BIOTEHNOLOGII IN INDUSTRIA ALIMENTARA

SUPORT CURS ANUL III TPPA +CEPA

BIOTEHNOLOGII CLASICE SI MODERNE Progresele considerabile nregistrate n ultimul secol n domeniul biotehnologiei , avnd la baza o serie de descoperiri tiniifice, dintre care amintim descoperirea ADN-ului, n 1953 i stabilirea tehnicilor de manipulare genetic n 1973, au pus bazele unei biotehnologii moderne cu considerabile efecte economice i sociale . Realizrile din ultimele decenii n domeniul ingineriei genetice, au determinat pe oamenii de tiin s anticipeze c secolul XXI va fi dominat de aceast activitate, aa cum secolul XX a fost dominat de descoperirile fizicii: tehnica informatic, fisiunea nuclear, explorarea cosmosului . Cele mai cunoscute descoperiri ale ingineriei genetice din secolul XX sunt: interferonul (o protein sintetizat de celula uman ca rspuns la atacul unor virusuri i care astzi se folosete pentru tratarea cancerului hepatic), insulina produs de bacterii, hormoni de cretere umani sau diferite vaccinuri . Cele mai multe cercetri, cu cele mai multe rezultate au fost realizate n domeniul medicinei i industriei farmaceutice: producia de hormoni, de antigene, de enzime, de reactivi necesari diagnosticrii. In domeniul industriei, biotehnologiile asigur valorificarea deeurilor industriale pentru obinerea de materiale plastice, combustibili sau substane chimice . Microorganismele sunt utilizate s transforme biomasa necomestibil n hran i energie A aprut aadar o ramur a ingineriei genetice, biotehnologia modern, care foloseste ca maini i aparate de producie microorganismele sau diferii constitueni celulari ai microorganismelor . Dezvoltarea biotehnologiilor va determina schimbri fundamentale n domeniul agroalimentar. Astfel prin tehnologia manipularii materialului genetic, ADN recombinat, se anticipeaz o cale de realizare de recolte mai bogate prin transferul genelor fixatoare de azot la plantele de interes major din punct de vedere al alimentatiei . Au fost realizate astfel materii prime vegetale cu coninut nutritiv mai ridicat, mai rezistente la boli i atacul duntorilor, secet, frig.

Este posibil, spun specialitii, ca peste 100 de ani, configuraia plantelor de cultur i configuraia animalelor s fie foarte diferite fa de cele din zilele noastre. Industria alimentar este poate cel mai vechi utilizator al biotehnologiilor, fermentaia ca proces biotehnologic fiind cunoscut de milenii. In antichitate, drojdiile erau folosite pentru fabricarea pinii, vinului , berii. In urm cu 5000 de ani sumerienii fabricau 20 de tipuri de bere. Biotehnologiile moderne au un domeniu vast de exploatare n industria modern.A crescut producia mondial de enzime exogene, utilizate n aproape toate ramurile industriale, sinteza de aminoacizi eseniali cu ajutorul bacteriilor, obinerea de alcool folosit ca substituent al petrolului sau producerea de biomasa prin valorificarea pe calea fermentaiei a unor plante cu cretere rapid. Beneficiile biotehnologiilor moderne au impus dezvoltarea lor foarte rapid la nivel mondial . 1.Creterea i diversificarea produciei vegetale Primele generaii de produse alimentare modificate genetic (OMG sau GMO) au fost bine primite de fermieri n SUA, prin creterea produciei agricole. Spre exemplu, studiile au artat c, o specie de porumb modificat genetic, rezistent la aciunea duntoare a insectelor, a manifestat o rezisten crescut i la la aciunea altor microorganisme: fungi, mucegaiuri care atacau porumbul nemodificat. De asemenea, nivelul de micotoxine produse de diferite specii de mucegaiuri sunt mult mai mici la porumbul-GMO. 2.Beneficii nutritive i igienice O mare varietate de produse biotehnologice din clasa uleiurilor sau grsimilor alimentare sunt deja pe pia.Cu ajutorul biotehnologiilor vegetale a fost redus coninutul de acizi grai saturai din cteva sortimente de uleiuri vegetale . Prin biotehnologie a fost rezolvat o problem de igien alimentar, atunci cnd uleiurile vegetale erau hidrogenate pentru cretera stabilitii la tratament termic sau pentru obinerea margarinei. Cercetarile biotehnologice au vizat de asemenea creterea coninutului proteic al cartofului. Aceti cartofi transgenici conin un numr important de aminoacizi, care n mod normal nu se gsesc n cartof. Pentru orz au fot create specii bogate n vitaminaA sau cu un coninut mai bogat de fier. A fost creat o roie modificat genetic care conine de trei ori mai mult antioxidantlicopen.Consumul de licopen este asociat cu scderea riscului producerii cancerului i scderea nivelului colesterolului din snge . Din punct de vedere al igienei alimentare, biotehnologia ncearc s resolve i urmtoarele probleme: Identificarea proteinelor alergenice din lapte, soia, alune i eliminarea lor din produciile vegetale viitoare Descreterea coinutului natural de substane toxice, prezente n produsele alimentare 3. Creterea calitii produselor Biotehnologiile sunt de asemenea utilizate pentru modificarea caracteristicilor materiilor prime pentru a fi mai atractive pentru consumator i mai uor de procesat. Cercetarile efectuate au determinat: creterea conservabilitii fructelor i vegetalelor proaspete ardeii, morcovii i salata sunt mai crocante

obinerea de soiuri cu smburi puini pentru pepeni i struguri creterea sezonalitii soiurilor de tomate, cpuni creterea aromei roiilor, ardeilor, perelor crearea de specii de ceai i cafea fr cofein Cercettorii japonezi au identificat enzima care produce substana care declaneaz lcrimarea atunci cnd tiem ceapa. Este numai o problem de timp pn cnd va fi creat o specie de ceap fr aceast enzim. Foarte multe cercetri au fost efectuate pentru schimbarea raportului ap-amidon din diferite leguminoase. Astfel, un cartof cu un coninut ridicat de amidon, va fi mai sntos pentru om, deoarece el va absorbi mai puin ulei n timpul prjirii. De asemenea, obinerea amidonului din cartof se va face cu un

2

consum energetic mult mai redus. Cu aceleai scopuri, este n cercetare i o specie de tomate pentru obinerea pastei de tomate. Creterea cu 1.2% a substanei uscate din cartofi, ar aduce o economie energetic de 35 milioane de $ procesatorilor americani . De beneficiile biotehnologiilor beneficiaz i industria de lactate. Specialitii din Noua Zeeland utilizeaz n present biotehnologiile animale pentru creterea coninutului de cazein din lapte cu 13% , pentru obinerea unei cantiti mrite de brnzeturi. ORGANISMELE MODIFICATE GENETIC 1. Organisme modificate genetic Avnd n vedere reacia consumatorilor privind introducerea pe pia a unor plante, dar i la adresa alimentelor i furajelor modificate genetic, este necesar cunoaterea noiunii de OMG , aa cum este cunoscut pe plan naional i internaional . In Germania organismele modificate genetic(OMG) sunt organisme al cror material genetic a fost modificat ntr-un mod care nu exist n natur n condiii naturale sau de recobinare natural. OMG trebuie s fie o unitate capabil de autoreplicare sau transmitere a materialului genetic . In SUA, OMG se refer la plante i animale care conin gene transferate de la alte specii, pentru a obine anumite caracter , precum rezistena la anumite pesticide i ierbicide. In Romnia, conform ordonanei de guvern OG nr.49/2000, OMG este un organism care conine o combinaie nou de material genetic, obinut prin tehnicile biotehnologiilor moderne care i confer noi caracteristici. 2. Ingineria genetic Ingineria genetic poate fi definit ca un ansamblu de metode i tehnici care permit introducerea n patrimonial genetic al unei celule a uneia sau a mai multor gene noi, numite de interes, fie modificarea unor gene prezente deja n celul. Genele trasferate sunt denumite transgene. Ingineria genetic mai este denumit i modificare genetic, transformare genetic sau transgenez, iar produsele produsele obinute poart numele de organisme modificate genetic sau organisme transgenice. Pentru modificarea genetic a plantelor este nevoie de : gene de interes selectarea plantelor la care transgena se exprim la un nivel ridicat , adecvat scopului(rezisten la ierbicid, culoare, arom) Comparativ cu metoda clasic de ameliorare, transformarea prin inginerie genetic are cel puin dou avantaje: permite introducerea unui singur caracter la o varietate gena transferat poate proveni din orice surs, ceea ce extinde n mod nelimitat posibilitile de exploatare Cercetrile de inginerie genetic necesit laboratore scumpe, echipamente, reactivi speciali i specialiti vizionari. In aceste condiii este evident c cercetrile de inginerie genetic s-au dezvoltat prioritar n rile cu mai multe resurse financiare i umane. 3.Posibilele reacii adverse ale organismelor modificate genetic OMG sunt subiectul unor dezbateri aprinse, pe de o parte din motive etice, iar pe de alt parte din motive legate de riscul utilizrii i consumrii lor. Ca urmare a presiunii consumatorilor, consiliul Comunitii Europene a emis directive care se refer la obinerea, utilizarea, eliberarea

metoda de integrare a transgenelor n nucleul celulei care va fi originea noii plante

3

deliberat n mediu i comercializarea OMG-urilor i a alimentelor obinute din materii prime modificate genetic. In directive nr.18/2001/CEE sunt menionate potenialele efecte adverse ale eliberrii OMG-urilor n mediu: apariia unor boli umane prin efecte toxice i alergice apariia unor boli la plante i animale prin efecte toxice i alergice

efecte negative asupra dinamicii i diversitii genetice a populaiilor de specii din mediu diminuarea rezistenei la patogeni compromiterarea tratamentelor profilactice sau terapeutice vegetale, veterinare sau umane, prin transferul de gene care confer rezisten la antibioticele utilizate n medicina uman i veterinar efecte asupra ciclului biogeochimic(ciclul compuilor n natur, n special ciclul C i N) Aceast directiv stabilete c introducerea alimentelor obinute din OMG-uri s se realizeze prin metoda pas cu pas. Etichetarea, care este obligatorie pentru toate produsele care conin OMG , asigur consumatorii c pot alege un produs modificat genetic sau unul tradiionale.

