Caracterizare Si Identificare Flavonoide

CONTRACT 52-117/2008

CERCETARI COMPLEXE PRIVIND STABILIREA DE MARKERI BIOCHIMICI SPECIFICI PENTRU PRODUSE LACTATE REGIONALE IN VEDEREA IMBUNATATIRII TRASABILITATII ACESTORA PE LANTUL ALIMENTAR TOTAL (TRASAREG)

RAPORT STIINTIFIC SI TEHNICETAPA II 15.12.2009

CONTRACT 52-117/2008 CERCETARI COMPLEXE PRIVIND STABILIREA DE MARKERI BIOCHIMICI SPECIFICI PENTRU PRODUSE LACTATE REGIONALE IN VEDEREA IMBUNATATIRII TRASABILITATII ACESTORA PE LANTUL ALIMENTAR TOTAL (TRASAREG)

RAPORT STIINTIFIC SI TEHNICETAPA II 15.12.2009 Cercetari preliminare privind elaborarea modelelor experimentale in vederea identificarii markerilor biochimici regionali care determina specificitatea regionala a laptelui.

Contract de finanare nr. 52-117/2008 TRASAREG

Faza de execuie nr. 2/15.12.2009/ PNII

CUPRINSCuprins................................................................................................................................................... Obiective generale ale proiectului si obiectivele etapei ........................................... ........................ Rezumatul etapei de execuie.................................................................................... ............................ Descrierea tiinific i tehnic.............................................................................................................. A. Activitate II.1.1. USAMV Bucuresti Model conceptual privind dezvoltarea metodelor de determinare a markerilor biochimici de tip carotenoide, flavonoide sau terpene n plante 1. Caracterizare generala a compusilor biochimici de tip carotenoide.......................................... 2. Metode de determinare a carotenoidelor 2.1 Etapa de extracie.................................................................................................................... 2.2. Saponificarea.. 2.3. Analiza cromatografic .. 2.4. Alte metode. 3. Caracterizare generala a compusilor biochimici de tip flavonoide 4. Metode de determinare a flavonoidelor. 4.1. Pregtirea probei. 4.2. Spectrometria de mas n analiza flavonoidelor. 4.3. Cromatografia de nalt performan pentru analiza flavonoidelor 4.4. Alte metode. 5. Caracterizare generala a compusilor biochimici de tip terpene. 6. Metode de determinare a terpenelor... 6.1. Extracia probei i concentrarea.. 6.2. Separarea cromatografic a constituienilor... 6.3. Detectarea i caracterizarea constituienilor... 7. Concluzii. B. Activitate II.1.2. ICDP Braov Stabilirea arealelor pastorale i a tehnicilor de valorificare a pajitilor; prelevarea i condiionarea probelor de nutreuri i de lapte din zona Blana Bucegi... 1. Rezumatul etapei 2. Prezentarea parcelelor experimentale din zona BCPM Blana Bucegi... 2.1. Faza I de utilizare a parcelelor experimentale din zona BCPM Blana Bucegi... 2.2. Faza a II-a de utilizare a parcelelor experimentale din zona BCPM Blana Bucegi 2.3. Faza a III-a de utilizare a parcelelor experimentale din zona BCPM Blana Bucegi. 2.4. Faza a IV-a de utilizare a parcelelor experimentale din zona BCPM Blana Bucegi.. 3. Rezultate obtinute in cadrul experimentarilor realizate la Baza de Cercetri Pajiti Montane (B.C.P.M.) Blana Bucegi... 3.1. Productia de substanta uscata................................................................. 3.2. Productia de lapte ...................................................................................... C. Activitate II.1.3. ICDCB Baloteti Elaborare model conceptual, adaptare metode de lucru, pregtirea cadrului experimental... 1. Rezumatul etapei 2. Descrierea tiinific i tehnic.. 3. Evaluarea strii de sntate a animalelor din loturi experimentale 3.1. Materiale si metode. 3.2. Rezultate i discuii. 4. ConcluziiCercetri complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale n vederea mbuntirii trasabilitii acestora pe lanul alimentar total

2 4 6 11 12 12 13 14 17 19 24 24 26 26 27 30 31 32 33 33 33 34 35 43 43 44 44 46 47 48 51 51 51 53 53 54 54 54 56 63

2



D. Activitate II.1.4. IBA Bucuresti Cercetri preliminare documentare privind metodica utilizat pentru selectarea i determinarea markerilor biochimici - Cercetri preliminare documentare privind dezvoltarea metodelor de determinare a markerilor biochimici (de tip flavonoizi sau carotenoizi sau terpene) n produsele lactate. Rezumatul etapei de execuie.................................................................................... ............................ 1. Caracterizarea general a markerilor biochimici de tip carotenoizi .................................................. 1.1 Introducere.............................................................................................................................. 1.2 Noiuni generale despre markerii biochimici de tip carotenoizi............................................. 1.3 Efectele procesrii asupra carotenoizilor................................................................................ 2. Identificarea markerilor biochimici in diverse tipuri de furaje......................................................... 2.1 Existena carotenoizilor n diverse tipuri de furaje................................................................ 3. Digestia, absorbia i metabolizarea carotenoizilor........................................................................... 3.1 Digestia, absorbia i metabolizarea carotenoizilor................................................................ 3.2 Influena factorilor endogeni i exogeni asupra variaiei concentraiei de markeri biochimici de tip carotenoizi n lapte...................................................................................... 3.3 Transferul carotenoizilor i retinolului din laptele materie prim n produsele lactate.......... 3.4 Influena dintre carotenoizii din lapte i proprietile senzoriale ale produselor lactate........ 4. Metode experimentale de determinare a markerilor biochimici........................................................ 4.1 Proceduri generale de analiz a carotenoizilor....................................................................... 4.2 Separarea cromatografic....................................................................................................... 4.3 Identificarea carotenoizilor..................................... ............................................................... Concluzii ............................................................................................................................................... Bibliografie............................................................................................................................................ E. Activitate II.1.5. IBNA Estimarea valorii nutritive a nutreurilor i elaborarea raiilor pentru vacile de lapte... 1. Rezumatul etapei. 2. Importana structurii raiei asupra digestiei ruminale i a produciei.. 3. Necesarul vacilor de lapte 3.1. Necesarul de energie............................................................................................................ 3.2. Necesarul de protein. ........................................ 3.3. Exprimarea valorii proteice a nutreurilor n PDI 3.4. Etapele de determinare a valorii nutritive energetice a silozului de porumb... 4. Concluzii Bibliografie

66 66 69 69 71 77 81 81 84 84 86 88 89 89 89 90 94 106 108 109 109 111 111 111 112 112 114 119 119 120

CONCLUZII...

Cercetri complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale n vederea mbuntirii trasabilitii acestora pe lanul alimentar total

3



OBIECTIVE GENERALE ALE PROIECTULUIEtapa 1: Elaborare model conceptual, adaptare metode de lucru, pregatirea cadrului experimental. Etapa 2: Cercetari preliminare privind elaborarea modelelor experimentale in vederea identificarii markerilor biochimici regionali care determina specificitatea regionala a laptelui. Etapa 3: Studierea comparativa a influentei markerilor biochimici din plante asupra caracteristicilor fizico-chimice si senzoriale a produselor lactate din diferite zone geografice Etapa 4: Integrarea i interpretarea rezultatelor. Transferul tehnologic al soluiilor propuse, promovarea rezultatelor. Identificarea si atribuirea drepturilor de proprietate intelectuala asupra rezultatelor. Intocmirea documentatiei pentru dobandirea protectiei unei indicatii geografice sau denumirea de origine a produselor lactate din regiunile luate in studiu.

OBIECTIVELE ETAPEI DE EXECUTIEObiectiv general al etapei 2/ 15.12.2009 Cercetri preliminare privind elaborarea modelelor experimentale n vederea identificrii markerilor biochimici regionali care determin specificitatea regional a laptelui.Activitate II.1

Cercetri preliminare documentare privind metodica utilizat pentru selectarea i determinarea markerilor biochimici.Activitate II.1.1. USAMV Bucuresti

Cercetari preliminare documentare privind dezvoltarea metodelor de determinare a markerilor biochimici (de tip flavonoizi sau carotenoizi sau terpene) n plante. Activitate II.1.2. ICDP Brasov Stabilirea arealelor pastorale i a tehnicilor de valorificare a pajitilor; Prelevarea i condiionarea probelor de nutreuri i de lapte din zona Blana Bucegi. Activitate II.1.3. ICDB Balotesti Evaluarea starii de sanatate a animalelor din loturi experimentale prin examene de profil metabolic in functie de modul de furajare (stabulatie/pasunat) Activitate II.1.4. IBACercetri complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale n vederea mbuntirii trasabilitii acestora pe lanul alimentar total

4



Cercetri preliminare documentare privind dezvoltarea metodelor de determinare a markerilor biochimici (de tip flavonoizi sau carotenoizi sau terpene) n produsele lactate. Activitate II.1.5. IBNA Estimarea valorii nutritive a nutreurilor i elaborarea raiilor pentru vacile de lapte.


5



REZUMATUL ETAPEI DE EXECUTIEPrezentul raport stiintific si tehnic prezinta rezultatele obtinute in cadrul etapei 2/termen de predare 15.12.2009, al carui obiectiv general are titlul Cercetri preliminare privind elaborarea modelelor experimentale n vederea identificrii markerilor biochimici regionali care determin specificitatea regional a laptelui. Rezultatele prezentate se refera la activitatile prezentate mai sus si realizate de catre partenerii consortiului din proiectul finantat prin contractul de finantare 52-117/ 1.10.2008. Prezentul raport este organizat in 5 parti (A,B,C,D,E) care corespund activitatilor prezentate in conformitate cu planul de realizare conform AA 2/2009 de catre partenerii din consortiul de realizare a proiectului. Studiul efectuat pentru aceast etap de raportare s-a concentrat pe identificarea referinelor bibliografice, legate de modele experimentale utilizate n identificarea markerilor biochimici regionali, care determin specificitatea produselor lactate, de la furaje la lapte i produse lactate, obinute din lapte de vac. In acest sens, s-a realizat un studiu de documentare privind caracterizarea, din punct de vedere biochimic, a markerilor biochimici de tip carotenoizi, analiza criteriilor de clasificare a tipurilor de carotenoizi i, nu n ultimul rnd, importana carotenoizilor n sntatea oamenilor. Aceste studii au fost realizate in cadrul parteneriatului, de catre USAMV Bucuresti pentru markerii biochimici din plante si IBA Bucuresti pentru markerii biochimici din produsele lactate. Datele bibliografice menioneaz c au fost identificai peste 600 de carotenoizi naturali i se poate estima c natura produce anual peste 100 de milioane de astfel de pigmeni. Cei mai rspndii pigmeni cu aceast structur sunt: fucoxantina (alge marine), luteina (plante ierboase), -carotenul, licopina, violaxantina i apocarotenoidele (compui cu mai puin de 40 de atomi de carbon n molecul). In plus, au fost analizate implicaiile carotenoizilor asupra produselor lactate, din punct de vedere nutriional i senzorial i faptul c pot fi considerai poteniali biomarkeri pentru managementului trasabilitii creterii animalelor, de la care se colecteaz laptele materie prim (ex. lapte de vac, lapte de oaie, lapte de capr, lapte de bivoli). Carotenoizii din laptele de vac sunt, n special, toi -carotenii trans, i la o concentraie mai mic, luteina. Carotenoizii determin culoarea portocalie la fructe i legume (exemplu: morcov, cartofi dulci i pepenele galben), la frunzele uscate i, n concentraie redus, determin nuanele de galben la alimente de origine animala precum smntn, unt i glbenu de ou. Culoarea produselor lactate depinde, n mare msur, de concentraia lor de carotenoizi, sugernd astfel c, culoarea poate fi o metod rapid i promitoare de msurare a trasabilitii condiiilor de hrnire. Managementul hrnirii vacilor de lapte permite un control eficient al concentraiei de carotenoizi i a culorii produselor lactate. Carotenoizii din plante sunt transferai n produsele animale, uneori n concentraie mai mare (exemplu n glbenuul de ou) sau n concentraie mai sczut, cum ar fi n produsele rumegtoarelor, unde modific culoarea laptelui, a produselorCercetri complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale n vederea mbuntirii trasabilitii acestora pe lanul alimentar total

