UNIVERSITATEATA DE VEST"VASILE GOLDIS ARAD

BIOLOGIA MOLECULAR A MEDICAMENTULUI

Arad 2009

1

PREFABiologia molecular este implicat major n cercetrile privind noile strategii terapeutice. Astfel, dac se identific gena/proteina care se afl la originea unei maladii ereditare sau dobndite exist posibilitatea descoperirii unor noi piste pentru concepia unor medicamente destinate s reduc deficitele sau excesele de activitate a acestei gene/proteine. De exemplu,n cazul anomaliei unui anumit receptor (protein a suprafeei celulare destinat s transmit mesajul extern la structurile celulare interne) care determin o anumit maladie este posibil concepia i dezvoltarea unor molecule ,viitoare medicamente, capabile s acioneze specific asupra receptorului sau s suplineasc funcia deficitar a acestuia printr-o alt cale. Cercetrile efectuate asupra moleculelor terapeutice se bazeaz acum pe tehnici de modelare a moleculelor asistate pe calculator, pe sinteza unor analogi de sintez a acestor molecule i pe teste de selecie de nivel nalt ale acestor numeroi analogi. Ansamblul acestor tehnici va permite ,n timp record, o selecie a eficacitii terapeutice a unei anumite inte dintre numeroasele molecule candidate. n prima parte a crii pe baza studiului molecular, mai precis al semnalelor moleculare, sunt analizate diferite tehnologii de testare celular. i, cnd amintim de aceste tehnici ne referim nu doar la simpla detectare a unui singur produs celular ci la urmrirea unei mari varieti de procese metabolice avnd drept scop final caracterizarea fenotipic multidimensional a comportamentului celular. Cel de al doilea capitol familiarizeaz cititorul cu modelele genelor knock-out, o tehnic care ne permite s creem i s introducem un model de mecanism patologic ntr-un organism complex urmrind astfel s obinem un instrument analitic cu relevan crescut n biologia molecular a medicamentului. Urmtorul capitol prezint detaliile unei tehnici de analiz molecular axat pe aa-numitele "gene reporter". Descifrarea recent a genomului uman a oferit un nou sprijin ntregii arii de cercetare. Dintro dat un numr mare de inte moleculare puteau fi supuse analizei. Mai nti trebuie s rspundem la ntrebarea: ce realizeaz aceast molecul int la nivelul proceselor biochimice celulare i cum este ea controlat? Acestei ntrebri i propune s raspund capitolul 4, care se ocup de receptorii "orfani" cuplai cu proteina G (GPCR) i ncearc implicit s prezinte noi provocri i oportuniti n gsirea unor noi liganzi cu efecte biologice nc necunoscute. Cea de-a doua parte a acestei cri este dedicat n ntregime procesului de sintez a medicamentelor. Dou arii de interes major pot beneficia enorm n urma cercetrii procesului de sintez n cadrul biologiei moleculare i utilizrii n acest scop a tehnicilior corespunztoare: elucidarea sintezei stereoselective a compuilor naturali i analogilor lor i sintetizarea compuilor 2

farmacologici derivai din ADN sau proteine. Primul capitol al acestei pri secunde ofer o privire de ansamblu, cuprinztoare, despre utilizarea enzimelor n sinteza stereoselectiv, implicnd utilizarea tehnicilor de recombinare genetic. Domeniul fascinant al produilor farmacologici care interacioneaz cu acizii nucleici, structura i sinteza acestora, agonitii lor i mecanismele de aciune fac obiectul capitolului 6. Partea a treia prezint metodele analitice implicate n determinarea interaciuni medicamentint. n acest sens se discut utilizarea proteinelor n cromatografia de afinitate i enantioseparare a enantiomerilor (molecul parte a unui compus alctuit din dou molecule din care una este imaginea n oglind a celeilalte fr s fie identic cu ea). Utilizarea rezonanei magnetice nucleare (NMR) i a tehnicilor nrudite n studiul structurilor moleculare este un alt subiect din aceast parte a crii. Elementele de cinetic, metabolism,i toxicologie implicate n domeniile farmacogenomicii i toxicogenomicii constituie partea final a acestei cri. Acum tim c o maladie este rezultatul combinat a sute de proteine i n acest context este dificil s sperm c vom gsi un principiu unic activ capabail s vindece boala. ntr-adevr, din 100 de medicamente care depesc stadiul de testare pe om , numai trei ajung pe pia. Celelalte se vor dovedi a fi toxice sau ineficiente. Probabil c toate intele bune asupra crora un medicament poate s exercite un efect au fost deja gsite. Ceea ce presupune c pentru a produce noi medicamente trebuie s se revin la cele vechi, care vor fi altfel reutilizate. Ca i natura, cercettorii vor face cu ajutorul biologiei moleculare, noul din vechi.

Autorii

3

CUPRINSCUVNT NAINTE .......................................................................................................................... 7 PARTEA I: CARACTERIZAREA MOLECULAR A INTERACIUNILOR MEDICAMENT-INT .................................................................................................................10 1. TESTELE CELULARE: UTILIZAREA I IMPACTUL LOR N DESCOPERIREA MEDICAMENTELOR ..................................................................................................................10 1.1. Introducere ..............................................................................................................................10 1.2. Proteinele membranare i rspunsurile celulare rapide...........................................................16 1.3. Evaluarea expresiei genelor i proteinelor n cadrul unor sisteme de analiz de mare capacitate........................................................................................................................................27 1.4.Reaciile celulare spaio-temporale i analizele subpopulaiilor..............................................37 1.5. Analizele fenotipice ................................................................................................................49 2. IMPLICAREA GENELOR KNOCKOUT N NELEGEREA MECANISMELOR BOLII I DEZVOLTAREA UNOR NOI STRATEGII TERAPEUTICE .....................................................58 2.1. Introducere ..............................................................................................................................58 2.2. Gene knockout la oareci ........................................................................................................59 2.3. Expresia genelor esut specifice..............................................................................................70 2.4. oareci transgenici ..................................................................................................................77 2.5. Lezarea genelor int la Drosophila ........................................................................................79 2.6. Inactivarea genelor int la petele zebr ................................................................................81 2.7 . Deleia tulpinilor int de Caenorhabditis elegans .................................................................82 3. SISTEME DE TESTE BAZATE PE GENE REPORTER CARE INVESTIGHEZ RECEPTORII CUPLAI CU PROTEINA G IMPLICAI N DESCOPERIREA DE NOI MEDICAMENTE ..........................................................................................................................84 3.1. Receptorii i comunicarea celular .........................................................................................84 3.2. Afinitatea i activitatea liganzilor GPCR................................................................................90 3.3. Rolul factorilor de transcripie n expresia genelor.................................................................91 3.4. Genele reporter.......................................................................................................................94 3.5. Sisteme de teste bazate pe gene reporter pentru investigarea GPCRs ..................................102 4. DE LA GENOMUL UMAN LA NOILE MEDICAMENTE: POTENIALUL RECEPTORILOR ORFANI CUPLAI CU PROTEINELE G ..................................................109 4.1.Introducere .............................................................................................................................109 4.2. GPCRs i genomul uman ......................................................................................................111 4.3. Investigarea liganzilor...........................................................................................................116 4.4. Screeningul pentru liganzi oGPCR folosind teste funcionale.............................................124 4.5. Perspective ............................................................................................................................137 PARTEA A II-A: SINTEZA MEDICAMENTELOR PE BAZA ENZIMELOR I ACIZILOR NUCLEICI...................................................................................................................................... 140 5.SINTEZA STEREOSELECTIV A MEDICAMENTELOR CU AJUTORUL ENZIMELOR RECOMBINANTE......................................................................................................................140 5.1. Sinteza stereoselectiv nainte de apariia ingineriei genetice ..............................................140 5.2. Metode clasice de mbuntire a tulpinilor pentru sinteza stereoselectiv ..........................144 5.3. Ingineria genetic i apariia enzimelor recombinante pentru sinteza stereoselectiv..........146 5.4. Antibioticele -lactamice ......................................................................................................149 5.5. Antibioticele poliketide.........................................................................................................157 5.6. Vitaminele.............................................................................................................................160 5.7.Steroizii...................................................................................................................................167 5.8. Alte medicamente .................................................................................................................168 4