4

ENZIME UTILIZATE IN PROCESELE BIOTEHNOLOGICE DIN INDUSTRIA ALIMENTARA

1. GENERALITI ASUPRA ENZIMELOR

Enzimele definite drept componente de natur proteic, produse de celu lele vii care catalizeaz reacii de sintez i degradare din organismele animale, vegetale i microorganisme, prezint numeroase implicaii i aplicaii n in dustria alimentar. Fiind componente ale materiilor prime vegetale i animale utilizate n industria alimentar, a cror activitate nu nceteaz odat cu recoltarea, depozitarea, conservarea i prelucrarea tehnologic a acestora, enzimele pot manifesta aciuni favorabile, dorite, care conduc la mbuntirea calitilor naturale constituionale, gustative etc. sau nefavorabile i nedorite, determinnd degradarea i pierderea valorilor nutritive. Dac n acest sens se are n vedere activitatea enzimelor proprii materiilor prime vegetale i animale, enzimele ca atare sub form de preparate enzimatice, obinute din diferite surse bogate n enzime, i gsesc multiple aplicaii ca adaosuri, fiind folosite nc din cele mai vechi timpuri ca de exemplu cheagul la prepararea brnzeturilor, Koji" (kabi-taki = floare de mucegai", prepa rat enzimatic obinut prin cultivarea lui Aspergillus oryzae pe un decoct de orez sau alte cereale), la prepararea unor produse tradiionale-fermentate, larg rspndite n Asia de Sud-Est. In ultimele decenii, preparatele enzi matice i-au gsit numeroase utilizri n diferite sectoare ale industriei alimentare. Aceast cretere spectaculoas a gradului de utilizare a preparatelor enzimatice n industria alimentar (dar i nealimentar) este explicat prin eficiena i precizia, versatilitatea i economicitatea cu care acioneaz aceste preparate enzimatice. Se postuleaz existena n materia vie a circa 10 000 de enzime diferite, dintre care circa 2 000 au fost izolate, n stare mai puin sau mai mult puri ficat i a cror intervenie i aciune n diferitele procese metabolice este mai mult sau mai puin cunoscut. Cataliznd reaciile biochimice din orga nismele vegetale i animale, enzimele condiioneaz desfurarea, coordonarea i autoreglarea acestor reacii prin care se realizeaz procesele metabolice (anabolice i catabolice) ale creterii, dezvoltrii, reproducerii i tuturor activitilor celulare. In industria alimentar, prelucrtoare de materii prime vegetale i animale, practic nu exist procese tehnologice n care s nu fie implicate enzimele endogene, proprii materiilor biologice folosite sau ale microorganismelor utilizate n prelucrarea acestora; n plus, n multe cazuri, n prezent, se recurge la suplimentarea acestor activiti enzimatice cu enzime exogene, cu preparate enzimatice obinute din diverse surse bogate n enzime, esuturi vegetale, animale i mai ales n ultimii ani din culturile diverselor microorganisme. Indiferent c se au n vedere enzimele endogene, proprii materiilor prime sau cele adugate acestora, ele se caracterizeaz prin urmtoarele proprieti generale: sunt cei mai eficieni catalizatori cunoscui astzi; n concentraii extrem de mici ( 10-6 M sau chiar i 10-9 M) determin realizarea reaciilor cu viteze extrem de mari; reaciile catalizate enzimatic se produc n condiii compatibile cu viaa, la temperatur i presiune obinuit, n mediu slab acid, neutru sau slab alcalin ; manifest specificitate de aciune (determin producerea unui anumit tip de reacii, de exemplu de oxidorcducere, de hidroliz, de sintez etc.) i de substrat (recunoate numai un anumit reactant, sau un grup limitat de reactani); asigur coordonarea, reglarea i controlul proceselor biochimice la care particip i care stau la baza metabolismului celular. 1.1. Constituia enzimelor

Determinant pentru funcia catalitic a enzimelor este configuraia lor, respectiv structura i organizarea spaial a moleculei proteice care manifest activitatea enzimatic. Din punct de vedere structural, enzimele se mpart n dou categorii: enzime de natur exclusiv proteic, constituite n ntregime din proteine (de exemplu: pepsina, tripsina, papaina etc.) ; enzime de natur heteroproteic formate dintr-o parte proteic (apo-enzim) i una neproteic denumit cofactor enzimatic. Cele dou pri separate snt inactive catalitic; mpreun formeaz complexul molecular apo-enzim:cofactor, respectiv holoenzima care manifest activitate catalitic. n structura holoenzimei, cofactorul imprim specificitate de aciune, respectiv tipul i viteza de reacie catalitic, n timp ce apoenzima imprim specificitatea de substrat, deci determin substana asupra creia acioneaz enzima. Apoenzima, fiind de natur proteic, va manifesta proprietile generale ale proteinelor: este termolabil i nedializabil; stabilete legtura enzimei cu substratul; manifest grade diferite de afinitate pentru cofactor; este susceptibil de modificri conformaionale n anumite limite. Cofactorul enzimatic reprezint componente neproteice, de natur chimic foarte diferit, care sunt indispensabile pentru manifestrile activitii catalitice a numeroase enzime. Dup natura chimic i modul lor de legare la apoenzim, cofactorii se clasific: coenzim; grupri prostetice; ioni metalici. Coenzimele sunt compui organici, derivai din vitamine, care se ataeaz temporar la apoenzim i care sunt uor disociabili de acestea. Ele trec uor de la o apoenzim la alta, putnd s participe la transformarea altor molecule de substrat dup terminarea unei anumite reacii. Din ei fac parte: NAD+, NADP+, FMN, FAD, ATP, CTP, acidul lipoic etc. Gruprile prostetice sunt substane organice fixate pe apoenzim, care disociaz greu, deoarece sunt legate prin legturi covalente. Aceste grupri sunt: TPP, piridoxalfosfatul, hemul. Gruparea prostetic imprim mecanismul unor procese enzimatice: transportul de electroni, de grupri NH2, acetic etc. Ionii metalici sunt indispensabili pentru exercitarea funciei catalitice a unor enzime, participnd n calitate de cofactori sau de componente structurale ale acestora. Ele se mai numesc metal-enzime, iar printre ionii care ndeplinesc rol de cofactor se pot meniona: Mg2+, Mn2+, Cu2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+, Mo2+. Unele enzime pot conine chiar doi ioni metalici. Exercitarea proprietilor catalitice ale enzimelor se realizeaz prin intermediul situsurilor catalitice centrilor sau zonelor active care reprezint ansamblul gruprilor chimice din structura enzimei ce particip efectiv n manifestarea activitii enzimatice (de exemplu, anumite resturi din aminoacizii constitueni ai lanurilor polipeptidice i cofactorii enzimatici, care vin n contact direct cu substratul). n funcie de organizarea lor structural se disting: enzime monomerice, constituite dintr-un lan polipeptidic care nu poate fi disociat n subuniti fr pierderea activitii lor catalitice i enzime oligomerice care sunt agregate moleculare constituite din doi sau mai muli protomeri, respectiv lanuri polipeptidice similare sau diferite, care prin disociere sau din contr prin asociere devin catalitic-active. Pentru o serie de enzime s-au stabilit existenta unor forme moleculare multiple sau izoenzime, care catalizeaz realizarea aceleiai reacii biochimice, dar care difer ntre ele prin configuraii spaiale diferite (compoziie n aminoacizi constitueni), prin proprietile lor fizico-chimice (pH sau temperatur optim, cinetic de reacie, comportare fa de inhibitori sau activatori etc.). imunologice etc. Se cunosc, de asemenea, aa-numitele sisteme sau complexe multienzimatice constituite din enzime intim legate prin interaciuni necovalente, care particip la realizarea unor secvene de reacii biochimice consecutive i nlnuite, n care produsul de reacie al primei enzime devine substrat pentru cea de a doua enzim, al crui produs de reacie devine substrat pentru a treia enzim etc., pn la realizarea ntregului ir de reacii prin care se metabolizeaz n celule un component biochimic. Astfel de sisteme sau complexe multienzimatice sunt, n general, localizate n celule la nivelul diferitelor formaiuni sau organite subcelulare.

6

1.2. Cinetica reaciilor i factorii care influeneaz activitatea enzimelor Enzimele catalizeaz producerea reaciilor chimice, termodinamic posibile, fr schimbarea echilibrului de reacie, prin scderea energiei de reacie a reactanilor i prin creterea vitezei de reacie a reactanilor (in vivo ele condiioneaz desfurarea, coordonarea i autoreglarea reaciilor biochimice ale materiei vii, prin care se realizeaz procesele metabolice ale creterii, dezvoltrii, reproducerii i tuturor activitilor celulare). ntr-o reacie catalizat enzimatic, enzim (E) formeaz cu substratul (S) un complex intermediar de tranziie (ES) foarte reactiv i instabil, care se transform rapid, conducnd la eliberarea produsului sau produilor de reacie (P) i a enzimei ce poate relua reacia, dup schema general: E+S ES EP P+E

O serie de enzime catalizeaz reacii n care pot interaciona dou sau chiar mai multe substraturi. Aa, de exemplu, sunt transferazele care catalizeaz transferul unei grupri chimice funcionale de pe un substrat (donor) pe alt substrat (acceptor), realizndu-se reacii de simpl sau dubl deplasare. Mecanismul catalizei enzimatice, sub raportul interaciunii dintre enzim si substrat, al formrii complexului reactiv enzim substrat i transformarea acestuia n produi de reacie, se bazeaz pe diferite interpretri, explicndu-se prin ipotezele broasc-cheie", potrivirii induse, catalizei covalente i catalizei generale prin acizi i baze. Viteza reaciilor catalizate enzimatic este dependent de: concentraia enzimei i a substratului, afinitatea enzimei fa de substrat, temperatur, pH, efectori (activatori sau inhibitori), potenial redox, radiaii etc.

7

In anumite limite, viteza reaciilor catalizate enzimatic este direct proporional cu concentraia enzimei, pentru ca, la concentraii crescute ale enzimei, s devin aproape constant. Creterea concentraiei substratului determin iniial o cretere rapid a vitezei de reacie, pentru ca ulterior viteza de reacie s creasc lent, iar la concentraii mari de substrat s devin maxim, cptnd o valoare constant (fig. 1). Expresia matematic care definete relaia dintre viteza de reacie catalizat enzimatic i concentraia substratului este dat de ecuaia Michaelis-Menten : vmax*[S] V = ----------------KM+[S] n care: v- este viteza de reacie la un moment dat; vmax viteza maxim de reacie, corespunztoare concentraiei mari de substrat, cnd enzima este saturat cu substrat ; [S] concentraia substratului ; kM constanta Michaelis-Menten, moli/1. Din punct de vedere grafic, ecuaia Michaelis-Menten reprezint o hiperbol, indicnd o tranziie de la o faz n care viteza de reacie este dependent de concentraia substratului (faz n care reacia este de ordinul 1) la o faz independent de concentraia substratului (faz n care reacia este de ordinul zero), n care viteza de reacie devine maxim, enzima fiind saturat cu substrat. La o vitez egal cu 1/2 din viteza maxim corespunde o valoare determinat a concentraiei substratului denumit kM sau constanta MichaelisMenten, care se exprim n moli/1 i care indic afinitatea enzimei fa de substrat; cu ct kM are o valoare mai mic, cu att afinitatea enzimei pentru substrat este mai mare i invers, cu ct kM are o valoare mai mare cu att afinitatea enzimei pentru substrat va fi mai mic. n anumite limite (pn la circa 60 ... 80C), viteza reaciilor enzimatice crete o dat cu temperatura (temperatura la care viteza de reacie este maxim corespunde temperaturii optime de aciune a enzimei). La temperaturi mai mari dect temperatura optim, viteza de reacie scade rapid, avnd loc un proces de denaturare termic a enzimei (fig. 2). Temperatura optim a enzimelor este influenat i condiionat de structura chimic a enzimei, a substratului, i de concentraia acestora n sistemul de reacie. In general, activitatea enzimelor scade la temperaturi peste 50 ... 60C; totui exist enzime care i pstreaz nc n mare msur activitatea i la temperaturi de peste 60C, ca de exemplu: papaina, o proteaz vegetal activ la 80C; peroxidaza din hrean care rmne activ i dup o nclzire la 100C.

8

Activitatea enzimelor este dependent de pH-ul mediului n care i exercit aciunea. pH-ul la care activitatea este maxim este denumit pH optim al enzimei, iar pH-ul la care enzima i menine activitatea n cele mai bune condiiuni se numete pH optim de stabilitate. Cele dou pH-uri optime ale unei enzime, de activitate i de stabilitate, pot avea valori apropiate, pot s coincid sau pot s fie diferite (fig. 3). Activitatea enzimelor este, de asemenea, influenat de prezena unor efectori (diferite substane chimice) n mediul de exercitare a activitii lor; activatorii influeneaz pozitiv, iar inhibitorii negativ activitatea enzimelor. In funcie de natura i modul de aciune al inhibitorilor, inhibiia enzimatic este de mai multe tipuri: ireversibil, reversibil (competitiv i necompetitiv), i alosteric.