6



lactate i a stratului adipos. Consumatorii sunt sensibili la culoarea produsului, dei preferinele difer de la ar la ar sau de la regiune la regiune. O culoare galben a laptelui este asociat cu punatul care, n multe ri europene, are conotaii de hran natural. Astfel, carotenoizii pot fi percepui ca indicatori ai punatului verde. Din punct de vedere al factorilor care afecteaz compoziia carotenoizilor n alimente, studiile arat c alimentele variaz, att calitativ ct i cantitativ, din punct de vedere al coninutului de carotenoizi. Proporiile relative ale acestor carotenoizi sunt destul de constante, dar concentraiile absolute variaz considerabil. Pot fi deosebite opt modele principale privind nivelele de carotenoizi n diferite resurse alimentare. S-a analizat in cadrul acestei etape stadiul cercetrilor privind existena carotenoizilor n diverse tipuri de furaje proaspete i conservate/ concentrate; diversitatea carotenoizilor n furaje i metodele de determinare disponibile si adecvate. n ciuda faptului c exist o mare varietate de carotenoizi n plante, n furaje nu se gsesc mai mult de 10, dintre care cei mai importani, din punct de vedere cantitativ, sunt -carotenii i luteina. Ca urmare a interesului limitat pentru coninutul de carotenoizi n dieta rumegtoarelor, analizele chimice sunt, de obicei, nespecifice i privesc carotenul, care este un amestec de mai multe molecule i izomeri. Au fost realizate o serie de experimente, n care s-a determinat concentraia de lutein sau xantofilii totali. Nu au fost determinate experimental alte molecule deoarece metodele de analiz nu au fost optimizate, fiind dezvoltate pentru alte matrici (cum ar fi laptele sau sngele) sau pentru alimentele oamenilor. Pn acum, metodele adecvate pentru furaje au inclus metode care necesitau un consum foarte mare de timp (folosind TLC [Thin Layer Chromatography- Cromatografie n strat subire]). In ultima perioad au fost puse la punct metode mult mai rapide, folosind HPLC (High Pressure Liquid Chromatography). Studiul a fost concentrat si pe aspecte legate de digestia, absorbia i metabolizarea carotenoizilor, procese deosebit de importante n stabilirea modelului conceptual de determinare a markerilor biochimici specifici pentru caracteristicile regionale a produselor lactate. Numeroase date arat faptul c exist o dependen a concentraiei de carotenoizi din laptele de vac fa de natura i cantitatea de suplimente dietetice, furnizate prin intermediul raiei de furaj, precum i prin transferul acestora din matricea vegetalelor ctre glandele mamare. Recuperarea sczut a carotenoizilor din lapte, relev eficiena puternic limitat a acestui transfer i se estimeaz c etapele diferite de transfer ale carotenoizilor, din hran n lapte, pot influena disponibilitatea acestora n glandele mamare. Prima etap n procesul de digestie al carotenoizilor l reprezint degradarea matricei vegetale, care elibereaz aceste substane n faza lichid a rumenului. Gradul de degradare al carotenoizilor n rumen, de ctre microorganisme, variaz n funcie de diferite rezultate obinute n modele experimentale in vitro sau in vivo, majoritatea n ceea ce privete -carotenul. Chiar dac unii autori nu au raportat nici o degradare a acestora, alii au raportat o degradare moderat sau o dispariie total a -carotenului. Starea suplimentelor de carotenoizi poate explica discrepanele dintre experimente, deoarece gradele de degradare au fost mai mari n situaiile n care carotenoizii au fost furnizai ca produse purificate fa de furnizarea lor sub form de furaje. In acest capitol a fost analizat i influena factorilor endogeni i exogeni asupra variaiei concentraiei de markeri biochimici de tip carotenoizi n lapte.Cercetri complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale n vederea mbuntirii trasabilitii acestora pe lanul alimentar total

7



Pentru evaluarea relaiei dintre condiiile de producere a laptelui i coninutul n componente de interes nutriional din brnz, este necesar s se cunoasc nivelul care determin variabilitatea compoziional a brnzei fa de cea a laptelui. Muli cercettori au demonstrat c, n afar de aspectele legate de coninutul de substan uscat din brnz, variabilitatea compoziional a acesteia n acizi grai, caroten, xantofile i vitamina E, depinde, n principal, de compoziia laptelui original. Compoziia laptelui original, n ceea ce privete acizii grai, vitaminele i carotenoizi, este puternic influenat de natura dietei animalului (compoziia biologic, stadiul de maturitate, modul de conservare etc.), de specia animalului, de ras, de modul de recoltare a laptelui i, bineneles, de stagiul de lactaie n care se afl animalul. Un alt obiectiv al acestei etape a fost studiul metodlore experimentale de determinare a markerilor biochimici (carotenoide sau flavonoide sau terpene). In acest sens au fost analizate o serie de metode de analiz i proceduri generale utilizate n identificarea calitativ i cantitativ a acestor tipuri de markeri biochimic. Pentru analiza lor pot fi utilizate diferite metode. Alegerea celei mai adecvate metode este, de obicei, determinat de tipul de informaii necesare a fi obtinute. n general, pentru determinare, acesti markeri biochimici trebuie extrasi naintea analizei, uneori chiar dintr-o matrice foarte complex. Cu toate acestea, este absolut necesar extracia eficient i respectarea tuturor protocoalelor analitice. In conformitate cu activitatile prevazute a se realize in cadrul acestei etape s-a urmarit aprecierii strii de sntate a vacilor de lapte, n strns legtur cu modul de furajare (stabulaie/punat). In aceste sens au fost efectuate teste hematologice i teste biochimice serice. Astfel, n perioada de stabulaie au fost prelevate i analizate 13 probe, iar n perioada de punatv14 probe. Probele au provenit de la vacile de lapte din lotul experimental din Biobaza ICDCB Baloteti. Screeningul hematologic a scos n eviden evoluia anemiei. Valorile sczute ale hematocritului pe toat durata anului au fost atribuite deficitului de aport al unor microelemente n materiile prime furajere folosite n ferm, de regul carenate n cupru, cobalt, seleniu. Acest lucru a fost susinut i prin rezultatul examenelor biochimice serice, care au evideniat nivele sczute ale concentraiei de magneziu, seleniu i cupru. Testele biochimice serice au indicat, de asemenea, creterea valorilor ureei serice n ambele perioade, fapt care a fost pus pe seama unui aport proteic ridicat n raie, n special pe baza furajelor concentrate. Totodat, aceasta a putut fi cauzat i de disfuncii renale fr exprimare clinic: excesul de protein a fost utilizat pe cale metabolic n scop energetic sau plastic, catabolizarea proteinelor fiind legat de o intensificare a ureogenezei. Valorile sczute ale glicemiei n perioada de stabulaie au indicat deficit energetic n raie. Valorile unor macrominerale serice au evideniat uoar hipocalcemie, dar i hipomagneziemie destul de serioas. Valorile macroelementelor serice analizate se coreleaz de altfel cu evoluia unor osteoartropatii. Deficitul de microelemente eseniale (seleniu i cupru) a caracterizat testele pe toat perioada investigat i sunt n strns legtur cu nivelul acestora n hran. Obiectivul principal al proiectului Cercetari complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale in vederea imbunatatirii trasabilitatii acestora pe lantul alimentar total esta acela de a gsii metodologii deCercetri complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale n vederea mbuntirii trasabilitii acestora pe lanul alimentar total

8



analiz care s serveasc la diferenierea produselor lactate regionale de alte produse similare. n cadrul acestui obiectiv generos, partenerul 2 al consortiului acestui proiect, ICDP BRASOV, i propune s participe la scoaterea in eviden a acelor caracteristici tehnologice i fizico-chimice care s conduc la ideea c laptele i produsele lactate obinute pe Platoul Munilor Bucegi pot fi considerate ca produse regionale (lapte de Bucegi, brnz de Bucegi, etc.), de o calitate i savoare deosebit. S-a ales ca areal de studiu platoul munilor Bucegi deoarece ICDP Braov deine aici o Baza pentru Cercetri Pajiti Montane situat ntre Vrfurile Blana (1875 m) i Nucet (1863 m). Baza de Cercetri Pajiti Montane (B.C.P.M.) Blana Bucegi este situat la 1800 m altitudine, pe un teren uor nclinat cu expoziie estic. Vegetaia primar a fost dominat de jneapn (Pinus mugo) i rarite de molid (Picea abies) dup a cror defriare s-a instalat o vegetaie ierboas dominat de Festuca nigrescens, F. ovina i Agrostis rupestris, care la rndul lor au fost invadate de specia nevaloroas Nardus stricta. Substratul litologic este format de conglomerate tipice de Bucegi. Solurile sunt brune acide i podzoluri, puternic debazificate, foarte srace n elemente fertilizante. Condiiile climatice sunt cele specifice etajului alpin inferior n care temperatura medie anuala a aerului este de 4,9C. Vntul bate cu viteze medii anuale de peste 6 metri/secund. Cantitatea de precipitaii czute n perioada de vegetaie (iunie septembrie) este n jur de 400 mm, iar cea anual este de aproximativ 1200 mm. La BCPM Blana Bucegi s-au iniiat iniiat cercetri privind valorificarea cu vaci de lapte a punilor subalpine n anul 1995 sub coordonarea domnului dr. ing. Teodor Maruca. Atunci au fost nfiinate si 5 parcele experimentale care au fost utilizate n mai multe faze de cercetare . De asemenea partenerul IBNA a estimat valoarea nutritiva a nutreurilor i a elaborat raii pentru vacile de lapte care sa asigure indeplinirea obiectivelor propuse. In urma studiului realizat s-au stabilit cateva criterii care vor fi luate in considerare la stabilirea acestor ratii. Pentru satisfacerea cerinelor nutriionale ale vacilor de lapte se impun urmtoarele: - cunoaterea normelor de hran: - norma de substan uscat (kg); - norma de energie net lapte (UNL); - norma de protein digestibil (PDIN i PDIE n g); - normele de macroelemente Ca, P, Mg, etc. (g); - normele de microelemente i vitamine (mg; UI); - capacitatea de ingerare a hranei (USV); - raportul dintre PDIE/UNL. - cunoaterea valorii nutritive a nutreurilor: - coninutul n substan uscat (g/kg SN); - coninutul n energie net lapte (UNL/kg SU); - coninutul n protein digestibil (PDIN i PDIE n g/kg SU); - coninutul n macroelemente Ca, P, Mg, etc. (g/kg SU); - coninutul n microelemente i vitamine (mg/kg SU sau UI/kg SU); - ingestibilitatea nutreului (USV/kg SU).Cercetri complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale n vederea mbuntirii trasabilitii acestora pe lanul alimentar total

