ING. CHAKIROU OLIVIER

(REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT)

CARACTERIZAREA LA NIVEL

MOLECULAR A RASELOR DE CÂINI

CIOBĂNEŞTI ROMÂNEŞTI

CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC:

Prof. univ. dr. ing. AUGUSTIN VLAIC

CLUJ-NAPOCA

2012

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI

MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA

ŞCOALA DOCTORALĂ

FACULTATEA DE ZOOTEHNIE ŞI BIOTEHNOLOGII

1

CUPRINS

Introducere………………………………………………………………………...

PARTEA I. STUDIU BIBLIOGRAFIC …………………………………………

CAPITOLUL I. RASELE DE CIOBĂNEŞTI ROMÂNEŞTI………………….

CAPITOLUL II. CERCETĂRI ASUPRA ORIGINII ŞI DIVERSITĂŢII

CÂINELUI DOMESTIC………………………………………………………….

CAPITOLUL III. STADIUL ACTUAL AL CERCETĂRILOR LA

CANIDE....................................................................................................................

PARTEA A DOUA. CERCETĂRI PROPRII…………………………………...

Scopul, obiectivele şi importanţa cercetărilor…………………………………...

CAPITOLUL IV. MATERIAL ŞI METODĂ…………………………………..

CAPITOLUL V. REZULTATE ŞI DISCUŢII………………………………….

5.1 REZULTATELE EXTRACŢIEI DE ADN DIN SÂNGE……………………..

5.2 MIGRAREA PROBELOR DE ADN MITOCONDRIAL...................................

5.3 SECVENŢIEREA PROBELOR DE ADN MITOCONDRIAL……………….

5.4 ALINIEREA SECVENŢELOR DE ADN MITOCONDRIAL………………

5.5 ESTIMAREA NUMĂRULUI ŞI FRECVENŢEI HAPLOTIPURILOR………

5.6 DISTRIBUŢIA GRAFICĂ A NEPOTRIVIRILOR NUCLEOTIDICE LA

CELE PATRU RASE DE CIOBĂNEŞTI ROMÂNEŞTI…………………………

5.7 TESTUL D (TAJIMA)………………………………………………………….

5.8 INDICI DE DIVERSITATE MOLECULARĂ………………………………

5.9 ESTIMAREA DISTANŢELOR GENETICE…………………………………

5.10 ANALIZA DE VARIANŢĂ MOLECULARĂ (AMOVA)………………….

5.11 ARBORI FILOGENETICI……………………………………………………

CAPITOLUL VI. CONCLUZII ………………………………………………….

REFERINŢE BIBLIOGRAFICE………………………………………………...

pag.

2

3

3

3

3

4

4

6

8

8

9

9

10

11

18

20

21

24

28

29

38

40

2

INTRODUCERE

La ora actuală, câinele domestic este cea mai răspândită specie din familia Canidae, cu

o populaţie la nivel global de aproximativ 400 milioane de indivizi, având cea mai largă

distribuţie geografică dintre toate speciile domestice. Dintre mamifere, câinii domestici sunt

remarcabili datorită multitudinii de variaţiuni naturale pe care le prezintă din punct de vedere

al caracteristicilor morfologice şi comportamentale, chiar dacă păstrarea raselor de câini se

face după standarde stabilite, astfel că în cadrul fiecărei rase animalele prezintă adesea o

morfologie şi un comportament uniform şi distinct. Există mai mult de 400 de rase la nivel

mondial, iar importanţa lor economică este substanţială (Lindblad-Toh şi colab 2005).

Studiul la nivel molecular a raselor de câini domestici a devenit o necesitate odată cu

punerea la punct a tehnicilor genetice moleculare. Aflarea originii şi a relaţiilor filogenetice

ale câinelui domestic au reprezentat primul pas spre cunoaşterea mai amănunţită a “celui mai

bun prieten al omului”. În anul 2005 câinele a devenit a V-a specie al cărei genom a fost

complet secvenţiat. Genomul canin a fost secvenţiat în speranţa că îi va putea ajuta pe

oamenii de ştiinţă să înţeleagă mecanismele evoluţionare complexe care formează genele şi

genoamele şi să furnizeze o unealtă puternică pentru identificarea factorilor genetici care

contribuie la starea de sănătate a omului. Se aşteaptă ca în următorii ani genomul câinelui

domestic să ajute la înţelegerea cauzei genetice a mai multor boli cu transmitere la

descendenţi pe care oamenii şi câinii le au în comun (Pires E.A. 2006).

O altă direcţie de cercetare la specia canină o reprezintă studiile de filogenie şi

biodiversitate, câinele fiind specia de mamifere cu cea mai mare variabilitate fenotipică. În

România nu s-au efectuat până în momentul de faţă cercetări la nivel molecular asupra nici

unei rase de câini. Caracterizarea la nivel molecular a câinilor ciobăneşti româneşti este foarte

importantă pentru cunoaşterea în detaliu a raselor autohtone, a originii fiecărei rase şi a

relaţiilor filogenetice din cadrul raselor româneşti şi a relaţiilor cu alte rase şi specii de canide.

Câinele reprezintă poate cea mai frumoasă cucerire a omului, fiind primul

element de progres al omenirii, deoarece el a fost acela care a favorizat trecerea

omului de la starea de sălbăticie la starea patriarhală, dându-i posibilitatea să întreţină

în apropierea sa şi alte specii de animale atât de folositoare pentru hrană şi alte utilităţi

(Bud I., 1998).

3

PARTEA ÎNTÂI: STUDIU BIBLIOGRAFIC

CAPITOLUL I. RASELE DE CIOBĂNEŞTI ROMÂNEŞTI

Acest capitol este structurat în două subcapitole. În primul subcapitol sunt prezentate

aspecte genetice generale ale câinelui domestic. Al doilea subcapitol prezintă cele patru rase

de câini ciobăneşti româneşti existente: Ciobănescul de Bucovina, Ciobănescul Carpatin,

Ciobănescul Corb şi Ciobănescul Mioritic.

CAPITOLUL II. CERCETĂRI ASUPRA ORIGINII ŞI DIVERSITĂŢII CÂINELUI

DOMESTIC

În acest capitol, care este structurat în şase subcapitole, sunt prezentate cele mai

importante cercetări efectuate asupra câinelui domestic, cu privire la originea şi relaţiile

filogenetice dintre acesta şi alte specii animale înrudite.

CAPITOLUL III. STADIUL ACTUAL AL CERCETĂRILOR LA CANIDE

Capitolul III al prezentei teze de doctorat prezintă, pe baza bibliografiei studiate,

cercetările realizate în ultimii ani asupra câinelui domestic. În cel de-al doilea subcapitol sunt

prezentate rezultatele unor măsurători fenotipice asupra raselor de căini ciobăneşti romăneşti

omologate provizoriu de către Federaţia Chinologică Internaţională (Ciobănescul de

Bucovina, Ciobănescul Carpatin, şi Ciobănescul Mioritic), precum şi evoluţia numerică a

acestor rase până în anul 2009.

4

PARTEA A DOUA: CERCETĂRI PROPRII

SCOPUL, OBIECTIVELE ŞI IMPORTANŢA CERCETĂRILOR

Scopul cercetărilor acestei teze de doctorat a fost cel de a stabili distanţele genetice şi

relaţiile filogenetice pentru cele patru rasele de câini ciobăneşti româneşti: Ciobănescul de

Bucovina, Ciobănescul Carpatin, Ciobănescul Mioritic şi Ciobănescul Corb.

Obiectivele şi activităţile cercetării

1. Obţinerea şi analizarea secvenţelor de ADN mitocondrial la cele patru rase de câini

ciobăneşti româneşti.