1.3. Clasificarea enzimelor Recenta clasificare i nomenclatur a enzimelor se bazeaz pe principiile i regulile stabilite i publicate n anul 1964, revizuite i republicate n 1973 de Comisia de Enzime a Uniunii Internaionale de Biochimie (I.U.B.) i a Uniunii Internaionale de Chimie Pur i Aplicat (I.U.P.A.C.). In acest sens, enzimele au fost clasificate n 6 clase (numeroase subclase i sub-subclase) i anume: oxidoreductaze catalizeaz reaciile de oxidoreducere prin transfer de hidrogen sau electroni, sau prin combinarea unui substrat cu oxigenul molecular ; transferaze catalizeaz transferul diferitelor grupri chimice de la un substrat donator la un alt substrat acceptor; hidrolaze catalizeaz scindarea hidrolitic a diferitelor substraturi, prin adiia apei la nivelul diferitelor grupri chimice; liaze catalizeaz adiia sau ndeprtarea unor grupri chimice din substraturi, prin mecanisme diferite fa de hidroliz; izomerazecatalizeaz rearanjri intramoleculare ; ligaze sau sintetaze catalizeaz sinteza unor noi legturi prin unirea a doi compui ntr-unul singur, folosind ca surs energetic nucleozidtrifosfaii. Clasele de enzime se mpart n subclase i sub-subclase, n funcie de o serie de detalii privind gruprile supuse transformrii i natura cofactorilor implicai n reacia catalizat enzimatic. Pentru nomenclatura enzimelor se folosesc nume uzuale sau tradiionale, care snt de obicei formate din numele substratului asupra cruia acioneaz enzima, urmat de terminaia -az i nume sistemice (recomandate de Comisia de Enzime) formate din numele substratului sau substraturilor i tipul de reacie catalizat, urmat de terminaia az, nsoite de un cod (alctuit din patru cifre care reprezint clasa, subclasa, sub-subclasa i numrul de ordine), precedat de EC (Enzyme Commission). Cteva exemple, privind numele unor enzime importante pentru industria alimentar: E.C. 3.2.1.2 -1-4-Glucan maltohidrolaza ( -amilaza) E.C. 3.1.1.3. Glicerol ester hidrolaza (lipaza)

9

1.4. Uniti de msur ale activitii enzimelor In principiu, determinarea activitii enzimelor se efectueaz prin : msurarea gradului de transformare a substratului, msurarea concentraiei produsului de reacie sau msurarea cineticii de reacie, urmrite ntr-un anumit interval de timp prin metode fizice sau chimice adecvate. Activitatea enzimelor se exprim cantitativ n unitile propuse de Comisia de Enzime (CE) i anume: Unitatea de activitate enzimatic (U) reprezint cantitatea de enzima care catalizeaz transformarea a l mol substrat/min n condiii standard (25C, pH i concentraie de substrat optime). Aceast unitate de msur recomandat de CE n 1961 se folosete nc n prezent; CE recomand renunarea sau abandonarea progresiv a folosirii unitii U i trecerea la Kat. Katalul (Kat) reprezint cantitatea de enzim care catalizeaz transferarea a l mol substrat/s n condiii standard. (Prin definiie aceast unitate de msur se apropie mai mult de dimensiunile constantelor de vitez folosite n cinetica chimic respectiv mol/s.) Se folosete i multiplul kilokatal (K Kat) i respectiv submultiplii milikatul (mKat), microkatul (Kat), nanokatul (nKat) i picokatul (pKat). Activitatea specific reprezint numrul de uniti enzimatice/mg protein (respectiv Kat/kg protein i Kat/kg protein). Activitatea enzimatic molar (numr de transfer = turnover number) reprezint numrul de molecule de substrat transformate de ctre o molecul de enzim n timp de l min sau l s (Kat/mol enzim). Cu toate aceste recomandri ale Comisiei de Enzime, n lucrri mai vechi sau chiar i n prezent se folosesc i alte moduri, arbitrare, de exprimare a activitii enzimelor, care de obicei snt definite de cei ce le utilizeaz.

2. PREPARATE ENZIMATICE I ENZIME IMOBILIZATE Preparatele enzimatice i de enzime imobilizate folosite n realizarea diferitelor procese biotehnologice din industria alimentar sunt considerate ca adjuvani de transformare. In anul 1982, Comitetul mixt FAO/OMS de experi n aditivi alimentari a stabilit o serie de norme generale pentru preparatele enzimatice utilizate n prepararea alimentelor". Conform acestui comitet, preparatele enzimatice, folosite ca aditivi n industria alimentar, sunt obinute din materii prime de origine animal, vegetal sau microbian, fiind constituite din celule ntregi, din pri de celule sau extracte complet lipsite de celule. Pot conine una sau mai multe componente enzimatice active, suporturi, solveni, ageni de conservare, antioxidani i alte substane necesare i conforme unei bune practici de fabricare. Ele se pot prezenta sub form lichid, semilichid, uscate sau imobilizate, avnd o culoare care poate s varieze de la qvasi incolor la brun nchis. In ceea ce privete materiile prime din care snt obinute preparatele enzimatice, normele Comitetului mixt FAO/OMS prevd ca: esuturile de origine animal s rspund normelor veterinare aplicate crnii i manipularea lor s satisfac exigenele unei bune practici igienice; materialele de origine vegetal, folosite ca surse de enzime sau ca ingrediente n prepararea mediilor de cultur pentru microorganismele productoare de enzime, trebuie s nu elibereze nici un reziduu nociv pentru sntate, n condiii normale de utilizare; preparatele enzimatice de origine microbian trebuie produse prin folosirea controlat fr penetrare de microorganisme susceptibile de a conduce la apariia de substane toxice sau alte produse nedorite. n cazul preparatelor de enzime imobilizate, n care insolubilizarea enzimei se realizeaz prin procedee fizice i/sau chimice, suportul i n special agentul de imobilizare folosit trebuie s fie inert sau admis de a fi utilizat n produsele alimentare, iar orice eliberare de enzim de pe suport, i mai ales eliberarea

10

de agent de imobilizare, trebuie s rmn n limitele acceptabile care vor fi precizate pentru fiecare preparat enzimatic imobilizat. Aditivii (inclusiv adjuvanii de transformare) i ingredientele care intervin n producerea preparatelor enzimatice trebuie s fie substane acceptate pentru a fi utilizate n produsele alimentare ca: apa, substane insolubile care pot fi ndeprtate o dat ce s-a produs procesul de transformare. Limitele i metodele de determinare a componentelor contaminante ale preparatelor enzimatice folosite n industria alimentar snt artate n tabelul 2. Limite i metode de determinare pentru componentele contaminante, recomandate de Comitetul mixt FAO/OMS (Etude FAO: Alimentations et Nutrion, 19/1982) Componente contaminante ale preparatelor enzimatice Arsen Plumb Metale grele Limite admisibile Metodele de determinare recomandate snt publicate n:

Maximum 3 mg/kg Me"thodes Generales (Directives Generales pour Maximum 10 mg/kg l'usage des normes IECFA d'identite et de purete) Maximum 40 mg/kg (exprimate ca plumb) Microbiologic Directives generales pour le denombrement de microorganisme Directives generales pour le denombrement des coliformes Methode par le comptage de colonies obtenues 30C. ISO. Norme internaionale Ref. nr. ISO 4833, Premier Edition (1978-02-01)

Numr total de Maximum 5. 1O4 /g germeni viabili Coliformi Escherichia coli Salmonclla Maximum 30/g

Absent pe o prob de 25 FDA Bacteriogical Analvtical Manual - Fifth Edition g ( 1978) Cap. X. Enteropathogenic Escherichia coli ; Cap. XII. Isolaion and identification of Salmonella Absent pe o prob de 25 g Absent Etude FAO: Appendice A Alimentation et Nutrition, 19/1982;

Activitatea antibiotic origine bacterian

de

2.1. Preparate enzimatice Preparatele enzimatice folosite n industria alimentar trebuie produse n condiii similare unei bune practici de fabricare a produselor alimentare, iar prin utilizarea lor s nu se ajung la o cretere a numrului total de germeni (NTG) i la creterea coninutului n sruri peste limitele admise pentru un anumit produs alimentar luat n considerare. Pentru obinerea preparatelor enzimatice sunt folosite de obicei surse bogate n enzimele dorite, care sunt ieftine, uor accesibile i care se prelucreaz uor. Aceste surse pot fi de origine vegetal, animal sau microbian. In plante, concentraii mari de enzime se pot ntlni n semine, cereale germinate sau negerminate, rdcini, sev i latexuri, frunze i n unele cazuri chiar n coaj. La animale, concentraii mari de enzime se gsesc n special n ficat, pancreas, mucoasa stomacal sau intestinal, inim, rinichi, creier etc. In scopuri practice sunt folosite mai ales pancreasul, mucoasa stomacal i intestinal.

11

O surs foarte important de enzime, pentru producerea preparatelor enzimatice, o constituie diferitele microorganisme ca: bacteriile, drojdiile i microciupercile (mucegaiurile). Fa de sursele de enzime de origine vegetal sau animal, culturile diferitelor microorganisme prezint o serie de avantaje care explic n mare msur tendina manifestat n ultimele 23 decenii de a fi folosite din ce n ce mai mult pentru obinerea de preparate enzimatice. Microorganismele pot fi obinute n cantiti mari, prin nmulire n instalaii speciale, pe medii de cultur ieftine (de obicei subproduse ale industriei alimentare ca: tre de gru, extract de porumb obinut prin concentrarea apelor de nmuiere de la fabricarea amidonului, melas, roturi de soia i de floarea-soarelui etc.). Ciclul de cretere i dezvoltare al microorganismelor este foarte scurt fa de cel al plantelor i animalelor, iar obinerea microorganismelor n cantiti mari nu necesit angajarea de terenuri cultivabile, cum este cazul la materiile prime vegetale. In plus, microorganismele prezint i avantajul c producia lor de enzime poate fi mult mrit prin selectarea i utilizarea de tulpini i mutante nalt productive precum i prin stabilirea condiiilor fizice i chimice optime (medii de cultur i condiii optime de cultivare) pentru producerea de enzime. In cazul utilizrii microorganismelor ca surse de enzime pentru industria alimentar, selectarea acestora se va face lundu-se n considerare o serie de criterii cum snt urmtoarele: s nu manifeste putere patogen i s nu produc toxine (endo-, exotoxine sau micotoxine), s nu manifeste activitate antibiotic sau potenial alergen i s produc cu precdere i n cantiti mari enzima sau complexul enzimatic dorit, pe medii de cultur ieftine i n condiii avantajoase. Indiferent de sursa de materii prime, prelucrarea lor pentru obinerea de preparate enzimatice de uz alimentar este n linii generale aceeai (fig. 4).

12

Enzimele obinute ca preparate brute sau parial purificate, sub form lichid, semilichid sau uscat sunt utilizate n industria alimentar ca atare, fiind adugate i acionnd n mediile pe care urmeaz s le transforme ca enzime libere", respectiv solubilizate n medii apoase i fr a mai putea fi ulterior recuperate. Activitatea lor, dup ce au realizat transformrile dorite, este de obicei oprit prin diferite tratamente, mai ales pe cale termic, prin acidulare sau alcalinizare. In unele cazuri ele mai rmn active i n produsul finit. 2.2. Preparate enzimatice imobilizate Principiul general al procedeelor de imobilizare a enzimelor const n legarea sau fixarea unei enzime sau a unui sistem multienzimatic de suportul insolubil n ap, n condiiile pstrrii proprietilor catalitice, respectiv specificitatea de aciune i posibilitatea de a aciona la pH i temperatur asemntoare enzimelor libere (neimobilizate). Suporturile sau matricile utilizate n imobilizarea enzimelor pot fi de natur anorganic: silicea coloidal, caolinita, particule sau perle de sticl cu grad de porozitate controlat, oxizi metalici (alumina, oxid de zirconiu, oxid de titan, crbune etc.), i de natur organic: celuloza i derivaii acesteia, agaroz, amidon,

13

dextran, colagen, polimeri obinui prin polimerizarea unor monomeri de tipul acrilamid, acid metacrilic .a., rini formaldehidice etc. In funcie de natura legturilor care se stabilesc ntre enzime i suportul de imobilizare, procedeul sau metodele de imobilizare pot fi fizice sau chimice. Procedeele fizice se bazeaz pe imobilizarea enzimelor prin intermediul legturilor fizice ca de exemplu, interaciuni electrostatice, formarea de legaturi ionice, formarea de legturi de hidrogen, interaciuni protein-protein etc., difereniindu-se n acest sens (fig. 5.): adsorbia pe suporturi insolubile n ap (crbune, clei, rini schimbtoare de ioni, celuloz, sticl etc.) ; includerea n structuri macromoleculare (aceast incluziune se realizeaz prin polimerizarea unor materiale ca poliacrilamid n silicagel, amidon, n prezena moleculelor de enzim, astfel nct se formeaz o matrice de polimer n care snt incluse moleculele de enzim i n care att substratul ct i produsul poate s difuzeze) ; microncapsulare n membrane semipermeabile ; imobilizarea n celule de ultrafiltrare.