5.9. Concluzii ...............................................................................................................................172 6. MEDICAMENTE PE BAZ DE ACIZI NUCLEICI.............................................................173 6.1. Introducere ............................................................................................................................173 6.2. Sinteza chimic a oligonucleotidelor ....................................................................................174 6.3. Modificri chimice ale oligonucleotidelor............................................................................176 6.4. Mecanismul de aciune..........................................................................................................186 6.5. Identificarea poziionrii situsurilor accesibile ribozimelor la nivelul ARN int................198 6.6. Distribuirea exogen a ribozimelor.......................................................................................199 6.7. Aplicaiile oligonucleotidelor n inhibarea expresiei genelor ...............................................202 6.8. Concluzii ...............................................................................................................................203 PARTEA III: METODE ANALITICE IMPLICATE N PRODUCEREA I UTILIZAREA MEDICAMENTELOR..................................................................................................................204 7. TENDINE RECENTE N ENANTIOSEPARAREA MEDICAMENTELOR CHIRALE..204 7.1. Introducere ............................................................................................................................204 7.2. Situaia actual a dezvoltrii i utilizrii medicamentelor chirale ........................................208 7.3. Rolul tehnologiilor de separare n producerea, cercetarea i utilizarea medicamentelor chirale...........................................................................................................................................211 7.4. Prepararea medicamentelor enantiomeric pure.....................................................................212 7.5. Bioanaliza medicamentelor chirale.......................................................................................225 7.6. Perspective ............................................................................................................................238 8. CROMATOGRAFIA DE AFINITATE: APLICAII N BIOFARMACEUTIC ................239 8.1. Introducere ............................................................................................................................239 8.2. Principiile cromatografiei de afinitate...................................................................................240 8.3. Ligandul ................................................................................................................................243 8.4. Matricea de afinitate..............................................................................................................249 8.5. Principii de operare ...............................................................................................................254 8.6. Modele de cromatografie de afinitate ...................................................................................256 8.7. Aplicaiile interaciunilor de afinitate ...................................................................................265 9. IDENTIFICAREA MEDICAMENTELOR PE BAZA REZONANEI MAGNETICE NUCLEARE ................................................................................................................................281 9.1. Introducere ............................................................................................................................281 9.2. Relaia structur-activitate (SAR) prin RMN .......................................................................282 9.3. Monitorizarea moleculelor mici............................................................................................294 9.4. Concluzii ...............................................................................................................................308 10. MARCAREA PROTEINELOR CU IZOTOPII C13 I N15 PENTRU ANALIZA STRUCTURII I DINAMICII MACROMOLECULELOR BIOLOGICE ...............................310 10.1. Introducere ..........................................................................................................................310 10.2. Sisteme de expresie ale ncorporrii in vivo a izotopilor C13 i N15 n proteine..................312 10.3. Marcarea izotopic acelular ..............................................................................................328 11. UTILIZAREA FRAGMENTELOR DE ANTICORPI CA MEDIATORI AI CRISTALIZRII PROTEINELOR MEMBRANARE N VEDEREA DESCOPERII DE NOI MEDICAMENTE ........................................................................................................................344 11.1. Introducere ..........................................................................................................................344 11.2. Cristalizarea proteinelor membranare mediat prin fragmente de anticorp........................348 11.3. Concluzii .............................................................................................................................367 PARTEA IV: ELEMENTE DE CINETIC, METABOLISM I TOXICOLOGIE ALE MEDICAMENTELOR..................................................................................................................368 12. FARMACOGENETICA: EFECTUL VARIANTELOR GENETICE N DISPONIBILITATEA I RSPUNSUL MEDICAMENTELOR..............................................368 12.1. Consideraii generale...........................................................................................................368 5

12.2. Relaii ntre genotip i fenotip.............................................................................................369 12.3. Stabilirea relaiilor ntre genotip i fenotip .........................................................................371 12.4. Fenotiparea versus genotipare i predicia rspunsului individual la medicamente ...........374 12.5. Polimorfismul genetic al enzimelor de metabolizare a medicamentelor (DMEs) ..............376 12.6. Polimorfismul CYP2D6......................................................................................................381 12.7. Polimorfsmul genetic al transportorilor de medicamente ...................................................385 12.8. Gena de rezisten multipl la medicamente (MDR) marker versus polimorfismul funcional .....................................................................................................................................385 12.9. Polimorfismul genetic al intelor medicamentelor..............................................................387 12.10. Concluzii ...........................................................................................................................391 13. FARMACOGENOMICA BIODISPONIBILITII I ELIMINRII MEDICAMENTELOR ................................................................................................................393 13.1. Introducere ..........................................................................................................................393 13.2 Contribuia metabolismului la clearance-ul medicamentelor ..............................................394 13.3. Transportorii medicamentelor: Glicoproteina P (P-gp) ......................................................404 13.4. Concluzii .............................................................................................................................408 14. TOXICOGENOMICA: INTEGRAREA NOILOR METODE PROPRII BIOLOGIEI MOLECULARE N TOXICOLOGIE .........................................................................................409 14.1. Dezvoltarea toxicologiei .....................................................................................................409 14.2. Genomica funcional: noi tehnologii ale biologiei moleculare .........................................411 14.3. Integrarea tehnologiilor genomice funcionale n toxicologie ............................................423 14.4. Aplicaiile toxicogenomicii n studiul mecanismului hepatotoxicitii indus de bromobenzen................................................................................................................................428 14.5. Concluzii .............................................................................................................................430 15. IMPORTANA POLIMORFISMULUI GENETIC I A INTERACIUNILOR MEDICAMENTOASE N TRATAMENTUL DURERII........................................................431 15.1. Introducere ..........................................................................................................................431 15.2. Polimorfismul genetic:efectele asupra diferitelor analgezice .............................................434 15.3. P-gp:un alt exemplu al variabilitii genetice .....................................................................448 15.4. Fenotipaj i genotipaj: perspective......................................................................................450 15.5. Concluzii .............................................................................................................................453 BIBLIOGRAFIE............................................................................................................................ 454

6

CUVNT NAINTEProgresul uria nregistrat de biologia molecular de-a lungul ultimelor decenii a condus la dezvoltarea a numeroase metode de cercetare inovatoare cu impact implicit asupra descoperirii i dezvoltrii de noi ageni farmacologici. Tehnicile moderne de identificare i validare a unor molecule inte pe de o parte i descoperirea i ulterior descrierea de noi medicamente i mecanisme de aciune pe de cealalt parte necesit un spectru extrem de larg de metode i tehnici care depete cu mult repertoriul metodologiilor clasice . Descrierea molecular detaliat a interaciunii medicament - molecul int este la fel de important i solicitant ca i cunoaterea interaciunii medicament ntregul sistem fiziologic. Acum ne sunt la ndemn conceptele i informaiile despre transportul medicamentelor, metabolismul i stabilitatea acestora. De asemenea, putem s prezicem i s determinm modalitatea de reacie a ntregului sistem la administrarea unui medicament, chiar dac se tie c acest medicament ar aciona doar la nivelul unei inte specifice. Metodele i conceptele moderne care fac obiectul farmacogenomicii i toxicogenomicii au demonstrat clar acest principiu. Lucrarea are patru pri: (1) Caracterizarea molecular a interaciunii medicament-int (2) Sinteza medicamentelor pe baza enzimelor i acizilor nucleici , (3) Metode analitice implicate implicate n producerea i utilizarea medicamentelor i n final, (4) Cinetic, metabolism, toxicologie i dezvoltarea agenilor farmacologici. Cel dinti capitol al primei pri prezint contextul biologic oferind o descriere la zi a testelor celulare care ne sunt la ndemn, aplicabilitatea i impactul lor asupra descoperirii agenilor farmacologici. Se analizeaz testele implicate n studiul proteinelor membranare, a rspunsurilor celulare rapide, testrile pentru cercetarea expresiei proteice i genice celulare , analiza spaio-temporal i a subpopulaiilor celulare i nu n ultimul rnd determinarea fenotipului. n capitolul doi al primei pri, se descriu elemente referitoare la oareci "knock-out" (oareci transgenici obinui prin recombinare omolog, cu modificri genetice care pot conduce la eliminarea funciei unei gene) i la tehnicile necesare generrii unor asemenea animale. Receptorii cuplai cu proteina G fac obiectul capitolelor trei i patru. n primul dintre ele accentul este pus pe caracterizarea receptorilor cuplai cu proteina G i aplicabilitatea genelor "reporter" ca sisteme de transcriere, n timp ce capitolul urmtor fcnd referire la etapa postgenomic ofer strategii de identificare a liganzilor pentru receptorii "orfani" cuplai cu proteina G. 7

