INTRODUCERE

Ultimul deceniu al secolului XX-lea ştiinţa oenologică s-a impus printr-o amplă

desfăşurare a investigaţiilor, ce ţin de unii microcomponenţi endogeni cu proprietăţi

deosebit de importante pentru organismul uman. În aspect geografic, aceste cercetări

cuprind toate continentele unde se cultivă viţa de vie. Substanţele, care au focalizat în

mod deosebit atenţia cercetătorilor oenologi, chimişti, iginienişti, farmacişti sunt  :

resveratrolul și proantocianidinele-componenți de natură fenolică, laitmotivul

binecunoscutului “paradox francez”( Scutaru I., 1995).

De mai bine de zece ani, britanicii şi americanii încearcă să dezlege miracolul

francez. Deşi francezii au o dieta bogată în grăsimi, unt, brînză, carne, foie gras(ficat

de pasăre gras, produs printr-o tehnologie specială) şi toate deliciile din fructe pe care

inima le cere, tot ei sunt cei care suferă cel mai puţin de boli de inimă.Mult mai puţini

francezi suferă de cancer intestinal sau boli reumatice decît americanii, mai puţin au

probleme la circulaţia sîngelui, au şanse mai puţine să se îmbolnăvească de

osteoporoză şi cu mult mai puţini tineri francezi decît cei americani au probleme de

digestie sau fac alergie la anumite alimente. În acest context e de menţionat şi

problema obezităţii :doar 10% dintre francezi sunt declaraţi supraponderali, în timp ce

22% dintre britanici și 33% dintre americani sunt declaraţi obezi.

Compuşii biologici activi descoperiţi în vinul roşu, alune sau alte produse

vegetale au prezentat, în urma cercetărilor, capacităţi de prelungire a duratei de

activitate vitală la organisme cu regim limitat de calorii.

Savantul David Sinclair, doctor în ştiinţe medicale şi cercetător la Harvard

Medical School, a observat în studiile sale că resveratrolul și proantocianidinele au un

puternic efect antioxidant și anticoagulator, împiedicînd blocarea vaselor

sangvine,care este cea mai frecventă cauză a atacurilor cardiace şi congestiilor

cerebrale.

Studiile efectuate la Universitatea din Harvard explică, într-o ultimă măsură, de

ce persoanele care consumă moderat vin roşu alături de fructe, legume şi cărnoase(nu

grase) prezintă un risc minim în ceea ce priveşte accidentele cardio-vasculare.

Această descoperire ar putea duce la crearea unor noi medicamente sau aditive

alimentare pentru prelungirea durata vieţii, pentru prevenirea sau tratarea maladiilor

cardiovasculare şi celor legate de îmbatrînire(Gaina B.,Roman O., Bourzeix M. et al.,

2007).

1

1. Rolul curativ şi nutritiv al compuşilor biologic activi din struguri şi vin

Încă din cele mai vechi timpuri în medicină se foloseşte tratamentul cu struguri.

Razes din Babilon (a. 950 p. Ch.) şi Hipocrate din Grecia Antică foloseau pe larg

strugurii şi mustul la tratarea multor boli.O utilizare mai amplă datează din secolul al

XlX-lea, cînd ampeloterapia, bazată pe rezultatele obţinute în medicină, biologie,

biochimie se aplică pe larg în Franţa, Germania, Italia, Elveţia.

În Moldova leagănul ampeloterapiei este oraşul balnear Camenca, unde la

începutul secolului al XlX-lea contele P. H. Vihtphenschtein a folosit pantele sud-

vestice ale Nistrului pentru cultivarea soiurilor de masă aduse din Franţa, Italia şi

Elveţia cu înalte proprietăţi curative. Contele a deschis pe teritoriul moşiei sale un

spital, în care se aplica ampeloterapia la tratarea invalizilor războiului ruso-francez

din 1812. În prezent, pe locul unde se afl ă acest spital mic a fost construit un

sanatoriu cu peste 500 de locuri. Aici se aplică pe larg ampeloterapia şi se tratează

pacienţi din toate ţările fostei U.R.S.S. (KARPOV S., 1997). Conform rezultatelor

obţinute, bobiţele de struguri exercită asupra organismului diferite acţiuni: diuretică,

purgativă, sudorifică şi, după cum s-a mai menţionat, ameliorează schimbul de

substanţe şi normalizează tensiunea arterială. Ampeloterapia se recomandă la tratarea

anemiei, astmului bronhic, a hemoroizilor, bolilor hepatice de rinichi etc. Este necesar

să menţionăm că strugurii sunt contraindicaţi în cazul ulcerului gastric şi duodenal,

bolilor tractului intestinal, diabetului zaharat, obezităţii, iar în cazul acidităţii ridicate

a stomacului vinul se consumă atent, selectîndu-se vinuri cu aciditate scăzută .

Vinurile de struguri conţin cantităţi minime de vitamine, care nu pot satisface

pe deplin cerinţele organismului, însă diversitatea şi acţiunea complexă a vitaminelor

determină importanţa lor. Vitaminele B1, B2, B6 , B12, PP şi acidul pantotenic sunt

prezente în cantităţi ce satisfac aproximativ 10% din necesităţile zilnice ale omului.

Biotina şi acidul folic se găsesc într-o măsură mai mică, iar mezoinozitul —în

cantităţi ce corespund aproximativ necesarului zilnic al omului.În vinurile roşii multe

vitamine (mai ales vitamina P) se găsesc în cantităţi mai mari comparativ cu cele

albe. Substanţele tanante din struguri şi vinurile roşii posedă acţiune antiradioactivă,

iar pectina stimulează eliminarea din organism a stronţiului.

În vin s-au descoperit multiple microelemente, dintre care 24 de elemente,

inclusiv mangan, zinc, rubidiu, fluor, vanadiu, iod, titan, cobalt etc. care sunt de o

importanţă vitală, cînd trec din struguri în vin. Dintre substanţele minerale cele mai

mari cantităţi (până la 4 g/l) se întâlnesc în vinurile supuse fermentării pe boştină, în

2

special în vinurile roşii seci și de tip Madeira. Predominant este potasiul şi fosforul,

care joacă un rol important la reglarea echilibrului acido- alcalin şi prevenirea

deficitului în schimbul de săruri. Vinurile albe seci conţin mai puţine substanţe

minerale - pînă la 2 g/l.

S-a dovedit că vinul înlătură oboseala organismului, intensifică activitatea

slăbită a inimii. Bunăoară, pentru întreţinerea activităţii slăbite a inimii împreună cu

alte remedii profesorul Zaharin G. A. aplica şi vinul de struguri. Iar cunoscutul

medic, profesor al Universităţi din Moscova, Golubev N., timp de 50 de ani a

practicat vindecarea cu vin de struguri. El considera că cea mai bună băutură pentru

ridicarea tonusului vital şi a activităţii slăbite a inimii este vinul spumant.La

vindecarea bolnavilor epuizaţi şi slăbiţi el folosea vinurile tari de tip Madeira şi

Portwein, prescriindu-le doar cîteva linguri pe zi. Vinurile albe seci posedă, după

părerea lui, acţiune tonică asupra sistemului nervos şi a inimii şi se pot prescrie

bolnavilor în cantitate de pînă la 0,5 1 pe zi.

La tratarea cu vin este important să se ţină cont de starea organismului şi

posibilele contraindicaţii. La Institutul de Cercetări Ştiinţifice a Metodelor Fizice de

Tratament şi Medicină Climatologică „I. M. Secenov” din lalta s-a acumulat o

experienţă pozitivă de tratare cu vin a bolnavilor cardio-vasculari. S-a demonstrat că

vinurile naturale din struguri acţionează favorabil asupra oamenilor de vârstă

avansată, normalizînd somnul, și totodată se consideră ca fiind secretul sănătății bune

și a vieții lungi, după cum afirma și Platon "Vinul este laptele bătrînilor".

În rezultatele cercetărilor efectuate asupra acţiunii de vindecare cu vinuri,

efectuate de doctorul Eilo (Bordeaux, Franţa), s-a făcut încercarea de a crea un cod

oenoterapeutic. În acest cod, de exemplu, se recomandă, în caz de anemie,consumarea

înainte de masă a vinurilor roşii seci în cantitate de două pahare  ; în caz de

ateroscleroză se recomandă vinuri albe seci cu apă minerală în cantitate de 0,5 l pe zi;

în caz de vome-vin spumant rece; în tuberculoză acută se recomandă vin roşu în

cantităţi mici; în diabet- vinuri de masă tinere; suferinzilor de avitaminoză li se

recomandă toate varietăţile de vinuri în cantităţi dietetice; în caz de dizenterie se

consumă vinuri roşii seci. Bolnavii de gripă, pneumonie şi pneumonie bronhică

deseori folosesc vinuri roşii fierbinţi cu zahăr, aşa-numitele «glintwein». În Moldova

este binecunoscută practica tratării răcelilor, guturaiului, gripelor cu vin îndulcit cu

miere şi picant cu piper roşu numit « izvar ».

Prof. Siniţkin V. a constatat că victimelor avariei de la Cernobîl le este foarte 3

indicat cîte un pahar de vin roşu sec zilnic. Astfel, în 3-5 săptămîni conţinutul

cesiului radioactiv din sânge scade de 3 ori. Aceasta ne vorbeşte despre efectul de

protecţie al vinurilor roşii împotriva contaminării radioactive.

Desigur, cea mai importantă problemă a oenoterapiei este alegerea tipului şi

dozei vinului. Vinul, ca şi orice substanţă medicinală, luată în doze excesive, aduce

daune sănătăţii, iar în cantităţi mici are acţiune benefică. Acesta e un factor important

în tratarea diferitelor afecţiuni.

În ceea ce priveşte dozarea, e bine să se ţină cont de proverbele populare  :

„Vinul te înveseleşte cînd îl bei în cantităţi mici, iar cînd îl bei mult — te

stăpîneşte».Ce înseamnă „A bea cu măsură?» înseamnă să consumi atît cît să simţi noi

forţe, o nouă energie, să sesizezi claritatea şi agerimea gîndirii şi fineţea mediului

ambiant. A indica această măsură ca un etalon unic este imposibil — fiecare trebuie

să şi-o cunoască singur. După părerea sociologilor francezi, cultura consumării

băuturilor alcoolice determină în mare măsură cultura societăţii în general. Arta

consumării şi aprecierii vinului este unul din elementele de bază a culturii omului.

În concluzie, abordînd problema rolului curativ şi nutritiv al compuşilor

biologici activi, se cere de menţionat, că conţinutul lor în struguri, must şi vin este

relativ scăzut. Însă în ansamblu efectul lor sumar asupra proceselor vitale în

organismul uman este considerabil. Aminoacizii, conţinîndu-se în cantităţi mai

importante, alături de acizii organici, prezintă un factor important în reglarea

multiplelor metabolisme contribuind la asimilarea mai completă a glucidelor, lipidelor

şi polisaharidelor în procesele nutriţiei umane. Însă rolul curativ decisiv îl joacă

compuşii cu proprietăţi biologice înalte numiţi - resveratroli, proantocianidine, și

anume lor le revine rolul decisiv în protecţia organismului contra proceselor nefaste

generate de majorarea concentraţiei în radicali liberi şi agravarea maladiilor cardio-

vasculare, a diabetului zaharat, cancerului, îmbătrînirii rapide a pielii şi a

organismului în întregime.

2. Principalii compuşi biochimici activi din struguri şi vinuri

Rolul benefic al vinurilor roşii asupra organismului uman este bine cunoscut,

4

datorită conținutului în alcool, acizi organici, substanțe azotate, polifenoli, substanțe

minerale etc., vinul se constituie și ca un aliment energetic (Țîrdea C., Sîrbu Gh.,

Țîrdea A., 2000). Un litru de vin sec are un potențial energetic de 600-800 kcal, iar un

vin licoros care este mai bogat în alcool și glucide- în medie 1700 kcal (Gaina

B.,2000).

Datorită conținutului în acizi organic, a ionilor de hidrogen (pH), a compușilor

fenolici și, în primul rînd, a taninurilor, l-a determinat pe Louis Pasteur pe bună

dreptate să afirme încă din secolul al XIX-lea că "Vinul este cea mai sănătoasă și cea

mai igienică băutură". Aceasta se datorează, mai întîi de toate, prezenţei legăturilor

fenolice, multe dintre care întăresc vasele sangvine astfel împiedicînd dezvoltarea

aterosclerozei şi a altor boli cardiovasculare, posedă o acţiune bactericidă şi o

activitate antioxidantă înaltă .

Figura 1: Acţiunea biologică a substanţelor fenolice asupra organismului uman

S-a constatat că în țările în care se consumă zilnic vin roșu, cum ar fi Franța

(Bordeaux), Italia, Spania, frecvența maladiilor cardio-vasculare este cu mult mai

scăzută decît în țările în care se preferă preponderant băuturi tari și mai puțin vin.

Ca urmare consumului zilnic de vin, longevitatea este mai mare, iar infarctul

miocardic și accidentele vasculare cerebrale sînt mai reduse (Pomohaci N., Cotea

V.D., Stoian V., și col.,2000).

Despre acțiunile benefice ale vinului roșu asupra organismului uman se vorbește tot mai

frecvent, datorită conținutului compușilor fenolici,și în primul rînd, a proantocianidinelor, cu

5

Complexul substanțelor fenolice

Acțiune antioxidantăAcțiune anticancerigenă

Eliminarea substanțelor toxice din organism

Captatori de radicali liberiAcțiune de întărire a vaselor capilare

Acțiune antivirală Acțiune antihistaminică

Acțiune de încetinire a îmbătrînirii celulelor

Acțiune antiinflamatorie

însușiri biologic active importante.( Brenna O., Pagliarini E., 2001 ; Положишникова М .,

Перелыгин О.Н., 2005).

S-a demonstrat experimental că unele substanţe fenolice ar putea prelungi

durata vieţii cu 30- 50% (Brenna O., Pagliarini E., 2001). Rezultatele numeroaselor

cercetări au demonstrat că cele mai puternice acţiuni ale substanţelor fenolice se

atestă la substanţele: resveratrol, cvercitina şi dihidrocvercitina. Aceste substanţe

încetinesc oxidarea membranelor lipidice, previne acţiunea dăunătoare a radicalilor

liberi, preîntîmpină îmbătrînirea celulelor.

Figura 2 : Structura chimică a cvercitinei și resveratrolului.

Resveratrolul(3,5,4'-trihydroxystilben) după clasificare se atribuie la fitoalexeni

- substanţe sintetizate de către plante care asigură o imunitate înaltă(le apără de

infecţiile micotice şi bacteriene).Cantităţi importante de resveratrol se acumulează în

pieliţa boabelor de viţă de vie, de aceea vinurile roşii fermentate pe boştină conţin

cantităţi mai mari de resveratrol în comparaţie cu vinurile albe de masă, a căror

proces de degradare a glucidelor e derulat normal.Pe de altă parte, există opinii că

acțiunile pozitive ale resveratrolului se manifectă numai în cazul unor concentrații

avansate ale acestuia care nu există în vin (Corder R.,2009).

Pe baza resveratrolului şi a dihidrocvercitinei, industria farmacologică autohtonă

şi cea străină produce preparate medicamentoase cu acţiune antioxidantă,

regeneratoare, dezintoxicantă şi diuretică (A.Flucol, B. Flucol, Resvert, Red Wine

Extract, Red Wine Plus şi altele). Cvercitina, ca şi resveratrolul posedă proprietăţi

antitumorale remarcabile. Ea are efecte benefice şi ajută la profilaxia cancerului,

prostatitei, maladiilor cardiovasculare, cataractelor, alergiilor/inflamaţiilor şi

maladiilor respiratorii aşa ca bronşita şi astma. Alimentele bogate în cvercitină includ

merele, ceaiul, ceapa, strugurii roşii, broccoli, cireşe şi mure.

6

Acizii aromatic (acizii fenolcarbonici) joacă un rol semnificativ în formarea

caracteristicilor organoleptice ale vinului(buchetul şi gustul), participă la procesele biochimice

de producere şi păstrare a vinurilor. Conţinutul calitativ şi cantitativ a acizilor fenolcarbonici şi a

flavonolilor este cercetat prin metoda HPLC ( Положишникова М ., Перелыгин О.Н., 2005).

