Capitolul i, II, III

27
CUPRINS CAPITOLUL I INTRODUCERE .................................................... 2 CAPITOLUL II METODE DE DETERMINARE A ACŢIUNII SINERGICE A UNOR ANTIOXIDANŢI POLIFENOLICI ............................................................... 3 II.IINTRODUCERE............................................................3 II.II.........................PREPARARE, EXTRACŢIE ŞI PURIFICARE PRELIMINARĂ 3 II.III.................METODE DE DETERMINARE A UNOR ANTIOXIDAŢI POLIFENOLICI 4 II.III.1...................................................METODE CROMATOGRAFICE 4 II.III.2...................................................METODE SPECTROMETRICE 7 II.III.3..................................................METODE ELECTROFORETICE 7 II.III.4.................................................... VOLTAMETRIA CICLICĂ 7 II.IV METODE DE DETRMINARE A ACŢIUNII ANTIOXIDANTE A UNOR COMPUŞI POLIFENOLICI...............................................................7 II.IV.1...........................TESTUL PAO(TEZA DE DOCTORAT GABRIELA IORDĂCHESCU) 7 II.IV.2..........................TESTUL DPPH(TEZA DE DOCTORAT GABRIELA IORDĂCHESCU) 8 II.IV.3............ DETERMINAREA NUMĂRULUI TBA(TEZA DE DOCTORAT GABRIELA IORDĂCHESCU) 8 II.IV.4................EFICACITATEA ANTIOXIDANTĂ(TEZA DE DOCTORAT GABRIELA IORDĂCHESCU) 9 II.IV.5.........DETERMINAREA INDICELUI DE PEROXID(TEZA DE DOCTORAT GABRIELA IORDĂCHESCU) 9 II.IV.6.......................................................GRADUL DE OXIDARE 10 II.IV.7.................................................TESTUL CU O-FENANTROLINA 10 II.IV.8.DETERMINAREA CONŢINUTULUI ÎN COMPUŞI POLIFENOLICI PRIN METODA BARY ŞI THROPE(TEZA DE DOCTORAT GABRIELA IORDĂCHESCU).............................................. 10 II.IV.9...............................................TOXICITATEA ANTIOXIDANŢILOR 10 II.V METODE DE EVALUARE A EFICIENŢEI ANTIOXIDANTE.........................10 II.V.1..................................METODE DE DETERMINARE A GRADULUI DE OXIDARE 10 II.V.2.........................METODE DE DETERMINARE A CANTITĂŢII DE OXIGEN CONSUMATE 10 II.V.3..........METODE PENTRU TESTAREA STABILITĂŢII ULEIURILOR ŞI A GRĂSIMILOR!!!!!!!!! 10 1

description

antioxidanti

Transcript of Capitolul i, II, III

Page 1: Capitolul i, II, III

CUPRINS

CAPITOLUL I INTRODUCERE ............................................................................................................................ 2

CAPITOLUL II METODE DE DETERMINARE A ACŢIUNII SINERGICE A UNOR ANTIOXIDANŢI POLIFENOLICI ........................................................................................................................................................ 3

II.I INTRODUCERE.............................................................................................................................................3II.II PREPARARE, EXTRACŢIE ŞI PURIFICARE PRELIMINARĂ..........................................................3II.III METODE DE DETERMINARE A UNOR ANTIOXIDAŢI POLIFENOLICI.....................................4II.III.1 METODE CROMATOGRAFICE..........................................................................................................................4II.III.2 METODE SPECTROMETRICE...........................................................................................................................7II.III.3 METODE ELECTROFORETICE..........................................................................................................................7II.III.4 VOLTAMETRIA CICLICĂ.................................................................................................................................7II.IV METODE DE DETRMINARE A ACŢIUNII ANTIOXIDANTE A UNOR COMPUŞI POLIFENOLICI........................................................................................................................................................7II.IV.1 TESTUL PAO(TEZA DE DOCTORAT GABRIELA IORDĂCHESCU).....................................................................7II.IV.2 TESTUL DPPH(TEZA DE DOCTORAT GABRIELA IORDĂCHESCU)..................................................................8II.IV.3 DETERMINAREA NUMĂRULUI TBA(TEZA DE DOCTORAT GABRIELA IORDĂCHESCU).................................8II.IV.4 EFICACITATEA ANTIOXIDANTĂ(TEZA DE DOCTORAT GABRIELA IORDĂCHESCU).........................................9II.IV.5 DETERMINAREA INDICELUI DE PEROXID(TEZA DE DOCTORAT GABRIELA IORDĂCHESCU)...........................9II.IV.6 GRADUL DE OXIDARE..................................................................................................................................10II.IV.7 TESTUL CU O-FENANTROLINA.....................................................................................................................10II.IV.8 DETERMINAREA CONŢINUTULUI ÎN COMPUŞI POLIFENOLICI PRIN METODA BARY ŞI THROPE(TEZA DE DOCTORAT GABRIELA IORDĂCHESCU).......................................................................................................................10II.IV.9 TOXICITATEA ANTIOXIDANŢILOR................................................................................................................10II.V METODE DE EVALUARE A EFICIENŢEI ANTIOXIDANTE...........................................................10II.V.1 METODE DE DETERMINARE A GRADULUI DE OXIDARE.................................................................................10II.V.2 METODE DE DETERMINARE A CANTITĂŢII DE OXIGEN CONSUMATE............................................................10II.V.3 METODE PENTRU TESTAREA STABILITĂŢII ULEIURILOR ŞI A GRĂSIMILOR!!!!!!!!!.......................................10II.V.4 METODE ANALITICE!!!!!!!!...........................................................................................................................10

CAPITOLUL III CALCUL STATISTIC ............................................................................................................. 12