Partea a-IIa a crii se ocup de diferite aspecte ale sintezei medicamentelor.Se ofer o combinaie clasic ntre elemente de sintez organic i biotehnologie realiznd tabloul sintezei stereoselective a medicamentelor cu ajutorul enzimelor recombinante. Prima parte a acestui capitol ne prezint o imagine de ansamblu asupra acestor elemente i ofer numeroase exemple evalund rezultatele unor asemenea strategii. n perspectiv vor fi utilizai ageni farmacologici care interacioneaz cu acizii nucleici . Atractivitatea lor ca i liganzi cu specificitate mare a intrat mereu n conflict cu numeroase probleme de farmacocinetic. Cu toate acestea, numeroase concepte cu privire la stabilizarea acestor molecule, potenialul fascinant de a interaciona cu ARN-ul (RNAi) au fcut ca primele medicamente aprobate s fie extrem de similare acestor molecule, spre exemplu manipulatorii semnalizrii celulare. Capitolul 6 discut mai multe aspecte, incluznd sinteza i aplicabilitatea unor asemenea tipuri de compui, incluznd tehnica interaciunii cu ARN (RNAi). Partea a-IIIa se ocup de aspecte analitice. Separarea enantiomerilor (enantiosepararea) medicamentelor chirale i cromatografia de afinitate sunt instrumente importante ale dezvoltrii medicamentelor i elementele lmuritoare asupra acestor aspecte sunt prezentate n capitolele 7 i 8. Metode analitice bazate pe tehnici de biologie molecular sunt incluse ntr-o serie de trei capitole. Dou dintre acestea se axeaz pe descrierea tehnicilor RMN care au cunoscut o dezvoltare deosebit n ultimele decenii. Aceast dezvoltare a condus ulterior la definirea tehnicii RMN ca un instrument de baz n determinarea att a structurilor macromoleculare dar i a detectrii i caracterizrii interaciunilor dintre ligand i molecula int. Capitolele 9 i 10 analizeaz aplicabilitatea tehnicii RMN n descoperirea agenilor farmacologici i descrie tehnici de marcare a proteinelor cu izotopi radioactivi de C13 i N15. Realizarea unor modele de structuri medicamentoase realiste are la baz cunotine exacte obinute prin cristalografie cu raze X. n ciuda, mbuntirilor evidente pe care le-a suferit metodologia n acest domeniu de cercetare, structurile receptorilor membranari, care reprezint de fapt intele cele mai importante ale medicamentelor, sunt nc neelucidate. Un pas uria ctre rezolvarea acestei enigme l-ar putea constitui utilizarea fragmentelor de anticorpi drept elemente de potenare ale cristalizrii. Detalii despre aceast nou i captivant tehnic sunt oferite cititorului n capitolul final al prii a-IIIa . Farmacogenomica i toxicogenomica sunt domenii noi cu un considerabil impact asupra viitoarei dezvoltri a agenilor farmacologici. Ultima parte a crii se ocup de aceste subiecte noi, care vor reui probabil cu timpul s genereze schimbri, renunndu-se la concepiile iniiale "aceeai doz este recomandat pentru toi pacienii care au aceeai boal". Direciile moderne se vor baza pe ideea "medicamentul adecvat, doza adecvat, persoana adecvat".

8

Pe de o parte, medicamentele vor aciona de manier mai intit i vor antrena mai puine efecte nedorite, iar eficacitatea lor va crete.Pe de alt parte, medicii vor fi n msur s decid plecnd de la profilul genetic al pacientului, dac un tratament are anse s reueasc i dac nu s opteze pentru un alt tratament. Riscurile personale ascunse n genele unui anumit pacient vor putea fi identificate de ctre medic i innd cont de specificitatea i individualitatea lor se va alege strategia pentru prevenie i tratament.Totalitatea medicamentelor cunoscute sunt dirijate asupra 400 de biomolecule diferite ale organismului nostru ,molecule cunoscute sub numele de inte terapeutice (drug targets) dintre care menionm:enzime,receptori,i alte biomolecule care sunt inhibate sau asupra crora acioneaz ntr-o manier sau alta. Datorit decriptajului genomului uman se vor descoperi ntre 3000 -10000 de biomolecule noi care vor fi utilzate ca situsuri de atac molecular. Terapia genic este o cale nou de cercetare ,care suscit un foarte mare interes. Ea i propune s vindece sau s atenueze efectul unei maladii reparnd o gen defect sau activnd sute de gene utile.Strategia introduce n celulele umane(cu excepia celulelor sexuale sau gamei) o gen corectoare sau terapeutic destinat s reduc defectele genei afectate, n cazul maladiilor genetice ,sau s acioneze ntr-un alt mod , de exemplu s ajute sistemul imunitar s elimine cancerul.n aceste cazuri se acioneaz asupra genomului pentru ca organismul s produc o protein de interes terapeutic , ceea ce presupune implicarea ADNului ca medicament. Dei sunt puine maladii care pot fi tratate pe baza terapiei genice aceast strategie ne d numeroase sperane, chiar dac ea nu poate fi utilizat curent avnd n vedere dificultile pe care trebuie s le depeasc.

9

PARTEA I: CARACTERIZAREA MOLECULAR A INTERACIUNILOR MEDICAMENT-INTCAPITOLUL 1 TESTELE CELULARE: UTILIZAREA I IMPACTUL LOR N DESCOPERIREA MEDICAMENTELOR 1.1. Introducere1.1.1.Testele/experimentele celulare Experimentele bazate pe studiul celulelor permit studierea funciilor preparatelor farmaceutice sau a intelor bolilor n cadrul unui mediu complex i al contextului biologic de ansamblu. Aplicarea noilor tehnologii n biologia molecular, mpreun cu introducerea noilor metode de analiz a mutat cadrul experimentelor celulare de la nivelul fenotipic cum ar fi, proliferarea celular, moartea celular, respiraia i diferenierea funcional, ctre analizele celulare ale funciilor moleculelor semnal - specifice i ale componentelor metabolice. n momentul de fa, experimentele celulare presupun msurtori mecanice, asociate intelor specifice, care permit identificarea componenilor chimici cu funcie specific intei sau funcie modulatoare asociat. Se poate aadar afirma c analizele celulare vor juca un rol din ce n ce mai important n descoperirea medicamentelor, n special a componentelor pentru validarea i optimizarea intei, precum i n selecia modulatorilor cu molecule mici i n opimizarea modulrii. n contrast cu testele biochimice ale substanelor chimice pentru modularea activitii intelor moleculare, sistemele celulare pot oferi informaii adiionale cu privire la transportul, metabolismul i stabilitatea medicamentelor. Cel mai important aspect este acela c10

intele farmacologice rmn n mediul lor natural atunci cnd este analizat modularea , astfel ca datele s aib o valoare predictiv nalt (Fig 1.1). Cu toate acestea, mai trebuie spus c, pentru a utiliza experimentele celulare, celulele trebuie scoase din mediul lor natural i crescute n culturi. Acest lucru va conduce inevitabil la alterri ale repertoriului genelor i ale expresiei proteice i deci ale fenotipului. Celulele utilizate n astfel de experimente trebuie deci s fie caracterizate din punctul de vedere al funciilor reelelor intracelulare, rspunsului la stimuli externi - cel puin pentru calea de semnalizare de interes - i comparate cu rspunsul i evenimentele ce au loc la nivelul esutului sau organului. n multe cazuri, acest lucru nu este nc pe deplin realizabil.

Fig. 1.1 Selecia intelor farmaceutice. Numrul mare al intelor farmaceutice poteniale necesit un proces eficient de selectare a acelor inte pentru modularea cilor i fenotipurilor relevante pentru anumite afeciuni. Experimentele celulare, care sunt strns legate cu intele de interes, permit calificarea modulatorilor cu molecul mic identificai n experimentele celulare sau biochimice de nalt capacitate, n conformitate cu funcionalitatea ntr-un mediu fiziologic relevant. Experimentele celulare care nu sunt strns legate cu inta vor indica efectele sistemice ale componenilor i pot fi interpretate ca i clasificare celular de siguran. Testele celulare pot fi utilizate pentru prioritizarea intelor i a componenilor.