Pentru realizarea acestui obiectiv au fost întreprinse următoarele activităţi:

Ø au fost identificate expoziţiile canine internaţionale şi naţionale la care au participat

câini din rasele de ciobăneşti româneşti. S-au luat în considerare doar câini specifici rasei

care au Carte de Origine Română (pedigree) şi care au primit un calificativ bun în urma

jurizării din cadrul expoziţiei;

Ø au fost recoltate probe de sânge de la câini ciobăneşti aparţinând raselor Ciobănesc de

Bucovina, Ciobănesc Carpatin, Ciobănesc Mioritic şi Ciobănesc Corb;

Ø s-a realizat extracţia de ADN din probele sanguine recoltate;

Ø s-au secvenţiat probe de ADN mitocondrial pentru rasele Ciobănesc de Bucovina,

Ciobănesc Carpatin şi Ciobănesc Mioritic şi Ciobănesc Corb

2. Estimarea indicilor de diversitate moleculară şi a distanţelor genetice

Pentru atingerea acestui obiectiv s-au realizat următoarele activităţi:

Ø Estimarea numărului de haplotipuri şi frecvenţa acestora

Ø Calcularea indicilor de diversitate nucleotidică

Ø Estimarea distanţelor genetice pe baza secvenţelor nucleotidice de la cele patru rase

5

3. Stabilirea relaţiilor filogenetice ale raselor de câini ciobăneşti româneşti pe baza

secvenţelor de ADN mitocondrial

În cadrul acestui obiectiv s-a urmărit realizarea de arbori filogenetici care să arate relaţiile

filogenetice dintre rasele de câini Ciobănesc de Bucovina, Ciobănesc Carpatin, Ciobănesc

Mioritic şi Ciobănesc Corb precum şi a relaţiilor filogenetice dintre fiecare rasa autohtonă şi

alte rase de câini, ale căror secvenţe nucleotidice sunt disponibile în baza de date Genbank.

Pentru realizarea acestui obiectiv s-au derulat următoarele activităţi:

Ø Analiza secvenţelor nucleotidice corespunzătoare indivizilor aparţinând raselor

Ciobănesc de de Bucovina, Ciobănesc Carpatin şi Ciobănesc Mioritic. Acest tip de

analiză constă în alinierea secvenţelor de ADNmt ale indivizilor din aceste rase cu

secvenţele de ADNmt de la specia canină existente în baza de date Genbank;

Ø Întocmirea arborilor filogenetici pentru fiecare rasă de câini ciobăneşti în parte, pe

baza rezultatelor obţinute prin intermediul analizei secvenţelor de ADNmt;

Ø Compararea secvenţelor de ADNmt obţinute de la rasele de câini Ciobănesc de de

Bucovina, Ciobănesc Carpatin şi Ciobănesc Mioritic şi stabilirea distanţelor

filogenetice dintre acestea.

Importanţa cercetării rezidă în faptul că rezultatele obţinute vor contribui la

cunoaşterea mai detaliată, la nivel molecular, a raselor autohtone de câini ciobăneşti şi de

asemenea la stabilirea relaţiilor filogenetice dintre acestea. Până în momentul de faţă nu s-au

realizat cercetări la nivel molecular asupra acestor rase de câini. De asemenea aceste cercetări

vor face parte din dosarul care va fi înaintat către Federaţia Chinologică Internaţională pentru

recunoaşterea permanentă a raselor de câini ciobăneşti Ciobănesc de de Bucovina, Ciobănesc

Carpatin şi Ciobănesc Mioritic.

6

CAPITOLUL IV. MATERIAL ŞI METODĂ

Pentru obţinerea secvenţelor de ADN mitocondrial în vederea realizării analizelor

genetice şi filogenetice s-au urmat următoarele etape:

1) Recoltarea probelor de sânge

2) Extracţia ADN din sânge

3) Amplificarea probelor de ADN

4) Migrarea probelor de ADN în gel de agaroză

5) Purificarea probelor de ADN

6) Secvenţierea probelor de ADN

Recoltarea probelor de sânge s-a realizat în mai multe etape succesive. Probele de

sânge au fost recoltate în cadrul expoziţiilor canine (de club, naţionale şi internaţionale) de la

indivizi cu pedigree (Carte de Origine Română). Expoziţiile la care am participat şi recoltat

sânge au avut loc în localităţile: Arad, Bistriţa, Râşnov, Alba-Iulia, Suceava, Rădăuţi şi Cluj-

Napoca. S-au recoltat în total 102 probe de sânge de la cele patru rase de câini ciobăneşti

româneşti. Pentru obţinerea unor rezultate corecte în urma analizelor statistice şi a analizelor

filogenetice a celor patru populaţii canine este necesară utilizarea unor eşantioane de probe

formate doar din indivizi neînrudiţi. Din acest motiv nu au putut fi utilizate pentru secvenţiere

şi analiză toate probele recoltate, ci doar o parte a acestora, deoarece la aceste expoziţii unii

dintre câini sunt înrudiţi. Probele de sânge şi probele de ADN obţinute în urma extracţiei au

fost etichetate în felul următor: CC-Ciobănesc Carpatin; CO-Ciobănesc Corb; CB-Ciobănesc

de Bucovina; CM-Ciobănesc mioritic.

În studiul de faţă s-a procedat la secvenţierea unei porţiuni de 887 pb din genomul

mitocondrial de la patru rase de câini ciobăneşti româneşti: Ciobănesc de Bucovina,

Ciobănesc Carpatin, Ciobănesc Mioritic şi Ciobănesc Corb. Secvenţa conţine un segment al

citocromului b, gena care codifică ARNt-Thr, gena care codifică ARNt-Pro şi o parte a

regiunii de control (poz. 15259 până la poz. 16146). S-a secvenţiat această porţiune deoarece

prezintă cea mai mare variabilitate nucleotidică din cadrul genomului mitocondrial (Figura 1).

7

Figura 1. Harta genomului mitocondrial canin. Harta a fost realizată de către Ryong

Nam Kim şi colab. (2012) în urma secvenţierii întregului genom mitocondrial la un individ

din rasa Jindo Coreean.

Analiza genetică efectuată în prezenta teză de doctorat a cuprins următoarele aspecte:

a) Alinierea secvenţelor de ADN mitocondrial

b) Estimarea unor indici de diversitate moleculară

c) Construirea graficelor de distribuţie a nepotrivirilor nucleotidice

d) Calculul Testului D (Tajima)

e) Estimarea distanţei genetice pe baza indicelui de fixaţie (FST) şi a distanţei Nei

f) Analiza de varianţă moleculară (AMOVA)

Ultima parte a studiului a constat într-o analiză filogenetică a celor patru rase de câini

ciobăneşti româneşti. Pentru construirea arborilor filogenetici s-a utilizat programul de analiză

genetică MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood,

Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods (Tamura K. şi colab. 2011). Acest

program construieşte arbori filogenetici pe baza secvenţelor nucleotidice. S-a procedat la

8

construirea de arbori filogenetici între toate secvenţele analizate de la cele patru rase de

ciobăneşti româneşti, precum şi dendrograme cuprinzând secvenţe de lupi sălbatici şi alte

secvenţe nucleotidice de la alte rase de câini din baza de date Genbank.

CAPITOLUL V. REZULTATE ŞI DISCUŢII

5.1 REZULTATELE EXTRACŢIEI DE ADN DIN SÂNGE

Extracţia de ADN din sânge s-a realizat prin două metode: o metodă clasică şi o

metodă pe baza de kit. Ambele metode au dat rezultate bune, însă pentru obţinerea unei

cantităţi mai mari de ADN se recomandă utilizarea metodei clasice de extracţie a ADN din

sânge. În figura 2 sunt date concentraţiile şi purităţile rezultate în urma extracţiei ADN prin

metoda clasică.

Figura 2. Cuantificarea probelor ADN extrase de la câini ciobăneşti româneşti. CC -

Ciobănesc Carpatin; CB - Ciobănesc de Bucovina; CM - Ciobănesc mioritic

Valoarea medie a cantităţii de ADN a fost de 267,24 ng/µl, valorea minimă fiind 40,86

ng/µl, iar cea maximă 609,14 ng/µl. În ceea ce priveşte puritatea probelor de ADN extrase,

acestea au avut valoarea maximă de 1,90 şi valoarea minimă de 1,20. Media a fost în jurul

valorii de 1,41 (Figura 2).

9

5.2 MIGRAREA PROBELOR DE ADN MITOCONDRIAL PRIN ELECTROFOREZĂ

În urma migrării probelor de ADN în gel de agaroză s-au obţinut următoarele profile

electroforetice pentru probele ADN analizate (Figura 3). Unele dintre probele ADN nu s-au

amplificat prin tehnica PCR. Aceste probe au fost extrase din nou, amplificate şi migrate

ulterior.