Substanţa

Acizii fenolcarbonici:

Variaţia concentraţiei, mg/dm3

Moldova Gruzia Franţa Italia Spania Cili

galic 15,2-79,4 58,0-78,5 28,5-69,7 65,0-76,0 30,9-

94,6

29,0-95,0

protocatehic 1,6-4,4 3,2-8,3 3,2-7,6 2,6-6,0 2,8-9,0 2,6-11,3

p-hidroxibenzoic 0,3-1,2 0,9-1,5 0,7-1,8 0.4-1.2 1,2-1,8 0,6-2,5

vanilie 1,1-4,8 2,4-5,4 1,4-5,1 1,4-2,7 1,6-3,2 1,0-6,4

siremc 1,0-4,4 4,3-7,8 2,0-6,8 2,5-3.8 2,6-4,3 2,3-1 1,2

cofeic 0,6-7,5 3,6-16,7 2,6-17,4 3,1-7.4 3,7-1 1.9 6,9-15,9

p-cumaric 0,0-3,1 2,8-7,8 2,4-9,4 2,7-4,2 4,2-9,8 4,5-8,8

ferulic 0,0-1,2 1,1-2,3 0,6-1,4 0,8-1,2 0,9-1,8 0,8-1,3

salicilic 0,2-2,1 0,1-1,0 0,5-4,3 0,1-1,0 0,2-1,0 0,3-2,1

Cvercitina 0,1-10,8 4,1-21,8 2,7-27,2 2,3-14,3 0,5-13,5 6,0-42,9

Dihidrocvercitina 0,5-2,4 1,9-2,4 1,4-2,9 1,7-2,6 1,4-2,2 1,1-2,4

Resveratrol 0,2-3,2 3,0-7,2 2,5-17,3 1,5-3,5 0,7-4,7 0,7-8,9

Conform datelor experimentale (Tabelul 1), cea mai mare parte din conţinutul sumar de

acizi fenolcarbonici identificaţi în vinurile roşii seci este atribuită acidului galic (50-85%) .

Este cunoscut faptul, că la formarea caracteristicilor organoleptice ale vinului un rol

esențial îl costituie terpenele aromatice pe larg răspîndite în regnul vegetal (în jurul la 4000), fapt

ce a determinat cercetarea lor aprofundată în numeroase lucrări ( Ribéreau-Gayon P.,

Dubourdieu D., Danèche B., 1998; Sîrghi C., Zironni R., 1994 ; Aceeva N.M., Gugucichina

T.I., Gontareva E.N. şi al. 2006).

În struguri se găsesc pînă la 40 de compuşi terpenici. Monoterpenele, cele mai aromate, se

găsesc sub forma de alcooli monoterpenici, şi anume linalol, α-terpeneol, nerol, geraniol,

citronellol, o-trienol, care exprimă aroma de trandafir. Concentraţia monoterpenolilor în soiurile

cu aroma simplă, inclusiv cele noi, este inferioară pragului de percepere (Gaina B., Bejan V.,

Panfil E., 2000).

2.1.RESVERATROLUL

7

Conţinutul sumar de acizi fenolcarbonici în vinurile roşii seci Tabelul 1

2.1.1 Generalităţi. Structura chimică și proprietățile resveratrolului.

Resveratrolul (3,5,4-trihidroxistilben) este o fitoalexină ce aparține clasei

compușilor polifenolici numiți stilbeni, care sunt produși de unele specii de plante cu

ajutorul sintezei enzimei stilbene, ca răspuns la stres, infecţii micotice și radiații

ultraviolete (UV).

Aceste substanţe vegetale posedă proprietăţi biochimice remarcabile şi reprezintă

un compus solubil în grăsimi care apare în 2 configuraţii : cis- şi trans (figura 3).

trans-resveratrol cis-resveratrol E-resveratrol Z-resveratrol

Figura 3: Structura chimică a trans- și cis-resveratrolului

Numai izomerul trans-resveratrol este produs natural în timpul maturării strugurilor, însă el

poate suferi o izomerizare în forma cis-resveratrol prin intermediul unui proces fotochimic, prin

iradierea cu raze UV sau printr-un proces enzimatic (figura 4) :

Figura 4 : Procesul de fotoizomerizare a trans-resveratrolului în forma cis-resveratrol

Proprietățile fizico-chimice ale resveratrolului:

1) Formula chimica : C14H12O3 ;

2) Masa molara: 228,25 ;

3) Se prezintă sub forma unui praf alb cu particule galben deschis  ; 

4) Punctul de topire: 265-266 º C ;

5) Solubilitate în apă: mai mare de 100μg/ml la 25 º C ; 

6) Solubilitate în etanol: 50g/l ;

7) Antioxidant mai puternic de 50 de ori decît vitamina E și C la un loc  ;

2.1.2 Resveratrolii în natură. Scurt istoric .

8

Resveratrolul a fost identificat pentru prima dată în 1939 de către chimistul

japonez, Michio Takaoka ca și constituent al extractului de rădăcină de Veratrum

grandiflorum și mai apoi din rădăcina de Fallopia japonica (sau Polygonum

cuspidatum).Mult timp această substanță nu a fost luată în seamă, pînă în anul 1976

cînd s-a descoperit că se conține în cantități destul de mari în strugurii roșii,în special

în pelița strugurilor. Dar cele mai multe cercetări datează din anul 1992 cînd oamenii

de știință au început să se intereseze de efectele resveratrolului,cînd prezența acestuia

a fost depistată în vinurile roșii. Începînd cu 2006, studiile privind efectele benefice

ale resveratrolului asupra oranismului uman datorită proprietăților sale antioxidante,

anticancerigene și mutegene au fost amplificate considerabil.

Resveratrolul şi unii compuşi ai săi cu glucoza, ca componenţi constituienţi, în

cantităţi mici se întîlnesc în materialul lemnos, rădăcinile viţei de vie și în seminţele

bobiţelor. Resveratrolul se găseşte în general în fructele de culoare indigo-vişiniu

spre negru: dude, cireșe, zmeură, corcodușe, fragi, afine,coacăză neagră, arahide,

struguri (preponderent în pieliţă şi seminţe). Într-o cantitate de 50-100 mg/g pieliţă de

strugure, se găsește de două ori mai mult resveratrol decît în oricare altă sursă

identificată. Resveratrolul se mai găsește de asemenea în concentrații mari în

rădăcinile unor plante asiatice dintre care Polygonum cuspidatum este cel mai bogat

în trans-resveratrol permițînd astfel extracția în concentrații de pînă la 99%.

În tabelul 2 este prezentată cantitatea totală de resveratrol ce se conține în unele

alimente.

Conținutul sumar al resveratrolului în strugurii roșii și arahide. Tabelul 2

Alimentul Cantitatea

(g)

Cantitatea totală de

resveratrol (mg)

Conținutul

resveratrolilor (mg/kg)

Struguri roșii 160 0,24-1,25 0,07-1,78

Arahide (crude) 146 0,01-0,26 1,77-7,11

Arahide (prelucrate) 180 0,32-1,28 0,15-0,50

Unt de arahide 258 0,04-0,13 1,50-7,81

Din datele prezentate rezultă că strugurii roșii au un conținut relativ înalt de

resveratrol comparativ cu arahidele native și netratate.

2.1.3. Interactivitatea moleculei de resveratrol cu ciuperca Botrytis cinerea.

9

Resveratrolii pot fi sintetizaţi de plantă ca mijloc de autoprotejare cu proprietăţi

antimicotice în raport cu Botrytis cinerea şi Plasmopara viticola. Biosinteza în frunze

şi bobiţe este stimulată de condiţiile neprielnice, de razele ultraviolete, de prezenţa

unor cantităţi relativ mari de metale grele (în special de cupru) etc.

După cele menționate anterior, rezultă că resveratrolul este secretat de către

strugurii de viță de vie atunci cînd aceștia sunt atacați de către ciupercile și bacteriile

parazite, în acest fel se declanşează o reacţie a viţei de vie care se va opune

dezvoltării ciupercii, în special a ciupercii Botrytis cinerea, unde este des întilnit

efectul său de eliberare a etilenei asupra strugurilor infectați (figura 5).Dezvoltarea

acesteia fiind favorizată de anumiți factori externi: umiditatea, temperatura, țesuturile

moarte, leziunile plantelor,lumina.

Figura 5: Producerea de etilenă de strugurii infectați cu Botrytis cinerea

(5µL de suspensie la 103 conidia mL -1 /strugure).

La început se observă emisiile de etilenă de la fructele netratate (_ ) comparativ cu

cele tratate cu trans-resveratrol ( ) în primele 4 zile.

Studiile anterioare au indicat că trans-resveratrolaul are efecte reale inhibitoare

asupra germinației Botrytis cinerea și, de asemenea, pe creșterea miceliilor (Adrian

M., Jeandet P., Veneau J. et al., 1997). O concentrație de aproximativ 160 mg/l de

resveratrol (figura 6) este puternic inhibantă pentru ciupercă.

100

10

75

50

25

0 Conc resv (mg/ dm3)

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Figura 6: Inhibarea germinării sporilor ciupercii Botrytis Cinerea de către

resveratrol

Deci,este necesar ca condiţiile mediului (umiditate, temperatură) să nu fie

suficient de favorabile pentru ca ciuperca să poată trece bariera pe care viţa de vie o

manifestă. Atunci cînd ciuperca atacă viţa de vie, aceasta produce oxidaze

(p-difenoloxidaza sau altfel spus polifenoloxidază, lacaza), care distrug resveratrolul

în cîteva minute (figura 7) şi lasă loc liber ciupercii care devine mucegaiului bobiţelor

de struguri.

Timpul (min)

Figura 7 : Degradarea resveratrolului de către polifenoloxidaza ciupercii Botrytis cinerea

Vinul rezultat din acest tip de recoltă nu numai că nu conţine resveratrol, dar are

şi o barieră antioxidantă diminuată. Vinul este oxidat, brun şi dezvoltă arome

maderizate deseori neplăcute (de sol, de petică, alteori –de fungi).

2.1.4. Activitatea biologică a resveratrolului și a derivaților săi.

11

% G

erm

inar

eA

bsor

banț

a(D

egra

dare

a re

sver

atro

lulu

i)

Molecula de bază, produsă de către vița-de-vie este izomerul trans- al

resveratrolului,care împreună cu derivații săi (figura 8) posedă proprietăți

antioxidante importante.

Figura 8 : Structura chimică a trans- resveratrolului (I), cis-resveratrolului (II) și

a derivaților trans-resveratrolului (II-VI).

Conform acestei figuri, fiecare grupă hidroxilă a derivaților este protejată de grupe

metilice (III, IV, V) și un derivat cu legătură dublă redusă (VI).

Compararea activității antioxidante a trans-resveratrol și derivaților săi, estimată în

testele in vitro, este raportat în tabelul 3. Rezultatele sunt exprimate prin EQ (testul

Citronelal) și EC50 (microzomi și testele DPPH) din fiecare compus.

Activitatea antioxidantă a trans-resveratrolului și a derivaților II-VI. Tabelul 3

Compound Citronellal EQ Microsomes EC50 DPPH EC50

I 135±8,81 0,77±0,08 24,5±1,5

II 241±38,0 1,10±0,09 24,1±1,2

III 661±20,3 2,40±0,34 48,6±4,2

IV 355±7,43 1,22±0,18 30,1±2,1

V >1000 >1000 >1000

VI 260±11,2 1,57±0,17 106,8±6,3

Din datele prezentate, se observă o relație invers proporțională între activitatea

antioxidantă și valorile EQ și EC50 : cu cît e mai puternic antioxidantul cu atît e mai

12

mică valoarea acestora. În toate cele 3 teste, trans-resveratrol (I) a demonstrat cea

mai mare activitate antioxidantă, în timp ce compusul V nu exercită nici un efect

semnificativ. Figura 9 demonstrează efectele trans-resveratrolului (I) și derivatele pe

producție TBARS indusă de TBHP în fibroblaste umane normale.

Figura 9: Activitatea antioxidantă a trans-resveratrolului (I)și a derivaților II-VI.

Activitatea antioxidantă a 60 µM trans-resveratrolul (I) sau derivații II-VI,

exprimată ca procent de inhibare a producției TBARS în fibroblaste umane normale

tratați cu TBHP (terț-butilhidroperoxid). Valorile ± S.D, înseamnă că sunt prezentate

cel puțin 5 experimente independente.

Efectele resveratrolului asupra radicalilor liberi în organism este bine cunoscut,și

anume efectul său inhibitor asupra sintezei ADN-ului. În acest scop, capacitatea

trans-resveratrolului de a inhiba sinteza ADN (polimeraza ɑ și ß) a fost comparat cu

ceilalți derivați, atît în celule,cît și în testele in vitro (figura 10).

13

Figura 10: Efectele tran-resveratrolului(I) și a derivaților săi (II-VI) în sinteza

ADN-ului în celule și în vitro.

Rezultatele raportate în fig.10A arată că printre derivate, numai compusul IV inhibă

încorporarea BrdUrd într-o măsură similară cu trans-resveratrolul. Rezultate

comparabile au fost obținute în testele in vitro privind activitatea ADN polimerazei

(fig. 10B).

2.1.5. Cercetări privind conținutul și dinamica conținutului de resveratrol în

vinuri și influența acvității lor asupra celulelor.

Primele lucrări ştiinţifice ce ţin de resveratrol au fost conduse de Langcane şi

Pryce în 1976 (Langcane P., Pryce R.J., 1976). Spre anii 1990, acest subiect a fost

reluat la Universitatea din Bourgogne în jurul a 2 axe, cu P. Jeandet (Jeandet P.,

Bessis R., Gautheron B.,1991) asupra biochimiei moleculei şi caracterul său de

protejare a viţei de vie contra infecţiilor micotice şi cu Blanche (Blanche D., Rustan

I., Durand P., 1997) asupra activităţii marcante contra bolilor cardiovasculare.

Cercetările în domeniu au demostrat că variaţia concentraţiei de resveratrol în

vin are la bază o serie de factori, cum sînt: originea geografică, expunerea la infecţii

micotice, clima, solul, soiul, tehnica vinificării. Trebuie, în primul rînd ca varietatea

viţei de vie, a soiului, să fie una producătoare de resveratrol. Printre aceste varietăţi

găsim: Pinot noir, Gamay, Cabernet-Sauvignon şi Mourvedre. După Dr. Goldberg

(Goldberg D.M., Yan J., Diamandis E.P., 1994) de la Universitatea din Toronto care a

analizat numeroase vinuri din lume, în faţa clasamentului se află Pinot noir.

De asemenea, asupra cantităţii resveratrolului influenţează pozitiv perioada de

macerare, doza anhidridei sulfuroase, protecţia mustului şi vinului de acţiunea

oxigenului şi oxidazelor etc.

Un interes ştiinţific şi practic prezintă studiul resveratrolilor în vinurile, sucurile produse şi

comercializate Spania şi Franţa (tabelul 4).

Conţinutul resveratrolilor în vinurile şi sucurile produse în Spania şi Franţa. Tabelul 4

Băuturi Cantitatea totală de

resveratrol în 150 ml (mg)

Cantitatea totală de

resveratrol (mg/dm3)

Vinuri albe (Spania) 0,01-0,27 0,05-1,80

Pinot noir (Franța) 0,06-0,30 0,40-2,0

Vinuri roze (Spania) 0,06-0,53 0,43-3,52

Vinuri roșii (Spania) 0,29-1,89 1,92-12,59

Vinuri roșii (Franța) 0,30-1,07 1,98-7,13

14

Suc de struguri (Spania) 0,17-1,30 1,14-8,69

Suc de struguri (Franța) 0,21-1,76 1,37-11,71

Rezultatele obţinute atestă o concentraţie sporită a resveratrolilor în vinurile

roşii şi mai mică în cele albe. Vinurile roşii spaniole conţin mai mulţi stilbeni

comparativ cu cele franceze, în schimb sucurile din struguri produse în Franţa sunt

mai bogate în resveratroli în comparaţie cu cele din Spania(Roy H., Lundy S., 2005).

Odată cu cercetările efectuate în ţările Uniunii Europene privind conţinutul şi

dinamica resveratrolilor, specialiştii din Republica Moldova, în colaborare cu colegii

din Franţa (Gaina B., Roman O., Bourzeix M., 2007) au făcut cercetări în acelaşi

domeniu. Studiul dinamicii resveratrolilor pe pacursul maturizării strugurilor a fost

realizat la o serie de clone de viţă de vie din selecţia naţională franceză, cultivate în

colecţiiile Şcolii Superioare Agronomice din Montpellier (ENSAM) şi a Institutului

Naţional pentru Viticultură şi Vinificaţie din Chişinău (INVV), în calitate de

exemplu prezentăm dinamica resveratrolilor în mustul din soiul Pinot noir (clona

667), realizată pe parcursul maturizării boabelor de struguri începînd cu 25 august

2004 cu un interval al determinărilor de 10 zile (tabelul 5).