Procedeele chimice de imobilizare a enzimelor se refer la cele care conduc la formarea de legturi covalente sau parial covalente, ntre gruprile funcionale, care ns nu snt eseniale pentru manifestarea activitii catalitice (nu snt implicate n situsul catalitic al enzimei), i un suport activat chimic, insolubil n ap. In cadrul acestor procedee se pot evidenia (fig. 6): legarea covalent a enzimelor de suporturi insolubile, care posed grupri reactive sau care pot fi activate prin diferite reacii chimice; copolimerizarea enzimelor cu un monomer reactiv i legarea ncruciat (cross-linking) sau reticular intra- i intermolecular a enzimelor legate de un suport cu un reactiv multifuncional. La imobilizarea enzimelor trebuie s se aib n vedere urmtoarele: conformaia spaial a moleculelor de enzim n sistemul imobilizat este diferit de cea a mediului natural din care s-a extras enzim. Pe de alt parte, structura tridimensional a moleculei de enzim este distorsionat de legturile sale cu suportul; micromediul moleculei de enzim imobilizat este diferit de cel al enzimei aflate n soluie, afectndu-se viteza de difuzie a substratului i a produilor de reacie. Inhibiia de substrat i de produs poate, de asemenea juca un rol important; procesul de transport al substanelor este un proces pasiv, n comparaie cu situaia enzimei din celula vie, iar aceasta va avea desigur influen i asupra vitezei de reacie. Imobilizarea enzimelor pe un suport anorganic sau organic provoac schimbri n comportamentul acestora i n cinetica reaciilor: se mrete stabilitatea enzimei (stabilitatea enzimei att n stare static ct i n stare dinamic fiind influenat de procedeul de imobilizare, msura acestei stabiliti fiind 1/2 din durata de via a enzimei); se schimb afinitatea enzimei fa de substrat, aceasta fiind influenat de durata lor de contact care, la rndul ei, este determinat de viteza fluxului sau viteza de agitare a substratului n contact cu

14

sistemul suport-enzim, de viteza de difuzie a substratului la enzim imobilizat; se modific caracterul catalizei prin trecere de la cataliza omogen la cea eterogen. La folosirea enzimelor imobilizate poate avea loc o variaie a pH-ului optim iar randamentul n produsul de transformare este micorat. De exemplu, prin folosirea amiloglucozidazei n soluie, plecnd de la o suspensie de amidon cu 33% s.u., se ajunge la un randament de transformare n glucoza de 95,5 96%, n timp ce la folosirea amiloglucozidazei imobilizate, randamentul este de 9293%. In orice caz, preparatele de enzime imobilizate, fa de cele libere sau solubile, prezint o serie de avantaje printre care se amintesc urmtoarele: refolosirea repetat a enzimei, cu aceeai cantitate de enzim putndu-se transforma cantiti mai mari de substrat; se poate lucra n sistem semicontinuu sau continuu, cu automatizarea procesului, ceea ce asigur un control precis al parametrilor de lucru ; are loc o cretere a vitezei de lucru, prin controlul riguros al vitezei fluxului de substrat i al concentraiei acestuia; se poate stopa reacia enzimatic la momentul dorit i se evit trecerea enzimei n produsul transformat ; costurile globale de producie sunt mai mici n comparaie cu procedeele de folosire .a enzimelor libere ; se pot utiliza i enzime care nu sunt trecute pe lista GRAS (Generally Recognised as Safe). Factorii critici ce trebuie luai n considerare la folosirea enzimelor imobilizate snt urmtorii: eficiena economic a imobilizrii determinat de costul enzimei, suportului i metoda de imobilizare; activitatea enzimei imobilizat care este n funcie de tehnica de imobilizare, caracteristicile materialului de suport, viteza de difuzie a substratului la enzim i a produsului de transformare. caracteristicile substratului ce trebuie transformat ; stabilitatea enzimei care trebuie meninut un timp ct mai ndelungat ; contaminarea microbiologic a sistemului enzim-suport n timpul utilizrii reactorului respectiv. Cu toate avantajele pe care le prezint enzimele imobilizate, pn n prezent, industria alimentar utilizeaz la nivel industrial numai glucozizomeraza imobilizat pentru izomerizarea glucozei n fructoz i lactaza imobilizat pentru hidroliza lactozei din lapte sau zer. Sunt efectuate ns o serie de cercetri la nivel de laborator i chiar la nivel pilot, care permit s se ntrevad n viitor extinderea folosirii preparatelor de enzime imobilizate i n alte sectoare ale industriei alimentare; n acest sens, sunt ns necesare cercetri care s conduc, probabil, la modificarea sau adoptarea unor tehnologii clasice" de obinere a diferitelor produse alimentare, la utilizarea preparatelor de enzime imobilizate sau la stabilirea de noi tipuri de bioreactoare i eventual noi moduri de folosire a enzimelor imobilizate n medii eterogene, consistente i vscoase de felul celor prelucrate ntr-o serie de sectoare ale industriei alimentare. 2.3 Enzime de fermentaie Cea mai important problem care trebuie rezolvat la obinerea de preparate enzimatice cu ajutorul microorganismelor este gasirea unui microorganism care s produc n cantitate mare enzima sau sistemul enzimatic dorit. In acest caz un interes practic l reprezint microorganismele heterotrofe. Pentru ca un organism s poat ataca un substrat i s-l metabolizeze, el trebuie s posede enzimele necesare care s catabolizeze reaciile de metabolism n condiiile de mediu proprii pentru dezvoltare. Totalitatea enzimelor pe care un organism le posed n permanen sau pe care poate s le elaboreze la nevoie formeaz echipamentul enzimatic potenial al microorganismului. Echipamentul enzimatic este determinat la rndul lui de genetica microorganismului. Zestrea ereditar constituit din gene care sintetizez enzimele microorganismelor variaz de la o specie la alta. Majoritatea enzimelor care alctuiesc echipamentul enzimatic sunt enzime intracelulare. Aceasta nseamn c enzimele sintetizate de gene, dup formare, rmn n celul, nefiind secretate n mediul nconjurtor n care microorganismele se dezvolt. Activitatea lor se desfoar n interiorul celulei. Unele microorganisme cum sunt drojdiile, bacteriile lactice, nu conin dect enzime intracelulare. La astfel de microorganisme eliberarea enzimelor n mediul nconjurtor are loc dup moartea celulelor, n urma proceselor de autoliz. Din acest cauz, astfel de microorganisme nu metabolizeaz dect substraturi nutritive solubile i permeabile prin membranele lor celulare.

15

Alte microorganisme, aa cum sunt bacteriile din genul Baccillus sau fungii din genul Aspergillus, elaboreaz pe lng un mare numr de enzime intracelulare i enzime extracelulare, pe care le secret n mediul nconjurtor. Enzimele extracelulare sunt, n general hidrolaze i sunt secretate de microorganisme cu scopul de a degrada substraturile insolubile i solubile cu molecule mari la compui solubili uor asimilabili. Enzime intracelulare de fermentaie In categoria enzimelor intracelulare sunt incluse toate enzimele care rmn cu biomasa dup separarea lichidului de fermentaie. Unele enzime se acumuleaz probabil n periplasm, astfel nct n mediul de cultur se afl cantiti mici de enzime rezultate din ruperea pereilor unui numr mic de celule. Principalele tipuri de enzime intracelulare sunt prezentate n tabelul urmtor: Microorganismul Enzima Penicillinacilaz Galactozidaz Glucozizomeraz Glucozoxidaz Pullulanaz Lactaz productor Escherichia coli Mortierella vinacea Saccaromyces cerevisiae Streptomyces albus Streptomyces sp. Pergillus niger Klebsiella aerogenes Candida pseudotropicalis Durata Fermentaiei, h 48 72 48 53 72 20 23 24 Nivelul de producie Laborator 100 l Laborator Laborator Laborator Laborator 500l 15 l Laborator

Majoritatea acestor enzime acioneaz asupra unor substraturi cu mas molecular mic. Aceasta se explic prin faptul c substraturile mici pot ptrunde n celule i funcioneaz astfel ca inductori ai enzimelor care le degradeaz. Spre deosebire de acestea, enzimele extracelulare acioneaz asupra substraturilor cu mas molecular mare. Enzimele intracelulare se mpart n dou mari categorii: unele au o poziie central n metabolismul organismului n cretere i se produc n cantiti mari in biomas, altele au un rol secundar, minor i se produc n cantiti mici. Pentru utilizarea acestora din urm n scopuri industriale este necesar imobilizarea lor, astfel nct s fie economic i justificat folosirea lor. In ceea ce privete activitatea enzimatic a acestor preparate, de cele mai multe ori constituie un secret de serviciu, deoarece poate face oricnd obiectul unui brevet de invenie. Pentru ca o enzim s fie economic, ea trebuie s aib o activitate enzimatic minim( 100 UE/ml). De aceea majoritatea enzimelor intracelulare la care nu se atinge acest valoare se imobilizeaz. Alteori, aceste enzime se utilizeaz pentru atacul unor impuriti care incomodeaz procesul principal, dar fr atacul componentului principal. De exemplu, hidroliza enzimatic complet a amidonului presupune i hidroliza legturilor 1,6 glucozidice, aflate n numr mic n structura amilopectinei. Pullulanazaeste folosit n acest caz pentru hidroliza legaturilor 1,6 facilitnd n acest fel aciunea amiloglucozidazei i - amilazei. Glucozoxidaza este folosit pentru ndeprtarea urmelor de glucoz din praful de ou folosit la obinerea maionezei i n acest caz nu trebuie s aib o activitate enzimatic mare. Producerea enzimelor intracelulare ridic probleme specifice. Bioprocesul trebuie astfel condus nct pe parcursul biosintezei s se evite spargerea celulelor. Un alt aspect se refer la stabilitatea enzimelor; unele enzime sunt stabile n mediul intracelular i devin instabile n afara celulei. Unul dintre dezavantajele procedeelor de obinere prin biosintez a enzimelor intracelulare l constituie necesitatea eliberrii acestora din celule, prin distrugerea membranei celulare, extracie i ulterior