1.1.2. Impactul asupra descoperii medicamentelor n timpul descoperii i dezvoltrii medicamentelor, multe elemente sunt pierdute datorit efectelor nedorite sau toxicitii i lipsei eficacitii dorite. O mare11

parte din aceste efecte pot fi determinate de interaciunile potenialelor medicamente cu alte inte dect cele considerate iniial ca modulatoare ale unei afeciuni. Sistemele de teste celulare au potenialul de a elucida multitudinea interaciunilor medicamentoase i deci de a contribui la o mai bun nelegere a aciunii i selectrii medicamentelor. Celula, prin structura i funciile sale, este organizat n cascade metabolice i de transducie a semnalului. Majoritatea acestor cascade sunt complexe i non-lineare [Stephaopoulos, Kelleher, 2001]. n plus, diferitele cascade comunic unele cu altele, formnd circuite i domenii intracelulare. Majoritatea bolilor nu pot fi explicate prin afectarea unei singure etape a unei ci, de semnalizare, ci prin multiple alterri care afecteaz reelele ntr-o manier complex [Hanahan, Weinberg 2000, Somogyi, Greller 2001]. Similar, medicamentele, fie c interacioneaz specific cu o singur int sau cu mai multe molecule, vor perturba cascadele metabolice i de semnalizare, ntr-un mod complex. n plus, din moment ce multe tipuri de celule utilizeaz aceleai molecule pentru semnalizare n contexte diferite, multe tipuri celulare pot fi afectate n grade diferite de acelai medicament. Introducerea recent a evalurii expresiei genice i proteice pe baza unor sisteme de analiz de mare capacitate, ca i a analizelor metaboliilor [Glassbrook i colab. 2000, Raamsdonk i colab. 2000] permit o mai bun nelegere a gradului i localizrii interferenelor. Experimentele celulare ofer astfel o soluie pentru studierea modulrii unei inte farmacologice n reeaua sa natural complex precum i a potenialelor efecte asupra altor reele. Bolile umane sunt caracterizate prin una sau mai multe alterri ale cilor metabolice i de semnalizare implicate major n meninerea homeostaziei celulare i diferenierea funcional. Testele celulare pot oferi o reprezentare a acestor alterri i devin astfel modele funcionale relevante pentru evaluarea aciunii medicamentelor. n zilele noastre, experimentele celulare ofer oportunitatea de a identifica punctele de interferen care conduc la alterri fenotipice sau modificri finale. Frecvent, multiple nivele de intervenie sunt necesare pentru a altera efectele unor reele biologice. Reguli similare se pot aplica pentru numrul de inte terapeutice care trebuie modulate, n special pentru maladii complexe. intele potrivite i combinaiile12

medicamentoase pot fi selectate numai n cazul n care fiecare component individual al unei ci particulare poate fi studiat individual, acest lucru fiind posibil prin utilizarea sistemelor celulare. Combinaia componentelor care duc la efectul dorit poate fi identificat prin analiza mai multor parametri. Mai mult, aceste analize pot facilita aprecierea efectului componentelor individuale asupra mai multor ci. Aceasta permite o estimare a efectelor nedorite (profilul de siguran), dar poate conduce de asemenea la identificarea unor aplicaii n noile condiii. n acest fel testele realizeaz o selecie rapid a componentelor chimice cu variate profile. Ierarhic, citirea spaio-temporal va genera o bun cunoatere a mecanismelor de aciune a medicamentelor i va permite prezicerea efectelor sistemice (Fig 1.2). Dezvoltarea i aplicarea mijloacelor computerizate i a modelelor cilor intracelulare sunt o condiie obligatorie pentru sigurana evalurii i a interpretrii [Gifford, 2002, Karp, 2001]. nelegerea nivelelor sistemelor este posibil numai prin urmrirea rezultatelor experimentale la nivel celular sau sub-celular.

Fig. 1.2. Circuitul celular schematic i conceptul analizei sistemelor celulare. Celulele se conecteaz cu mediul nconjurator printr-o varietate de receptori, canale i transportori. Semnalizarea intracelular ,cile i reelele metabolice reacioneaz la stimulii intra- i extracelulari ntr-o manier dependent spaio-temporal. Diferitele tipuri de celule reacioneaz diferit la acelai stimul. Diferite tipuri de celule ale esuturilor normale i patologice sau celule manipulate genetic pot fi expuse la stimuli diferii n prezena i n absena medicamentelor i reaciile celulare pot fi 13

evaluate. Analizele multiparametrice identific compuii cu efecte asupra homeostaziei celulei care pot fi specifice intei, nelegate de int, reversibile sau ireversibile.

1.1.3. Clasificarea testelor celulare Testele celulare au avantajul c nu necesit purificarea intelor farmacologice. Totui, n multe cazuri, testele celulare necesit manipularea celular pentru a permite citirea specific a semnalului. Supraexprimarea receptorilor de suprafa celular sau a proteinelor intracelulare pot avea efecte substaniale asupra fiziologiei celulei i trebuie luate n considerare atunci cnd se utilizeaz aceste teste pentru descoperirea noilor medicamente. Reaciile precoce ale hormonilor, factorilor de cretere i neurotransmitorilor sunt deseori mediate prin intermediul mesagerilor secunzi sau influxului i efluxului rapid de ioni. Modificrile proteinelor posttranslaionale i translocaia proteinelor sunt urmtoarele etape care altereaz statusul fiziologic al unei celule. Asemenea modificri sunt capabile s conduc la modificri rapide ale cilor metabolice, precum i la alterri ale activitii genelor i expresiei proteice, ducnd n final la noi fenotipuri celulare, ce includ proliferarea i moartea celular. Testele celulare pot fi clasificate n funcie de evenimentele temporale care apar atunci cnd o celul este expus la alterri ale mediului extra- i intracelular (Tabelul 1.1). Rspunsurile rapide indicatoare de modificri ale concentraiilor ionilor sau mesagerilor secunzi conduc n final la modificari funcionale i fenotipice. Unele dintre evenimentele celulare pot fi refcute n aa numitele sisteme model, care pot fi mai uor de manevrat i manipulat genetic fa de celulele mamiferelor. Drojdiile s-au dovedit a fi organismele cel mai frecvent utizate n aceste sisteme, deoarece semnalele metabolice i interaciunile protein-protein sunt relevante pentru transducia semnalului, putnd fi traduse ntr-un rspuns al creterii uor msurabil [White, 1996, Ito i colab., 2001]. Cteva modificri ale dublului sistem hibrid al drojdiilor s-au dovedit utile n identificarea compuilor care interfer funcional cu mecanismele intracelulare specifice. Tucker i Fields (2001) au descris un sistem senzor pentru descoperirea medicamentelor bazat pe activarea conformaional, dup legarea medicamentului, sau a unei enzime implicate major n14

proliferare. Cu toate acestea, comparativ cu celulele mamiferelor, drojdiile prezint unele diferene care includ prezena peretelui celular, lipsa genelor pentru complementul total al mamiferelor i alterri ale sistemelor metabolice.Tabelul 1.1 Clasificarea tipurilor de reacii celulare funcionale Mesageri secunzi i canale nivelele Ca2+ canale ionice transportori nucleotide ciclice Dinamica proteinelor modificari posttranslaionale (fosforilarea) translocaiile proteice Expresia genic tehnologiile pe chip-uri tehnologia ADN ramificat senzori oligonucleotidici Expresia proteic tehnologia genelor reporter reacia ELISA array-uri ale proteinelor pe chip-uri Profilul metaboliilor profilul analitic cantitativ Rspunsurile metabolice i proliferarea celular, citotoxicitatea, fenotipice moartea celular/ apoptoza, acidifierea diferenierea celular

1.1.4.

Progrese

ale

mijloacelor

i

tehnologiilor

pentru

profilul

componentelor celulare Perfecionarea sistemelor analitice [Straub i colab., 2001] i a sistemelor de citire permite cercettorilor s obin aspecte clare ale alterrilor expresiilor genice i proteice [Celis i colab., 2000], precum i a metaboliilor [Glassbrook i colab., 2000, Nicholson i colab., 2002]. n afara situaiei n care este necesar o analiz pe scar larg, tehnologiile curente permit obinerea unor rezultate convenabile pentru profilul medicamentelor. Pentru studiile expresiei genice, experimentele care utilizeaz sonde fluorescente pot substitui sistemele bazate pe cipuri cel puin pentru unele cazuri bine selecionate [Broach, Thorner, 1996; Goetz i colab, 2000]. Actual sunt disponibile cteva sisteme de imagistic celular sau microscopie de mare capacitate i scanare laser, precum i dezvoltarea unor noi markeri fluoresceni i anticorpi specifici. Aceste combinaii permit studiul traficului proteinelor n celule. Studiile dinamicii i interaciunii proteinelor a fost facilitat de identificarea proteinelor florescente [Raamdonk i colab., 2000, Remington, 2002;15

Schaufele, 2001] i a altor colorani fluoresceni [Mitchell, 2001], mpreun cu aplicaiile fluorescenei cu transfer de energie prin rezonan (fluorescence resonance energy transfer - FRET). Alte tehnologii, precum spectroscopia cuplat multipolar (multipole coupling spectroscopy - MCS) [Hefti, Kumar, 1999] i biochip-urile pentru monitorizarea celular multiparametric [Baumann, 1999] sunt pe cale de a fi utilizabile. Sistemul FLIPRTM (Cititorul de plci fluorometrice; Molecular Devices, Sunnyvale, CA) utilizat pentru studiul rspunsurilor rapide ale mesagerilor secundari, precum eliberarea Ca2+, a fost recent mbuntit pentru a permite analiza canalelor ionice. Aplicaiile FLIPR sunt discutate n detaliu mai jos. n seciunile urmtoare, vom descrie n detaliu un set selectat de aplicaii. Discuiile sunt grupate, pe baza tabelului 1.1, n rspunsuri rapide sau sistemele mesagerilor secundari, alterri ale expresiei genice sau proteice, alterri metabolice, precum i efectele asupra fenotipului [Dingerman i colab.,2004].