La aciditatea titrabilă de 9,2 g/dm 3 şi conţinutul în zăhar de 96 g/dm 3 s-a testat

o concentraţie totală a resveratrolilor de 2,34 g/dm 3; pe parcursul a 30 zile s-a atins

maturizarea biologică cu aciditatea titrabilă 6,l g/ dm3 şi zăharul de 190 g/ dm 3 şi cu

suma totală a resveratrolilor de 4,38 mg/ dm 3. Maturitatea tehnologică a fost atinsă

după 20 zile urmare a maturităţii biologice, indicii tehnologici alcătuind : aciditate

titrabilă – 5,1 g/dm3 , zăharul 230 g/dm3 şi suma totală a resveratrolilor 6,21 mg/dm 3.

Tabelul 5

Dinamica conţinutului de resveratrol în boabele şi mustul de Pinot noir (Montpellier, 2004).

Nrd/o

Data preluării probei

Obiectul de investigaţie, concentraţia în masă a

zahărului, aciditatea titrabilă

Concentrația de resveratrol, mg/dm3

Trans-resveratrol Cis-resveratrol Suma totală de resveratrol

1. 25.08.04 Suc din boabe; zah.=96 g/dm3 ac.=9,2 g/dm3

1,11 1,23 2,34

2. 05.09.04 Suc din boabe; zah.=110 g/dm3 ac.=8,7 g/dm3

1,39 1,34 2,73

3. 15.09.04 Suc din boabe; zah.=150 g/dm3

ac.=7,7 g/dm32,01 1,83 3,84

4. 25.09.04 Suc din boabe; zah.=190 g/dm3

ac.=6,1 g/dm32,29 2,09 4,38

5. 05.10.04 Suc din boabe; zah.=210 g/dm3

ac.=5,8 g/dm33,37 2,25 5,62

6. 15.10.04 Suc din boabe; zah.=230 g/dm3 3,77 2,44 6,21

15

ac.=5,1 g/dm3

În concluzie, constatăm că de la începutul maturizării strugurilor şi pe parcursul

a 50 zile, concentraţia resveratrolilor a sporit de cca 3 ori, atingînd nivelul de 6,21

mg/dm3 la soiul Pinot noir cultivat în condiţiile regiunii Roussillon Languedoc din

sudul Franţei (clona 667 a ENTAV – Franţa).

Resveratrolii, îndeplinind funcţii fiziologice importante la viţa de vie, cum sînt rezistenţa

la stresuri (atacul de micomicete, vătămători, temperaturi joase în timpul iernii etc.), se găsesc în

sucul boabelor în cantităţi relativ joase (0,5 -5,5 mg/dm3). Aceşti constituenţi biochimici ai

mustului şi vinului joacă o importanţă majoră în protecţia organismului uman contra surplusului

de radicali liberi prin captarea şi eliminarea lor din organism, prin protejarea sistemului

cardiovascular de depunerile pe interiorul vaselor a colesterolului negativ.

Din punct de vedere al efectului pe care poate să-l exercite resveratrolii asupra redox-

potenţialului din vinuri, precum şi asupra redox-potenţialului în organismul uman (scăderea

concentraţiei radicalilor liberi), este important să cunoaştem care sînt diminuările resveratrolilor

din vinurile brute pe întreaga catenă a schemei tehnologice de prelucrare şi condiţionare a lor.

Un astfel de studiu a fost realizat la Staţiunea de Cercetări Agronomice din Narbonne cu

participarea profesorului Michele Bourzeix pentru vinul brut Cabernet-Sauvignon (2004,Narbonne),

fapt ce a permis obținerea unor date experimentale exacte ce ţin de procentajul înlăturării din vin a

resveratrolilor în urma efectuării diverselor operaţiuni tehnologice (tabelul 6).

Dinamica conţinutului resveratrolilor în funcţie de operaţiunile tehnologice în vinul brut Cabernet-Sauvignon. Tabelul 6

N. d/o

Denumirea operațiunii tehnologice

Doza sau concentrația, temperatura

Concentrația de resveratrol, mg/dm3

%înlăturăriiTrans-

resveratrolCis-

resveratrolSuma totală de resveratrol

1. Control - 4,7 4,1 8,8 0

2.Enzimarea cu pectinază +β glicozidază

5g/hl 4,5 4,0 8,5 3

3. Decantarea la rece t = 4ºC,τ =12 ore

4,2 3,4 7,6 14

4. Prelucrarea cu bentonită

c=1 g/dm3 3,1 2,3 5,4 39

5. Prelucrarea cu gelatină

c=0,2 g/dm3 4,1 2,7 6,8 23

6. Filtrarea grosieră ,, Zeitz" 4,3 3,4 7,7 12

7. Filtrarea fină ,, Zeitz" 4,0 3,1 7,1 19

8. Filtrarea prin membrană

d= 0,45µĸ 4,1 2,7 6,8 23

16

Acest studiu efectuat la Stațiunea de Cercetări Agronomice din Narbonne cu participarea

profesorului Michele Bourzeix, au permis obținerea unor rezultate concrete privind procentul

înlăturării din vin a resveratrolilor în urma efectuării diverselor operațiuni tehnologice ( Bourzeix M.,

1985).

Spre exemplu, la tratarea vinului brut cu pectinază și β-glicozidază s-a atestat o diminuare

de 3% a resveratrolilor, însă cea mai mare diminuare a avut loc la preucrarea cu bentonită a

vinului brut în doze de 1mg/dm3, în aceste condiții,concentrația reziduală a resveratrolilor a

constituit 5,4 mg/dm3 din 8,8 mg/dm3 conținut inițial. Bentonita, în calitate de sorbent natural,

absoarbe cantități importante de resveratrol datorită suprafeței sale bine structurate și deschise

comparativ cu alți compuși fenolici, sorbția cărora este mult mai inferioară.

Este important de menționat, că, deși orice operațiune de filtrare a vinului brut poate

diminua conținutul de resveratroli de la 12% pînă la 23 % (filtrarea grosieră, fină și prin

membrane), totuși suma totală a înlăturării compușilor cercetați atinge 54%, ceea ce este puțin

mai mult decît jumătate din conținutul inițial a acestor compuși.

O înlăturare considerabilă a resveratrolului din vin s-a depistat în urma

interacţiunii acestuia cu levurile din vin, fapt demonstrat în urma unui studiu realizat

de Gaina B. și Roman O. la Institutul Universitar al Viei şi Vinului din Dijon, Franţa

în colaborare cu profesorul Gougeon Regis; sedimentarea levurilor după finalizarea

fermentaţiei alcoolice diminuază conţinutul resveratrolilor prin adsorbţia lor pe

suprafaţa membranelor celulare cu cca 80%( Gaina B., Roman O., Gougeon R., 2007).

Despre proprietățile biologic active ale compușilor fenolici din struguri,must,suc

și vinuri, și rolul lor în tratarea maladiilor din domeniul uvoterapiei și oenoterapiei

(Gaina B., Savin Gh., Bejan V. și al., 2005) atestă academicianul Boris Gaina, în

lucrarea sa, unde se menționează că pentru utilizarea vinurilor în oenoterapie, se

recomandă de a folosi vinurile brute netratate (Primeur, Mlado, Tulburel), iar în

uvoterapie- struguri și must proaspăt, la fel netratați și conservați la frig.(Gaina B.,

2000)

În ultimul deceniu a crescut semnificativ interesul consumatorilor de vinuri față de

producția vitivinicolă ecologică. Studiile recente, realizate la Institutul Național al Viei și

Vinului din Moldova, în colaborare cu Institutul Național de Cercetări Agronomice din

Narbonne (Franța) au avut ca scop determinarea concentrației resveratrolilor în vinurile

ecologice obținute din unele soiuri noi rezistente la factori biotici și abiotici ai mediului

17

ambiant. Despre tratarea limitată a acestor soiuri contra bolilor și vătămătorilor s-a menționat în

diverse publicații din R.Moldova (Gaina B.,2000; Gaina B.,2002; Duca G.,Gaina B.,Covaleov

O.,și al.,2004), însă primele rezultate obținute începînd cu anul 2005 privind conținutul

resveratrolilor în vinurile ecologice (tabelul 7) au fost expuse în lucrarea Gaina B.(2007).

Tabelul 7

Concentrația resveratrolilor în vinurile ecologice obținute din soiuri noi(Chișinău, 2005).

Nrd/o

Denumirea vinului (soiul de viță de vie)

Originea strugurilor (localitatea)

Concentrația de resveratrol, mg/dm3

Trans-resveratrol Cis-resveratrol Suma totală de resveratrol

1. Riton (alb) Chișinău, INVV 1,07 0,93 2,63

2. Legenda (alb) Chișinău, INVV 1,44 1,12 2,56

3. Viorica (alb) Chișinău, INVV 1,92 1,41 3,33

4. Perveneț Magaracia (alb)

Vulcănești, SEV 2,01 1,33 3,34

5. Negru de Ialoveni (roșu)

Chișinău, INVV 5,13 4,71 9,84

6. Rubin Tairova (roșu) Cahul,SÎS 4,41 3,19 7,60

7. Iubilei Magaracia (roșu)

Cahul,SÎS 5,01 3,66 8,67

Un conţinut mai redus al resveratrolilor se atestă la vinurile albe din soiurile Riton,

Legenda, Viorica şi Perveneţ Magaracia (de la 2,63 mg/dm3 pînă la 3,34 mg/dm3) în comparaţie

cu o concentraţie sporită a resveratrolilor în vinurile roşii din varietăţile Negru de laloveni, Rubin

Tairova şi lubilei Magaracia (de la 7,60 mg/dm3 pînă la 9,84 mg/dm3). E de menționat că aceste

vinuri au fost netratate, deci, doar în vinurile materie primă s-ar putea determina concentrații

palpitabile de resveratroli.

Analiza cromatografică HPLC aduce clar informaţie mult mai bogată decît

analiza spectrofotometrică, deoarece aceasta permite detectarea izomerilor şi a

dimerilor resveratrolului. Se observă, de fapt, şi prezenţa dehidromerului a trans-e-

viniferina, care ar putea implica contaminarea soluţiei mamă de resveratrol (Jeandet

P.,Breuil A.C., Adrian M., et al.,1997). S-a observat pentru prima dată că conţinutul de

viniferină creşte odată cu creşterea conţinutului de resveratrol în soluţie, după cum este

prezentat în figura 11.

18

Figura 11: Evoluţia concentraţiilor iniţiale(CO) în resveratrol şi viniferină măsurate prin HPLC, în funcţie de concentraţia teoretică a vinului model.

Resveratrolul (3,5,4-trihidroxistilben) este considerat ca fiind un constituent al

vinului, în special a vinurilor roşii (Goldberg D.M., Yan J., Diamandis E.P et al.,

1995; Jeandet P., Bessis R., Sbaghi M., et al.,1995). Numeroase metode de analiză a

resveratrolului în vinuri au fost utilizate de către oamenii de știință din străinătatea

(Jeandet P., Bessis R., Maume B.F., et al.,1995 ; Lamuela-Raventos R.M.,Waterhouse

A.L.,1993; Lamuela-Raventos R.M., Romeo-Perez A.I.,1995; Mattivi F., 1993; Pezet

R., Pont V., Cuenat P.,1994 ; Siemann E.H., Creasy L.L., 1992).

Studii în domeniu au fost efectuate și de cercetătorii italieni ( Pace-Asciak C.R.,

Hahn S., Diamandis E.P.,și al.,1995) care au făcut o comparație între cromatrogramele

HPLC ale vinului alb și roșu (figura 12).

19

Figura 12: Comparație între Cromatogramele HPLC la 278 nm de vinuri albe și

roșii folosite. Cromatograma (A) se referă la vin alb (Trebbiano d'Abruzzo 1996);

cromatogramă (B)- la un vin roșu (Montepulciano d'Abruzzo 1995).

Componenții identificați sunt: 1. Acid Prothocatechinic; 2. Acid galic;

3. (+)- Catechine; 4. (-)-Epicatechina; 5. Trans-resveratrol; 6. Rutina.

Așa cum se arată în figura 12, vinul roșu conține o cantitate mai mare de

compuși fenolici decât vinul alb.Proeminent vîrfurile corespuns acidul protocatechinic

și acidului galic, identificate cu numerele 1 și 2, respectiv, (+)-catechina și (-)-

epicatechina, (vîrfurile 3 și respectiv 4), trans-resveratrolul (vîrf 5) și rutina (vîrf 6),

au fost prezente doar în vinul roșu.Interesul sporit faţă de resveratroli şi unii derivaţi

ai săi este strîns legat de rolul pe care l-ar putea exercita aceştia în diminuarea riscului

maladiilor cardiovasculare a consumatorilor de vinuri roşii şi care cultivă un mod

sănătos de viaţă (Frankel E.N.,1993).

Un rol aparte este atribuit unui alt reprezentant al acestor compuşi biologici şi

anume - piceida (Lamuela-Raventos R.M., Romeo-Perez A.I.,1995;), în cadrul acestei

lucrări, în anul 2006 la Institutul Universitar al Viei şi Vinului(IUVV, Dijon), în

colaborare cu Laboratorul de CEnologie - din Universitatea Reims s-a utilizat o

metodă HPLC care a permis de a realiza separarea şi analiza izomerilor cis şi trans a

celor 4 stilbeni - resveratrol, piceida, pterostilben şi un dimer al resveratrolului.

Această metodă a permis determinarea concentraţiei fiecăruia din stilbeni într-o

selecţie de vinuri, în funcţie de soiul, de regiunea de producere, inclusiv de AOC* şi

de metodele de vinificare.

Printre polifenoli care atrag cea mai mare atenție, sunt resveratrolul și cuazercina

din cauza abundenței lor relative în produsele alimentare și a potențialului terapeutic

și efectelor lor biologice multiple în tratarea diferitor boli.

Resveratrolul, cuazercina și standardele lor interne au fost cuantificate la 320 nm

(resveratrol), 286 nm (4,4 '-dihidroxibifenil) și 370 nm (cuazercină și 2 ", 5,7 -

Trihydroxyflavone). Cromatogramele la aceste lungimi de undă sunt prezentate în

fig.13.

20

Figura 13: Cromatogramele HPLC de probe de sânge tratate cu a) 5µM

resveratrol (ambele înregistrate la 286 și 320 nm).

Cromatogramele la aceste lungimi de undă arată că analiții sunt atît de bine

integrați și fără picuri care să interfereze matricea de sânge. Acest lucru se aplică și în

plasmă, deoarece polifenolii sunt bine cunoscuți prin efectul lor de a se lega cu

aviditate de albumină, și sunt, prin urmare, "sechestrați" în plasmă (Rolinski, O.J.,

Martin, A., Birch, D. J., 2008).

*AOC-denumire de origine controlată.

Cercetările efecutate la Institutul din Padova, Departamentul experimental de

Științe biomedicale, referitor la efectele trans-resveratrolului și a unor derivați ai săi

asupra șobolanilor, pentru a obține rezultate concrete în ceea ce privește activitatea

acestor compuși la nivel intravenos (figura 14) și activitatea organelor principale

(creier, ficat, plămîni, rinichi,intestine etc.).

mAU R-S 40 R-S R Glucuronidase

30 R-G 20 Sulfatase

10

21

No treatment 0 0 5 10 15 20 25 30 35 Time(min)

Figura 14: Cromatogramele HPLC-UV (320 nm) a unei probe de sânge retrasă după 4 ore de la administrare intragastrică RGS (0,22 mmol / kg); cromatogramele reprezintă alicote de aceeași probă, fără nici un tratament enzimatic și după tratamentul cu sulfatază sau cu glucuronidaza, cum este indicat: R-S: resveratrol-sulfat;R-G: resveratrol-glucuronid, R: resveratrol.

În urma majorării concentrației sangvine (figura 15) s-a observat o majorare nesemnificativă a resveratrolului, în schimb se observă creșterea derivaților săi.

Figura 15: Concentrația sanguină vs curbele de timp pentru resveratrol și metaboliții săi principali (3,4 '-disulfatului (R-SS),3 - glucuronid (RG), 3-sulfat (RS)) după administrarea gastrică de resveratrol (A) sau RGS (B) la 0,22 mmol / kg doză.