Figura 3. Vizualizarea în lumină UV a unui gel de agaroză. Benzile întunecate corespund

fragmentului de 887 pb de ADN mitocondrial. CC-Ciobănesc Carpatin; CO-Ciobănesc Corb;

CB-Ciobănesc de Bucovina; CM-Ciobănesc mioritic

5.3 SECVENŢIEREA PROBELOR DE ADN MITOCONDRIAL

Secvenţierea probelor de ADN mitocondrial extras din sângele recoltat de la rasele

Ciobănesc de Bucovina, Ciobănesc Carpatin, Ciobănesc Corb şi Ciobănesc Mioritic s-a

realizat de către firma Macrogen din Olanda. În urma secvenţierii probelor de ADN

mitocondrial s-au obţinut secvenţele nucleotidice (887 pb) pentru rasele: Ciobănesc de

Bucovina, Ciobănesc Carpatin şi Ciobănesc Mioritic. Secvenţa conţine un segment al

citocromului b, gena care codifică ARNt-Thr, gena care codifică ARNt-Pro şi o parte a

regiunii de control.

10

Tabel 1

Conţinutul procentual al bazelor azotate corespunzător celor patru rase de căini ciobăneşti

româneşti (valori relative). Conţinutul nucleotidic a fost determinat cu programul Arlequin v.

3.5

Rasa

Adenină

(%)

Guanină

(%)

Timină

(%)

Citozină

(%)

AT

(%)

GC

(%)

Ciobănesc de Bucovina

28,31

15,24

29,74

26,71

58,05

41,95

Ciobănesc Carpatin

28,19

15,32

30,03

26,47

58,22

41,78

Ciobănesc Corb

28,26

15,23

29,90

26,61

58,16

41,84

Ciobănesc Mioritic

27,96

15,85

29,64

26,55

57,60

42,40

În tabelul 1 se prezintă proporţia de baze azotate corespunzător secvenţei nucleotidice

de 887 pb a câte unui individ din rasele Ciobănesc de Bucovina, Ciobănesc Carpatin,

Ciobăbesc Corb şi Ciobănesc Mioritic. Proporţia de baze azotate este foarte apropiată între

secvenţele analizate. Procentele de AT s-au aflat între valorile 57,60 şi 58,22, iar cele de GC

între 41,78 şi 42,40.

5.4 ALINIEREA SECVENŢELOR DE ADN MITOCONDRIAL

Toate secvenţele de la cele patru rase de câini ciobăneşti româneşti au fost aliniate

între ele. Deasemenea pentru fiecare secvenţă s-a realizat o analiză BLAST, pentru a

determina care sunt secvenţele nucleotidice din baza de date Genbank cele mai asemănătoare

cu secvenţele câinilor ciobăneşti româneşti.

Rezultatele alinierilor au fost utilizate pentru construirea arborilor filogenetici.

11

Figura 4. Exemplu de aliniere a secvenţelor de ADNmt de la câinii ciobăneşti româneşti şi

secvenţele de lupi din baza de date Genbank. Secvenţele de lupi sunt notate cu „W”

5.5 ESTIMAREA NUMĂRULUI ŞI FRECVENŢEI HAPLOTIPURILOR

Pentru efectuarea analizelor statistice s-au luat în considerare câte 11 secvenţe

reprezentative pentru fiecare din cele patru populaţii de câini ciobăneşti româneşti.

În cadrul celor 44 de secvenţe nucleotidice analizate s-a identificat un număr de 18

haplotipuri. Distribuţia haplotipurilor în cadrul celor patru populaţii se poate observa în

tabelul 2.

12

Tabel 2

Numărul de haplotipuri şi numărul de indivizi la care s-au identificat haplotipurile de la cele

patru rase de câini ciobăneşti româneşti

Rasa

Haplotip

Ciobănesc de Bucovina

n = 11

Ciobănesc Carpatin n = 11

Ciobănesc Corb

n = 11

Ciobănesc Mioritic

n = 11

Hap. 1 8 0 0 1 Hap. 2 2 0 0 0 Hap. 3 1 6 1 0 Hap. 4 0 1 0 0 Hap. 5 0 1 0 0 Hap. 6 0 1 0 0 Hap. 7 0 1 0 0 Hap. 8 0 1 0 0 Hap. 9 0 0 2 0

Hap. 10 0 0 2 0 Hap. 11 0 0 1 0 Hap. 12 0 0 3 0 Hap. 13 0 0 2 0 Hap. 14 0 0 0 1 Hap. 15 0 0 0 1 Hap. 16 0 0 0 3 Hap. 17 0 0 0 4 Hap. 18 0 0 0 1

La populaţia Ciobănesc de Bucovina s-au identificat 3 haplotipuri (Hap. 1, 2 şi 3); la

populaţia Ciobănesc Carpatin s-au identificat 6 haplotipuri (Hap. 3, 4, 5, 6, 7, 8); la populaţia

Ciobănesc Corb s-au identificat 6 haplotipuri (Hap. 3, 9, 10, 11, 12, 13 ); la populaţia

Ciobănesc Mioritic s-au identificat 6 haplotipuri (Hap. 1, 14, 15, 16, 17, 18).

Dintre cele 18 haplotipuri identificate, doar două haplotipuri au fost comune între rase

(hap.1 şi hap. 3). Haplotipul 1 este comun raselor Ciobănesc de Bucovina şi Ciobănesc

Mioritic şi a fost identificat la opt indivizi din rasa Ciobănesc de Bucovina, însă doar la un

singur individ Ciobănesc Mioritic.

Haplotipul 3 a fost identificat la rasele Ciobănesc de Bucovina, Ciobănesc Carpatin şi

Ciobănesc Corb. Cea mai mare frecvenţă a acestui haplotip a fost observată la populaţia de

Ciobănesc Carpatin, unde a fost identificat la 6 din cei 11 indivizi analizaţi. La populaţiile de

13

Ciobănesc de Bucovina şi Ciobănesc Corb, acest haplotip a fost prezent la doar câte un

individ din cei 11 analizaţi per rasă.

Restul de 16 haplotipuri au fost caracteristici rasei din care fac parte indivizii studiaţi.

Figura 5. Frecvenţa haplotipurilor la cele patru rase de câini ciobăneşti româneşti (frecvenţe

relative).

În figura 5 se prezintă frecvenţele relative a celor 18 haplotipuri pentru fiecare rasă

de ciobăneşti româneşti. Cea mai mare frecvenţă a fost atinsă de haplotipul 1 (0,727), urmat

apoi de haplotipul 3 (0,545), haplotipul 17 (0,364), haplotipul 12 (0,300), haplotipul 16

(0,273). Restul haplotipurilor au fost identificate la unul sau maxim doi indivizi şi au

frecvenţe cuprinse între valorile: 0,090 şi 0,200.

14

Pe baza diferenţelor nucleotidice dintre secvenţele de ADN mitocondrial, programul

Arlequin a construit matrici de distanţe între haplotipuri pentru fiecare populaţie de ciobăneşti

şi per total. Matricile corespunzătoare fiecărei rase sunt prezentate în figurile 6, 7, 8 şi 9.

Figura 6. Matricea distanţelor interhaplotipice pentru populaţia Ciobănesc de Bucovina.

Distanţele dintre haplotipuri au fost calculate pe baza numărului de diferenţe nucleotidice

dintre secvenţe. Intensitatea culorii graficului este direct proporţională cu numărul de

diferenţe dintre secvenţele de ADNmt

La rasa Ciobănesc de Bucovina s-au identificat 3 haplotipuri. Numărul mediu de

diferenţe „pairwise” pentru populaţia de Ciobănesc de Bucovina a fost de 3,759 +/- 2,051

(deviaţia standard).

Haplotipul 1 a fost observat la 8 din cei 11 indivizi analizaţi. Haplotipul 2 a fost

observat la doi indivizi, iar haplotipul 3 a fost observat la doar un singur individ.