III.I OBŢINEREA POPULAŢIEI STATISTICE FORMATĂ DIN VALORI EXPERIMENTALE..........12III.II CALCULUL VALORILOR PARAMETRILOR STATISTICI AI UNEI REPARTIŢII TEORETICE NORMALE.....................................................................................................................................12III.II.1 SEMNIFICAŢIA PARAMETRILOR STATISTICI AI UNEI REPARTIŢII TEORETICE NORMALE...............................12III.II.2 VERIFICAREA CARACTERULUI ÎNTÂMPLĂTOR AL ÎMPRĂŞTIERII REZULTATELOR EXPERIMENTALE............15III.II.3 VERIFICAREA NORMALITĂŢII REPARTIŢIEI DATELOR EXPERIMENTALE.......................................................15III.II.4 VVVVVV.......................................................................................................................................................15III.II.5 VVVVVV.......................................................................................................................................................15III.II.6 VVVV...........................................................................................................................................................15III.IV VERIFICAREA CARACTERULUI ÎNTÂMPLĂTOR AL ÎMPRĂŞTIERII REZULTATELOR EXPERIMENTALE................................................................................................................................................15III.IV.1 Calculul parametrilor statistici ai repartiţiei normale................................................................................15

1

Page 2: Capitolul i, II, III

CAPITOLUL IINTRODUCERE

Având în vedere preocuparea omului pentru sănătate şi longevitate s-au făcut nenumărate studii cu privire la modalităţile de a le păstra şi eventual îmbunătăţi. Printre aceste studii fac parte şi acelea care determină conţinutul în compuşi polifenolici naturali cu proprietăţi antioxidante, antialergice, anti-inflamatorii, antivirale şi anticanceroase. Astfel de compuşi sunt acizii polifenolici şi compuşii flavonoidici care se clasifică în foarte multe categorii cum ar fi: flavonoli, flavone, catehine, proantocianidine, antocianidine şi isoflavonoizi

2

Page 3: Capitolul i, II, III

CAPITOLUL IIMETODE DE DETERMINARE A ACŢIUNII SINERGICE A UNOR

ANTIOXIDANŢI POLIFENOLICI

II.I INTRODUCERE

SSSSSSS

II.II PREPARARE, EXTRACŢIE ŞI PURIFICARE PRELIMINARĂAnaliza compuşilor fenolici începe cu extracţia. Procedura de extracţie depinde de planta analizată, de compuşii fenolici ce urmează a fi identificaţi şi de procedura analitică ce urmează a fi utilizată(Lee şi Widmer 1996)(Shakkinen). Primul pas în vederea realizării unei bune extracţii este strivirea, măcinarea, macerarea sau fărâmiţarea probei pentru a mări suprafaţa de contact cu solventul(Waterman şi Mole 1994) )(Shakkinen). Acesta ajută şi la amestecarea probei pentru a se asigura un extract reprezentativ pentru întreaga probă.Cum mulţi compuşi fenolici se găsesc sub formă glicozidică sau esterificată, pregătirea probei ar putea include şi o hidroliză alcalină, acidă sau enzimatică în vederea eliberării acestor compuşi fenolici. Această etapă a hidrolizei poate fi omisă dacă se analizează compuşii în forma lor derivată)(Shakkinen).În cazul acizilor fenolici, cea mai utilizată metodă de hidroliză este cea chimică(acidă sa bazică) (Lee şi Widmer 1996) şi mai rar cea enzimatică(cu -glucozidaza(Kanes ş. a. 1993) sau hidroxicinamoil-quinate esteraza(Gaupy ş. a. 1990)). Hidroliza acidă se poate face prin încălzirea probelor cu HCl timp de 2 h(Kuninori şi Nishiyama 1986). Hidroliza bazică a esterilor acidului benzoic şi a acidului cinamic poate fi făcută cu NaOH la temperatura camerei timp de 4-24 h(Seo şi Morr 1984, Torres ş.a. 1987, Peleg ş.a. 1991, Roussef ş.a. 1992a, b, Romnel şi Wrolstad 1993a) sau timp de 90 min. la 60oC în atmosferă de N2(Kuninori şi Nishiyama 1986). Romnel şi Wrolstad(1993a) au testat hidroliza acidă în comparaţie cu hidroliza bazică în analiza conţinutului în acizi fenolici(acidul elagic, acidul hidroxibenzoic, acidul hidroxicinamic, flavonoli, flavan-3-oli) din sucul de zmeură. Extractul hidrolizat alcalin a fost foarte asemănător cu cel acid. Numai acidul elagic a fosta hidrolizat mai eficient în condiţii alcaline decât cele acide(Romnel şi Wrolstad 1993a). Recuperarea a fost mai slabă(57-67%)pentru extractul cu acid hidroxicinamic hidrolizat alcalin(Peleg ş.a. 1991). Totuşi, Seo şi Morr(1984) au găsit că hidroliza cu NaOH duce la o mai bună recuperare a acidului ferulic extras din soybean protein products urmată de o hidroliză acidă cu HCl. Hollman şi Venema(1993) au testat extracţia urmată de hidroliză pentru conţinutul în acid elagic din walnuts şi berries(căpşuni, zmeură, mure) utilizând HCl sau soluţie apoasă de metanol în proporţii diferite şi variind perioada de hidroliză. Caracteristicile hidrolizei pentru elagitaninuri din walnuts (optim HCl 5M în soluţie apoasă de metanol 57% timp de 1h) diferă de cele ale berries(optim cu HCl 3,5 M în soluţie apoasă de metanol 72% timp de 4-8h). În general, optimizarea condiţiilor de extracţie şi de hidrolizăeste necesară întotdeauna atunci când acizii fenolici sunt determinaţi cantitativ din fructe sau alte părţi ale plantelor(Lee şi Widmer 1996).Determinarea compuşilor flavonoidici în plante a fost studiată pe larg de Markham(1982,1989), de Harborne(1988,1994) şi de Robards şi Antolowich(1997)(Shakkinen).Flavonoizii sunt în general compuşi stabili şi pot fi extraşi din diferite plante proaspete sau uscate cu diferiţi solvenţi la rece sau la cald. Pentru extracţie, solvenţii utilizaţi se aleg în funcţie de polaritatea compuşilor flavonoidici studiaţi. Uneori se mai foloseşte şi o extracţie cu light petroleum sau hexan pentru a „scăpa” de steroli, carotenoide, clorofile etc.)(The flavomoids, J. B. Harborn, T. J. Mabry, H. Mabry, pag. 3). Solvenţii cei mai utilizaţi sunt amestecuri de apă şi etanol, metanol, acetonă sau dimetilformamidă (Robards şi Antolowich 1997) )(Shakkinen).În cazul acizilor fenolici, cei mai utilizaţi solvenţi sunt acetatul de etil(Azar ş.aş 1987, Fernández de Simón ş.a. 1990,1992) dietileterul(Fernández de Simón ş.a. 1990,1992), metanol şi metanol în soluţie