În 2005, oamenii de știință italieni (Vita J.A.,2005) au obținut primul rezultat

pozitiv de suplimentare a resveratrolului la vertebrate(figura 16) în ceea ce privește

efectele pozitive ale resveratrolului la nivelul activității celulare.

22

Figura 16: Cromatograma reprezentativă a plasmei de șobolan (A); plasmă martor îmbogățită cu 5 nmol/g de trans-resveratrol (B); probele de plasmă obținute la 90 min. după administrarea intravenoasă a 15 mg / kg de trans-resveratrol (C) în : creier, intestine, ficat, plămîni, rinichi. Vîrf 1: trans-resveratrol, vîrf 2 :trans-resveratrol glucuronid; vărf 3: trans-resveratrol sulfat.

Se observă un pic al trans-resveratrolului și trans-resveratrol glucuronid în toate cazurile,

ceea ce atestă o stimulare intensă a acestor organe în urma admnistrării unei anumite cantități de

trans-resveratrol.Un studiu asemănător a fost efectuat de către Johan Auwerx (de la Institutul de

Genetică și Biologie Celulară și Moleculară din Illkirch, Franța), care împreună cu coautori au

publicat un articol online, în revista ,,Cell" în noiembrie 2006, în care s-a demonstrat că șoarecii

hrăniți cu resveratrol pentru 15 săptămâni au rezistența mult mai mare pe banda de alergat.

Studiul a susținut ipoteza lui Sinclair că efectele resveratrolului sunt într-adevăr datorită la

activarea genei Sirtuin 1( Kaeberlein., Matt., McDonagh., et al., "Substrate-specific activation of

sirtuins by resveratrol", 2005). 

Complexitatea şi interactivitatea ansamblului de caractere biologice depinde de

prezenţa moleculei de resveratrol. Atunci cînd totul s-a desfăşurat bine şi resveratrolul

este prezent în struguri la nivelul pieliţei substanţa joacă rol de barieră.Ca urmare

vinurile roşii, unde pieliţa este supusă macerării, vor conţine o cantitate mai mare de

23

resveratrol, în timp ce vinul alb conține mult mai puțin resveratrol, deoarece este

supus fermentării după ce pieliţa a fost înlăturată . Cantitatea de resveratrol variază

între 0,5-22 mg/l în vinurile roşii şi 0,2-3 mg/l în cele albe.

S-a demonstrat deja că toate speciile şi varietăţile Vitis nu prezintă aceleași

aptitudini de sinteză a stilbenilor(Lamuela-Raventos R.M.,Waterhouse A.L.,1993 ;

Xiao, J., Suzuki, M., Jiang, X., Chen, X., 2008). Referitor la acest studiu realizat de

cercetătorii moldavi şi francezi în comun, vinurile elaborate din Pinot noir, şi mai ales

cele din varietăţile Gamay, prezintă un conţinut relativ ridicat în resveratrol, total

respectiv 8 şi 29 mg/l total (Gaina B., Roman O., Bourzeix M., Gougeon R.,2007 ).

Referitor la diferența de sintetizare a stilbenilor în funcție de specia de viță de vie au fost

făcute ample cercetări de către Mihail V. Blagosklonny în Roswelt Park Cancer Institute, Statele

Unite ale Americii (2011). În acest studiu s-a analizat funcția de phytoalexin resveratrol, produs

de StSy ( stilben sintaza). S-a constatat că soiul Pinot Noir, a acumulat cantități mai mici de

glycoside trans-piceid, în timp ce Vitis rupestris a produs masiv trans-resveratrol și substanța

toxică oxidativă δ-viniferin, indicînd faptul că metabolismul preferat de resveratrol se regăsește

în specia Vitis. Acest studiu, ne arată că, în răspuns la Harpin (bacterie patogenă), soiul Pinot

Noir este mai sensibil și produce o cantitate mai redusă de resveratrol și piceid de glicozide, în

timp ce speciile rezistente Vitis rupestris au tendința să acumuleze resveratrol. Harpin elicitor a

determinat o acumulare temporară (StSy) transcrieri, care este mai puternic în Vitis rupestris în

comparație cu Vitis vinifera la varietatea Pinot Noir (Qiao F., Chang XL., Nick P., 2010).

Pentru a investiga, dacă produsul de StSy, adică resveratrol stilbenic, sau derivații săi

(figura 17 A), de asemenea, se acumulează ca răspuns la elicitor, abundența de resveratrol a fost

cuantificată prin HPLC în ambele linii celulare după tratament Harpin.

Figura 17 A : Căi

alternative de

glicozilare a

resveratrolului

24

Figura 17 B : Acumularea stilbenilor ca răspuns la Harpin în Pinot noir și Vitis rupestris.

Pentru a întelege funcția biologică a acumulării de resveratrol, au fost

investigate în continuare răspunsurile celulare exogene la resveratrol (figura 18).

Figura 18(A-D) : Reacțiile ,,Pinot noir" și V.rupestris la administrarea

resveratrolului.

A.O relație doză-răspuns pentru creștere (măsurată ca creșterea în volum a celulelor) peste concentrația resveratrol.

B.Timpul de inhibare a creșterii, ca răspuns la administrarea a 50 µM de resveratrol în comparație cu controlul solventul (concentrație egală din etanol).

C. Timpul la alcalinizarea extracelulare indusă de 50 µM resveratrol (+ res), comparativ cu controlul solvent (-res).

D. Relația doză-răspuns la starea de echilibru a pH-ului peste concentrația de resveratrol (evaluată la două ore după adăugarea de resveratrol.

25

Figura 18 (E-H) : răspuns de apărare a genelor la administrarea a 50µM de resveratrol, inclusiv codificarea sintazei reveratrol (RS), stilben sintetazei (StSy), genele proteine legate 5 și 10 (PR5, PR10), și inhibarea genei proteinei poligalacturonază (PGIP) detectate prin semiquantitative RT-PCR. E, G . prezintă un gel reprezentant, F, H .arată valorile medii și erorile standard la con (de control, barele albe), 0,5 h (bare cu cruci), 1 h (bare orizontal în dungi), și 3 h (baruri cu dungi verticale) după adăugarea a 50 resveratrol pM din cel puțin trei serii experimentale independente, în raport cu valoarea de control respectiv, folosind factorul alungire 1-α (EF1α) ca standard intern.

Hematocritului (PCV) la diferite concentrații de resveratrol a fost măsurată la

faza de staționare după 7 zile de creștere (Figura 18A), și s-a observat o diminuare de

la 10 µM resveratrol apropiat de nivelul zero la 500 µM în ambele linii de celule cu o

influența mai mare asupra Vitis rupestris în comparație cu soiul Pinot Noir.

Timpul de inhibare a creșterii (Figura 18B) a arătat un decalaj de 48 h și a ajuns

la 80% (în comparație cu controlul solventul) la 96 de ore în ambele linii celulare. Cu

toate acestea, inhibarea a fost mult mai pronunțat la 96 ore, comparativ cu faza

staționară trei zile mai tîrziu.Astfel, inhibarea a fost compensată cu timpul, aparent

mai rapid în Vitis vinifera la Pinot Noir, decît în Vitis rupestris.

În următoarea etapă, alcalinizarea extracelulară, ca un indicator celular rapid și

comod de apărare plante (Felix G., Regenass M,, Boller T., 1993) a fost analizat ca

răspuns la 50 µM resveratrol (corespunzînd cu jumătatea concentrației maxime, ca

răspuns la elicitor). În ambele linii celulare, alcalinizarea a fost detectabilă la 30 min,

26

dar dezvoltată mai rapid în Vitis rupestris (Figura 18C). Doză-răspuns a pH (figura

18D) au arătat o creștere proporțională cu concentrațiilor de resveratrol atingînd o

valoare maximă de 1,25 unități, deși a fost prezentată această creștere,nu a fost la fel

de pronunțată în Pinot Noir. Totuși în majoritatea liniilor de celule sunt prezente

fluctuații necontrolate ale pH-ului, în consecință are loc defalcarea vacuolară și

moartea celulelor.

Un al doilea aspect al hipersensibilității legate de moartea celulară programată

este reorganizarea Actin (Lamb C, Dixon RA., 1997 ; Franklin-Tong VE, Goutay CW.,

2008). În figura 19 este reprezentat reacția microfibrelor și a filamentelor Actin la

resveratrol.

Figura 19 : Răspunsul

microfilamentelor la administrarea Harpin și resveratrol.

Celulele de Pinot Noir (A, C, E) și Vitis rupestris (B, D, F) au fost tratate fie

cu etanol ca solvent de control, cu resveratrol (50 µM), sau cu Harpin (9 µg l -1), iar

microfilamentele au fost colorate prin imunofluorescență. Cînd microfilamentele au

fost vizualizate după 30min. tratament, fie cu solventul (figura 19 A, B), sau cu 50

µM resveratrol (figura 19 C, D), nu a fost găsită nici-o diferență de celulele netratate.

Totuși, tratamentul cu Harpin (9 μg.l-1) a condus la dezintegrarea microfilametelor în

Vitis rupestris dar nu și în Pinot Noir (figura 19E, F).27

Spre deosebire de microtubuli, răspunsul filamentelor de actină la resveratrol a

fost pronunțat în Vitis rupestris (figura 20). În comparație cu controlul netratat, în

cazul în care s-au observat fire fine de actină în periferia celulelor,filamentele de

actină au fost puternic combinate și contractate spre nucleu după 30 minute tratament

cu resveratrol.

Figura 20 : Răspunsul filamentelor de actină la resveratrol.

A. Organizarea actinei în Vitis rupestris într-o celulă de control după 30 min. a

administrării a 50µM resveratrol,vizualizat la faloid fluorescent.

B. Răspunsul actinei la administrarea a 50 µM resveratrol in vivo folosind

marcatorul de actină tutun. Dimensiuni baruri= 20µm.

C. Indică relocalizarea auxin-efluxului PIN1-RFP după tratamentul cu inhibitor de

actină LatB(2µM).Săgețile indică relocalizarea markerului PIN1-RFP. Dimensiuni

baruri= 20µm.

Toate imaginile au fost capturate cu ajutorul unui microscop AxioImager Z.1

28

(Zeiss), echipat cu un slider microscop ApoTome prin seturi de filtre de 38 HE pentru

FITC sau GFP (excitație la 470 nm, fascicule la 495 nm, iar emisiile la 525 nm) sau

43 HE pentru PIN1-RFP (excitație la 550 nm, fascicule la 570 nm, iar emisiile la 605

nm).

Cînd filamentele Actin au fost eliminate de Latrunculin B, reintegrarea PIN1-

RFP în membrana plasmatică a fost afectată rezultînd aglomerări intracelulare (figura

20C, rîndul de sus). În mod similar, 50 µM resveratrol au fost capabili de a induce o

aglomerare similară, dar cu o întîrziere de aproximativ 15 min, comparativ cu

tratamentul cu Latrunculin B (figura 20C, rîndul de jos). Acest răspuns rapid celular

la resveratrol a fost urmat, o zi mai tîrziu, de o scădere a indicelui mitotic, și o

stimulare de celule moarte. Aceste răspunsuri au fost dependente de concentrația de

resveratrol și au fost afectate deja la cea mai scăzută concentrație testată a 1 µM

resveratrol. În plus, sincronia diviziunii celulare,un diagnostic pentru activitatea de

transport a actin-auxin( Nick P.,2010), a fost perturbată rezultînd o scădere progresivă

a unui vîrf-6 de frecvență diagnosticate peste vîrful-5 cînd concentrația de resveratrol

a ajuns la 10 µM.

În concluzie, putem afirma că microtubulii, care sunt eliminați prin elicitor în

Vitis rupestris, nu răspund semnificativ la tratamentul cu resveratrol. Răspunsul

actinei la resveratrol este mai puternic în Vitis rupestris și mai slab în Vitis labrusca

soiul Pinot Noir.

2.1.6. Rolul resveratrolului în protecția organismului uman contra radicalilor

29

liberi. Acțiuni benefice.

Resveratrolul protejează celulele endoteliale de stresul oxidativ indus de

oxidarea LDL(colesterolului negativ,rău) fie prin intermediul activității directe de

neutralizarea a radicalilor liberi,cît și prin inhibarea acțiunii nicotinamid adenin

nucleotid fosfat oxidazei (NOX). Resveratrolul are o acțiune anti-inflamatorie prin

inhibarea ciclooxigenazei COX și prin reducerea sintezei de prostaglandine pro-

inflamatorii și vaso-protectivă, prin creșterea producției de oxid nitric și producția

redusă de peptide vasoactive demostrînd o eficacitate înaltă în protecția cardio-

vasculară.

În ciuda multitudinii de acțiuni observate, mecanismul de acțiune al acestui compus nu este

încă complet deslușit. Există studii care indică modificarea expresiei unor enzime precum COX-

2 și ODC, inhibarea unor enzime active la nivelul cyt P450 și activarea unei proteine reglatoare

Sir-2, o protein-deacetilaza NAD-dependentă. Se pare ca mecanismul din urmă a fost asociat cu

creșterea longevității. De asemenea se pare ca resveratrolul mimează efectele protective ale

SIRT1 (o proteina tip Sir-2 specifică mamiferelor). Aceste efecte sunt similare restricției calorice

(RC), acesta fiind si unul dintre mecansimele posibile de acțiune ale polifenolului.

Resveratrolul și RC produc modificări metabolice, precum scăderea insulinei si creșterea

biogenezei mitocondriale. S-a observat că alterarea căilor semnalizatoare ale insulinei și

modificările produse în activitatea mitocondrială, rezultă din activarea unei enzime adenosin

monofosfat kinaza (AMPK). AMPK este activată de o serie de factori patologici, legați de stres-

ul celular, printre care deprivarea de glucoza, hipoxia, stres-ul oxidativ sau diferiți hormoni

precum leptina sau adiponectina. Activarea AMPK joacă un rol important împotriva stresului

oxidativ, mai ales împotriva ischemiei, reducînd mărimea infarctului. De asemenea s-a observat

ca AMPK este activată si de către neuronii hipotalamici sub influența unor condiții restrictive

alimentare (dieta).

Biplab Dasgupta si Jeffrey Milbrandt de la Departamentul de patologie si Neurologie,

Washington University School of Medicine – SUA (2011), au realizat un studiu pe culturi

celulare privind modul de acțiune al resveratrolului și efectele sale protective (Schema 1). Ei au

plecat de la observația că o parte din schimbările metabolice produse de către resveratrol sunt

asemanătoare cu cele care au loc la activarea AMPK. Astfel ei au considerat ca ipoteza inițială că

activarea AMPK ar putea fi un important mediator în exercitarea proprietăților compusului la

nivel neuronal.

30

Schema 1 : Acțiunile molecului de resveratrol asupra organismului uman

Astfel, ei au utilizat culturi celulare neuro2a neuroblastoma, care au fost tratate cu 10 µM

resveratrol. Apoi a fost urmarită activarea AMPK prin utilizarea de anticorpi fosfo-AMPK

specifici. După circa 2 ore, cercetătorii au observat o importantă creștere a fosforilării AMPK,

creștere menținută pînă la 72 de ore de la tratare. Pentru a confirma această observație, cei doi

oameni de stiință și-au concentrat atenția asupra fosforilării acetilcoenzimei A carboxilazei

(acetil-CoA carboxilaza sau ACC), țintă primară a AMPK-ului activat. Ca urmare, experimentul

lor a confirmat ipoteza inițială că resveratrolul prezintă acțiuni asemanătoare RC (promovarea

biogenezei mitocondriale și a eficienței bioenergetice).

Pentru a cerceta în continuare efectele neuroprotective la nivelul creierului, echipa de

cercetători a injectat intraperitoneal (i.p.) resveratrol unui grup de șoareci masculi în vîrsta de 2

luni. În paralel s-a format și un grup de control care a primit un alt grup de șoareci masculi în

vîrstă de 2 luni, cărora li s-a injectat intraperitoneal un vehicul inert(ce nu conține resveratrol).

Analiza ulterioară a relevat faptul că o singură injecție cu resveratrol a determinat o creștere a

activării prin fosforilare a AMPK și a ACC de pînă de 2 ori mai mult, în numai 2 ore. Aceste

rezultate indică faptul ca administrarea i.p. de resveratrol, produce o activare a AMPK, iar

această activare determină o fosforilare a ACC, o țintă importantă a AMPK-ului activat.