Matricea distanţei dintre haplotipuri (Fig. 6) ne arată că cea mai mare diferenţă este între

haplotipul 3 şi hap. 1 şi 2. Numărul mare de diferenţe nucleotidice dintre hap. 3 şi hap.1,

15

respectiv hap. 2, se datorează faptului că acest haplotip este comun cu rasele Ciobănesc

Carpatin şi Ciobănesc Corb, deci nu este caracteristic rasei Ciobănesc de Bucovina. Numărul

mic de haplotipuri observate la rasa Ciobănesc de Bucovina este datorat variabilităţii genetice

mici dintre secvenţele de ADN mitocondrial studiate.

Figura 7. Matricea distanţelor interhaplotipice pentru populaţia Ciobănesc Carpatin.

Distanţele dintre haplotipuri au fost calculate pe baza numărului de diferenţe nucleotidice

dintre secvenţe. Intensitatea culorii graficului este direct proporţională cu numărul de

diferenţe dintre secvenţele de ADNmt.

Dintre cele şase haplotipuri identificate la rasa Ciobănesc Carpatin, cea mai mare

distanţă a fost estimată între haplotipul 6 şi restul haplotipurilor. Numărul mediu de diferenţe

„pairwise” pentru populaţia de Ciobănesc Carpatin este de 12,896 +/- 6,300 (deviaţia

standard)

Cea mai mare frecvenţă haplotipică a fost observată la haplotipul 3 (0,545). Acest

haplotip a fost evidenţiat şi la rasele Ciobănesc de Bucovina şi Ciobănesc Corb, însă cu o

frecvenţă mult mai mică (0,090) . Incidenţa acestui haplotip şi la rasele Ciobănesc de

16

Bucovina şi Ciobănesc Corb poate fi explicată prin schimbul de gene care a avut loc între cele

trei rase de ciobăneşti româneşti înaintea recunoaşterii lor ca rase diferite.

Numărul relativ mic de diferenţe nucleotidice între haplotipul 3 şi restul

haplotipurilor identificate la rasa Ciobănesc Carpatin (vezi fig. 7), precum şi frecvenţa mare a

acestuia în cadrul populaţiei studiate, sugerează faptul că acest haplotip este caracteristic rasei

Ciobănesc Carpatin şi a ajuns în cadrul populaţiilor de Ciobănesc de Bucovina şi Ciobănesc

Corb prin încrucişări între femele de Ciobănesc Carpatin şi masculi aparţinând raselor

Ciobănesc de Bucovina şi Ciobănesc Corb (ADN-ul mitocondrial se transmite doar pe linie

maternă).

Figura 8. Matricea distanţelor interhaplotipice pentru populaţia Ciobănesc Corb. Distanţele

dintre haplotipuri au fost calculate pe baza numărului de diferenţe nucleotidice dintre

secvenţe. Intensitatea culorii graficului este direct proporţională cu numărul de diferenţe

nucleotidice dintre secvenţele de ADNmt

Matricea distanţelor interhaplotipice core

(fig. 8) ne arată că cele mai mari distanţe

haplotipurilor, respectiv 12 şi restul haplotipurilor. Restul di

prezentat valori medii. Numărul m

Corb este de 76,817 +/- 36,217 (deviaţia standard).

Figura 9. Matricea distanţelor interhaplotipice pentru populaţia Ciobănesc Mioritic. Distanţele

dintre haplotipuri au fost calculate pe baza

secvenţe. Intensitatea culorii graficului este direct proporţională cu numărul de diferenţe

nucleotidice dintre secvenţele de ADNmt

Pentru populaţia de Ciobănesc Mioritic numărul mediu de diferenţe „pairwise”

de 97,205 +/- 45,335, şi reprezintă cel mai mare număr de diferenţe nucleotidice calculat la

cele patru rase de ciobăneşti analizate.

La rasa Ciobănesc Mioritic s

(0,398), comparativ cu celelate rase

17

Matricea distanţelor interhaplotipice corespunzătoare populaţiei de Ciobănesc Corb

) ne arată că cele mai mari distanţe s-au estimat între haplotipul

haplotipurilor, respectiv 12 şi restul haplotipurilor. Restul distanţelor dintre haplotipuri au

prezentat valori medii. Numărul mediu de diferenţe „pairwise” pentru populaţia de Ciobănesc

36,217 (deviaţia standard).

Matricea distanţelor interhaplotipice pentru populaţia Ciobănesc Mioritic. Distanţele

dintre haplotipuri au fost calculate pe baza numărului de diferenţe nucleotidice dintre

secvenţe. Intensitatea culorii graficului este direct proporţională cu numărul de diferenţe

nucleotidice dintre secvenţele de ADNmt

Pentru populaţia de Ciobănesc Mioritic numărul mediu de diferenţe „pairwise”

45,335, şi reprezintă cel mai mare număr de diferenţe nucleotidice calculat la

cele patru rase de ciobăneşti analizate.

La rasa Ciobănesc Mioritic s-a observat cea mai mare distanţă între haplotipuri

(0,398), comparativ cu celelate rase de ciobăneşti româneşti. Această distanţă a fost calculată

aţiei de Ciobănesc Corb

au estimat între haplotipul 9 şi restul

stanţelor dintre haplotipuri au

ediu de diferenţe „pairwise” pentru populaţia de Ciobănesc

Matricea distanţelor interhaplotipice pentru populaţia Ciobănesc Mioritic. Distanţele

numărului de diferenţe nucleotidice dintre

secvenţe. Intensitatea culorii graficului este direct proporţională cu numărul de diferenţe

Pentru populaţia de Ciobănesc Mioritic numărul mediu de diferenţe „pairwise” este

45,335, şi reprezintă cel mai mare număr de diferenţe nucleotidice calculat la

a observat cea mai mare distanţă între haplotipuri

de ciobăneşti româneşti. Această distanţă a fost calculată

18

între haplotipul 1 şi haplotipul 18. Haplotipul 18 a prezentat distanţe foarte mari comparativ

cu restul haplotipurilor, cu valori cuprinse între 0,383 – 0,398.

5.6 DISTRIBUŢIA GRAFICĂ A NEPOTRIVIRILOR NUCLEOTIDICE LA CELE PATRU

RASE DE CIOBĂNEŞTI ROMÂNEŞTI

Graficele de distribuţie a nepotrivirilor nucleotidice au fost construite pentru două

cazuri. Primul caz are la bază presupunerea că populaţia a trecut printr-o fază de mărime

constantă a populaţiei, în timp ce la al doilea caz se face presupunerea că populaţia a trecut

printr-o fază de expansiune demografică. Graficele prezintă diferenţele „pairwise” observate

şi diferenţele aşteptate pentru cele două cazuri (mărime constantă şi expansiune demografică).

Graficele vor fi prezentate pentru cele două cazuri la fiecare rasă în parte.

Mărime constantă Expansiune demografică

Figura 10. Graficele distribuţiei nepotrivirilor nucleotidice la rasa Ciobănesc de Bucovina

Mărime constantă Expansiune demografică

Figura 11. Graficele distribuţiei nepotrivirilor nucleotidice la rasa Ciobănesc Carpatin

19

Mărime constantă Expansiune demografică

Figura 12. Graficele distribuţiei nepotrivirilor nucleotidice la rasa Ciobănesc Corb

Mărime constantă Expansiune demografică

Figura 13. Graficele distribuţiei nepotrivirilor nucleotidice la rasa Ciobănesc Mioritic

Cele două grafice de distribuţie a nepotrivirilor nucleotidice corespunzătoare fiecărei

rase de ciobăneşti româneşti au fost comparate între ele. Nici unul dintre grafice nu este

susţinut statistic (p>0,05).

La rasa Ciobănesc de Bucovina se observă că există o mai bună potrivire între

distribuţiile observate şi cele aşteptate pentru cazul de evoluţie constantă a populaţiei.

Graficele distribuţiei la rasa Ciobănesc Carpatin sunt aproape identice, deci

neconcludente în ceea ce priveşte istoria demografică recentă a acestei rase.

La rasa Ciobănesc Corb se observă o mai bună potrivire a distribuţiilor observată,

respectiv aşteptată, pentru modelul constant de evoluţie a mărimii populaţiei.

20

Pentru populaţia de Ciobănesc Mioritic graficele nepotrivirilor nucleotidice sunt prea

asemănătoare pentru a se putea trage o concluzie privind evoluţia demografică a acestei

populaţii.