1.2. Proteinele membranare i rspunsurile celulare rapideO varietate de proteine membranare au fost exprimate n diferite celule eucariote (linii celulare ale mamiferelor, celule ale insectelor, drojdii) cu ajutorul tehnologiei ADN recombinant, pentru a studia receptorii de suprafa celular, canalele ionice sau proteinele de transport. 1.2.1 Receptorii Receptorii de suprafa celular mediaz semnalizarea celular de la suprafaa celular la citoplasm i/sau nucleu prin intermediul a dou procese majore, semnalizarea prin intermediul receptorilor legai la enzime sau a proteinelor de legare a GTP (proteinele G). Receptorii legai la enzime includ receptorii guanilat ciclazici, receptorii tirozin-kinazici, receptorii asociai tirozin kinazei, receptorii tirozin fosfatazici i receptorii serin/treonin kinazici [Schlessinger, 1993]. n toate cazurile, n urma activrii este iniiat o cascad de evenimente care afecteaz statusul receptorilor i concentraia uneia sau mai multor molecule mici de semnalizare16

intracelulare. n cele ce urmeaz, vom discuta monitorizarea semnalelor mediate de proteinele G, care sunt activate de receptorii cuplai cu proteina G n urma legrii unui ligand specific. Consecutiv stimularii au loc modificari ale AMPc intracelular sau concentraiei Ca2+. Aceste dou molecule semnal specifice sunt implicate n procesele reglatoare ale sistemelor cardiovascular i nervos, mecanismelor imune, diferenierii i creterii celulare i metabolismului. Ambii mesageri acioneaz ca efectori alosterici pe proteine int specifice ale celulei, incluznd kinazele (protein kinaza A i C), lipazele (fosfolipaza C), proteinele de legare a Ca2+ (calmodulina) i canale ionice (receptori glutamat ionotropici). Concentraiile citoplasmatice ale mesagerilor secundari sunt reglate prin intermediul enzimelor membranei plasmatice n cazul cii AMPc enzima adenilat ciclaza produce direct AMPc, iar n cazul cii Ca2+ lipazele sunt stimulate s produc mesagerul solubil inozitol trifosfatul (IP3) care induce eliberarea Ca2+ din reticulul endoplasmic. n unele cazuri canalele ionice sunt activate prin interaciunea direct cu subunitile proteinei G [Cruce M, 2000]. n prezent au fost realizate diferite tehnologii pentru monitorizarea intracelular a mesagerilor secundari n celule. Detectarea Ca2+ este n general bazat pe indicatorii fluoresceni, care au proprietatea de a penetra cu uurin membranele celulare i a-i altera emisia fluorescent n urma legrii Ca2+. Pentru msurtorile unui rspuns rapid i tranzitor, reacia de legare a Ca2+ trebuie s fie reversibil, oferind date cinetice importante care permit diferenierea unui semnal tranzitor tipic datorat activrii specifice a receptorului de un semnal nespecific care afecteaz homeostazia Ca2+ i permeabilitatea membranar. n mod curent se utilizeaz numeroase sisteme, diferite, pentru a detecta AMPc n testele celulare. n cele mai multe cazuri celulele sunt lizate n urma expunerii la un ligand specific, iar cantitatea de AMPc este determinat printr-o imunoreacie competitiv (Perkinelmer Life Sciences, Boston, Ma; Molecular Devices; Biomol Research Laboratories, Plymouth Meeting, Ca) sau printr-o reacie enzimatic competitiv de complementare (Discoverx, Fremont, Ca). Tipic, receptorii cuplai cu proteina G sunt supraexprimai n liniile celulelor eucariote pentru a monitoriza concentraia mesagerilor secundari n urma stimulrii17

cu un ligand specific [Sullivan i colab., 1999]. n multe cazuri, co-exprimarea unei subuniti corespunztoare sau a proteinelor G himerice este necesar pentru a obine un semnal suficient pentru detecie [Milligan, Rees, 1999]. 1.2.1.1 Tehnologia FLIPR pentru detecia eliberrii Ca2+ intracelular Sistemul FLIPR permite citiri repetate pentru sistemele de analiz de mare capacitate n reaciile celulare. Pe scurt, celulele sunt ncrcate cu un indicator fluorescent (ex. Fluo-4 AM pentru Ca2+) care arat un spectru de absorbie compatibil cu o excitaie la 488 nm de la o surs laser argon mergnd pn la o emisie maxim la 516 nm n prezena Ca2+. Emisia fluorescent este indus simultan n toate situsurile unei plci cu 96 sau 384 de situsuri, iar cinetica eliberrii Ca2+ intracelular, declanat de expunerea la un ligand specific, poate fi monitorizat la o rat de maxim 60 de ori pe minut. Sistemul FLIPR distinge rapid agonitii complei, agonitii pariali i antagonitii pentru a accelera screening-ul primar i secundar. Figura 1.3(a) ilustreaz un experiment tipic efectuat pe o linie de celular de mamifer transfectat cu un vector ce conine gena GPCR. Componentele pozitive reprezentate n figura 1.3(b) au fost verificate prin msurtori n duplicat, iar modulatorii cu molecul mic au fost ulterior testai pentru relaia doz-rspuns prin experimente EC50/IC50.

18

Antagonist

Fig 1.3. Determinarea Ca2+ intracelular prin sistemul FLIPR. Fig 1.3.(a) Curb a cineticii Ca2+ tipice, precum i parametrii utilizai pentru calcularea semnalului fluorescent maxim. n acest exemplu maximele au fost msurate nainte i dup adiia ligandului (Max 1 si Max 2) i au fost standardizate prin diviziune la minima masurat nainte de adugarea compusului (Min). Media controalelor pozitive a fost stabilit control 100%, iar media controalelor negative a fost stabilit control 0%. Pentru fiecare godeu, au fost calculate activitile relative n funcie de controale. Fig 1.3 (b) Diagram a fluxului pentru un experiment tipic. Celulele modificate genetic care au inta GPCR supraexprimat au fost adugate n plci cu 384 de godeuri peste noapte. Celulele au fost splate cu soluie tampon nainte de adaugarea soluiei tampon ce coninea colorantul Fluo-4 AM, urmat de o incubare de 45 de minute. Dup o etap adiional de splare, plcile au fost transferate n aparatul FLIPR i au fost adugai compuii chimici, urmai de adiia ligandului. Emisia fluorescenei a fost monitorizat ncepnd de la un moment anterior adiiei compusului i continuat pn cnd s-a observat o descompunere substanial a semnalului. n graficele mrite sunt prezentate exemple de agonist i antagonist. 19

1.2.1.2. Tehnica reaciilor competitive n detecia AMPc intracelular Cele mai multe experimente utilizate pentru detecia AMPc intracelular sunt bazate pe anticorpi monoclonali care recunosc specific AMPc. Clasic, lizatele celulare sunt amestecate cu AMPc biotinilat exogen pentru a forma un heterotrimer cu un anticorp specific i streptavidina. Formarea acestui complex este n competiie cu AMPc endogen nebiotinilat. Streptavidina i anticorpii se pot lega covalent la un fluorofor donor i acceptor (criptat de europiu i aloficocianina), formnd o pereche FRET interactiv dup formarea complexului. Un semnal sczut este observat atunci cnd este crescut producia de AMPc intracelular, datorit competiiei pentru legarea la anticorpul specific. Tehnologia AlphaScreenTM (PerkinElmer Life Sciences) este o tehnologie alternativ care permite detecia cantitativ a unei game variate de componente celulare, inclusiv AMPc. AlphaScreen are la baz utilizarea unor particule donor i acceptor care sunt acoperite cu un strat de hidrogel care ofer grupri funcionale pentru bioconjugare. Cnd particulele sunt aduse una lng alta, este iniiat o cascad de reacii chimice pentru a produce un semnal nalt amplificat. nainte de excitarea laser, un fotosensibilizator din particula donoare convertete oxigenul ambiental la starea excitat de singlet. Moleculele de oxigen n starea de singlet difuzeaz pentru a reaciona cu chemiluminiscentul de la nivelul particulei acceptoare, ceea ce activeaz fluoroforii coninui n aceeai particul. AlphaScreen a fost utilizat n testele funcionale ale GPCR pentru detecia produciei endogene de AMPc. n toate sistemele menionate mai sus, celulele sunt supuse lizei nainte de realizarea msurtorilor, adugnd nu numai un pas suplimentar procedurii, dar, mai important, fcnd imposibile msurtorile cinetice deoarece datele pot fi obinute numai la final. n plus, au fost dezvoltate metode FRET care au la baz studiul celulei ca ntreg pentru studiul dinamicii temporale i spaiale a nucleotidelor ciclice (vezi 1.4.4).