31

Într-un studiu realizat de Pezzuto și coleg. (Jang M., Uneani G.O, Slowing K., et al., 1997)

s-a demonstrat că resveratrolul a fost eficient în cele trei faze ale cancerului. Mai mult, savanții

de la Universitatea din Liecester au prezentat miercuri, 5 decembrie 2012, probe despre modul în

care resveratrolul care se găsește în vinul roșu poate preveni cancerul (figura 21).

Figura 21 : Acțiunea resveratrolului în prevenirea cancerului.

Cercetătorii de la universitatea din Liecester au cercetat nivelurile resveratrolului care

poate fi benefic în prevenirea cancerului folosind modelul din laborator, aceștia au descoperit că

o cantitate zilnică de resveratrol, echivalentă cu două pahare de vin, poate înjumătăți rata

tumorilor intestinale. De asemenea, s-a demonstrat activitatea antioxidantă și antimutagenică a

resveratrolului, precum și niveluri crescute ale chinon-reductazei, o enzimă capabilă de

detoxifiere în cazul carcinogenezei.

Resveratrolul a fost raportat ca eficient împotriva disfuncțiilor celulelor neuronale și

împotriva morții celulare și este eficient împotriva maladiilor Huntington și Alzheimer.

Cercetătorii de la Northeastern Ohio Universities College of Medicine și Ohio State

University demonstrează că molecula de resveratrol are o acțiune inhibitorie directă asupra

fibroblastilor cardiaci și poate inhiba progresia fibrozei cardiac( figura 22).

32

Viovalabilitatea resveratrolului depinde de formele sale conjugate: glucuronat și sulfonat,

chiar dacă majoritatea studiilor in vitro folosesc forma agliconică a resveratrolului.

Figura 22: Acțiunea inhibitoare a resveratrolului la nivel celular.

Mecanismele prin care molecula de resveratrol ar putea prelungi viața nu sunt încă bine

înțelese, dar acest lucru pare să funcționeze prin inhibarea lipazei, reducînd absorbția grăsimii în

pereții intestinali. Numai în forma trans- molecula este capabilă să activeze gena SIRT 1 in vitro.

Recent, Kaeberlein și coleg. au adus în discuție această teorie, care reunește resveratrolul, SIRT

1 și reducerea de calorii. Molecula de resveratrol pare să potenteze efectul unor medicamente

antiretrovirale, împotriva HIV in vitro.

Un grup de cercetători de la National Institutes of Aging laboratory din Baltimore,

împreună cu specialiști din Australia și Spania, sub conducerea dr. David Sinclair, profesor de

patologie la Harvard Medical School, au efectuat recent un studiu (2010-2012) pe baza moleculei

de resveratrol, prin care s-a demonstrat ca va fi posibil ca populația să fie ferită de efectele

dăunatoare ale dietelor bogate în calorii și grăsimi, o problema majoră a societății moderne.

33

Antioxidant

Antiinflamator

Antitumoral

AntimutagenCardioprotector

Neuroprotector

Antibacterian

Făcînd o sinteză a informației anterioare, putem enumera principalele efecte ale

resveratrolului :

Schema 2 : Cele mai importante efecte ale resveratrolului asupra organismului

Resveratrolul este cel mai puternic antioxidant, el încheagă și îndepărtează

radicalii liberi din organism,în același timp stimulează înmulțirea celulelor sănătoase

si capacitatea lor de regenerare.Resveratrolul menține capacitatea de funcționare

normală a trombocitelor, ajută la scăderea vîscozității sîngelui, îmbunatățindu-se

astfel circulația sîngelui.Are proprietatea de a încetini cu 50% sporirea celulelor

cancerigene sau poate chiar să le stopeze.

34

2.2 Proantocianidinele

2.1.1 Generalităţi. Tanine din semințe de struguri (proantocianidine), activitatea

biologică și aplicații.

Taninele condensate izolate din seminţe de struguri (TSS), numite altfel proantocianidine,

reprezintă o grupă de substanţe naturale cu structură polifenolică. Interesul faţă de aceşti compuşi

este determinat de mai mulţi factori. În primul rînd ei posedă un spectru larg de activităţi

biologice, iar prezenţa lor în dieta umană e considerată ca o măsură preventivă în combaterea

maladiilor severe, cum ar fi cancerul şi ictusul cerebral. Asimilarea benefică a taninelor din

struguri e legată de consumul moderat de vin. În acelaşi timp seminţele de struguri reprezintă

deşeuri ale producţiei vinicole şi ele conţin de asemenea cantităţi semnificative de compuşi

polifenolici. Ţinînd cont de faptul că valorificarea produselor secundare ale industriei vinicole

reprezintă o direcţie de cercetare prioritară recunoscută de Guvernul Republicii Moldova, un şir

de companii au iniţiat programe de cercetare orientate spre elaborarea procedurilor eficiente de

extracţie a proantocianidinelor din seminţele de struguri.

În mod cronologic, prima sursă explorată de tanine condensate a fost scoarţa de pin.

Ulterior, una dintre sursele preferabile ale acestor compuşi au devenit seminţele de struguri,

graţie faptului disponibilităţii lor în cantităţi industriale. În rezultat, pe piaţa produselor

secundare vinicole au apărut un şir de extracte din seminţe de struguri, reprezentînd surse sigure

de tanine. Taninele reprezintă nişte compuşi polihidroxilaţi cu structură aromatică care în primul

rînd sunt caracterizaţi de proprietatea de a forma complexe insolubile cu proteinele salivare.

Deaceea prezenţa acestor compuşi în vin contribuie la proprietăţile lui organoleptice, în primul

rînd la culoare şi astringenţă.(Vidal S., Cartalade D., Souquet J.M., et al. 2002;Jorgensen E.M.,

Marin A.B., Kennedy J. A., et al. 2004; Gonzalez-Manzano S., Santos-Buelga C., Perez-Alonso

J.J, et al. 2006; Peyrot des Gachons C., Kennedy J. A., et al. 2003).În afară de aceasta, derivaţii

flavan-3-olului reprezintă antioxidanţi importanţi în celulele vii. De aceea taninele din seminţe

de struguri sunt examinate în primul rînd datorită activităţii lor antioxidante. Se cunoaşte că

potenţialul de oxido-reducere a compuşilor fenolici este sufficient de mic pentru a interacţiona cu

diferite specii oxidante prin intermediul diferitor mecanisme, de regulă prin un mecanism de

captare a radicalilor liberi(Freitas V., Glories Y., Laquerre M., și al. 1998 ; Uchida S., Edamatsu

R., Hiramatsu R., și al. 1987).

Aceşti compuşi au un rol semnificativ în calitate de repelenţi pentru protecţia plantelor

contra agenţilor patogeni şi diferitor dăunători(Gonzalez-Manzano S., Santos-Buelga C., Perez-

Alonso J.J, et al. 2006). Datele literare demonstrează că taninele au o acţiune protectoare în cazul

35

degradării oxidative a AND-ului precum şi o acţiune benefică în inhibarea preventivă a

carcinogenezei (Pinelo M., Laurie V.F., Waterhouse A.L., et al. 2006). De rînd cu proprietăţile

lor antioxidative, proantocianidinele pot influenţa eliberarea oxidului de azot de către celulele

endoteliale (Fitzpatrick D.F., Fleming R.C., Bing B., et al. 2000). Bazîndu-se pe aceste

mecanisme de acţiune, compuşii polifenolici din produsele vinicole au fost prezentaţi în diferite

publicaţii ca substanţe cu acţiune antibacteriană, antivirală, anticarcinogenică, antiinflamatorică,

antialergică şi vasodilatatorie. De asemenea taninele respective au demonstrate capacitatea de a

inhiba agregarea trombocitelor, de a îmbunătăţi permeabilitatea vaselor sangvine şi de a diminua

fragilitatea lor.Au mai fost relatate studii despre efectul enotaninelor asupra sistemelor

enzimatice cum ar fi fosfolipazele A2,ciclooxigenazele şi lipooxigenazele. În rezultat beneficiul

potenţial al enotaninelor pentru sănătatea umană a fost recunoscut pe larg(Santos-Buelga C.,

Scalbert A., et al. 2000). Aceasta a condus la aplicaţii fitofarmaceutice diverse a enotaninelor

condensate: prevenirea maladiilor cardiovasculare,reducerea edemelor, îmbunătăţirea circulaţiei

periferice, îmbunătăţirea vederii,tratarea retinopatiei diabetice,hipercolesterolemiei,stabilizarea

tonusului ţesuturilor conjunctive,reducerea reacţiilor alergice şi inflamatorii, ameliorarea

tratamentului plăgilor precum şi îmbunătăţirea funcţiei imunitare(Murray M, Pizzorno J., 1999).

Extractele dinseminţe de struguri (spre exemplu preparatul Leucoselect™) sunt utilizate

atît ca ingredienţi activi în produse farmaceutice cît şi în calitate de aditivi alimentari. Aceste

extracte contribuie înprimul rînd la tratarea fragilităţii şi creşterea stabilităţii pereţilor vaselor

sanguine, precum şi la captarea radicalilor liberi activi şi inhibarea ionilor superoxidici(Gabetta

B., Fuzzati N., Griffini A., 2000).

În baza acestor circumstanţe, proantocianidinele din seminţele de struguri prezintă un

interes sporit în calitate de compuşi biologici activi cu un spectru larg de activităţi.

Un grup de cercetători științifici, au demonstrat că proantocianidinele extrase din semințe

de struguri au fost găsite capabile de a reduce în mod semnificativ creșterea papilomavirusului

uman HPV 16 care stimuleaza apariția celulelor canceroase. Astfel, oamenii de știință, au salutat

activitatea lor, ca un pas important în dezvoltarea de tratamente alternative de cancer deoarece

chimioterapia standard și radioterapia, utilizate frecvent pentru a trata pacienții cu cancer, de

multe ori au efecte secundare dureri și reacții severe, care includ leziuni tisulare și defecțiuni.

Descoperirea și validarea de noi tratamente si strategii de prevenire, lipsite de aceste efecte

secundare nocive, reprezintă unul dintre obiectivele principale ale cercetătorilor oenologi.

36

2.2.2 Structura chimică și proprietățile proantocianidinelor

Componenţa proantocianidinelor din seminţele de struguri este foarte complexă. Unităţile

structurale care stau la baza acestei complexităţi sunt doi compuşi polifinolici relativi simpli:

catehina1 şi epi-catehina2 (figura 23)

Figura 23: Structura chimică a catehinei(1) și epicatehinei (2)

În urma condensării oxidative între atomii de carbon C-4 ai catehinei1 sau epi-catehinei2

cu atomii de carbon C-6 sau C-8 ale aceloraşi molecule se formează lanţuri oligomerice. Aceşti

oligomeri reprezintă o pletoră de compuşi ce diferă prin gradul de polimerizare (GP), modul de

joncţiune a monomerilor şi succesiunea lor. Proantocianidinele B1-B4 (figura 24), care conţin

legătura C4-C8 sunt cei mai răspîndiţi dimeri (da Silva J, Rigaud J, Cheynier V, et al. 1991).În

multe cazuri oligomerii formaţi au grupa hidroxil la atomul de carbon C-3 esterificată cu acidul

galic(Fitzpatrick D.F., Fleming R.C., Bing B., et al. 2000; da Silva J, Rigaud J, Cheynier V, et al.

1991).

Figura 24 : Structura chimică a proantocianidinelor B1-B4

E de menţionat faptul că numai cîteva proantocianidine au fost isolate în stare individuală

şi caracterizate. Structura lor include compuşi de la dimeri la tetrameri(Gabetta B., Fuzzati N.,

Griffini A., et al. 2000). În acelaşi timp distribuţia proantocianidinelor oligomerice în seminţele

de struguri, inclusive în soiurile albe, a fost studiată de mulţi autori(Gabetta B., Fuzzati N.,

Griffini A., et al. 2000; da Silva J, Rigaud J, Cheynier V, et al. 1991 ; Oszmianski J., Sapis J.C.,

1989 ; Lea A.G.H., Bridle P., Timberlake C.F., et al. 1979 ; Romeyer F.M., Macheix J., Sapis J.,

1986 ; da Silva R.J.M., Bourzeix M., Cheynier, V., et al. 1991; da Silva R.J.M., Rosec J.P.,

37

Bourzeix M., et al. 1992). Flavanoidele monomerice şi esterii lor cu acidul galic predomină în

fracţiile solubile în apă a compuşilor polifenolici obţinuti din seminţele de struguri.

Oligomerii sînt reprezentaţi în general de proantocianidinele de tip B( da Silva R.J.M.,

Bourzeix M., Cheynier, V., et al. 1991; Santos-Buelga C., Francia-Aricha E.M., Escribano-

Bailon,M.T., 1995). Structura lor a fost investigată în lucrările publicate(Pekic B., Kovac V.,

Alonso E., et al. 1998 ; Kovac V., Bourzeix M., Heredia N., et al. 1990 ; Kovac V., Alonso E.,

Revilla E., et al. 1995). Un studiu comparativ al compoziţiei flavan-3-olilor a fost de asemenea

efectuat(Santos-Buelga C., Francia-Aricha E.M., Escribano-Bailon M.T., 1995). Compuşii

cercetaţi au provenit din 17 soiuri diferite de struguri din Spania, incluzînd 10 soiuri roşii şi 7

albe. Un număr total de 27 proantocianidine au fost izolate: (+)-catehina1, (-)-epi-catehina2, epi-

catehin-3-O-galat, dimerii B-1 – B-7 (3)-(9), trimerii C-1 (11) şi C-2 (12), de rînd cu un şir

numeros de proantocianidine esterificate cu acidul galic la grupa hidroxil C-3 în ciclul B şi la

grupa fenolică de la atomul C-3’ al ciclului C.

Figura 25: Structurile chimice ale derivaților proantocianidinelor

38

În rîndul compuşilor esterificaţi sunt dimeri şi trimeri ai flavan-3-olului, unii din ei conţin

două fragmente de acid galic. Dimerul B-2 (4) predomină în grupa respectivă. Proantocianidinele

descries diferă nu numai după numărul şi succesiunea unităţilor flavan-3-olice, modul de

esterificare, dar şi după modul diferit de joncţiune a monomerilor (C-4 – C-8 sau C-4 – C-6) şi

configuraţia la atomul de carbon C-4 (α sau β). Lucrarea în cauză prezintă numai un singur

tetramer descris, el consistînd numai din unităţi ale epi-catehinei [epi-catehina (4β-8)- epi-

catehina (4β-8)- epi-catehina (4β-8)- epi-catehina]. Izolarea taninelor polimerice individuale

reprezintă o sarcină dificilă. Toate exemplele din literatură relatează numai izolarea unor fracţii

ce conţin amestecuri ale cîtorva polimeri individuali(Gabetta B., Fuzzati N., Griffini A., et al.

2000).

Gradul mediu de polimerizare (GmP) al flavan-3-olilor poate fi diferit şi datele obţinute

depind de metoda de determinare. Conform autorilor(Vidal S., Cartalade D., Souquet J.M., et al.

2002), proantocianidinele cum asa moleculară mare pot conţine pînă la 20 unităţi de flavan-3-ol,

şi acesti compuşi sunt solubili în vin. Din esterii acidului galic a fost identificat un

octamertrigaloilat(de Freitas V., Glories Y., Bourgeois G., et al. 1998). Cercetările mas-

spectrometrice(Hayasaka Y., Waters E.J., Cheynier V., et al. 2003) relatează grade de

polimerizare de la 9 la 11 unităţi. În acelaşi timp, bazîndu-se pe experimentele hidrolizei

acide(Sun B.S., Leandro C., da Silva J.M.R, et al. 1998), au fost obţinute valori mai mari ale GP,

variind de la 17 pînă la 31 unităţi.

