Biofizica Lucrari Practice

122
UNIVERSITATEA "OVIDIUS" CONSTANŢA FACULTATEA DE MEDICINĂ GENERALA LUCRĂRI PRACTICE BIOFIZICĂ MEDICALĂ Teren Ovidiu Petcu Lucian Cristian Vasile Monica -2009-

Transcript of Biofizica Lucrari Practice

UNIVERSITATEA "OVIDIUS" CONSTANA FACULTATEA DE MEDICIN GENERALA LUCRRI PRACTICE BIOFIZIC MEDICAL Teren Ovidiu Petcu Lucian Cristian Vasile Monica -2009- Ovidius University Press, 2009 2 Facultatea de Medicin Disciplina Biofizic Aleea Universitatii nr. 2 Constana Romania Tel/Fax: 0241-605000 Copyright2004Toate drepturile sunt rezervate Editurii Universitii Constana Ovidius University Press Lucrri Practice de Biofizic Medical 3 PREFA CarteadeLucrriPracticedeBiofizicMedicalseadreseaz studenilor Facultii de Medicin General din cadrul Universitii Ovidius Constana. Coninutullucrrilordelaboratorafostadaptatcerinelor programeloranaliticealefacultiictilaperformanaaparaturii existente n dotarea laboratorului. Tematicalucrrilorpracticeestenstrnslegturcu problemele teoretice predate la cursul debiofizic i este orientat spreadezvoltaabilitilestudentuluideautilizaaparaturade laborator, a analiza i interpreta rezultatele obinute. Lucrareaafostastfelconceputnctstransmitatt cunotineleteoreticenecesarepentrunelegerealucrrilor prezentate,ctidescriereatehnicilordelucruiaprincipiuluide funcionare a aparaturii ntlnite n mod curent n acest domeniu. Spermcnacestmodlucrareavafinacelaitimpun material de lucru ct i un material de documentare. Forma actual a crii de lucrri practice a fost ntocmit de colectivul Disciplinei deBiofizic,alCatedreideFiziologieNormaliPatologicdin cadrul Facultii de Medicin General, Constana. AutoriiOvidius University Press, 2009 4 Lucrri Practice de Biofizic Medical 5 CUPRINS Prelucrarea matematic a datelor experimentale7 Microscopia de transmisie microscopia de reflexie17 Tehnici speciale de microscopie22 Cromatografie i electroforez31 Sedimentare i centrifugare42 Spectrofotometria de absorbie n UV-VIS49 Poteniale de aciune57 Fenomene de transport65 Determinarea coeficientului de vscozitate a lichidelor73 Determinarea coeficientului de tensiune superficial a lichidelor79 Determinarea densitii lichidelor86 Determinarea concentraiei unor soluii prin indice de refracie91 Determinarea concentraiei substanelor optic active98 Telecobaltoterapia105 Bibliografie selectiv122 Ovidius University Press, 2009 6 Lucrri Practice de Biofizic Medical 7 Prelucrarea matematic a datelor experimentale I. Noiuni teoretice A. Indicatori de tendin central Indicatoriidetendincentralsuntvaloricelocalizeazntr-un feloarecaremijloculsetuluidedate.Dintreindicatoriidetendin central menionm: Modul - valoarea care apare cel mai frecvent. Un set de date poate fi non-modal (dac toate valorile posibile au aceeaifrecven),mono-modal(osingurvaloaremaximal),multi-modal (cu mai multe valori ce apar cu aceeai frcven maximal). Mijlocul-mediaaritmeticavalorilorextremealesetuluide date. Mediana-valoareacempartesetuldedatendougrupeegal populate. PentrusetuldedateS={X1,...,Xn},ordonatcresctor,cnd n=2k+1 (numr impar de date), mediana este Me=Xk+1. n cazul aceluiai set dar pentru n=2k (numr par de date), mediana este: 2X XM1 k ke++=Media-celemaifolositesunt:mediaaritmetic(Xma), geometric (XG), armonic (XH) i cuadratic (XQ). Se poate arta uor c aceste medii se afl n relaia: Q ma G HX X X X s s sOvidius University Press, 2009 8 B. Indicatori de poziie Indicatorii de poziie sunt folosii pentru localizarea unui anumit subgrupdedatenrelaiecurestuleantionului.Senumesco-cuantile aceiindicatoricemparteantionulnpriegalpopulate.Celemai utilizatesunt:cvartila(qk),decilaipercentila(pk),valoricempart datele n pri coninnd o ptrime, o zecime, sau o sutime din elemente.SconsidermunsetdedateordonatcresctorundeLeste valoarea cea mai mic din set iar H valoarea cea mai mare. Percentiladeordinulpkestevaloareanumericpentrucarek% dindatesunt maimici dect pk iar (100-k)% sunt mai mari. Se observ c p50 = q2. C. Indicatori de mprtiere (dispersie) Indicatoriidemprtieredescriuvariabilitateadatelor.Datele grupatestrnsauvalorimicipentruindicatoriidedispersie,ntimpce datele mprtiate au valori mari. Principaliiindicatoridemprtieresunt:domeniul,variana, deviaia i momentele. Domeniul reprezint intervalul de valori al datelor. A=[Xmin, Xmax] Uneori se indic lrgimea