INTRODUCERE N BIOCHIMIA ANALITICndrumar metodic pentru practica didactic

UNIVERSITATEA DE STAT DIN MOLDOVAFacultatea de Biologie i Pedologie

Catedra Biologie Vegetal

Pavel Grigorcea, Ala Cherdivar, Maria Pisov

Chiinu - 2005CEP USM

Aprobat deConsiliul metodico-tiinici editorial al USM

3Descrierea CIP a Camerei Naionale a CriiGrigorcea, PavelIntroducere n biochimia analitic. ndrumar metodic pentru practica

didactic / P. Grigorcea, A. Cherdivar, M. Pisov; red. resp.: Maria Duca, Veaceslav Reva. Univ. de Stat din Moldova. Facultatea de Biologie i Pedologie. Catedra Biologie Vegetal.-Chiinu: CEP USM, 2005. -196 p.

Bibliogr. p.195-196 (23 tit.)ISBN 978-9975-70-613-1

577.1(076.5)

CZU 577.1 (076.5)G 82

ISBN 978-9975-70-613-1

PREFA .................................................................................1. NORME DE PROTECIE A MUNCII .............................2. NOIUNI GENERALE DE ANALIZ BIOCHIMIC .....3. TEHNIC EXPERIMENTAL N BIOCHIMIE ............

3.1. Vase i ustensile, utilizate n analiza biochimic. Unele reguli de mnuire a lor ....................................... 3.2. Operaii de baz n laboratorul de biochimie ..............

4. ETAPELE ANALIZEI BIOCHIMICE CANTITATIVE ...4.1. Cunoaterea compoziiei biochimice a probei de analizat ........................................................4.2. Alegerea metodei de analiz ...........................................4.3. Stabilirea mrimii probei de analizat i a numrului de probe paralele .........................................4.4. Luarea probei ..................................................................4.5. Aducerea probei n soluie .............................................4.6. Eliminarea interferenelor .............................................4.7. Analiza propriu-zis .......................................................

5. TRATAREA MATEMATIC A ANALIZEI BIOCHIMICE ..............................................

5.1. Clasicarea erorilor ........................................................5.2. Noiuni de statistic ........................................................

5.2.1. Indicatorii statistici ai unui ir de determinri experimentale .........................................5.2.2. Evaluarea gradului de dispersie a valorilor determinate ...5.2.3. Eliminarea rezultatelor anormale ................................5.2.4. Exemple de prelucrare statistic a rezultatelor unei analize biochimice ..................................................5.2.5. Prezentarea datelor ca numr semnicativ ..................5.2.6. Redactarea i tehnoredactarea .....................................

Recomandat de Consiliul profesoral al Facultii de Biologie i Pedologie

Redactor responsabil: Maria Duca, doctor habilitat n biologie, prof. universitar Redactor tiinic: Veaceslav Reva, doctor habilitat n biologie, conf. universitar

57

1114

142448

4848

4949505151

525254

565761

636567

CUPRINS

Pavel Grigorcea, Ala Cherdicvar, Maria Pisov, 2005 USM, 2005

4 5

6. METODE GRAVIMETRICE DE ANALIZ ................... 6.1. Determinarea gravimetric a apei n materiale vegetale ...

7. METODE VOLUMETRICE DE ANALIZ ..................... 7.1. Principii generale ale analizei volumetrice ...................

7.1.1. Condiiile reaciilor volumetrice. Clasicarea metodelor de analiz volumetric .................................7.1.2. Soluii .........................................................................7.1.3. Soluii titrate ...............................................................

7. 2. Metode volumetrice bazate pe reacii de neutralizare .....7.2.1. Alcalimetria ................................................................7.2.2. Acidimetria ................................................................

7.3. Metode volumetrice bazate pe reacii de oxidoreducere ...............................................................

7.3.1. Manganometria ...........................................................7.3.2. Iodometria ...................................................................7.3.3. Complexometria ..........................................................

8. METODE FIZICO-CHIMICE DE ANALIZ BIOCHIMIC ..............................................

8.1. pH-metria ........................................................................8.1.1. Deniia pH-ului ........................................................8.1.2. Indicatorii de pH ........................................................8.1.3. Determinarea experimental a pH-ului ......................

8.2. Soluii tampon .................................................................8.2.1. Mecanismul de aciune a soluiilor tampon .............8.2.2. Determinarea capacitii de tamponare a plasmei sanguine .........................................................8.2.3. Modaliti de preparare a unor soluii tampon ...........8.2.4. Tria ionic .................................................................

8.3. Analiza spectrofotometric ...........................................8.3.1. Noiuni generale de spectrofotometrie .........................

8.3.2. Legile spectrofotometriei ...........................................8.3.3. Denirea unor noiuni utilizate n spectrofotometrie ..8.3.4. Categorii de soluii n spectrofotometrie ...................8.3.5. Aparatura pentru determinri spectrofotometrice .....

BIBLIOGRAFIE ........................................................................

Biochimia ca tiin a aprut graie contientizrii faptului c procesele activitii vitale sunt determinate de fenomene ce pot explicate pe baza chimiei i zicii. Datorit eforturilor unor savani ilutri, care au reuit s traseze obiective juste, s creeze metode de laborator adecvate pentru rezolvarea acestor obiective, au fost descoperite multe particulariti ale materiei vii.

n ultimii 50-60 de ani biochimia a beneciat de o avalan de descoperiri de importan major. Aceasta se conrm prin faptul c n perioada respectiv a favorizat explozia geneticii moleculare mpreun cu care a format temelia biologiei moleculare i a bioingineriei cu o puternic inuen n medicin, agricultur, industrie i n multe alte domenii ale activitii omului. Totui, au rmas numeroase aspecte ale vieii a cror elucidare urmeaz a realizat de biochimie cu efortul tinerilor ce tind s mbrieze profesia de biochimist.

Obiectivul principal al ndrumarului metodic pentru practica de studiu (practica didactic, de iniiere) la specializarea Biochimie const n formarea la studeni a abilitii de a executa de sine stttor acele analize biochimice care sunt strict necesare pentru ndeplinirea practicii de producere i a lucrrilor de licen. Deci, se prezint a un compendiu n biochimia analitic, disciplin care actualmente pentru alte domenii ale biochimiei, precum i pentru multe direcii ale biologiei joac acelai rol ca i matematica pentru zicieni.

Graie faptului c multe dintre metodele biochimiei analitice calitative, inclusiv electroforeza, cromatograa i alte metode moderne de izolare, puricare i caracterizare a proteinelor i polipeptidelor, au fost elaborate la catedra noastr, n cele ce urmeaz vom prezenta n temei acele lucrri de biochimie analitic cantitativ care sunt aplicate la catedr i n laboratorul de biochimie a plantelor.

Deoarece practica de studiu are scopul de a forma la studeni deprinderi de a executa de sine stttor majoritatea experienelor, unele din ele ind executate neglijent, ceea ce poate provoca accidente grave, ndrumarul ncepe cu unele norme de protecie a muncii n laborator.

ndrumarul familiarizeaz studenii cu vasele, ustensilele,

69697171

727383919196

97102108116

123123123126129137138

142143144146147148150154154195

PREFA

6 7

dispozitivele i aparatele ce alctuiesc un minim obligatoriu pentru orice laborator de biochimie. n el sunt prevzute cile de planicare, executare, prelucrare statistic, pregtire i prezentare a unei mici lucrri tiinice. Cuprinde noiuni generale de biochimie analitic, clasicarea metodelor de analiz biochimic clasic (gravimetric, volumetric); sunt explicate metodele de preparare a soluiilor (soluii titrate, soluii tampon), de exprimare a concentraiei lor. Din metodele volumetrice de analiz sunt descrise metodele alcalimetrice, acidimetrice, iodometrice, manganometrice i complexometrice. Ca metode zico-chimice de analiz sunt prevzute pH-metria, electrofotocolorimetria, sunt descrise principiile de exploatare a colorimetrelor Specol i EK. Metodele cromatograce cuprind metode pe suprafa plat (pe hrtie i pe plci de Silufol) i pe coloan (pe baza gelltrrii pe coloane de Sephadex). Principiul ecrei metode este suplimentat de o aplicaie practic, n care studenii execut de sine stttor o analiz asupra unei anumite substane ce se conine ntr-un obiect de origine biologic.

La selectarea temelor, descrierea unora dintre lucrri, corectarea majoritii lucrrilor au participat specialiti cu renume n biochimie: eful catedrei de biochimie, genetic i microbiologie a Universitii Al.I.Cuza, Iai profesorul universitar Artenie Vlad, profesorul universitar Dumitru C. Cojocaru i confereniarul universitar Elena Tnase de la aceeai catedr, decanul facultii de Biologie i Pedologie a Universitii de Stat din Moldova profesorul universitar Vasile Ciobanu crora autorii le sunt foarte ndatorai pentru preioasele sfaturi i suport moral.

Ne exprimm adnca noastr gratitudine confereniarului universitar T. Homenco pentru contribuirea n tratarea matematic a datelor experimentale, liceniatului n biologie I. Popescu pentru prezentarea grac a gurilor, liceniatului n chimie V. Cernuean pentru graa formulelor i ecuaiilor chimice, licenianilor n biologie V. Paiu i M. Calistru pentru probarea experimental a unor lucrri.

1. NORME DE PROTECIE A MUNCII

nainte de a ncepe lucrrile, se aranjeaz inuta de lucru (halat, mnui, ochelari de protecie etc.) i se aaz n ordine pe masa de lucru toate materialele necesare.

Nu se recomand a pune pe masa de laborator obiecte sau substane inutilizabile n cadrul lucrrilor la zi.

Lucrrile de laborator trebuie s e executate doar cu cantitile i concentraiile de substane strict necesare, cntrite sau msurate exact, respectndu-se condiiile indicate n normele de specialitate puse la dispoziia studenilor.

Nu se permite ca sticlele cu soluii i reactivi s e lsate deschise pe mese sau s se schimbe dopurile de la un vas la altul. Fiecare sticl va purta o etichet pe care va scris corect formula (n unele cazuri i/sau denumirea) substanei ce o conin. Cnd se toarn reactivi din sticle, lichidul nu trebuie s se preling peste etichete, distrugndu-le i ngreunnd citirea denumirii reactivului.

Este interzis gustarea substanelor i a soluiilor cu care se lucreaz, precum i mirosirea lor fr precauie. n cazul sesizrii substanelor volatile, vasul se ine la distan, iar vaporii care se degaj se apropie de nri prin micarea minii.

n timpul desfurrii lucrrilor nu se permite a se apleca deasupra vasului n care s-a turnat sau erbe un lichid oarecare, de asemenea nu este permis nclinarea vasului respectiv spre student.

ntruct majoritatea laboratoarelor folosesc nclzirea cu gaze naturale, pentru a evita accidentele, trebuie respectate instruciunile de manipulare. Pentru a aprinde acra de gaz, se aprinde mai nti chibritul n dreptul oriciului de ieire a gazului, apoi se deschide treptat robinetul de gaz. Dac becul de gaz se aprinde n interior, se nchide imediat robinetul de la conducta de gaz i se informeaz conductorul lucrrii.

Este interzis aprinderea becurilor de gaz cu bucele de hrtie plimbate de la o mas de lucru la alta.

8 9

Nu se las niciodat becuri de gaz aprinse fr supraveghere. ntotdeauna, nainte de a prsi laboratorul se controleaz gazul.

Aparatele electrice trebuie montate i exploatate n aa fel, nct s e prevenite electrocutrile, arsurile, incendiile i exploziile.