Conform studiilor realizate pînă în prezent se cunosc mai multe metode moderne de

cercetare a proantocianidinelor, după cum ar fi cromatografia de performanţă înaltă cu lichide

(HPLC) şi spectrometria de masă (MS). Însă pentru a putea fi cercetate, este nevoie de a

cunoaște metodele de extragere a acestora. Astfel, în lucrarea unui grup de autori ( V. Kulciţki,

P. F. Vlad*, Gh. Duca, T. Lupaşcu, 2007) sunt menționate unele metode de extracţie utilizate în

izolarea proantocianidinelor din seminţele de struguri folosind amestecul de acetonă-apă în

diferite proporţii (70:30 în prezenţă de silicagel, 60:40 la +4oC, 50:50 la temperature camerei),

methanol pur la temperatura camerei, methanol cu adaus de acid ascorbic (1g/l) la -20oC, urmat

de amestecul methanol-apă (1:1) la -24oC şi acetonă-apă (75:25), totul în atmosferă de azot

(Santos-Buelga C., Francia-Aricha E.M., Escribano-Bailon M.T, 1995; Monagas M., Gomez-

Cordovez C., Bartolomea B., et al. 2003). Metanolul a fost utilizat de asemenea şi în combinaţie

cu alţi solvenţi pentru extracţia taninelor din seminţe de struguri. Cîteva exemple includ extracţia

cu methanol acidulat cu HCl,() amestec metanol-apă (75:25) la temperatura camerei şi iradiere

ultrasonică. Etanolul apos a fost utilizat pentru extracţia taninelor din seminţele de struguri, (de

Freitas V., Glories Y., Laquerre M., et al. 1998; Darne G., Madero T.J., 1979) precum şi a

39

proantocianidinelor din Rhodiola semenovii( Kuliev R.Z., Akhmedov U.;, Khalmatov Kh.Kh., et

al. 2004).

Un alt exemplu interesant de extracţie (Kuliev, R.Z.; Akhmedov, U.; Khalmatov, Kh.Kh.,

et al. 2004), include fracţionarea unui extract etanolic apos prin extracţie succesivă cu eter

dietilic şi etilacetat, ce a condus la fracţii mai simple ale proantocianidinelor. Partea eterică a

inclus (+)-catehina (1), (+)-galocatehina (13), (-)-epi-catehina (2), (-) – epi-catehingalat (14),

(-)-epi-galocatehină (15), (-)-epi-galocatehingalat (16) şi acid galic (17). Fracţia din etilacetat a

inclus următorii dimeri: (+)-catehin-(4α-8)-(+)-catehină (18), (-)-epi-catehingalat-(4β-8)-(-)-epi-

catehingalat (19) şi (-)-epi-catehin-(4β-8)-(-)-epi-catehingalat (20).

Figura 26: Fracțiile pronatocianidinelor

2.2.3 Progrese tehnico-științifice în studierea și implementarea proantocianidinelor.

2.2.3.1 Rolul proantocianidinelor în tratarea bolilor neurodegenerativ

În ultimii ani, continuă să se realizeze cercetări din ce în ce mai intens în ceea ce constă

extragerea acestor compuși biologic activi din strugurii pentru valorificarea lor la elaborarea

diferitor preparate pentru industria alimentară, cosmetică și farmaceutică sau ca supliment

alimentar.

Astfel s-a constatat că extractul din semințe de struguri este benefic pentru prevenirea și

tratamentarea unei boli neurodegenerative. Acest extract de semințe de struguri conținînd unul

sau mai mulți compuși derivați din acestea au puterea de a reduce acumularea, agregarea și / sau

40

depunerea de β amiloid sau oligomerii săi și / sau pentru a reduce misfolding-ul, acumulare și /

sau agregarea Tau proteinelor sau a altor proteine. Bolile neurodegenerative sunt asociate cu

condițiile în care celulele neuronale se deteriorează, își pierd funcția, și de multe ori mor.

Consecințele bolilor neurodegenerative sunt de multe ori devastatoare. Pacienții cu boli

neurodegenerative pot suferi deteriorări grave în abilitățile cognitive sau legate de sistemul

locomotor. Ca urmare, calitatea lor de speranța de viață și a vieții pot fi reduse considerabil. În

cazul organismului uman, aceste boli includ boala Alzheimer, boala Parkinson, scleroză laterală

amiotrofică, boala Huntington, demență fronto-temporală.

Precum am atestat în lucrarea autorilor (V. Kulciţki, P. F. Vlad*, Gh. Duca, T. Lupaşcu,

2007) importanța proantocianidinelor, structura lor chimică și metodele de cercetare, în final, în

cadrul unui experiment HPLC semipreparativ a fost descoperit un compus individual și conform

datelor MS acest compus e un trimergaloilat, structura 21 (figura 27) a fost propusă în baza

numai a experimentelor MS-MS. Dar pentru a stabili definitive structura acestui compus, în

special stereochimia lui sunt necesare studii adaugătoare.

Figura 27: Structura chimică a trimergaloitatului.

In acest mod, un grup de savanți (Giulio Maria Pasinetti, Lap Ho, Jun Wang, 2010), au

realizat o invenție care prevede o metodă de reducere a misfolding-lui, acumulare, agregarea sau

depunere de Aβ (amiloid β peptid) oligomeric Aβ, proteinele Tau sau alte proteine asociate cu o

bolile neurodegenerative. Și totodată, au stabilit structura compusului tructura 21, precum și

stereochimia lui. Metoda implică administrarea unei cantități eficiente dintr-o compoziție

farmaceutică care cuprinde un extract de semințe de struguri sau unul sau mai mulți compuși

derivate din acestea (figura 28).

41

Figura 28: Structura moleculară a unui proanthocianidin tipic heteropolimeric.

Compoziția farmaceutică poate să conțină un ingredient activ, ales din grupul format de

un antioxidant, un inhibitor acetilcolinesterazei, și combinații ale acestora. Într-o variantă

particulară, extractul din semințe de struguri cuprinde aproximativ 12% în greutate din

proantocianidingalloylated raportat la greutatea totală a proantocianidinei în extract. 

Prezenta invenție se bazează pe descoperirea compușilor obtinuți dintr-un extract de

semințe de struguri ca inhibitori eficienți împotriva misfolding-ului, acumulare, agregarea și / sau

depunerea de Aβ, proteinei Tau, și alte proteine care sunt asociate cu diferite boli

neurodegenerative. Concret, invenția se bazează parțial pe descoperirea că anumite tipuri de

extract de semințe de struguri reduc sau inhibă formarea de oligomeri de sintetic Aβ1-40 (Aβ40) și

Aβ1-42 (Aβ42) în vitro (figura 29)

42

Figura 29 : Efectul MNG-AZ GSE privind conversia Aβ peptidic în formele lor oligomerici

solubile în vitro. Fig. 2A și 2B, dodecil sulfat de electroforeza gelului de poliacrilamidă de sodiu

(SDS-PAGE) a produsului de incubare Aβ1-42 (2A) și A β1-40 (2B), cu diferite cantități de MNG-AZ

GSE. Fig. 2C și 2D – rezultatul SDS-PAGE a Aβ 1-42 (2C) și Aβ1-40 (2D), în prezența sau absența

MNG-AZ GSE urmărind Foto-induse Reticularea Proteine nemodificate (PICUP)

43

Figura 30: ilustrează o Aβ cu efect de inhibare a MNG-AZ investigat de metabolismul

MTT. Fig. 3A (și 3C) arată toxicitatea cu greutate moleculară mică Aβ1-40 (și Aβ1-42) și efectul de

MNG-AZ în reducerea toxicității. Fig. 3B (și 3D) arată toxicitatea Aβ1-40 agregare (și Aβ 1-42

agregare) și efectul de MNG-AZ în reducerea toxicității

Figura 31: 4A și 4B arată efectul de MNG-AZ GSE asupra funcției cognitive la tulpina, varsta si

sex-potrivit animalelor sălbatice de tip masurate prin teste Morris-labirint de apă.

Rolul benefic al produsului bogat în extracte de proantocianidine a fost demonstrat pe

exemplul Drosophilei care era infectată cu o boala neurodegenerativă.

44

În acest mod, administrarea preparatului MNG-AZ la un individ ce suferă de boala

Huntington are un efect benefic la tratarea acesteia manifestîndu-se prin mărirea numarului de

organisme și perioada de supravețuire. Acest efect poate fi examinat conform Fig.32 și Fig.33.

Figura 32: % de supraviețuire peste zile în modelul Drosophila de boala Huntington.

În acest caz grupul de organisme a fost tratat cu un extract de semințe de struguri unde,

cercurile hașurate reprezintă rezultate din grupul de control iar cele nehașurate –ale insectelor

cărora le-a fost administrat preparat.

Figura 33: % de supraviețuire peste zile într-un model de Drosophila HD

În acest caz, același efect a fost obținut, însă, s-a folosit metodă de tratare, prepartul MNG-AZ,

unde diamantele umbrite reprezintă rezultate din grupul de control iar cele neumbrite-rezultatele

din grupul supus tratării.

45

Experimentul pe baza Drosophilei nu a fost unicul experiment care a servit la luarea

deciziilor referitor la rolul inhibitor al extractului din semințe de struguri. Deasemenea, acestea

cercetări au fost elaborate prin administrarea în creierul șoarecilor Tg2576 (șoareci transgenici

care exprimă proteine amiloid mutantă precursor și prezintă deteriorarea AD-tip cognitiv), și

semnificativ îmbunătățește sau încetiniște pierderea funcției cognitive la șoareci Tg2576

(comparativ cu șoarecii netratați).

Figura 34: schema de evaluare test folosind posterioarele extensive la nivelul membrelor pentru

unun șoarec JNPL3 model transgenicde tauopathy.

Tendința animalelor naturală de a extinde membrele posterioare lateral atunci când

acestea sunt agățate de cozi cu capul în jos, sunt evaluate în conformitate cu un sistem de rating

de patru puncte: 4 = functionarea normala (fig. 34A), 3 = insuficiență renală ușoară (Fig. 34B), 2

= insuficiență hepatică moderată (fig. 34C), și 1 = afectare severa (fig. 34D).

Folosind aceast exemplu prin tratarea șoarecelui, s-au observat anumite schimbări care

pot fi explicate analizînd graficele urmatoare :

46

Figura 35: efectul unui tratament GSE pe un model de șoarece JNPL3 transgenic

tauopathy. Fig. 7A arată depreciere cu motor la șoareci JNPL3, la vârsta de 5 luni și 13 luni,

respectiv, atunci cand sunt tratați cu GSE, în comparație cu cele care nu sunt tratate cu GSE. Fig.

7B prezintă în comparație rata de mortalitate între soarecii JNPL3 netratați și cei tratași cu GSE,

grafice de linie caracterizează prin aceea că reprezintă % de indivizi supraviețuind în timp.

Examinînd aceste date experimentale, putem concluziona că acest preparat cu extrat de

proantocianidine elaborat pentru tratarea bolilor neurodegenerative reduce acumularea, agregarea

și/ sau agregarea Tau proteinelor, astfel, prin administrarea acestui preparat, se reduce speranța

de viața a celulelor care provoc aceste boli.

2.2.3.2 Interactivitatea moleculei de proantocianidina cu Centella asiatica

Boli care afectează inima sunt de obicei clasificate în boli de inima pe termen lung. Mai

precis, bolile cardiovasculare care se referă la clasa bolilor de inima, care implică inima și vasele

de sânge (artere și vene). Un tip dintre bolile cardiovasculare este ateroscleroza. Ateroscleroza

este un sindrom care afectează vasele de sânge arteriale, care transportă sânge bogat în oxigen la

inima și alte părți ale corpului. Aceasta se referă la procesul în care depozitele de substanțe grase,

colesterol, produse celulare reziduale, calciu,se depund pe pereții vasculari, ducînd la îngroșarea

peretului vascular, și micșorarea lasticității în rezultat, se micșorează lumenul vascular și, ca

rezultat, poate provoca dereglări de vascularizare în organe(creer, cord...) ducînd la procese de

47

eschemie și infracturi. Din aceste considerente, medicii-savanți caută remediul potrivit și cît mai

inofensiv pentru sănătatea umană.

Abascal K și colab. "Botanicals for chronic venous insufficiency",terapii alternative și

complementare, Vol.. 13, N [°.] 6, decembrie 2007, pp. 304-311; au prezentat plante care sunt

utile ca terapie adjuvantă pentru tratamentul insuficienței venoase cronice. Plantele utilizate

includ Ruscus aculeatus, semințe de castan sălbatic, Centella asiatica, Vitis vinifera și

proantocianidine oligomerice cum ar fi Pycnogenol (R).

Astfel, pentru utilizare înprevenirea sau tratamentul aterosclerozei s-a descoperit că

extractul din semințe de struguri poate fi implimentat la prepararea unui compus de uz medical,

un preparat care conține o combinație de proantocianidine precum Pycnogenol sau semințe de

struguri și Centella asiatica și / sau extrase ale acestora.

Rezultatele experimentului la un grup de pacienți Tabelul 8.

Vîrsta Numărul

de pacienți

Bărbați Placă aterosclerotică

Artera fumurală Artera carotidă

Pacienți apți

pentru testare

63.3; 7 57 38 66 69

62.4; 5.1 58 34 57 66

În concluzie, rezultatele observate sugerează o acțiune pozitivă importantă a combinației

de Pycnogenol (R) + Teca si Pycnogenol combinație (R) + Teca + Aspirina (APT), la micșorarea

depunerilor de substante aterosclerotice pe peretele interior al vaselor sanguine, reduce apariția

plăcilor aterosclerotice pe vasele carotide și femurale, care sunt cele mai periculoase tipuri de

placi, asociate de evenimente cardiovasculare ce duc la embolizare și tromboza.

II. MATERIALE ŞI METODE

II.1.MATERIALE

În cadrul investigaţiilor realizate la tema:compuşi biologici activi din sucul

boabelor, must şi vinurile obţinute din el au fost utilizate în calitate de materiale

bobiţe a varietăţilor:

Soiuri albe - Chardonnay, Chasselas, Riton, Legenda, Viorica, Alb de Ialoveni şi

soiuri roșii-Perveneţ Magaracia, Pinot noir, Cabernet-Sauvignon, Gamay, Merlot,

Regent (Diana x Chambourcin), Negru de Ialoveni,Rubin Tairova,Iubilei Magaracia.

48

Aceste materiale au fost colectate în diferite ţări viti-vinicole, printre care

Franţa, Elveţia şi Moldova.În studiul realizat au fost utilizate în calitate de marqeuri,

resveratrolii ; procesul sorbţiei resveratrolilor au fost analizate pe levuri selectate şi

pregătite special.

Vinurile din Bourgogne au fost furnizate de Biroul Interprofesional de Vinuri din

Bourgogne (BIVB), cît şi de producători de vinuri elaborată pe baza soiului Pinot noir.

Vinurile au fost filtrate mai apoi injectate(20 µl) direct în sistemul HPLC. în condiţii

de analiză deja descrise în literatura de specialitate( Jeandet P., Breuil A.C., Adrian M.,

et al., 1997).

În calitate de materiale au fost la fel utilizate şi vinuri de masă seci, naturale

(netratate-brute, tratate, condiţionate. îmbuteliate). Studiul conţinutului resveratrolilor

în vinurile obţinute din soiuri noi ( Gaina B.,2007) cu rezistenţă sporită la factorii

biotici şi abiotici a mediului ambiant a inclus varietăţile noi,din selecția intraspecifică

Riton, Legenda, Viorica,Perveneţ, Magaracia(albe),Negru de Ialoven, Rubin Tatarova

şi Iubilei Magaracia (roşii).

Studiul dinamicii resveratrolilor pe parcursul maturizării strugurilor a fost realizat cu

utilizarea bobiţelor şi sucului extras din ele pentru determinarea concentraţiei

resveratrolilor.

Utilajul tehnologic şi de laborator utilizat în cadrul investigaţii include:

a. materiale tehnologice - desciorchinător-zdrobitor, pompă cu melc, fermentator,

presă cu membrană, refrigerator, filtru cu membrane şi filtru cu plăci, etc.

b. materiale secundare oenologice - bentonită, gelatină, enzime pectolitice şi (3

glicozidazice, anhidrida sulfuroasă, filtru carton, plăci filtrante din acetat celuloză

pentru instalaţiile cu microfiltrare şi altele.

c. materiale de investigaţie - spectrofotometre, refractometre, pH-metru, oximetru,

chromatografe HPLC, microscop, etc.

II.2. METODE

II.2.1. Dozarea resveratrolului prin spectrofotometrie

Spectrofotometria este o metodă analitică cantitativă care constă în măsurarea

absorbanţei sau a densităţii optice a unei substanţe chimice date în soluţie. Cu cît

aceasta este mai concentrată cu atît ea absoarbe mai multă lumină în limitele de

proporţionalitate enunţate de legea lui Beer- Lambert.

Densitatea optică a soluţiilor este determinată de un spectrofotometru prealabil

49

etalonat la lungimea de undă de absorbţie a substanţei chimice ce trebuie studiată.