5.7 TESTUL STATISTIC D (TAJIMA)

Deoarece graficele de distribuţie a nepotrivirilor nucleotidice nu au fost concludente s-

a procedat la calcularea statisticului D. Acest test face o discriminare între secvenţele

nucleotidice care au evoluat la întâmplare (pe baza modelului teoriei neutralităţii) şi

secvenţele care nu au evoluat la întâmplare, fiind sub influenţa unui proces nerandomizat cum

sunt selecţia stabilizatoare sau direcţională, expansiunea sau restrângerea demografică, etc.

În tabelul de mai jos sunt trecute numărul de indivizi luaţi în studiu din cele patru rase

de câini ciobăneşti româneşti, valorile testului D, semnificaţia statistică a testului, numărul de

situsuri polimorfice (S) şi coeficentul de diversitate nucleotidică (π).

Tabel 3

Valorile testului D la cele patru rase de câini ciobăneşti româneşti

Rasa

Statistici

Ciobănesc de

Bucovina

Ciobănesc

Carpatin

Ciobănesc

Corb

Ciobănesc

Mioritic

Nr. indivizi 11 11 11 11

S 16 62 131 327

Π 0,004 0,015 0,084 0,094

Testul D -1,430 -2,115 2,394 -1,817

Semnificaţia

statistică

n.s., p>0.01 **, p< 0.01 **, p< 0.01 *, p< 0.05

Valorile testului D au fost negative pentru populaţiile Ciobănesc de Bucovina,

Ciobănesc Carpatin şi Ciobănesc Mioritic. Doar la populaţia de Ciobănesc Corb valoarea lui

D a fost pozitivă. Valorile testului au fost semnificative din punct de vedere statistic pentru

rasele Ciobănesc Carpatin, Ciobănesc Corb şi Ciobănesc Mioritic.

21

Valoarea testului D a fost semnificativă statistic pentru populaţia de Ciobănesc

Mioritic (p < 0.05), şi distinct semnificativă (p < 0.01) pentru populaţiile de Ciobănesc

Carpatin şi Ciobănesc Corb. Valorile negative obţinute la populaţiile Ciobănesc de Bucovina,

Ciobănesc Carpatin şi Ciobănesc Mioritic semnifică un exces al polimorfismelor cu frecvenţă

joasă comparativ cu valorile aşteptate, ceea ce indică o creştere a mărimii populaţiei şi/sau

selecţie negativă (purificatoare).

La populaţia de Ciobănesc Corb valoarea statisticului D a fost pozitivă (2,394), ceea ce

semnifică faptul că populaţia prezintă nivele scăzute a polimorfismelor (frecvenţe scăzute şi

ridicate), ceea ce indică o scădere a mărimii populaţiei şi/sau aflarea populaţiei sub efectul

selecţiei stabilizatoare.

5.8 INDICI DE DIVERSITATE MOLECULARĂ

Figura 14. Gradul de diversitate a genelor al cele patru rase de câini ciobăneşti româneşti

Deoarece genomul mitocondrial este haploid, în loc de terminologia „heterozigoţie

aşteptată” se va utiliza „diversitatea genelor” (Nei, 1973).

22

Analizând datele din figura 14 se poate observa că cea mai mare diversitate a genelor

este la populaţia Ciobănesc Corb, la care s-a observat cea mai mare valoare a diversităţii

genelor GST = 0.888 +/- 0.075 (deviaţia standard). Valorile pentru populaţia Ciobănesc

Mioritic sunt foarte apropiate de cele ale populaţiei de Ciobănesc Corb, cu GST = 0.836 +/-

0.088 (deviaţia standard). La Ciobănescul Carpatin valoarea indicelui de diversitate a fost GST

= 0.7273 +/- 0.1444 (deviaţia standard). Populaţia de Ciobănesc de Bucovina a înregistrat cel

mai mic indice GST, cu o valoare de 0.472 +/- 0.1617 (deviaţia standard).

Valorile obţinute pentru rasele de câini ciobăneşti româneşti sunt asemănătoare cu cele

obţinute de către alţi autori la alte rase de câini pe ADN microsatelit. Koskinen (2000) a

obţinut valori cuprinse între 0.35 şi 0.88 la rasele Golden Retreiver, Ciobănesc German,

Teckel cu păr sârmos, Pembroke Welsh Corgi şi Terrier Bedlington. Pires şi colab. (2009) au

prezentat valori începând cu 0.60 (Pointer portughez), cea mai mare valoare raportată a

heterozigoţiei aşteptate fiind de 0.89 (Câinele tunisian).

În studiul realizat de Kim şi colab. (2001) pe un număr de 11 rase de câini asiatici s-au

raportat valori ale heterozigoţiei aşteptate cuprinse între 0.310–0.718, cu o valoare medie de

0,580.

Figura 15. Numărul de alele la loci diferiţi la cele patru populaţii de câini ciobăneşti

româneşti

23

Datele din figura 15 ne arată că la populaţia de Ciobănesc Mioritic s-a estimat numărul

cel mai mare de alele, cu o medie de 1,444 +/- 0,583 (deviaţia standard). Ciobănescul Corb a

prezentat o valoare medie de 1,161 +/- 0,370 (deviaţia standard). La rasele Ciobănesc

Carpatin şi Ciobănesc de Bucovina numărul mediu de alele a fost de 1,080 +/- 0,289 (deviaţia

standard), respectiv 1,019 +/- 0,138 (deviaţia standard).

Tabel 4

Indici ai diversităţii nucleotidice la cele patru rase de câini ciobăneşti româneşti

Rasa

Statistici

Ciobănesc de

Bucovina

Ciobănesc

Carpatin

Ciobănesc

Corb

Ciobănesc

Mioritic

Nr. observat de tranziţii

16

32

59

141

Nr. observat de transversii

0

64

73

224

Nr. de substituţii

16

66

132

365

Nr. observat de situsuri cu

tranziţii

16

31

59

133

Nr. observat de situsuri cu

transversii

16

31

59

133

Nr. de situsuri polimorfice

16

62

131

327

Numărul mediu de

diferenţe „pairwise”(π)

3,709

12,509

69,133

77,855

Din datele din tabel se constată că în ceea ce priveşte numărul de substituţii

nucleotidice, populaţia de Ciobănesc Mioritic prezintă cel mai mare număr (365), urmată de

populaţia de Ciobănesc Corb (132). La populaţia de Ciobănesc Carpatin numărul de substituţii

este de 66, iar la populaţia de Ciobănesc Corb s-a observat cel mai mic număr de substituţii

(16). Cel mai mare indice de diversitate moleculară (π) a fost cel obţinut de populaţia de

Ciobănesc Mioritic (77,855), ceea ce denotă faptul că această populaţie are cel mai mare grad

24

de diversitate moleculară la nivel intrapopulaţional. Cea mică diversitate a fost raportată la

populaţia de Ciobănesc de Bucovina, la care π = 3,709. Acest nivel scăzut de diversitate

nucleotidică poate fi pus pe seama unui anumit grad de izolare geografică pe care o suferă

această rasă, deoarece majoritatea indivizilor tipici rasei provin din regiunea Bucovinei şi

prezintă un grad mai mare de cosangvinizare.

5.9 ESTIMAREA DISTANŢELOR GENETICE

1. Estimarea indicelui de fixaţie FST

Figura 16. Matricea distanţelor FST dintre rasele de câini ciobăneşti româneşti. Intensitatea

culorii căsuţelor din grafic este direct proporţională cu valoarea distanţei genetice dintre rase.

Valorile distanţelor genetice dintre cele patru rase de câini ciobăneşti româneşti

estimate pe baza statisticului FST sunt prezentate în figura 16. Între rasele Ciobănesc de

Bucovina şi Ciobănesc Corb s-a estimat cea mai mare distanţă genetică dintre cele patru rase

25

luate în studiu (FST = 0,368). Indicele FST între rasa Ciobănesc de Bucovina şi rasele

Ciobănesc Corb şi Ciobănesc Mioritic a prezentat valorile 0,317 respectiv 0,299. Distanţa

genetică dintre Ciobănescul Carpatin şi Ciobănescul Corb a atins valoarea 0,146, iar între

Ciobănescul Carpatin şi Ciobănescul Mioritic valorea distanţei a fost de 0,218. Cea mai mică

valoare a indicelui de fixaţie a fost estimată între rasele Ciobănesc Corb şi Ciobănesc

Mioritic, cu o valoare de 0,137.