16

separarea extractului de resturile celulare. In plus enzimele sunt impurificate cu toate proteinele intracelulare, chiar dac enzime dorit se afl n properie mare n totalul proteinelor extrase din celule. Un avantaj tehnologic al enzimelor intracelulare l constituie faptul c extracia se poate efectua cu un volum mic de soluie tampon, ceea ce conduce la obinerea unui extract brut cu coninut mare de enzim i nu mai este necesar concentrarea ulterioar a acestuia. Enzime extracelulare de fermentaie Cele mai importante enzime microbiene extracelulare sunt, n general hidrolazele( proteinaze, amilaze, celulaze) care actioneaz asupra substraturilor cu mas molecular mare. Pentru microorganisme, este normal, din punct de vedere fziologic, s produc nutrieni din polimeri biologici disponibili n mediul nconjurtor celular. Pentru a ataca mai uor substraturile, microorganismele i produc singure enzimele necesare hidrolizei acestora i uneori aceast producie de enzim este optim chiar la tulpinile slbatice. Enzimele hidrolitice produse prin fermentaie i utilizate n cantiti mari n industrie sunt proteazele, amilazele, celulazele. Acestea sunt comercializate i utilizate n industria alimentar, textil, detergenilor. Pentru c productia unei enzime extracelulare utilizeaz n cea mai mare parte resursele diponibile ale celulei, biosinteza i secreia unei astfel de enzime sunt supuse unui complex de factori regulatori. In general, producia acestor enzime este indus de niveluri reduse ale polimerilor, iar uneori polimerii nii funcioneaz ca inductori. Alteori, compuii care nu sunt substraturi pentru enzime, dar sunt nrudii ca structur cu acestea, pot funciona ca inductori. De exemplu, producia de celulaze este indus att de lactoz, ct i de celobioz. Producia acestor enzime este de asemenea supus represiei prin catabolii. Atta timp ct nutrienii cu mas molecular mic sunt diponibili, celulele cresc fr s produc hidrolaze i abia la epuizarea nutrienilor ncepe biosinteza enzimelor hidrolitice extracelulare. Astfel, inducia i represia biosintezei enzimelor sunt fenomene complexe ce au loc n concordan cu condiiile de mediu n care se gsesc celulele. Trebuie reinut faptul c factorii care determin nmulire i dezvoltarea celulei vor determina i declanarea biosintezei enzimelor. Un rol important n formarea enzimei l are existena n mediul de cultur a substratului care induce formarea enzimei specifice degradrii respectivului substrat. El constituie inductorul operonului enzimei. Primul studiu sistematic efectuat n aceast direcie a fost efectuat de Karstrm, care mparte enzimele n dou grupe: enzimele constitutive i enzimele adaptative. Enzimele constitutive se sintetizeaz n celule n mod permanent. Concentraia lor este ns influenat de prezena sau absena n mediul de cultur a substraturilor pe care ele le metabilizeaz. Concentraia aceastor enzime poate s varieze i sub influena altor factori: sursa de azot, sursa de carbon, factorii de cretere, srurile minerale, temperatura, pH-ul. In schimb, sinteza enzimelor adaptative este declanat numai de prezena substraturilor specifice n mediul de cultur sau atunci cnd este nevoie de prezena lor n procesele metabolice. Pe baza unor studii ndelungate i de profunzime cu privire la biosinteza enzimelor induse de substrat s-a ajuns la urmtoarele concluzii:-

Elaborarea de ctre un organism a unei enzime induse are loc numai n prezena inductorului; ca inductor funcionez, de obicei, substratul care trebuie metabolizat; funcia de inductor poate s o ndeplinesc i substanele nrudite structural cu acesta, dar care nu poate ndeplini funcia de substrat; Biosinteza are loc pornind ntotdeauna de la substane cu structur simpl; Procesul de biosintez decurge cu consum de energie i din acest motiv, pe lng substanele necesare sintezei(aminoacizi, vitamine, diferii cationi) este nevoie n mediu i de o surs de carbon, de obicei un glucid;

-

17

-

Sinteza enzimelor induse are loc, de regul, n timpul nmulirii microorganismului; ea poate sa aib loc n faza staionar, dac sunt prezente inductorul i substraturile de sintez; Procesul de biosintez al enzimelor este inhibat de toate substanele care inhib biosinteza substanelor proteice, de exemplu cloramfenicolul; Biosinteza enzimelor induse este inhibat ori de cte ori n mediul de cultur este prezent un substrat uor metabolizabil de ctre enzimele constitutive ale microorgamismului; Biosinteza unei enzime induse este inhibat selectiv i de metaboliii rezultai din reaciile de transformare ale inductorului, datorit activitii acestuia; fenomenul se numete represie;

-

-

2.4 Enzime microbiene cu aplicaii industriale. Domenii de utilizare Principalele aplicaii ale enzimelor utilizate pe scar larg n ultimele 2 decenii sunt prezentate n tabelul urmtor(Frost i Moss,1985): Denumirea enzimei 1 Enzime proteolitice alcaline bacteriene Industriile utilizatoare 2 Detergeni Procese alimentare Pielrie Enzime proteolitice bacteriene neutre Enzime proteolitice fungice Industria alimentar Panificatie Industria brnzeturilor Submers Submers Submers n culturi de suprafat Submers Submers Submers Submers n culturi de suprafa 3. Alte glucozidaze Lactaz(Industria laptelui Submers in Extracelulare(Ex) Lichid(L) Extracelulare(Ex) Extracelulare(Ex) Extracelulare(Ex) Extracelulare(Ex) Intracelulare(In) Extracelulare(Ex) Extracelulare(Ex) Lichid(L) Lichid(L) Solid(S) Submers Extracelulare(Ex) Tipul de fermentaie 3 1.Enzime proteolitice Lichid(L) Solid(S) 4 I Felul enzimei Forma de condiionare 5

2.Enzime amilolitice amilaze bacteriene amilaze fungice Amiloglucozidaze Pullulanaze Amidon, bere Detergeni, textile Amidon Panificaie Amidon Bere Amidon Lichid(L) Solid(S) Lichid(L) Solid(S) Lichid(L) Solid(S) Lichid(L) Solid(S)

18

galactozidaz) Invertaz Rafinaz( -galactozidaz) Celulaze -1,3(4)-Glucanaze Lipaze Pectinaze Industria textil Rafinarea zahrului Industria alimentar(sucuri) Industria berii Industria alimentar Teste de diagnostic Industria sucurilor i buturilor alcoolice

culturi de suprafa Submers Submers Submers Submers Submers Submers in culturi de suprafa 4. Alte enzime Submers Submers

Intracelulare(In) Intracelulare(In) Intracelulare(In) Extracelular(Ex) Extracelular(Ex) Extracelular(Ex) Extracelular(Ex)

Solid(S) Lichid(L) Solid(S) Imobilizat(Im) Lichid(L) Solid(S) Lichid(L) Solid(S) Lichid(L) Solid(S)

Glucozizomeraza Glucozoxidaza

Amidon Industria sucurilor i buturilor alcoolice Teste de diagnostic Industria sucurilor Antibiotice

Intracelulare(In) Intracelulare(In)

Imobilizat(Im) Lichid(L) Solid(S)

Catalaza Penicilinacilaza

Submers Submers

Intracelulare(In) Intracelulare(In)

Lichid(L) Solid(S) Imobilizat(Im)

O analiz a pieei comerciale arat c enzimele obinute prin procese fermentative microbiene reprezint aproximativ 80% din totalul produciei de enzime produse astzi n lume. Dintre celelelte enzime, obinute prin extracie, necesittile sunt acoperite de urmtoarele preparate: cheag de viel, -amilaz din orz, proteinaz pancreatic, etc. Dintre enzimele de fermentatie cea mai mare cantitate o reprezint proteinazele alcaline bacteriene utilizate n industria detergenilor.

3. OXIDOREDUCTAZE IMPORTANTE N BIOTEHNOLOGIILE ALIMENTARE Oxidoreductazele sunt enzimele participante n procesele de oxidare biologic, care catalizeaz reaciile de oxidoreducere printr-o serie de mecanisme: transfer de hidrogen (transhidrogenaze sau dehidrogenaze), transfer de electroni (transelectronaze), combinarea direct a unui substrat cu oxigenul molecular (oxidare) etc. Ele acioneaz asupra unei perechi de substraturi, A i B, dintre care cel redus se va oxida, iar cel oxidat se va reduce, dup schema general: Ared + Boxid Aoxid + Bred

19

In funcie de gruprile chimice de substanele donatoare de hidrogen asupra crora acioneaz, sau de substanele care ncorporeaz oxigenul etc., se mpart n 17 subclase, n cadrul crora se difereniaz diferitele sub-subclase de oxidoreductaze. Aceste enzime i exercit aciunea lor catalizatoare prin intermediul unor coenzime (nicotin-adenindinucleotidice NAD+, NADP+; flavinice ca "flavinmononucleotidul FMN sau flavinadenindinucleotidul FAD, heminice, etc.), care se comport ca acceptori intermediari ntre substratul donor, iniial, i cel acceptor, final . Numeroase oxidoreductaze intervin n procesele metabolice, att anaerobe ct i aerobe, ca, de exemplu, glicoliza i diferitele fermentaii, ciclul acizilor tricarboxilici, catena de respiraie celular etc., care se desfoar n diversele materii prime alimentare i n procesele fermentative de obinere a unor pro duse alimentare. Unele oxidoreductaze proprii materiilor prime, n special vegetale, folosite n industria alimentar sunt implicate n procese degradative ca, de exemplu: n mbrunarea enzimatic (polifenoloxidaze, peroxidaze etc.), n procesele de albire sau decolorare (lipooxigenaza), n degradarea acidului ascorbic (acid ascorbic oxidaza), deteriorarea oxidativ a unor produse (peroxidaze, catalaze) etc. De asemenea, unele preparate enzimatice cu activitate oxidoreductazic sunt folosite n diferite scopuri n industria alimentar ca, de exemplu- glucozoxidaza pentru protejarea unor alimente mpotriva deteriorrilor oxidative i mbrunarea Maillard, sau catalaza pentru eliminarea H2O2 reziduale n pasteurizarea" la rece a laptelui.

3.1. Oxidoreductaze NAD+ sau NADP+ dependente Aceste enzime catalizeaz procesele reversibile de oxidoreducere caracterizate prin transfer de hidrogen de pe un substrat donor pe altul acceptor i au caracter anaerob, deoarece acceptorul de hidrogen este altul dect oxigenul. Sunt denumite adesea dehidrogenaze, transhidrogenaze i dehidraze. Coenzimele lor, NAD+ sau NADP+, care se comport ca acceptori sau donori intermediari de hidrogen ntre substraturile participante n reacie, se detaeaz uor de apoenzim, puind s-i exercite acest rol pentru mai multe enzime. Oxidoreductazele NAD+ dependente intervin n numeroase procese catabolice oxidative ale alcoolilor, aldehidelor, aminoacizilor, iar cele NADP+ dependente catalizeaz mai ales procese anabolice reductive. Ele snt foarte rspndite n diverse organe i esuturi animale i vegetale, precum i n diferite microorganisme. Dehidrogenazele prezint deci importan i n numeroase procese fermentative i n procesul de respiraie care se desfoar n diverse materii prime sau n procesele fermentative de obinere a unor produse alimentare. Alcool dehidrogenaza (alcool: NAD+oxidoreductaza). Catalizeaz transformarea acetaldehidei, rezultat din decarboxilarea acidului piruvic, n alcool etilic, dup reacia: Glucide Acid piruvic Aldehid acetic Alcool etilic

Reacia prezint importan deosebit n procesul de fermentaie alcoolic; n condiii aerobe, enzima poate s catalizeze reacia de oxidare a alcoolului etilic n aldehid acetic. Enzima are masa molecular 150000 i conine Zn2+ n structura ei. Lactat dehidrogenaza (L-lactat: NAD-oxidoreductaza). Catalizeaz (n condiii anaerobe) reducerea acidului piruvic cu formare de acid lactic n prezen de NADH + H+ conform reaciei:

20

Acidul lactic constituie etapa final a glicolizei i a fermentaiei lactice. Lactat dehidrogenaza izolat din inima i muchii mamiferelor sau din unele bacterii ca, de exemplu, Bacillus subtilis, conduce la formarea de acid L-lactic, deosebindu-se de lactat dehidrogenaz obinut din Lactobacillus plantarum care duce la formarea de acid D-lactic. In general, microorganismele care realizeaz fermentaia lactic produc acid lactic racemic, deoarece acidul L-lactic rezultat este parial izomerizat la acid D-lactic, prin intervenia unei izomeraze. Malicdehidrogenaza (L-malat: NAD+ -oxidoreductaza). Catalizeaz reacia de oxidare a acidului malic n acid oxalilacetic, care mai departe este transformat n acid lactic. Malatoxidaza. Denumit i enzim malic (malat: NADoxidoreductaza), malatoxidaza catalizeaz reacia de transformare a acidului malic n acid piruvic, acesta fiind apoi transformat n acid lactic.