Aparatele de nclzire electric (cuptoare, etuve, bi electrice) trebuie aezate pe mese protejate cu tabl de oel. Ele vor conectate la o priz de pmnt pentru evitarea electrocutrilor. Nu se admite conectarea mai multor aparate electrice la o singur priz.

Aparatele n urma conectrii crora se observ scntei sau care au cauzat apariia scurtcircuitului nu vor utilizate dect dup nlturarea defeciunii.

Conectarea aparatelor electrice la reea se va face respectnd riguros condiiile de intensitate i tensiune electric indicate pe aparatul respectiv.

Instalaiile electrice, precum i aparatele electrice din laborator nu trebuie manipulate cu mna umed.

Majoritatea accidentelor pot surveni la manipularea incorect a reactivilor din substane chimice corosive, toxice, inamabile sau explozibile. Aa, de exemplu, deosebit de corosive sunt soluiile concentrate de NaOH i KOH, soluia concentrat de amoniac, acizii concentrai (acidul clorhidric, acidul sulfuric, acidul azotic), perhidrolul, bromul.

Cnd se lucreaz cu acizi concentrai, substane corosive, toxice, manipularea lor se face doar sub ni, utiliznd mnui i ochelari de protecie.

La diluarea acidului sulfuric concentrat se toarn acidul n ap (i nu invers), ncet sub agitare, utiliznd vase rezistente la ocuri termice, reacia ind puternic exotermic.

Soluia de amoniac, acidul clorhidric i azotic concentrat se vor turna numai sub o ventilaie continu a aerului.

O deosebit atenie se cere la manipularea bromului. n acest caz, experienele se execut sub ni. Ochii i minile se vor feri de vaporii de brom prin utilizarea ochelarilor, respectiv a mnuilor de

protecie. La turnare, pictura din gtul aconului se va scoate foarte atent pe marginea vasului, deoarece bromul se prelinge uor pe sticl i poate provoca arsuri pe mini, care se vindec foarte greu.

Unii solveni organici prezint o aciune narcotic i toxic (spre exemplu: cloroformul, eterul etilic); alii sunt toxine ale sngelui (ca benzenul i omologii si); dereglatori ai sistemului nervos (spre exemplu, alcoolul metilic), sau dereglatori ai metabolismului (cum sunt hidrocarburile clorurate); ali solveni organici sunt deosebit de volatili i prezint pericol de inamabilitate (eterul etilic, eterul de petrol, benzenul). Din aceste considerente se cere o deosebit atenie la manipularea acestor lichide.

Nu se vor pstra n vase de sticl cantiti de lichide inamabile mai mari de un litru.

Dac din ntmplare se vars o cantitate oarecare de lichid inamabil, se sting imediat toate becurile, se deconecteaz nclzitoarele electrice, se nchid uile i se deschid ferestrele. Lichidul vrsat se va terge cu o crp, iar apoi prin stoarcere se colecteaz ntr-un balon cu dop.

n cazul aprinderii unui lichid inamabil, n linite, fr panic, trebuie mai nti s se sting becurile, s se acopere acra cu o plapum sau cu nisip. Concomitent cu operaiile de stingere se scot din ncpere toate vasele cu substane inamabile. Dac acra nu se stinge, se cheam pompierii, anunndu-i n prealabil ce substane anume au luat foc. nainte de a ncepe operaiile de stingere, dac sunt aparate electrice racordate la reea, se va ntrerupe curentul electric.

Alcoolul i alte substane lichide solubile n ap se pot stinge cu stingtoarele cu spum chimic, bioxid de carbon sau tetraclorur de carbon.

n caz c se aprinde mbrcmintea, este indicat ca persoana n cauz s nu alerge, ci s se sting, nvelindu-se cu o plapum.

Distrugerea lichidelor inamabile, miscibile cu apa, se face prin aruncarea la canal i amestecarea cu o cantitate de ap care s

10 11

asigure o diluare corespunztoare. Lichidele inamabile nemiscibile cu apa, sau cu substane toxice n coninut, nu se vor arunca la canal, ci se vor mprtia pe un teren viran.

n caz de arsuri termice, superciale sau profunde, se recomand pansamente cu alcool de 60%. n caz de arsuri produse de substane chimice, se spal plaga cu mult ap, dup ndeprtarea n prealabil a mbrcmintei, apoi se va proceda dup cum urmeaz: la arsuri produse de acizi se va spla plaga cu soluie de bicarbonat de sodiu 2%; la arsuri produse de substane alcaline plaga se va spla cu o soluie de acid boric sau acetic de 2%; plgile produse de brom se vor spla cu soluie concentrat de tiosulfat de sodiu.

Cnd substanele chimice au ptruns n ochi, se va spla ochiul cu mult ap, apoi se vor face splturi cu colir (medicament pentru ochi), utiliznd un phrel special de splat ochii.

n cazul nghiirii unor acizi sau baze tari, se vor introduce n stomac substane neutralizante: bicarbonat de sodiu sau, respectiv, acid acetic. Dac a survenit intoxicaia, accidentatul va scos din ncpere i va culcat ntr-o camer aerisit, unde i se va nltura mbrcmintea din jurul toracelui i a gtului spre a-i uura respiraia. n caz c nu mai respir, i se va face respiraie articial, de preferin gur la gur.

n caz de electrocutare, se ntrerupe rapid curentul electric i se scoate ct mai repede accidentatul din zona respectiv; n caz c nu se poate ntrerupe curentul electric, nu se pune mna direct pe accidentat, ci cu ajutorul unor obiecte (haine uscate) se apuc bolnavul i i se face respiraie articial. Bolnavul va apoi transportat la spital.

Biochimia analitic constituie un domeniu al biologiei care are ca obiect de studiu stabilirea prin metode adecvate a compoziiei calitative i cantitative a substanelor sau a amestecurilor de substane n materiale biologice.

Dup scopul i obiectivele urmrite, biochimia analitic se subdivide n: biochimie analitic calitativ i biochimie analitic cantitativ.

Analiza compoziiei unei substane sub aspectul naturii elementelor care o compun formeaz obiectul analizei calitative. Determinarea raporturilor cantitative n care se gsesc aceste elemente ntr-o substan constituie obiectul analizei cantitative.

Biochimia analitic are o importan aplicativ major, ea constituind un mijloc indispensabil de cercetare pentru diferite domenii ale activitii practice. Astfel, unitile de cercetri tiinice, cele industriale i diferite uniti cu prol medical, agro-zoo-veterinar utilizeaz intensiv biochimia analitic n scopul efecturii analizei sngelui i a altor uide la om i animale, a materiilor prime, a controlului proceselor tehnologice, a analizei solului, ngrmintelor, pesticidelor, organismelor vegetale i animale, a produselor de origine vegetal, animal, microbian i a celor de sintez chimic.

Pentru determinarea cantitativ (dozarea) a diferitelor substane, biochimia analitic utilizeaz anumite metode experimentale analitice.

Metode gravimetrice. Se bazeaz pe transformarea componentului biochimic de analizat ntr-o alt substan, practic insolubil, ce se izoleaz din soluie sub form de precipitat. Aceast substan greu solubil se formeaz n urma reaciei dintre soluia iniial a substanei de analizat i un anumit reactiv precipitant. Cantitatea componentului, care este complet inclus n precipitat, se determin prin cntriri, i respectiv, prin calcul din masa substanei care formeaz precipitatul.

2. NOIUNI GENERALE DE ANALIZ BIOCHIMIC

12 13

Metode volumetrice. Se bazeaz, n principiu, pe msurarea exact a volumului soluiei unui anumit reactiv, de concentraie precis cunoscut, care reacioneaz cu substana de analizat. Ele se mai numesc i metode titrimetrice de analiz, deoarece principala operaie este titrarea.

Metode zico-chimice sau metode instrumentale de analiz. Utilizeaz diferite aparate bazate pe anumite principii zice. n funcie de proprietile zico-chimice ale substanelor analizate, metodele zico-chimice de analiz includ: metode optice de analiz i metode electrochimice de analiz.

Metodele optice se bazeaz pe anumite proprieti optice ale substanelor de analizat, n baza crora se poate determina cantitatea lor. Ca metode optice de analiz, menionm:

a) metode fotometrice de analiz, cum sunt: colorimetria, care se bazeaz pe compararea intensitii culorii unor soluii de concentraii diferite; spectrofotometria, care folosete aparate speciale (denumite spectrofotometre), cu ajutorul crora se poate determina coecientul de extincie al soluiei pentru diferite lungimi de und; nefelometria, care se bazeaz pe msurarea cantitii de lumin difuzat de particulele unui sistem coloidal;

b) metode refractometrice de analiz, care msoar indicele de refracie al substanei de analizat cu ajutorul refractometrului;

c) metode polarimetrice de analiz, care msoar cu ajutorul polarimetrului rotirea planului luminii polarizate trecute prin soluia de analizat.

Metodele electrochimice se bazeaz pe proprietile electrochimice ale substanelor de analizat. Dintre aceste metode menionm:

a) metoda de analiz prin electroliz, n care substana de analizat se depune pe electrod sub aciunea curentului electric.

b) metoda poteniometric, care folosete determinarea potenialelor ce se stabilesc ntre soluia substanei de analizat i un electrod polarizat cufundat n soluia respectiv;

c) metoda conductometric, care determin conductibilitatea electric a soluiei de analizat;

d) metoda polarograc, ce se bazeaz pe procesele de polarizare care se produc pe un electrod pictor de mercur.

Metodele cromatograce de analiz reprezint metode cu capacitate major de separare a substanelor individuale din amestecuri naturale.

Determinarea cantitilor de substane izolate se face cu ajutorul metodelor sus-menionate de analiz, n special cu cele foto- sau spectrofotometrice.

Metodele electroforetice de analiz sunt bazate pe capacitatea substanelor ce poart careva sarcin electric de a se deplasa ntr-un cmp electric cu viteze corelative cu sarcina electric, precum i cu dimensiunile i forma substanelor separabile. Depistarea i dozarea substanelor separate se face de asemenea cu ajutorul metodelor zico-chimice de analiz.

14 15

3. TEHNIC EXPERIMENTAL N BIOCHIMIE

Tehnica experimental n biochimie reprezint totalitatea procedeelor ntrebuinate n practica de cercetare a substanelor de provenien biologic. n afar de aparatura de performan cu destinaie special, ea cuprinde o serie de metode chimice i zico-chimice de larg acreditare care folosete o mulime de dispozitive i aparate. Acestea, n multe cazuri, necesit cunoaterea unor operaiuni foarte simple, de exemplu, unirea corect a dou lifuri de sticl sau prepararea unei soluii de careva reactiv de anumit concentraie. Cu toate c la prima vedere astfel de operaiuni par a banale, lipsa cunotinelor n acest domeniu poate avea consecine grave. Acestea sunt considerentele din care studenii trebuie s cunoasc unele obiecte de lucru, materialele din care ele sunt confecionate, regulile de manipulare corect a lor.

3.1. Vase i ustensile utilizate n analiza biochimic.Unele reguli de mnuire a lor

Pentru efectuarea lucrrilor de laborator n majoritatea cazurilor sunt necesare vase (recipiente care servesc pentru pstrarea lichidelor, iar uneori i a unor substane solide sub form de granule sau pulbere) i ustensile (obiecte care servesc la efectuarea unor operaii curente), de alegerea corect a crora n mare msur depinde reuita experienei.

Vasele i ustensilele pot din sticl, din materiale ceramice, din metal, lemn, mase plastice sau uneori combinate ntre ele.

Majoritatea lucrrilor de laborator se execut cu ustensile din sticl, aceasta deoarece sticla posed astfel de proprieti ca transparen, pasivitate fa de majoritatea agenilor chimici, o anumit rezisten mecanic, bun rezisten termic, poate curit dup ntrebuinare, costul ei ind relativ mic n comparaie cu alte materiale.