domeniului (amplitudinea mprtierii): Lucrri Practice de Biofizic Medical 9 Ax= Xmax - Xmin Toatedeviaiilemediifadeunindicatordetendincentral (media aritmetic, geometric, cuadratic, armonic sau modul, mediana, notate generic prin ) se definesc n acelai fel, ca medii ale diferenei ntre valoarea msurat i indicatorul respectiv. Maigeneralestemomentulcentratdeordinq,mq(x)fade media x. n continuare vom analiza semnificaia i utilitatea unora dintre momentele centrate: -m1(x)=0,momentulcentratdeordinul1,nuaducenicio informaie,ntructiavaloareazerooricarearfidistribuiadatelor;din aceast cauz nu este folosit. -m2(x)se numetevarian(V);rdcinaptrata varianei se numetedeviaieptratic,notatcuo.Ambelemrimiarat mprtierea datelor. Oricerezultatexperimentaltrebuieprezentatprinmedia aritmetic deviaia. Intervalul (-o, +o) se numete interval de ncredere sau confiden.ntructnbiologieimedicinsuntngeneralpuinedatede procesat, trebuie s se nlocuiasc variana V cu variana standard SV i deviaia on cu deviaie standard on-1 sau SD (se utilizeaz indicatorii standard on-1 i SV cnd na de particul se numete plan hidrodinamic de alunecare, iar potenialul n acest plan senumetepotenialelectrocinetic().Valoareapotenialuluielectro-cineticsepoatedeterminaindirectpebazamsurriimobilittii electroforetice a particulei n cmp electric. Figura4.3.Foreleceacioneazasuprauneiparticulencrcatecusarcinelectric suspendat ntr-un mediu lichid. Distribuia ionilor n stratul dublu electric de la suprafaa unei particule scufundate ntr-un electrolit. Ovidius University Press, 2009 36 Metodamicroscopicdeelectroforez-acestmetodeste singuratehnicdisponibilpentrudeterminareavitezeielectroforeticea particulelor mari, cum ar fi celulele sanguine,microorganisme,particule coloidale,etc.Sebazeaz peobservareadirect, lamicroscop amigrrii particulelorsuspendatentr-osoluietamponadecvatcaurmarea aplicrii unui cmp electric creat de un curent continuu.Pentruaceasttehnicestenecesarocelulelectroforetic (figura 4.4), prevzut cu doi electrozi, un sistem de umplere i golire, ce se poateintroducen cmpulunuimicroscop.Celula poatefi plansau cilindric (capilar). Figura 4.4. Electroforeza microscopic: cuva electroforetic folosit i imagineaobservat la microscop prevzut cu micrometru ocular. ElectroforezalajoastensiuneEsteometodcepermite separareaproteinelorplasmatice.Dispozitivulexperimentalfolositeste prezentat n figura 4.5.Casuportalelectrolitului(alsoluieitampon)sefoloseteatt hrtie special pentru electroforez (de tip Whatman) ct i membrane de celuloz. Dintre avantajele utilizrii membranelor de celuloz amintim, n primul rnd: rezoluia mult mai bun i un timp de migrare mai mic. Lucrri Practice de Biofizic Medical 37 Figura 4.5. Electroforeza la joas tensiune dispozitiv experimental. Dupseparareaproteinelorurmeazunprocedeudefixarei colorare.nprimulrnd,mediulsuportestefixatprinintroduceren etanol,metanolsauacid,oriprinnclzirefcndastfelproteinele insolubile.Benzilesuntcoloratecuajutorulunorcoloranispecifici proteinelor(albastrudebromfenol),sespalnmaimultebicuacid acetic2%isunttrecuteprinvaporideamoniacpentruregenerarea colorantului (figura 4.6). Figura 4.6. Electroforeza mediul suport dup procedeele de fixare i colorare. Dupacesteprocedeebenzilesuntscanatecuajutorulunor densitometreprinreflexie,transmisiesaucombinate,cepermittrasarea spectrelor caracteristice probelor oferind totodat cantitatea n g/100ml.Ovidius University Press, 2009 38 Electroforezapeunmediusuportacetatdecelulozaserului uman este prezentat n figura 4.7. Figura 4.7. Electroforeza pe un mediu suport acetat de celuloz a serului uman. Este cunoscut faptul c scderea albuminelor survine de regul n toatedisproteinemiile,fiindnsmaiaccentuatncazulunuideficitn aportuldeproteine,ndeficituldesintez(cirozhepatic),saun pierderi de proteine (sindrom nefrotic, arsuri). Creterea 1, 2 globulinelor se nsoete de regul de o cretere afibrinogenuluiiaglicoproteinelorideoaccelerareaVSH-ului.O cretere marcat a 2 globulinelor se ntlnete n sindromul nefrotic. Modificrileglobulinelorauoimportanmairedus,dar cretereaglobulinelorindicprezenaunorinflamaiicronice,sau sugereaz o proliferare reactiv sau tumoral a imunocitelor productoare deimunoglobuline.Scdereaglobulinelorsurvinensindromul nefrotic, malnutriie.Toate aceste modificri au ca rezultat forme diferite ale spectrlor