Cap_4 Functiile Materialului Genetic (1)

Tratat de Biotehnologie Cap.4 Funciile materialului genetic

F

4 UNCIILE MATERIALULUI GENETIC 4.1 REPLICAREA ADN

Replicarea ADN reprezint transmiterea fidel a informaiei genetice la celulele fiice, n urma diviziunii celulare. Replicarea este una dintre cele dou funcii eseniale ale materialului genetic. Mai mult dect att, replicarea ADN este procesul de baz al continuitii vieii pe Pmnt.

4.1.1 Principalele etape ale replicrii ADN

Ca i alte procese din biologia molecular, i procesul de replicare se desfoar n 3 etape iniierea, elongarea i terminarea :

Iniierea implic recunoaterea regiunii de pe o molecul ADN unde va ncepe procesul de replicare

Elongarea cuprinde evenimetele ce se desfoar la o bifurcaie de replicare, unde catenele parentale sunt copiate n catene fiice

Terminarea este o etap destul de puin cunoscut i se desfoar atunci cnd molecula parenatl a fost complet replicat

Etapele chimice ale replicrii ADN

Din punct de vedere chimic, replicarea ADN presupune urmtoarele etape principale: desfacerea iniial a dublului helix ntr-o zon denumit regiune de origine a replicrii sinteza unor fragmente de ARN m.c. scurt ce ofer captul 3-OH liber pentru sinteza primelor

legturi fosfo-diesterice; aceste fragmente poart numele de primeri i sunt sintetizate de ARN polimeraze speciale denumite primaze

n bucla de ADN desfcut procesul de replicare se va desfura n ambele direcii, formndu-se deci 2 bifurcaii de replicare

n faa fiecrei bifurcaii de replicare dublul helix va fi desfcut prin intervenia topoizomerazelor (care dersucesc dublul helix) i a helicazelor (care desfac legturile de hidrogen dintre cele 2 catene); astfel, bucla de replicare se va lrgi n fiecare din cele 2 capete

fiecare din cele 2 catene ale helixului parental va servi drept matri pentru sinteza unei catene noi sinteza catenelor noi se realizeaz de ctre enzime numite ADN polimeraze, pe baz de

complementaritate cu catena veche folosit ca matri; nucleotidele sunt legate ntre ele prin formarea de legturi fosfo-diesterice; alungirea catenei noi se realizeaz n direcie 5 3

datorit faptul c ADN polimerazele nu pot sintetiza o caten nou dect n direcie 5 3, la fiecare bifurcaie de replicare, sinteza celor 2 catene noi are loc oarecum diferit :

una din catenele noi este sintetizat continuu, pornind de la un singur primer: aceast caten este denumit catena conductoare (leading) (Figura 4.1)

cealalt caten este sintetizat discontinuu, pe msur ce dublul helix parental este desfcut n continuare; aceast caten este denumit caten ntrziat (lagging) i este format din multe fragmente distincte, denumite fragmente Okazaki (de la numele celul care le-a descris prima oar) de aproximativ 100 nucleotide; fiecare asemenea fragment este iniiat de la un primer

ntr-o faz mai avansat a replicrii primerii sunt ndeprtai att din structura catenei conductoare, ct i din cea ntrziat, dup care golurile sunt umplute tot de o ADN polimeraz

aceste fragmente sunt apoi unite ntre ele prin refacerea legturilor fosfo-diesterice de ctre o ADN ligaz

65


n timpul procesului de replicare monocatenele ADN (att cele vechi, ct i cele nou sintetizate) sunt stabilizate i protejate de aciunea nucleazelor, de ctre o clas special de proteine numite proteine Ssb (Single Stranded Binding)

terminarea replicrii unei molecule de ADN difer ntre moleculele circulare i cele lineare la moleculele circulare, ntlnite n majoritatea cazurilor la cromozomul bacterian i la plasmide,

cele 2 bifurcaii de replicare se ntlnesc ntr-o regiune denumit ter. la moleculele ADN lineare din cromozomii de la eucariote, capetele acestora (telomerele) sunt

replicate printr-un mecanism diferit, iar fragmentele sunt apoi unite de ADN ligaze

Figura 4.1 Reprezentarea schematizat a unei bifurcaii de replicare.

Complementaritatea dintre bazele azotate de pe cele 2 catene ale moleculei de ADN determin o structur perfect adaptat funciei de replicare, fiecare dintre cele 2 catene servind drept matri pentru sinteza unei catene complementare.

In majoritatea cazurilor, replicarea se realizeaz pe model semiconservativ, macromoleculele de ADN fiice fiind formate dintr-o caten veche i una nou (Figura 4.2).

Figura 4.2 Principalele trei modele de replicare a moleculelor ADN. La majoritatea organismelor (chiar i la genomuri virale) replicarea ADN se desfoar

bidirecional, ceea ce presupune formarea a dou bifurcaii de replicare ce avanseaz de la secvena de origine a replicrii (denumit secven oriC pentru cromozomul bacterian) ctre regiunea de terminare a replicrii (denumit secvna ter n cromozomul bacterian).

66


Dei procesul de replicare a moleculelor de ADN se desfoar enzimatic n mod similar la toate organismele, att la cele procariote, ct i la cele eucariote, totui exist suficiente diferene ntre cele 2 tipuri principale de organisme.

Astfel, cromozomul bacterian este un replicon unic, adic are o singur secven de origine a replicrii. n contrast, cromozomii de la eucariote sunt fiecare dintre ei structuri multirepliconice (au mai multe regiuni de origine a replicrii ADN) (Figurile 4.3 i 4.4).

Figura 4.3 Replicarea bidirecional a unui cromozom bacterian (A) i a unui cromozom de tip eucariot (B)

Figura 4.4 Reprezentarea schematic a replicrii cromozomului bacterian.

Mai mult chiar, apar diferene i datorate structurii teriare. Cromozomul bacterian are o

structur circular i, ca urmare, cele 2 bifurcaii de replicare se ntlnesc la nivelul secvenei ter (Figura 4.5). Cromozomul de tip eucariot are o structur linear, iar capetele lui (denumite telomere) se replic diferit de restul cromozomului.

Figura 4.5. Imaginea de microscopie electronic i reprezentarea schematizat a unei molecule circulare de ADN n timpul replicrii.

67


4.1.2 Enzimologia replicrii cromozomului bacterian

Cercetrile asupra procesului de replicare a moleculei ADN precum i asupra enzimelor implicate au debutat pe cromozomul de Escherichia coli i, ca urmare, majoritatea datelor experimentale provin de la bacterii (Figura 4.6).

4.1.2.1 Complexul primozom Complexul primozom este format dintr-o serie de proteine ce determin iniierea replicrii

ADN. Cele mai importante proteine sunt: primaza: la bacterii este denumit DnaG i este codificat de gena dnaG; aceast

enzim sintetizeaz scurte fragmente de ARN ce au funcie de primeri, adic ofer capul 3-OH liber pentru polimerizare.

proteinele de iniiere: n, n, n, DnaA, DnaB, DnaC i DnaT Iniierea replicrii presupune detaarea secvenei oriC de membrana plasmatic, dup ce, n

prealabil, a fost atins o anumit mas celular (denumit mas de iniiere) i n urma acumulrii unei cantiti substaniale de fosfolipide acide pe faa intern a membranei plasmatice.