Vase i aparate din sticl. n practica de laborator se utilizeaz urmtoarele vase din sticl: eprubete, pahare Berzelius, vase Erlenmayer, baloane cu fund rotund i cu fund plat, baloane Wrtz, cristalizoare, capsule din sticl, sticle de ceas, sticlue picurtoare, borcane i sticle pentru reactivi etc. (Fig.1).

Dintre aparatele din sticl menionm: refrigerentele (Fig.2) utilizate n procesul de distilare sau pentru evitarea evaporrii unei anumite substane dintr-un amestec supus nclzirii; ba1oanele de reacie cu dou, trei sau patru gturi i vasele de reacie cu capac. Acestea vor folosite exclusiv pentru operaii nepericuloase.

Tuburile din sticl care urmeaz a introduse n gurile dopurilor sau n tuburile de cauciuc trebuie tiate drept, iar marginile trebuie rotunjite la acr.

La lucrrile sub vid, de exemplu la distilare, se vor ntrebuina numai baloane mici, cu fundul rotund, sau vase speciale pentru lucrri sub vid.

La folosirea lifurilor i reduciilor se respect urmtoarele condiii: manonul i conul trebuie s e din acelai tip de sticl; mbinarea lor se face prin rsucirea uoar a conului n manon; se evit contactul lor cu substanele puternic alcaline, se evit rcirea brusc sau nclzirea prelungit a sticlei. La confecionarea unui ansamblu experimental se utilizeaz un singur tip de sticl.

Cnd se lucreaz sub vid, lifurile i reduciile se ung cu vaselin siliconic, cu precauie, evitndu-se contactul cu substanele chimice din instalaie sau aparat.

lifurile i reduciile nepenite nu se vor desface prin rsucire, ci se vor nclzi uor la acra unui bec de gaz (circa 70C), avnd grij s nu se nclzeasc i conul, apoi conul se mpinge cu degetul mare, innd aparatul cu celelalte degete. De asemenea, se poate folosi un ciocan de lemn cu care se lovete uor liful (metoda se poate aplica i la scoaterea dopurilor de sticl).

n practica de laborator se mai folosesc i alte legturi, cum ar : prin dopuri de cauciuc, plut sau mas plastic, prin tuburi de

16 17

a - eprubet;b - pahar Berzelius;c - vas Erlenmayer;d - balon cu fund plat;e - balon cu fund rotund;f - balon Wrtz;g - sticl de ceas;h - ol de cntrire,

form joas (box);i - ol de cntrire, form nalt;j - creuzet din sticl pentru uscare sau cntrire;k - balon cu fund rotund cu un lif;l - balon de tip par cu un lif;

Fig. 1. Vase i ustensile din sticl:m - balon cu dou gturi cu lif;n - balon cu trei gturi cu lif,o - piset din sticl;p - instilator sau picurtoare;q - butelie pentru reactivi.

cauciuc sau polietilen, iar pentru ramicaii se utilizeaz tuburile n form de T, Y, U, simple sau cu olive (Fig.2).

Robinetele pot ataate la un vas sau separate. Ele pot cu o cale sau cu dou, n form de T, Y sau U.

n afar de tuburile din sticl care pot drepte sau ndoite, de diverse lungimi i diametre, n laborator se mai folosesc alonjele sau prelungitoarele (Fig.2), care sunt tuburi din sticl drepte sau ndoite, avnd diametrul la unul din capete mult mai mic dect la cellalt. Acestea se utilizeaz cel mai mult la legtura dintre un refrigerent descendent i vasul de culegere al distilatorului.

Din sticl de calitate inferioar se confecioneaz baghete - vergele din baton de sticl, utilizate n general la amestecarea soluiilor; spatule, fabricate din vergele de sticl. Din sticl cu proprieti speciale de calitate superioar (Jena, Pyrex, Duran, sticl clit, sticl de cuar etc.) se confecioneaz n ateliere specializate vase i ustensile cu destinaie special.

Recipientele de sticl mari nu se vor pune direct pe mas, ci pe o plac de material elastic.

Dopurile de cauciuc, plut sau de polietilen trebuie s intre n gtul balonului numai cu o uoar forare. n momentul introducerii vasul trebuie inut de gt i nu de fund.

Vasele de sticl se nclzesc progresiv pe bi de ap, de ulei, nisip etc. Pentru a evita supranclzirea lichidelor, se folosesc bile de ceramic sau sticl poroas, e bucele de piatr ponce (roc vulcanic sticloas, foarte poroas) sau porelan poros, care se introduc n lichidul rece. Acestea condiioneaz o erbere progresiv i linitit a lichidelor.

Baloanele cu fund rotund se aaz pe masa de lucru, sprijinindu-le pe nite inele din material elastic i de mrime potrivit. Vasele ce conin substane solide n suspensie trebuie agitate n timpul nclzirii.

Capetele baghetelor folosite pentru amestecare trebuie rotunjite la acr; agitarea cu bagheta se face printr-o micare circular de-a

18 19

a - refrigerent simplu cu aer;b - refrigerent cu aer cu bule;c - refrigerent Liebich;d - refrigerent cu bule;

e - refrigerent cu spiral;f - plnii;g - canale sau robinete;h - lifuri;

i - alonj;j - tuburi de legtur,k - reducii.

lungul pereilor vasului. Pentru transvazarea precipitatelor se vor folosi baghete de sticl avnd aplicat pe unul din capete o bucat de tub de cauciuc.

Splarea vaselor se face imediat dup terminarea operaiei, cu lichide, n care impuritile respective sunt solubile.

Aparatura erbinte se apuc, dup caz, cu crp uscat, cu un clete de lemn sau metalic, n cazul creuzetelor sau capsulelor supuse calcinrii. Aparatura de sticl erbinte se va feri de oc termic, respectiv nu se va aeza pe un loc ud sau rece i nu se vor turna lichide reci n ea. Se interzice nclzirea aparaturii de sticl direct pe acr. Cletele cu care se apuc aparatura erbinte de sticl se va nclzi puin n prealabil la capt.

Vase i ustensile din ceramic. n practica de laborator cele mai folosite materiale ceramice sunt: porelanul, faiana i amota, care au proprietatea de a mult mai rezistente termic fa de sticl, precum i la aciunea agenilor chimici. De asemenea, datorit coecientului de dilataie termic mic, aceste materiale suport diferene mari de temperatur, ceea ce determin utilizarea larg n laborator. Dezavantajele pe care le prezint faiana i porelanul sunt: fragilitatea, costul ridicat, faptul c nu sunt transparente. Din materiale ceramice se confecioneaz pahare, capsule de evaporare, creuzete, mojare cu pistile, spatule, plnii Bchner, plcue cu falduri, triunghiuri de amot, plci pentru exsicatoare i altele (Fig.3).

Manipularea vaselor i ustensilelor din ceramic se face n acelai mod ca i cu vasele i aparatura din sticl. nclzirea creuzetelor i a capsulelor de porelan se face pe triunghiuri de ceramic. nclzirea n cuptoarele de calcinare se va supraveghea permanent, iar scoaterea lor din cuptor se face n exsicator cu plac din ceramic (nu din tabl), fr a se atinge de pereii acestuia sau de alte vase din sticl.

Materiale din metal. n laboratorul de biochimie se utilizeaz ustensile i materiale de laborator confecionate din er, font, alam, aluminiu etc.

Fig. 2. Vase i aparate din sticl:

20 21

Fig. 3. Ustensile din ceramic:a - mojare i pistile pentru frmiat diferite substane solide;b - capsul din porelan pentru evaporare i uscare;c - creuzet cu capac;d - plnia de ltrare Bchner sau ltrul-plac cu vid (schem i seciune);e - spatule din porelan;f - triunghi din porelan.

Dintre aceste materiale vom cita: stativele din er, utilizate la xarea instalaiilor de laborator, constau dintr-o vergea metalic rigid, xat pe un postament greu de form dreptunghiular sau pe trei piciorue din font; trepiedele, folosite ca suporturi pentru susinerea vaselor i aparatelor de laborator n timpul nclzirii; sita de er, folosit pentru protejarea vaselor de sticl supuse nclzirii; cletele, utilizat la manipularea creuzetelor sau a altor vase erbini; clemele Hoffmann (cu urub) sau Mohr (cu arc),

xate pe tuburi din cauciuc pentru oprirea sau reglarea debitelor de lichide; inelele metalice, utilizate ca suporturi pentru susinerea vaselor sau pentru susinerea plniei n timpul ltrrii; creuzetele metalice, confecionate din oel, font sau platin; bile de ap, ulei sau cu nisip, folosite la nclzirea diverselor soluii n vase din sticl; plitele i reourile electrice; buteliile din oel pentru gaze; trompele de ap; stativele pentru eprubete (din tabl de aluminiu); spatulele metalice; lingurile de ars; pensetele; foarfecele i altele (Fig. 4). Dintre aparate menionm: perforatorul de dopuri, becurile de gaz (Fig.4); etuva electric i cuptorul de calcinare (Fig. 5); balanele de laborator tehnic i analitic (Fig. 10).

n afar de vasele i aparatele din sticl, ceramic i metal, n laboratorul de biochimie se utilizeaz i alte materiale confecionate din lemn, cauciuc i din materiale plastice. Dopurile de plut, nainte de a gurite (cu perforatoare speciale pentru dopuri), se preseaz uor cu ajutorul unei prese de dopuri. Gurirea se face cu un perforator ceva mai mic dect diametrul termometrului sau al tubului ce urmeaz s e introdus prin dop. Potrivirea gurii denitive se face prin frecarea cu o pil rotund. Etaneitatea perfect se poate obine prin ungerea, la dopuri i la legturile dintre diferitele pri ale aparatului, cu vaselin special (un amestec de vaselin i cear).

nclzirea vaselor i a instalaiilor de laborator se poate face cu gaz sau energie electric. Gazul prezint avantajul c transmiterea cldurii se face repede, acra rezultat are o temperatur ridicat i se poate regla uor: de la acra oxidant (albastr), care n zona central atinge temperatura de peste 1500C, la acra reductoare (roie).

Cnd se nclzete cu energie electric, se folosesc o serie de aparate de nclzit prezentate mai nainte, care, n funcie de temperatura pe care o pot furniza, se mpart n:

- bi de ap i termostate (0 - 100C); - bi de nisip, etuve i bi de ulei (0 - 250C); - reouri i cuptoare de calcinare (peste 300C).

22 23

Fig. 4. Ustensile din metala - perforatoare de dopuri;b - perii pentru eprubete;c - bec de gaz Bunsen 1 - conduct de gaz, 2 - deschiztur pentru ptrunderea aerului, 3 - oriciul n manon pentru reglarea cantitii de aer);

d - bec de gaz Teclu 1 - conduct de gaz, 2 - deschiztur pentru ptrunderea aerului, 3 - disc pentru reglarea cantitii de aer; 4 - robinet pentru reglarea cantitii de gaz);

e - bec de gaz nzestratcu rozet (uture dublu ncruciat, uture lat);f - foarfece; g - pensete;h - spatule, i - clete metalice;j - trepied metalic (pirostrie); k - cleme Mohr (cu arc);l - cleme Hoffmann (cu urub).

Fig.5. Etuve electricea - cu termoreglare; b - fr termoreglare.

24 25

3.2. Operaii de baz n laboratorul de biochimie

Mojararea. Deseori n laboratorul de biochimie este nevoie de mrunirea, mcinarea sau pulverizarea materialului brut de analizat, pentru a obine dimensiunile dorite la luarea probelor de laborator.