Parker şi colab. (2004), în cadrul unui studiu amplu realizat pe 85 de rase de câini, a

obţinut o valoare medie a FST de 0,330. Kim şi colab. (2001) au obţinut valori cuprinse între

0,022 şi 0,369, cu o valoare medie de 0,154, pentru cele 11 rase de câini luate în studiu.

Koskinen & Bredbacka (2000) au estimat valori ale FST , pentru cinci rase finlandeze de câini,

cuprinse între 0.182 şi 0.291.

1. Estimarea distanţei genetice Nei (figura 17, tabel 5)

Distanţa genetică estimată în interiorul populaţiilor a atins valori cuprinse între 0,472

(Ciobănesc de Bucovina) şi 0,888 (Ciobănesc Corb). Pentru populaţiile de Ciobănesc Carpatin

şi Ciobănesc Mioritic valorile au fost de 0,727, respectiv 0,836 (vezi figura 19 şi tabelul 6).

Distanţa Nei (DA) a atins cea mai mare valoare (0,350) între populaţiile de Ciobănesc de

Bucovina şi Ciobănesc Carpatin. Valorile DA estimate între rasa Ciobănesc de Bucovina şi

celelalte două rase de ciobăneşti româneşti au fost: 0,310 (Ciobănesc Corb) şi 0,279

(Ciobănesc Mioritic). Între rasa Ciobănesc Carpatin şi rasele Ciobănesc Corb şi Ciobănesc

Mioritic, valorile estimate ale distanţei genetice au fost de 0,137, respectiv 0,218. Distanţa

genetică dintre Ciobănescul Corb şi Ciobănescul Mioritic a fost egală cu 0,147. Valorile

obţinute nu sunt semnificative din punct de vedere statistic (p ^0,05).

Cercetările efectuate de alţi autori au prezentat valori aemănătoare pentru diferite rase

de câini luate în studiu. Zajc şi colab. (1999), într-un studiu realizat pe trei rase de ogari,

Labrador şi Ciobănesc German, au obţinut valori ale DA cuprinse între 0,253 şi 0,395. Kim şi

colab. (2001), în studiul realizat pe 11 rase de câini asiatici, a obţinut valori cuprinse între

0,107 şi 0,323.

26

Figura 17. Graficul distanţelor genetice la nivel intra şi interpopulaţional pentru cele patru

rase de ciobăneşti româneşti. Distanţa Nei brută (Ds) este colorată cu verde, iar distanţa Nei

netă (DA) este colorată în albastru. Culoarea portocalie este corespunzătoare distanţei genetice

din interiorul populaţiilor (numărul mediu de diferenţe „pairwise” dintre secvenţele de

ADNmt de la fiecare rasă).

27

Tabel 5

Matricea distanţelor genetice. Distanţa Nei netă (DA) este sub diagonală, distanţa

genetică din interiorul populaţiilor este pe diagonală, iar distanţa genetică Nei brută (DS) este

deasupra diagonalei

Ciobănesc de

Bucovina

Ciobănesc

Carpatin

Ciobănesc Corb

Ciobănesc

Mioritic

Ciobănesc de

Bucovina

0,472

0,950

0,990

0,933

Ciobănesc

Carpatin

0,350

0,727

0,945

1,000

Ciobănesc

Corb

0,310

0,137

0,888

1,000

Ciobănesc Mioritic

0,279

0,218

0,147

0,836

Distanţa genetică estimată în interiorul populaţiilor a atins valori cuprinse între 0,472

(Ciobănesc de Bucovina) şi 0,888 (Ciobănesc Corb). Pentru populaţiile de Ciobănesc Carpatin

şi Ciobănesc Mioritic valorile au fost de 0,727, respectiv 0,836.

Distanţa Nei (DA) a atins cea mai mare valoare (0,350) între populaţiile de Ciobănesc

de Bucovina şi Ciobănesc Carpatin. Valorile DA estimate între rasa Ciobănesc de Bucovina şi

celelalte două rase de ciobăneşti româneşti au fost: 0,310 (Ciobănesc Corb) şi 0,279

(Ciobănesc Mioritic). Între rasa Ciobănesc Carpatin şi rasele Ciobănesc Corb şi Ciobănesc

Mioritic, valorile estimate ale distanţei genetice au fost de 0,137, respectiv 0,218. Distanţa

genetică dintre Ciobănescul Corb şi Ciobănescul Mioritic a fost egală cu 0,147. Valorile

obţinute nu sunt semnificative din punct de vedere statistic (p >0,05).

Cercetările efectuate de alţi autori au prezentat valori asemănătoare pentru diferite rase

de câini luate în studiu. Zajc şi colab. (1999), într-un studiu realizat pe trei rase de ogari,

Labrador şi Ciobănesc German, au obţinut valori ale DA cuprinse între 0,253 şi 0,395. Kim şi

colab. (2001), în studiul realizat pe 11 rase de câini asiatici a obţinut valori cuprinse între

0,107 şi 0,323.

28

5.10 ANALIZA DE VARIANŢĂ MOLECULARĂ (AMOVA)

Tabel 6

Rezultatele analizei de varianţă moleculară (AMOVA)

Sursa de variaţie

Grade de

libertate

Suma pătratelor

abaterilor

Mediile aşteptate

ale pătratelor

Procentul de

variaţie

Dintre populaţii

3

4,981

0.12069

24.92

Din interiorul

populaţiilor

40

14.182

0.36364

75.08

Total

43

19.163

0.48432

Pentru analiza de varianţă moleculară s-au luat în considerare 400 de loci polimorfici.

Analiza s-a realizat pe baza numărului de mutaţii dintre haplotipurile moleculare. Cele patru

populaţii de ciobăneşti româneşti au fost considerate ca fiind un singur grup. Analiza de

varianţă moleculară ne arată că 24,92% din totalul variaţiei moleculare este datorată

diversităţii inter-rasiale, iar restul de 75,08% se datorează diversităţii intra-rasiale (tabel 6).

Rezultate asemănătoare au fost obţinute şi de către alţi autori. Van Asch şi colab.

(2005) au obţinut în urma analizei AMOVA, pentru cele patru rase de câini portughezi luaţi în

studiu, un procent de variaţie inter-rasială de 32.80%, în timp ce variaţia intra-rasială a fost de

67,30%. Gökçek C. (2005) în cercetarea efectuată asupra raselor de câini ciobăneşti turceşti

Kangal şi Akbash a obţinut un procent de variaţie inter-rasială de aproximativ 17%, iar cel

pentru variaţia intra-rasială a fost de aproximativ 83%. Pires şi colab (2006) au efectuat

analiza AMOVA pe un eşantion de probe aparţinând la 8 rase de câini portughezi autohtoni,

obţinând un procent de aproximativ 20% pentru variaţia inter-rasială.

29

5.11 ARBORI FILOGENETICI

Arborii filogenetici construiţi pe baza analizei BLAST sunt arbori de referinţă. Aceşti

arbori prezintă asocierile filogenetice pe baza scorurilor obţinute la alinierea BLAST a

secvenţelor nucelotidice. Deoarece la întocmirea arborilor s-a utilizat doar câte o secvenţă

nucleotidică pentru fiecare rasă, aceşti arbori nu sunt decât orientativi în ceea ce priveşte

relaţiile filogenetice ale ciobăneştilor româneşti.

Dendrogramele din figurile 39, 40 şi 41 arată că secvenţele de ADNmt de la cele patru

rase de ciobăneşti româneşti s-au grupat în clustere, în funcţie de rasa din care fac parte

indivizii secvenţiaţi. Pentru fiecare rasă s-a format câte un cluster, ceea ce denotă o puternică

diversitate genetică între cele patru rase. Din gruparea apropiată a cladelor corespunzătoare

raselor Ciobănesc Carpatin şi Ciobănesc Corb se poate observa că secvenţele de ADNmt de la

aceste rase prezintă un grad mai scăzut de divergenţă între ele comparativ cu cele de la

celelalte două rase de ciobăneşti româneşti.