9



- date despre animal: - greutatea potenial a vacii, G (kg); - producia potenial maxim zilnic de lapte PlM (kg/zi); - coninutul n grsime al laptelui GrL (%); - sptmna de lactaie n; - luna de gestaie ( se iau n consideraie numai lunile 8 i 9). Adresa de site a proiectului: http://www.monapopa.usamv.ro/TRASAREG.html


10



DESCRIEREA TIINIFIC I TEHNIC


11



A. Activitate II.1.1. USAMV Bucuresti Model conceptual privind dezvoltarea metodelor de determinare a markerilor biochimici de tip carotenoide, flavonoide sau terpene n plante.Metaboliii plantelor sunt ntlnii de obicei sub forma unui amestec complex de mai multe substane cu polaritate i hidrofobicitate diferite. Cele mai importante grupe de substane n materialul plantelor sunt mprite n: substane cu polaritate sczut (terpene), semi-polare (flavonoide, lipide) i polare (unele carotenoide, glicozide polare, proteine). 1. Caracterizare generala a compusilor biochimici de tip carotenoide Carotenoidele reprezint un grup de pigmeni naturali prezeni n fructe i legume, avnd culori de la galben la rou. Din punct de vedere chimic, carotenoidele sunt compui poliizoprenici i pot fi clasificate n dou clase principale [1]: a) carotene sau carotenoide care conin n structura lor doar atomi de carbon i hidrogen b) xantofile care sunt derivai hidrocarbonai oxigenai ce conin cel puin un atom de oxigen, precum grupri hidroxi, ceto, epoxi, metoxi sau carboxil. Caracteristica lor structural este sistemul de duble legturi conjugate, care influeneaz proprietile lor chimice, biochimice i fizice. n figura 1 sunt prezentate structurile unor carotenoide. Aceast clas de compui naturali este foarte rspndit n natur. Carotenoidele sunt sintetizate de ctre plante i multe microorganisme, deci animalele trebuie s le obin din alimente. Coninutul de carotenoide n fructe i vegetale depinde de mai muli factori precum, varietatea genetic, maturitate, depozitare, prelucrare i preparare. Interesul pentru studiul acestor compui este datorat funciilor lor fiziologice i biologice care au fost intens studiate i prezentate n detaliu de ctre van Berg i colab.[2]. Pe lng activitatea provitaminei A a unor carotenoide, acestea prezint i alte funcii, precum antioxidani i de intensificare a rspunsului imun. Studiile epidemiologice au indicat o asociere ntre consumul ridicat de vegetale i o reducere a riscului unor boli cronice degenerative, precum anumite tipuri de cancer, boli cardiovasculare [3, 4].


12



- caroten

OH luteina

HO OH zeaxantina

HO

O OH astaxantina

HO O

licopen

Figura 1. Structura chimic a unor carotenoide. 2. Metode de determinare a carotenoidelor n ceea ce privete analiza carotenoidelor, iniial, a fost folosit cromatografia cu coloan deschis la presiune atmosferic [5], dar aceast metod a necesitat cantiti mari de prob. Totui, Rodriguez-Amaya [6] a subliniat c utiliznd aceast tehnic, n ciuda dezavantajelor ei, o bun separare poate fi realizat pentru probele alimentare cu compoziie complex de carotenoide. Almeida-Muradin i colab. [7] au gsit rezultate similare cnd metodologia HPLC a fost comparat cu cea a cromatografiei cu coloan deschis pentru determinarea carotenoidelor cu activitatea provitaminei A din frunzele de sfecl, precum i din frunzele verzi ale unor plante. Odat cu dezvoltarea cromatografiei de lichide de nalt performan (HighPerformance Liquid-Chromatography HPLC), multe metode att cu faz normal, ct i cu faz invers au fost descrise pentru a separa xantofilele i carotenoidele. n analiza HPLC a carotenoidelor, cel mai utilizat detector este cel ultraviolet vizibil (UV-Vis) i, recent detectorul fotodiod (photodiode array detector DAD), care permite o colectare continu de date spectrofotometrice n timpul analizei [8]. Cnd este necesar o sensibilitate ridicat, detecia electrochimic reprezint o alternativ bun [9]. n matrici complexe, cnd DAD nu este suficient pentru identificare din cauza interferenelor spectrale, cromatografia de lichide cuplat cu spectrometria de mas reprezint o alternativ bun.Cercetri complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale n vederea mbuntirii trasabilitii acestora pe lanul alimentar total

13



2.1. Etapa de extracie 2.1.1. Extracia lichid lichid a carotenoidelor Datorit structurii complexe a carotenoidelor i a varietii mari a acestor compui prezeni n vegetale i fructe, nu exist o metod de referin pentru analiza lor. Numeroi solveni organici precum acetona [10, 11], tetrahidrofuran (THF) [12], n-hexan [13], pentan [14], etanol (EtOH) [15], metanol (MeOH) [16], cloroform [9], precum i amestecuri de solveni, precum diclormetan (DCM) : MeOH (6:1, v/v) [17], aceton : eter de petrol (50:50, v/v) [18], THF : MeOH (1:1, v/v) [8], [19], [20], n-hexan : toluen (5:4, v/v) [21], n-hexan : aceton (6:4, v/v) [22], 2-propanol : DCM (2 :1, v/v) [23], n-hexan : acetat de etil (85 : 15, v/v) [24] au fost mult utilizai. Astfel, Taungbodhitham i colab. [25] au evaluat 6 combinaii diferite de solvent: aceton : hexan (4:6, v/v), EtOH : hexane (4:3, v/v), cloroform : MeOH (2:1, v/v), DCM : MeOH (2:1, v/v), hexan : izopropanol (3:2, v/v) i aceton : eter de petrol (50:50, v/v) pentru a extrage licopen i - i -caroten din sucul de roii conservat, i cele mai bune recuperri au fost obinute cu amestecul EtOH : hexan. Rezultate similare au fost gsite de ctre Lin i Chen [26] care au utilizat 5 sisteme de solveni, EtOH : hexan (4:3, v/v), aceton : hexan (3:5, v/v), EtOH : aceton : hexan (2:1:3, v/v/v), acetat de etil : hexan (1:1, v/v) i acetat de etil (100%), pentru a compara eficiena extraciei carotenoidelor din sucul de roii. Ei au concluzionat c extracia cu eficiena cea mai bun a fost realizat cu amestecul EtOH : hexan (4:3, v/v). Deli i colab. [27] au folosit MeOH urmat de dietil eter pentru a extrage carotenoidele din ardei (Capsicum annuum var. lycopersiciforme rubrum). Gandul-Rojas i colab. [13] au extras clorofilele i xantofilele libere i monoesterificate cu dimetilformamid i carotenoidele cu hexan din msline. O metod pentru determinarea izomerilor lutein i zeaxantin din cri (Tagetes erecta) utiliznd ca solvent de extracie hexan i eter de etil fost raportat de Hadden i colab. [28]. Ali autori [29], au utilizat un amestec mai complex, hexan : aceton : EtOH pentru a extrage majoritatea carotenoidelor din sucul de portocale. Un amestec de THF : MeOH a fost ales de Murkovic i colab. [19] pentru a izola - i -caroten i luteina din dovleac (Cucurbita pepo, C. maxima i C. moschata). Rozzi i colab. [9] au raportat o metod pentru a determina licopen, - i -caroten, -, - i tocoferol din coaja i seminele de roii folosind cloroform ca solvent de extracie. n ciuda faptului c THF i eterul de etil au fost larg utilizai datorit solubilitii ridicate pe care carotenoidele o prezint n acestea, unii cercettori [14Error! Bookmark not defined.] au atras atenia asupra faptului c aceti solveni pot forma peroxizi care pot degrada rapid -carotenul, contribuind la formarea de compui secundari. De aceea este recomandat adugarea de antioxidani, precum butilatul de hidroxitoluen (BHT) n solvent. Trebuie evitat utilizarea antioxidanilor puternici care pot contribui la autooxidarea -carotenulului. Extracia -carotenoidelor trebuie realizat foarte rapid, evitnd expunerea la lumin, oxigen, temperaturi ridicate i la metale prooxidante (precum fier, cupru) pentru a minimiza autooxidarea i izomerizarea cis-trans [2]. Mai mult, pentru a preveni pierderile de carotenoide n timpul procedurii de extracie, adugarea de antioxidani, precum acid ascorbic, pirogalol este recomandat [30]. Urmtoarea etap din cadrul procedurii de extracie este omogenizarea amestecului i separarea extractului de carotenoide rezultat. Acest proces trebuie repetatCercetri complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale n vederea mbuntirii trasabilitii acestora pe lanul alimentar total

14



pn ce filtartul este incolor. Filtratul este concentrat, i carotenoidele sunt separate ntrun solvent organic corespunztor i ap. Faza organic este ndeprtat i evaporat; n timpul evaporrii nu este recomandat atingerea unor temperaturi de peste 400C, pentru a evita degradarea, i n final reziduul este dizolvat ntr-o cantitate corespunztoare de solvent [26], [30]. 2.1.2. Extracia cu fluide supercritice (SFE) SFE este folosit ca o metod alternativ la extracia tradiional lichid lichid pentru izolarea carotenoidelor din probe alimentare, deoarece aceast metod prezint cteva avantaje. De exemplu, viteza mai mare n extracie, etapa de evaporare nu este necesar, i dioxidul de carbon nu este toxic, costul lui este sczut, este neinflamabil i acceptabil din punct de vedere al mediului [31]. n plus, CO2 prezint o temperatur critic joas (310C), fiind astfel ideal pentru extracia compuilor instabili termic. Totui, CO2 prezint o polaritate sczut, ceea ce determin ca extracia compuilor polari s fie foarte greu de realizat. Aceast limitare poate fi rezolvat prin adugarea unui modificator organic, precum MeOH sau EtOH, n scopul creterii puterii lui de solvatare [32]. n ceea ce privete prelucrarea probei, unii cercettori au raportat c ndeprtarea apei din materialele vegetale faciliteaz SFE i probele omogenizate sunt extrase mult mai rapid datorit micorrii dimensiunii particulelor [14]. Gomez-Prieto i colab. [33] au extras all-trans-licopen din roii folosind CO2 fr modificator. Ei au studiat efectul densitii CO2 fluid asupra randamentului de extracie, realiznd mai multe extracii la diferite densiti (0,25, 0,35, 0,45, 0,55, 0,60, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85 i 0.90 g/mL). Rezultatele cele mai bune au fost obinute pentru 0,9 g/mL. O comparaie ntre extracia Soxhlet utiliznd n-hexan i EtOH ca solveni i SFE pentru determinarea clorofilelor i carotenoidelor din maghiran (Origanum marojana L.) a fost prezentat de Vagi i colab. [31]. Trei temperaturi diferite (40, 50 i 600C) i trei presiuni diferite (100, 250 i 400 bar) au fost testate; condiiile optime pentru extracie observate fiind 500C i 450 bar. n plus, cantitatea de -caroten extras cu EtOH a fost jumtate din cantitatea obinut cu fluide supercritice. Ferreira de Franca i colab. [34] au aplicat SFE pentru a determina lipidele i carotenoidele din fructele unei specii de palmier ce crete n zonele tropicale (Mauritia flexuosa). A fost studiat efectul presiunii i temperaturii, condiiile optime finnd 200 bar i 39,90C. Intr-un alt studiu, realizat de Baysal i colab. [35] cteva condiii de extracie, precum temperatura extractorului (35, 45, 55 i 650C) presiunea fluidului de extracie (200, 250 i 300 bar), adugarea de cosolvent (5%, 10% i 15% EtOH), timpul de extracie (1, 2 i 3 ore) i debitul CO2 (2, 4 i 8 kg/h) au fost optimizate pentru determinarea licopenului i -carotenului din reziduul rezultat la fabricarea pastei de roii. Rezultatele au demonstrat c temperatura cea mai mare folosit pentru extracie a condus la un randament de extracie maxim; totui, autorii au atras atenia asupra faptului c, temperaturi mai mari de 650C ar determina un randament de extracie mai bun, dar aceasta ar putea cauza degradarea carotenului. Nu au fost observate diferene semnificative n ceea ce privete randamentul de extracie al licopenului i -carotenului, atunci cnd presiunea a fost modificat de la 200 la 300 bar. Ali autori [31] au artat c presiuni de extracie mai mari de 400 bar pot determina randamente mai mari. n ceea ce privete timpul de extracie i debitul, randamentul cel mai bun a fost obinut pentru un timp de extracie de 2 ore. S-a observatCercetri complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale n vederea mbuntirii trasabilitii acestora pe lanul alimentar total