Pentru obinerea unei cantiti mici de substan, n laborator, se folosete mojarul din porelan, iar pentru materialele mai dure - mojarul din agat. Se iau poiuni mici din material, de mai multe ori. Mrunirea materialului nu se face prin lovire (apare pericolul spargerii pistilului sau mojarului), ci prin frecarea pistilului de pereii mojarului prin micri circulare, operaia numindu-se mojarare. Pentru substanele explozive se folosesc mojare speciale, cu pistil de cauciuc. n cazul substanelor necunoscute, mojararea se face cu mult precauie, efectundu-se ncercri pe cantiti mici.

Pentru sortarea substanelor se folosesc site rotunde, cu ochiuri din srm, iar pentru materialele foarte ne - site din estur de capron sau mtase. Cernerea se execut printr-o micare de dute-vino sau prin scuturarea sitei.

Extragerea este procedeul de separare a unei substane dintr-un material.

Dizolvarea este fenomenul de rspndire a moleculelor unei substane printre moleculele altei substane. Dac amestecul este omogen, poart numele de soluie. Componentele soluiei sunt: solvatul (care se dizolv) i solventul (n care se dizolv). O soluie poate avea diferite concentraii, concentraia ind raportul dintre solvat i solvent.

La prepararea soluiilor se folosesc baloane Erlenmayer sau baloane cotate, n care se introduce substana de dizolvat, pe care se toarn o cantitate de dizolvant mai mic dect e necesar. Se nclzete, dac e cazul chiar pn la erbere, se agit mereu i se adaug apoi restul de solvent. E bine ca substana de dizolvat s e n prealabil pulverizat n mojar.

Pentru efectuarea unei analize biochimice, substanele, de cele mai

multe ori, se aduc n soluie. Atunci cnd substana nu e solubil n ap, se ncearc solubilitatea ei n ali solveni. ntr-un sens mai larg putem vorbi de dizolvare i atunci cnd n urma unor reacii chimice substanele insolubile n ap se transform n substane solubile n ap. De exemplu, CaCO3 e insolubil n ap, dar solubil n acizi diluai, deoarece n urma reaciei dintre CaCO3 i acid se obine o sare solubil n ap.

CaCO3 + 2HCl CaCl2 + CO2 + H2OInsolubil Solubil

Globulinele sunt insolubile n ap, ns sunt solubile n soluii saline. ncercarea solubilitii se face n cantiti mici (1-2 mg) de material, n dependen de substanele ce urmeaz a investigate. Astfel, proteinele sumare se dizolv n soluii diluate de sruri (NaCl sau KCl), acizii nucleici - n soluie de acid percloric 0,5 N la 0C, monozele - n soluie de alcool etilic 75-80% la erbere, lipidele - n alcool etilic i ali solveni organici etc.

Substane complet insolubile nu exist, de aceea e corect s se foloseasc termenul de substan practic insolubil.

Amestecarea i agitarea au rolul de a produce omogenizarea i micarea materialelor. n laborator prin amestecare se nelege, n mod obinuit, folosirea unui dispozitiv n interiorul vasului de reacie care produce amestecarea; prin agitare se nelege micarea ntregului vas de reacie, n mod curent nu se face ns distincie ntre aceste dou operaii.

Amestecarea se realizeaz:- manual cu baghete de sticl;- cu amestectoare sau agitatoare, piese ce se rotesc n interiorul

vasului, acionate de obicei de un motor electric.Agitatoarele pot confecionate din sticl, porelan,

metal acoperit cu cauciuc sau mase plastice i au diferite forme. n cazul unor volume mici se folosesc deseori agitatoare magnetice formate din corpuri de oel nvelite pentru protejare cu o manta de sticl sau polietilen. Se folosesc mult astzi metodele de amestecare cu ajutorul ultrasunetelor.

26 27

Agitarea se realizeaz n general n vase de reacie mai mici, obinuite, uneori n baloane cu fund rotund, xate n piesa mobil a unui aparat de agitare, care execut micri de dute-vino, de oscilaie sau de rotaie.

Cea mai simpl operaie de agitare este scuturarea lateral a eprubetei sau a balonului. La agitare, eprubeta nu trebuie astupat.

Evaporarea este operaia care are drept scop concentrarea soluiilor sau eliminarea componenilor volatili. Prin evaporare se recupereaz reziduurile nevolatile din soluie. Evaporarea poate decurge la presiune normal sau sub vid. Componenii volatili care se pot elimina sunt: apa, amoniacul, excesul de unii acizi etc. Evaporarea se execut n capsule de porelan sau n pahare aezate pe baie de ap sau de nisip. Soluia de evaporat se aduce la erbere, prin amestecare continu cu bagheta de sticl. Pentru a nu se produce supranclzirea lichidului, se obinuiete s se introduc cioburi de porelan poros (nu i n cazul n care se separ o substan solid). n timpul evaporrii rapide, reziduul solid se urc pe marginile capsulei, depind-o de cele mai multe ori, fenomen nedorit, care poate evitat prin nclzirea capsulei n alta mai mare. Pentru evaporare se folosesc i lmpile cu radiaii infraroii. Eliminarea dizolvantului se poate face i prin absorbie. De exemplu: vaporii de ap pot absorbii cu H2SO4 conc., KOH, CaCl2, P2O5, silicagel. Pentru concentrarea soluiilor de substane macromoleculare se folosesc granule de biogeluri, de exemplu de Sephadex cu pori mici, care adsorb apa i substanele cu mase moleculare mici.

Precipitarea reprezint separarea unei substane insolubile dintr-o soluie printr-o metod anumit (reacie chimic, micorarea solubilitii substanei prin rcire, evaporare, cristalizare etc.).

Este mai bine ca precipitarea s se efectueze la temperatura laboratorului, apoi s se lase la rece (+4C), pentru c prin rcire se mresc particulele de precipitat. n soluia rmas limpede deasupra precipitatului, cu o pictur de reactiv se ncearc dac precipitarea este complet. Excesul de reactiv poate dizolva uneori precipitatele.

Decantarea este operaia prin care se poate separa un precipitat de supernatant (lichidul de deasupra sa), n baza diferenei de densitate (masa substanei n unitate de volum). Pentru ca separarea componenilor s e total, precipitatul se spal cu ap distilat de trei-patru ori, n pahar, ateptnd de ecare dat depunerea lui, efectund decantarea (scurgerea) lichidului cu ajutorul unei baghete de sticl.

La general, pentru a mpiedica dizolvarea precipitatelor formate, se folosete pentru splare o soluie foarte diluat din reactivul pentru precipitare.

Filtrarea este o metod prin care un precipitat se poate separa de faza lichid cu ajutorul unor materiale poroase, numite ltre. Filtrarea se folosete n mod curent n laborator, la analiza calitativ i cantitativ, la cristalizri, la separarea unor impuriti mecanice.

Drept ltre n laboratoare se folosesc: hrtie special (hrtie de ltru), care poate avea mrimea diferit a porilor, sticl poroas (frite), porelan poros, vat de sticl.

Hrtia de ltru poate aleas cu densitatea i mrimea porilor n dependen de substana sau precipitatul de ltrat. Exist ltre cu pori ni i densitate mare pe unitatea de suprafa (panglic albastr cu diametrul porilor de circa 1 2,5 nm), ltre medii (panglic alb cu diametrul porilor de circa 3 nm) i ltre rare (panglic roz sau neagr cu diametrul porilor de circa 10 nm).

Soluiile care pot distruge hrtia de ltru cum sunt acizii concentrai sau bazele concentrate, se ltreaz pe vat de sticl, pe frite (ltre de sticl poroas) sau porelan poros.

Filtrarea se poate face: la presiune atmosferic, sub vid, la cald, la rece.

Filtrarea la presiune atmosferic se efectueaz folosind o plnie simpl de sticl i hrtie de ltru. Filtrul simplu din hrtie poroas (ltrul neted) se confecioneaz astfel: se ia o bucat de hrtie de form ptrat, de mrime potrivit pentru plnia aleas, se mpturete n patru, se rotunjete cu o foarfec, se xeaz, prinznd cu degetele mari n interiorul plniei, i, dac e necesar, se umezete (Fig.6).

28 29

Fig.6. Confecionarea ltrului simplu

Fig.7. Confecionarea ltrului cu faluri

(gofrat)

Fig.8. Tipuri de ltrare:

a simpl; b n vid.

a

b

Pentru mrirea vitezei ltrrii, se ntrebuineaz ltre cu suprafa mai mare numite ltre cree, cutate sau ltre n faluri.

Un ltru cre se poate pregti pornind de la ltrul neted: rondela de hrtie de ltru se ndoie n semicerc, apoi de-a lungul unei jumti de diametru (raz), se ndoaie hrtia n faluri mici, schimbnd sensul ndoiturii n mod succesiv, pn ce se ajunge la cealalt parte a diametrului, iar hrtia are aspectul unui evantai dublu. Se despart cele dou pri ale evantaiului, hrtia lund forma unei plnii ncreite, care se aeaz pe o plnie obinuit de sticl (Fig.7). Filtrele cree se folosesc mai ales pentru ltrarea precipitatelor voluminoase i gelatinoase, n special la cald sau pentru cazul cnd ne intereseaz numai soluia ltrat, precipitatul de pe ltru urmnd s e ndeprtat din lucru.

n timpul ltrrii, vrful tieturii oblice a plniei se alipete de peretele vasului n care se ltreaz. Marginea hrtiei de ltru trebuie s e cu un centimetru mai jos de marginea plniei. Soluia se toarn n plnie sprijinind marginea paharului, din care se face decantarea, pe o baghet de sticl i soluia se prelinge de-a lungul baghetei i curge n plnie pe pereii conului, nu direct n vrful conului hrtiei de ltru, pentru a evita ruperea ltrului (Fig.8).

Filtrul nu se umple pn la marginea sa cu soluia ce se ltreaz, ci cu cm mai jos. Vasul n care s-a aat soluia se cltete de 3-4 ori cu ap distilat sau cu solvent, volumele de splare trecndu-se pe ltru.

Plniile obinuite numite plnii calitative, au tubul de scurgere cu acelai diametru pe toat lungimea lui, sau au diametru din ce n ce mai mic spre extremitatea lui. Sunt plnii de sticl cu o gtuitur n interior, ceva mai jos de vrful conului plniei. Aceste plnii servesc mai ales pentru ltrri cantitative, de aceea se mai numesc i plnii cantitative, ele avnd avantajul de a mri viteza ltrrii.

Filtrarea n vid se realizeaz cu ajutorul plniei Bchner pe care se aeaz o hrtie de ltru i care e ataat la un balon Erlenmayer cu tromp (Fig. 8).

Pentru ltrarea la presiuni sczute sunt folosite i plniile de sticl cu plac de sticl poroas. Filtrarea prin acest procedeu este rapid i izoleaz bine faza solid de cea lichid.

Cnd se termin ltrarea, nu trebuie oprit trompa nainte de a se desface ncet aconul n care s-a fcut ltrarea. Dac nti nchidem trompa, atunci apa, din cauza depresiunii din vas, se ridic n sus, trece prin tubul de cauciuc i impuric lichidul sau soluia ltrat. O desprindere brusc a vasului de tromp poate arunca lichidul afar din vas, cauznd pierderi, mai ales atunci cnd intereseaz numai lichidul ltrat.

ndeprtarea de pe ltru a substanei solide ltrate sau a precipitatului se face astfel: se rstoarn plnia deasupra

30 31

Fig. 9. Exsicatoarea simplu, b de vid.

a b

unei sticle de ceas sau capsule de porelan, pe care cade ltrul cu precipitatul, sau se scoate ltrul din plnie cu ajutorul unei pensete, se desface ltrul i se rstoarn. Se tamponeaz sau se preseaz uor cu o hrtie de ltru uscat pentru a se suge excesul de lichid care nu a fost sucient de bine tras la pomp.