Pentru izoterma de adsorbţie, concentraţiile în resveratrol în soluţiile limpezite

obţinute în urma ultracentrifugării au fost măsurate prin spectroscopie UV la lungimea

de undă 305nm, folosind o cuvă din cuarţ de l cm şi referindu-ne la o dreaptă de

etalonare externă (y=0,1179x ; r 2=0,9996 ; n=6, figura II.1). Diluările necesare au fost

făcute astfel încît să satisfacă legea lui Beer -Lambert.

Figura II.1 : Gama de calibrare pentru analiza spectrofotometrică UV.

y=0,1179x ; r2 =0,9996 ; n=6, gama concentrațiilor resveratrolului de la 1 la 30 mg/kg.

II.2.2. Dozarea resveratrolului prin HPLC

Cromatografia lichidă de înaltă performanţă (HPLC) permite separarea, detectarea

şi cuantificarea a numeroşi compuşi organici ne volatili. Reuşita separării se bazează

pe alegerea corectă a fazei staţionare şi a fazei mobile(amestec de eluanţi) ţinînd cont

de compuşii prezenţi. în cazul nostru, analizele au fost realizate ut izilizînd coloana

C18, cu un gradient de eluare lineară(acetonitril/apă) şi un flux de l ml/min. Un volum

de 40 µl de soluţie au fost injectate pentru orice analiză. O dublă detectare a fost

realizată printr-un cuplaj UV/fluorimetrie (Adrian, 2000). Cuantificarea speciilor

50

detectate a fost realizată referindu-ne la o dreaptă de etalonare externă (y=76530x ;

r2=0,9979; n=9, gama de la 1 la 50mg/kg, fig. 2).

Figura II. 2 : Gama de calibrare pentru analiza prin HPLC.

y=76530x ; r2=0,9979; n=9, gama concentrațiilor resveratrolului de la 1 la 50 mg/kg.

II.2.3 Metodele fizico-chimică HPLC

Odată cu progresul remarcabil al tehnicilor HPLC, această metodă a fost pe larg utilizată la

analiza polifenolilor de diferită origine botanică, inclusiv a taninelor condensate din vin, struguri

şi seminţe de struguri. Punctul forte al acestei metode constă în posibilitatea de a separa compuşii

polifenolici cu polaritate avansată la tmperatură ambientală, fără a recurge la derivatizare sau la

încălzirea probei. În ultima decadă metodele HPLC au cunoscut o serie de inovaţii, care au

promovat efficient performanţa metodei. În primul rind e necesar de a menţiona introducerea

51

larga a detectoarelor cu grilă de diode pentru monitorizarea procesului de separare în domeniile

UV-Vis. Aceasta a dat posibilitate de a analiza eluatul de pe coloana HPLC pe toată banda

spectrală, făcînd astfel posibilă înregistrarea în regim continuu (“on fly”) a spectrelor UV-Vis ale

picurilor individuale sau chiar ale secţiunilor din picurile cromatografice. În aşa fel a devenit

posibil de a identifica componentele separate ale amestecurilor analizate în baza spectrelor UV-

Vis, precum şi de a estima puritatea compuşilor separaţi şi eficienţa separării.

Altă îmbunătăţire revoluţionară, care a avut un impact colosal asupra utilizării foart largi a

tehnicii HPLC a fost combinarea aparatului HPLC cu spectrometrul de masă. Aceasta a fost

posibil în urma apariţiei metodelor eficiente de ionizare, mai ales a metodei de ionizare prin

electro-spray, şi nu în ultimul rind de apariţia micro-coloanelor HPLC care au redus substanţial

debitul solvenţilor şi volumele picurilor cromatografice. În aşa fel metoda hibridă LC-MS a

devenit cea mai universală tehnică analitică pentru studiul unui şir larg de compuşi, începînd de

la compuşi cu masă moleculară mică pînă la biololimeri.

În baza acestor progrese, HPLC şi-a găsit aplicare în diferite domenii ale studiului

compuşilor naturali, inclusiv în studiul polifenolilor din struguri. Lucrările de pionierat cu

utilizarea metodei HPLC în oenologie aparţin lui Nagel şi Wulf, care printre primii au publicat o

serie de articole în acest domeniu.42-44 În timp ce aceste prime investigaţii au tins să evidenţieze

noutatea metodei, în particular rapiditatea analizei, oenologii au început în scurt timp să aplice

această tehnică în monitorizarea calităţii vinului, inclusiv în monitorizarea schimbărilor în

conţinutul de flavonoide în timpul fermentării şi maturării vinurilor roşii. (Nagel C.W., Wulf

L.W., 1979) Metoda HPLC a fost de asemenea aplicată în studiul conţinutului de procianidine în

vinuri şi băuturi slab alcoolizate, precum şi în studiul profilului de antocianidine în vinuri pe

durata anilor de maturare.( McCloskey L.P., Yengoyan L.S., 1981)

Un articol larg de analiză a utilizării HPLC în studiul flavonoidelor din produsele

alimentare a fost publicat la sfîrşitul anilor 90.( Merken HM, Beecher GR., 2000) Acest articol

cuprinde perioada pînă la 1999. În anii următori însă, au apărut mai multe publicaţii ce ţin de

utilizarea HPLC în studiul proantocianidinelor din struguri, mai ales publicaţii ce relatează

exploatarea noilor inovaţii din HPLC.

Pentru proantocianidinele din alimente, analiza HPLC e efectuată în cele mai dese cazuri în

varianta fazelor reversate (RP). Dozarea cantitativă este efectuată în baza detectoarelor UV, de

obicei la 280 nm. Însă detectarea UV nu este specifică pentru proantocianidine, în condiţia

prezenţei în matricea analitică a altor compuşi polifenolici. Deaceea uneori se recurge la

detectarea prin fluorescenţă (excitare la 276 nm şi emisie la 316 nm), ceea ce oferă sensitivitate

52

crescută şi selectivitate faţă de procianidine.( Lazarus SA, Adamson GE, Hammerstone JF, et al.

1999) Coloanele RP C18 au fost utilizate pentru a separa de la monomeri la trimeri în produse

alimentare din Spania,(de Pascual-Teresa S., Santos-Buelga C., Rivas-Gonzalo J.C., 2000) de la

monomeri la tetrameri în vin(Carando S., Teissedre PL., Rascual-Martinez L. et al. 1999; Fuleki

T., da Silva R.J.M., 1997) şi seminţe de struguri. (Fuleki T., da Silva R.J.M., 1997 ; Peng Z.,

Hayasaka Y., Iland P.G., et al. 2001) Oligomerii proantocianidinici se separă în dependenţă de

gradul lor de polimerizare (de la monomeri la tetrameri) ca compuşi individuali, însă ordinea de

eluare nu este în concordanţă cu masa moleculară. Analiza oligomerilor superiori tetramerilor nu

a dat rezoluţie satisfăcătoare a picurilor pe coloane cu fază reversată. Cu mărirea masei

moleculare se observă o suprapunere avansată a picurilor şi coeluare a oligomerilor izomerici

superiori.

Multe relatări despre utilizarea metodei HPLC în analiza TSS sunt dedicate investigaţiilor

activităţii lor biologice. Fitzpatrick şi colaboratorii au descris izolarea din seminţele de struguri şi

caracterizarea unor compuşi responsabili de relaxarea endotelium-dependentă a activităţii vaselor

sanguine. Seminţele de struguri de soiul Concord au fost extrase cu methanol şi compuşii

obţinuţi au fost analizaţi prin metoda HPLC analitică şi semipreparativă după o fracţionare

preliminară. A fost folosit un system cromatografic Waters, cuplat cu un detector Waters 481

UV-Vis, precoloană şi coloană cu fază reversată Radial Pak NovaPak C18. Eluarea a fost

efectuată în regim de gradient al componenţei eluantului, utilizînd doi solvenţi. Faza mobilă A a

fost apa, iar faza mobilă B a fost soluţia de 10% acid acetic în apă. Gradientul a evoluat de la

25%B pînă la 100% B în regim isocratic, timp de 55 min conform unui profil complex. Debitul

eluentului a fost de 1.0 ml/min, iar detectarea UV la 280 nm. Extractele integrale au arătat un

profil complex, cu puţine picuri separate şi identificate. Ecxepţie au făcut acidul galic,

epicatehina şi epicatehingalatul. Una din fracţiile obţinute după o fracţionare preliminară prin

gel-filtrare a fost separată satisfăcător, iar compuşii individuali au arătatactivitate biologică

elevat.

II.2.4 Metodă de obținere, din semințe de struguri, a unui extract sub formă de pulbere, cu

un conținut ridicat de proantocinidine

Un alt procedeu de extracție a proantocianidinelor din semințe de struguri pentru a putea

obține un extract sub formă de pulbere a fost realizat de către un grup de inventatori (Burghelea

Beatrice, Câmpeanu Romulus Ilie, 2007),care a prezentat modalitatea prin care strugurii se

tratează cu apă și/sau alcool etilic, la o temperatură de până la 120°C și o presiune de 1 atm, timp

53

de 45...60 min, după care extractul polifenolic în soluție de alcool etilic, bogat în

proantocianidine se concentrează, se centrifughează și se filtrează, obținîndu-se un extract care,

ulterior, se purifică și se îmbogățește prin trecerea pe o coloană cromatografică având faza

inversă. Acest produs obținut poate fi utilizat ca ingredient cu proprietăți antioxidante în

industria alimentară, cosmetică și farmaceutică sau ca supliment alimentar. Dacă primele invenții

aveau la bază metode de extracșie cu solvenți organici cum sunt metanolul și/sau acetona sau

acetatul de etil (brevet OSIM 99206/1990, cerere de brevet US 5484594/1996-01-16, cerere de

brevet US 5773262/1998-06-30, cerere de brevet US 5912363/1999-06-15, brevet

6544581/2003-04-08), în ultimul timp datorită reglementărilor impuse în industria alimentară,

farmaceutică și cosmetică a fost necesar să se găsească soluții pentru înlocuirea lor cu metode

alternative, ecologice, de extracție, purificare și concentrare.

Procedeul de obținere din semințe de struguri a unui extract sub formă de pulbere cu un

conținut bogat în polifenoli, cuprinde:

Obținerea unui extract lichid brut prin extracția componentelor polifenolice din semințe de

struguri cu apă sau cu o soluție de 5-50 % alcool etilic în apă, la temperatură de

max.120°C și o presiune de 1 atm, timp de 45-60 mn, raportul în volume între semințe și

faza lichidafiind cuprns între 1:2 și 1:3;

Obținerea unui extract lichid total prin concentrarea, centrifugurea și filtrarea extractului

lichid brut ;

Opțional, obținerea unui extract lichid total îmbogățit în proantocianidine monomerice prin

trecerea extractului lichid total pe o coloană cromatografică de silice cu lanțuri alchilice

C8 și eluare cu o soluție de alcool etilic 50-96%;

Obținerea unei pulberi prin liofilizarea extractului lichid total sau a extractului lichid

îmbogățit.

Concluzie

Rezultatele investigaţiilor din ultimii ani ne permit să constatăm existenţa efectelor

benefice ale polifenolilor din semințe de struguri. Capacitatea acestei categorii de polifenoli de a

consuma radicalii liberi de oxigen din mediu în care aceștia se află este superioară altor

antioxianți bine cunoscutți, cum ar fi vitamna C, E, betacaroten. Substanțele polifenolice sunt de

10-20 de ori mai puternice decît vitamina E în protecţia anti-oxidativă a LDL-colesterolului.

54

Fiind consumatori de radicali liberi ai oxigenului, cum sunt superoxizii – anionul superoxid,

oxigenul singlet și radicalii hidrozxil, aceștia inhibă agregarea trombocitelor, intervin în reacțiile

de sinteză și eliberae a multor substanțe care provoacă inflamații, inhibă enzimele care pot

vătăma integritatea și elasticitatea capilarelor, a pelii și a altor țesuturi. Conferă protecţie

materialului genetic (ADN), ferindu-l de mutaţii. Protejează ficatul, inima şi sistemul nervos de

agresiunea radicalilor liberi.

Însă cea mai mare atenție se atrage la substanțele polifenolice : resveratrolii și

proantocianidinele, care au un puternic efect antioxidant.

Studiile realizate asupra proantocianidinelor din struguri au demonstrat că aceştia oferă

protecţie împotriva bolii Parkinson şi a afecţiunilor oculare. Polifenolii cresc rezistenţa arterelor

şi venelor, îmbunătăţesc microcirculaţia, fluidifică sângele şi protejează fibrele de colagen,

menţinând sănătatea vaselor de sânge, au efect tonic general, sunt recomandate în stări de

astenie, oboseală, pentru efectul lor revigorant, contribuie la revitalizarea organismului dupa

eforturi fizice si intelectuale.

În ceea ce privește rolul resveratrolului în oganismul uman, se poate spune că datorită

proprietăților sale de a capta radicalii liberi din organism, poate fi considerat „medicamentul

secolului XXI”, prin faptul că diminuează riscul bolilor cardiovasculare cu 30%-50%, posedă

puternice efecte  anti-inflamatorii și antibactericide : menține fermitatea pielii, elasticitatea,

împiedică îmbătrînirea prematură, îmbunătățind capacitatea memoriei, reface structura genelor

afectate, luptă împotriva disfuncțiilor celulelor neuronale și împotriva morții celulare și este

eficient împotriva maladiilor Huntington și Alzheimer.

Datorită acestor multiple proprietăți, acești compuși au provocat interesul multor

cercetători științifici de a studia structura și fiziologia lor, comportamentul acestora asupra

organismului uman, care prezintă anumite patologii, și fiind urmărind în acest mod evoluția

tratării acestor abateri ai funcționării normale a activității organismului uman administrat în

diferite doze. Aceste cercetări au avut succes și în acest mod, astăzi s-au găsit metode eficiente

de extragere a lor pentru a putea valorifica potențialul lor atit nutritiv cît și terapeutic.

Bibliografie

1. Adrian M., Jeandet P., Veneau J., Weston LA, Bessis R., Biological activity of resveratrol, a

stilbenic compound from grapevines, against Botrytis cinerea, the causal agent for gray

mold. J Chem Ecol 23: 1689-1702.

55

2. Arpenti G.N. Основы технологии столовых вин с повышеннй пищевой ценностью и их

медико-биологическая оценка. 1994. P. 124-136

3. Bejan V., Elaborarea procedeelor tehnologice de obţinere a vinurilor de calitate în plaiul

„Pleşna -Mîndreşti” din Codrii Moldovei, Autoref. Tezei doctor în tehnică, 2007, Chişinău,

INVV, pag. 10-13.

4. Belcaro G., Burki C., Ferrari V. Combination of proanthocyanidins and Centellaasiatica for

the treatment atherosclerosis. Horphang Research IP (PYC) LTD., Limasol (CY). 2012Pub.

No.: US 2012/0164244 A1

5. Blanche D., Rustan I., Durand P., Lesgards G., Loreau N. GasChromatography analysis of

resveratrol in plasma, lipoproteins and cells after in vitro incubation, J.Chromat. 1997; 702;

pag.103-110.

6. Bourzeix M., Le vin-aliment. Station d'Oenologie et Technologie Vegetale, Narbonne, 1995,

pag.17

7. Brenna O., Pagliarini E., Multivariate analysis of antioxidant power and polyphenolic

composition in red wines-J. Agr. And Food Chem. 2001. 49. Nr. 10. pag 484.

8. Burghelea B., Câmpeanu R.I.,Kontek A.C., Porumb R., Procedeu de obținere, din semințe de

struguri, a unui extract sub formă de pulbere, cu uncontinutridicat de proantocianidine.

16.07.2007

9. Carando S, Teissedre PL, Rascual-Martinez L, Cabanis JC. Levels of flavan-3-ols in French

wine. J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 4161–4166.

10. Carpov S., Tehnologia generală a Industriei Alimentare,Chișinău-București: Ed. Ştiinţa,

1997. pag. 300.

11. Cotea V.D., Tratat de oenologie, București, 1995, 1998, vol.1,2, pag.628.

12. Darne, G.; Madero, T.J. Mise au point d’une methode d’extraction des lipides solubles

totaux, des glusides solubles totaux et des composes phenoliques solubles totaux des organes

de la vigne. Vitis. 1979, 18(3), 221-228.

13. Duca G., Gaina B., Covaleov O., Экологичеески чистое виноделъческое производство,

Ed.Știința, Chișinău, 2004, pag.13-72

14. Felix G., Regenass M., Boller T.,Specific perception of subnanomolar concentrations of

chitin fragments by tomato cells: induction of extracellular alkalinization, changes in protein

phosphorylation, and establishment of a refractory state, 1997, Plant J 4, pag. 307–316.