15



c o or nu este suficient pentru extracia carotenoidelor, iar la 3 ore procesul de degradare crete. Debitul optim att pentru licopen, ct i pentru -caroten a fost 4 kg/h. Adugarea de 5% EtOH drept cosolvent a mbuntit recuperrile celor dou carotenoide. Recent, diferite temperaturi i presiuni de extracie au fost testate de Rozzi i colab. [9] pentru a determina licopenul din produsele secundare rezultate n urma procesrii tomatelor. Rezultatele au indicat c recuperarea maxim este realizat la 860C i 345 bar. Barth i colab. [22] au comparat extracia clasic cu solvent i SFE pentru determinarea carotenoidelor din morcov (Daucus carota L.). Ei au observat c activitatea provitaminei A a fost cu 7% mai mare cu SFE dect n probele extrase cu solveni. O metod pentru separarea selectiv a izomerilor -carotenului din alga Dunaliella bardawil a fost cercetat de Gamlieli-Bonshtein i colab. [36]. Separarea izomerilor a fost posibil datorit vitezei lor de dizolvare diferit n CO2 supercritic. Civa modificatori ai CO2 (ap, EtOH, clorur de metilen, hexan) au fost testai pentru a mbuntii eficiena extraciei - i -carotenului din diferite vegetale [14Error! Bookmark not defined.]. Adugarea de hexan nu a contribuit semnificativ la creterea solubilitii -carotenului n CO2 supercritic. n cazul clorurii de metilen, solubilitatea carotenului crete, dar ea provoac degradarea -carotenului. n final, dei -carotenul a fost mai puin solubil n EtOH dect n hexan, cnd EtOH a fost adugat drept modificator, solubilitatea -carotenului n CO2 a crescut semnificativ [14]. Mendes i colab. [37] au raportat metoda extraciei supercritice cu CO2 a compuilor cu importan farmaceutic din microalge. Cantaxantina i astaxantina au fost extrase din Chlorella vulgaris. Mai multe condiii de presiune i temperatur au fost comparate i rezultatele cele mai bune au fost obinute la 275 i 350 bar i 550C. -carotenul produs de Dunaliella salina a fost un amestec de izomeri cis i trans, izomerul cis fiind mult mai solubil dect izomerul trans n CO2 supercritic. Condiiile optime pentru extracia celor doi izomeri au fost ndeplinite la 300 bar i 400C. n tabelul 1 sunt prezentate cteva exemple de condiii ale extraciei cu fluide supercritice n analiza carotenoidelor. Tabelul 1 Exemple de condiii ale extraciei cu fluide supercritice utilizate n analiza carotenoidelor.Proba Roii [33] Semine de roii [9] Alga Dunaliella bardawil [36] Reziduuri de la pasta de roii [35] Analit All-trans-licopen Fluid supercritic CO2 fr modificator Condiii SFE (temperatur, presiune, debit) T=40 0C p=281 bar D=4 mL/min T=86 0C p=345 bar D=2.5 mL/min T=40 0C p=448 bar D=0.5-1 mL/min T=55 0C (licopen) T=65 0C (, -caroten) p=300 bar D=4 kg/h

Licopen, -caroten, - CO2 fr tocoferol, -tocoferol, - modificator tocoferol Izomeri geometrici ai - CO2 fr carotenului modificator Licopen, -caroten CO2 i 5% EtOH ca modificator


16



Proba Vegetale(morcovi, rapi,varz, broccoli, mutar, dovlecel) [14Error! Bookmark not defined.] Alga Spirulina Pacifica [32Error! Bookmark not defined.] Morcovi (Daucus carota L.) [38]

Analit -caroten, -caroten

Fluid supercritic CO2 i EtOH ca modificator

Condiii SFE (temperatur, presiune, debit) T=40 0C p=342 bar D=1.5 mL/min

-caroten, -criptoxantina, CO2 i 15% EtOH -zeaxantina ca modificator

-caroten, -caroten,

CO2 i 5% cloroform ca modificator

T=80 0C (zeaxantina) T=760C (-criptoxantina) T=60 0C (-caroten) p=350 bar D=2 mL/min T=40 0C p=606 bar D=1 mL/min

2.2. Saponificarea naintea analizei HPLC, procedura de saponificarea este de obicei utilizat ca etap n simplificarea separrii prin ndeprtarea substanelor, precum clorofile i lipide, care ar putea interfera cu detecia cromatografic. Mai mult, prin procesul de saponificare, pot fi obinute informaii utile despre natura i distribuia carotenelor prezente n prob prin evaluarea profilului lor cromatografic nainte i dup tratamentul alcalin [39]. Totui, o pierdere a coninutului total de carotenoide a fost prezentat n literatur [40]. Fernandez i colab. [41] au comparat efectele saponificrii alcaline i hidrolizei enzimatice asupra concentraiei totale de carotenoide din uleiul de palmier din Costa Rica. Rezultatele au artat o concentraie mai mare a carotenoidelor utiliznd hidroliza enzimatic. Compuii cei mai sensibili la tratamentele alcaline sunt xantofilele, n special epoxicarotenoidele. De aceea, daca proba ce urmeaz a fi analizat conine aceti pigmeni n compoziie, aceast etap de purificare ar trebui s fie evitat. Ca o regul general, pentru probele cu coninut sczut de grsime, trebuie s fie aplicate condiii mai blnde n etapa de saponificare, i pentru probele cu coninut ridicat de grsimi trebuie utilizate condiii mai severe [39]. Totui, saponificarea ar trebui utilizat pentru a estima prezena esterilor carotenoidici care altfel pot fi nedetectai. n tabelul 2 sunt prezentate diferite condiii de saponificare aplicate pentru diverse probe. Tabelul 2 Diferite condiii de saponificare utilizate n analiza carotenoidelorProba Suc de portocale [29] Analit Neoxantina, violaxantina, luteoxantina, anteraxantina, mutatoxantina, luteina, izoluteina, zeaxantina, - i criptoxantina, licopen, -, - i -caroten Luteina, zeaxantina, licopen, criptoxantina, -- i -caroten Condiii de saponificare 10% sol. metanolic de KOH (peste noapte, temperatura camerei, ntuneric) sol. saturat de KOH (sub atmosfer de azot, 30 min, ntuneric)

Legume crude i preparate (lptuca, fasole verde, sparanghel, sfecl, ardei, spanac, roii, morcovi, varz, castravete, dovlecel, cartof, ceap, conopid) [40]


17



Proba Vegetale sbatice comestibile (Urtica dioica L.) [42] Ulei de msline [24 Cereale [15] Legume proaspete i prelucrate (broccoli, morcovi, fasole verde) [43] Cartofi dulci (Ipomoea batatas L.) [44] Alimente fortificate (cereale pentru micul dejun, unt de arahide, margarin) [45] Varz (Brassica oleracea var. Acephala cv. Vates) [21]

Analit Luteina i izomeri, -caroten i izomeri, neoxantina, violaxantina, licopen, -tocoferol, -caroten Luteina, zeaxantina, criptoxantina Trans--caroten -caroten, -caroten Acetat de -tocoferol, palmitat de retinil, -caroten Luteina, -caroten, retinol, filochinona

Condiii de saponificare sol. metanolic de KOH (temperatura camerei) sol. etanolic de KOH (sub atmosfer de azot, 30 min, 700C) 80% sol. etanolic de KOH (n baie de ap la punctul de fierbere, 10 min) 100% sol. etanolic de KOH (30 min, 700C) 10% etanol:ap (50:50, v/v) 1 or, 800C 60% sol. apoas de KOH coninnd pirogalol ca antioxidant (sub atmosfer de azot, 30 min, 700C) 80% sol. apoas de KOH (15 min, 700C)

Dup etapa de saponificare, carotenoidele sunt extrase cu eter de etil, dietil eter [46], n-hexan [43], clorur de metilen [16], eter de petrol [47] sau amestecuri, precum nhexan : eter de etil (70:30, v/v) [48], dietil eter : eter de petrol (1:1, v/v) [30], n-hexan : acetat de etil (85:15, v/v) [24], n-hexan : toluen [21] i apoi, extractul este splat pn cnd KOH este ndeprtat. Khachik i colab. [49] au observat o pierdere important n coninutul de xantofile din broccoli dup aplicarea unui tratament cu 30% hidroxid de potasiu metanolic sub atmosfer de azot la temperatura camerei timp de 3 ore. Contrar, pierderea de carotene nu a fost semnificativ. Ye i colab. [45] au raportat c metoda extraciei directe cu solvent reprezint o tehnic alternativ saponificrii n analiza vitaminelor i -carotenului din diferite alimente fortifiate. Hart i Scoot [47] au determinat coninutul de carotenoide din legumele i fructele consumate n mod obinuit n Marea Britanie. Urmtoarea procedur de saponificare a extractului de carotenoide a fost aplicat pentru fructe i unele legume, precum ardei: 10% hidroxid de potasiu metanolic sub atmosfer de azot, la ntuneric timp de o or la temperatura camerei. Unii cercettori au observat o extracie mai bun a carotenoidelor cnd sunt utilizate temperaturi ridicate n etapa de saponificare, dar n ceea ce privete coninutul de xantofile [50]. Procedurile de extracie lichid descrise n literatur necesit timp ndelungat i implic utilizarea de cantiti mari de solveni organici volatili, care au impact negativ asupra mediului i asupra sntii umane. De aceea, interesul n dezvoltarea de noi metode pentru extracia carotenoidelor este n continu cretere. Fish i colab. au dezvoltat [51] o metod pentru determinarea cantitativ a licopenului care utilizeaz cantiti reduse de solveni organici.Cercetri complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale n vederea mbuntirii trasabilitii acestora pe lanul alimentar total