electroforegramelor analizate (figura 4.8). Lucrri Practice de Biofizic Medical 39 Figura4.8.Tipuridedisproteinemie:(A)Inflamaieacut,(B)Inflamaiecronic,(C) Sindromnefrotic,(D)Enteropatieexudativ,(E)Cirozhepatic,(F)Mielommultiplu, (G) Hipogamaglobulinemie. Focalizareaizoelectrica(electrofocusing)-reprezintometod deseparareaparticulelorcupuncteizoelectricediferitentr-ungradient de pH sub aciunea unui cmp electric omogen.Punctulizoelectricaluneiparticule(saumolecule)corespunde valorii pH-ului la care sarcina electrica net este nul.Dispozitiveledeelectrofocusingfolosescocoloanancarese realizeazungradientnaturaldepHprinutilizareaunoramfolii transportoricuurmtoareleproprieti:buncapacitatedetamponarei bunconductivitatelapunctulizoelectric,masmolecularmic, solubilitatebunlapunctulizoelectric,absorbiemicaluminiipeste 260nm, nu reacioneaz chimic cu componenii amestecului ce urmeaz a fi descompus.Cei mai utilizai sunt acizii poliaminopolicarboxilici avnd masa molecular ntre 300-1000D i puncte izoelectrice situate n domeniul de pH=3-10. Ovidius University Press, 2009 40 II. Parte experimental A. Separarea clorofilelor prin cromatografie pe hrtie Materialenecesare:hrtiedecromatografie,vasdecroma-tografie,micropipete,benzen,eteretilic,ciclohexan,alcooletilic98%, ap distilat, stativ, mojar. Mod de lucru: Semojareazctevafrunzentr-o soluiede80% alcool etilic i 20% ap dup care se las ntr-un loc ntunecat 30 min. Se traseazfoartefincucreionulliniadestartpehrtieicuajutorulunei micropipetesepunspoturiledesubstana(ocantitatede0.1-1lavnd grij ca aceasta s nu se ntind).Sepregtetentr-unpaharBerzeliuseluentulformatdin50% eter etilic, 40% ciclohexan, 8% benzen i 2% ap, se agit bine i apoi se toarn n vasul de cromatografie astfel nct s acopere fundul vasului cu cel mult 2-3mm.Seintroducehrtiadecromatografiefixatnstativ1mmn lichid.Seacopervasuliseateapt45mindupcaresetrecela identificareacomponentelorilacalculultimpilordereinerepentru fiecare component. B. Determinarea vitezei electroforetice a eritrocitelor Materialenecesare:cuvdeelectroforez,microscopBiorom, suspensiedeeritrocite,sursdetensiune,soluieizotonic,micrometru ocular, cronometru. Mod de lucru: Se conecteaz cuva de electroforeza la microscop iseumplecusoluieizotonicdupcareseateapt1-5minpn Lucrri Practice de Biofizic Medical 41 eritrocitele difuzeaz n toat cuva. Se pune la punct imaginea astfel nct sseobservecumicrometrulocularohematie.Seconecteazsursade tensiune i se msoar timpul (t) n care o celul se deplaseaz ntre dou repere ale micrometrului ocular (d). Datele se trec n tabelul de mai jos. No.t(s) v (m/s)vmed(m/s)on-1 1 .... Figura 4.9. Imaginea observat prin micrometrul ocular(dup aplicarea cmpului electric hematiile se afl n miscare cu vitez v) Deoarecedistana(d)vzutpemicrometruloculariparcurs decelulelenmicareestendiviziuni,trebuiecaaceastasfie transformat nmicroni(m)pentru a puteafi calculat valoarea vitezei de deplasare. 100g1d Dob =m tDv =sm S se calculeze intervalul de confiden i s se compare valorile obinute cu cele din literatur. ) v , v ( v1 n med 1 n med o + o esm Ovidius University Press, 2009 42 Sedimentarea si centrifugarea I. Noiuni teoretice 1. Sedimentarea Sedimentarea-Esteotehnicdesepararecesebazeazpe diferenadedensitatedintrecomponenteleamestecului.npractica medical se utilizeaz nu numai ca tehnic de separare dar i ca o metoda de analiz (VSH - viteza de sedimentare a sngelui). Pentruonelegeremaibunaprocesuluisepoatemodela comportarea unei hematii n cmp gravitaional. SconsideramosuspensiedeparticulesfericederazRi densitate aflate ntr-un lichid de densitate 0 ( 0). v R 6 g R34g R3403 3 q t + t = t ( )102g R92vq = (1) Considernd tLv = undeLestespaiulparcursnmicare rectilinie i uniform iar t timpul de sedimentare, obinem: ( )101 2g R L29t q =Dupcumseconstatdinrelaia(1)vitezadesedimentare depindeattdemrimeaparticulelor(R)ctideinteraciuneaacestora cu lichidul n care se afl, prin coeficientul de vscozitate q.Sedimentareapoatefidecifolositnunumaicatehnicde separareaunorparticuledeinteresdaricametoddecercetaren vederea obinerii unor informaii legate de aceste particule. Demareimportanclinicestedeterminareavitezeide sedimentareaeritrocitelor.ntabelulurmtorsuntprezentatevalorile normale obinute prin metoda Westergreen. Ovidius University Press, 2009 44 Subiect1 ora2 ore barbat2 - 8mm5 - 18mm femeie4 - 10mm6 - 20mm nou - nascut1 - 2mm- sugar5 - 10mm- copil mic7 - 12mm- 2. Centrifugarea Centrifugarea - reprezint o tehnic de separare a componentelor unui amestec cu densiti diferite sub influena unui cmp centrifugal. Deoarecevitezadesedimentarepentruparticuledemrimea hematiilor, sau mai mici, este deosebit de sczut, este necesar o metod carescreascforaactiv(greutateancazulsedimentarii).Astfel,n cazul centrifugrii, rolul forei de greutate l joac fora centrifug. Figura 5.2. Forele ce acioneaz asupra unei particule de raza R i densitate aflat ntr-un lichid de densitate 0 ( > 0). x R316a m F2 3 3c cf v t = =Neglijndforadegreutateiconsiderndcmigrareaducela creterea razei traiectoriei circulare, avem urmtoarele relaii: cf v aF F F = +Lucrri Practice de Biofizic Medical 45 dtdxR 6 Fv q t =x R316F02 3 3a v t =( )xdxR89dt102 2 2 v t q = Prin integrare obinem timpul necesar separrii:( )if102cxxln ) R (89t v t q = . Ultracentrifugarea-Pentruparticulefoartemicicumarfi proteineleplasmaticesedimentareaprincentrifugareaobinuiteste practicnerealizabildincauzafenomenelordedifuzie.Suntnecesaren acest caz turaii deosebit de mari >15000rot/min.Ultracentrifugelecerealizeazacesteturaiitrebuiesfiebine stabilizatemecanic(pentruaevitafenomenuldebticarearducela rupereaaxului)ibinetermostatate(pentruampiedicadegradarea termic).Cndsistemulestemonodispersapareo limitnetdeseparaie ntre solvent i particulele dispuse la fundul eprubetei.Cndsistemulestepolidispersaparmaimultecmpuriieste necesaroultracentrifugarefracionat.Secentrifugheazperndla fiecareturaiedeinteresiserecolteazsausedimentulsausuper-natantul. Ovidius University Press, 2009 46 II. Parte experimental A. Determinarea vitezei de sedimentare a eritrocitelor(metoda Westergreen) Materiale necesare: -sngevenos,1.6ml,recoltatpeanticoagulantulcitrattrisodic 3.8%, n cantitate de 0.4 ml; -materiale pentru puncie venoas; -eprubete de hemoliz; -hemosedimentrulWestergren,alctuitdintr-unstativmetalic prevzutcupipeteWestergren,deaproximativ300mmlungimei2.53mm diametru. Mod de lucru: -se aspir cu seringa, n condiii sterile, o cantitate de 0.4ml citrat trisodic 3.8%; -sepuncioneazvenapacientuluiiseaspirsngepnla diviziunea de 2ml; -dup omogenizare sngele se pune ntr-o eprubet de hemoliz; -se aspir sngele n pipetele Westergren pn la diviziunea zero; -se fixeaz pipetele n stativ (ntr-o poziie perfect vertical), apoi se noteaz timpul (momentul se start) i numele pacientului. Citirearezultatuluisefacelaoori/sauladouore,valoarea fiind dat de nlimea coloanei de plasm aprut n partea superioar a tubului exprimat n mm, pe unitate de timp. Lucrri Practice de Biofizic Medical 47 B. Centrifugarea sngelui Materiale necesare:- sering i ac pentru puncie venoas - eprubete de hemoliz - stativ - pipete gradate - citrat trisodic 3,8% - balan de echilibrare - ser fiziologic - eprubete de centrifugare Mod de lucru:-serecolteazocantitatede5-6mlsngedupmetodadescris anterior; -se introduce n eprubeta de centrifugare 1ml citrat trisodic 3,8%, 4mlserfiziologici5mlsngedupcareseaseazeprubetapebalana de echilibrare; -peplatanulopusseaseazoeprubetidenticncarese introduce ap distilat pn la echilibrarea balanei; -seaeazceledoueprubetencentrifugnpoziiidiametral opuseunafadealta,senchidecapaculcentrifugiiiseregleazla 2000rotatii/min, dup care se centrifugheaz 2minute; -se scoate eprubeta i se masoar deplasarea frontului eritrocitar, apoi se continu centrifugarea. Ovidius University Press, 2009 48 Probleme: 1._Cunoscndvalorilefiziologicealecoeficientului de vscozitate labrbatB=0,047Kg/msilafemeieF=0,043Kg/ms,densitatea eritrocitului =1095Kg/m3 i a plasmei o=1027Kg/m3 calculai din formula vitezei de sedimentare ct ar trebui s fie raza eritrocitului presupus sferic. 2._Determinaivitezadesedimentareaunorparticuledecret suspendatentr-unlichidirazaacestorparticulepresupusesferice cunoscnd apa=1 g/cm3, apa=1.05 10-3Kg/ms, creta=1,545 g/cm3. 