Uscarea precipitatelor. Uneori cu precipitatul se lucreaz mai departe aa umed cum rmne de pe ltru. De cele mai multe ori ns trebuie ca mai trziu precipitatul s e uscat. Uscarea unei substane umede se face prin mai multe procedee:

a) substana cristalizat se ntinde n strat subire pe o foaie tripl de hrtie de ltru, de mrime potrivit, se acoper cu alte dou-trei hrtii de ltru suprapuse i se preseaz uor. Hrtiile de ltru ce vin n contact direct cu substana se rennoiesc pn ce nu mai apar umezite;

b) substanele solide ntinse pe o sticl de ceas se pot usca ntr-un exsicator simplu, n care se a o substan deshidratant.

Cel mai puternic deshidratant este pentoxidul de fosfor, ns el se ntrebuineaz mai rar. n mod obinuit ca substan deshidratant se folosete acidul sulfuric concentrat sau clorura de calciu granulat, iar cnd substana cedeaz uor amoniac uscarea se face pe sod caustic (NaOH solid ) sau pe calce sodat (NaOH + CaO). Uscarea se poate grbi prin evacuarea aerului dintr-un exsicator de vid. Vidul n exsicator se face cu ajutorul unei trompe de ap, pompe de ulei etc. Mai nti trebuie s se nchid robinetul exsicatorului, apoi s se ntrerup legtura cu trompa i la urm s se nchid apa. Dac mai nti oprim apa, atunci apa ntr n exsicatorul n care se a vid;

c) substanele care nu se schimb la o temperatur mai ridicat se pot usca n etuve.

Separarea unui amestec eterogen lichid-lichid. Lichidele care nu se amestec, de exemplu apa i uleiul, se separ cu ajutorul unei plnii cu robinet numit plnie de separare. De asemenea, se poate utiliza centrifugarea.

Practica de laborator cere uneori ltrarea la cald, ceea ce se realizeaz cu dispozitive speciale, cum ar introducerea ltrului ntr-o manta conic de cupru prin care circul vapori de ap sau aer cald, sau ntr-o spiral ce are forma plniei i prin care trec vaporii de ap.

Filtrarea la temperaturi joase se face cu plnii obinuite din sticl, montate n vase prin care circul lichide de rcire sau ntr-un vas cu ghea sau amestec rcitor. Plnia se poate acoperi cu o sticl de ceas sau capsul n care se pune ghea cu sare sau ghea carbonic.

Uscarea const n ndeprtarea lichidelor dintr-o substan. Exist mai multe procedee de uscare, n funcie de natura substanelor i scopul urmrit.

Uscarea substanelor solide la temperatur normal se realizeaz:

n curent de aer, precipitatele ind splate cu alcool, cu eter etc., n vid, tot dup splare cu lichide volatile; n exsicatoare ce conin substane higroscopice: H2SO4 conc.,

P2O5 granulat, silicagel, etc.

32 33

1

6

12

11

2

3

8

4

3

5 7 9 10

Fig. 10. Schema balanei analitice.

Uscarea la cald la 100-150C se realizeaz n etuve, timp de 1-2 ore (pn la masa constant). Pentru determinarea coninutului de ap, uscarea se face la 105C.

Uscarea lichidelor i gazelor se face cu ajutorul unor substane deshidratante (higroscopice).

Msurarea maselor (cntrirea). Cntrirea se realizeaz cu ajutorul balanelor.

n principiu, cntrirea la balan se face comparnd masa substanei de cntrit cu masa unui etalon sau a unei greuti.

n laboratoarele de biochimie se folosesc urmtoarele tipuri de balane, care difer prin precizia lor:

- balane tehnice, care au o precizie de ordinul gramelor;- balane analitice, care au o precizie de 0,1-0,2 mg.

Balana tehnic se compune dintr-o prghie cu brae egale care se sprijin prin intermediul unui cuit din oel sau agat pe o coloan central de susinere. Prghia este prevzut la mijloc cu un ac indicator care poate oscila n dreptul unei scale gradate. La capetele prghiei se a suspendate, cu ajutorul unor cuite ne, dou talere (platane). Balana este prevzut cu un dispozitiv de oprire. Reglarea orizontalitii balanei care este montat pe un suport se face cu ajutorul unui r prevzut la captul liber cu plumb.

Balana analitic este un instrument cu ajutorul cruia se efectueaz cntrirea precis, foarte exact, necesar n analiza cantitativ. Cntririle la balana analitic se fac cu precizie pn la a patra zecimal de gram.

Balana analitic este construit pe principiul prghiilor i poate prevzut cu amortizor care, dup un numr mic de oscilaii, oprete acul indicator n dreptul unei diviziuni de pe scala gradat.

Balana analitic obinuit (Fg.10) este alctuit dintr-o prghie cu brae egale (1), sprijinit prin intermediul unui cuit (prism) de oel sau de agat pe o coloan vertical (2). La capetele prghiei sunt sprijinite cu ajutorul altor dou cuite (prisme) dou furci de care sunt

suspendate cele dou platane (3). Acestea sunt cuitele marginale (terminale). Muchiile de sprijin, att ale cuitului din centru, ct i ale celor dou marginale trebuie s e paralele i situate n acelai plan. La mijlocul prghiei se a un ac indicator (4) care se mic o dat cu prghia, prin faa unei scale gradate (5) xate pe coloana central. Balana este prevzut cu un dispozitiv de oprire (aretare) (6) prin care prghia balanei poate ridicat de pe cuite, pentru a nu se uza n timp cnd nu se lucreaz. Mecanismul de oprire se pune n funciune cu butonul (7) sau cu ajutorul unei bascule. Acest buton este situat sub placa de suport a balanei (8) sau lateral. Imaginea scalei este mrit prin intermediul unui sistem optic i proiectat pe un ecran de sticl mat (9). Rotirea butonului (10) servete la coborrea maselor etalonate (n form de inele) (11) pe o bar suport (12).

Balana este nchis ntr-o cutie cu perei de sticl i ui laterale, pentru a ferit de praf.

Cntrirea se efectueaz cu ajutorul unei serii de mase etaloane (greuti) care pot ataate direct la balan sau sunt pstrate ntr-o cutie special. Una din seriile de mase etalonate, des ntlnit, este compus din urmtoarele mase din alam nichelat: 100 50 20 10 5 2 2 1 g. Masele etalonate sub un gram sunt de: 500 200 100 50 20 10 mg.

Pentru masele de ordinul miligramelor i zecimilor de miligrame se folosesc indicaiile acului de pe scala gradat.

Balanele analitice se caracterizeaz prin sensibilitate, precizie i exactitate.

34 35

Sensibilitatea se exprim prin numrul de diviziuni de pe scal cu care se deplaseaz acul indicator la adugarea pe unul dintre platane a unei sarcini de un miligram sau prin numrul de miligrame ce corespund unei diviziuni de pe scala gradat. Dup valoarea sensibilitii, balanele analitice pot :

- macrobalane cu sensibilitate de 10 diviziuni /mg;- semimicrobalane cu sensibilitate de 100 diviziuni /mg;- microbalane cu sensibilitate de 1000 diviziuni /mg;- ultramicrobalane cu sensibilitate de 10000-100000 diviziuni/mg.

Precizia balanei analitice reprezint msura gradului reproductibilitii rezultatelor obinute la cntriri succesive ale aceluiai obiect. Cu ct rezultatele cntririlor repetate ale unui obiect difer mai puin ntre ele, cu att mai mare este precizia balanei.

Exactitatea balanei se caracterizeaz prin diferena dintre valoarea masei cntrite a unui obiect i valoarea ei adevrat.

Balanele analitice moderne sunt simple, uor de manevrat i permit o cntrire rapid. Exist balane analitice i cu un singur platan, la care masele etalonate sunt ncorporate la balan i manevrate din exterior prin intermediul unui mecanism, eliminndu-se complet cutia cu mase etalonate.

Reguli de cntrire. Utilizarea corect a balanei analitice necesit respectarea cu strictee a urmtoarelor reguli de cntrire: se controleaz dup lentila vizirului dac balana analitic este

aranjat strict orizontal; balana analitic trebuie s e perfect curat, fr urme de

praf; deschiderea i nchiderea balanei se fac ncet, fr manipulri

brute; naintea cntririi trebuie s se stabileasc i s se verice

punctul zero al balanei; obiectele sau substanele de cntrit se aeaz pe platanul din

stnga al balanei, iar masele etalonate pe cel din dreapta; balana analitic nu se ncarc niciodat peste sarcina maxim;

obiectele sau substanele ce se cntresc trebuie s aib temperatura ncperii n care se a amplasat balana;

balana analitic trebuie s e oprit n timpul ncrcrii sau descrcrii sale;

cntrirea se face cu uile nchise ale balanei; masele etalonate de ordinul gramelor se pstreaz n cutii

speciale; masele etalonate se manipuleaz numai cu penseta (gramele)

i cu ajutorul dispozitivului de manevrare a maselor etalonate (zecimile i sutimile de gram);

toate cntririle necesare n efectuarea unei anumite analize sau a unui grup de analize se execut la aceeai balan analitic i cu aceeai cutie de mase etalonate (greuti analitice).

Operaiile cntririi. Pentru a prepara soluii de diferite concentraii, se calculeaz cantitatea de substan necesar. Aceast cantitate se cntrete la balana tehnic n cazul preparrii soluiilor aproximative, sau la balana analitic n cazul preparrii de soluii etalon.

Cntririle la balana analitic implic urmtoarele operaii:- balana analitic se conecteaz la sursa de curent electric pentru

aprinderea becului ce lumineaz scala gradat n dreptul creia oscileaz un ac indicator;

- se deschide uor balana i se regleaz punctul zero: acul indicator trebuie s se opreasc n dreptul diviziunii zero de pe scala gradat (Fig. 11);

- obiectul sau substana de cntrit se aeaz pe platanul din stnga balanei;

- pe platanul din dreapta se pun mase etalonate (greuti) de ordinul gramelor i se adaug apoi mase etalonate sub form de inele (decigrame i centigrame), pn cnd se ajunge la echilibrare, adic deschiznd uor balana acul indicator se oprete n dreptul unei diviziuni de pe scala gradat (miligrame i zecimi de miligram).

36 37

-3-10 +10-2 -1 0 +1 +2 +3

Fig. 11. Scala balanei analitice.

De exemplu, dac pe platanul balanei au fost puse mase etalonate n valoare de 14 g, iar masele etalonate sub form de inele au valoarea de 5 decigrame i, respectiv, 6 centigrame, iar acul indicator s-a oprit pe scala gradat la diviziunea +8,2 mg, rezult c masa obiectului cntrit este de:

14 + 0,5 + 0,06 + 0,0082 = 14,5682 g.De obicei, se recomand efectuarea cntririi astfel nct acul

indicator s devieze n partea pozitiv a scalei.n cazul n care acul indicator se oprete n partea negativ a

scalei gradate, valoarea miligramelor i a zecimilor de miligram se scade din valoarea maselor folosite la echilibrare.

De exemplu, n cazul de mai sus, cnd 8,2 va n partea negativ (-), rezultatul cntririi va :

14 + 0,5 + 0,06 - 0,0082 = 14,5518 g.- dup terminarea cntririi, balana se descarc prin scoaterea

maselor etalonate n ordine descrescnd, precum i a obiectului cntrit;

- se veric punctul zero al balanei;- se ntrerupe alimentarea cu curent electric a balanei.