Aceste dou enzime intervin n fermentaia malolactic a vinurilor. Alturi de aceste dou oxidoreductaze, n fermentaia lactic a vinurilor intervine i enzim malolactic (L-malat: NADcarboxiliaza) care catalizeaz reacia:

Acetaldehiddehidrogenaza (Acetaldehida: NAD-oxidoreductaza). Catalizeaz oxidarea aldehidei acetice n acid acetic, mai ales n procesul de oetire a vinurilor.In condiii aerobe, alcoolul etilic din vin, sub influena alcooldehidrogenazei, este transformat n aldehid acetic iar aceasta sub influena acetaldehiddehidrogenazei se oxideaz n acid acetic. 3.2. Oxidoreductaze FAD sau FMN dependente Aceste enzime cunoscute i sub denumirea de flavinenzime au drept coenzime FAD-ul sau FMNul care snt derivai ai riboflavinei (vitamina B 2). Unele flavinenzime conin n molecula lor i ioni metalici ( MO, Fe), care le confer uneori i funcia de a transporta electroni. In general coenzimele flavinenzimelor snt strns asociate moleculelor de apoenzim (deo-sebindu-se din acest punct de vedere de NAD + i NADP + care se pot detaa de apoenzim). Unele flavinenzime acioneaz ca dehidrogenaze anaerobe, iar altele au caracter aerob, putnd transfera hidrogenul direct de la substratul donor ctre oxigenul molecular cu formare de ap oxigenat. In cadrul acestor din urm enzime se ncadreaz glucozoxidaza, care i gsete multiple utilizri n industria alimentar.

21

Glucozoxidaza (Notatina, -D-glucozo-O 2-transhidrogenaza, -D-gluco-oxigen-oxidoreductaza, EC 1.1.3.4). Este o flavoenzim care conine 2 moli de flavinadenindinucleotid (FAD) ca grupare prostetic/mol enzim. Se obine din Aspergillus niger (S.U.A.), Penicillium amagasakiense (Japonia) i Penicillium vitale (Rusia). Glucozoxidaza din Aspergillus este considerat enzim intracelular implicat n mecanismul metabolis mului energetic In practic, tulpinile de Aspergillus niger snt cultivate submers i miceliul respectiv este separat de mediul de cultur; miceliul, care conine enzim, este dezintegrat i glucozoxidaza trece n soluie care este centrifugat pentru separarea pereilor celulari. Dup purificri repetate, enzima este precipitat cu aceton sau alcool etilic, precipitatul fiind separat prin filtrare sau centrifugare, uscat, apoi extras cu soluie tampon. Enzim n soluie este standardizat i stabilizat, putnd fi pstrat civa ani la tempe ratura de refrigerare. Glocozoxidaza din Penicillium este purificat direct din mediul de cultur, fiind considerat o enzim extracelular, fapt care este n neconcordant cu funcia sa n procesele bioenergetice ale celulei. De fapt, miceliul de Penici llium se autolizeaz rapid, n comparaie cu Aspergillus, i enzima este trecut n mediul de biosintez. Prin urmare, glucozoxidaza din Penicillium este tot o enzim intracelular. Activi tatea acestor enzime rmne neschimbat n intervalul de temperatur 30...60C. Enzim posed o specificitate de substrat foarte ridicat, glucoza fiind oxidat de 160 ori mai repede dect -glucoza, dar aceasta nu are o semnifi caie practic deoarece mutarotaza (aldozmutarotaza, EC 5.1.3.3.) restabilete permanent echilibrul ntre i -D-glucoz. 3.3. Transelectronaze Sunt enzime care catalizeaz reaciile de oxidoreducere prin transfer de electroni de pe un donor ctre un acceptor. In funcie de natura acceptorului, transelectronazele pot fi: anaerobe, cnd acceptorul este o alt substan diferit fa de oxigenul molecular, i aerobe, cnd acceptorul este oxigenul. Transelectronazele anaerobe snt cunoscute i sub denumirea de citocromi, care snt localizai la nivelul mitocondriilor, unde particip ca transportori de electroni n catena de respiraie celular. 3.4. Oxidaze Sunt oxidoreductaze care catalizeaz reaciile unor substraturi cu oxigen molecular sau al peroxizilor, fiind caracterizate prin transfer de hidrogen de pe un donator pe un acceptor care este oxigenul molecular. Ca produs de reacie se formeaz H2O2. n funcie de mecanismele de aciune oxidazele pot fi: oxigenaze: dioxigenaze i monooxigenaze; oxidaze transportoare de electroni: citocromoxidaza, cupruoxidazele (tirozinaze, polifenoloxidazele, cateholoxidaza, ascorbatoxidaza etc.); hidroxiperoxidaze (peroxidaze i catalaze). Lipoxigenaza este o dioxigenaz (lipoxidaza linoleat: oxigenoxidoreductaza, EC 1.13.1.13), fiind cunoscut i sub denumirea de carotenoxidaz. Catalizeaz oxidarea acizilor grai polinesaturai care conin legturile cis, cis- 1,4 pentadienice cu ajutorul O2. Acizii grai polinesaturai oxidai sunt acidul linoleic (9, 12 octadecadienoic), linolenic (9, 12, 15 octadecatrienoic) i arahidonic (5,8, 11, 14 eicosatetraenoic). Aceti acizi grai snt denumii eseniali. Snt oxidate i gliceridele i metilesterii acizilor grai menionai. Se formeaz peroxizii respectivi . Lipoxigenaza se gsete n mazre, fasole, arahide, cartofi, ridichi, dar activitate lipoxigenazic extrem de mare o au boabele de soia. Enzima este activ si la temperaturi sczute i prin aciunea ei se formeaz mirosuri nedorite n produsele vegetale respective. Boabele de soia conin dou tipuri de lipoxigenaz, una activat de Ca 2+ iar cealalt inhibat de Ca2+, vrful de activitate fiind suma efectelor pozitive i negative, funcie de modificrile concentraiei de calciu. Lipoxigenaza din soia nu necesit activare cu metale sau grupare prostetic. Antioxidanii obinuit folosii sunt inhibitori slabi ai lipoxigenazei iar acidul ascorbic i tocoferolii accelereaz reaciile de oxidare. Lipoxigenaza din soia se utilizeaz pentru albirea finii de gru prin distrugerea carotenilor.

22

Polifenoloxidazele (denumite cresolaze, catecholoxidaze, cateholaze, tirozinaza, fenolaza; denumire sistemic O-difenol: oxigenoxidoreductaza, EC 1.10.3.1) sunt enzime care transport electronii direct pe oxigen. Catalizeaz hidroxilarea monofenolilor cu formare de O-difenoli, care sunt transformai n Ochinone. Sunt larg rspndite n plante, gsindu-se n cantitate mai mare n special n ciuperci, tuberculi de cartofi, frunze de ceai i tutun, boabe de cafea i n diferite fructe ca mere, piersici, caise, banane etc. Polifenoloxidazele din plante nu prezint o specificitate deosebit, puind s acioneze asupra unor mari varieti de compui monofenolici i O-difenolici. In schimb, polifenoloxidazele din esuturile mamiferelor au o specificitate mult mai restrns, acioneaz doar asupra tirozinei i dihidroxifeni-Lalaninei. mbrunarea materialelor vegetale (legume, fructe proaspete tiate) n contact cu oxigenul din aer este datorat polimerizrii sau polimerizrii oxidative a chinonelor formate din mono- i difenoli, asupra crora au acionat polifenoloxidazele. Prin folosirea unor tratamente termice ca, de exemplu: n cazul blanrii legumelor i fructelor, are loc inactivarea polifenoloxidazelor. De asemenea, concentraii relativ mici de clorur de sodiu, de ageni de complexare a cuprului, de acid ascorbic, S02 pot preveni sau minimaliza procesele de mbrunare enzimatic a legumelor i fructelor cauzate de polifenoloxidaze. Peroxidazele snt enzime care catalizeaz reacii de oxidoreducere dup reacia general: ROOH + AH2 H2 + ROH + A n care: ROOH poate fi peroxidul de hidrogen (H202) sau un alt peroxid organic. Aceste enzime snt larg distribuite n microorganisme (bacterii, drojdii), n plante ca, de exemplu, napi, gulii, cartofi, smochine i diferite alte legume i fructe, n esuturi i lichide biologice animale ca, de exemplu, ficat, lapte, saliv, n leucocite etc. Din punct de vedere structural pot fi grupate n: peroxidaze feriprotoporfirice (cu grupare prostetic feriprotoporfirina III) prezente n plantele superioare (legume i fructe), n animale (ca, de exemplu, triptofanpirolaza, tiroid-iodin-peroxidaza) i n microorganisme (citocrom c-peroxidaza din drojdii); verdo-peroxidaze (cu grupare prostetic porfirinic diferit de feri-porfirina III) de culoare verzuie, cum este lactoperoxidaza din lapte i flavo-protein-peroxidaza (cu FAD ca grupare prostetic) de felul celor gsite n diferii streptococi dar i n unele esuturi animale. n general, peroxidazele prezint o mare stabilitate termic. De exemplu, pentru unele peroxidaze s-a constatat pstrarea a circa 50% din activitatea iniial dup un tratament termic de 32 min la 85C, 12 min la 100C, 2,5 min la 116C i 0,4 min la 145C. Datorit termostabilitii lor, determinarea activitii peroxidazice din diferite legume i fructe este folosit ca un indice al eficienei tratamentelor termice aplicate n procesele de blanare, sterilizare etc. Determinarea activitii lactoperoxidazei este folosit la urmrirea eficienei pasteurizrii n industria laptelui. Diferitele peroxidaze intervin n degradarea fructelor i legumelor, fiind implicate n modificarea mirosului i gustului (mai ales la mazre, fasole etc.) n procesele de mbrunare enzimatic. Sub form de preparate enzimatice, n special peroxidaza obinut din hrean, snt folosite, alturi de glucozoxidaz, n determinarea specific a glucozei din diferite materiale biologice. 4. HIDROLAZE IMPORTANTE N INDUSTRIA ALIMENTAR Hidrolazele sunt enzime care catalizeaz scindarea hidrolitic a substraturilor, determinnd desfacerea legturilor dintre atomii de carbon i ali atomi prin introducerea elementelor apei. Principalele legturi scindate la hidrolaze sunt legturile: ester glicozidazic i peptidic. 4.1. Lipaze i esteraze Enzimele lipolitice snt importante n metabolismul i degradarea lipidelor. Importana lor fiziologic const n aceea c hidrolizeaz grsimile alimentare cu formare de di-, monogliceride i acizi grai, produi care snt transportai, oxidai i sintetizai n gliceride i fosfolipide proprii organismului. Importana lor tehnologic const n faptul c realizeaz hidroliza controlat a lipidelor, n vederea formrii de arome n cadrul alimentelor (de exemplu,, n cazul brnzeturilor) sau n sisteme pregtite special pentru obinerea de aromatizani. Enzimele lipolitice sunt implicate ns i n degradarea unor produse alimentare cu coninut ridicat n lipide (lapte i produse lactate, carne, pete, produse vegetale bogate n lipide, cum ar fi arahidele, semine de floarea soarelui, soia, germeni de gru i porumb etc.).