18



2.3. Analiza cromatografic Numeroase metode pentru determinarea carotenoidelor din probe vegetale i nu numai au fost prezentate n literatur. Unele exemple recent publicate sunt prezentate n continuare. Lin i Chen [26] au dezvoltat o metod pentru a determina diferite carotenoide prezente n sucul de roii, incluznd all-trans-luteina, all-trans--caroten, all-translicopen i cei 13 cis-izomeri ai lor. Separarea a fost realizat utiliznd o coloan C30 (250 mm x 4,6 mm diametru interior, 5 m dimensiunea particulelor) i un gradient a doi elueni, (A) acetonitril (ACN) : 1-butanol (70:30, v/v) i (B) clorur de metilen. Analiza a fost complet n 55 de minute la un debit de 2 mL/min i lungimea de und a fost setat la 476 nm. Metoda HPLC pentru determinarea clorofilelor, carotenoidelor i derivailor lor n unele legume proaspete i prelucrate a fost descris de Gokmen i colab. [52]. O coloan C8 MikroPak din oel inoxidabil (150 mm x 4,6 mm diametru interior, 5 m dimensiunea particulelor) i un amestec de MeOH : ap ca faz mobil la un debit de 0,75 mL/min a fost folosit. Cromatogramele au fost nregistrate simultan la 432, 450, 470, 652 i 666 nm folosind DAD. Un amestec cuaternar de MeOH : ACN : clorur de metilen : ap (50:30:15:5, v/v/v/v) coninnd 0,1% BHT ca antioxidant i 0,1% TEA ca modificator, i o coloan C18 Kromasil (250 mm x 4,6 mm diametru interior, 5 m dimensiunea particulelor) a fost folosit de Melendez i colab. [16] pentru a analiza profilul carotenoidelor din sucul de portocale congelat. O lungime de und mai specific de 486 nm a fost selectat i un debit de 2,5 mL/min. Carotenoidele au fost identificate prin comparaie cu spectrele standardelor obinute cu un DAD de la 350 la 800 nm. O alt metod pentru determinarea pigmenilor clorofilici i carotenoidici din mazrea prelucrat (Pisum sativum L.) a fost propus de Edelenbos i colab. [10]. Un gradient de solvent binar constnd din (A) MeOH : ap (80:20, v/v) i (B) 100% acetat de etil la un debit de 1 mL/min a fost folosit ca faz mobil. Separrile au fost realizate pe o coloan LiChrospher 100 RP-18 (244 mm x 4 mm diametru interior, 5 m dimensiunea particulelor) i temperatura a fost meninut la 300C. Cromatogramele au fost nregistrate la 440 nm cu un detector DAD i spectrele de absorbie ale carotenoidelor i clorofilelor au fost nregistrate ntre 300 i 600 nm. Recent, Gomez-Prieto i colab. [33] au realizat o separare optim a urmtoarelor carotenoide: fitoen, fitofluen, -caroten i licopen, precum i a izomerilor all-translicopen din probele de roii. Un gradient liniar din eluenii (A) MeOH : ap (96:4, v/v) i (B) metil-ter-butil eter (MTBE) a fost folosit i debitul a fost setat la 1 mL/min. O coloan C30 Develosil UG (250 mm x 4,6 mm diametru interior) meninut la 200C a fost utilizat i -apocarotenal a fost folosit ca standard intern. Pentru a determina diferite carotenoide, n aceeai injectare, au fost selectate 4 lungimi de und (285, 347, 450 i 472 nm). Vagi i colab. [31] au dezvoltat o metod HPLC izocrat i cu faz invers pentru a detrmina clorofilele i carotenoidele din maghiran (Origanum majorana L.). n acest sudiu, s-a utilizat o coloan C18 Nucleosil 5 din oel inoxidabil (250 mm x 4 mm diametru interior) i ca faz mobil amestecul ACN : MeOH : alcoolizopropilic (39:43:18, v/v/v) la un debit de 0,9 mL/min. Cromatogramele au fost nregistrate la lungimea de und de 430 nm.Cercetri complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale n vederea mbuntirii trasabilitii acestora pe lanul alimentar total

19



Analiza xantofilelor din cereale utiliznd un sistem de gradient din doi elueni (A) MeOH : MTBE : ap (81:15:4, v/v/v) i (B) MeOH : MTBE (9:91, v/v) i o coloan C30 (250 mm x 4,6 mm) a fost descriz de Moros i colab. [Error! Bookmark not defined.]. Debitul a fost 1 mL/min i cromatogramele au fost monitorizate la 450 i 445 nm utiliznd detectorul DAD. Dou coloane cu faz normal i una cu faz invers au fost folosite pentru a analiza carotenoidele din extractul de obinut de la florile de cri (Tagetes erecta) [28]. O coloan Zorbax SIL 5 m (250 mm x 4,6 mm diametru interior) i n-hexan : acetat de etil (75:25, v/v) ca faz mobil la un debit de 2 mL/min a fost utilizat pentru a separa all-trans-luteina, izomerii cis ai luteinei, precum i all-trans-zeaxantina. Cellalt sistem cu faz normal a inclus o coloan Cyclobond 5 m (250 mm x 4,6 mm diametru interior) cu n-hexan : acetat de etil (87:13, v/v) ca faz mobil i un debit de 2 mL/min a fost utilizat pentru a identifica all-trans i cis izomerii luteinei i all-trans-zeaxantina. Cu ajutorul cromatografiei cu faz invers, o separare mai complet a cis izomerilor luteinei a fost realizat. A fost utilizat o coloan silica C30 YMC S3-SIL200 3 m cu o faz mobil constnd din 3% MTBE n MeOH la un debit de 1 mL/min. All-trans-luteina, izomerii 9- i 9-cis-luteina, izomerii 13- i 13-cis-luteina i all-trans-zeaxantina au fost identificai. n toate cazurile, carotenoidele au fost detectate la 450 nm. ntr-un studiu realizat de Lee i colab. [29], mai mult de 25 de carotenoide dintr-o prob de portocal dulce (Earlygold) au fost separate n 40 minute utiliznd un gradient de eluie ternar constnd din: eluent (A) ACN : MeOH (75:25, v/v), eluent (B) 100% MTBE i eluent (C) ap coninnd 0,01% BHT i 0.05% TEA la un debit de 1 mL/min. Separarea a fost realizat pe o coloan C30 (150 mm x 4,6 mm diametru interior) meninut la 250C. ntr-un alt experiment descris de Lee, aceleai condiii au fost aplicate pentru identificarea a 29 de carotenoide n sucul obinut dintr-un alt tip de portocal (Red Navel orange Cara Cara). Carotenoidele au fost detectate la 450 nm. A fost dezvoltat o metod pentru a difernia citricele din portocal, mandarin i amestec pe baza profilului lor carotenoidic. Un sistem de eluie compus din MeOH, ap i MTBE i o coloan C30 (25 cm x 4,6 mm diametru interior, 5 m) a fost utilizat pentru separare. Analiza a fost complet n 50 minute, la un debit de 1 mL/min. Pentru a maximiza absorbana n domeniul rou/portocaliu din spectrul vizibil, a fost selectat o lungime de und de 486 nm [46]. 2.3.1. Cromatografia de lichide de nalt performan Analiza carotenoidelor din alimente este n principal realizat prin HPLC. Separrile cu faz invers [9], [11], [15], [20], [27], [32], [33], [53], au fost des utilizate n determinarea acestor compui, dei cteva metode cu faz normal [54] au fost de asemenea prezentate n literatur. Ambele sisteme izocratic [36], [55] i gradient de eluie au fost utilizate. n general, prin utilizarea metodelor cu gradient de solvent rezoluia obinut este mai bun dect n cazul sistemelor izocratice. Totui, prima metod prezint unele dezavantaje, precum timpul de analiz mai mare deoarece este necesar reechilibrarea coloanei dup fiecare injectare, ceea ce reprezint o problem seroas pentru analiza de rutin [16].


20



2.3.1.1. Faza mobil ACN, MeOH sau amestecurile din aceti solveni sunt constituenii majoritari ai fazei mobile utilizate n analiza carotenoidelor. Pentru a optimiza separarea unor carotenoide (de exemplu izomerii geometrici), faza mobil este de obicei modificat prin adugarea unor cantiti mici din alt solvent organic [2]; de exemplu: DCM [19], [56], ap [52], [55], n-hexan [57], [58], aceton [54], cloroform [8], THF [12], [35], [59], propanol [9], [20], [31], acetat de etil [10], [28], clorur de metilen [16], [22] sau diferii eteri [15], [33], [60]. MeOH a fost recomandat n diferite lucrri [61] deoarece furnizeaz o recuperare mai bun dect ACN sau solvenii pe baz de ACN. n acelai mod, THF a asigurat o recuperare uor mai mare dect acetatul de etil [62]. Utilizarea cloroformului trebuie evitat pe ct de mult posibil din cauza toxicitii ridicate; n plus, solvenii clorurai sunt asociai cu pierderile de carotenoide. Antioxidanii, precum acidul ascorbic sau BHT [8], [16], [47], sunt de obicei adugai n faza mobil pentru a o stabiliza. Gueguen i colab. [63] au observat o scdere a coninutului de carotenoide n timp cnd acidul ascorbic a fost adugat fazei mobile. Contrar, n soluii standard, BHT a protejat eficient carotenoidele de procesele de degradare. Carotenoidele sunt susceptibile la oxidare i pot suferi degradri n coloan. Diferite studii [8], [47], au demonstrat c adugarea de solveni modificatori, de exemplu TEA sau acetat de amoniu, n faza mobil reduce pierderile sau degradarea. TEA acioneaz ca un modificator puternic, i micoreaz timpul de retenie. Totui, a fot testat c la concentraii n jur de 0,05% nu modific semnificativ timpul de eluie, i o separare bun poate fi realizat [47]. Huck i colab. [8] au investigat factorii de selectivitate pentru lutein/zeaxantin i zeaxantin/-caroten pentru evaluarea unor sisteme diferite de faz mobil. O faz mobuil cuaternar ACN : MeOH (coninnd 0,05% TEA i 0,05 M acetat de amoniu) : cloroform : n-heptan a fost dezvoltat pentru a mbuntii recuperarea i separarea carotenoidelor. 2.3.1.2. Tipurile de coloane HPLC cu faz invers este larg utilizat pentru a separa carotenoidele din diverse probe. Coloanele C8 [52] i mai ales C18 [8], [11], [12], [19], [27], [48], [64], [65], [66], [67], au fost deseori selectate de cercettori pentru a efectua analize. Epler i colab. [61] au comparat 65 de coloane cromatografice cu faz invers pentru a determina selectivitatea i recuperarea unui amestec din urmtoarele carotenoide: luteina, zeaxantina, -criptoxantina, licopen, - i -caroten utiliznd ACN i MeOH modificat cu THF sau acetat de etil ca faz mobil. Fazele staionare au fost n general C18 i au fost clasificate ca monomerice, intermediare sau polimerice. S-a demonstrat c separarea luteinei i zeaxantinei este realizat doar prin utilizarea coloanei C18 polimerice i unele coloane intermediare, dar aceste coloane au furnizat recuperri mai mici dect coloanele C18 monomerice. Autorii au observat, de asemenea c, dimensiunea porilor coloanei poate afecta selectivitatea carotenoidelor cu dimensiuni diferite, precum zeaxantina i -caroten, dar nu afecteaz dac dimensiunea este asemntoare (de exemplu, - i -caroten).Cercetri complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale n vederea mbuntirii trasabilitii acestora pe lanul alimentar total