3._Cunoscnd raza particulei de cret determinat anterior, evaluai folosindmodelulmatematicalcentrifugrii,timpuldecentrifugarepentru aceste particule suspendate ntr-un mediu vscos (glicerin). Se cunosc:- =1000rot/min, (500rot/min) - glicerina=13,93 10-3Kg/ms - glicerina=1,26 g/cm3 - ln(x2/x1)=0,143 Verificai experimental rezultatul obinut. Lucrri Practice de Biofizic Medical 49 Spectrofotometria de absorbie n ultraviolet i vizibil I. Noiuni teoreticenaceastlucrarencercmsprezentmaplicaiilespectro-fotometrieinultravioletivizibilpentrusubstanenstarelichid, lichidepure,amestecuriinspecialsoluii.Spectreleurmritesunt spectre moleculere electronice la care structura de rotaie nu mai apare iar cea de vibraie se manifest numai n anumite cazuri printr-o structurare a benzilor de absorbie care, n general, sunt largi i nerezolvate n linii.Benziledeabsorbiedinacestedomeniispectralecorespund tranziiilordepenivelulelectronicfndamentalpecelemaijoasenivele electroniceexcitate,pentrucaretranziiilesuntpermiseconformlegilor de selecie. n aceste condiii tranziiile electronice implic cele mai mari variaiideenergie,iarfrecvenelecuantelorabsorbitesesitueazattn domeniul vizibil ct i de ultraviolet al spectrului.Laacestetranziiielectroniceparticipelectroniiunoranumite grupristructuralealemoleculelornumitecromofori.ncazulsubstan-elor organice asemenea grupri structurale sunt reprezentate de legtura simpl, dubl i tripl, gruparea bazic, etc.Interaciacromoforilorntreeisaucualtegrupriatomice provoacimportantemodificarialespectru1uideabsorbieatribuit cromoforului singur. n aceste condiii pot apare urmtoarele efecte:-efectulbatocromic-dedeplasare amaximului deabsorbie spre lungimi de und mai mari (deplasarea spre rosu), Ovidius University Press, 2009 50 - efectul hipsocromic - de deplasare a maximului de absorbie spre lungimi de und mai mici (deplasarea spre albastru),-efectul hipercromic - de cretere a intensitii de absorbie, -efectul hipocromic - de descretere a intensitii de absorbie.Proprietiledeabsorbiealemediuluipotficaracterizateprin mrimile: absorban, trasmitan, extincie, coeficient de extincie.LegeaBouguer-Lambertexprimrelaiacantitativdintreinten-sitateaI,aluminiiemergente,intensitateaI0,aluminiiincidente, grosimea x a substanei absorbante i natura substanei. Figura 6.1. Reprezentarea grafic a legii Bouguer-Lambert (X1/2 grosimea de njumtire). Expresia legii Bouguer-Lambert se poate scrie:kx0e I ) x ( I=Prin definiie transmitana (T), sau coeficientul de transmisie al unei substane este dat de formula: 100II(%) T0 =iar extincia natural En, este dat de relaia: x kIIlnT1ln En0n= = =Lucrri Practice de Biofizic Medical 51 unde kn reprezint coeficientul natural de extincie. Se poate arta uor c 0sEns. Avantajulfolosiriiextincieiesteacelaalproprietiide aditivitate pe care o are aceast mrime: un amestec de mai multe soluii diluateavndextinciileE1,...,Ensecomportcaosingursoluiecu extincia global E, dat de relaia: n 1E ... E E + + =Prin absorban (A), sau coeficient de absorbie se nelege: 100II I(%) A00=n practic, deoarece logaritmii naturali sunt mai puin comozi se folosete o relaie asemntoare n care intervin, ns logaritmii zecimali: E0kx0e I 10 I I = =undekreprezintcoeficientulzecimaldeextincieiarEextincia zecimal sau densitatea optic. LegeBeerestevalabilnumaipentrusoluiidiluatei stabileteolegturmatematicntreextinciaE,concentraiaCa substaneiicoeficientulmolardeextinciecaredepindedenatura substanei i de lungimea de und. x C ) ( ) x , ( E c = unde C se msoar n mol/dm3. n aceste condiii legea Bouguer-Lambert-Beer se poate scrie: x C ) (010 I ) x , ( I c = Ovidius University Press, 2009 52 Curbele care dau dependen E=f(), T=f(), A=f(), c=f() sau f(v),suntcunoscutesubnumeledespectredeabsorbie.Unexemplude astfel de spectru este reprezentat n figura 6.2. Figura 6.2. Spectrul de absorbie de tipul A=f(). Factorii care pot influena spectrul de absorbie al unei substane: a)naturasolventuluiniveleleenergeticeelectronicealemolecu-lelornstarecondensatpotfimodificateprinprezena moleculelor solventului datorit interaciilor ce apar. b)concentraiasoluieiitemperaturacucretereaconcentraiei aparasocierimolecularecaredauunspectrudistinctdecelal monomeruluisubstaneidestudiat,temperaturafavorizeaz deplasarea echilibrului dintre concentraiile de monomer i dimer iartemperaturileridicatepotproducechiartransformri ireversibile ale spectrelor de absorbie. c)valoareapH-uluisoluieilavaloridiferitedepH,punctul izosbesticaprutnspectruindicprezenanamestecaunor Lucrri Practice de Biofizic Medical 53 specii moleculaare ce se transform una ntr-alta ntr-o proporie depinznd de pH. d)iradiereasubstaneloriradiereaopticaprobeipoateconduce lapolimerizareauneispeciimoleculareideaicimodificrin