3

Page 4: Capitolul i, II, III

aposă(Kuninori şi Nishiyama 1986, Tores ş.a. 1987, Mckae ş.a. 1990, Tomáas-Lorente 1992) )(Shakkinen).Pentru purificarea extractelor s-a folosit: Precipitarea cu acetat de Pb(care are dezavantajul coprecipitării şi a altor compuşi nefenolici); Precipitarea cu polivinil piralidonă(PVP) la pH=3,5 în 1-10 % metanol în apă; Tratarea cu cărbune sub formă de pudră; Dializa(dialysis)-pentru izolarea moleculelor grele de flavonoizi(şi a taninurilor) care sunt solubile în

apă şi sunt amestecate cu carbohidraţi sau substanţe anorganice solubile în extractul crud

II.III METODE DE DETERMINARE A UNOR ANTIOXIDAŢI POLIFENOLICI

II.III.1 Metode cromatograficeMetodele cromatografiei pe hârtie au fost dezvoltate pentru compuşii flavonoidici în anii `50 - `60(Markham1982, Robards şi Antolowich 1997) (Shakkinen).Aceste tehnici au fost înlocuite de cromatografia în strat subţire(TLC) în anii `70 care era o tehnică mai puţin costisitoare pentru analiza simultană a mai multor probe(Robards şi Antolowich 1997, Harborne 1998). Selecţia unei faze staţionare convenabile şi a unui solvent adecvat depinde de clasa de flavonoizi ce urmează a fi examinată. Flavonoizii hidrofilici, cum sunt flavonolii, pot fi rapid separaţi prin TLC pe poliamidă sau celuloză microcristalină(Wildanger şi Herrmann 1973, Robards şi Antolowich 1997). TLC este încă utilizată în separările preparative(Lee şi Widmer 1996) ca o metodă de screening rapidă şi ieftină pentru determinarea claselor de compuşi flavonoidici prezenţi în fructe(Fernández de Simón ş.a. 1992) şi miere(Sebatier ş.a. 1992). Aplicaţiile TLC pentru determinarea cantitativă a acizilor fenolici(Azor ş.a. 1987, Regnault-Roger ş.a. 1987, Srisuna ş.a. 1989, Agbor-Egbe şi Rickard 1990) sunt de obicei realizate utilizând cromatografia în fază normală sau pe suport de silice ori celuloză iar separarea compuşilor se face cu un amestec de purtători de tip hidrocarbură(toluen, dioxan sau benzen) şi modificatori organici polari(acetonă, butanol, etanol şi acid acetic). Avantjele TLC în screening-ul de extracte din probe faţă de HPLC sunt: detecţia contaminanţilor care ar putea fi absorbiţi pe faza staţionară a coloanei HPLC sau determinarea condiţiilor de extracţie necesare pentru o separare cu succes a compuşilor fenolici(Fernández de Simón ş.a. 1992, Lee şi Widmer 1996).Cromatografia de gaze(GC) are aplicabilitate limitată în analiza compuşilor flavonoidici şi a altor compuşi fenolici din cauza volatilităţii lor scăzute; principalul dezavantaj este necesitatea unei etape în plus care să asigure volatilitatea compuşilor fenolici(Lee şi Widmer 1996, Robards şi Antolowich 1997). Totuşi, cromatografia de gaze cuplată cu spectrometria de masă(MS) a fost aplicată pentru analiza flavonolilor din ceaiul negru(Finger ş.a. 1991) şi din varză(Nielsen ş.a. 1993). Avantajele cromatografiei de gaze include şi o separare îmbunătăţită a izomerilor foarte apropriaţi prin simpla cuplare cu un spectrometru de masă(Mouly ş.a. 1993, Schmidt ş.a. 1994). În anii `80, cromatografia de gaze a fost aplicată pentru analiza acizilor fenolici din fructe(Möller şi Herrmann 1983, Schuster şi Herrmann 1985) şi legume(Huang ş.a. 1986).Cromatografia de lichide de înaltă performanţă(HPLC) a fost cea mai utilizată metodă cromatografică în analiza compuşilor flavonoidici din ultimii 20 de ani(Harborne 1988, Robards şi Antolowich 1997, Merken şi Beecher 2000). A fosta adusă o nouă dimensiune în investigarea compuşilor flavonoidici din extractele de plante şi alimente. Avantajele particulare ale acestei metode este rezoluţia îmbunătăţită a amestecurilor de compuşi flavonoidici în comparaţie cu alte tehnici cromatografice, abilitatea de a obţine date calitative şi cantitative într-o singură operaţie şi viteza mare a analizei(Harborne 1988, Markham 1989). Ca şi în cazul compuşilor flavonoidici, pentru determinarea acizilor fenolici cea mai utilizată metodă este HPLC, mai precis RP-HPLC(reversed-phase high performace liquid chromatographie)(tabel 3 pag 40 Shakkinen). Sistemele de solvenţi utilizate în mod normal în HPLC include eluţii cu gradient binar ce folosesc drept solvenţi acid acetic în soluţie apoasă, acid formic în soluţie apoasă sau acid fosforic în soluţie apoasă cu metanol sau acetonitril drept modificator organic. pH-ul sau tăria ionică a fazei mobile influenţează retenţia acizilor fenolici pe coloană în funcţie de protonare, disociere sau disociere parţială(Marko-Varga şi Barcele 1992). Schimbarea pH-ului ce va duce la creşterea ionizării probei poate reduce retenţia la separarea în fază inversă . Astfel, cantităţi mici de acid acetic(2-5%), acid formic, acid fosforic sau acid

