CITOLOGIE Lucrarea  prac)că  2  –  Preparatul  microscopic  permanent  

Exclusiv  pentru  uz  didac2c  

         Cerințe  necesare  pentru  o  examinare  precisă:  -­‐   Celulele  și  celelalte  elemente  prezente  în  țesut  să  fie  păstrate  în  condiții  cât  mai  apropiate  de  condițiile  lor  naturale  (FIXARE)  

-­‐   Preparatul  să  fie  transparent,  subțire,  plat  

-­‐   Diferitele  componente  să  fie  colorate  diferit  (COLORARE)  

Pregă/rea  preparatului  pentru  microscopie  op/că  

Exclusiv  pentru  uz  didac2c  

℗2013  Dr.  M.I.  Nicolescu,  Disciplina de citologie și histologie, UMF „Carol Davila” București

Posibilități de preparare -  secțiuni -  „in toto” (structuri/organisme mici, suficient de subțiri pt. a fi întinse pe o lamă) -  zdrobire (pt. studiul conținutului celulei) -  frotiuri (celule suspendate în fluid) -  culturi celulare

Pregă/rea  preparatului  pentru  microscopie  op/că  

Exclusiv  pentru  uz  didac2c  

℗2013  Dr.  M.I.  Nicolescu,  Disciplina de citologie și histologie, UMF „Carol Davila” București

Preparatul microscopic permanent

•  Modalitatea de examinare a unor celule, fragmente de ţesut sau organ, cărora li s-au suprimat procesele vitale prin fixare

•  Permite examinarea la microscopul optic a principalelor caracteristici ale celulelor şi a modului lor de organizare

Exclusiv  pentru  uz  didac2c  

℗2013  Dr.  M.I.  Nicolescu,  Disciplina de citologie și histologie, UMF „Carol Davila” București

Preparatul microscopic permanent Un preparat microscopic este alcătuit din:

1.  obiect de examinat (subţire şi transparent)

2.  mediu de montare (transparent)

3.  suport de montare (lamă şi lamelă)

hGp://www.agtcbioproducts.com/images/slide.jpg  

Exclusiv  pentru  uz  didac2c  

℗2013  Dr.  M.I.  Nicolescu,  Disciplina de citologie și histologie, UMF „Carol Davila” București

Preparatul microscopic permanent

Scopul realizării – de a conserva - structurile celulare şi - raporturile dintre ele pe un timp nelimitat.

Este folosit în: - clinică - laboratorul de anatomie patologică - medicină legală - cercetare - scop didactic

Exclusiv  pentru  uz  didac2c  

℗2013  Dr.  M.I.  Nicolescu,  Disciplina de citologie și histologie, UMF „Carol Davila” București

Etapele obţinerii preparatului microscopic permanent

1. Recoltare 2. Fixare 3. Deshidratare și clarificare 3. Impregnare și includere 4. Secţionare 5. Colorare 6. Montare (între lamă şi lamelă) 7. Etichetare

Exclusiv  pentru  uz  didac2c  

℗2013  Dr.  M.I.  Nicolescu,  Disciplina de citologie și histologie, UMF „Carol Davila” București

1. RECOLTAREA

= Operaţia prin care fragmentul de ţesut/organ este prelevat de la om, animal viu sau de la cadavru

RECOLTAREA BIOPSICĂ •  Se recoltează de la om sau animal viu şi se practică în scop diagnostic.

•  Se realizează prin : 1.  raclare 2.  puncţie-biopsie 3.  aspiraţie cu ac fin 4.  intervenţie chirurgicală

1.  dimensiunea pieselor să nu depăşească 5 mm

2.  instrumentele bine ascuţite

pentru a evita zdrenţuirea şi pierderea paralelismului dintre planuri

3.  adecvată în funcţie de tipul

organului; se vor evita modificările de volum, formă şi relief

Exclusiv  pentru  uz  didac2c  

℗2013  Dr.  M.I.  Nicolescu,  Disciplina de citologie și histologie, UMF „Carol Davila” București

RECOLTAREA NECROPSICĂ

•  recoltarea de la cadavrele umane se practică în laboratoarele de anatomie patologică şi medicină legală cu scopul de a confrunta datele de anatomie clinică şi tanatogenetice •  după sacrificarea animalului, în scop de cercetare sau didactic