21



A fost raportat n literatur [39] c, coloanele C18 prezint o rezoluie slab n separarea izomerilor geometrici (cis trans) ai carotenoidelor. Sander i colab. [68] au dezvoltat o coloan C30 polimeric, special proiectat pentru separarea izomerilor carotenoidici. De atunci, numeroase metode analitice au utilizat coloanele C30 polimerice [15], [20], [21], [33], [60], [69]. Separri satisfctoare pentru all-trans-licopen din roii utiliznd o coloan C30 au fost obinute de Gomez-Prieto i colab [33]. Marsili i Callahan [14] au testat 3 coloane C18 comerciale cu faz invers: coloana Waters Novo-Pak (4 m dimensiunea particulelor, 3,9 mm x 150 mm), coloana Supelcosil (5 m dimensiunea particulelor, 4,6 mm x 250 mm) i coloana Vydac 201TP (5 m dimensiunea particulelor, 4,6 mm x 250 mm) pentru a investiga care este cea mai potrivit coloan pentru a separa - caroten de -caroten. Rezultatele au indicat c rezoluia cea mai bun a fost realizat utiliznd coloana Vydac 201TP i a fost selectat pentru determinarea -carotenului din vegetale. Principalele xantofile din cereale (luteina, zeaxantina i -criptoxantina) au fost determinate n mai puin de 25 minure utiliznd o coloan C30 [15]. Un numr important de carotenoide a fost identificat n uleiul vegetal de palmier [70], precum: fitoen, -caroten, neurosporen, -zeacaroten, -zeacaroten, licopen, caroten, -caroten, -caroten i -caroten, din care - i -carotenul reprezint mai mult de 90%. nainte de presarea fructelor n scopul obinerii uleiului, acestea sunt supuse unui tratament termic utiliznd abur presurizat. nclzirea cauzeaz izomerizare cis/trans a carotenoidelor. Astfel, un amestec complex de carotenoide apolare i cis-izomerii lor este obinut, ceea ce determin ca separarea s fie dificil de realizat. Acest amestec este analizat prin HPLC utiliznd o coloan C30. Aceast coloan, pe lng faptul c produce o separare foarte bun a carotenoidelor asemntoare, precum - i -caroten, contribuie i la separarea cis-izomerilor, ceea ce nu este posibil utiliznd o coloan C18. 2.3.1.3. Temperatura coloanei Un alt factor important care trebuie luat n considerare pentru a realiza o separare satisfctoare a carotenoidelor este temperatura coloanei. Diveri autori [8], [71] au afirmat c modificri ale temperaturii cauzeaz schimbri semnificative n rspunsul cromatografic al carotenoidelor; deci, este important a lucra la temperaturi constante. Scott i Hart [71] au studiat efectul temperaturii coloaei n separarea unui amestec de carotenoide dintr-o soluie de referin standard i dintr-un extract al unui aliment uscat. Au fost testate 4 temperaturi diferite (15, 20, 22,5, 25 i 300C) i rezultatele au indicat c schimbrile de temperatur afecteaz timpul de eluie i profilul. Cea mai bun separare a fost realizat la 20 22,50C. Asemntor, Huck i colab. [8] au optimizat temperatura coloanei pentru a realiza o separare eficient a luteinei, zeaxantinei, -criptoxantinei i -carotenului. Temperatura a fost variat n intervalul 21 800C. Cea mai bun selectivitate a fost realizat la 210C I la temperaturi mai mari de 600C degradarea carotenoidelor a fost semnificativ. 2.3.2. Cromatografia de lichide spectrometria de mas (LC MS) LC MS poate fi folosit n identificarea carotenoidelor deoarece furnizeaz informaii despre structur i n plus, este o metod foarte sensibil. Metodele LC MSCercetri complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale n vederea mbuntirii trasabilitii acestora pe lanul alimentar total

22



dezvoltate pentru analiza carotenoidelor include n principal ionizarea la presiune atmosferic (APCI atmospheric pressure chemical ionization) [8], [19], [21], [72], [73], [74] sau ionizare electrospray (ESI electrospray ionization) [28]. Lacker i colab. [60] au dezvoltat o metod pentru identificarea unui amestec de carotenoide, incluznd astaxantina, cantaxantina, zeaxantina i -caroten, precum i cistrans izomerii -carotenului utiliznd LC MS n modul APCI. Analiza a fost realizat pe o coloan 25 cm x 4,6 mm, umplut cu ProntoSil silicagel 3 m, modificat cu triacontiltriclorosilan C30, iar ca faz mobil a fost utilizat amestecul MeOH : MTBE (70:30, v/v). Spectrele de mas au fost realizate n intervalul m/z 200 700. O metod HPLC MS MS (APCI) pentru identificarea carotenoidelor din diferite vegetale a fost descris de Huck i colab. [Error! Bookmark not defined.]. O coloan C18 Phenomenex Luna (25 cm x 2 mm, 5 m) a fost utilizat ca faz staionar i sistemul de faze mobile a constat din ACN (0,1% BHT) : MeOH (coninnd 0,05 M acetat de amoniu i 0,05% TEA) : CHCl3 (coninnd 0,1% BHT) : n-heptan (coninnd 0,1% BHT) (50:40:5:5, v/v/v/v) la un debit de 0,2 mL/min. Spctrele de mas au fost nregistrate n domeniul m/z 300 2000. Limita de detecie a fost la nivel de nanograme. Unii autori au utilizat spectrometria de mas pentru a asigura identificarea corect a peak-ului i puritatea n matricea complex. Murkovic i colab. [19] au utilizat LC MS APCI pentru a confirma prezena carotenoidelor n diferite varieti de dovleac. HPLC MS (ESI) a fost utilizat de Hadden i colab. [28] pentru a confirma prezena carotenoidelor n extractul de cri. Careri i colab. [32] au utilizat cromatografia de lichide cu faz invers spectrometria de mas (electrospray) pentru separarea -carotenului i xantofilelor. Separarea a fost realizat pe dou coloane ODS Hypersil conectate n serie (200 x 2,1 mm, 5 m i 100 x 2,1 mm, 5 m) i faza mobil ACN : MeOH (0,1 M acetat de amoniu) : DCM. Determinrile au fost realizate prin operarea spectrometrului de mas n domeniul m/z 500 650. Breithaupt i colab. [74] au utilizat LC APCI MS pentru identificarea a 8 monoesteri ai luteinei produi de diesterii luteinei din cri (Tagetes erecta L.) dup o saponificare enzimatic incomplet a diesterilor luteinei. Separarea a fost realizat pe o coloan C30 (250 x 4,6 mm diametru interior) i faza mobil constituit din doi elueni (A) MeOH : MTBE : ap (81:15:4, v/v/v) i (B) MeOH : MTBE : ap (6:90:4, v/v/v). Spectrele de mas au fost nregistrate n domeniul m/z 80 1200. A fost descris o metod pentru separarea i identificarea esterilor zeaxantinei din anumite extracte de plante utiliznd LC APCI MS [73]. Pentru separare, o coloan C30 (250 x 4,6 mm diametru interior, 5 m) meninut la 300C a fost utilizat. Spectrele de mas ale esterilor zeaxantinei au fost nregistrate n domeniul m/z 400 1200. Limita de detecie a diesterilor zeaxantinei a fost 0,4 g/mL. Carotenoidele prezente n mango, all-trans--caroten, all-trans- i cis-criptoxantina, all-trans-zeaxantina, all-trans- i cis-violaxantina, all-trans i cisneoxantina au fost identificate utiliznd spectrometru de mas cuplat la un cromatograf de lichide ntr-un experiment realizat de Mercadante i colab. [75]. n tabelul 3 au fost selectate cteva metode HPLC recent utilizate n analiza carotenoidelor.


23



Tabelul 3 Cteva metode HPLC recente utilizate pentru analiza carotenoidelor din diverse surseProba Fructe i legume tradiionale din Portugalia [76] Cartof dulce (Ipomoea batatas) [77] Caise, dovleac [78] Vegetale [79] Planta ierbacee Potamogeton crispus [80] Cartofi (Solanum phureja) [81] Diferite fructe, legume [82] Extracie Eter de petrol Coloana 100 x 4,6 mm, 5 m cuplat cu C18-RP (250 x 4,6 mm, 5 m) C30 250 x 4,6mm, 5m C30-RP 150 x 3 mm 3 m C18 250 x 4,6 mm, 5 m 150 x 4,6 mm C30 250 x 4,6 mm 3 m C30 150 x 4,6 mm 3 m Faza mobil ACN:MeOH:DCM, 75:20:5 A: MeOH:ACN:ap, 84:12:2 B: DCM A: ACN:MTBE:ap, 81:15:4 B:MeOH:MTBE:ap, 4:92:4 ACN:DCM:MeOH, 6:2:2 A: MeOH:ap, 90:10 B: acetat de etil MeOH:MTBE (diferite procente) A:MeOH:MTBE:ap, 95:3:2 B:MeOH:MTBE:ap, 8:90:2 Detecia UV-Vis DAD DAD DAD MS UV-Vis DAD LC MS UV-Vis DAD

Hexan:aceton:EtOH, 2:1:1 Aceton:hexan, 1:1

Aceton rece Eter de petrol:aceton, 1:1 aceton MeOH

2.4. Alte metode O alt metod de analiz folosit n determinarea coninutului de carotenoide este spectroscopia cu reflexie n infrarou apropiat (NIRS Near Infrared Reflectance Spectroscopy), considerat a fi o metod rapid, precis i nepoluant pentru analiza calitativ i cantitativ n domeniul alimentar [83]. A fost utilizat la determinarea coninutului total de carotenoide din morcovi [84] i boabe de gru [85], i n special unele carotenoide, precum licopen i luteina din produsele pe baz de roii [86], zeaxantina i luteina n boabele de porumb [87]. Studiul realizat de X. Chen i colab. [88] a folosit NIRS pentru a determina coninutul de lutein i -caroten din varza furajer (Brassica oleracea). 3. Caracterizare generala a compusilor biochimici de tip flavonoide Flavonoidele sunt n mare parte molecule plane i variaia lor structural deriv de la modelul de substituie: hidroxilare, metoxilare, prenilare sau glicozilare. Flavonoidele sunt mprite n: flavone, flavonoli, flavanone i flavanoli n funcie de prezena gruprii carbonil n poziia C-4, gruprii OH n poziia C-3, legturii simple saturate ntre C-2 i C-3, i o combinaie ntre absena gruprii carbonil din C-4 cu o grupare OH n poziia C-3 (figura 2 ). Dei cteodat se gsesc n form aglicon, majoritatea flavonoidelor din plante sunt prezente ca O-glicozide, n care una sau mai multe grupri hidroxil ale agliconei suntCercetri complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale n vederea mbuntirii trasabilitii acestora pe lanul alimentar total

24



legate la un zahar, formnd o legtur O C glicozidic. Exist anumite grupri hidroxil n flavonoide care sunt de obicei glicozilate, acestea fiind: gruparea 7-hidroxil din flavone, flavanone i izoflavone i gruprile 3- i 7- hidroxil din flavonoli i flavanoli. Izoflavonoidele sunt flavonoide cu inelul B ataat n poziia C-3 a inelului C. Aceasta exclude posibilitatea existenei unei legturi de hidrogen n poziia 3, ceea ce determin ca activitatea antioxidant a izoflavonei s fie redus [89]. Toate au ca structura de baz flavona (2-fenil benzopirona). n tabelul 4 sunt prezentate cteva exemple de flavonoide i surse ale acestora.HO 7 A 5 OH O C 4 O Genisteina (Izoflavona) 2 2' B 4' OH Daidzeina (Izoflavona) O OH HO O