23

Lipazele se difereniaz de esteraze prin afinitatea lor mai mare pentru acizii grai cu lan lung din structura gliceridelor. Pe de alt parte, pe plan structural, lipazele prezint o poriune hidrofil i alta lipofil, fapt ce le permite plasarea lor la interfaa ulei/ap, aciunea lor fiind favorizat de calitatea emulsiilor de tipul ulei/ap. Srurile de calciu i proteinele sunt activatori (efectori) ai lipazelor. In cazul lipazelor din sucul pancreatic, rol de activator l au i srurile acizilor biliari. Enzimele lipolitice de tipul lipazelor i fosfolipazelor sunt prezente ca enzime endogene n diferite esuturi animale, lapte, produse vegetale. Laptele conine o lipaza (cea mai important) care are pH optim la 8,59 i alte 23 lipaze care includ i o lipaza acid. Proteinele din lapte au aciune inhibitoare fa de lipaze. Clorura de calciu (CaCl2) inhib semnificativ lipazele din lapte. Lipazele din lapte hidrolizeaz rapid trigliceridele simple, viteza de hidroliz micorndu-se o data cu creterea lanului de acid gras din structura trigliceridei. Lipazele din lapte posed si activitate de sintez: glicerol + acid gras gliceride + ap Sinteza gliceridelor este influenat de concentraia enzimei, concentraia glicerolului, temperatura i durata incubrii. Fructele i legumele, dar n special seminele de gru, ovz, secar, soia etc., conin lipaze care provoac deteriorri ale acestora n condiii nefavorabile de umiditate relativ mare a aerului, coninut mare de umiditate al cerealelor, temperatur ridicat. Datorit creterii coninutului de acizi grai liberi scad proprietile de panificare a finurilor de gru. Germenii de gru, secar, orz au o activitate lipolitic mai mare dect endospermul, deci sunt mai bogai n lipaze. Scutelum i stratul aleuronic, de asemenea, conin mai multe lipaze dect endospermul. Lipazele produse de microorganisme snt produse de drojdii (Candida, Torulopsis) , mucegaiuri (Rhizopus, Penicillimmi, Aspergillus, Geotrichum, Mucor), bacterii (Pseudomonas, Achromobacter, Staphylococcus). Lipazele din microorganisme difer ntre ele prin pH i temperatura optim de activitate, durata/temperatura de inactivitare, respectiv stabilitatea termic. Lipazele produse de microorganisme snt considerate ca lipaze adevrate care hidrolizeaz grsimile i uleiurile naturale ca i gliceridele sintetice. Concentraii sczute de sruri de Ca, Na, K, Mg activeaz lipazele, dar metalele grele snt inhibitori puternici. Avnd n vedere aciunea negativ a lipazelor asupra caracteristicilor senzoriale ale produselor alimentare, este necesar s se ia urmtoarele msuri: s se reduc coninutul n ap liber al produsul alimentar (acolo unde este posibil), pentru a micora activitatea apei (aw), deci pentru micorarea vitezei reaciilor enzimatice; s se pstreze produsele alimentare la temperaturi ct mai sczute (de refrigerare sau congelare) sau s se inactiveze lipazele prin tratament termic ; s se reduc timpul de depozitare al materiilor prime ; s se elimine factorii care concur la dezvoltarea microflorei lipolitice. 4.2. Enzime oligozidazice Dintre oligozidaze, mai importante pentru industria alimentar sunt -glucozidaza (EC 3.2.1.21), D-galactozidaza (EC 3.2.1.22), -D-galactozidaza (EC 3.2.2.23), -D-fructofuranozidaza (EC 3.2.1.26).

-Glucozidaza (EC 3.2.1.21), denumit i emulsin, scindeaz legtura -glucozidic din -glucozii rspndii n plante cum ar fi amigdalin, prunazin, naringin, dar i din celobioz i gentiobioz. Aceast enzim este produsa i de unele microorganisme: Alcaligenes faecalis, Botryodiplodia theobromae, Phoma

24

strasseri, Septoria licopersici, Aspergillus niger, Myrothecium verucaris, Trichoderma viride, Saccharomyces lactis etc. -D-Galactozidaza (EC 3.2.1.32) este prodsu de B. stearothermophilus, Penicillium duponti, Absidia griseola, Mortierella vinaceae, Aspergillus awamori. Substratul natural al acestei enzime este rafinoza, trizaharid format din galactoz, glucoza i fructoz. Enzima desface rafinoza n galactoz i zaharoz i are aplicaii n industria zahrului i industria derivatelor proteice vegetale.

-D-Galactozidaza (EC 3.2.2.23), cunoscut i sub numele de lactaz hidrolizez lactoza la glucoza i galactoz (fig. 13). Este gsit n unele plante, microorganisme i n mucoasa intestinal a mamiferelor. Este obinut din tulpini de mucegaiuri (Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus foetidis), din drojdii (Kluyveromyces fragilis, Kluyveromices lactis, Candida pseu-dotropicalis, Torulopsis lactis) i bacterii (Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Escherichia coli). Preparatele lactazice din drojdii acioneaz bine la pH 6 i la temperatura de 35 ... 40C, deci la pHul substratului natural (lapte degresat, lapte concentrat), cele de origine fungic au activitate maxim la pH 5 i la temperatura de 50 ... 60 "C, fiind recomandate pentru hidroliza lactozei din zer. Din Aspcrgillus oryzae i Aspergillus niger se obin lactaze acidoactive i acidostabile, folosite la hidroliza lactozei n mediu acid. Lactaza de origine bacterian (E. coli) acioneaz bine la pH ~ 7,3 i la 46 C. Ionii de sodiu i potasiu snt activatori ai lactazei din E. coli i din drojdii. Preparatele enzimatice de lactaz se utilizeaz pentru obinerea de produse lactate destinate i adulilor care prezint intoleran la lactoz (deficient congenital, primar sau secundar de lactaz), pentru obinerea siropului'de lactoz ce are multiple aplicaii n industria alimentar, pentru mpiedicarea apariiei unor defecte n produsele lactate concentrate i congelate. Se utilizeaz i n panificaie, n cazul utilizrii zerului pulbere la fabricarea pinii. 4.3. Amilaze Amidonul, cel mai important homoglucid de rezerv din regnul vegetal, se gsete n diferite materii prime folosite n industria alimentar, de obicei sub form de granule, n cele dou componente principale, amiloza i amilopectina, care snt dispuse n straturi concentrice, fiind nsoite de mici cantiti de alte substane organice (protide, lipide) i substane anorganice (H3PO4, Si03, H2O). Amiloza care reprezint 20 25% din amidon, este alctuit din uniti de glucoza legate ntre ele prin legturi l-4 glucozidice, gradul de polimerizare fiind de 2006000 (n medie 103). Amilopectina care reprezint 7580% din amidon este format din lanuri liniare de glucoza legate l-4 glucozidic, lanuri care se grefeaz unele pe altele prin legturi l-6 glucozidice. Numrul legturilor l -6 glucozidice reprezint 56% din ansamblul de legturi din amilopectin, gradul de polimerizare al acesteia fiind de 105109 resturi de glucoza. Sub form de granule, amidonul este rezistent la aciunea enzimelor amilolitice. In general, enzimele amilolitice acioneaz numai n condiiile n care granulele de amidon sunt cel puin lezate (de exemplu n cazul amidonului din cereale supuse mcinrii) i mai ales cnd amidonul a fost gelificat prin nclzire n prezen de ap, realizndu-se pe aceast cale o hidratare, o umflare i deci o spargere a granulelor de amidon. Sub aceast form amidonul devine uor atacabil de enzimele amilolitice care, acionnd asupra amilozei i

25

amilo-pectinei, produc desfacerea hidrolitic a legturilor l-4 glucozidice, determinnd depolimerizarea acestora i formarea de dextrine de diferite mrimi, maltoz, glucoza. Enzimele implicate n degradarea amidonului pot fi endogene, care se gsesc n cantitate mai mare n cereale ncolite, importante n cazul orzului ce este transformat n mal, i exogene, care n cea mai mare parte sunt de natur bacterian sau fungic. Amilazele sunt bine caracterizate i difereniate pe baza tipului de legtur hidrolizat, modul lor de atac (endo sau exo), natura substratului limit i produii de degradare. Enzimele care atac amidonul snt glucozilhidrolaze i aparin urmtoarelor grupe: a) Enzime care hidrolizeaz legturile l-4 glucozidice .-Amilaza, cunoscut i sub denumirea de amilaz dextrinogenic, diastaza, ptialin, glucogenaz, l,4-glucon 4-glucanohidroxilaz (EC 3.2.1.1.), este o metalprotein care conine calciu n proporie de l atom gram/molecul, strns legat de enzim. Prin ndeprtarea calciului, enzim devine inactiv i instabil la cldur. Calciul nu particip direct la formarea complexului enzim-substrat, dar menine molecula de enzim n configuraia optim pentru un maxim de activitate i stabilitate, (n practica de hidroliza a amidonului se adaug calciu sub form de sruri). Enzim are activitate la pH cuprins ntre 4,5 i 7,0, pH-ul optim depinznd de originea enzimei. Stabilitatea la cldur este de asemenea diferit n funcie de originea enzimei. Amilaza hidrolizeaz mai mult sau mai puin la ntmplare legturile l-4 glucozidice din interiorul moleculelor de amiloz i amilopectin, conducnd la dextrine de diferite mrimi, respectiv la lichefierea amidonului i la o hidroliza prelungit i la maltoz i maltotrioze. -Amilazele pot fi de origine animal (amilaz produs de glanda salivar i pancreas), de origine vegetal (cereale ncolite n special mal) cu importan n industria berii, spirtului i panificaiei i de origine microbian (bacterii, mucegaiuri i mai puin drojdii), cele de origine bacterian fiind mai stabile la cldur dect cele de origine fungic. -Amilaza, denumit i amilaz zaharigenic, l-4 glucano-maltohidrolaza (EC 3.3.1.2) hidrolizeaz legturile l-4 glucozidice ale amidonului de la capetele nereductoare ale lanurilor poliglucidice (este exoenzim). Amiloza cu numr impar de uniti de glucoza este transformat n maltoz n proporie de 90% i n maltotrioze. La concentraii mari ale enzimei i la hidroliz prelungit, maltotrioza este degradat lent la glucoza i maltoz. Amilopectina este degradat i ea n maltoz dar hidroliz se oprete la legturile l6 glucozidice care nu pot fi hidrolizate i nici by-passate. Se formeaz n acest fel 6070% maltoz, restul fiind dextrine limit. -amilaza are pH-ul optim ntre 5 i 6 iar temperatura optim ~55 ... 63 C. Pentru activitatea enzimatic snt necesare gruprile SH. Surse importante de -amilaz sunt orzul, grul, secara, cartofii dulci i soia. Recent s-a dovedit c este produs i de unele microorganisme (Bacillus, Streptomyces ), avnd pH-ul optim la 56 i temperatura optim la 60 C. b) Enzime care hidrolizeaz legturile l-6 glucozidice. Sunt cunoscute i sub denumirea de enzime de debranare (deramificare) ce acioneaz asupra arnilopectinei din amidon, n cadrul acestora snt mai bine cunoscute urmtoarele enzime: pullulanaza (EC 3.2.1.41), care hidrolizeaz poliglucidul pullulan, conducnd la eliberarea de maltotrioza. Acioneaz, de asemenea, i asupra legturilor l -6 glucozidice din amilopectin i n mai mic msur asupra celor din structura glicogenului. Este produs de numeroase microorganisme, dar se extrage, n principal, din Klebsiella aerogenes. izoamilaza (EC 3.2.1.68) poate deramifica att amilopectin cit i glicogenul. Acioneaz foarte slab asupra pullulanului. Este produs de specii dePseudomonas i Citophaga. Aceste dou enzime de deramificare pot completa 100% aciunea de dextrinizare i zaharificare a amidonului produs de i amilaze. Ca i amilaza, enzimele de deramificare nu acioneaz asupra amidonului negelificat. c) Enzime care hidrolizeaz att legturile l-4ct i l-6 glucozizidice. n cadrul acestora o deosebit importan o prezint: glucoamilaza ce hidrolizeaz mai repede legturile l-4 dar i cele l-6 de la capetele nereductoare ale lanurilor poliglucidice din amidon, conducnd la glucoza. Randamentul de transformare a amidonului n glucoza este afectat de capacitatea enzimei de a polimeriza glucoza la maltoz i maltotrioza, reacie care este dependent de concentraia ridicat a substratului. Preparatele comerciale de amiloglucozidaza snt de origine fungic (Aspergillus, Rhizopus), fiind impurificate cu lipaze, tanaze, celulaze, hemicelulaze, proteaze. 4.4. Enzime pectolitice :