spectrul de absorbie. e)formareadecomplecicationiiprezeni nsolvent potduce la formarea complecilor i deci influenarea spectrului probei. f)fluorescenadatoritfenomenuluidefluorescen,intensitatea radiaieireemisevaducelaovaloareaparentmaimica absorbiei probei dect cea real. g)fenomene de oxidare h)probele nu sunt dizolvate total sau precipit ulterior i)fenomene de hidroliz Descrierea instalaiei spectrofotometrice Unspectrofotometruconineoparteopticiunaelectric. Componenteledebazalepriiopticesunt:sursa,monocromatorul, compartimentulprobeloridetectorulmpreuncusistemulde nregistrare (figura 6.3). Figura 6.3. Principalele componente ale unui spectrofotometru. Spectrofotometrelesepotclasificaattdupsistemuldispersiv ctidupsistemulconstructiv.Astfel,nfunciedeprimulcriteriu Ovidius University Press, 2009 54 existspectrofotometrecuprism,spectrofotometrecureea,spectro-fotometremixte,iarnfunciedealdoileacriteriuspectrofotometrecumonofascicul i cu dublu fascicul. SpectrofotometrulCamspecM330arecaelementdispersivo reeadedifraciecu1200linii/mmiestedetipulmonofascicul.M330 poate trasa spectre UV-VIS n intervalul de lungimi de und cuprins ntre 190-900nm,cuoacurateede1nm.nabsorbiepoatebaleape intervalul -0.3 la 2.5Abs, iar n transmisie de la 0 la 200%. M330 poate fi accesatfiedirectutilizndtastaturaacestuia,fieprinintermediulunui calculator. II. Parte experimental Trasarea spectrelor de absorbie ale diferitelor tipuri de Hb (A) Pentru obinerea hemoglobinei: -se centrifugheaz sngele uman la 5000 rot/min -se ndeprteaz supernatantul -se suspend celulele roii n tampon izoton 0.9% NaCl.-secentrifugheaz10minla5000rot/min(supernatantultrebuie s fie ct mai limpede)-selizeazglobuleleroiiastfel:seadauglaunvolumde eritrocite 1.5 volume de ap i 0.5 volume cloroform -se ndeprteaz cloroformul-sefolosetesoluiadehemoglobinpentrucitirelaspectro-fotometru. Lucrri Practice de Biofizic Medical 55 (B) Pentru obinerea methemoglobinei (de culoare brun): -setrateazopartedinsoluiadehemoglobincusoluiede fericianur de potasiu 3% (C) Pentru obinerea hemoglobinei reduse: -seadauglasoluiainiialdehemoglobinditionitdesodiun exces pn la observarea culorii violete. Moddelucru:Oposibilitatesimplirapiddetrasareaunui spectru este utilizarea programului n varianta de lucru Immediate mod. Acestmodpermitescanareaprobeintredoulungimideund,mrirea i micorareaunor zone prestabilite, deplasare cursorului n zonele dorite obinndu-se valorile de absorbie i de lungime de und, afiarea datelor subformdetabel,derivatele1-4alespectrului,salvareiprintarea graficului. Primul pas l constituie selectarea tipului de grafic dorit absorbie sautransmisie;acestlucrufcndu-sefoarteuorprinselectareacu ajutorul mouse-lui a butoanelor Abs sau %T. SeselecteazapoiScan,peecranaprndofereastrEnter scanwavelengthspentruselectareaintervaluluidelungimideund. Dup introducerea datelor se apas OK. Se ateapt cteva secunde pn spectofotometruliatingelungimeadeunddestart.Frprobn compartimentulcuvelorsaudepreferatcuocuvconinndnumai solventul n care a fost preparat soluia, se traseaz zeroul prin apsarea butonului Set Zero. Ovidius University Press, 2009 56 Dupobinereazerouluiiprimireamesajuluideconfirmarese trecelatrasareaspectruluipropriu-zisprinapsareabutonuluiStart. Folosind butonul ID se poate face o fi de identitate a probei iar apsnd butonul Disk graficul poate fi salvat pe disk n zona dorit. Butonul Data permitelistareavalorilorobinute,Zoom(+-)mrireimicorareaunor zone prestabilite iar Deriv trasarea derivatelor spectrului. Setraseazspectreledeabsorbiealediferitelor tipuridehemo-globin (A), (B), (C) preparate i se compar cu datele din literatur. Figura 6.4. Spectrele de absorbie ale diferitelor tipuri de hemoglobin. Lucrri Practice de Biofizic Medical 57 Potenialul de aciune I. Noiuni teoretice nstareanormal(numitstarederepaus)membranacelular este polarizat, avnd faa intern mai negativ dect cea extern. n mod uzual se ia faa intern drept referin.Potenialul de membrana, Vm numit potenial de repaus, ia valori de la minus civa milivoli, pentru majoritatea celulelor, pana la 60mV pentruaxo1ema,90mVpentrusarcolemasichiar200mVpentru membranele,celulelordinorganulelectricalpeteluitorpila,Torpedo californicum. Figura7.1prezintceeacesentmplcndaxolemaeste excitatdeun stimul electricdepolarizant. Dacdepolarizareadepeste