4

Page 5: Capitolul i, II, III

trifluoracetic(0.1%) sunt incluse în sistemul de solvenţi pentru a împiedica ionizarea grupărilor fenolice şi carboxilice şi pentru a creşte rezoluţia şi reproductibilitatea metodelor cromatografice.(Shakkinen)

5

Page 6: Capitolul i, II, III

Cromatografia în fază normală a fost utilizată la separarea compuşilor flavonoidici(flavone, flavonoli şi flavonone aglycones) din sucul de portocale(Galensa şi Herrmann 1980a,b). Acetaţii flavonoizilor au fost separaţi isocratic pe LiChrosorbSi60 utilizând sistemele acetonitril-benzen, etanol-benzen sau izo-octan-etanol-acetonitril drept solvent şi detecţia la 312 nm sau 270 nm. Totuşi, pentru sistemele în fază normală, există posibilitatea ca în cazul materialelor foarte polare să fie reţinute pe coloană )Vande Casteele ş.a. 1983) ceea ce duce la o alterare graduală a caracteristicilor separării. Astfel, cromatografia în fază inversă(RP) a fost invariabil o metodă de separare a flavonolilor de alţi compuşi flavonoidici din fructe(tabel 2 pag 36 Shakkinen)

6

Page 7: Capitolul i, II, III

Calea normală de separare utilizează o coloană C18(cu particule de 3-5µm) împreună cu o fază mobilă apoasă şi metanol sau acetonitril drept modificator organic. Mici cantităţi de acid acetic, acid formic sau tampon fosfat încorporat în faza mobilă tinde să marcheze îmbunătăţirea separărilor compuşilor flavonoidici de alţi compuşi fenolici(Lamuela-Raventós şi Waterhouse 1994, Merken şi Bucher 2000)(Shakkinen)

II.III.2 Metode spectrometrice

SSSDS

II.III.3 Metode electroforetice

SSSS

II.III.4 Voltametria ciclică

SSSS

II.IV METODE DE DETRMINARE A ACŢIUNII ANTIOXIDANTE A UNOR COMPUŞI POLIFENOLICI

II.IV.1 Testul PAO (teza de doctorat Gabriela Iordăchescu)Testul PAO, sau testul Puterii AntiOxidante, este un test de oxidare forţată şi se utilizează pentru a determina eficacitatea antioxidanţilor naturali sau sintetici. Se bazează pe principiul urmăririi în cromatografie în fază gazoasă a dispariţiei linoleatului de metil în condiţii de oxidare de oxidare forţată(temperatură, lumină, prezenţa oxigenului). Determinările se fac prin creşterea procentuală a reacţiei înjumătăţite în raport cu proba martor. Acest test poate dura o perioadă de aproximativ 10 h şi permite compararea puterii antioxidante cunoscute sau potenţiale a extractelor vegetale.Metoda este reproductibilă şi rapidă şi se realizează cu un dispozitiv pus al punct de colectivul condus de prof. dr. Claudette Berset de la E.N.S.I.A.A. Massy (Franţa)(Berset 1990, Cuvelier 1993).Fiecare prelevare la un timp dat, face obiectul unei analize cromatografice. Pornind de la cromatogramele obţinute, se determină procentul de metil linoleat(ML) rămas neoxidat cu ajutorul formulei:

%MLneoxidat = (SML/SC20)*(S0C20/S0ML)*100,

unde:SML – suprafaţa picului de metil linoleat la timpul t;SC20 – suprafaţa picului C20(eicosan)(standard intern insensibil la oxidare) în unităţi arbitrare la timpul t;S0C20 - suprafaţa picului C20(eicosan)(standard intern insensibil la oxidare) în unităţi arbitrare la timpul t0;S0ML – suprafaţa picului de metil linoleat la timpul t0.Cantitatea de metil linoleat rămasă neoxidată în funcţie de timp se reprezintă grafic. Din această diagramă se determină timpul pentru jumătate de reacţie. În funcţie de acesta se determină puterea antioxidantă(PAO) cu ajutorul relaţiei:

PAO = [(t-tm)/t]*100

7

Page 8: Capitolul i, II, III

unde:t – timpul pentru jumătate de reacţie a probei cu antioxidant;tm - timpul pentru jumătate de reacţie a probei martor.Cunoscând PAO pentru diferite concentraţii de antioxidant în mediul de reacţie se trasează o diagramă a variaţiei acestei caracteristici din care se determină concentraţia eficace(QE), pentru care puterea antioxidantă este 100.

II.IV.2 Testul DPPH(teza de doctorat Gabriela Iordăchescu)Se mai numeşte şi testul antiradical şi se utilizează pentru a evidenţia proprietatea antioxidanţilor de a acţiona asupra radicalilor liberi, un radical liber stabil(difenil – picril hidrazil DPPH) care prezintă absorbanţă la 515 nm. În figura 1 este prezentată configuraţia sa(Kureki 1982, Yoshida 1989, Lamaison 1991)Fig. 1

.(C6H5)2 – N – N – C6H7(NO2)3

Prin analogie cu reacţiile între radicali liberi şi compuşi cu acţiune antioxidantă(ca de exemplu polifenolii), DPPH reacţionează ca acceptor de hidrogen, şi în condiţiile în care este redus îşi pierde absorbanţa.DPPH. + H DPPH – HReacţiile se urmăresc spectrofotometric, determinând viteza de reacţie şi puterea antiradical a antioxidanţilor testaţi.(Lamaison 1988).Metoda a fost validată cu ajutorul soluţiilor etalon de acid rozmarinic(CE50 = 0.67 * 10-5M), coeficient de variaţie pentru linearitate – 2.2%, repetabilitate 3%, reproductibilitate 3.5%.Se trasează curbele etalon pentru antioxidanţii testaţi, deoarece dacă prezintă absorbanţă la 515 nm în soluţie metanolică măsurătorile nu pot fi luate în consideraţie.Se determină absorbanţa iniţială a soluţiei metanolice de radical liber pentru a fi utilizată drept etalon pentru soluţiile de antioxidanţi.Cuvele utilizate pentru determinări trebuie acoperite cu un film protector pentru a evita contactul cu oxigenul. Se citeşte absorbanţa după 1 minut de reacţie şi apoi din 15 în 15 minute până când cele două componente rămân în echilibru(respectiv reducerea intensităţii şi stabilizarea culorii).Se trasează curbele de dependenţă a procentului de DPPH în funcţie de raportul mg antioxidant/mg DPPH. Cu ajutorul acestor curbe se calculează concentraţia de antioxidant eficace(CE50) pentru a reduce cantitatea de DPPH la 50%. Puterea antiradical(PAR) se determină cu ajutorul formulei:

PAR = 1/CE50

II.IV.3 Determinarea indicelui de TBA (teza de doctorat Gabriela Iordăchescu)Acumularea produselor de degradare oxidativă în cazul diferitelor produse alimentare poate fi evaluată prin reacţia acestora cu acidul 2-tiobarbituric.Metoda se bazează pe formarea complexului colorat dintre produşii de oxidare ai unei grăsimi şi acidul 2-tiobarbituric urmată de măsurarea intensităţii coloraţiei.Proba mărunţită se supune operaţiei de distilare în apă distilată acidulată cu HCl. După distilare se adaugă acid 2-tiobarbituric şi se menţine pe baia de apă la fierbere timp de 35 de minute.După răcire se citeşte extincţia la λ = 532 nm faţă de martor, pregătit în aceleaşi condiţii, cu apă distilată în locul soluţiei de probă.Formula utilizată pentru determinarea valorii TBA este:

NTBA = D532*8,1[mg malonaldehidă/Kg produs],unde, D532 – extincţia probei citită la λ = 532 nm;8,1 - …………..

8

Page 9: Capitolul i, II, III

II.IV.4 Eficacitatea antioxidantă (teza de doctorat Gabriela Iordăchescu)Acest test urmăreşte determinarea eficacităţii antioxidanţilor pe un mediu ce imită un produs alimentar, şi a fost pus la punct în special pentru a estima eficienţa antioxidanţilor în condiţiile în care, trebuie să protejeze coloranţii alimentari, în special în condiţiile operaţiei de extrudare când se impun condiţii deosebite de lucru(temperatură ridicată).Scopul metodei este compararea eficienţei antioxidanţilor în cazul protecţiei pigmenţilor carotenoizi din ardeiul roşu în condiţiile fotooxidării.Metodică Soluţia de concentrat de ardei roşu în acetonă se obţine în urma unei omogenizări cu ajutorul unei instalaţii cu ultrasunete, datorită faptului că produsul este greu solubil în acest solvent. Din soluţia omogenizată, se adaugă 200 ppm într-o soluţie 10% de gelatină la 360C. Pentru a asigura conservabilitatea soluţiei se adaugă azotură de sodiu.Probele pregătite conform protocolului testului, s-au dozat în capsule Petri protejate pe laturile exterioare cu bandă adezivă de culoare neagră pentru captarea integrală a luminii UV şi evitării difuziei luminii în cazul determinărilor fotometrice. Pentru a evita uscarea gelatinei şi pierderea transparenţei s-a aplicat un start de 1 mL de vaselină. S-a utilizat lumina UV pentru a diminua timpul de esxpunere a probelor.Cu ajutorul spectrofotometrului de reflexie s-a citit ΔE(diferenţa totală de culoare) la momentul T 0 şi apoi s-a urmărit în acelşi mod evoluţia până la 72 h.Principiile măsurătorilor fotometriceFotometria este tehnica de măsurare în domeniul vizibil cea mai răspândită şi utilizată pentru aprercierea culorii unui produs. Evoluţia culorii obiectelor opace se bazează pe măsurarea luminii reflectate pe suprafaţă.Culoarea se poate defini prin 3 componente: Luminozitate (L*) – corespunzătoare unui număr de fotoni reflectaţi. Cu cât culoarea este mai

închisă, cu atât sunt mai puţini fotoni rflectaţi Tenta corespunzătoare lungimii de undă dominată a curbei de reflexie. De obicei o asimilăm culorii.Tenta şi saturaţia sunt evaluate pornind de la valorile cromatice a* şi b*(figura nr. 1)

Figura nr. 1

Tenta şi Saturaţia în fotometrie +b*

M1 . -a* θ

VERDE ROŞU+a*

-b*

ALBASTRUCei 3 parametrii L*(luminozitatea), şi valorile cromatice a* şi b* sunt unităţile de bază ale fotometriei.Tenta este definită prin: θ = arctg b*/a*;Saturaţia este definită prin :

Diferenţa de culoare ΔE =

Colorimetrul determină cei 3 parametrii cu ajutorul fibrelor optice, necesitând calibrare internă şi o calibrare externă. Pilotajul se face prin microordinator conectat la imprimantă.

II.IV.5 Determinarea indicelui de peroxid(teza de doctorat Gabriela Iordăchescu)Metoda se bazează pe proprietatea peroxizilor de a elibera iodul din KI în mediu slab acid pe o perioadă determinată(până la descompunerea peroxizilor). Formula de calcul este:

9

Page 10: Capitolul i, II, III

Ip= (V-Vm)/M,În care:Ip - indice de peroxid;V – volumul de tiosulfat de sodiu 0.01N folosit la titrarea probei de grăsime(mL);Vm - volumul de tiosulfat de sodiu 0.01N folosit la titrarea probei martor(mL);M – masa de produs luată în analiză(g).(Vasu 1985, Banu 1971)

II.IV.6 Gradul de oxidare

SSSSS

II.IV.7 Testul cu o-fenantrolina

SSS

II.IV.8 Determinarea conţinutului în compuşi polifenolici prin metoda Bary şi Thrope (teza de doctorat Gabriela Iordăchescu)Compuşii fenolici sunt cei mai activi, datorită structurii lor şi a prezenţei în cantități apreciabile în produsele vegetale. Metoda utilizată pentru dozarea fenolilor totali este metoda Bary şi Thrope modificată de Taga şi Miller[1984]. Mostrele uscate şi standardele se prepară într-o soluţie acidificată (60:40 metanol/apă + 0,3 % HCl). S-au adăugat Na2CO3 şi reactiv Folin - Ciocalteau cu citirea absorbanţei la 750 nm la un spectrofotometru JASCO UV-VIS. Standardul a fost acidul galic. Concentraţiile în compuşi fenolici au fost determinate prin comparaţie cu o curbă de calibrare standard.

II.IV.9 Toxicitatea antioxidanţilor

SSSS

II.V METODE DE EVALUARE A EFICIENŢEI ANTIOXIDANTE

II.V.1 Metode de determinare a gradului de oxidare

SSSS

II.V.2 Metode de determinare a cantităţii de oxigen consumate

SSSSS

II.V.3 Metode pentru testarea stabilităţii uleiurilor şi a grăsimilor!!!!!!!!!

SSSSSS

II.V.4 Metode analitice!!!!!!!!

10

Page 11: Capitolul i, II, III

SSSSSSSSSS

11

Page 12: Capitolul i, II, III

CAPITOLUL IIICALCUL STATISTIC

III.I OBŢINEREA POPULAŢIEI STATISTICE FORMATĂ DIN VALORI EXPERIMENTALE

xi ni67.6 71.5 70.5 70.9 68.2 70.2 70.4 69.1 70.1 70.3 69.6 70.970.0 70.1 68.5 70.6 70.8 70.8 70.1 70.6 68.1 69.6 70.8 70.969.1 70.2 70.1 67.0 70.2 72.5 67.9 70.4 70.2 70.4 70.1 69.370.8 70.6 69.3 70.2 68.4 70.8 70.2 70.2 68.4 72.5 68.7 69.870.4 68.6 70.0 69.7 70.8 67.2 69.8 69.5 70.6 69.9 70.2 70.669.7 70.1 69.9 68.3 69.3 71.6 69.5 70.7 71.0 71.4 68.5 70.770.4 67.8 70.3 69.5 70.7 69.1 70.5 69.7 68.4 71.2 70.9 70.869.3 70.2 71.8 72.5 70.9 73.0 70.9 68.5 69.5 70.5 69.9 70.670.6 69.4 68.3 70.6 70.4 70.3 68.9 70.4 70.5 69.3 70.5 68.772.5 70.4 70.5 70.7 69.8 70.6 70.5 70.7 69.5 70.5 70.5 70.5

III.II CALCULUL VALORILOR PARAMETRILOR STATISTICI AI UNEI REPARTIŢII TEORETICE NORMALE

III.II.1 Semnificaţia parametrilor statistici ai unei repartiţii teoretice normale

Parametrii statistici sunt mărimi dimensionale sau adimensionale care caracterizează sintetic o populaţie statistică. Parametrii statistici utilizaţi se clasifică în două categorii distincte, în funcţie de semnificaţiile pe care le au, astfel:III.II.1.a Parametrii statistici de tendinţă(de centrare, plasare);III.II.1.a Parametrii statistici de împrăştiere(de concentrare).

III.II.I.a Parametrii statistici de tendinţă(de centrare, plasare) descriu ”punctul” în jurul căruia se plasează valorile care formează o populaţie statistică. În această categorie de parametrii statistici se includ: media aritmetică(m), mediana(Me), modulul(Mo) şi valoarea centrală(Xc).

a.1. Media aritmetică(m)Valoarea mediei aritmetice descrie tendinţa de localizare(centrare) a valorilor unei populaţii statistice, fiind parametrul cel mai utilizat al tendinţei centrale.Pentru o populaţie statistică formată din N valori experimentale discrete, valoarea mediei repartiţiei teoretice normale este:

m = ,

unde, j – numărul valorilor individuale din populaţie, i = ;

- frecvenţa absolută a valorilor individuale i;

= - probabilitatea ca valorii variabilei aleatoare x să fie egală cu valoarea

variabilei independente i.Se observă că valoarea mediei aritmetice este egală cu valoarea momentului de ordinul 1 al valorilor populaţiei. Dacă populaţia statistică este formată din variabile numerice cu caracter continuu, valoarea mediei teoretice este definită de relaţia:

m =

12

Page 13: Capitolul i, II, III

unde, x1 şi x2 sunt5 limitele – inferioară şi superioară – intervalului în care se plasează valorile populaţiei;

f(x) – funcţia de densitate de probabilitate a valorilor populaţiei statistice.Pentru o populaţie statistică prezentată sub forma unor subşiruri:

m =

unde, φ - nr. de subşiruri în care sunt împărţite valorile populaţiei;

- media aritmetică a subşirului care are numărul de ordine i.

Pentru o populaţie statistică cu valori grupate în k clase,

m =

unde, - frecvenţa absolută a clasei i;

- valoarea centrală a clasei i.

Pentru populaţii statistice foarte numeroase se reţin probe(eşantioane) de volum n, n<<N, iar

unde, ‚ media aritmetică a eşantionului, valoare care estimează punctual valoarea mediei aritmetice(m) a populaţiei.Pentru populaţia statistică de la pct. III.I:

n = 120m =

=

a.2. Mediana(Me)Valoarea x = Me a a variabilei aleatoare pentru care este îndeplinită condiţia matematică F(Me) = 0,5 se numeşte mediană. F(x) reprezintă funcţia de repartiţie teoretică normală a variabilei aleatoare x, iar x = Me este valoarea variabilei aleatoare pentru care graficul său prezintă un punct de inflexiune, iar F(Me) = 0,5

Fig. Nr. 1Semnificaţia valorii medianei pentru funcţia de repartiţie F(x)

GRAFIC

În consecinţă, mediana(Me) reprezintă acea valoare care ocupă poziţia centrală a populaţiei dispusă în serie statistică, deci, frecvenţa absolută a valorilor mai mari ca mediana este egală cu frecvenţa absolută a valorilor mai mici ca mediana. Valoarea medianei se calculează cu relaţii care depind de volumul populaţiei, astfel:1). N este impar, Me = X(N+1)/2, relaţie prin care se obţine numărul de ordine al valorii care reprezintă mediana şirului statistic; mediana are o valoare identică cu cel puţin una din valorile populaţiei statistice.2). N este par, Me = (XN/2+X(N/2) +1)/2, relaţie prin care se obţine valoarea medianei, ca medie a valorilor care au număr de ordine N/2 şi (N/2) +1 în şirul statistic. Dacă valorile care au aceste numere de ordine sunt identice, mediana este valoarea care face parte din populația statistică.

a.3. Modulul(Mo)valoarea experimentală X = Mo care are cea mai amre frecvenţă absolută - este valoarea cea mai probabilă – se numeşte modul. Valoarea modulului teoretic pentru o populaţie statistică se calculează cu ajutorul relaţiei:

13

Page 14: Capitolul i, II, III

Mo = 3*Me*2mValoarea modulului corespunde unui maxim al valorii funcţiei de frecvenţă(fig. nr. 2), pentru o

populaţie formată din valori cu caracter continuu.Fig. Nr. 2

Relaţia dintre valoarea funcţiei de frecvenţă şi modulul populaţiei.

GRAFIC

Dacă graficul funcţiei de frecvenţă prezintă un singur maxim – este unimodal – populaţia va fi caracterizată de un singur modul(este unimodală). Având în vedere că f`(x) = 0 prezintă uneori mai multe soluţii, populaţia respectivă este multimodală (fig. nr. 3) prezentând graficul funcţiei de frecvenţă pentru o populaţie dimodală.

Fig. Nr. 3Graficul funcţiei de frecvenţă de repartiţie pentru o populaţie dimodală

GRAFIC

Valorile X1 = (Mo)1 şi X2 = (Mo)2 au cele mai mari frecvenţe absolute din întreaga populaţie. Pe baza observaţiei directe, se poate identifica valoarea variabilei aleatoare care are cea mai mare frecvenţă absolută – modulul experimental. Pentru populaţiile statistice care respectă o repartiţie teoretică normală, valoarea modulului teoretic este egală, sau foarte apropiată, de valoarea modulului experimental.

a.4. Valoarea centrală(Xc)valoarea centrală(Xc) a unei populaţii este acea valoare care ocupă poziţia centrală a câmpului de împrăştiere. Valoarea centrală se calculează cu ajutorul relaţiei:

Xc =

Fiind semisuma valorilor extreme ale populaţiei. Folosind o relaţie similară, se poate calcula valoarea centrală a unui câmp de toleranţă (XT), astfel:

XT =

unde, Tinf şi Tsup reprezintă limitele câmpului de toleranţă.a.5. Consideraţii asupra parametrilor statistici de tendinţă

Asupra parametrilor statistici de tendinţă ai unei populaţii statistice, se impun următoarele consideraţii:A. Parametrii statistici de tendinţă au mărimi şi unităţi de măsură identice cu cele ale valorilor

experimentale.B. La calcularea valorilor parametrilor statistici de tendinţă se reţin un număr de zecimale cu 2

unităţi mai mare decât numărul de zecimale cu care au fost obţinute valorile experimentale.

III.II.I.a Parametrii statistici de împrăştiere(de concentrare) descriu tendinţa de concentrare sau împrăştiere a valorilor populaţiei, precum şi forma graficului funcţiei de frecvenţă. În această categorie de parametrii statistici se includ: dispersia, abaterea(eroarea) medie pătratică, amplitudinea, coeficientul de variaţie, asimetria, coeficientul de asimetrie şi coeficientul de exces

b.1. Dispersia(varianţa)Dispersia este o mărime adimensională care descrie concentrarea valorilor populaţiei în jurul unei anumite valori. Ea reprezintă momentul centrat de ordin 2 faţă de valoarea reală(vr),

D(N) =

sau faţă de valoarea medie(m)14

Page 15: Capitolul i, II, III

D(N) =

Dispersia valorilor populaţiei statistice faţă de valoarea reală (vr) se calculează în cazul proceselor de etalonare a aparaturii, de verificare(testare) a unui proces analitic sau a unei operaţii tehnologice.Dispersia valorilor populaţiei statistice faţă de valoarea media (m) se calculează pentru cazul în care nu se cunoaşte valoarea reală a variabilei aleatoare. Spre exemplu, concentraţia molară a ionilor de Ca+2 în apa provenită de la o sursă naturală. Pentru că valoarea [Ca+2] este dependentă de foarte mulţi factori naturali, pentru fiecare populaţie statistică se calculează dispersia valorilor faţă de valoarea medie.Pentru cazul unui eşantion de volum n, n<<N, dispersia valorilor se calculează faţă de valoarea medie a eşantionului( ).

D(N) =

Valoarea dispersiei afectează geometria graficului funcţiei de frecvenţă, conform fig. nr. 4Fig. nr. 4

Geometria graficului funcţiei de frecvenţă în funcţie de valoarea dispersiei:a. Dispersia are valoarea micăb. Dispersia are valoare mare

GRAFIC

a b

Dispersia valorilor unei populaţii statistice este o măsură a preciziei unui proces analitic sau a unei operaţii tehnologice; dispersiile mici corespund unei precizii mari

b.2. Eroarea(abaterea) medie pătraticăEroarea(abaterea)medie pătratică – eroarea(abaterea) standard – este mărimea egală cu radical din valoarea dispersiei, păstrând unitatea de măsură a valorilor populaţiei şi notaţia σ sau Δ, după caz. Astfel, în cazul unui proces de etalonare sau testare a unui ansamblu analitic, mărimea

σ =

se numeşte eroare medie pătratică(eroare standard); diferenţa se numește eroare.

Dacă nu se cunoaşte valoarea reală a variabilei aleatoare, mărimea

σ =

se numeşte abatere medie pătratică(abatere standard); diferenţa se numeşte abatere.

Eşantionul de volum n se caracterizează prin abaterea medie pătratică Δ, a cărei valoare se calculează:

Δ =

Abaterea medie pătratică a eşantionului(Δ), se estimează punctual valoarea abaterii medii pătratice(σ) pentru populaţie. Valoarea abaterii(erorii) medii pătratice caracterizează precizia procesului analitic sau tehnologic; valorile mici corespund unor precizii mari. Pentru un proces normal, analitic sau tehnologic, eroarea(abaterea) standard nu poate fi mai mare decât precizia cu care se face determinarea.(ex. dacă la determinarea pH-ului valorile experimentale se obţin co o precizie de ordinul sutimilor, abaterea standard a populaţiei nu poate fi σ > 0.09).Pe baza valorilor erorilor(abaterilor)se calculează şi valori ale abaterilor(erorilor) relative la valoarea medie. Astfel:

15

Page 16: Capitolul i, II, III

Eroarea relativă =

Abaterea relativă =

sunt mărimi adimensionale care caracterizează precizia determinărilor.b.3. Amplitudinea(R sau W)

Amplitudinea caracterizează o populaţie statistică prin dimensiunea câmpului de împrăştiere a valorilor. Valoarea amplitudinii se calculează cu ajutorul relaţiei:

R = Xmax - Xmin

unde, Xmax şi Xmin sunt valorile extreme ale populaţiei. Valoarea amplitudinii păstrează unitatea de măsură a valorilor populaţiei, fiind un parametru statistic prin care se compară două populaţii statistice obţinute în condiţii experimentale identice. Sunt preferate populaţiile statistice caracterizate prin valori mici ale amplitudinii.

b.4. Coeficientul de variaţie(C.V.)Pentru o populaţie statistică care este caracterizată prin parametrii m şi σ, valoarea coeficientului de variaţie

C.V.(N) =

Se mai numeşte abatere standard relativă la valoarea medie. Valoarea sa poate fi estimată prin valoarea coeficientului de variaţie a eşantionului

C.V.(N) =

Coeficientul de variaţie este o mărime adimensională. Sunt preferate procesele analitice sau tehnologice caracterizate prin valori mici ale coeficientului de variaţie, deci valori mari pentru inversul său 1/C.V.. Mărimea 1/C.V. dimensionează raportul dintre mărimea valorilor(descrisă prin valoarea medie) şi cea a zgomotului de fond(descrisă prin valoarea abaterii standard). Pentru a evita riscul confundării semnalelor analitice cu zgomotul de fond,

b.5. Asimetria graficului funcţiei de frecvenţăPentru o populaţie statistică N(m, σ) formată din valori care respectă o repartiţie teoretică normală, valorile principalilor parametrii statistici de tendinţă sunt egale(m = Me = Mo) iar graficul funcţiei de frecvenţă este perfect simetric faţă de axa x =m. unele populaţii normale sunt caracterizate din valori diferite ale celor 3 parametrii statistici iar graficul funcţiei de frecvenţă devine asimetric. Asimetria graficului funcţiei de frecvenţă se poate caracteriza prin valorile parametrilor asimetrici(AN).

AN =

Sau coeficientul de asimetrie(β1N)

β1N =

pentru o populaţie N(m, σ). Pentru un eşantion n( ,Δ) se calculează parametrii:

An =

β1N =

care estimează valorile celor care caracterizează populaţia. Pentru o populaţie formată din valori care respectă o repartiţie teoretică normală, parametrii care caracterizează asimetria graficului funcţiei de frecvenţă au valoarea zero. În activitatea experimentală se pot obţine 2 tipuri de

16

Page 17: Capitolul i, II, III

populaţii statistice, în funcţie de relaţia în care se află valorile parametrilor statistici de tendinţă m şi Mo.

1). m > Mo (Mo < Me < m), graficul funcţiei de frecvenţă prezentat in fig. nr. 5Fig. nr. 5

Alura graficului funcţiei de frecvenţă pentru o asimetrie pozitivă(de stânga)

GRAFIC

Populaţia statistică este caracterizată prin valoare pozitivă pentru A şi valoare negativă pentru β1. Se consideră că asimetria este pozitivă sau de stânga – având în vedere că valoarea cu frecvenţa absolută cea mai mare este mai mică(în stânga) decât valoarea medie a populaţiei.

2). M < Mo (m < Me < Mo), graficul funcţiei de frecvenţă prezentat în fig. nr. 6.Fig. nr. 6

Alura graficului funcţiei de frecvenţă pentru o asimetrie negativă(de dreapta)

GRAFIC

Populaţia statistică este caracterizată prin valoare negativă pentru A şi valoare negativă pentru β1. Se consideră că asimetria este negativă sau de dreapta. Valoarea modulului este mai mare decât valoarea medie a populaţiei.Populaţiile 1). şi 2). sunt mai apropiate de comportarea unei populaţii normale, cu cât valorile parametrilor A şi β1 sunt mai apropiate de zero.

b.6. Coeficientul de exces β2

Coeficientul de exces β2 este definit ca raportul dintre valoarea momentului centrat de ordin 4 ;i valoarea momentului centrat de ordin 2(dispersia), de fiecare dată în raport cu valoarea medie.

β2 =

valoarea coeficientului de exces, se compară cu cea care caracterizează o repartiţie normală; excesul poartă numele „kurtosis”. O populaţie normală este caracterizată prin valoarea β2 = 3, repartiţia normală este mezokurtică. Faţă de valoarea acestui parametru, se cunosc două tipuri de populaţii statistice cu repartiţii cvsinormale.

1). β2 > 3, repartiţia este leptokurtică, fig. nr. 7, curbă în stil „gotic”Fig. nr. 7

Alura graficului funcţiei de frecvenţă în cazul unei repartiţii leptokurtice

GRAFIC

Se observă că graficul funcţiei de frecvenţă este ascuţit la vârf – o concentrare a unor valori în jurul valorii medii, fără a atinge punctele de inflexiune(m – σ, m + σ) –şi înregistrează trene mai lungi decât în cazul unei repartiţii normale.

2).

17

Page 18: Capitolul i, II, III

III.II.2 Verificarea caracterului întâmplător al împrăştierii rezultatelor experimentale

SSSS

III.II.3 Verificarea normalităţii repartiţiei datelor experimentale

SSSS

III.II.4 vvvvvv

SSSS

III.II.5 vvvvvv

SSSSS

III.II.6 vvvv

SSS

III.IV VERIFICAREA CARACTERULUI ÎNTÂMPLĂTOR AL ÎMPRĂŞTIERII REZULTATELOR EXPERIMENTALE

III.IV.1 Calculul parametrilor statistici ai repartiţiei normale

18