Secvena oriC din cromozomul de E.coli are 245 bp i prezint 2 regiuni importante:

- o regiune cu 4 cutii dnaA (sunt formate din cte 9 bp, denumite 9-meri) la care se va ataa proteina DnaA

- o regiune cu 3 cutii de tip 13-meri, bogate n adenin-timin, la care se vor ataa complexe proteice DnaB-DnaC

Zece pn la 12 molecule de DnaA se leag la cutiile dnaA, determinnd buclarea moleculei de ADN i, ca atare, desfacerea dublului helix n cutiile dnaB. Zonele monocatenare aprute se complexeaz cu proteina DnaB (cu funcie de helicaz), adus de proteina DnaC. Ulterior, primaza (DnaG) ncepe aici sinteza moleculelor de ARN primeri (Figura 4.7).

Figura 4.6 Reprezentarea schematic a unei bifurcaii de replicare.

Figura 4.7 Originea replicrii n cromozomul de E. coli.

68


Figura 4.8 Structura regiunii de origine a replicrii la drojdia de bere (Saccharomyces cerevisiae). (A) Structura secvenei ARS1, o secven ARS tipic de la S.cerevisiae, cu poziionarea secvenelor funcionale A, B1, B2 i B3. Desfacerea dublului helix are loc n regiunea B2 prin ataarea proteinei ABF1 la regiunea B3. Proteinele complexului de origine a replicrii sunt ataate permanent la regiunile A i B1.

n procesul de replicare a ADN, n diverse etape, apar zone monocatenare ce sunt stabilizate

(i aprate) fa de aciunea nucleazelor prin ataare de proteine de tip Ssb (Single Stranded Binding proteine ce se ataeaz la monocatene ADN).

4.1.2.2 Topoizomerazele Superspiralizarea cromzomului bacterian impune intervenia unor enzime care s realizeze

relaxarea dublului helix ADN. Aceste enzime se numesc topoizomeraze i acioneaz asupra topoizomerilor ADN (Figura 4.9). Topoizomerii sunt molecule ADN cu structur primar i secundar identic i care difer n structura teriar.

Dou molecule ADN d.c. ce au aceeai secven de nuceotide dar numr diferit de nlnuiri i suporarsuciri sunt topoizomere datorit diferenelor de natur topologic.

La bacterii, ca de altfel i la eucariote, exist 2 clase de topoizomeraze cu mecanisme diferite de aciune (Figura 4.9) :

topoizomeraze tip I induc rupturi monocatenare (i tranzitorii) n ADN topoizomeraze tip II induc rupturi bicatenare n ADN (Figura 4.10)

La bacterii, topoizomeraza de tip I cea mai bine caracterizat este TopA de la E.coli, care relaxeaz suprarsuciri negative nalt rsucite. Topoizomerazele de tip II, n absena ATP, au rolul de a relaxa macromolecula ADN ca i TopA, n timp ce n prezena ATP induc suprarsuciri negative n moleculele circular covalent nchise (CCC) relaxate. Cea mai cunoscut enzim din aceast clas este ADN giraza, care poate introduce aproximativ 100 de suprarsuciri negative per minut.

Figura 4.9 Desfacerea dublului helix ntr-o bifurcaie de replicare, prin aciunea topoizomerazelor.

69


Figura 4.10 Modul de aciune al ADN topoizomerazelor de tip I i II. (A) Topoizomerazele de tip I realizeaz ruperi monocatenare, conduc catena intact prin aceast rupere, refcnd apoi legtura fosfo-diesteric. (B) Topoizomerazele de tip II taie ambele catene dintr-un dublu helix; prin acest

spaiu este trecut un alt fragment al dublului helix, iar apoi se refac cele 2 legturi fosfo-diesterice.

Figura 4.11 Rolul secvenelor terminator i al proteinelor Tus n replicarea cromozomului la E.coli.

4.1.2.3 ADN polimeraze Procesul de replicare propriu-zis a ADN este realizat de un complex de enzime denumite

ADN polimeraze. Cea mai important activitate enzimatic desfurat de o asemenea enzim este formarea de legturi fosfo-diesterice ntre nucleotide adiacente, cu creterea lanului n direcie 5 3.

Toate ADN polimerazele descrise pn n prezent polimerizeaz n direcie 5 3 i nu pot realiza acest proces dect pornind de la capul 3OH liber al unei nucleotide. De obicei, acest cap este oferit de un scurt fragment monocatenar de ARN denumit primer. La bacterii au fost descrise 3 tipuri de ADN polimeraze ce coexist n aceeai celul:

70


ADN polimeraza I (ADN pol I) este codificat de gena polA i are o g.m. de aprox 100 Md. n celula de E.coli exist circa 400 molecule de ADN pol I care are o vitez de polimerizare de 667 nucleotide / min. n afar de activitatea de polimerizare, aceast enzim poate desfura i activitate de exonucleaz (adic de desfacere de legturi fosfo-diesterice i eliminare de nucleotide dintr-o caten). Astfel, ADN pol I are un domeniu polipeptidic ce realizeaz activitate exonucleazic n direcie 3 5 , activitate foarte important ce i asigur enzimei i posibilitatea de a i corecta singur eventualele erori de ncorporare a unor nucleotide mperecheate greit. Aceast funcie este denumit citire corect (proof-reading). Totodat, ADN pol I poate desfura i activitate exonucleazic n direcie 5 3, activitate ce i permite ndeprtarea primerilor ARN.

ADN polimeraza II (ADN pol II) este codificat de gena polB. i aceast enzim poate avea i activitate exonucleazic 5 3.

ADN polimeraza III (ADN pol III) este principala replicaza a cromozomului bacterian i reprezint un adevrat complex enzimatic format din cel puin 10 subuniti funcionale (Tabelul din Figura 4.12).

Figura 4.12 Subunitile ADN polimerazei III de la procariote. Denumirea subunitii

Masa molecular

Gena Funcii Subansamblu

130 pol C (dnaC) ADN pol Exo 5 3 27 dnaQ Exo 3 5 10 holE structural

Miezul enzimei

71 dnaXZ Dimerizarea miezului

enzimei complexul

47 dnaXZ 35 holA 33 holB 15 holC 12 holD

ATPaze complexul favorizeaz transferul sub. la matria ADN

40 dnaN Leag miezul enzimei la ADN i l recicleaz

complexul

Holoenzima ADN pol III acioneaz ca dimer, fiecare din cei 2 monomeri realiznd sinteza pe

una din cele 2 catene. O excepie o reprezint complexul care acioneaz doar pe catena ntrziat.

Figura 4.13 Reprezentarea schematizat a interveniei subunitilor ADN polimerazei la eucariote.