ovaloarecritic(sauliminar),atuncimembranasedepolarizeazn continuaredinproprieiniiativa(panala0mV)ichiarserepolarizeaz darnsenscontrarpanapela+50mV.Apoipotenialuliniialeste restaurat.Aceastaoscilaiedetensiunedecirca120mVnamplitudinei 1msduratse numetepotenialde aciune.Depolarizarea externeste defaptdoarundeclanator(trigger)alfenomenuluintructenergia rspunsuluispecificalmembraneiprovinedelametabolismulcelulari nu de la stimul.Ovidius University Press, 2009 58 Figura 7.1. Simularea potenialului aciune. Dup potenialul de aciune apar o serie de oscilaii mici i lente, numite postpoteniale (pozitive i negative, n funcie de sensul depirii potenialuluiderepaus).ntimpulpotenialuluideaciune,membrana estecompletinexcitabil(perioadarefractaraabsoluta).Pedurata derulriipostpotenialelor,membranaestemaipuinexcitabildectn modnormal(perioadarefractararelativa).Membranaarenevoiede aproximativzeceduratealepotenialuluideaciune,frniciunstimul pentrua-irefacecompletpotenialulderepausiexcitabilitatea anterioar.Potenialuldeaciunesepropagfardecrement(atenuare)n lungul axonului sub forma aa-numitului impuls nervos. Impulsul nervos satisfacelegeatotul-sau-nimic,ceeacenseamncniciunfelde excitaienusetransmitedacstimululareovaloareinferioarpragului deexcitabilitate,inicio modificareca form,amplitudineiduratnu aparedacstimululestesuperiorpragului.Praguldepindedeampli-Lucrri Practice de Biofizic Medical 59 tudinea, durata, frecvena i forma stimulului. Influena frecvenei devine importantpeste1000Hz,cndexcitabilitateadescreterapiddac frecvenadestimularecrete.Lafrecvenejoase(sub100Hz)nuse observ nici o modificare a potenialului de aciune.Unstimulcuorampamailung,dposibilitateamembraneis seacomodezelaexcitaieisirefac(celpuinparial)starea perturbatdedepolarizare,decisiscadexcitabilitatea.Scurtarea timpului de stabilire a pulsului depolarizant las nemodificat capacitatea dereacieamembranei.nceleceurmeazseconsidernumaipulsuri rectangulare.Pentru astfel de stimuli, caracteristicile de prag, adic intensitatea liminar I (indiferent de natura pulsului: tensiune sau curent electric, oc mecanic,chimic,etc.)idurataliminaltsatisfaclegeaintensitate-durat:tBA ) t ( I + =reprezentat grafic n figura 7.2. Legea este de tip hiperbolic i are dou asimptote: una vertical i una orizontal. Figura 7.2. Legea intensitate-durata pentru un puls rectangular Ovidius University Press, 2009 60 Intensitateaminimaunuistimulrectangularceexcit membrana (avnd o durat infinit) se numete reobaz (notat cu R).R A )tBA (lim) t ( Ilimt t= = + =o o Ceamaimicdurataunuipulsrectangular,cuamplitudinea egalcudublulreobazei,carencexcitmembrana,afostdenumit cronaxie(t).Cronaxiaesteceamaiutilizatmrimencaracterizarea excitabilitii unui esut. Cu ct este mai mic cronaxia, cu att mai mare este excitabilitatea membranei. O membran mai excitabil are nevoie de mai puin energie de stimulare.Cronaxiapoatefideterminatnlocuindvaloareaintensitii I=2A (A=R) n legea intensitate-durat: = t+ = BBR R 2 tR Se poate rescrie acum legea prin nlocuirea constantelor A si B: |.|

\|t+ =t1 R ) t ( IReobaza i cronaxia depind de aciunea unor chimicale: hormoni, toxine,anesteziceetc.,cepotfiutilizatenscopmedical,attn diagnosticctinterapie.Uneoriestenecesarcretereaexcitabilitii, alteori,dincontr,estenevoiesfiesczut.Dinaceastcauzstudiile electrofiziologicealeefectelorunorliganziasuprabioelectrogenezei membranei sunt o practic curent de peste un secol.Lucrri Practice de Biofizic Medical 61 Aufostfcutenumeroasencercrideexplicareapotenialului deaciune.Ceamaiproductivpentruolungperioaddetimp(fapt pentrucareeconsideratclasic)afostTeoriaionic,propusntre 1949-1952 de doi cercettori britanici, laureai ai Premiului Nobel pentru medicin n 1963, Hodgkin i Huxley.Considernd c:-existblocanidiferiipentrucelemaiimportantefluxuriionice active (TTX pentru Na+ i TEA pentru K+),-membranacelularesteundielectric(izolator)cesepardou mediiconductive(citoplasmailichidulinterstiialsunt electrolii),-axonulperfuzatcusoluiesalinizoton,avndaceleai concentraiidesodiu,potasiuiclorcaiaxoplasma,areo comportare electric similar celui integral, deci impulsul nervos este un fenomen de membran,Hodgkin i Huxley au propus modelul electric al membranei prezentat n figura 7.3 i teoria aferenta lui. Figura 7.3. Circuitul echivalent al unei poriuni de