OH HO O HO O

OH OH

OH

O

OH OH Catechina (Flavanol) OH OH HO O OH O Quercetina (Flavonol) OH

Apigenina (Flavona)

HO

O

OH

O

OH

Narigenina (Flavanona)

Figura 2 Structura chimic a unor flavonoide


25



Aceast clas de compui influeneaz sntatea uman i a animalelor, datorit importanei lor n diet, care este atribuit proprietilor lor antioxidante. Un numr mare de publicaii referitoare la efectele benefice ale flavonoidelor asupra sntii, precum cancer, boli de inim au fost prezentate [90]. Tabelul 4 Cteva exemple de flavonoide i surse ale acestoraTipul de flavonoide Flavonoli quercitina caempferol Flavone rutina luteolina apigenina Flavanoli (Epi)catechina Flavanone naringenina hesperidina Antocianidine cianidina delfinidina Izoflavone Surse ceap, mr, struguri negrii, ceai, broccoli andiv, praz, broccoli, grapefrui, ceai ceap, mr, struguri negrii, ceai, broccoli lmie, msline, elin, gogoar elin, ptrunjel struguri negrii, mere citrice suc de portocale struguri, cpuni, zmeur vinete boabe de soia, legume

4. Metode de determinare a flavonoidelor 4.1. Pregtirea probei Pregtirea probei n cazul plantelor i alimentelor ncepe cu etapa de mrunire, naintea extraciei cu etanol apos sau metanol. Cteva studii au urmat procedura descris de Coward i colab. [91]. O prob alimentar congelat-uscat (0,5 g) i 5 g de daidzein deuterat (standard intern) au fost dispersate prin sonicare i extrase cu 80% metanol apos (5 mL) prin agitare timp de o or la 600C. Amestecul a fost rcit i centrifugat timp de 5 minute, extractul de solvent a fost ndeprtat i reziduurile redizolvate n etanol apos (2 x 2,5 mL). Extractul rezultat a fost concentrat i lipidele ndeprtate prin extracie n mai multe pri cu hexan. Dup uscarea fazei apoase alcoolice sub azot, reziduul a fost redizolvat n 50% metanol apos (10%) naintea analizei LC. Recent, flavonoidele glicozilate acilate au fost caracterizate din conopid [92]. Utiliznd aceast metod aceast metod, conopida congelat-uscat (70 g) a fost extras prin fiebere cu 3 L de ap distilat timp de o or. Extractul a fost mai departe amestecat cu particule de Amberlite XAD-2 i agitat pentru a reine compuii fenolici pe suprafaa particulelor neionice de Amberlite. Particulele de Amberlite au fost introduse n coloana cromatografic, splate cu ap distilat (5 L), i eluate cu metanol. Extractul metanolic a fost uscat i redizolvat n 50% metanol apos pentru a fi analizat mai departe. Trebuie notat c extracia glicozidelor flavonoidelor n solveni nclzii poate conduce la modificri de compoziie. Aceasta este o problem mai ales pentru esterii malonil ai glicozidelor flavonoidelor. Acetia sufer hidroliz puternic la gruparea malonil chiar i la temperatura camerei. Acest lucru se poate ntmpla i n autosamplerCercetri complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale n vederea mbuntirii trasabilitii acestora pe lanul alimentar total

26



n timpul analizei. Esterii malonil pot de asemenea suferi decarboxilri generate de cldur (pentru a forma acetilglicozide) n stare uscat. Pentru cteva alimente care conin flavonoide, aceasta poate avea loc n timpul prelucrrii, deci naintea analizei lor n experiment [91]. Pentru a depi aceste probleme, alte metode noi de pregtire a probei precum extracia cu fluide supercritice n contracurent i extracia cu lichide presurizate au fost utilizate n analiza flavonoidelor din plante [93], [94]. n tehnica n contracurent, o prob lichid este introdus n mijlocul coloanei umplute, printr-un orificiu care este localizat peste orificiul de intrare a CO2, crend un contracurent ntre debitul de prob (descendent) i debitul de CO2 (ascendent). CO2 supercritic a fost des utilizat n metodele de prelucrare a citricelor [95]. Aceast metod este potrivit pentru extracia componenilor volatili. Un avantaj particular al cromatografiei de lichide spectrometriei de mas (LC MS) const n capacitatea acestei metode de a determina att formele libere, ct i cele conjugate ale flavonoidelor. Spre deosebire de GC MS, cnd se utilizeaz LC MS etapa de extracie nu este de obicei necesar. Printre metodele analitice folosite n analiza flavonoidelor sunt prezentate n literatur: HPLC [96] , HPLC MS [97], GC MS [98], LC multidimensional [99]. 4.2. Spectrometria de mas n analiza flavonoidelor Datorit importanei flavonoidelor i glicozidelor lor n organismele vii, identificarea i/sau determinarea structural a acestor compui n esutul plantelor joac un rol important. Spectrometria de mas este una din metodele fizico-chimice aplicat n determinarea structural a compuilor organici. Caracteristica MS este utilizarea unor diferite principii fizice, att pentru ionizarea probei, ct i pentru separarea ionilor, produi conform raportului m/z (m mas, z sarcin). Aplicarea MS n analiza glicozidelor flavonoidelor s-a dezvoltat odat cu apariia aa numitelor tehnici de ionizare blnde. Compuii acestei clase sunt polari, nevolatili i instabili termic. Efectul electronului (EI electron impact), cu energii ale electronului cuprinse ntre 10 100 eV, i ionizarea chimic (CI chemical ionization) nu sunt potrivite pentru analiza MS a glicozidelor flavonoidelor. Ambele metode necesit ca analitul s fie n faz gazoas pentru ionizare, i derivatizarea gruprilor hidroxil (metilare, trimetilsilare i acetilare) este necesar. Prin introducerea tehnicii de ionizare prin desorbie, analiza glicozidelor flavonoidelor fr derivatizare este posibil. Dealungul timpului au fost introduse i alte tehnici: FAB (fast atom bombardment), LSIMS (liquid secondary ions mass spectrometry). Cele mai interesante i utilizate metode din punct de vedere al studiilor structurale ale glicozidelor flavonoidelor sunt: ESI i APCI [100]. Din spectrele de mas pot fi obinute urmtoarele informaii cu privire la glicozidele flavonoidelor: a) masa molecular b) strucrura agliconei (modelul de hidroxilare, poziia inelului B n inelul C) c) informaii despre acilarea gruprilor hidroxil ale zaharului i posibila metilare a hidroxidului agliconicCercetri complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale n vederea mbuntirii trasabilitii acestora pe lanul alimentar total

27



d) numrul de inele de zaharuri i configuraia lor. Aa cum a fost prezentat mai sus, flavonoidele sunt diferite din punct de vedere structural i n general fac parte dintr-un amestec complex izolat din extractul de plante. Dei, GC MS a fost principala metod folosit n analiza moleculelor mici n ultimii 20 de ani, n prezent nu este aa de des folosit n analiza flavonoidelor datorit volatilitii limitate a glicozidelor flavonoidelor care se gsesc n fructe i vegetale. Odat cu apariia surselor API, LC MS a devenit cea mai utilizat metod pentru analiza flavonoidelor n amestecuri complexe. Deoarece LC MS furnizeaz masa molecular a fiecrui component cu timpul lui de retenie, este folosit pentru identificarea compuilor cunoscui. O caracterizare adiional a componentelor cunoscute sau necunoscute poate fi realizat prin cuplarea LC cu spectrometria de mas. Este utilizat, de asemenea, i pentru analiza cantitativ. Eficiena ionizrii unor diferite surse API, de exemplu ESI i APCI, a fost revizuit anterior de Rauha i colab. [101]. ESI MS n modul ion-negativ cu tampon acetat de amoniu acid ca faz mobil a furnizat cea mai bun sensibilitate. De Rijke i colab. [102] au prezentat un studiu comparativ n ceea ce privete performanele analitice ale tehnicilor APCI i ESI, att n modul ion-pozitiv, ct i n cel negativ. Cele mai bune rspunsuri MS au fost n modurile ion-negativ, n general tehnica APCI mai bun dect ESI. Rezultatele obinute cu APCI i ESI negativ au fost similare pentru toate flavonoidele aglicone. Claeys i colab. au publicat o serie de lucrri despre utilizarea spectrometriei de mas n determinarea structurii glicozidelor flavonoidelor din plante [103], [104], [105]. Recent, ei au raportat aplicaia LC ESI MS i disocierea prin ciocnire indus (CID) n caracterizarea structural a O-glicozidelor flavonolilor acilai din semintele de Carrichtera annua [104]. Gruprile acil produc ioni caracteristici n spectrele [M + H]+ i [M + Na]+. Cuplarea cu spectrometria de mas a fost utilizat pentru caracterizarea tipului legturii interglicozidice a izomerilor O-diglicozidici ai flavonoidelor. Scindarea legturii O-glicozidice concomitent cu o aranjare a hidrogenilor conduce la eliminarea reziduurilor de monozaharide dehidratate, de exemplu: pierderea a 162 u (hexoz), 146 u (deoxihexoz), 132 u (pentoz). Flavonoidele metilate sunt caracterizate de o pierdere de 15 u, avnd drept rezultat [M H CH3]- [106]. Metoda ESI MS/MS este destul de bun pentru a deosebi civa izomeri ai flavonoidelor metilate pe baza spectrelor de ioni. Cuyckens i Claeys [103] au studiat optimizarea cromatografiei de lichide pe baza deteciei ESI MS i a detectorului DAD pentru analiza glicozidelor flavonoidelor. n modul ion-pozitiv, analiza ESI MS n metanol coninnd 1% acid acetic a fost pe departe cea mai sensibil, n timp ce faza mobil ACN / ap coninnd 0,5% acid formic a prezentat cea mai bun sensibilitate n analiza LC/ESIMS/UV DAD. n modul ion-negativ, cea mai bun sensibilitate a fost obinut cu o faz mobil ce conine 0,1% acid formic, n timp ce adugarea de baze a redus sensibilitatea. S-a observat de asemenea c prezena acidului acetic n faza mobil determin creterea sensibilitii, reducnd timpul de retenie n coloana LC. Hvattum [107] a raportat identificarea n extractul de mce a unui antocian i a ctorva glicozide ale quercetinei. Determinarea stereochimic a resturilor de hexoz i pentoz n flavonoidele acetilate a fost realizat utiliznd spectrometria de mas [108].Cercetri complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale n vederea mbuntirii trasabilitii acestora pe lanul alimentar total