1. RECOLTAREA

(cât mai aproape de momentul decesului) pentru a evita procesele de autoliză

Exclusiv  pentru  uz  didac2c  

℗2013  Dr.  M.I.  Nicolescu,  Disciplina de citologie și histologie, UMF „Carol Davila” București

Recoltarea biopsică A.  raclare B. puncţie – biopsie C. aspiraţie cu ac fin D. intervenţie

chirurgicală -  biopsie incizională -  biopsie excizională

hGp://img.webmd.com/dtmcms/live/webmd/consumer_assets/site_images/ar)cles/health_tools/eczema_overview_slideshow/photolibrary_rm_photo_of_hand_with_eczema.jpg  hGp://www.beliefnet.com/healthandhealing/images/si55551723.jpg  

hGp://www.glowm.com/resources/glowm/graphics/figures/v1/0270/016f.jpg    

A  

C  

D  

B  

Exclusiv  pentru  uz  didac2c  

℗2013  Dr.  M.I.  Nicolescu,  Disciplina de citologie și histologie, UMF „Carol Davila” București

•  etapă critică pentru un bun preparat •  proces fizic sau chimic prin care:

-  sunt oprite rapid procesele vitale (celulare), -  păstrându-se, cu alterări minime:

-  volumul, -  forma, -  relieful şi -  raporturile moleculare (în structuri/ultrastructuri) şi spaţiale (între structuri/

ultrastructuri)

Prin fixare urmărim: 1. Conservarea ţesuturilor 2. Prevenirea pierderii de constituenţi celulari 3. Creşterea diferenţierii optice a structurilor celulare 4. Mărirea consistenţei ţesuturilor în scopul de a facilita

trecerea lor prin celelalte etape şi mai ales pentru secţionare

2. FIXAREA

hGp://www.leicabiosystems.com/typo3temp/pics/Sci_Lab_Histo_Lead0004_d0f91f3944.jpg  

Exclusiv  pentru  uz  didac2c  

℗2013  Dr.  M.I.  Nicolescu,  Disciplina de citologie și histologie, UMF „Carol Davila” București

•  Serie  de  soluții  alcoolice  de  concentrații  crescânde  (până  la  100%)  pentru  îndepărtarea  apei  și  înlocuirea  ei  cu  alcool  

•  Îndepărtarea  alcoolului  cu  ajutorul  unor  agenți  în  care  și  alcoolul  și  parafina  sunt  miscibli  (ex:  toluen)  

3. DESHIDRATAREA și CLARIFICAREA Exclusiv  pentru  uz  didac2c  

℗2013  Dr.  M.I.  Nicolescu,  Disciplina de citologie și histologie, UMF „Carol Davila” București

©McGraw-­‐Hill  Companies  /  Junqueira  Histology  

-­‐  etapa  care  asigură  condiţii  op)me  pentru  secţionarea  pieselor      

•  Cea  mai  folosită  masă  de  incluziune:  parafina  

4. INCLUDEREA

hGp://www.leicabiosystems.com/typo3temp/pics/Embedding_028_sized_31fe12192c.jpg  hGp://www.leicabiosystems.com/typo3temp/pics/Sci_Lab_Histo_Lead0008_03_a9cda89157.jpg  

Exclusiv  pentru  uz  didac2c  

℗2013  Dr.  M.I.  Nicolescu,  Disciplina de citologie și histologie, UMF „Carol Davila” București

•  cu  microtomul  (  vor  rezulta  secțiuni  cu  o  grosime  de  aprox.  5μm)  

5. SECȚIONAREA Exclusiv  pentru  uz  didac2c  

℗2013  Dr.  M.I.  Nicolescu,  Disciplina de citologie și histologie, UMF „Carol Davila” București

©McGraw-­‐Hill  Companies  /  Junqueira  Histology  

-­‐  etapa  prin  care  se  urmărește  creşterea  contrastului  dintre  elementele  celulare/)sulare,  prin  capacitatea  substraturilor  morfologice  (care  conțin  proteine,  acizi  nucleici  sau  alte  macromolecule)  de  a  lega  diferit  coloranții  

•  Prin  metode  compa)bile  cu  metoda  de  fixare    •  Pot  fi  metode  universale  (HE)  sau  specifice  ţesutului  studiat  

(Nissl)  

6. COLORAREA Exclusiv  pentru  uz  didac2c  

℗2013  Dr.  M.I.  Nicolescu,  Disciplina de citologie și histologie, UMF „Carol Davila” București