26

Enzimele care acioneaz asupra substanelor pectice pot fi clasificate n dou grupe: enzime saponifiante sau pectinesteraze i enzime depolimerizante sau pectinglicozidaze. Pectinesterazele (pectinmetilesteraza pectindemetoxilaza, pectinpectilhidrolaze, EC 3.1.1.11), notate PME sau PE, hidrolizeaz esterul metilic al acidului galacturonic. Pectinesterazele se gsesc n diferite produse vegetale (tomate, ceap, pepeni, mere, pere etc.) i au un optim de pH aproape de neutralitate. De exemplu, pectinesterazele din tomate i citrice au pH-ul optim la 7,5, cele din mere la 6,6 i cele din struguri la 5,6. Snt relativ stabile la cldur. Pectinglicozidazele sunt enzime depolimerizante. Preparatele enzimatice pectolitice snt utilizate n mare msur pentru ameliorarea extraciei sucului celular din fructe i legume (prin degradarea pereilor celulari), pentru macerarea fructelor i legumelor n vederea obinerii de nectaruri (prin degradarea substanelor pectice ale lamelelor mijlocii care asigur legtura dintre celule, fr a se distruge pereii celulelor parenchimatoase) i pentru limpezirea (clarificarea) diferitelor categorii de sucuri. In cazul preparatelor enzimatice pectolitice folosite pentru macerare, este necesar ca acestea s posede i activitate celulazic, hemicelulazic, proteazic i amilazic. 4.5. Peptidhidrolaze (proteinaze i peptidaze) Peptidhidrolazele proteinazele i peptidazele cunoscute i sub denumirea general de enzime proteolitice catalizeaz scindarea hidrolitic a legturilor peptidice, din moleculele proteidelor, polipeptidelor i oligopeptidelor, conducnd la eliberarea de peptide de diferite mase moleculare, sau chiar la aminoacizi, dup urmtoarea reacie general:

n funcie de regiunea din molecula proteidelor sau polipeptidelor la nivelul creia acioneaz, acestea se subdivid n endo- i exopeptidhidrolaze ; endo-peptidhidrolazele, denumite i proteinaze sau peptidilpeptidhidrolaze, scindeaz hidrolitic legturile peptidice din interiorul catenelor polipeptidice ale proteidelor i proteinelor cu masa molecular mare, producnd catene polipeptidice de mas molecular mai mic, iar exo-peptidhidrolazele, peptidazele sau exopeptidazele catalizeaz desfacerea hidrolitic a legturilor peptidice de la extremitile catenelor polipeptidice sau oligopeptidice, conducnd, n general, la eliberarea de aminoacizi. Exo-peptidazele pot aciona att asupra produilor de hidroliz a endo-peptidhidrolazelor ct i asupra unor proteine nehidrolizate. La rndul lor, exopeptidazele, se subdivid n aminopeptidaze, care desfac hidrolitic aminoacizii de la capetele N terminale ale catenelor peptidice (corespunztoare resturilor de aminoacizi cu gruparea NH2 liber) i carboxipeptidaze ce scindeaz hidrolitic aminoacizii de la capetele C terminale (corespunztoare resturilor de aminoacizi cu gruparea COOH liber). n cadrul exo-peptidazelor se grupeaz i dipeptidazele, care desfac legturile peptidice din dipeptide, precum i dipeptidil-peptidhidrolazele, care scindeaz dipeptide de la captul N terminal al lanului polipeptidic i peptidil-dipeptidhidrolazele ce elibereaz dipeptide din captul C terminal. In cazul endo-peptidhidrolazelor, lundu-se n considerare unele grupri funcionale din centrii activi ai enzimelor, comportarea fa de unii inhibitori sau activatori i efectul pH-ului, se pot distinge: proteinaze serinice, care au n centrul activ un rest de serin i care sunt inhibate de unii compui organofosforici; acestui grup i aparin: tripsina, chimotripsina, elastaza, subtilizina (din Bacillus sp.), proteinaza alcalin din Aspergillus sp. etc.; proteinaze tiolice sau SH-dependente, care au n centrul activ grupri SH libere, corespunztoare resturilor de cistein i care pot fi inactivate prin blocarea acestora cu metale grele, cu ageni alchilani sau oxidani; din cadrul acestora fac parte: papaina, ficina i bromelina; proteinaze carboxilice (acide) al cror centru activ cuprinde grupri carboxilice ionizate i care sunt active n domeniu de pH acid; din acest grup fac parte proteinazele care coaguleaz laptele, chimozina, pepsina, proteinazele produse de Mucor sp., precum i proteinazele acide produse de Aspergillus sp. ; metal-proteinaze, care sunt activate de ioni metalici legai de centrul activ (ca, de exemplu, Ca 2+, Zn2+, Mg2+, Fe2+); din grupul acestora fac parte: colagenazele, proteinaza neutr produs de Bacillus subtilis, sau Aspergillus oryzae etc.

27

Dintre peptidhidrolazele vegetale : Papaina. Sub denumirea de papain se nelege preparatul brut ce se colecteaz din fructele de Caryca papaia, cu puin nainte de coacerea acestora. Latexul colectat n contact cu aerul se coaguleaz, dup care se usuc sub vid, se macin i se cerne. Preparatul brut de papaia conine de fapt trei fraciuni: papain propriu-zis (10%), chimio-papain (45%) i lizozim (20%), ultima fraciune fiind denumit i papainpeptidaz. Aceste fraciuni difer ntre ele prin masa molecular i punctul izoelectric. Papaina propriu-zis este o proteinaz tiolic constituit dintr-un lan polipeptidic format din 212 resturi aminoacizi. Papaina are o activitate specific larg hidroliznd att peptidele mici ct i proteinele. Este foarte activ n hidroliza amidelor i esterilor. Are pH-ul optim n jur de 6. Papaina are o stabilitate bun. Chimopapaina. A fost obinut n stare cristalizat din latexul de papaya i este format din chimopapaina A i B. Are aciune asemntoare cu papain, ns este mai puin eficace asupra hemoglobinei i este mai stabil dect papaina. Chimopapaina i pierde 50% din activitatea sa dac este meninut 75 min la 75C (pH = 7,2), fa de 56 min pentru papain. Preparatul brut de papain atac relativ bine fibrele musculare i pe cele elastice dar mai puin pe cele de colagen. Bromelina. Este o enzim proteolitica cu aciune energic care se gsete n sucul de ananas. Ca i papain i ficin, bromelina este o sulfhidril-proteaz, ns are structura unei glicoproteine. Optimul de activitate este la pH = 6,3 i la 55C. Are o aciune bun asupra fibrelor de colagen, dar o aciune slab asupra celor elastice. Aciunea asupra fibrelor musculare este foarte redus. Peptidhidrolazele de origine animal mai bine cunoscute i mai des folosite snt: chimozina, pepsina i tripsina, crora li se adaug chimotripsina, elastaza i carboxipeptidazele, aminopeptidazele i dipeptidazele, produse de diferite glande digestive. Cu excepia ultimelor dou tipuri de exo-peptidaze, celelalte peptidhidrolaze sunt produse de glandele digestive sub form de pro-enzime (preenzime sau zimogene) inactive, care devin active numai n urma scindrii hidrolitice a unor poriuni din structura lor, ce blocheaz activitatea lor enzimatic. Conversia proenzimelor n enzime active se realizeaz pe cale autocatalitic, care conduc la enzim activ i fragmente polipeptidice inactive enzimatic. Chimozina. Cunoscut i sub denumirea de cheag, rennin, presur sau labferment, chimozina constituie un preparat enzimatic cu aciune coagulant (asupra laptelui) i proteolitica, asemntor pepsinei, obinut din stomacuri de viel, miel sau ied, folosit n special la prepararea brnzeturilor. Chimozina rezult din precursorul inactiv prochimozina produs de mucoasa stomacului glandular (al patrulea stomac al vieilor) prin hidroliza parial, proces influenat de pH i concentraia n sruri. Chimozina este o preteaz serinic, cu specificitate de aciune similar pepsinei, acionnd mai ales la nivelul legturilor peptidice n care sunt implicate resturi de triptofan, fenilalanina, tirozin, metionin i leucin; manifest activitate coagulant i proteolitic. Pepsina. Endo-peptizad produs sub form de pepsinogen de glandele stomacale ale mamiferelor inclusiv ale omului i care se gsete i n sucul gastric al psrilor, reptilelor i petilor, pepsina scindeaz hidrolitic legturile peptidice din interiorul catenelor polipeptidice ale proteinelor, acionnd de preferin la nivelul legturilor peptidice n care sunt implicai aminoacizi aromatici (fenilalanin, tirozin sau triptofan) i dicarboxilici (acizii glutamic i aspartic). Transformarea pepsinogenului n pepsina catalitic activ se realizeaz la pH mai mic decit 5, n prezena ionilor H+ sau a unor mici cantiti de pepsina, activarea fiind nsoit de eliberarea unui polipeptid alctuit din 29 de resturi de aminoacizi, care acioneaz ca inhibitor al pepsinei, i cinci peptide mici. Pepsina este constituit dintr-un singur lan polipeptidic cu un rest izoleucinic la captul N terminal i un rest de valin la captul C terminal. pH-ul optim de aciune este 1,52,5. Este folosit la precipitarea cazeinei, obinerea de peptone, n unele ri pentru limpezirea berii la rece, ca adjuvant digestiv i este inclus n reeta de preparare a unor buturi tonice i a chewing-gum-ului. Tripsina. Este tot o endo-peptidaz, care desface hidrolitic legturile peptidice n interiorul catenelor polipeptidice, de preferin cele constituite ntre gruparea carboxil a unui aminoacid diaminic (arginin, lizin) i gruparea aminic a altui rest de aminoacid. Este produs de pancreas sub form de tripsinogen, forma inactiv, care se transform n tripsin activ n intestinul subire sub aciunea enterochinazei (o enzim intestinal) sau pe cale autocatalitic, n prezena unor mici cantiti de tripsin. Tripsina este constituit din 223 resturi de aminoacizi a cror secveniabilitate este cunoscut. Acioneaz la pH neutru, slab alcalin, pH-ul optim fiind 8,5. n ultimele decenii, datorit dezvoltrii impetuoase a proceselor i instalaiilor de cultivare a microorganismelor la nivel industrial, pentru realizarea de diferite produse (antibiotice, vitamine, preparate enzimaticc etc.) pe cale biosintetic, s-a nregistrat un interes deosebit i pentru cercetarea i obinerea de

28

preparate peptidhidrolazice din microorganisme, n special din bacterii i fungi. Interesul pentru astfel de preparate proteolitice a crescut i mai mult dup anul 1965, cnd s-au folosit astfel de preparate pentru obinerea de detergeni cu enzime, de tip Biotex, care conin proteaze produse de Bacillus licheniformis. Multe din microorganismele folosite la producerea de preparate proteolitice produc aceste enzime extracelular, secretndu-le n lichidele de cultur, ceea ce uureaz foarte mult condiiile de prelucrare industrial pentru obinerea de preparate enzimatice. Datorit acestor fapte, exist n prezent tendina ca o serie de preparate proteolitice de natur vegetal sau animal s fie nlocuite din ce n ce mai mult cu preparate proteolitice microbiene, care sunt n general mai ieftine i de o mai mare diversitate. n prezent snt cunoscute numeroase tulpini de microorganisme care secret n mediile lor de cultur cantiti apreciabile de enzime proteolitice; dintre acestea, ns, sunt folosite pentru obinerea de preparate proteazice numai tulpinile nepatogene i care nu produc toxine. De mai muli ani, n diferitele sectoare ale industriei alimentare, se folosesc proteaze obinute mai ales prin cultivarea unor microorganisme ca: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Streptomyces sp., Rhizopus sp., Byssoclamys fulva, Endothia parasiiica, Mucor niiehei, Mucor pusillus etc. Proteinazele microbiene nu sunt, n general, foarte diferite de cele vegetale sau animale; aparin i ele serin sulfhidril- i carboxil-proteinazelor, precum i metalo-proteinazelor.

MICROORGANISME FOLOSITE IN PROCESELE BIOTEHNOLOGICE Viaa Terrei nu ar fi posibil fr existena microorganismelor, pentru c acestea stabilesc echilibrul ntre substanele organice i cele anorganice, ntre materia vie i materia nevie. Industria alimentar, n mare parte, este de neconceput fr e