71


4.1.3 Replicarea plasmidelor bacteriene Indiferent dac confer bacteriei gazd caractere eseniale sau neeseniale, toate plasmidele au

n structura lor o regiune foarte important pentru replicarea i meninerea stabil a plasmidului respectiv n populaia bacterian. n prezent se consider c aceast regiune esenial ar conine:

a) secvene de origine a replicrii plasmidiale, denumite convenional oriV (fata de oriC - originea replicrii cromozomului bacterian); o secven oriV trebuie s indeplineasca urmatoarele conditii:

- regiunea ADN minimal, cu activitate n cis, ce poate sustine replicarea plasmidial - regiunea ADN n care cele 2 catene se despart pentru a iniia procesul de replicare - nucleotidul/nucleotidele la care incepe sinteza catenei leading b) multe plasmide codific o protein implicat n iniierea replicrii plasmidiale,

denumita proteina de tip Rep c) gene implicate n controlul replicrii plasmidiale

4.1.3.1 Replicarea plasmidelor lineare (ADN d.c. linear)

n ceea ce privete replicarea plasmidelor lineare, aceasta se desfoar prin mecanisme diferite funcie de tipul de telomere.

a) plasmide cu telomere hairpin Datorit capetelor legate covalent, ADN polimeraza poate trece peste ele continund

replicarea printr-un intermediar replicativ concatemeric. Asemenea plasmide ar putea reprezenta un caz special de plasmide circulare monocatenare, n care jumtate din cerc este complementar cu cealalt jumtate.

b) plasmide cu telomere invertroni

se replic printr-un mecanism de replicare ADN primat de proteine, n cazul de fa proteina TP (Telomeric Protein). n cazul unor asemenea plasmide, telomerele reprezint originea replicrii i sunt recunoscute de proteine de iniiere care desfac dublul helix ADN. Plasmidele cu telomere invertroni sunt replicate de o ADN polimeraz ce seamn mai mult cu ADN polimeraza de la eucariote, dect cu ADN polimerazele de la procariote.

Ultima nucleotid de la capul 5 al fiecarei din cele 2 catene (nucleotida la care este ataat covalent proteina TP), este o adenin (A). Separat de molecula plasmidial, se formeaz complexe din alt monomer TP i alt molecul de adenin. Cei 2 monomeri TP (unul ataat la o adenin, iar cellalt ataat la adenina din telomera plasmidial) se atrag i are loc procesul de dimerizare, iar ntre A i primul nucleotid (T) de pe catena complementar se formeaz legturi de hidrogen. Tototdat, acest al doilea A ofera capul 3 liber pentru primarea polimerizarii (Figura 4.14).

Figura 4.14 Replicarea plasmidelor lineare cu telomere invertroni.

72


4.1.3.2 Replicarea plasmidelor circulare. Au fost descrise 3 mecanisme generale de replicare a plasmidelor circulare .

4.1.3.2.1 Mecanismul THETA Acest mecanism prezint asemnri foarte mari cu procesul de replicare a cromozomului

bacterian. Ca i n cazul acestuia, acest mecanism poart numele de theta datorit faptului c intermediarii de replicare sunt molecule cu forma literei grecesti theta. Mecanismul theta de replicare se intlnete cu precdere la plasmidele de la bacteriile Gram-negative, dar i la unele plasmide de la Gram-pozitive (streptococ, enterococ, unii lactococi).

Replicarea acestor plasmide necesit o protein iniiator, codificat plasmidial i denumit proteina Rep, iar procesul pornete de la o regiune denumita oriV, ce are organizare similar cu oriC din cromozomul bacterian.

Intreg procesul de replicare de tip theta depinde de mai multe clase de proteine, din care ns doar proteinele de tip Rep sunt codificate plasmidial, celelalte sunt codificate cromozomal i sunt aceleasi proteine ce intervin i n replicarea cromozomului bacterian. O excepie o reprezint plasmidul Col E1, care se replic printr-un mecanism de tip theta, dar nu necesit prezena unei proteine iniiator de tip Rep.

La plasmidele ce se replic prin mecanism theta, regiunea oriV cuprinde: 4-5 secvene ADN n repetitie direct i denumite iteroni, la care se ataeaz proteina Rep (iteronii exist i n cazul celorlalte dou mecanisme de replicare plasmidial), o regiune bogat n A/T, unde este iniiat desfacerea dublului helix, cutii dnaA, la care se ataeaz proteina DnaA.

Proteinele Rep sunt proteine de tip leucine-zipper cu un domeniu HTH (-helix-turn helix) i se ataeaz la ADN intr-o manier situs-specific, i anume la secvenele iteroni. Ataarea se realizeaz astfel nct moleculele Rep sunt aliniate pe aceeai fa a moleculei ADN.

Etape Procesul de replicare a plasmidelor prin mecanism theta se desfoar n urmatoarele etape :

a) n prima etap are loc ataarea proteinelor Rep la secvenele iteroni; acest lucru determin o curbare a moleculei ADN n aceast zon, fapt ce faciliteaz etapa urmtoare;

b) ataarea proteinelor DnaA la cutiile dnaA; la rndul ei, aceast etap o faciliteaz pe urmtoarea;

c) ataarea complexului proteic DnaB-DnaC la regiunea din oriV bogat n A/T; DnaB este o helicaz i desface dublul helix n aceast zon;

d) are loc sinteza unui ARN primer de ctre o ARN polimeraz codificat de o gen cromozomal;

e) incepe procesul de polimerizare desfurat, la majoritatea plasmidelor din aceast clas, de ctre ADN polimeraza III (excepie face plasmidul Col E1, care este replicat prin mecanism theta, dar de ctre ADN polimeraza I);

f) sinteza celor 2 catene (leading i lagging) este cuplat i se desfoar cvasi-simultan; g) sinteza se desfoar n majoritatatea cazurilor unidirecional, spre deosebire de replicarea

cromozomului bacterian care la marea majoritate a speciilor bacteriene se desfoar bidirecional. Dintre cele mai cunoscute plasmide ce se replic prin mecanism theta, amintim pSC101, P1,

RK2, RP4, R6K, R1, CColE2, ColE3.

4.1.3.2.2 Mecanismul STRAND-DISPLACEMENT (SD) Denumirea provine din termenul strand-displacement (dislocarea catenei) i se refer la faptul

c n timpul procesului de replicare are loc dislocarea uneia din cele 2 catene ADN. Acest mecanism se ntlnete mai ales la plasmidele promiscue din grupul de incompatibilitate IncQ. La aceste plasmide regiunea oriV este alcatuit din 3 secvene ADN de tip iteroni, 1 regiune bogat n G/C (174 bp), 1 regiune bogat n A/T (31 bp)

Procesul de replicare ADN de tip strand-displacement nu depinde de proteine ale celulei gazd (codificate cromozomal, cum ar fi DnaA, DnaB, DnaC), ci de trei proteine codificate plasmidial:

RepA este o helicaz ce intra n dublul helix ADN n regiunea bogat n A/T i faciliteaza dislocarea catenei parentale nereplicate sub forma buclei D (forma literei D);

73


RepB este o primaz care sintetizeaz un primer ARN necesar iniierii polimerizrii ADN; RepC este o protein iniiator care se ataeaz la secvenele iteroni din oriV. Replicarea pornete de la dou origini (ssiA i ssiB) simetrice i adiacente, ce funcioneaz n

forma monocatenar i sunt situate pe cele 2 catene. Procesul de replicare ncepe cnd aceste 2 origini sunt expuse monocatenar.