20

1.2.1.3. Tehnologia Complementrii Fragmentelor Enzimatice (EFC) EFC are la baz organisme modificate genetic ce conin dou fragmente legate de o reacie enzimatic, de exemplu acceptorul enzimei (EA) i donorul enzimei (ED). Fragmentele separate sunt inactive i numai formarea spontan de heterodimeri duce la forma enzimatic activ [Zabin, 1982]. Tehnologia HitHunterTM (DiscoveRx) este bazat pe o variant modificat a enzimei -galactozidaza care formeaz perechea EA/ED. Aceast tehnologie a fost adaptat pentru utilizarea n multe reacii n care sunt implicate: kinaza, receptorul progesteronic, receptorul estrogenic i AMPc. n acest capitol vom discuta numai despre aplicaia specific pentru detecia intracelular a AMPc. Pe scurt, este utilizat un conjugat peptidic ED-AMPc din care AMPc este recunoscut de un anticorp specific. n absena anticorpului specific, fragmentul ED este capabil s complementeze EA pentru a forma un complex activ. n aceast reacie, anticorpul AMPc este titrat pentru inhibiia complet a formrii enzimei. Expunerea lizatului celular la o anumit cantitate de anticorp permite formarea complexului anticorp-AMPc, reducnd astfel cantitatea liber de anticorp. Ca urmare, adugarea de conjugat ED n urmatoarea etap a reaciei va conduce la scderea formrii complexului anticorp-ED, promovnd astfel complementarea enzimei active. ED-conjugat liber din reacie este proporional cu concentraia AMPc intracelular, acelai principiu putnd fi aplicat pentru msurarea activitii galactozidazei. 1.2.2. Proteine de transport membranar O mare varietate de substane sunt transportate n interiorul organismelor complexe, n unele cazuri prin intermediul transportului pasiv, prin difuziune facilitat datorat gradientului de concentraie sczut, sau prin intermediul cilor paracelulare sau transcelulare. Absorbia i distribuia multor constitueni alimentari precum ionii, monozaharidele, aminoacizii i nucleotidele sunt mediate/facilitate de proteine specifice de transport membranar, care formeaz canale prin membranele celulare. Mecanisme similare sunt necesare pentru ndeprtarea activ a xenobioticelor, produilor de metabolism din esuturi. Aceste proteine specifice de21

transport carrier sunt divizate n dou clase, transportori uniport (sisteme uniport), respectiv transportori cuplai (sisteme de transport cuplat), primii transportnd un singur tip de molecul de pe o fa pe alta a membranei, iar transportorii cuplai transfer o molecul n funcie de transportul simultan sau secvenial al celei de-a doua [Ardelean, Tripa, 2001]. Sistemele de transport cuplat sunt la rndul lor divizate n transportori simport, care transport simultan moleculele n aceeai direcie i transportori antiport, care transport moleculele n direcii opuse. Unii transportori specifici acioneaz ntr-o manier pasiv, transfernd moleculele n funcie de gradientul de concentraie; acesta este cazul multor nutrieni precum glucoza, gsit n concentraii mari n spaiul extracelular. O situaie similar este reprezentat de canalele ionice cu poart comandat de ligand sau de voltaj din sistemul nervos, care elibereaz ionii dup stimularea de ctre neurotransmitori, respectiv depolarizarea membranar. n schimb, transportorii activi sunt dependeni de hidroliza ATP-ului i ei transfer moleculele mpotriva gradientului de concentraie. Cel mai bine cunoscut i variat grup de proteine de transport activ l constituie super-familia de transportori ABC (caset legat la ATP) [Dean i colab., 2001]. Au fost descrise peste 50 de transportori ABC, substraturile transportate fiind foarte variate: aminoacizi, monozaharide, ioni anorganici, polizaharide, peptide i chiar proteine mari. Unul dintre cei mai studiai transportori ABC, proteina de rezisten la mai multe medicamente - MDR1 (multi-drug resistance) [Brinkmann, Eichelbaum, 2001], a fost n centrul ateniei multor eforturi de descoperire a medicamentelor n ultimii ani deoarece supraexpresia acestei proteine n celulele canceroase umane poate determina rezistena simultan a acestor celule la o varietate de chimioterapice din clase diferite. Alte procese importante n care se implic transportorii ABC includ rezistena la clorochin n malarie, prezentarea peptidelor antigenice celulelor imune n maladia genetic fibroza chistic [Hwang i colab., 2001].

22

1.2.2.1. Canalele ionice Majoritatea celulelor menin un potenial electric de o parte i de alta a membranei,care este cel mai bine studiat la nivelul neuronilor i celulelor musculare al cror potenial atinge o valoare nalt de aproximativ -70mV. Potenialul membranar este meninut de pompa de sodiu i potasiu (Na+, K+ - ATPaza) care funcioneaz ca o pomp antiport de transport activ ce scoate din celula 3 ioni de Na+ i introduce 2 ioni de K+ pentru fiecare molecula de ATP hidrolizat, crend astfel o ncrctur negativ n interiorul celulei [Ardelean, Tripa, 2001]. Proteinele canal formeaz pori hidrofili care traverseaz bistratul lipidic, permind anumitor ioni s treac de pe o parte pe cealalt a membranei datorit gradientului de concentraie. O caracteristic a canalelor ionice este prezena unui mecanism cu poart care controleaz micarea ionilor. n acest capitol vom insista asupra canalelor ionice exprimate n neuroni i celulele musculare, care au astfel un rol important n semnalizarea neuronal i contracia muscular. Schimbrile potenialului membranar pot fi induse ntr-o manier limitat spaial, prin intermediul canalelor de Na+ cu poart comandate de ligand n acest caz neurotransmitorul. Deschiderea ulterioar a canalelor de Na+ comandate de voltaj induce autopropagarea depolarizrii de-a lungul membranei celulare (potenialul de aciune), inducnd n final deschiderea canalelor de Ca2+ cu poart comandate de voltaj de la nivelul sinapsei. Influxul de Ca2+ induce eliberarea neurotransmitorilor n fanta sinaptic, propagnd semnalul n celula post-sinaptic. Funcionarea deficitar a canalelor ionice st la baza multor afeciuni incluznd afeciuni musculare i cardiace, epilepsia, migrena, depresia i ataxia. Deschiderea canalelor ionice este n cele mai multe cazuri monitorizat prin msurarea modificrilor potenialului membranar. Standardul de aur utilizat n acest scop este tehnologia patch clamp, care ofer o sensibilitate foarte nalt, rezoluie temporal bun, precum i msurarea conductanei unui singur canal la un voltaj precis. Aceast tehnologie ofer cele mai bune informaii pentru evaluarea funcional a canalelor ionice; dezavantajele majore ale acestei tehnici includ participarea operatorilor experimentai, experimente laborioase i rezultate puine. n23