-­‐  permite  conservarea  specimenelor  pentru  cât  mai  mult  )mp  

•  între lamă şi lamelă, în diferite medii de montare, iniţial fluide

•  Protejarea secţiunilor fragile de eventualele deteriorări •  Conservarea coloraţiei şi asigurarea unui mediu optic

omogen şi transparent necesar examinării microscopice

7. MONTAREA Exclusiv  pentru  uz  didac2c  

℗2013  Dr.  M.I.  Nicolescu,  Disciplina de citologie și histologie, UMF „Carol Davila” București

8. ETICHETAREA

Pe fiecare lamă se notează:

–  tipul celular/tisular –  sursa de recoltare –  fixatorul –  metoda de colorare –  data realizării preparatului

Exclusiv  pentru  uz  didac2c  

℗2013  Dr.  M.I.  Nicolescu,  Disciplina de citologie și histologie, UMF „Carol Davila” București

PAUZĂ

COLORANTUL HISTOLOGIC •  Substanţă colorată, de obicei de natură organică, ce

poate intra în celulă ataşându-se la nivelul componentelor celulare şi permiţând astfel diferenţierea lor optică.

Nu toate substanţele colorate sunt coloranţi! Coloranții prezintă, d.p.d.v. chimic: -  Grupări cromofore (purtătoare de culoare) -  Grupări auxocrome (cu capacitatea de a colora)

-  Ionizate (principale) – formează leg. electrochimice cu substratul -  Neionizate (secundare) – formează leg. de hidrogen cu substratul

Exclusiv  pentru  uz  didac2c  

℗2013  Dr.  M.I.  Nicolescu,  Disciplina de citologie și histologie, UMF „Carol Davila” București

Clasificare:  -­‐  după  proveniență:  naturali  (vegetali/animali)  sau  sinte)ci  -­‐  după  caracterul  chimic:    -­‐  acizi:  gr.auxocr.  sarcină  -­‐  …  se  atașează  pe  substrat  (+)  

     -­‐  bazici:  gr.auxocr.  sarcină  +  …  se  atașează  pe  substrat  (-­‐)        -­‐  neutri  (amestecuri  de  col.  acizi  și  bazici)  

METODE DE COLORARE Exclusiv  pentru  uz  didac2c  

℗2013  Dr.  M.I.  Nicolescu,  Disciplina de citologie și histologie, UMF „Carol Davila” București

Criterii de clasificare: 1.  Momentul colorării 2.  Nr. de coloranţi utilizaţi 3.  Mecanismul colorării 4.  Metoda de obţinere a

coloraţiei optime 5.  Raportul dintre

rezultatul colorării şi culoarea colorantului

(vitale / permanente)

(simple / combinate)

(directe / indirecte – cu intermediar)

(progresive / regresive – cu decolorant)

(ortocromatică / metacromatică)

METACROMAZIA Capacitatea unui substrat de a se colora într-o altă culoare decât cea a

colorantului. PRINCIPIU: -  existenţa unor grupări funcţionale aflate la o distanţă foarte mică una de

alta. -  colorantul se dispune ordonat şi foarte aproape moleculă de moleculă

permiţând reaşezări ale electronilor la alte nivele energetice şi absorbţia de alte lungimi de undă din spectrul vizibil

Exclusiv  pentru  uz  didac2c  

℗2013  Dr.  M.I.  Nicolescu,  Disciplina de citologie și histologie, UMF „Carol Davila” București

Mastocite  Ob.  100x  cu  imersie  Col.:  Albastru  de  toluidină    -­‐-­‐  »  granulații  roșu  -­‐  violet  

COLORAȚII UZUALE Exclusiv  pentru  uz  didac2c  

℗2013  Dr.  M.I.  Nicolescu,  Disciplina de citologie și histologie, UMF „Carol Davila” București

•  Hematoxilină-­‐eozină  (HE)  •  Giemsa  •  Mallory  •  Colorații  tricrome:  Masson,  Azan,  Van  Gieson  •  Impregnarea  argen)că  •  Metode  speciale  (Cajal  /Da  Fano,  Hematoxilină  ferică  Regaud)  •  Sudan  (III,  IV,  B,  BB)  

1.   Compoziție  

2.   Rezultate  (text  +  imagini  +  sursă)  

3.   Par/cularități