Dizolvarea substanelor pentru prepararea reactivilor Substana cntrit la balana analitic sau la balana tehnic, n funcie de precizia necesar, se aduce n soluie, efectundu-se urmtoarele operaii:

- sticla de ceas sau ola cu substana cntrit se ine deasupra unui pahar Berzelius n care substana se trece cantitativ (cu ajutorul apei distilate dintr-o piset);

- se agit uor prin micri circulare ale paharului sau cu o baghet de sticl, pn la completa dizolvare a substanei;

- cu ajutorul unei plnii, lichidul se transvazeaz ntr-un balon cotat, n cazul preparrii soluiilor etalon, sau ntr-un cilindru gradat, n cazul preparrii soluiilor aproximative;

- paharul se spal de cteva ori cu ap distilat, volumele de splare trecndu-se n balonul cotat sau n cilindrul gradat;

- se ndeprteaz plnia i, cu ajutorul pisetei sau al pipetei, se adaug ap distilat pn la cota balonului sau pn la o anumit diviziune a cilindrului;

- soluia din balonul cotat se omogenizeaz prin micri de rsturnare, dup nchiderea prealabil a balonului cu un dop rodat; soluia din cilindrul gradat se omogenizeaz cu ajutorul unei baghete de sticl;

- soluiile obinute se transvazeaz n sticle de reactivi adecvate, perfect curate, uscate i etichetate.

Msurarea volumelor de reactivi. n ansamblul analizelor cantitative, cntrirea i msurarea exact a volumelor de reactivi reprezint operaiile cele mai importante de care depinde precizia rezultatelor.

Pentru msurarea volumelor se utilizeaz diferite tipuri de vase din sticl riguros gradate, respectiv etalonate. Pentru msurarea exact a volumelor este necesar s se lucreze la temperatura la care s-a fcut etalonarea vaselor respective (de regul, 20C).

n Figura 12 sunt prezentate unele vase gradate ntrebuinate curent pentru msurarea volumelor.

Baloanele cotate sunt vase de sticl cu fund plat i gt alungit pe care se a marcat un semn circular denumit cot. Acest semn indic capacitatea balonului cotat, respectiv limita pn la care trebuie s se umple balonul. Pe corpul baloanelor cotate se a notat capacitatea i temperatura la care au fost etalonate.

Baloanele cotate au diferite capaciti: 10, 25, 50, 250, 500, 1000, 2000 cm3 (ml) i, uneori, sunt prevzute cu dopuri rodate pentru nchidere. Umplerea baloanelor cotate cu soluie se face pn la cot, astfel nct meniscul lichidului s e tangent la cota nscris pe balon.

38 39

Fig.12. Ustensile de msurat volume:a - biuret cu robinet;b - citirea corect la biuret sau la pipet cu evitarea erorii de paralax;c - cilindre gradate;d - pahar gradat (menzur);

e - baloane cotate;f - pipete gradate cu diviziuni;g - plnii de separare cu diviziuni;h - pipet cu bul;i dozator.

Baloanele cotate se utilizeaz pentru msurarea exact a volumelor, respectiv pentru prepararea soluiilor titrate.

Cilindrii gradai sunt vase cilindrice din sticl gradate n cm3 (ml) i fraciuni de ml. Volumul cilindrilor gradai variaz de la 1 la 2000 cm3. Pentru msurarea lichidelor volatile se folosesc cilindri prevzui cu dop rodat. Cilindrii gradai se utilizez numai pentru msurri aproximative de volum, avnd o precizie mai mic dect baloanele cotate. Volumul de lichid se msoar la diviziunea de pe cilindru care marcheaz acest volum, astfel ca meniscul lichidului s e tangent la diviziunea respectiv.

Pipetele reprezint tuburi de sticl elate la partea inferioar i sunt utilizate pentru msurarea exact a volumelor mici de soluie. Dup forma i modul de gradare, se deosebesc pipete cu bul i pipete gradate cu diviziuni.

Pipetele cu bul se caracterizeaz prin existena unei bule pe care sunt notate volumul i temperatura de etalonare. Ele sunt folosite pentru msurarea unor volume xe de lichid i nu prezint gradaii intermediare. Volumul maxim de umplere a pipetelor cu bul este indicat printr-o cot marcat cu un semn circular la partea superioar sau prin dou cote: una la partea superioar a bulei i alta la partea inferioar. Pipetele cu bul au capaciti diferite: 5; 10; 15; 20; 25; 50 i 100 cm3 (ml).

Pipetele gradate (sau normale) sunt utilizate i pentru msurarea unor volume de lichid mai mic dect cel total nscris pe pipet. Ele sunt gradate n cm3 (ml) i fraciuni de cm3 (chiar sutimi de cm3), permind astfel msurarea de volume intermediare. Pipetele gradate au capaciti: 1; 2; 5; 10; 20 i 25 cm3 (ml).

Micropipetele se folosesc pentru msurarea volumelor foarte mici de lichid, avnd capacitatea de 0,1 sau 0,2 cm3 (ml). Ele pot gradate n sutimi i miimi de cm3 i sunt, n general, utilizate pentru msurarea unor volume de lichid egale sau mai mici de 0,2 cm3.

Msurarea volumelor cu pipeta implic urmtoarele operaii:- se imerseaz vrful pipetei n lichid i se aspir pn cnd

lichidul depete gradaia dorit;

40 41

- se astup captul superior al pipetei cu degetul arttor;- innd pipeta n poziie vertical, se stabilete contactul cu degetul

arttor lsnd lichidul s curg uor pn cnd meniscul ajunge tangent la cot sau la diviziunea dorit; n acest moment, se astup imediat captul superior al pipetei cu degetul arttor;

- se terge vrful pipetei cu hrtie de ltru i se aduce vrful pipetei pe peretele interior al vasului n care se introduce volumul de lichid msurat cu pipeta;

- se ridic degetul arttor i se las s se scurg liber ntregul volum de lichid din pipet, sau numai o parte din aceasta, n funcie de volumul dorit a pipetat;

- msurarea volumelor se face prin meninerea pipetei n poziie vertical (nu oblic), iar citirea cotei (diviziunii) se face astfel ca orizontala tangentei la meniscul de lichid s e situat n dreptul ochilor observatorului (Fig. 12,b).

Biuretele sunt tuburi gradate de sticl cu ajutorul crora se msoar exact volumele de soluii utilizate ca reactivi n analiza volumetric. Biuretele sunt prevzute la partea inferioar elat cu un dispozitiv de scurgere, respectiv de nchidere. Acest dispozitiv poate un tub de cauciuc prevzut cu o bil de sticl sau cu o clem sau cu un robinet din sticl, care permite reglarea scurgerii lichidului din biuret.

Biuretele cu bil sau cu clem se folosesc n cazul soluiilor alcaline, iar cele cu robinet din sticl n cazul soluiilor acide.

n funcie de capacitatea lor, biuretele pot :- macrobiurete, cu capaciti de 25, 50 i 100 cm3, gradate n cm3

i fraciuni de cm3;- microbiurete cu capaciti de l, 2 i 5 cm3, gradate n zecimi i

sutimi de cm3. Dac se lucreaz cu soluii uor alterabile, se folosesc biurete cu umplere automat.

Msurarea volumelor de lichid cu biureta implic urmtoarele operaii:

- biureta se xeaz n poziie vertical cu ajutorul unui stativ i al unei cleme;

- biureta se umple cu lichid pe la partea superioar (deschis), astfel nct s e depit diviziunea zero sau alt gradaie considerat;

- din partea inferioar a biuretei se evacueaz aerul;- se las lichidul s se scurg prin picurare pn cnd meniscul

inferior al lichidului devine tangent la diviziunea zero sau la alt diviziune considerat, n cazul lichidelor incolore, iar pentru cele colorate pn cnd meniscul superior devine tangent la gradaia respectiv;

- msurarea volumelor cu ajutorul biuretei se face prin scurgerea lichidului cu vitez mic, treptat i n picturi, astfel nct erorile datorate aderenei lichidului la pereii biuretei s e minime.

Erori posibile la msurarea volumelor. Eroarea de picurare. Sfritul unei titrri este pus n eviden cu ajutorul unui indicator chimic, adic o substan care la punctul de echivalen i modic vizibil una din proprieti (culoarea, uorescena, turbiditatea etc.). Pentru aceast modicare este necesar o fraciune dintr-o pictur a reactivului volumetric. Practic, punctul nal al titrrii se nregistreaz dup adugarea unei picturi de reactiv n exces. Acest exces constituie eroarea de picurare.

Eroarea de scurgere. La scurgerea unei soluii printr-un tub, n funcie de tensiunea supercial, densitate, viscozitate i viteza de scurgere a lichidului, o cantitate de soluie ader pe suprafaa interioar a tubului. Aceast eroare de scurgere apare n cazul msurrii volumelor cu pipeta sau cu biureta.

Eroarea de citire. Modul de citire a cuplului menisc-gradaie are o mare importan. n acest sens, pot interveni dou erori de citire, care trebuie evitate pentru a nu afecta precizia rezultatelor: prima este eroarea de paralax, care se produce n cazul cnd, la citirea gradaiei, ochiul observatorului este situat deasupra sau sub orizontala tangentei la menisc. Pentru evitarea erorii de paralax, ochiul trebuie s se ae pe orizontala tangentei la menisc sau, dac biureta are gradaii

42 43

Fig.13. Instalaie pentru distilare simpl:1 - balon Wrtz;2 - dop;3 - termometru;

4 - refrigerent Liebich;5 - alonj;6 - balon Erlenmayer.

circulare, partea din fa a gradaiei trebuie s se suprapun peste partea din spate a acesteia; a doua eroare de citire se poate produce din cauza fenomenului de refracie a luminii la suprafaa lichidului.

Eroarea de temperatur. Ustensilele folosite pentru msurarea volumului (baloane cotate, pipete, biurete) sunt etalonate la o anumit temperatur (de obicei la 20C) stabilit convenional. Volumul soluiilor se modic n funcie de temperatura mediului ambiant. Dac soluia se prepar la o temperatur diferit de 20C, apare eroarea de temperatur.

Msurarea densitii lichidelor. Msurarea densitilor lichidelor se efectueaz cu ajutorul densimetrului (sinonim - areometru), iar densitatea solidelor poroase cu ajutorul picnometrului. Areometrul este un tub de sticl nchis la capete i gol n interior. n partea lui superioar se gsete o scal, iar n partea inferioar are un rezervor, umplut de obicei cu alice de plumb, din care cauz areometrul cufundat ntr-un lichid st n poziie vertical. Areometrul se gradeaz pentru o anumit temperatur indicat pe scal. Scala are diviziuni corespunztoare valorii greutilor specice. Folosind o serie de areometre, se poate determina repede greutatea specic a unui lichid.

n acest scop, lichidul care urmeaz a cercetat se toarn ntr-un cilindru ngust i uscat, cu capacitate de 100 - 250 ml, n care se introduce areometrul. n prealabil, lichidul se aduce la temperatura la care este etalonat areometrul.