prezent, diferite companii sunt implicate n dezvoltarea noilor echipamente pentru automatizarea procedurilor patch-clamp. Unul dintre cele mai avansate echipamente este staia IonWorksTM (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) care utilizeaz tehnicile de fluidic integrat pentru poziionarea automat a unei singure celule n godeurile unui suport special. nregistrri ale unui singur canal ionic au fost obinute la o rat de pn la 2000 de reacii pe zi. Rezultate mai bune sunt obinute prin utilizarea coloranilor solvatocromatici pentru care celulele sunt permeabile, precum DiBAC (Molecular Probes, Eugene, OR) sau prin utilizarea colorantului recent descoperit FMP (Molecular Devices). Asocierea cu sistemul FLIPR permite monitorizarea funciei canalelor ionice prin sisteme de analiz de mare capacitate, depind numrul de 30000 de compui analizai pe zi. Detalii cu privire la alte tehnologii de analiz a canalelor ionice au fost descrise de Xu i colab., ( 2001). Tehnologia FLIPR i analiza canalelor ionice. Pentru identificarea compuilor care moduleaz activitatea canalelor ionice este imperativ disponibilitatea evalurilor rapide i economice ale activitilor biologice prin analize de mare capacitate. Una din metodele bazate pe fluorescen care testeaz modificrile potenialului membranar utilizeaz o sond fluorescent poteniometrica acid bis-(1,3-dibutilbarbituric) trimetin oxonol [DiBAC4(3)], care separ compartimentele intracelulare i extracelulare n funcie de potenialul electric de o parte i de alta a membranei. n urma depolarizrii celulei, colorantul ptrunde n celul, iar legarea la situsurile hidrofobe intracelulare se traduce ntr-o cretere a intensitii semnalului fluorescent. Invers, hiperpolarizarea membranei declaneaz eliminarea colorantului din celul i scderea fluorescenei deoarece cuantumul produciei DiBAC4(3) este sczut n mediu apos. Deoarece separarea DiBAC4(3) este un proces lent, aceasta tehnologie nu este aplicabil pentru evaluarea canalelor cu o cinetic rapid la nivelul porii sau cu desensibilizare rapid. mbuntiri substaniale au fost obtinue odat cu descoperirea colorantului FMP [Baxter i colab., 2002] care are o cinetic de separare mai rapid. Figura 1.4 prezint un experiment tipic condus cu miotuburi difereniate (linia celular C2C12).24

Fig 1.4 Activitatea canalelor ionice n miotuburi difereniate. Linia celular de celule musculare murine C2C12 a fost utilizat pentru validarea colorantului FMP. Celulele C2C12 au fost adugate n plci i difereniate n miotuburi prin expunerea la ser de cal. Celulele C2C12 difereniate exprim nAchR, iar depolarizarea celulelor poate fi indus cu un agonist specific pentru receptor, precum carbacol. Exemple de agonist i antagonist sunt reprezentate n graficele mrite.

Biblioteca LOPAC (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) a compuilor farmacologici activi a fost supus screening-ului pentru identificarea compuilor care exercit efecte agoniste sau antagoniste asupra receptorului nicotinic al acetilcolinei (nAChR). Pe scurt, celulele au fost splate cu o soluie tampon i ncrcate cu colorant FMP timp de 30 de minute la temperatura camerei. 644 de compui din libraria LOPAC au fost adaugai n FLIPR, urmai de stimularea cu carbacol.25

n contrast cu semnalizarea tipic prin intermediul Ca2+, depolarizarea membranar nu prezint o cinetic tranzitorie. Evaluarea datelor i identificarea modulatorilor poate fi efectuat dup modelul descris n figura 1.3. Identificarea agonitilor i antagonitilor este posibil ntr-un singur experiment. Compuii pozitivi au fost supui determinrii EC50/IC50 i, n cazul agonitilor, antagonistul specific al AChR - pancuronium a fost utilizat pentru a evidenia reversul semnalului carbacol (vezi Fig. 1.4). Iniial, 21 de compui au fost identificai ca agoniti, iar 12 compui au avut specificitate pentru AChR. Tehnologia VIPRTM (Voltage Ion Probe Reader) i analiza canalelor ionice Tehnologia VIPR (electrod folosit la msurtori de potenial ntre mediul intern i extern al unei celule) (Aurora Bioscience, San Diego, CA) este bazat pe FRET i utilizeaz dou molecule fluorescente. Prima molecul, oxonol este un ion hidrofob, nalt fluorescent, ncrcat negativ, care poate fi rapid redistribuit ntre dou situsuri de legatur pe cele dou fee ale membranei plasmatice ca rspuns la modificrile potenialului membranar. Cea de-a doua molecul fluorescent, lipidul coumarina se leag specific pe o fa a membranei plasmatice i funcioneaz c un donor FRET pentru molecula acceptoare de oxonol sensibil la voltaj. Cnd molecula de oxonol ajunge la nivelul situsului intracelular al membranei plasmatice n urma depolarizrii, FRET este sczut, ceea ce se traduce n creterea fluorescenei donorului i descreterea emisiei oxonolului. Aceast tehnologie permite dezvoltatea cercetrilor n domeniul biologiei canalelor ionice. Tehnologia VIPR poate furniza cadre de citire subsecvene real-time n urma reaciilor efectuate n microplci. 1.2.2.2. Proteinele MDR MDR (proteina rezistent la medicamente) este n principal legat de supraexpresia proteinelor superfamiliei de transportori ABC. Cel mai studiat membru al acestei superfamilii este produsul genei MDR1 (glicoproteina P) care este exprimat n intestin, rinichi, ficat, bariera hemato-encefalic i n multe celule tumorale. n ultimul caz, supraexpresia genei MDR1 este unul din factorii principali ai rezistenei celulelor la chimioterapia cancerului. Aceast rezisten este rezultatul26

pomprii medicamentelor anticanceroase n exteriorul celulelor, rezultnd scderea nivelelor intracelulare ale acestora. Moleculele mici, capabile s reversibilizeze efluxul pot restaura sensibilitatea la medicamente a celulelor tumorale rezistente. Cele mai utilizate metode pentru identificarea inhibitorilor pompei MDR sunt bazate pe substraturile fluorescente ale glicoproteinei P, precum Hoechst 33342, rodamina 123 i rodamina 6G. Celulele sunt ncrcate cu substratul, iar colorantul extracelular este ndeprtat prin splarea cu detergeni anterior lizei [Sarver i colab., 2002]. Msurtorile emisiei fluorescenei ofer rezultate cantitative, proporionale cu acumularea intracelular a substratului. Expunerea celulelor la inhibitorii pompei MDR va reduce efluxul substratului i deci va determina nregistrarea unui semnal fluorescent crescut. Aceste reacii nu sunt omogene i implic etape de splare dup ncrcarea celulelor cu colorantul corespunzator. Un nou substrat pentru pompa MDR a fost dezvoltat recent pentru realizarea unor reacii omogene ntr-un sistem FLIPR. Tehnica FLIPR pentru Multirezistena la Medicamente (FLIPR Multidrug Resistance Assay) (Molecular Devices) este o aplicaie omogen care necesit numai 15 minute de incubare la temperatura camerei cu un colorant proprietar, care este transportat de ctre produsul genei MDR1 i el i modific proprietile fluorescente numai n urma aciunii enzimelor intracelulare asupra sa. Aceasta permite performana reaciilor cinetice asupra celulelor vii pentru screening-ul inhibitorilor pompei MDR. Eliminarea etapelor de splare i controlul temperaturii a determinat automatizarea reaciei [Sarver i colab., 2002].

1.3. Evaluarea expresiei genelor i proteinelor n cadrul unor sisteme de analiz de mare capacitateProfilul expresiei genelor i proteinelor poate fi aplicat n descoperirea medicamentelor cu cel puin dou scopuri diferite. Prima aplicaie este pentru descoperirea noilor medicamente poteniale. n acest caz, inta de interes o constituie fie o component a sistemului de expresie, fie monitorizarea expresiei ca indicator pentru inta din amonte ce reflect rspunsul celular cuplat [Broach, Thorner, 1996].27