Secvenţele de la rasa Ciobănesc de Bucovina prezintă cel mai mic grad de diversitate

moleculară, astfel că din cele 11 secvenţe analizate, 8 sunt grupate sub formă de cluster

datorită diferenţelor nucleotidice foarte mici dintre secvenţe. Restul de trei secvenţe (CB13,

CB18 şi CB24) au prezentat o divergenţă nucleotidică mai mare faţă de restul şi s-au aranjat

separat de cluster.

La rasa Ciobănesc Mioritic, datorită diversităţii moleculare foarte mari, unele din

secvenţele nucelotidice (CM1, CM4 şi CM8) s-au grupat separat de clusterul rasei, fără a se

grupa însă împreună cu secvenţele de la celalte rase de ciobăneşti.

30

Fig. 18. Arbore filogenetic obţinut prin metoda „maximum likelihood” a secvenţelor

nucleotidice de la cele patru rase de ciobăneşti româneşti. Modelul de substituţie nucleotidică

utilizat este modelul Kimura cu 2 parametrii. Prescurtări: CB - Ciobănesc de Bucovina, CC -

Ciobănesc Carpatin, CO – Ciobănesc Corb, CM-Ciobănesc Mioritic

31

Figura 19. Arbore filogenetic fără rădăcină obţinut prin metoda UPGMA a secvenţelor

nucleotidice de la cele patru rase de ciobăneşti româneşti. Modelul de substituţie nucleotidică

utilizat este modelul Kimura cu 2 parametrii. Prescurtări: CB- Ciobănesc de Bucovina, CC -

Ciobănesc Carpatin, CO – Ciobănesc Corb, CM-Ciobănesc Mioritic

32

Figura 20. Arbore filogenetic al secvenţelor nucleotidice de la rasele de ciobăneşti

româneşti şi secvenţe nucleotidice de lupi. Dendrograma a fost construită după metoda

„neighbor joining”, pe baza modelului de substituţie Tamura – Nei. Prescurtări: CB-

Ciobănesc de Bucovina, CC - Ciobănesc Carpatin, CO – Ciobănesc Corb, CM-Ciobănesc

Mioritic; secvenţele de lupi sunt notate cu W

Arborele filogenetic al celor patru rase de ciobăneşti româneşti împreună cu secvenţele

de ADNmt de la lupi indică o mai mare apropiere genetică între rasa Ciobănesc Carpatin şi

lupul sălbatic. Secvenţele nucleotidice de la indivizi din rasele Ciobănesc de Bucovina,

33

Ciobănesc Corb şi Ciobănesc Mioritic prezintă o divergenţă nucleotidică mult mai mare faţă

de secvenţele lupilor decât cele de la indivizii Ciobăneşti Carpatini.

Figura 21. Arbore filogenetic de tip „neighbor-joining” rezultat în urma alinierii BLAST între

secvenţa nucleotidică a unui individ Ciobănesc de Bucovina şi secvenţele nucleotidice a altor

rase de talie mare

Figura 21 prezintă filogenia dintre secvenţa de ADNmt a unui Ciobănesc de

Bucovina şi secvenţele altor rase de câini de talie mare. Arborele a fost construit pe

baza secvenţelor nucleotidice existente în baza de date Genbank. Se poate observa că

cele mai apropiate rase, pe baza secvenţelor de ADNmt, cu rasa Ciobănesc de

Bucovina sunt rasele: Terra Nova, Mastiff Tibetan, urmate la o mai mare distanţă

genetică de rasele Bobtail, Ciobănesc German şi Ciobănesc Australian.

34

Figura 22. Arbore filogenetic de tip „neighbor-joining” rezultat în urma alinierii BLAST între

secvenţa nucleotidică a unui individ Ciobănesc Carpatin şi secvenţele nucleotidice a altor rase

de talie mare

Secvenţa nucleotidică de la individul de Ciobănesc Carpatin (fig. 22) prezintă o

divergenţă nucleotidică mai mare faţă de rasele analizate decât cea a individului din rasa

Ciobănesc de Bucovina, ceea ce face ca lungimea ramurii corespunzătoare acestei secvenţe să

fie mai lungă comparativ cu cea de la Ciobănescul de Bucovina. Cele mai asemănătoare rase,

din punct de vedere al secvenţelor de ADNmt analizate, cu rasa Ciobănesc Carpatin sunt

rasele: Mastiff Tibetan, Saint Bernard, Dog German şi Schnauzer.

35

Figura 23. Arbore filogenetic de tip „neighbor-joining” rezultat în urma alinierii BLAST între

secvenţa nucleotidică a unui individ Ciobănesc Mioritic şi secvenţele nucleotidice a altor rase

de talie mare

Arborele filogenetic rezultat între secvenţa de la un individ Ciobănesc Mioritic şi alte

secvenţe din baza de date Genbank ne arată o mai mare apropiere genetică (la nivel de

ADNmt) între această rasă şi rasele Walker Hound, Ciobănesc de Shetland şi Saint Bernard.

36

Figura 24. Arbore filogenetic de tip „neighbor-joining” rezultat în urma alinierii BLAST între

secvenţa nucleotidică a unui individ Ciobănesc Corb şi secvenţele nucleotidice a altor rase de

talie mare

Organizarea ramificaţiilor arborelui din figura 24 indică o distanţă genetică mare între

secvenţa de ADNmt a Ciobănescului Corb şi celelalte secvenţe. Cea mai asemănătoare

secvenţă aparţine unui individ din rasa Ciobănesc Australian, urmată de secvenţele de ADNmt

de la rasele Rottweiler, English Sheepdog şi Bobtail. La nivel fenotipic rasa Ciobănesc

Corb se aseamănă cu rasa Terra Nova, însă analiza BLAST ne arată că la nivel de

ADN mitocondrial aceste rase sunt diferite.

37

Fig 25. Arbore realizat prim metoda UPGMA rezultat în urma alinierii multiple ClustalW2

între secvenţele ciobăneştilor româneşti şi cele altor rase de câini. Modelul de substituţie a

nucleotidelor este modelul Kimura cu 2 parametrii

Deoarece ramurile arborelui din figura 25 corespunzătoare raselor Ciobănesc Mioritic

şi Ciobănesc Carpatin prezintă mai puţine noduri interne (puncte de divergenţă) şi au o

lungime mult mai mare, indică faptul că aceste rase şi-au păstrat caracterul ancestral, fapt ce

poate confirma istoricul de sute de ani al acestor rase. Secvenţa nucleotidică de la rasa

Ciobănesc Mioritic este cea mai apropiată de nodul ancestral (rădăcina arborelui), adică

prezintă cea mai mare asemănare genetică cu ancestorul ipotetic al raselor de câini din arbore.

Lungimea mare a ramurii corespunzătoare Ciobănescului Mioritic este datorată numărului

mare de substituţii nucleotidice dintre secvenţa corespunzătoare rasei şi restul secvenţelor.

Deasemenea, această distanţă este faţă de ancestorul ipotetic comun indică faptul că această

rasă şi-a păstrat caracterul ancestral, însă a evoluat la rândul său prin selecţie artificială

asemeni celorlalte rase de câini. Numărului mare de puncte de divergenţă şi distanţa genetică

mică dintre rasa Ciobănesc de Bucovina şi celelalte rase din dendrogramă arată că această

rasă este cea mai evoluată dintre rasele de Ciobăneşti Romăneşti.

38

CAPITOLUL VI. CONCLUZII

Analiza haplotipurilor observate la cele patru rase de ciobăneşti româneşti arată

că există o diversitate mare a haplotipurilor la rasele Ciobănesc Corb, Ciobănesc

Carpatin şi Ciobănesc Mioritic. La fiecare din cele trei populaţii s-a observat un număr

de şase haplotipuri. La rasa Ciobănesc de Bucovina s-au identificat doar trei

haplotipuri, dintre care haplotipul 1 a fost prezent la 8 din cei 11 indivizi analizaţi.

Haplotipul 3 a fost identificat la rasele Bucovina, Carpatin şi Corb, însă acest

haplotip pare să fie specific rasei Ciobănesc Carpatin deoarece 6 din cei 11 indivizi

prezintă acest haplotip. La rasele Bucovina şi Corb haplotipul 1 a fost identificat la

câte un individ din fiecare rasă.