28



Pe lng O-glicozidele flavonoidelor, n multe plante medicinale i vegetale se gsesc i C-glicozidele flavonoidelor [109]. n cazul C-glicozidelor, zaharul este direct legat de partea flavonoidic prin intermediul unei legturi C C rezistent la acid. Tehnica MS MS cu CID permite caracterizarea Cglicozidelor att n modul ion-pozitiv, ct i n cel negativ. Wang i Sporns [110], [111] au fost primii care au utilizat tehnica MALDI TOF (matrix-assisted laser desorption time-of-flight) n analiza izoflavonelor n produsele din soia. Izoflavonele au fost predominant ionizate n forma protonat cu cantiti foarte mici de ioni de sodiu i potasiu. n analiza, a fost observat pierderea restului glicozidic. Aceeai tehnic a fost folosit n analiza cantitativ a glicozidelor flavonolilor din migdale [112]. Yang i Chien [113] au demonstrat detecia oligomerilor: catechin, epicatechin i derivaii lor galoilai n seminele de struguri utiliznd MALDI TOF. n tabelul 5 sunt prezentate cteva comparaii n cea ce privete tehnicile de ionizare n spectrometria de mas n cazul analizei flavonoidelor. Tabelul 5 Comparaii privind tehnicile de ionizare n spectrometria de mas pentru analiza flavonoidelorTehnica de Aplicaia principal ionizare EI n principal analiza agliconelor (calitativ i cantitativ) FAB Glicozidele flavonoidelor Avantaje Poate fi cuplat uor cu GC Sensibilitate ridicat Identificarea compuilor necunoscui Domeniu de mas extins pn la 7000 Da Metod de ionizare blnd Limite mari de mas Suport concentraii la nivel mM ale srurilor Domeniu de mas pn la 2000 Da Foarte sensibil (femtomoli) Susceptibil pentru HPLC/MS Domeniu mare de mas Susceptibil pentru HPLC/MS Rezoluia sarcinii ~ 2000 Sensibilitate de la femtomol la picomol Dezavantaje Necesit derivatizare Domeniu de mas limitat Posibil descompunere termic Fragmentri mari Sensibilitate redus Necesit solubilitatea probei n matrice Picuri ale matricei de baz mari Rezoluie sczut Semnalele de baz ale matricei sunt mari, puin folosit pentru molecule mici Sensibilitatea poate varia cu tipul compusului Posibilitatea unei descompuneri termice Toleran relativ sczut la sruri Analiza poate fi dificil pentru compuii neionizabili Toleran mic sau chiar absent pentru amestecurile neomogene

MALDITOF APCI

Glicozidele flavonoidelor, proantocianidine Agliconele flavonoidelor

ESI

Diferite flavonoide (calitativ i cantitativ)

EI electron impact; FAB fast-atom bombardment; MALDI-TOF Matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight; APCI atmospheric pressure chemical ionization ESI electrospray ionizationCercetri complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale n vederea mbuntirii trasabilitii acestora pe lanul alimentar total

29



4.3. Cromatografia de nalt performan pentru analiza flavonoidelor Pentru separarea flavonoidelor, condiiile cromatografice ale metodei HPLC includ utilizarea unei coloane C18 cu faz invers; detector diod UV-Vis i un sistem de solvent binar coninnd ap acidifiat (solvent A) i un solvent organic polar (solvent B). Separarea necesit un timp de 1 or la un debit de 1.0 1.5 mL/min. De obicei, solventul A este un acid sau un aditiv, precum fosfatul. Solventul B este pur sau metanol sau acetonitril acidifiat. Separarea i determinarea cantitativ a flavonoidelor din trestia de zahr a fost realizat folosind HPLC UV [114]. O metod cu separare bun a flavonoidelor a fost descoperita de R. Tsao i colab. [115] care au utilizat o faz mobil binar constnd din 6% acid acetic n 2mM soluie apoas de acetat de sodiu (v/v, pH final 2,55) (solvent A) i acetonitril (solvent B) i coloana C18 cu faz invers. Utilizarea acetatului de sodiu a reprezentat cheia pentru separarea a 25 de flavonoizi din fructe. LC MS a fost utilizat pentru a demonstra prezena glicozidelor flavonoidelor n miere i posibila utilizare a acestora ca markeri florali [116]. LC UV MS a fost folosit pentru identificarea flavonoidelor din fructele arborelui de papaya Vasconcellea pubescens [117]. n tabelele 6 i 7 sunt prezentate cteva publicaii recente referitoare la analiza GC i LC a flavonoidelor. Tabel 6 Publicaii recente privind analiza GC a flavonoidelorMetoda GC MS [118] GC MS [119] HT HRGC MS [120] GC MS [121] GC MS [122] HT HRGC MS i FID[123] Derivatizare TMS TMS none TBDMS Proba Diferite extracte de ierburi Ginkgo biloba Vellozia graminifolia Fructe i alune Propolis Lonchocarpus urucu

TMS: trimetilsilil; HT: high-temperature; HR: high-resolution; TBDMS: N-(terbutildimetilsilil)-N-metiltrifluoroacetamid;

Tabel 7 Publicaii recente privind analiza LC a flavonoidelorColoane 25 x 2,0 mm, 5m coloan C18 [124] 150 x 3,9 mm, 5m coloan C18 [125] 150 x 3,0 mm, 5m coloan C18 [126] 250 x 4,6 mm, 5m coloan C18 [127] Solveni MeOH : acid formic apos 0,01% Izocratic 0,5 mL/min Ap : ACN, acidifiat cu acid acetic (0,1%), 1 mL/min A: ap : acid formic, 95:5 B: MeOH : acid formic, 95:5 A: ap, 1% acid formic B: ACN Detecie HPLC ESI HPLC HPLCDAD-MS (ESI+) HPLCDAD-MS (ESI+) Proba Boabe de soia Soia, trifoi rou struguri Mure, afine cpuni,


30



Coloane 150 x 3,9 mm, Novapack C18 [128] 150 x 4,6 mm, 5m Capcell Pak C18 [129] 250 x 4,6 mm, 5m coloan C18 [130] 100 x 1 mm, 1,7m UPLC BEH C18 [131] 125 x 3 mm, 5m LichroCart Purospher RP-18 [132] 125 x 3 mm, 5m Lichrospher 100 RP-18 [133]

Solveni A: ap : acid formic, 90:10 B: ap : MeOH : acid formic, 45:45:10 A: ap : acid trifluoracetic 0,1% B: acetonitril : ap, 50:50 A: ap : acid formic, 99:1 B: ACN : acid formic, 99:1 A: ap : acid formic, 99:1 B: ACN : acid formic, 99:1 A: ap : acid formic, 99:1 B: ACN : acid formic, 99:1 A: ap : acid acetic, 99:1 B: ACN : acid acetic, 90:10

Detecie HPLC-DAD MS (ESI+) LCDAD MS (ESI +) HPLC-DAD -MS (ESI) UPLC(ESI)-TOF HPLCESI () ITMS

Proba Cojile de struguri afine Ceai verde Ceai verde Afine

HPLC ESI Linte MS

4.4. Alte metode Electroforeza capilar este o tehnic economic i printre avantaje menionm: volumul de injectare al probei redus, randament ridicat, timp redus al analizei, care pot fi folositoare n determinarea rapid i eficient a flavonoidelor din sisteme complexe. Metoda electroforezei capilare a fost aplicat pentru determinarea a nou flavonoide (inclusiv dou rare) n planta medicinal Anaphalis margaritacea [134]. De asemenea, metoda electroforezei capilare cuplat cu detecia electrochimic (CE ED) a fost dezvoltat pentru identificarea i determinarea a cinci flavonoide din planta chinezeasc Portulaca oleracea L. [135]. Detecia electrochimic, bazat pe reacia electrochimic a analiilor la suprafaa electrodului, furnizeaz una dintre cele mai selective i sensibile metode de detecie pentru CE. Majoritatea flavonoidelor sunt compui electroactivi, deci CE ED a fost de asemenea utilizat pentru determinarea unor flavonoide din plante [136]. Studiul realizat de Y. Peng i colab. [137] a utilizat CE ED pentru analiza cantitativ i calitativ a markerilor flavonoidici din Frucus aurantii din diferire zone geografice. Autorii au concluzionat c metoda CE ED reprezint o tehnic important pentru markerii chimici, fiind o metod alternativ, competitiv i suplimentar metodei HPLC. O alt metod descris n literatur [138] este detecia amperometric a flavonoidelor din plante utiliznd un electrod modificat cu lacaz (o oxidoreductaz ce conine cupru i care se gsete n multe plante i microorganisme). Lacaza catalizeaz ndeprtarea atomului de hidrogen din gruparea hidroxil din poziia orto- i para- a substratului fenolic. Principiul metodei const n imobilizarea enzimei prin adsorbie pe suprafaa unui electrod de grafit. n acest studiu electrodul a fost testat pentru msurtori electrochimice a unor flavonoide, precum catechina, epicatechina, prodelfinidina. Metoda HPLC reprezint cea mai potrivit alegere pentru identificarea flavonoidelor, deoarece metodele de separare sunt deja bine stabiliate i cuplarea cu MS este uor de realizat. Recent, dezvoltarea de noi tehnici, precum UPLC contribuie la reducerea timpului de analiz fr a compromite rezoluia [139].Cercetri complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale n vederea mbuntirii trasabilitii acestora pe lanul alimentar total

31



5. Caracterizare generala a compusilor biochimici de tip terpene Terpenele reprezint o clas de compui organici produse de un numr variat de specii de plante. Din punct de vedere al scheletului hidrocarbonat, pot fi mprite n monoterpene (C10) ce conin dou uniti izoprenice, diterpene (C20) i triterpene (C30) [140]. n figura 3 sunt prezentate structurile chimice a unor terpene.OH OH

geraniol

linalool

mircen

-ocimen

O OH

-pinen

camfor

mentol

limonen

Figura 3 Structura chimic a unor terpene. Cromatografia de gaze a fost folosit nc de la nceput pentru separarea diferitelor terpene din produse naturale [141], ct i n caracterizarea de noi uleiuri eseniale. Datorit volatilitii terpenelor, informaia cea mai util este obinut utiliznd tehnici succesive, care implic n prealabil metode cromatografice sau spectroscopice. n unele cazuri poate fi aleas metoda HPLC fiind potrivit pentru analiza glicozidelor terpenelor care nu sunt volatile. Au fost folosite o serie de metode pentru extracia i concentrarea probei, separarea cromatografic a constituienilor i caracterizarea acestora.


32



6. Metode de determinare a terpenelor 6.1. Extracia probei i concentrarea Extracia terpenoidelor volatile din plante este de obicei realizat utiliznd distilarea cu abur. Au fost recent raportate posibile probleme referitoare la aceast metod, deoarece poate avea loc degradarea unor monoterpene din cauza hidratrii catalitice acide [142]. O modificarea a acestei metode implic extracia cu ap supranclzit [143], i n acest caz substanele dizolvate pot fi extrase cu hexan. De asemenea a fost folosit simultan distilarea cu abur i extracia cu diclormetan [144]. Microextracia n faz solid [145], [146] a fost utilizat, dar recuperrile monoterpenelor nu au fost aa de mari precum n cazul celorlalte metode. Extracia cu microunde a fost folosit pentru extracia volatil a terpenelor din diverse plante [147]. Comparnd recuperrile relative a distilrii cu abur, distilrii i extracia cu diclormetan, extracia cu microunde i extracia cu fluide supercritice folosind CO2, cel mai mare numr de compui identificai, 79, a fost n cazul metodei SFE, comparativ cu 67 pentru extracia cu microunde , 61 pentru distilarea i extracia cu DCM, i doar 43 utiliznd distilarea cu abur. Cantiti mici de constituieni din materialul plantelor au fost colectate utiliznd metoda headspace-ului, care implic volatilizarea terpenoidelor din prob ntr-un spaiu nchis, i apoi analizar

Caracterizare Si Identificare Flavonoide

Documents

Transcript of Caracterizare Si Identificare Flavonoide