Pentru a face un screening de mare capacitate (HTS) posibil, secvenele promotoare de interes, care sunt cuplate cu evenimentele celulare din amonte, sunt legate la aa-numitele gene reporter, care servesc ca indicatori pentru activarea transcripiei i translaiei. Cea de-a doua aplicaie este utilizarea profilului expresiei pentru a obine informaii asupra specificitii la nivel celular a unui medicament candidat sau pentru identificarea unor markeri surogat pentru aciunea medicamentelor. n acest caz, ar trebui investigat expresia genic sau proteic a ct mai multor gene sau proteine ca rspuns la un potenial medicament candidat. Modelele de expresie pot fi utilizate ca un indicator pentru numrul interaciunilor dintr-o celul. Asemenea date pot fi relevante pentru nelegerea impactului modulrii unei singure inte terapeutice asupra ntregului sistem celular. Chip-uri de expresie genic au fost introduse recent pentru msurarea simultan a sute de gene exprimate la nivelul ARNm [Epstein, Butow, 2000]. Utilitatea acestei abordri, a fost recent validat la drojdii; n acest caz profilurile expresiilor au identificat ci ale unor mutaii necaracterizate anterior sau au identificat noi poteniale inte terapeutice. Similar, au fost introduse chip-uri pentru caracterizarea expresiei proteice pentru a captura o fraciune particular a proteinelor i a permite analiza cu o cantitate rezonabil de prob [Weinberger i colab, 2002]. n plus, tehnicile de proteomic au fost introduse de Celis i colab., (2000). Analiza a mii de probe devine o condiie obligatorie dac profilurile de expresie sunt utilizate n identificarea unui modulator. Selecia modulatorilor cu molecule mici i optimizarea modulrii vor necesita analize de mare capacitate care s fie la nivelul a sute sau mii de componente. Ambele pot fi obinute prin focalizarea asupra unor gene indicatoare selectate sau a produilor lor, indicatori mai degrab ai intei de interes dect ai profilului complet al expresiei. n seciunea urmtoare ne vom axa pe exemple care pot fi aplicate n descoperirea iniial a medicamentelor. Chip-urile pentru expresia genic [Epstein, Butow, 2000; Weinberger i colab, 2002] i tehnologiile de proteomic sunt subiectul multor recenzii recente.28

1.3.1. Analiza genelor reporter pentru identificarea modulrii compuilor biologici activi Factorii de transcripie pot fi clasificai att n funcie de natura structural, ct i n funcie de modul n care rspund pentru modularea transduciei semnalului. O astfel de clasificare, esenial pentru tehnologiile ce implic genele reporter, aparine lui Brivanlou i Darnell (2002). Conform acestei clasificri, factorii de transcripie pot fi grupai n dou mari clase aceia care sunt activai constituional i cei a cror activitate este reglat ntr-o manier spaio-temporal, cantitativ i calitativ. Din clasa factorilor de transcripie reglai face parte clasa factorilor de transcripie dependeni de semnal, care sunt activai n urma unui semnal intracelular sau extracelular. Genele reglate prin intermediul acestor factori de transcripie dependeni de semnal sunt atractive ca gene reporter deoarece cupleaz cile de semnalizare cu rspunsul transcripional. Semnalele extracelulare, n urma interaciunii cu moleculele receptoare corespunztoare de pe suprafaa celulei, iniiaz o cascad de evenimente intracelulare care conduc la alterri ale expresiei unui set de gene. Una sau cteva dintre aceste gene pot fi utilizate ca indicatori pentru modularea intelor n cadrul unor ci de semnalizare specifice. Activarea unei anumite gene poate fi uor identificat prin ataarea la gena de interes a unei aa-numite gene reporter. Pentru acest scop, trebuie create plasmide care conin promotorul sau regiunea reglatoare a genei de interes lng gena reporter. Aceste plasmide sunt apoi introduse ntr-o linie celular care exprim calea de interes ce conine intele farmacologice i cupleaz indicatorul reporter cu calea particular de interes. Un numr de gene au fost descrise ca fiind gene reporter [Broach, Thorner, 1996]. Expresia poate fi monitorizat prin intermediul fluorescenei, de exemplu prin utilizarea unei proteine fluorescente verzi (GFP) ca reporter sau prin detecia cu anticorpi marcai fluorescent. Alternativ, este utilizat activitatea enzimatic a reporterului, aa cum se ntmpl n cazul luciferazei care convertete substratul ntr-un produs luminescent, sau reporterul este detectat cu ajutorul fluorescenei, luminescenei sau reaciilor colorate ale produilor secundari.

29

Tehnologia ce implic utilizarea genelor reporter a fost utilizat pe scar larg pentru a realiza HTS pentru o varietate de inte de interes n descoperirea medicamentelor. Pentru multe inte, precum receptorii transmembranari pentru care alte metode de screening erau dificil de realizat, tehnologia genelor reporter a devenit metoda cea mai bun pentru identificarea modulrii compuilor biologici/ farmacocinetici activi (lead finding). Exemplele selectate includ utilizarea reaciilor ce implic genele reporter n identificarea agonitilor i antagonitilor pentru o mare varietate de GPCR [Goetz i colab., 2000] transfectai ntr-o linie de celule ovariene de hamster (CHO) cu un construct al reporterului luciferazei 6xCRE. Aceast linie celular a servit ca un indicator pentru GPCR, precum receptorul pentru melanocortina-1 care n urma stimulrii moduleaz nivelele de AMPc n celul. Aceasta reacie poate fi realizat ntr-o plac cu 384 godeuri, oferind astfel economii substaniale de timp, cost i realizare a culturilor celulare. n aceeai linie celular a fost stabilit un sistem HTS pentru receptorul metabotropic al glutamatului mGluR7. Receptorul mGluR7 este cuplat negativ cu adenilat/adenilil ciclaza i stimularea sa duce la scderea nivelelor de AMPc. Celulele CHO au fost transfectate stabil cu ADNc pentru mGluR7 de la obolan i o gen reporter care rspunde la AMPc. Aplicabilitatea pentru HTS a fost demonstrat ntr-o linie n care nivelele de AMPc induse de forskolina (un activator al adenilat ciclazei) au fost reduse semnificativ de ctre agonitii receptorilor. Xing i colab. (2000) au descris o metod direct pentru investigarea receptorilor cuplai negativ cu adenilat ciclaza. Linia celular CHO transfectat stabil a coninut trei plasmide distincte: (i) o proteina himeric Gq/i care redirecioneaz semnalul Gi negativ ntr-un semnal Gq pozitiv; (ii) un GPCR cuplat cu Gi, n acest caz receptorul -opioid sau receptorul pentru 5-hidroxitriptamina i, (iii) reporterul 3xNFAT -lactamazei. Astfel, activarea GPCR cuplat cu Gi s-a translatat ntr-o activare NFAT prin intermediul cii de semnalizare mediata de Gq, permind monitorizarea expresiei -lactamazei ntr-un format HTS. O mare varietate de linii celulare diferite au fost utilizate pentru a stabili reaciile genelor reporter. Celule din rinichiul embrionar uman (HEK) 293-EBNA crescute n culturi celulare n suspensie au fost utilizate pentru expresia receptorilor30

prostanoizi cuplai cu un reporter CRE-SEAP (fosfataza alcalin secretat de placenta uman). Celulele ECV304, o linie celular transformat spontan, derivat din celule endoteliale ale venei ombilicale umane, au fost transfectate cu un reporter ICAM-1 pentru screening-ul componenilor care inhib expresia ICAM-1 n urma stimulrii cu interleukina IL-1b. Linia celular provenit din celule de cancer mamar uman MDAMB-453 a fost utilizat ca gazd a transfeciei pentru a stabili reporterii stabili sub controlul promotorului virusului tumorii mamare la oarece (MMTV) pentru a studia agonitii receptorilor androgeni i glucocorticoizi. Celulele MDA-MB exprim att receptorii glucocorticoizi ct i receptorii androgeni, servind astfel ca o celul gazd ideal pentru reporterii construii. Ca un exemplu practic, datele obinute cu ajutorul reaciilor care implic genele reporter n condiiile HTS, sunt prezentate n figura 1.5 i tabelul 1.2. Celulele transfectate stabil cu gena reporter a luciferazei au fost aplicate ntr-o plac cu 384 de godeuri i dozate cu diluii seriate ale unui compus care activeaz promotorul genei reporter. Dup o incubare de 24 de ore, celulele au fost splate, lizate i a fost adugat substratul luciferazei (LucLite2; PerkinElmer Life Sciences). Cantitatea exprimat de proteina luciferaz s-a corelat direct cu cantitatea de substrat metabolizat ntr-un compus luminiscent, care a fost detectat cu ajutorul unui cititor de plci luminometric (TopCount2 NXT; PerkinElmer Life Sciences). Datele prezentate au oferit informaii asupra concentraiei minime a compusului de referin pozitiv necesar ca standard pe fiecare plac pentru HTS a 100000 de compui. Pentru a obine rezultate de calitate pentru fiecare plac individual n timpul HTS, este calculat un criteriu numit factor Z (diferena dintre mediile semnalului de fond i godeurile de control pozitiv) i deviaia standard (SD) a godeurilor de control pentru fiecare plac. Din moment ce factorul Z ia n considerare att intensitatea semnalului, ct i variaia intrinsec, el ofer o msur a stabilitii unei reacii. Screening-ul este considerat posibil dac 00,3 pentru dextrometorfan. Fenotipul UM este definit prin urmtoarele raporturi metabolice: