic study of atorvastatin in beagle dogs after oral administration of atorvastatin self-microemulsifying drug delivery system. Pharmazie. 2006;61(1):18-20. 84. Khuhawar MY, Rind FMA, Rajper AD. High-performance liquid chromatographic determination of isoniazid, pyrazinamide, and indomethacin in pharmaceutical preparations. Acta Chromatographica. 2005;15:269-275. ISSN: 1233-2356. 85. Lee HW, Won KJ, Cho SH, Ha YH, Park WS, Yim HT et al. Quantitation of niflumic acid in human plasma by high performance liquid chromatography with ultraviolet absorbance detection and its application to a bioequivalence study of talniflumate tablets. J Chromatogr B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 2005;821(2):215-220. 86. Gonzalez Martin MI, Sanchez Gonzalez CI, Jimenez Hernandez A, Garcia Cachan MD, Castro de Cabo MJ, Garzon Cuadrado AL. Determination by high-performance liquid chromatography of phenylbutazone in samples of plasma from fighting bulls. 2002;769(1):119-126. 87. Han CH, Nie XC. Determination of the concentrations of four components in Trabit injection A by reversed-phase ion-pair HPLC. Yaowu Fenxi Zazhi. 2001;21(2):88-91. 88. Shaji J, Jain V. Reverse phase HPLC method development an validation for determination of Meloxicam in bulk and pharmaceutical formulation. Int J Pharm Sci Res. 2011;2(1):121-129. ISSN: 0975-8232. 89. Nemutlu E, Sayin F, Başci NE, Kir S. A validated HPLC method for the determination of meloxicam in pharmaceutical preparations. Hacettepe University Journal of the Faculty of Pharmacy. 2007;27(2):107-118. ISSN: 1300-0608. 90. Hoyo-Vadillo C, Escobar Y, Escobar-Islas E, Venturelli CR. Pharmacokinetics of the commonly used NSAID: Nimesulide by oral administration to healthy Mexican volunteers. Proc West Pharmacol Soc. 2003;46:168-196.

Page 70: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

58

91. Zhao X, Chen D, Li K, Wang D. Sensitive liquid chromatographic assay for the simultaneous determination of ibuprofen and its prodrug, ibuprofen eugenol ester, in rat plasma. Yakugaku Zasshi. 2005;125(9):733-737. 92. Birajdar AS, Meyyanathan S, Suresh B. A RP-HPLC method for determination of diclofenac with rabeprazole in solid dosage form. Pharma Science Monitor. 2010:448-455. ISSN: 0976-7908. 93. Dhaneshwar SR, Bhusari VK. Validated HPLC method for simulaneous quantitation of diclofenac sodium and misoprostol in bulk drug and formulation. Der Chemica Sinica. 2010;1(2):110-118. ISSN: 0976-8505. 94. Madni AU, Ahmad M, Akhtar N, Usamn M. New simultaneous High Performance Liquid Chromatographic method for determination of NSAIDs and opioid analgesics in advanced drug delivery systems and human plasma. World Academy of Science, Engineering and Technology. 2009;55:158-163. ISSN: 2010-3778. 95. Bandarkar FS, Vavia PR. A stability indicating HPLC method for the determination of meloxicam in bulk and commercial formulations. Trop J Pharm Res. 2009;8(3):257-264. 96. Battu PR, Reddy MS. RP-HPLC method for simultaneous estimation of paracetamol and ibuprofen in tablets. Asian J Research Chem. 2009;2(1):70-72. ISSN: 0974-4169. 97. Sultana N, Arayne MS, Shafi N, Siddiqui FA. Simultaneous RP-LC Analysis of Diltiazem and Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs in Pharmaceutical Formulations and Human Serum. Chromatographia. 2010;71(1-2):71-77. 98. Sora I, Galaon T, Udrescu S, Negru J, David V, Medvedovici A. Fast RPLC-UV method on short sub-two microns particles packed column for the assay of tenoxicam in plasma samples. J Pharm Biomed Anal. 2007;43:1437-1443. ISSN: 1873-264X. 99. Arayne MS, Sultana N, Siddiqui FA. A new RP-HPLC method for analysis of meloxicam in tablets. Pak J Pharm Sci. 2005;18(1):58-62. ISSN: 1011-601X. 100. Bae JW, Kim MJ, Jang CG, Lee SY. Determination of meloxicam in human plasma using a HPLC method with UV detection and its application to a pharmacokinetic study. J Chromatogr B. 2007;859:69-73. 101. Zawilla NH, Abdul-Azim Mohammad M, El kousynm, El-Moghazy Aly SM. Determination of meloxicam in bulk and pharmaceutical formulations. J Pharm Biomed Anal. 2003;32:1135-1144. ISSN: 1873-264X. 102. Velpandian T, Jaiswal J, Bhardwaj RK, Gupta SK. Development and validation of a new high-performance liquid chromatographic estimation method of meloxicam in biological samples. J Chromatogr B. 2000;738:431-436. 103. Vignaduzzo SE, Castellano PM, Kaufman TS. Method development and validation for the simultaneous determination of meloxicam and pridinol mesylate using RP-HPLC and its application in drug formulations. J Pharm Biomed Anal. 2008;46:219-225. ISSN: 1873-264X. 104. Ganesan M, Rauthan KS, Pandey Y, Tripathi P. Determination of Ibuprofen in human plasma with minimal sample pretreatment. Int J Pharm Sci Res. 2010;1(5):120-127. ISSN: 0975-8232.

Page 71: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

59

105. Sajewicz M, Kowalska T. On problems with liquid chromatographic quantification of chiral 2-arylpropionic acids by use of UV-absorbtion-based detectrion. Acta Chromatographica, 2006;17:292-301. ISSN: 1233-2356. 106. Franceschi L, D’aronco S, Furlanut M. A simple and sensitive of HPLC method to monitor serum and synovial fluid concentrations of ketorolac in rheumathologic patients. JBABM. 2010;2(6):121-124. ISSN: 1948-593X. 107. Sinha PK, Jeswani RM, Topagi KS, Damle MC. A validated RP-HPLC metod for determination of meloxicam in the presence of its impurities. Int J PharmTech Res. 2009;1(4):1051-1060. ISSN: 0974-4304. 108. Ganea M, Bota S, Gligor F, Moisa C, Vicaş L, Bojiţă M. The identification and assay of ketoprofen from solid pharmaceutical forms. Validation of HPLC method. Farmacia. 2008;LVI(4):433-439. ISSN: 2065-0019. 109. Dhaneshwar SR, Salunkhe JV, Bhusari VK. Validated HPLC method for simultaneous quantitation of levocetirizine hydrochloride and nimesulide in bulk drug and formulation. IJCP. 2011;2(2):1-4. ISSN: 0976-8157. 110. Hasan SMF, Shoaib MH, Hassan F, Inam-Ur-Rehman. Bioequivalance studies of two brands of meloxicam tablets in healthy Pakistani volunteers. Pak J Pharm Sci. 2009;22(2):199-204. ISSN: 1011-601X. 111. Yuwono M, Indryanto G. Validation of chromatographic method of analysis. În: Brittain HG (editor). Profiles of drug substances, excipients, and related methodology. Vol.32. Orlando: Academic Press; 2006. p. 243-262. ISBN: 978-0122608322. 112. *** The United States Pharmacopoeia 28. United States Pharmacopoeial Convention. MD; 2004. p. 2748 – 2751. 113. *** ICH Topic Q2B: Validation of Analytical Procedures (CPMP / ICH / 281 /95). The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products. Disponibil la: http://www.uam.es/personal_pas/txrf/MU5.pdf. 114. *** Understanding Your Spectra Module, Agilent ChemStation for LC 3D System, Agilent Technologies.2003. 115. Roman L, Bojiţă M, Săndulescu R. Validarea metodelor de analiză şi control. Ed. Medicală; 1998. ISBN: 973-3903620. 116. Snyder LR, Kirkland JJ, Glajch JL. Practical HPLC method development. 2nd Edition. John Wiley & Sons, Inc; 1997. ISBN: 978-0471007036. 117. Oprean R, Rozet E, Dewé W, Boulanger B, Hubert Ph. Ghid de validare a procedurilor analitice cantitative. Cluj Napoca: Ed. Medicală Universitară „Iuliu Haţieganu”; 2007 118. Jaba E. Statistica. Bucureşti: Ed. Economică; 1998. p.343. 119. Carr GP, Wahlich JC. A practical approach to method validation in pharmaceutical analysis. J Pharm Biomed Anal. 1990;8:613-618. 120. Somenath M (editor), Brukh R. Sample preparation techniques in analytical chemistry. John Wiley & Sons, Inc.; 2003. 121. *** Reviewer guidance. Validation of Chromatographic Methods. Center for Drug Evaluation and Research (CDER), FDA.1994. 122. *** Guideline for Submitting Samples and Analytical Data for Methods Validation, FDA.1987.

Page 72: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

60

123. Detlef W. Development and validation of an HPLC method to analyze IBP and impurities according to the European Pharmacopoeia. Agilent Technologies Inc., Application Note, 2010. 124. Dvořák J, Hájková R, Matysová L, Nováková L, Koupparis MA, Solich P. Simultaneous HPLC determination of ketoprofen and its degradation products in the presence of preservatives in pharmaceuticals. J Pharm Biomed Anal. 2004;36(3):625-629. 125. Kev N, Vijayasrinivas S, Kumar MK, Mathivanan N, Kumar MS, Meb R. Simultaneous reverse phase HPLC estimation of NIMe and DICm. Indian J Pharm Sci. 2003;658(4):407-409. 126. Tomuţă I, Vlase L, Leucuţa SE. HPLC determination of indometacin from human plasma. “Ovidius” University Annals of Medical Science – Pharmacy. 2003;1(1). 127. Şpac AF, Dorneanu V. Drugs: HPLC analysis of NSAIDs. În: Cazes J (editor). Encyclopedia of Chromatography. Third Edition. Taylor & Francis Group.2009. 128. Panusa A, Multari G, Incarnato G, Gagliardi L. High-performance liquid chromatography analysis of anti-inflammatory pharmaceuticals with ultraviolet and electrospray-mass spectrometry detection in suspected counterfeit homeopathic medicinal products. J Pharm Biomed Anal. 2007;43(4):1221-1227. 129. Iuliani P, Carlucci G, Marrone A. Investigation of the HPLC response of NSAIDs by fractional experimental design and multivariate regression analysis. Response optimization and new retention parameters. J Pharm Biomed Anal. 2010;51(1):46-55. 130. Negru J, Şpac AF, Dorneanu V. Identificarea unor medicamente antiinflamatoare nesteroidiene după separare HPLC şi confirmare spectrală. Rev Med Chir Soc Med Nat. 2008; 2(2) - Supl. 1:369-377. 131. Joseph-Charles J, Bertucat M. Determination of MEL in tablets formulations by ultraviolet spectrophotometry and high-performance liquid chromatography. Anal Lett. 1999;32(10):2051. 132. Negru J, Şpac AF, Dorneanu V. Contribuţii la alegerea fazei mobile în vederea separării prin HPLC şi identificarea – determinarea cantitativă a unor antiinflamatoare nesteroidiene folosind detectorul UV-VIS. Rev Med Chir Soc Med Nat. 2011; 115(1):236-244. 133. Perju AC, Şpac AF, Dorneanu V. Contribution to the meloxicam determination by high pressure liquid chromatography. Al XIII – lea Congres Naţional de Farmacie, Volumul de rezumate. Cluj Napoca. 28 – 30 septembrie 2006:78. 134. Perju AC, Şpac AF, Dorneanu V. Contribution to the nimesulide determination by high pressure liquid chromatography. Al XIII – lea Congres Naţional de Farmacie, Volumul de rezumate. Cluj Napoca. 28 – 30 septembrie 2006:78. 135. Sarzi-Puttini P, Atzeni F, Lanata L, Bagnasco M, Colombo M, Fischer F, D'Imporzano M. Pain and KTP: what is its role in clinical practice? Reumatismo. 2010;62(3):172-188.

Page 73: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

61

136. Moffat AC, Osselton MD, Widdop B. Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons in pharmaceuticals, body fluids and postmortem material. Vol.2. 3rd ed. Pharmaceutical Press, London, 2004:1156-1157. 137. Flanagan RJ. Guidelines for the interpretation of analytical toxicology results and unit of measurement conversion factors. Annals of Clinical Biochemistry. 1998;35:261-267. 138. Ossipov MH, Jerussi TP, Ren K, Sun H, Porreca F. Differential effects of spinal (R)-KTP and (S)-KTP against signs of neuropathic pain and tonic nociception: evidence for a novel mechanism of action of (R)-KTP against tactile allodynia. Pain. 2000;87(2):193-199. 139. Lovlin R, Vakily M, Jamali F. Rapid, sensitive and direct chiral high-performance liquid chromatographic method for KTP enantiomers. J Chromatogr B Biomed Appl. 1996;679(1-2):196-198. 140. Boisvert J, Caillé G, McGilveray IJ, Qureshi SA. Quantification of KTP enantiomers in human plasma based on solid-phase extraction and enantioselective column chromatography. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 1997;690(1-2):189-193. 141. Baeyens WR, Van der Weken G, Haustraete J, Aboul-Enein HY, Corveleyn S, Remon JP, García-Campaña AM, Deprez P. Application of the restricted-access precolumn packing material alkyl-diol silica in a column-switching system for the determination of KTP enantiomers in horse plasma. J Chromatogr A. 2000;871(1-2):153-161. 142. Lees P, Taylor PM, Landoni FM, Arifah AK, Waters C. Ketoprofen in the cat: pharmacodynamics and chiral pharmacokinetics. Vet J. 2003;165(1):21-35. 143. Igarza L, Soraci A, Auza N, Zeballos H. Some pharmacokinetic parameters of R-(-)- and S-(+)-KTP: the influence of age and differing physiological status in dairy cattle. Vet Res Commun. 2004;28(1):81-87. 144. Montoya L, Ambros L, Kreil V, Bonafine R, Albarellos G, Hallu R, Soraci A. A pharmacokinetic comparison of meloxicam and KTP following oral administration to healthy dogs. Vet Res Commun. 2004;28(5):415-428. 145. Jin YX, Tang YH, Zeng S. Analysis of flurbiprofen, KTP and etodolac enantiomers by pre-column derivatization RP-HPLC and application to drug-protein binding in human plasma. J Pharm Biomed Anal. 2008;46(5):953-958. 146. Jack DS, Rumble RH, Davies NW, Francis HW. Enantiospecific gas chromatographic-mass spectrometric procedure for the determination of KTP and ibuprofen in synovial fluid and plasma: application to protein binding studies. J Chromatogr. 1992;584(2):189-197. 147. Paik MJ, Nguyen DT, Kim KR. Enantioseparation of flurbiprofen and KTP in patches and in urine excretions by achiral gas chromatography. Arch Pharm Res. 2004;27(12):1295-1301. 148. Głowka FK, Karazniewicz-Łada M. CE Determination of Ketoprofen Enantiomers in Clinical Samples of Plasma, Synovial Fluid and Urine. Chromatographia. 2008;67:S97–S105. 149. Martin MJ, Pablos F, Gonzalez AG. Simultaneous determination of caffeine and non-steroidal anti-inflammatory drugs in pharmaceutical formulations and