Indicii de diversitate moleculară au atins cele mai mari valori la rasa Ciobănesc

Mioritic, urmată de rasa Ciobănesc Corb. Cea mai mică diversitate a fost raportată la

populaţia de Ciobănesc de Bucovina, această rasă fiind şi mai restricţionată geografic

comparativ cu celelalte rase româneşti.

Valorile distanţei genetice calculate pe baza indicelui de fixaţie arată că există

o diferenţiere genetică foarte mare între rasa Ciobănesc de Bucovina şi celelalte trei

rase de ciobăneşti româneşti, deoarece valoarea indicelui de fixaţie FST a fost mai mare

de 0,25 pentru fiecare din cele trei valori estimate. Între rasa Ciobănesc Carpatin şi

rasa Ciobănesc Mioritic există o diferenţiere genetică mare, valoarea FST fiind mai

mare de 0,15. Între rasa Ciobănesc Carpatin şi rasa Ciobănesc Corb există o

diferenţiere genetică moderată, valoarea indicelui FST fiind mai mică de 0,15. Aceeaşi

situaţie apare şi la distanţa dintre Ciobănescul Corb şi Ciobănescul Mioritic, la care

valoarea FST nu depăşeşte pragul de 0,15 (Hartl şi Clark, 1997).

Valorile distanţelor genetice ale lui Nei indică acelaşi nivel de diferenţiere

observat la calculul indicelui de fixaţie şi susţin rezultatele obţinute cu privire la

distanţa genetică dintre cele patru rase de ciobăneşti româneşti.

Atât indicii diversităţii moleculare, cât şi estimatele distanţelor genetice au

prezentat valori în concordanţă cu cele din literatura de specialitate pentru diferite rase

de câini.

39

Gruparea secvenţelor nucleotidice în clustere la fiecare rasă de ciobăneşti

româneşti, aşa cum se poate observa din analiza filogenetică, arată o diferenţiere

puternică între cele patru rase.

Între cele patru rase de câini ciobăneşti româneşti a existat (înaintea începerii

selecţiei în rasă curată) un schimb de gene, fapt observat la alinierea secvenţelor

nucleotidice (anumite mutaţii punctiforme sunt comune între rase), şi deasemenea din

aranjarea unora din secvenţele de la o rasă de ciobăneşti româneşti în cadrul clusterului

altei rase.

Analizele filogenetice şi distanţele genetice foarte mari (distanţa Nei şi indicele

de fixaţie) ne arată că avem de-a face cu patru rase de câini distincte, care prezintă

caracteristici fenotipice şi genetice specifice.

Caracteristicile la nivel molecular, distanţele filogenetice şi aspectul fenotipic al

câinilor ciobăneşti româneşti analizaţi în acest studiu ne arată că cele patru rase de

ciobăneşti româneşti prezintă diferenţe mai mult decât suficiente pentru a putea fi

considerate rase distincte.

40

Bibliografie selectivă

1. BRUFORD M.W., 2006. Mitochondrial DNA Sequence Variation in Portuguese Native

Dog Breeds: Diversity and Phylogenetic Affinities. Journal of Heredity

2006:97(4):318–330 doi:10.1093/jhered/esl006

2. BUD I. şi colab. 1998. Mic tratat de chinologie. Ed. Promedia Plus Cluj-Napoca.

3. ÇIGDEM GÖKÇEK, 2005. Mitochondrial dna (mtdna) sequence analyses of kangal

Dogs in turkey. Teză de dizertaţie.

4. COŞIER V., 2008. Inginerie genetică. Ed. Risoprint. Cluj-Napoca

5. EXCOFFIER, L. AND H.E. L. LISCHER, 2010. Arlequin suite ver 3.5: A new series of

programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows.

Molecular Ecology Resources. 10: 564-567.

6. IRION D.N, SCHAFFER A., FAMULA T., EGGLESTON M., HUGHES S., PEDERSEN N.

2003. Analysis of genetic variation in 28 dog breed populations with 100

microsatellite markers, in: Journal of Hereditary 94(1), 81-87

7. IVANOV S.V., POTAPOV V.A., FILIPENKO E.A., ROMASHCHENKO A.G. 1991.

Heterogeneity of the Canidae Bsp-repeats family: discovery of the EcoRI subfamily.

Genetika;27: 973–982.

8. KOSKINEN M. T., BREDBACKA P. Assessment of the population structure of five

Finnish dog breeds with microsatellites. Animal Genetics, 2000, 31, 310–317

9. LANDER, E.S., LINTON, L.M., BIRREN, B., NUSBAUM, C., ZODY, M.C., LINDBLAD-

TOH, K., WADE, C.M., MIKKELSEN, T.S., KARLSSON, E.K., JAFFE, D.B., KAMAL, M.,

CLAMP, M., CHANG, J.L., KULBOKAS III, E.J., ZODY, M.C., et al. 2001. Initial

sequencing and analysis of the human genome. Nature; 409:860–921.

10. LIBRADO, P. AND ROZAS, J. 2009. DnaSP v5: A software for comprehensive analysis

of DNA polymorphism data. Bioinformatics25: 1451-1452 | doi:

10.1093/bioinformatics/btp187.

11. LINDBLAD-TOH, K., WADE, C.M., MIKKELSEN, T.S., KARLSSON, E.K., JAFFE, D.B.,

KAMAL, M., CLAMP, M., CHANG, J.L., KULBOKAS III, E.J., ZODY, M.C., et al. 2005.

Genome sequence, comparative analysis and haplotype structure of the domestic

dog. Nature

41

12. NEI M., 1972. ”Genetic Distance between Populations,” In The American Naturalist,

Vol. 106, pp. 283-292, 1972.

13. OLSEN, J. (2000): Genetisk variation hos bedlingtonterrier i Danmark, Veterinary

Master Thesis, Department of Animal Genetics, Royal Veterinary and Agricultural

University, Copenhagen, Denmark

14. OSTRANDER E.A., COMSTOCK K.E. 2004. The domestic dog genome. CurrBiol

14:R98–9.

15. PIRES E.A., OURAGH L., KALBOUSSI M., MATOS J., PETRUCCI-FONSECA F.,BRUFORD

M.W. 2006. Mitochondrial DNA Sequence Variation in Portuguese Native Dog

Breeds: Diversity and Phylogenetic Affinities. Journal of Heredity 2006:97(4):318–

330 doi:10.1093/jhered/esl006

16. POTAPOV V.A.. SOLOV’EV V.V. ROMASHCHENKO A.G., SOSNOVTSEV S.V., IVANOV

S.V. Features of the structure and evolution of complex, tandemly organized Bsp-

repeats in the fox genome. I. Structure and internal organization of theBamHI-dimer.

MolBiol (Mosk) 1990;24:1649–1665.

17. PROSCHOWSKY H., OLSEN J.B., JEPSEN B., FREDHOLM M. (2002). Evaluation of the

present breeding programme against copper toxicosis in Danish Bedlington terriers.

in Animal Genetics 34, 142-145

18. RYONG NAM KIM, DAE-SOO KIM, SANG-HAENG CHOI, BYOUNG-HA YOON, ARAM

KANG, SEONG-HYEUK NAM, DONG-WOOK KIM, JONG-JOO KIM, JI-HONG HA,

ATSUSHI TOYODA, ASAO FUJIYAMA, AERI KIM, MIN-YOUNG KIM, KUN-HYANG

PARK, KANG SEON LEE AND HONG-SEOG PARK. 2012. Genome Analysis of the

Domestic Dog (Korean Jindo) by Massively Parallel Sequencing. DNA Res (2012) 19

(3): 275-288. doi: 10.1093/dnares/dss011 First published online: April 3, 2012

19. VLAIC A., 1997. Inginerie genetică. Realizări, speranţe şi nelinişti. Ed. Promedia Plus,

Cluj Napoca.

20. ZAJC I. & SAMPSON J. (1999). Utility of canine microsatellites in revealing the

relationships of pure bred dogs, in The American Genetic Association 90, 104-107

21. ZAJC I., MELLERSH C.S., SAMPSON J. Variability of canine microsatellites within and

between different dog breeds. Mamm Genome 1997;8:182–185.