Distilarea. Metoda se aplic la puricarea sau separarea substanelor lichide dintr-un sistem omogen sau eterogen lichid sau dintr-un sistem solid-lichid. Metoda se bazeaz pe diferena dintre presiunile de vapori ale componentelor sistemului, deci pe diferenele ce exist ntre punctele de erbere ale componentelor. n cazul n care diferena dintre punctele de erbere ale componentelor este mai mare de 20C, se poate utiliza metoda distilrii simple la presiune obinuit sau la presiune redus. Cnd aceast diferen este mult mai mic, se va aplica metoda distilrii fracionate. n procedeul distilrii fracionate, componentele se culeg separat, n funcie de temperatura la care se distileaz. Pentru puricare

fraciunile se redistileaz.Descrierea instalaiei. Instalaia de distilare (Fig.13) simpl

const dintr-un balon care conine sistemul sumativ supus distilrii (1), nchis la capt cu un dop (2), prin care trece un termometru (3). Balonul Wrtz este aezat pe o sit de metal i sprijinit cu un trepied i o clem de stativ. Utiliznd un dop perforat (n cazul cnd nu avem lif) se racordeaz balonul la un refrigerent descendent cu ap (4). La captul cellalt al refrigerentului se aplic o alonj (5), care se introduce n gura unui vas de culegere (6).

nclzirea se face la acra unui bec de gaz, iar rcirea cu ap de apeduct.

Procedeu experimental. Obinerea apei distilate i redistilate. n

44 45

Fig. 14. Instalaie pentru distilare n vid.a - balon Cleisen;b - balon Wrtz;c - tub de sticl capilar;

d - clem;e - vas de siguran.

balonul Wrtz se introduc 2/3 din capacitatea sa ap de apeduct, apoi se adaug cteva cristale de permanganat de potasiu (soluie roz) i cteva bucele de porelan poros pentru a uura erberea i a evita supranclzirea. Se adapteaz termometrul i refrigerentul i se ncepe nclzirea la acra becului de gaz. Distilatul se va culege ntr-un vas curat, iar refrigerentul se va spla bine nainte de montare.

Pentru a obine ap cu puritate mai ridicat, aceasta se va supune redistilrii, n urma creia se obine ap bidistilat.

Distilarea n vid. Sunt multe substane care nu se pot distila sub presiunea atmosferic din cauz c se descompun. Acest fel de substane se pot distila ns cu uurin sub presiune redus, fr s se descompun.

Coborrea punctului de erbere n vid este destul de important fa de punctul de erbere al acelorai substane la presiunea obinuit, De exemplu, acidul acetic, sub o presiune de 12 mm al coloanei de mercur, erbe la 19C n loc de 118C la presiune atmosferic.

Procedeu experimental pentru distilarea n vid. Cea mai simpl montare este urmtoarea (Fig.14): se ia un balon Cleisen sau un balon de fracionare a cu tubulur lateral lung, care se introduce pn aproape de fundul unui al doilea balon de fracionare b i se xeaz n gtul balonului a cu un dop de plut sau cauciuc.

n gtul primului balon de fracionare a se xeaz un dop cu dou gturi. Prin una din guri trece un termometru; prin a doua gaur un tub de sticl c tras n capilar la captul care ajunge pn aproape de fundul balonului a. La cellalt capt al acestui tub c este xat un tub de cauciuc scurt de civa cm i care se poate nchide prin turtire, cu ajutorul unei cleme cu urub d.

Tubulura lateral a balonului b se pune n legtur cu o tromp de ap care formeaz vid n interiorul aparaturii. ntre balonul b i tromp se intercaleaz un vas de siguran e care poate un vas de tromp conic cu tubulur lateral. Balonul b se rcete cu ap de la un robinet. Sub balonul b se aeaz o plnie de mrime potrivit, prin care se scurge ap. Tubul de scurgere al plniei se prelungete

cu un tub de cauciuc pn la chiuveta canalului.Baloanele de fracionare a i b trebuie s e de sticl rezistent

la presiune, iar dopurile i legturile s se nchid bine. Legturile se fac cu un tub de cauciuc cu perei groi, numite i tuburi de vid, pentru ca s nu se nchid prin turtire.

Rostul tubului c, elat n capilar, este de a putea introduce n balonul a, prin masa lichidului de distilat, un curent foarte mic de aer, pentru a uura erberea i pentru a nu se produce un vid prea naintat n aparat. Intrarea aerului n aparat se poate regla prin manipularea clemei cu urub d.

nainte de a ncepe nclzirea pentru distilare, se controleaz dac aparatul se nchide bine peste tot, fcnd vid.

La terminarea distilrii nu se desfac brusc legturile i nici nu se

46 47

Fig. 15. Instalaie pentru antrenare cu vapori:a - bidon cu ap pentru producerea vaporilor;b - tub de siguran (din sticl, ajunge pn aproape de fundul bidonului);c - tub de sticl (un capt se termin imediat sub dopul bidonului, iar cellalt la fundul balonului cu fund rotund, aezat nclinat);f - tub de legtur cu un refrigerent lung.

nchide trompa. Mai nti se desface treptat clema cu urub d pentru a lsa s intre ct mai mult aer, i numai dup aceea se desface legtura de la tromp. Se poate proceda i altfel: ntre vasul de siguran i tromp, pe tubul de cauciuc de legtur, xm o clem cu urub. Cnd vrem s ntrerupem operaia, strngem tubul de cauciuc cu clema, desfacem legtura cu trompa i apoi desurubm treptat clema, n aa fel ca aerul s intre n aparat ncetul cu ncetul. Dup aceste operaii, putem s desfacem diferitele pri ale aparatului fr nici un risc.

Pentru a putea ti, care este presiunea redus la care se face distilarea n vid, ntre balonul b i vasul de siguran e se intercaleaz un manometru cu mercur.

Atunci cnd trebuie s se separe mai multe substane prin distilare fracionat la vid, n locul balonului b se monteaz un aparat care conine nchise ntr-un vas cilindric mai multe eprubete ce pot aduse pe rnd n dreptul tubului de scurgere (refrigerent) printr-o micare de rotaie.

Antrenarea cu vapori. Sunt substane de natur biochimic, de exemplu uleiurile eterice, care prin volatilizare direct se descompun, dar care se volatilizeaz mult mai uor i fr s se descompun cnd n masa lor trece un curent de vapori de ap. Acest fel de substane se pot purica sau separa dintr-un amestec prin distilare sau antrenare cu vapori de ap.

Procedeu experimental pentru antrenarea cu vapori de ap. Aparatura necesar pentru antrenarea cu vapori de ap este urmtoarea: bidon cu ap, productor de vapori, un balon de sticl n care se pune amestecul de antrenat, un refrigerent model Liebich i un recipient (Fig.15). Vasul n care se produc vaporii este un bidon de tabl a n care se toarn ap pn la l/2. Gtul bidonului se astup cu un dop de plut strbtut de dou oricii. Prin unul trece un tub de sticl b de siguran care ajunge sub ap pn aproape de fundul bidonului; prin cealalt gaur trece un tub de sticl ndoit c. Un capt al acestuia se termin imediat sub dopul bidonului, iar cu cellalt capt se face legtura cu balonul n care este pus substana de antrenat.

Balonul d poate aezat nclinat, i prin dopul cu care se astup

trec dou tuburi de sticl. Unul e ajunge la un capt aproape de fundul balonului, iar cu cellalt capt, n afara dopului, se face legtura cu tubul c de la bidonul n care se produc vaporii. Legtura se face cu un tub de cauciuc. Al doilea tub f de la balon se termin imediat sub dop. Captul cellalt al acestui tub, ndoit n unghi ascuit, se unete cu un refrigerent Liebich la a crei ieire se ataeaz recipientul.

La nceputul operaiei se nclzete separat, att bidonul n care se produc vaporii, ct i balonul n care se a substana de antrenat. Cnd vaporii de ap se dezvolt constant din apa n erbere i lichidul din balon a fost sucient nclzit, se face legtura dintre

balon i bidon, lsnd totul n funciune ct este necesar.Cnd cantitatea substanei de antrenat este mic, nu se mai face

prenclzirea ei; n acest caz, vaporii de ap erbini se introduc direct n lichidul rece.

48 49

4. ETAPELE ANALIZEI BIOCHIMICECANTITATIVE

Analiza biochimic cantitativ necesit msurri exacte, deoarece, indiferent de metoda utilizat n analiz, rezultatele obinute trebuie s corespund valorilor determinate. Fiecare metod de analiza biochimic este constituit dintr-o suit de operaii (dizolvare, precipitare, ltrare, cntrire etc.) pentru efectuare a cror se folosete aparatur special, diferii reactivi.

4.1. Cunoaterea compoziiei biochimice a probei de analizatnainte de a efectua o analiz biochimic cantitativ este

necesar a cunoate compoziia biochimic a probei. Dac aceasta nu e cunoscut, primul pas l constituie analiza biochimic calitativ. Aceasta se execut prin metode clasice de analiz biochimic calitativ. Cele mai importante dintre ele au fost efectuate n cadrul lucrrilor de laborator la biochimia general [7].

4.2. Alegerea metodei de analizMetoda de analiz se alege n funcie de:

concentraia n care se gsete componentul analizei n prob (exemplu: cnd concentraia este de ordinul procentelor sau zecilor de procente analiza cantitativ clasic: gravimetrie sau volumetrie; dac componentul se gsete n urme metode zico-chimice);

proprietile zice i chimice ale componentului de analizat i ale celor nsoitoare (exemplu: dac formeaz compui greu solubili gravimetria; dac formeaz compui colorai spectrofotocolorimetria);

componena probei; exactitatea cerut; consideraii economice (la o investigaie cu un numr prea mare

de analize se vor consuma prea muli reactivi).

Alegerea metodei necesit un amplu proces de documentare, selectarea metodei optime, adaptarea ei pentru proba ce urmeaz a analizat i testarea metodei pe probe standard, asemntoare cu proba real.

4.3. Stabilirea mrimii probei de analizat i a numruluide probe paralele

Mrimea probei luate spre analiz depinde de concentraia componentului care urmeaz a dozat i de sensibilitatea metodei utilizate (reactivi, produi de reacie i aparatur).

Pentru prelucrarea statistic a rezultatelor obinute este necesar efectuarea analizelor cel puin n trei repetri.

4.4. Luarea probei

Aceasta este etapa care include cele mai mari erori, putndu-se ajunge chiar la denaturarea complet a rezultatelor. Proba care este supus analizei trebuie s e reprezentativ, adic s aib aceeai compoziie cu cea a materialului din care a fost extras. Uneori acest pas prezint cele mai dicile aspecte din tot procesul analitic.

Prelevarea probelor lichide se realizeaz cu ustensile i n recipieni curai, confecionai din materiale care nu interacioneaz cu componenii probei. Dac proba poate suferi transformri n timp, atunci analiza se efectueaz imediat sau proba se xeaz. Dac xarea duce la modicri ale compoziiei probei, atunci xarea se face n azot lichid sau se liolizeaz. Dac xarea duce la deshidratare, concomitent este necesar a determina umiditatea materialului.

Pentru lichidele omogene luarea probei nu ridic probleme deosebite. n cazul soluiilor, probele pentru analiza cantitativ au un volum mic, deoarece acestea prezint un grad ridicat de omogenitate pn la nivel molecular.

Dac sistemul cercetat nu este prea mare i este constituit din mai multe faze lichide, nainte de luarea probei materialul va omogenizat prin agitare.

50 51

n cazul n care sistemul este foarte mare (exemplu: parcel, cmp, lac, ru), probele vor luate din mai multe locuri i adncimi (proba medie). Probele se unesc, se usuc (cu acest prilej se determin umiditatea probei) i se macin n. n funcie de exactitatea cerut, de gradul de neomogenitate a materialului i de mrimea particulelor de la care ncepe s se manifeste neomogenitatea, masa probei poate varia ntre zecimi i sute de grame. Reducerea masei pn la nivel de grame sau i mai mic se poate realiza prin metoda sferturilor: dup o amestecare minuioas a probei, aceasta se turtete i se mparte n patru, se iau dou sferturi opuse i acest proces de reducere se continu pn se ajunge la cantitatea dorit.