Etape Procesul de replicare SD se desfoar n urmtoarele etape:

1. monomeri ai proteinei RepC se ataeaz la secvene iteroni din oriV; 2. proteina RepA (helicaza) se ataeaz la regiunea din oriV bogat n A/T, determinnd

desfacerea dublului helix; 3. proteina RepB (primaza) se ataeaz la bucla A/T i sintetizeaz un primer ARN; 4. ncepe procesul de polimerizare ADN; 5. helicaza RepA faciliteaz dislocarea catenei parentale nereplicate sub forma unei bucle D. Produsele intermediare ale unui proces de replicare SD sunt:

- o molecul ADN circular d.c. - o molecul ADN circular m.c. pe aceasta va fi iniiat un nou proces de replicare

care va conduce la formarea catenei complementare, i deci, a formei dublucatenare a plasmidului.

n cazul unui asemenea mecanism de replicare sinteza celor dou catene noi ale moleculei de

ADN nu este cuplat i simultan.

4.1.3.2.3 Mecanismul ROLLING-CIRCLE (RC) Denumirea provine din faptul c n timpul procesului, molecula de ADN are forma unui cerc

rotativ. Acest mecanism de replicare este ntlnit la plasmide din multe bacterii Gram-pozitive, de exemplu plasmidul pT181 (de la Staphylococcus), pUB110 i pC194 (de la Bacillus subtilis).

Ca i n cazul mecanismului SD, replicarea de tip RC depinde de o protein iniiator codificat plasmidial (propteina Rep) i de o serie de proteine codificate pe cromozomul bacterian.

Plasmidele ce se replic prin mecanism RC au doua secvene ori situate distanat una de alta: dso (double-stranded origin), de la care este iniiat replicarea primei catene noi (catena

leading); dso are 2 regiuni: regiunea bind, la care are loc ataarea proteinei iniiator Rep i regiunea nick, n care proteina Rep produce ruptura monocatenar initial

sso (single-stranded origin), de la care este iniiat sinteza celei de-a doua catene noi (catena lagging)

Etape n procesul de replicare RC se parcurg urmtoarele etape: - proteina Rep se ataeaz la regiunea bind a secvenei dso; - proteina Rep taie o legtur fosfodiesteric (ruptur monocatenar) i rmne ataat la

capul 5 Tyr-fosfodiesteric; capul 3 va servi ca primer pentru sinteza catenei leading; - n procesul de sintez a catenei leading intervin o serie de proteine codificate pe

cromozomul bacterian: helicaza, Ssb, ADN polimeraza III; - replicarea catenei leading continu mai mult de o rund complet depind regiunea dso; - pentru terminarea replicrii catenei leading are loc o reacie de transfer de caten: prin

monomerul liber, proteina Rep atac regiunea dso a catenei vechi, taie o legatur fosfodiesteric i reface alta, rezultnd o molecul circular d.c. care a eliberat i un dimer de Rep inactiv i, respectiv, o molecul circular m.c. pe care, de la sso, este sintetizat un primer i apoi o caten noua

Deci, i n cazul acestui mecanism sinteza celor dou catene ADN noi nu este cuplat. Intr-un asemenea proces proteina Rep are un rol mai complex dect ntr-o replicare SD :

- se ataeaz la dso, avnd rol n iniierea replicrii; - taie o legtur fosfodiesterica, producnd nick-ul iniial; - la terminarea sintezei primei catene noi, Rep taie i reface legturi fosfodiesterice

Datorit activitatii sale catalitice, proteina Rep de la plasmidele ce se replic printr-un mecanism RC este similar cu topoizomerazele din clasa I.

74


n general, plasmidele ce se replic prin RC au o alctuire modular, cel mai important modul fiind LIC (Leading strand Initiation and Control region) care este format din dso, gena rep i elemente de control al replicrii plasmidei. Pe baza structurii LIC au fost definite 4 familii de plasmide ce se replic prin mecanism RC, familii ce au drept reprezentani urmatoarele plasmide: pT181, pC194, pMV158, pSN2. Alte module importante n aceste plasmide sunt: 1-2 sso, 1 mob, 1 gen de antibiorezisten.

4.1.3.3 Mecanisme de control al replicrii ADN plasmidial Replicarea acestor plasmide se desfoar unidirecional i este realizat de ADN polimeraza

I i nu de ADN pol III care replic cromosomul bacterian.

Plasmidele din familia Col E1

Procesul de replicare ncepe cu sinteza unui ARN primer (=ARN II), ce este transcris ncepnd de la un situs localizat la 555 pb n amonte fa de oriV. Iniial, acest transcript este separat de ADN, ca n cazul unei transcrieri obinuite. Pe msur ce ARN polimeraza se apropie de oriV, transcriptul ncepe s ramn hibridizat cu matria ADN; cauza probabil: ARN II contine 6 G consecutive situate la circa 265 nucleotide n amonte fa de oriV; aceste 6 G interacioneaz probabil cu 6 C consecutive din ADN matri, ce se gsesc la cca 20 nucleotide n amonte fa de oriV. Apoi hibridul este tiat de RNaza H, iar capul 3 al ARN va fi elongat de ADN pol I.

O modalitate de control negativ al replicrii plasmidelor din familia Col E1 este prin formarea unui al doilea ARN (=ARN I), care are funcie de ARN antisens, contine 108 nucleotide i este transcris de la -445 fa de oriV, dar n direcie opus, de pe cealalt caten ADN.

Prin legarea lui ARN I (antisens) de ARN II (primer) este alterat conformaia secundar a acestuia din urm, astfel nct ARN primer nu mai poate hibridiza cu oriV.

Acest ARN antisens este transcris constitutiv, dar este instabil, iar legarea lui la ARN II este mediat de o protein numit Rop (codificat de gena rop).

Aplicarea unui inhibitor al sintezei proteice (de exemplu, cloramfenicolul) blocheaz sinteza proteinei Rop, rezultatul fiind o crestere a frecvenei de iniiere a replicrii plasmidelor Col E1. Acest lucru se bazeaz pe faptul c n citoplasma bacterian exist suficiente molecule de ADN pol I (cca 300), chiar dac este blocat proteosinteza.

pSC101

Prima citare a lui pSC101 n literatura de specialitate a fost n 1973 - Cohen care a folosit-o ca

vector n experimente de clonare. Ulterior ns, aceast plasmid a fost identificat ca plasmid natural la Salmonella i Escherichia coli. Ea prezint un numr mediu de copii (6-7) per echivalent cromosomal i are o gen de rezisten la tetraciclin. ntreaga plasmida (9263 pb) a fost complet secveniat.