15. Fitzpatrick, D.F.; Fleming, R.C.; Bing, B.; Maggi, D.A.; O’Malley, R.M. Isolation and

Characterization of Endothelium-Dependent Vasorelaxing Compounds from Grape Seeds. J.

Agric. Food Chem.2000, 48, 6384-6390.

56

16. Franklin-Tong VE., Goutay C.W ., A role for actin in regulating apoptosis/programmed cell

death: evidence spanning yeast, plants and animals, 2008, Biochem J 413: 389–404.

17. deFreitas, V., Glories, Y.; Laquerre, M. Incidence of Mollecular Structure in Oxidation of

Grape Seeds Procyanidins. J. Agric. Food Chem.1998, 46, 376-382.

18. deFreitas, V.; Glories, Y.; Bourgeois, G.; Vitry, C. Characterisation of oligomeric and

polymeric procyanidins from grape seeds by liquid secondary ion mass spectrometry.

Phytochemistry, 1998, 49, 1435.

19. Fuleki T, da Silva R.J.M. Catechin and procyanidin composition of seeds from grape

cultivars grown in Ontario. J. Agric. Food Chem. 1997, 45, 1156–1160.

20. Gabetta, B.; Fuzzati, N.; Griffini, A.; Lolla, E.; Pace, R.; Ruffilli, T.; Peterlongo, F.

Characterization of proanthocyanidins from grape seeds. Fitoterapia.2000, 71, 162-175.

21. Gaina B., Via,Vinul și Civilizația.Chișinău : Ed.Litera-Poliproject,2000, pag. 68.

22. Gaina B., Produse ecologice vitivinicole, Ed Litera,Chișinău, 2002, pag.136

23. Gaina B., Savin Gh., Bejan V.et al., Uvologie și Oenologie. Tip AȘM.Chișinău,2005,

pag.15-202

24. Gaina B., Roman O., Bourzeix M., Gougeon R., Date recente privind resveratrolii în must și

vinuri, Viticultura și Vinificația în Moldova , Chișinău, 2007

25. Geny, L.; Saucier, C.; Bracco, S.; Daviaud, F.; Glories, I. Composition and cellular

localization of tannins in grape seeds during maturation. J. Agric. Food Chem. 2003, 51,

8051-8054.

26. Goldberg D.M., Yan J., Diamandis E.P., Karumchiri A., Soleas G., Waterhouse A.L., The

trans-resveratrol concentration of wine; a global survey. Am. J. Enol. Vitic. 1994; 66; pag.

3959-3963.

27. Gonzalez-Manzano, S.; Santos-Buelga, C.; Perez-Alonso, J.J.; Rivas-Gonzalo, J.C.;

Escribano-Bailon, M.T. Characterization of the Mean Degree of Polymerization of

Proanthocyanidins in Red Wines Using Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-

MS). J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 4326-4332.

28. Hayasaka, Y.; Waters, E.J. Cheynier, V.; Herderich, M.J.; Vidal, S. Characterization of

Proanthocyanidins in Grape Seeds Using Electrospray Mass Spectrometry. Rapid Commun.

Mass Spectrom. 2003, 17, 9-16.

29. Jang M., Cai L., Udeani G.O., Slowing K.V., Thomas C.F., Beecher C.W.W., Fong H.H.S.,

Farnsworth N.R., Kinghorn A.D., Mehta R.G., Moon R.C., Pezzuto J.M., 1997, Science,

volumul 10:218-221.

57

30. Jeandet P., Bessis R., Gautheron B. The production of resveratrol (3,5,4ɑ-tihydroxystilbene)

by grape berries in different developmental stages, 1991, J.Agric.Food Chem., pag. 43, 316-

319

31. Jeandet P., Bessis R., Maume B.F., Meunier P., Peyron D., Trolla T P., Effect of enological

practices on the resveratrol isomer content of wine, 1995, J. Agric. Food Chem, 43, pag.316-

319.

32. Jeandet P., Bessis R., Sbaghi M., Meunier P., Trolla T.P., Resveratrol content of wines of

different ages : relationship with fungal disease pressure in the vineyard, 1995b, Am. J. Enol.

Vitic, 46, pag.1-4.

33. Jeandet P., Breuil A.C., Adrian M., Weston L.A., Debord S., Meunier P., Maume G., Bessis

R., HPLC analysis of grapewine phytoalexins coupling photodiode aray detection and

fluorimetry, 1997, Anal. Chem., 69, 24, 5172-5177.

34. Jorgensen, E.M.; Marin, A.B.; Kennedy, J. A. Analysis of the Oxidative Degradation of

Proanthocyanidins under Basic Conditions. J. Agric. Food Chem.2004, 52, 2292-2296.

35. Kaeberlein M., McDonagh T., Heltweg B., Hixon J., Westman E.A., Caldwell S., Napper A.,

Curtis R., DiStefano P.S., Fields S., Bedalov A., Kennedy B.K., (April 2005). "Substrate-

specific activation of sirtuins by resveratrol". Journal of Biological Chemistry 208 (17):

Retrieved November 14, 2012, pag. 17038–7045.

36. Kovac, V.; Bourzeix, M.; Heredia, N.; Ramos, T. Etude des catechines et proanthocyanidols

de raisin et vins blancs. Revue France d’Oenologie. 1990, 125, 7-14.

37. Kovac, V.; Alonso, E.; Revilla, E. The effect of adding supplementary quantities of seeds

during fermentation on the phenolic composition of wines. Am. J. Enol. Vitic. 1995, 46, 363-

367.

38. Kuliev, R.Z.; Akhmedov, U.; Khalmatov, Kh.Kh.; Kuliev, Z.A. Dimeric Proanthocyanidins

from Rhodiola semenovii. Chem. Nat. Comp.2004, 40 (1), 94-95.

39. Labarbe, V.; Cheinier, V.; Brossaud, F.; Souquet, J.M.; Moutounel, M. Quantitative

fractionation of grape proanthocyanidins according to their degree of polymerization. J.

Agric. Food Chem. 1999, 47, 2719-2723.

40. Lamb C., Dixon RA., The Oxidative Burst in Plant Disease Resistance, 1997, An. Rev Plant

Physiol Plant Mol Biol 48, pag. 251–275. 

41. Lamuela-Raventos R.M., Waterhouse A.L., Occurence of resveratrol in selected California

wines by a new HPLC method, 1993, J. Agric. Food Chem., 41. pag.521-523.

42. Lamuela-Raventos R.M., Romero-Perez A.I., Direct HPLC analysis in selected California

wines by a new HPLC method, 1995, J. Agric. Food Chem., 43, 2, pag.281-283.

58

43. Langcane P., Pryce R.J., : Thе produсtion оf rеsvеratrol by Vitis vinifеra and anоthеr

mеmbеrs of thе Vitaсеaе as rеsponsr to infесtiоn injury. Рhysiol. Plant Рathol. 1976:9;77-86.

44. Lea, A.G.H. High performance liquid chromatography of cider procyanidins. J. Sci. Food

Agric.1979, 30, 833-838.

45. Lea, A.G.H.; Bridle, P.; Timberlake, C.F.; Singleton, V. The procyanidin of white grapes and

wines. Am. J. Enol. Vitic. 1979, 30, 289-300.

46. Lea, A.G.H. Reversed-phase gradient high-performance liquid chromatography of

procyanidins and their oxidation products in ciders and wines, optimized by Snyder’s

procedures. J. Chromatogr.1980, 194, 62-68.

47. Lazarus SA, Adamson GE, Hammerstone JF, Schmitz HH. High-performance liquid

chromatography/mass spectrometry analysis of proanthocyanidins in foods and beverages. J.

Agric. Food Chem. 1999, 47, 3693–3701.

48. Mattivi F., Solid phase extraction of trans resveratrol from wines for HPLC analysis. 1993,

Z. Lebensm Unters Forsch. 196, pag. 522-525.

49. McCloskey, L.P.; Yengoyan, L.S. Analysis of anthocyanins in Vitisvinifera wines and red

colour versus aging by HPLC and spectrophotometry. Am. J. Enol. Vitic. 1981, 32,257-261.

50. Merken HM, Beecher GR. Measurement of food flavonoids by high-performance liquid

chromatography: A review. J. Agric. Food Chem.2000, 48, 577–599.

51. Michaud, J.; Lacaze, P.; Masquelier, J. Fractionement des oligomersflavanolique du raisin.

Bull. Soc. Pharm. Bordeau. 1971, 110, 111-116.

52. Monagas, M.; Gomez-Cordovez, C.; Bartolomea, B.; Laureano, O.; Ricardo da Silva, J.M.

Monomeric, Oligomeric, and Polymeric Flavan-3-ol Composition of Wines and Grapes from

Vitisvinifera L. Cv. Graciano, Tempranillo, and Cabernet Sauvignon. J. Agric. Food

Chem.2003, 51, 6475-6481.

53. Murray M, Pizzorno J. Procyanidolic oligomers. In: Murray M, Pizzorno J, eds. The

Textbook of Natural Medicine. 2nd ed. London: Churchill Livingston; 1999, 899-902.

54. Nagel, C.W.; Wulf, L.W. Changes in anthocyanins, flavonoids and hydroxycinnamic acid

esters during fermentation and aging of Merlot and Cabernet Sauvignon. Am. J. Enol. Vitic.

1979, 30, 111-116.

55. Nick P., Probing the actin-auxin oscillator, 2010, Plant Signaling Behav 5: 4–9. 

56. Nonaka, G.J.; Miwa, N.; Nishioka, I.; Stilbene glycoside gallates and proanthocyanidins

from Polygonummultiflorum. Phytochemistry. 1992, 21(2), 429-432.

57. Oszmianski, J.; Sapis, J.C. Fractionation and Identification of Some Low Molecular Weight

Grape Seed Phenolics. J. Agric. Food Chem.1989, 37, 1293-1297.

59

58. Pace-Asciak R., Hahn S., Diamandis E.P., Soleas G., Goldberg D.M., The red wine phenolics

trans-resveratrol and quercetin block human platelet aggregation and eicosanoid synthesis:

implications for protection against coronary heart disease. Clin. Chim. Acta.1995, 235,

pag.207–219.

59. de Pascual-Teresa S, Santos-Buelga C, Rivas-Gonzalo JC. Quantitative analysis of flavan-3-

ols in Spanish foodstuffs and beverages. J. Agric. Food Chem. 2000, 48, 5331–5337.

60. Pasinetti G.M., Ho L., Wang J. Methods for preventing and treating neurodegenerative

diseases. Pub.No.: US 2011/0111072 A1.

61. Pekic, B.; Kovac, V.; Alonso, E.; Revilla, E. Study of the Extraction of proanthocyanidins

from grape seeds. Food Chem.1998, 61(1-2), 201-206.

62. Peng Z, Hayasaka Y, Iland PG, Sefton M, Hoj P, Waters EJ. Quantitative analysis of

polymeric procyanidins (tannins) from grape (Vitisvinifera) seeds by reverse phase high-

performance liquid chromatography. J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 26–31.

63. Pezet R., Pont V., Cuenat P., Method to determine resveratrol and pterostilbene in grape

berries and wines using HPLC and highly sensistive fluorimetric detection. J. Chromatogr.,

A, 663, 1994, pag.191-197.

64. Peyrot des Gachons, C.; Kennedy, J. A. Direct method for determining seed and

skeenproanthocyanidins extraction into red wine. J. Agric. Food Chem.2003, 51, 5877-5881.

65. Pinelo, M.; Laurie, V.F.; Waterhouse, A.L. A Simple Method To Separate Red Wine

Nonpolymeric and Polymeric Phenols by Solid-Phase Extraction. J. Agric. Food Chem.2006,

54, 2839-2844.

66. Pomohaci N., Cotea V.D., Stoian V., Nămoloșanu I., Popa A., Sîrghi C., Antoce A.,

Oenologie.București : Ed.Ceres, 2000, Vol.1, pag. 367.

67. Qiao F, Chang XL, Nick P., The cytoskeleton enhances gene expression in the response to

the Harpin elicitor in grapevine, 2010, J Exp Bot 61, pag.4021–4031. 

68. Ribéreau-Gayon P., Dubourdieu D., Danéche B., et autres, Traite d’œnologie 1.

Microbiologie du vin. Vinification, Edition Dunod, Paris, 1998.

69. Rolinski, O. J., Martin, A., Birch, D. J. Ann. NY Acad. Sci. 2008, 1130, pag.314-319.

70. Romeyer, F.M.; Macheix, J.; Sapis, J. Changes and importance of oligomericprocyanidins

during maturation of grape seeds. Phytochemistry.1986, 25, 219-221.

71. Roy H., Lundy S., Resveratrol. Pennington Nutrition Series,2005 No.7

72. Santos-Buelga, C.; Francia-Aricha, E.M.; Escribano-Bailon, M.T. Comparative flavan-3-ol

composition of seeds from different grape varieties. Food Chem. 1995, 53, 197-201

60

73. Santos-Buelga, C.; Scalbert, A. Proanthocyanidins and Tannin-like Compounds – Nature,

Occurrence, Dietary Intake and Effect on Nutrition and Health. J. Sci. Food Agric.2000, 80,

1094-1117.

74. Scutaru I., „Paradoxul francez şi vinurile din Moldova”, Universitatea Tehnică din Moldova,

1995, pag.7

75. Siemann E.H., Creasy L.L., Concentration of the phytoalexin resveratrol in wine. 1992. Am.

J. Enol. Vitic., 43, pag. 49-52.

76. da Silva, R.J.M.; Bourzeix, M.; Cheynier, V.; Moutounet, M. Procyanidin composition of

Chardonnay, Mauzac and Grenache blanc grapes. Vitis. 1991, 30, 245-252.

77. da Silva J, Rigaud J, Cheynier V, et al. Procyanidin dimers and trimers from grape seeds.

Phytochemistry. 1991, 30, 1259-1264.

78. da Silva, R.J.M.; Rosec, J.P.; Bourzeix, M.; Mourgues, J.; Moutounet, M. Dimer and

trimerprocyanidins in Carigan and Mourvedre grapes and red wines. Vitis. 1992, 31, 55-63.

79. Sîrghi.C., Zironi R., Aspecte innovative ale enologiei moderne. Editura ’’Sigma’’, Chişinău,

1994.

80. Sun, B.S.; Leandro, C.; da Silva J.M.R.; Spranger, I. Separation of Grape and Wine

Proanthocyanidins According to their Degree of Polymerization. J. Agric. Food Chem. 1998,

46, 1390-1396.

81. Teissedre, P.L.; Waterhouse, A.L.; Frankel, E.N. Principal Phenolic Phytochemical in French

Syrah and Grenache Rhone Wines and Their Antioxidant Activity in Inhibiting Oxydation of

Human Low Density Lypoproteins. J. Inter. Sci. de la Vigne et du Vin.1995, 29(4), 205-212.

82. Țîrdea C., Sîrbu Gh., Țîrdea A.,Tratat de vinificație. Iași : Ed."Ion Ionescu de la Brad",2000.

83. Uchida, S.; Edamatsu, R.; Hiramatsu, R.; Mori, A.; Nonaka, G.I.; Nishioka, I.; Ozaki, M.

Condensed tannins scavenge active oxygen free radicals. Med. Sci. Res.1987, 15, 831-832.

84. Vidal, S.; Cartalade, D.; Souquet, J.M.; Fulgrand, H.; Cheinier, V. Changes in

Proanthocyanidin Chain Length in Winelike Model Solutions. J. Agric. Food Chem.2002, 50,

2261-2266.

85. Vita J.A., Polyphenols and cardiovascular disease: effects on endothelial and platelet

function, 2005, Am J.Clin nutr.81 (1 suppl): 292S-297S.

86. Xiao J., Suzuki M., Jiang X., Chen X., Yamamoto K., Ren F., Xu M., J. Agric. Food. Chem.

2008, 56, pag.2350-2356.

87. Агеева Н. М. Гугучкина, Гонтарева Е.Н., Влияние микотоксинов на преврашение

летучих компонентов и органических кислот виноградных вин. Виноделие и

виноградарство, 2006, N3, стр. 22-24.

61

88. Положишникова М ., Перелыгин О., Н. Определение биологической ценности и

идентификация красных виноградных вин по содержанию флавонолов и

фенилкарбоновых кислот, Журнал : " Виноделие и Виноградарство", Москва,2005, №

6, стр.22-24.

89. http://www/quackwatch.org/01 QuackeryRelatedTopics/DSH/resveratrol.html

62