Page 74: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...

62

blood plasma by reversed-phase HPLC from liniar gradient elution. Talanta. 1999;49:453–459. 150. Roda A, Sabatini L, Mirasoli M, Baraldini M, Roda E. Bioavailability of a new KTP formulation for once-daily oral administration. Int J Pharm. 2002;241(1):165-172. 151. Suenami K, Lim LW, Takeuchi T, Sasajima Y, Sato K, Takekoshi Y, Kanno S. Rapid and simultaneous determination of nonsteroidal anti-inflammatory drugs in human plasma by LC-MS with solid-phase extraction. Anal Bioanal Chem. 2006;384(7-8):1501-1505. 152. Suenami K, Lim LW, Takeuchi T, Sasajima Y, Sato K, Takekoshi Y, Kanno S. On-line sample extraction and enrichment of non-steroidal anti-inflammatory drugs by pre-column in capillary liquid chromatography mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2007;846(1-2):176-1783. 153. Vergote GJ, Vervaet C, Van Driessche I, Hoste S, De Smedt S, Demeester J, Jain RA, Ruddy S, Remon JP. In vivo evaluation of matrix pellets containing nanocrystalline KTP. Int J Pharm. 2002;240(1-2):79-84. 154. Granero GE, Amidon GL. Possibility of enterohepatic recycling of KTP in dogs. Int J Pharm. 2008;349(1-2):166-171. 155. Qiu HX, Liu J, Kong H, Liu Y, Mei XG. Isobolographic analysis of the antinociceptive interactions between KTP and paracetamol. Eur J Pharmacol. 2007;557(2-3):141-146. 156. Negru J, Popa DS, Vlase L, Iacob D, Achim M, Dorneanu V. High-throughput HPLC method for rapid quantification of ketoprofen in human plasma. Farmacia. Acceptat spre publicare. 157. Popa DS, Vlase L, Leucuţa SE, Loghin F. Determination of cocaine and benzoylecgonine in human plasma by LC-MS/MS. Farmacia. 2009;57(3):301-308. 158. Guidance for Industry, Bioanalytical Method Validation. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. Federal Register. 2001; 66. 159. Guidance on the Investigation of Bioavailability and Bioequivalence. The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products, Committee for Proprietary Medicinal Products. 2001; CPMP/EWP/QWP/1401/98. 160. Vlase L, Popa DS, Muntean D, Mihu D, Leucuta S. A New, High-Throughput HPLC/MS Assay for Therapeutic Level Monitoring of Digoxin in Human Plasma. J AOAC Intern. 2009;92(5):1390-1395. 161. Butnariu A, Popa DS, Vlase L, Andreica M, Muntean D, Leucuta S. New high-throughput liquid chromatographic tandem mass spectrometry assay for therapeutic drug monitoring of carvedilol in children with congestive heart failure. RRML. 2009;15(2):7-15. 162. Vlase L, Popa DS, Leucuta SE, Loghin F. Bioanalysis of methadone in human plasma and urine by LC/MS/MS. Rev Roum Chimie. 2008;53(12):1157–1164. 163. Vlase L, Popa DS, Muntean D, Achim M. A New LC/MS/MS Method for Determination of Lisinopril in Human Plasma. Studia Universitatis Babeş-Bolyai Chemia. 2010:55(1):91-101.

Page 75: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...
Page 76: Contribuţii la identificarea unor substanţe medicamentoase prin ...