Regiunea replicativ a acestei plasmide are 3 zone majore: (1) regiunea par - foarte important pentru stabilitate i afecteaz i numrul de copii; (2) regiunea ori - de la care pornete replicarea unidirecional i care conine

majoritatea situsurilor necesare pentru replicare i pentru incompatibilitate; (3) gena repA - care este o gen specific plasmidial i codific o protein de

replicare. pSC101, mpreun cu fagul P1 i cu o serie de alte plasmide (F, R6K), aparine unei clase de

repliconi a caror replicare nu este realizat de ADN polimeraza I. Aceti repliconi codific o protein autoreglat (RepA) esenial pentru replicare i poseda copii repetate direct ale unei secvene ce este specific pentru fiecare plasmid i la care se ataeaza proteina RepA. RepA se ataeaz la cele 3 secvene RS din regiunea ori , participnd la iniierea replicrii.

75


Figura 4.15 Controlul replicrii la plasmidul Col E1.

Meninerea stabil a lui pSC101 n celula bacterian presupune intervenia a mai multor clase de proteine: DnaA (esenial i n iniierea replicrii cromosomului bacterian), IHF (Integration Host Factor, protein histone-like implicat n reglarea unei serii de procese celulare), DnaB, DnaC, DnaG (primaza), componente ale holoenzimei ADN polimeraza III.

Regiunea ori din plasmidul pSC101 conine situsuri multiple de legare pentru proteine eseniale n replicarea plasmidial:

- un situs de ataare a proteinei DnaA - 2 secvene repetate, formate din cte 13 pb (13-mer), omoloage cu secvenele din

oriC i la care se ataeaz complexul DnaB-DnaC - o regiune bogat n A/T - ntre regiunea A i regiunea T se gasete situsul pentru IHF - un cluster de 3 secvene repetate direct RS1 (24 pb), RS2 (18 pb), RS3 (24 pb) la

care se atasaza proteina RepA - ARN polimeraza se ataeaza la un promotor localizat n i ntre aceste 3 secvene

RS (promotorul pentru ARN-Y) Procesul de transcriere n regiunea oriV i implicat n iniierea replicrii este un fenomen

extrem de frecvent n lumea bacterian, att pentru replicarea cromosomului, ct i a unor plasmide. n cazul lui pSC101, printr-un asemenea proces de transcriere la origine, este sintetizat ARN-Y care ncepe din mijlocul lui RS2. Acest proces nu se afl sub controlul proteinei RepA, iar rolul moleculei ARN-Y pare s fie acela de a facilita deschiderea dublului helix ADN n regiunea ori.

Regiunea par nu este esenial pentru replicare (plasmidele par- se replic), dar este esenial pentru stabilitatea plasmidelor n celula bacterian, probabil prin situsul pentru giraza.

76


Legarea simultan a proteinelor Rep A, IHF, Dna A, DnaB-Dna C este favorizat de curbarea ADN determinat de legarea IHF (curbeaza dublul helix ADN cu150o la situsul de atasare), i determin formarea REPLISOMULUI.

Reglarea numrului de copii plasmidiale la pSC101 i, probabil, i la alte plasmide i sisteme similare, nu este produsul unui singur mecanism de reglare, ci este o rezultant a unui set de interaciuni moleculare (ADN-proteine, ADN-ADN, proteine-proteine), fiecare dintre ele contribuind la replicarea, stabilitatea i partiia eficient a plasmidului.

Figura 4.16 Structura regiunii replicative la plasmidul pSC101.

4.2 TRANSCRIEREA GENETIC

Principii i definiii

Transcrierea genetic reprezint procesul de sintez, catalizat enzimatic, a moleculelor de ARN, ca urmare a citirii informaiei codificate n molecule ADN. Procesul se desfoar pe baza legilor de complementaritate chimic dintre cele 2 catene ale unei molecule de acid nucleic dublu catenar i conduce la formarea de legturi fosfo-diesterice ntre ribonucleotide.

Prin transcriere genetic se sintetizeaz toate tipurile de molecule ARN proprii celulelor, att la organisme procariote, ct i la eucariote, i anume: ARN mesager (ARNm), ARN ribozomal (ARNr), ARN de transfer (ARNt), ARN heterogen nuclear (ARNhn).

Molecula ARN rezultat prin transcriere, nainte de orice alt procesare, poart numele de transcript primar.

Procesul de transcriere a unei poriuni din ADN (denumit gen) presupune deci sinteza unei copii a informaiei genetice, copie care din punct de vedere chimic este o molecula de acid nucleic monocatenar, i anume ARN.

Transcrierea ncepe n anumite zone din molecula ADN, zone numite promotori. Acetia au anumite secvene de nucleotide care i fac uor de recunoscut de ctre ARN polimeraze (enzimele ce sintetizeaz molecule de ARN). n zona promotorilor dublul helix ADN este desfcut de ctre ARN polimeraze, formndu-se o aa-numit bucl de transcriere. n interiorul acesteia, ARN polimeraza sintetizeaz o molecul de ARN, copiind informaia genetic de pe una din catenele ADN pe care o folosete ca matri.

Primul nucleotid de pe catena ADN matri care este citit i cruia i corespunde un prim nucleotid n catena ARN, este numerotat convenional cu +1 i denumit startpoint (punct de pornire a transcrierii). Urmtoarele nucleotide din matria ADN sunt numerotate +2, +3, +4 etc.

Fa de poziia nucleotidului +1, se definesc 2 zone n matria ADN : - zona amonte (upstream), n care nucleotidele sunt numerotate cu semnul minus (-1, -2, -3

etc) - zona aval (downstream), n care nucleotidele sunt numeortate cu semnul plus (+2, +3, +4 etc)

77


Procesul de transcriere pornit de la promotori continu pn n anumite zone din ADN, cu anumite secvene, zone denumite terminatori. n aceste zone, ADN polimeraza se desprinde de pe molecula de ADN, bucla de transcriere format n dublul helix ADN se nchide, iar transcriptul ARN este eliberat.

O zon din ADN cuprins ntre un promotor i un terminator poart numele de unitate de transcriere. Din cele 2 catene ale moleculei de ADN, catena care este folosit ca matri pentru sinteza unui transcript ARN este complementar cu aceasta i este numit caten antisens. Catena ne-matri este denumit caten codificatoare sau caten sens.

Admind c o gen reprezint o zon din ADN (sau mai exact, secvena de nucleotide de pe una din catenele ADN dintr-o anumit zon) ce codific un polipeptid (sau o molecul de ARNr, ARNt ARNhn), o unitate de transcriere poate include :

- o singur gen, caz n care se numete transcriere monocistronic - sau mai multe gene, caz n care se numete transcriere policistronic Dei exist i destule excepii, n general, transcrierea monocistronic este caracteristic

organismelor eucariote, iar cea policistronic procariotelor (Figura 4.16)

Figura 4.17 Reprezentarea schematizat a unui proces de transcriere monocistronic i, respectiv, policistronic.

4.2.2 Enzime

Procesul de transcriere genetic este catalizat de o clas special de enzime numite ARN polimeraze.

La organismele procariote eixst cte o singur specie molecular de ARN polimeraz per celul, aceasta realiznd sinteza tuturor tipurilor de ARN din celul.

La eucariote, majoritatea celulelor dein cte 3 specii moleculare de ARN polimeraze, fiecare dintre ele sintetiznd anumite specii de ARN.