membran axonal Ovidius University Press, 2009 62 Citoplasmailichidulinterstiial,mediiconductoare,sunt reprezentateprinrezistorielectriciconectainserie.Membranaeste conceput ca fiind compus din celule electrice independente.Fiecarecelulconineuncondensatoritreiramuripentru transportul selectiv al ionilor: una pentru sodiu, una pentru potasiu, i una de scurgere pentru toi ceilali ioni la un loc.Dincauzagradienilordeactivitatechimicaionilorimplicai ntreceledoufeealemembranei,fiecareramurconineobaterie Nerst,acreiforelectromotoareEesteproporionalculogaritmul raportului activitilor chimice.Conductaneleioniceselectivesuntreprezentatederezistori,a crorrezistenpoatevariadatoritunuipulsdetensiuneamembranei sau/i aciunea unor liganzi. Efectul TTX Adugareadetetrodotoxin,TTX(oneurotoxinputernica extras din ficatul i ovarele unui peste din Marea Japoniei, Sphoeroides rubripes,iuniitritoni),nsoluiadeimersieaaxonului,blocheaz transportul de sodiu i nu are efecte directe notabile asupra transportului de potasiu.Figura 7.4 prezint efectul TTX asupra probabilitilor n, m, h, a conductanelor de sodiu i potasiu, a potenialului de aciune. Toxina are nevoiedecevatimppentruadifuzanstructuriadaefect.Cnd conductana maxim a sodiului scade sub o valoare critic, membrana nu mai rspunde. Lucrri Practice de Biofizic Medical 63 Figura 7.4. Efectul TTX. Figura 7.5. Efectul cesiului asupra bioelectrogenezei membranei. Ovidius University Press, 2009 64 Efectul cesiului Datorit competiiei la legarea de componentele proteice ale membranei cu ceilali cationi monovaleni (n special cu ionii de K+) prezenta cesiului n soluia de imersie afecteaz dinamica probabilitatilor n, m si h i duce la o scdere semnificativ a conductanei superficiale a potasiului i la o foarte mic cretere a conductanei de sodiu. Aceste schimbri modific potenialul de aciune, crescndu-i puin durata dup cum se observa n figura 7.5. II. Parte experimental Utilizndprogramuldesimularedindotarealaboratoruluide biofizicssedeterminevaloareareobazei,acronaxiei,perioadei refractareisseurmareascefecteleTTXiCs.Comentairezultatele obinute. Lucrri Practice de Biofizic Medical 65 Fenomene de transport I. Noiuni teoretice 1. Difuzia Difuziapasivreprezintfenomenuldetransportpasiv,datorat agitatieitermice,aunorparticuledinzoneledeconcentratie,densitate mai ridicate, spre zonele cu valori mai mici ale acestor mrimi, printr-un mediu suport omogen. Fenomenuldedifuziepasivestecelmaiintenslagaze,unde vitezatermicestefoartemareicelmailentncazulsolidelor,unde moleculele (sau ionii) au poziii relativ fixe n spaiu. naintedeaprezentalegiledifuziei,vomfaceuneleprecizrin legatur cu anumii termeni folosii: flux i gradient. Fluxulreprezintcantitateadesubstan,sarcin,energie transportat printr-o suprafa n unitatea de timp. Pringradientsentelegevariaiauneimrimi(concentraie, densitate, potenial electric etc.) ntre dou puncte ale spaiului, raportat la distana dintre cele dou puncte. nacestecondiiidefinimdifuziacacelmaigeneraltipde transportpasiv(spontan),produsdegradientuldeconcentraie(pentru gaze),saudegradientuldeactivatatechimic(pentrumateriaconden-sat). Difuziapasivntr-unmediuomogensesupuneladoulegi, cunoscute sub numele de legile lui Fick: Ovidius University Press, 2009 66 (1)Cantitateadesubstandifuzatprintr-osuprafaE,n unitateadetimpesteproporionalcuariasuprafeei,cugradientulde concentraieidepindedecondiiiledemediu.Factoruldeproporiona-litate se noteaz cu D i reprezint coeficientul de difuzie. dxdcS Ddtdm =m=masadesubstan,S=supraadedifuzie,D=coeficientuldedifuzie, dxdc= gradientul de concentraie, t = timpul. (2)Vitezadevariaieaconcentraieiesteproporionalcu variaia spatial a gradientului de concentratie. |.|

\|cccc =cc =xcxDxcDdtdc22 Reprezentaregraficavariaiei deconcentratiecu distana (ntr-unsolvent)oferoimagineagradientuluisubformauneipantede-a lungul creia "coboar" solvitul. Figura 8.1. Reprezentarea schematic i grafic a dependenei concentraiei unui solvit (molecule difuzante) care se injecteaz n partea stng a unui solvent (faza omogen). Lucrri Practice de Biofizic Medical 67 Transportuldesubstanprindifuzieconducelamodificarea concentraieinfiecarepunctalspaiuluiocupatdeansamblulsolvit-solvent, n final ajungndu-se la o egalizare a concentraiei. Figura 8.2. Distribuia spaial a concentraiei la diferite momente de timp (t0