4.2.3 Transcrierea la procariote

4.2.3.1 Promotori Promotorii reprezint secvene din structura ADN, aflate n amonte fa de ogen, la care se

ataeaz n mod situs-specific (n funcie de secvena de nucleotide) ARN polimeraza. Un promotor de la procariote prezint 4 regiuni importante din punct de vedere funcional : - o secven hexameric (adic format din 6 perechi de baze) n jurul poziiei -35; este denumit generic hexamerul -35 - o secven hexameric n jurul poziiei -10, denumit generic hexamerul -10 - o regiune spaiatoare ntre cei 2 hexameri (ADN spacer)

78


- o regiune situat ntre poziiile -40 i -60, bogat n A i T, denumit elementul UP (Upstream = amonte)

Cei 2 hexameri i elementul UP au secven de nucleotide nalt conservat, secvenele

consensus fiind 5-TTGACA-3 pentru hexamerul -35 i, respectiv, 5-TATAAT-3 pentru hexamerul -10 (Figura 4.18).

Cu ct secvenele de nucleotide din cei 2 hexameri sunt mai apropiate de cele de mai sus, cu att tria promotorului respectiv este mai mare, adic cu att ARN polimeraza se va ataa mai strns i cu att gena respectiv va fi transcris cu o rat mai ridicat.

Cei 2 hexameri din promotori sunt recunoscui de subunitatea ARN polimerazei, iar la elementul UP se ataeaz subunitatea -CTD a acestei enzime.

Figura 4.18 Structura promotorilor la procariote.

4.2.3.2 Terminatori Transcrierea genetic continu de la promotori pn la terminatori. Acetia reprezint regiuni

din molecula ADN ce prezint o anumit secven de nucleotide: - 2 copii ale unei secvene poli-GC n repetiie invers; aceast regiune prezint

complementaritate intracatenar i determin formarea n transcriptul ARN a unei structuri n ac-de-pr (hairpin) ce mpiedic avansarea ARN polimerazei

- o regiune format din 4 10 adenine (ce corespunde pe transcript cu 4 10 resturi de uracil) care reprezint semnalul propriu-zis de terminare a transcrierii

Dei regiunile terminator sunt identificate pe molecula ADN, terminarea transcrierii este de fapt realizat de catena ARN (Figura 4.19).

Pn n prezent au fost identificate 2 clase de terminatori la procariote: - terminatori Rho independeni : sunt regiuni de tip terminator n care cele 2 secvene poli-

GC prezint complementaritate intracatenar perfect, realiznd o structur n ac-de-pr stabil - terminatori Rho dependeni : sunt regiuni terminator n care cele 2 poli-GC nu prezint

complementaritate intracatenar perfect; n acest caz structura n ac-de-pr este stabilizat de ctre o protein numit proteina Rho (de la litera greceasc Rho - ) care alunec pe molecula ARN pn la acul-de-pr i l stabilizeaz.

Figura 4.19 Structura terminatorilor la procariote.

79


4.2.3.3 ARN polimeraza de la procariote

Aceast enzim este una dintre cele mai mari proteine din celula bacterian, avnd o greutatea de 480 kd, un diametru de aproximativ 100 Angstromi i fiind vizibil i la microscopul electronic. O celul de E.coli conine n medie 7000 de molecule de ARN polimeraz.

Holoenzima este format din 4 tipuri de subuniti:, b, b i . Subunitatea este dimerizat, formul general a enzimei fiind 2a .

Subunitatea este codificat de gena rpoA i este dimerizat. Ea are un prim rol n asamblarea tuturor subunitilor enzimei, proces ce se desfoar n ordinea: 2 2- 2-- 2---. Fiecare monomer de este format din 3 regiuni:

CTD reprezint domeniul carboxi-terminal al subunitii i se ataeaz direct la ADN, recunoscnd secvena UP din structura promotorilor.

NTD reprezint domeniul amino-terminal al subunitii; nu se ataeaz direct la ADN, ci la subunitatea

- linker polipeptidic ce are o structur flexibil i face legtura dintre cele 2 domenii terminale

Subunitatea este codificat de gena rpoB i realizeaz formarea propriu-zis a legturilor fosfo-diesterice ntre ribonucleotide, acest proces desfurndu-se ntotdeauna n direcie 5 3.

Subunitatea este codificat de gena rpoC i are rol n ataarea iniial, situs-nespecific a ARN polimerazei la molecula de ADN (Figura 4.20).

Subunitatea Celula procariot conine mai multe specii moleculare de subunitate , fiecare recunoscnd

anumii promotori i, deci, transcriind anumite gene. Astfel, n celula de E.coli, cele mai des ntlnite specii moleculare de sunt:

70 are o g.m. de 70 kd i codificat de gena rpoD; acest recunoate cele 2 secvene consensus TTGACA i TATAAT, fiind folosit de celula bacterian n condiii generale de mediu. Ca urmare, marea majoritate a genelor bacteriene sunt transcrise cu ajutorul acestei subuniti 70.

60 are g.m. 60 kd, este codificat de gena rpoN i este folosit de celul n condiii de privare de azot.

32 are g.m. de 32 kd, este codificat de gena rpoH i este folosit de celul n condiii de oc termic; cu ajutorul acestei subuniti sunt transcrise genele de oc termic.

24 are g.m. 24 kd, nu este cunoscut gena codificatoare i este folosit de celul n condiii de oc termic extrem; se pare c 24 particip la transcrierea unui set de gene ce determin o moarte celular programat, o sinucidere celular (asemntoare proceselor de apoptoz de la celulele eucariote).

Figura 4.20 Reprezentarea schematic a atarii ARN polimerazei procariote la promotori.

80


4.2.3.4 Fazele transcrierii genetice la procariote Ca i alte procese realizate de materialul genetic, transcrierea genetic se desfoar n 3 etape

iniierea, elongarea i terminarea transcrierii.

Iniierea transcrierii Aceast etap ncepe prin ataarea ARN polimerazei la un promotor, proces ce se desfoar

el nsui n mai multe etape: a) etapa de promotor nchis I ARN polimeraza se ataeaz la hexamerul -35 b) etapa de promotor nchis II (promotor curbat) ARN polimeraza se ataeaz apoi i la

hexamerul -10; cei 2 hexameri nu sunt ns orientai steric optim fa de situsurile de ataare la ARN polimeraz (i anume lla subunitatea s); ca urmare, pentru a se ataa la amndoi hexamerii, enzima trebuie s distorsioneze molecula de ADN; deci, promotorul curbat prezint o tensiune torsional ce va fi eliberat prin deschiderea dublului helix pe o distan de 10 18 pb, ajungndu-se astfel n cea de-a treia etap, cea de

c) etapa de promotor deschis; se formeaz astfel bucla de transcriere care depete situsul START (nucleotidul +1 al catenei matri)

Se formeaz astfel un complex binar: ADN ARN polimeraz. Iniierea transcrierii continu cu ataarea primului nucleotid, care de obicei la procariote este ATP sau GTP. Complexul devine astfel din binar, ternar: ADN ARN polimeraz ARN. Dup sinteza a aproximativ 8-10 ribonucleotide, subunitatea se desprinde din complex, considerndu-se c acest eveniment ncheie etapa de iniiere a transcrierii.

Elongarea transcrierii Aceast etap ncepe dup desprinderea subunitii i este realizat de subunitatea care

formeaz legturi fosfo-diesterice ntre ribonucleotide. Catena ARN crete n direcia 5 - 3. Odat cu ARN polimeraza, i bucla de transcriere se deplaseaz pe molecula de ADN, transcriptul rmnnd n hibrid cu matria ADN doar pe o poriune de aproximativ 12 nucleotide.

Rata de polimerizare a ARN polimerazei de la E.coli este de circa 30 40 nucleotide per secund. Frecvena erorilor de ncorporare (a ribonucleotidelor greit mperecheate cu cele din catena matri ADN) de ctre aceast enzim este de 1 baz greit per 104 baze ncorporate. Dup ce ARN polimeraza a trecut de promotor, o alt enzim (cu tot cu subunitate ) se poate ataa la acesta i poate ncepe o nou rund de transcriere.

Terminarea transcrierii Terminarea transcrierii are loc n momentul n care ARN polimeraza ajunge n regiunea unui

terminator. Acul-de-pr format n catena transcriptului (vezi figura 4.18) blocheaz avansarea enzimei i o determin s staioneze cteva milisecunde; acest timp este ns suficient pentru ca transcriptul s se desprind din hibridul cu catena ADN matri (desprinderea este facilitat i de faptul c legturile dintre poli-A de pe ADN i poli-U din ARN sunt slabe). Bucla de transcriere se inchide i astfel procesul este ncheiat.

Moleculele de ARN transcript pot evolua fie ca ARN measger, ARN ribozomal, ARN de transfer.

Majoritatea moleculelor de ARNm de la procariote sunt monocistronice i sunt altuie din 3 regiuni mai importante :

- regiunea cap (leader), care conine secvena SHINE-DALGARNO (5-AGGAGG3) ce este complementar cu un hexamer de la capul 3 al moleculelor de ARNr de 16S

- regiunea codificatoare, care ncepe cu codonul start AUG i se termin cu un codon stop - regiunea cozii

81


4.2.4 Transcrierea la eucariote

4.2.4.1 ARN polimerazele la eucariote n sine, procesul de transcriere la organismele eucariote se desfoar n mod similar cu cel de

la procariote. Exist totui o serie de diferene. Astfel, n timp ce la procariote exist o singur specie molecular de ARN polimeraz per

celul, la eucariote exist, n majoritatea cazurilor 3 specii moleculare de asemenea enzime. Cele 3 ARN polimeraze de la eucariote sunt nrudite i structural i funcional. Cu toate acestea, cele 3 enzime iniiaz transcrierea de la promotori diferii i transcriu gene diferite :

- ARN polimeraza I transcrie n mod special gene ce codific pentru ARN ribozomal - ARN polimeraza II transcrie mai ales gene ce codific ARN mesager - ARN polimeraza III transcrie mai ales ARN de transfer i o serie de molecule mici de

ARN, de exemplu ARN nuclear mic i nucleolar mic Alte diferene importante apar i n ceea ce privete factorii de transcriere. Astfel, dac la

procariote iniierea transcrierii necesit doar facotrul , la eucariote debutul acestui proces necesit mai multe proteine, denumite generic factori de transcriere generali.

n general, structura promotorilor pentru ARN pol I i III este mai simpla dect a promotorilor pentru ARN pol II, dei i aceste 2 enzime necesit factori de transcriere.

4.2.4.2 Promotorul la eucariote Regiunile promotor la eucariote prezint o zon miez care cuprinde un set minimal de

secvene necesare iniierii transcrierii de ctre ARN pol II. Un asemenea miez de promotor este de obicei format din 40 de nucleotide ce cuprind de multe ori i situsul START (nucleotidul +1) i este format din:

- elementul BRE ce reprezint elementul de recunoatere a factorului de transcriere TFIIB (TFIIB Recognition Element)

- cutia TATA la care se ataeaz factorul TBP (TATA Binding Protein); aceast protein reprezint de fapt o subunitate a factorului de transcriere TFIID

- regiunea Inr (Initiator) la care se ataeaz factorul TFIID - regiunea DPE (Downstream Promoter Element = elementul n aval fa de promotor) la

care se ataeaz tot TFIID Cei mai muli promotori de la eucariote includ doar 2 sau 3 din aceste regiuni (Figura 4.21).

4.2.4.3 Complexul de pre-iniiere Factorii de transcriere necesari ARN polimerazei II au fost notai TFII (Transcription Factors

for RNA polymerase II). La eucariote se formeaz mai nti un complex preoteic de pre-iniiere care se ataeaz la

elementul TATA. Succesiunea de evenimente este urmtoarea : - elementul TATA este recunoscut de TFIID; aceast protein este un complex cu mai

multe subuniti, dintre care una (TBP) se va lega la cutia TATA. - celelalte subuniti ale complexului TFIID poart numele de proteine TAF (TBP

Associated Factors = factori asociai cu TBP) - TBP se leag la cutia TATA; prin legarea sa la cutia TATA, TBP distorsioneaz

molecula de ADN n acea regiune determinnd recrutarea i a altor factori de transcriere i a ARN polimerazei

- TFIIA i TFIIB se ataeaz la promotor - TFIIF se cupleaz cu ARN polimeraza i mpreun se ataeaz la promotor - TFIIE i TFIIH se ataeaz i ei la ntreg acest complex nucleo-proteic

Ca urmare a atarii acestor proteine, dublul helix se deschide n zona promotorului. Spre deosebire de procariote, la eucariote deschiderea dublului helix necesit energie (furnizat prin hidroliza ATP) iar procesul este mediat de activitatea de tip helicaz a factorului TFIIH.

Sinteza catenei ARN poate acum s nceap.

82


Figura 4.21 Structura unui promotor la eucariote.

Figura 4.22 Factorii generali de transcriere pentru ARN polimeraza II

Factori generali de transcriere

Numrul de subuniti

TBP 1 TFIIA 2 TFIIB 1 TFIIE 2 TFIIF 3 TFIIH 9 proteine TAF 11

Caseta 4. ....Rolul celorlalte proteine GTF Proteinele TAF se asociaz cu factorul TBP, mediind ataarea acestuia la cutia

TATA. TFIIB se pare c mediaz legtura dintre complexul TBP-TATA i ARN polimeraz. TFIIF modific conformaia steric a ARN polimerazei facilitnd ataarea acesteia la promotor. TFIIE l aduce pe TFIIH i i regleaz activitatea. TFIIH desface legturile de hidrogen dintre cele 2 catene ADN, cu formarea buclei de transcriere.

S-a constatat c in vivo iniierea transcrierii la eucariote necesit i alte proteine n afar de cele listate mai sus, inclusiv un aa-numit complex mediator, a

4.2.4.4 Factorii de elongare n aceast etap, ARN polimeraza II se desprinde de marea majoritate a factorilor de iniiere.

Locul lor este luat de un set de factori de elongare (TFIIS, TEF). Astfel, TFIIS asigur corporarea corect a ribonucleotidelor i corecteaz bazele ncorporate greit (funcie de proofreading). Factorul TEF fosforileaz anumite reziduuri de serin din structura ARN polimerazei II, fapt ce stimuleaz etapa de elongare.

Pe de alt parte, n timpul etapei de elongare, ARN polimeraza se asociaz cu o serie de proteine necesare pentru procesarea tipurilor de ARN transcript.

- enzime ce adaug la capul 5 al transcriptului un rest de guanin metilat, ceea ce i va conferi transcriptului rezisten la enzime de tip nucleaze i se ataeaz la structura ribozomului

- enzime ce produc poliadenilarea captului 3: enzime de tip poli-A polimeraze adaug o coad de pn la 200 de resturi de A la capul 3 al transcriptului; ataarea unei asemenea enzime pare s fie implicat n terminarea transcrierii

83


84

BIBLIOGRAFIE SELECTIV

1. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P., 2002, Molecular Biology of the Cell. 4th ed., Garland Publishing House, New York.

2. Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L., 2002, Biochemistry. , W. H. Freeman and Co., New York. 3. Brown T.A., 2002, Genomes. 2nd ed., BIOS Scientific Publishers, Ltd, Oxford, UK. 4. Campbell A.M., 1992, Chromosomal insertion sites for phages and plasmids. Journal of Bacteriology

174(23):7495-7499. 5. Cohen S.N., 1993, Bacterial plasmids: their extraordinary contribution to molecular genetics. Gene 135:67-76. 6. Cooper G.M., 2000, The Cell - A Molecular Approach. 2nd ed., Sinauer Associates, Inc., SUA. 7. Cornea C.P., 1998, Elemente de Inginerie Genetic, Editura ALL, Bucureti. 8. Covic M., tefnescu D., Sandovici I., 2004, Genetic medical, Editura Polirom. 9. Dale J.W., 1998, Molecular Genetics of Bacteria, 3rd Edition.Anonymous Chichester, UK:John Wiley & Sons. 10. Del Solar G., Giraldo R., Ruiz-Echevarria M.J., Espinosa M., Diaz-Orejaz R., 1998, Replication and control of

circular bacterial plasmids. Microbiol Molec Biol Rev 62(2):434-464. 11. Embley T.M., Hirt R.P., Williams D.M., 1994, Biodiversity at the molecular level: the domains, kingdoms and

phyla of life. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 345(1311):21-33. 12. Espinosa M., del Solar G., Rojo F., Alonso J.C., 1995, Plasmid rolling circle replication and its control. FEMS

Microbiol Lett 130:111-120. 13. Freifelder D., 1987, Microbial Genetics. Jones and Bartlett Publishers. Boston, USA. 14. Gavril L., 2003, Genomica Un tratat despre genom, de la virusuri la om, vol.I, vol.II, Ed. Encicl., Bucureti. 15. Gilson E., Bachellier S., Perrin S., Perrin D., Grimont P.A.D., Grimont F., Hofnung M., 1990, Palindromic unit

highly repetitive DNA sequences exhibit species specificity within Enterobateriaceae.. Researches in Microbiology 141:1103-1116.

16. Griffiths A.J.F., Miller J.H., Suzuki D.T., Lewontin R.C., Gelbart W.M., 1999, Introduction to Genetic Analysis. 7th ed., W. H. Freeman & Co., New York.

17. Hardy K.G., 1988, Plasmids: A Practical Approach. IRL Pres. Oxford, UK. 18. Herlea V., 1998 Microbiologie general, Ed. Univ., Bucureti. 19. Hinnebusch H., Barbour A.G., 1992, Linear- and circular-plasmid copy numbers in Borrelia burgdorferi. J.Bact.

174(16):5251-5257. 20. Hinnebusch J., Tilly K., 1993, Linear plasmids and chromosomes in bacteria. Molecular Microbiology

10(5):917-922. 21. Hiraga S., 1992, Chromosome and plasmid partition in E.coli. Annu Rev Biochem 61:283-306. 22. Lewin B. , 1997, Genes. 6th ed., Oxford University Press, New York, USA. 23. Lodish H., Berk A., Zipursky S.L., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J.E., 2000, Molecular Cell Biology. 4th

ed., W. H. Freeman & Co. Publishing, New York. 24. Manen D., Caro L., 1991, The replication of plasmid pSC101. Molecular Microbiology 5(2):233-237. 25. Margulis L., 1992, Biodiversity: molecular biological domains, symbiosis and kingdom origins. Biosystems

27(1):39-51. 26. Moller-Jensen J., Gerdes K.J.R., 2000, Plasmid and chromosome segregation in prokaryotes. Trends in

Microbiology 8(7):313-320. 27. Nester E.W., Evans Roberts C., Nester M., 1995, Microbiology, A Human Perspective, WCB Publishers, SUA. 28. Pettijohn D.E., 1988, Histone-like proteins and bacterial chromosome structure. J Biol Chem 263(26):12793-6. 29. Prescott L.M., Harlez J.P., Klein D.A., 1996, Microbiology. Third Edition, WCB Publishers, SUA. 30. Raicu P., Stoian V., 1991, Genetica dezvoltrii la eucariote, Editura Academiei Romne. 31. Russel P.J., 1994, Fundamentals of Genetics, Harper Collins College Publishers, SUA. 32. Sakaguchi K., 1990, Invertrons, a class of structurally and functionally related genetic elements that includes

linear DNA plasmids, transposable elements and genomes of adeno-type viruses.. Microbiol Rev 54(1):66-74. 33. Stoica I., Vassu T., Ssrman E., 2002 Biologia i taxonomia molecular a microorganismelor. Colecia de

culturi microbiene. Ed. Arvin Press. 34. Strachan T., Read A.P., 1999, Human Molecular Genetics 2. 2nd ed., BIOS Sci. Publishers, Ltd,Oxford, UK. 35. Summers D.K., 1996, The Biology of Plasmids.Anonymous Anonymous Oxford, UK:Blackwell Science Ltd. 36. Sykora P., 1992, Macroevolution of plamids: a model for plasmid speciation. J Theor Biol 159:53-65. 37. Trun N.J., 1998, Architecture of a bacterial chromosome. ASM News 64(5):276-283. 38. Vassu T., Stoica I., Cstuak O., Muat F., 2001, Genetica microorganismelor i Inginerie genetic microbian.

Note de curs i Tehnici de laborator. Editura Petrion, Bucureti. 39. Watson J.D., Baker T.A., Bell S.P., Gann A., Levine M., Losick R., 2004, Molecular Biology of the Gene. Fifth

Edition, CSHL Press. 40. Weaver R.F., 1999, Molecular Biology, WCB McGraw-Hill Press. 41. Woese C.R., Kandler O., Wheelis M.L. , 1990, Towards a natural system of organisms: proposal for the

domains Archaea, Bacteria and Eucarya., Proc Natl Acad Sci USA, 87, pp 4576-4579. 42. Zarnea G., Tratat de Microbiologie Generala. vol I (1983), II (1984) i V (1994), Editura Academiei Romane.

4.1.3.2.1 Mecanismul THETA

Cap_4 Functiile Materialului Genetic (1)

Documents

Transcript of Cap_4 Functiile Materialului Genetic (1)