4.5. Aducerea probei n soluien majoritatea cazurilor, analiza biochimic se realizeaz n

soluii apoase. Pentru aceasta este necesar transformarea probei solide n componeni solubili. Agentul de dizolvare potrivit se alege n funcie de natura probei i scopul urmrit.

n cazul n care este necesar pstrarea strii native a proteinelor i activitii enzimelor, aducerea probei n soluie se efectueaz n condiii blnde, n soluii tampon, la care pH-ul, compoziia i tria ionic sunt apropiate de cele ziologice, la temperaturi sczute i n timp redus.

n alte cazuri, aducerea probei n soluie se execut n condiii dure. De exemplu, pentru dozarea proteinelor dup coninutul de azot prin metoda Kjeldahl proba se dezintegreaz pe cale umed n acid sulfuric la erbere (340C). n aceste condiii, proba este dezintegrat pn la CO2 i H2O, iar azotul transformat n sulfat de amoniu.

Dezagregarea alcalin pe cale umed se utilizeaz n cazul analizei aminoacide a proteinelor pentru a putea doza triptofanul, serina i treonina, care n mediu acid se distrug. De regul, dezagregarea pe cale umed se realizeaz n sisteme nchise: vasul n care are loc acest proces (pahar Erlenmayer, Berzelius sau Kjeldahl) se acoper cu un refrigerent sau sticl de ceas, pentru a evita pierderile.

Aducerea probelor la sec ridic multe diculti condiionate de pierderile prin stropire, mai ales n ultima parte, cnd exist un volum mic de solvent; din acest motiv, evaporarea se realizeaz prin nclzire lent.

4.6. Eliminarea interferenelorInterferena reprezint o intensicare sau slbire a intensitii

prin suprapunerea a dou sau a mai multor efecte. Interferena este ntlnit n analizele biochimice n orice situaie n care proba conine specii ce mresc sau atenueaz semnalul componentului analizat. Exist dou modaliti de eliminare a interferenelor: utilizarea agenilor de mascare substane care interacioneaz

cu speciile interferente, transformndu-le n compui stabili care nu mai intervin la generarea semnalului;

ndeprtarea speciei interferente din sistemul analizat, apelndu-se la diverse tehnici de separare: precipitarea selectiv, extracia lichid-lichid, distilarea, metode cromatograce etc.

4.7. Analiza propriu-zisAnaliza propriu-zis de determinare a concentraiei (cantitii)

unui component se poate realiza: gravimetric componentul aat n soluie este transformat n

compus greu solubil, separat prin ltrare, uscat n termostat i cntrit la balana analitic. Masa componentului se determin inndu-se cont de factorul gravimetric;

volumetric componentului aat n soluie i se adaug, prin intermediul unei biurete, cantitatea echivalent necesar de reactiv aat ntr-o soluie de concentraie riguros determinat. Sfritul titrrii este pus n eviden cu ajutorul indicatorilor.

Determinri cantitative se mai pot realiza utiliznd metode zico-chimice, analiza cromatograc, analiza electroforetic. Ultimele sunt descrise n [6,7,23].

52 53

5. TRATAREA MATEMATIC A ANALIZEI BIOCHIMICE

La realizarea analizelor biochimice concur foarte muli factori, care pot introduce o serie de erori. Pentru a trage cele mai juste concluzii din rezultatele obinute n urma msurrilor analitice, necesare unei interpretri corecte a diverselor procese cercetate, biochimistul trebuie s nsueasc metodele adecvate pentru evaluarea datelor experimentale. Discuii detaliate asupra acestor ntrebri pot gsite n [4, 9, 15, 17, 20]. n cele ce urmeaz ne vom referi doar la unele noiuni strict necesare n analiza biochimic.

5.1. Clasicarea erorilor

La ecare etap de analiz biochimic pot comise erori, care fac ca rezultatul nal X al unei analize s difere de valoarea real A (sau X0). Diferena X = [X - A] este numit eroarea analizei, deci eroarea msurrii se numete devierea rezultatelor msurtorilor de la valoarea real a mrimii msurate.

Erorile se pot clasica avnd n vedere diferite criterii de clasicare. Astfel, dup cauzele care le produc, pot mprite n trei categorii:

- erori sistematice (determinate sau permanente);- erori ntmpltoare (accidentale sau temporare);- erori grobe (anormale).

Erorile sistematice au cauze permanente ce pot cunoscute. Cauzele ind permanente, erorile se repet n toate determinrile, astfel cauza poate descoperit i nlturat evitndu-se n felul acesta abaterea. O eroare sistematic determinat pentru metoda dat se va aduga sau se va scdea din rezultatul nal.

Din grupa erorilor sistematice fac parte: erorile care depind de metoda de analiz utilizat. Acestea

pot proveni: dintr-o anumit solubilitate a precipitatului;

datorit unor reacii care nu se produc practic total; din cauza unor reacii i fenomene zico-chimice secundare; datorit caracterului higroscopic al unor produi, atunci cnd pot precipita i ali ioni existeni n soluie; datorit pierderilor prin descompunere sau volatilizare la calcinare etc.;

erorile care depind de aparate i manipularea lor: aparate defecte, etalonarea greit a vaselor de msur i a aparatelor, necunoaterea manevrrii aparatelor etc.;

erori datorate impuricrii soluiilor prin atacarea materialului din care sunt confecionate vasele n care acestea sunt pstrate etc.;

erori care depind de tehnica executrii analizei: nerespectarea indicaiilor prevzute de metod, slaba calicare a operatorului etc.

Erorile ntmpltoare au cauze variabile, de aceea la msurri repetate se pot schimba att ca mrime, ct i ca semn. Ele nu pot apreciate din timp i apar datorit condiiilor specice n care se execut determinarea, ca: variaia factorilor mediului extern (uctuaii de temperatur, de presiune, de umiditate), datorit impuricrii accidentale, neateniei n timpul lucrului, vibraiilor n timpul citirii la aparate etc. Pentru estimarea erorilor ntmpltoare se folosete teoria probabilitilor, ale crei concluzii nu sunt absolut sigure, ci numai cele mai probabile.

Erorile grobe se datoresc unor abateri grave de la metodica determinrii sau unor greeli de calcul. Fiind puse n eviden, rezultatele eronate sunt nlturate.

Exactitate i precizie. n discuiile obinuite, termenii exactitate i precizie sunt folosii cu neles sinonim, atunci ns cnd aceti termeni sunt aplicai unor date tiinice este necesar s se fac distincie ntre ei. Un rezultat exact este acela care concord cu valoarea adevrat a mrimii msurate. Precizia se refer la concordana ntre rezultatele experimentale ale unui grup de msurtori. Valoarea erorilor sistematice determin gradul exactitii

54 55

rezultatului, iar valoarea erorilor ntmpltoare determin precizia lui. Cu ct sunt mai mici valorile erorilor sistematice, cu att este mai exact rezultatul i cu ct rezultatele mai multor determinri efectuate asupra aceleiai mrimi sunt mai apropiate ntre ele, cu att precizia este mai mare (rezultatele sunt reproductibile).

n analiza biochimic cantitativ se cere ca rezultatele prezentate s corespund valorilor reale ale mrimilor determinate i de aceea este necesar s e nlturate, pe ct e posibil, erorile ce intervin la efectuarea unei analize. Prezentarea unor rezultate ct mai apropiate de cele adevrate necesit corecii, care se bazeaz pe calculul statistic al erorilor.

Dup modul de exprimare, erorile pot absolute i relative.

5.2. Noiuni de statisticUnul dintre obiectivii principali ai tiinelor este acela de

a descoperi n cadrul fenomenelor complexe ale naturii legile dup care au loc aceste fenomene. Cunoaterea legilor permite cunoaterea legturilor dintre cauz i efect, iar aceasta se obine pe baza determinrilor experimentale.

Statistica tiina care, folosind calculul probabilitilor, se ocup cu studiul cantitativ al fenomenelor de mas, prezentate de elemente ce au anumite caracteristici comune. Statistica analizeaz i prelucreaz datele statistice (valorile asupra crora inueneaz o mulime de cauze, care constituie populaii de valori).

Populaia de valori reprezint o mulime (colectivitate, efectiv, ansamblu) innit de valori omogene din punct de vedere calitativ. Practic, pentru cunoaterea exact a populaiei ar trebui msurate toate elementele ce constituie populaia i calculai indicatorii statistici ai populaiei. n unele situaii, studierea ntregii populaii este dicil i chiar imposibil (populaii foarte numeroase, timp ndelungat necesar msurrii etc.). n astfel de cazuri studierea caracteristicilor comune ale elementelor unei populaii se poate efectua cu ajutorul unei probe extrase din populaie.

Proba (eantionul, mostra) este o parte din populaie care servete la studiul populaiei din care a fost extras. Desigur, proba nu poate indica totul despre populaia din care a provenit, ns d o anumit informaie asupra populaiei, materializat prin valorile unor mrimi care poart numele de indicatori (parametri) statistici ai probei. Indicatorii statistici ai probei sunt cu att mai apropiai de indicatorii statistici ai populaiei, cu ct proba este mai reprezentativ pentru populaie, adic este extras aleator (ntmpltor), i cu ct mai numeroas ea este.

5.2.1. Indicatorii statistici ai unui ir de determinri experimentale

S presupunem c, pentru determinarea valorii unei mrimi oarecare (X), care caracterizeaz elementele dintr-o populaie, s-a extras din populaia respectiv o prob format din n elemente (n

56 57

Parametrii (indicatorii) statistici ai unui ir de determinri experimentale se mpart n dou categorii:

- valorile tipice, care indic ordinul de mrime i tendina central a ansamblului de msurtori: medie, median i moda;

- indicii de dispersie, care arat gradul de mprtiere (dispersie, uctuaie) a valorilor obinute experimental fa de valoarea medie.

Dintre valorile tipice, n cercetrile cu caracter biologic se folosete mai des media aritmetic.

Media aritmetic simpl a probei ( X ) (se citete x barat este cel mai rspndit indice statistic) este valoarea cea mai probabil a mrimii msurate i se calculeaz astfel:

n

XXXXX n

.........321

sau dup formula:

n

iiXn

X1

1

unde: Xi sunt valorile mrimii determinate experimental, iar n este numrul elementelor din prob.

Diferena | X - Xi| = X este numit eroare absolut a unei determinri individuale.

Media aritmetic indic valoarea (tendina) central a ansamblului de msurri. Importana ei const n faptul c ea ine seama de toate valorile irului. n cazul irurilor cu volum mare, media aritmetic este destul de stabil. Ca orice indicator statistic, ea nu conine dect o parte din informaia cuprins n irul de valori, deoarece media aritmetic cuprinde ntr-un singur numr toate informaiile date de valorile determinate experimental. O lucrare care prezint numai media aritmetic a unui ir de determinri este incomplet, deoarece nu d o indicaie cu privire la gradul de dispersie a valorilor determinate fa de valoarea central.

5.2.2. Evaluarea gradului de dispersie a valorilor determinate

Dintre indicii de dispersie cei mai utilizai sunt:1. Abaterea (eroarea) parial a ecrei determinri (Xi).

Este diferena dintre valoarea din prob (Xi) i media aritmetic a probei ( X ) , adic:

.XXX ii

Abaterile pariale pot pozitive, negative sau nule. Pentru un numr n de determinri, suma algebric a tuturor abaterilor pariale este nul, abaterile pozitive compensndu-se cu cele negative, adic:

.01

n

iiX

2. Abaterea (eroarea) absolut (X). Pentru a calcula abaterea medie din abaterile pariale, trebuie adunate abaterile pariale, iar suma lor raportat la numrul determinrilor. Dar suma algebric a abaterilor pariale este nul, adic ar rezulta c abaterea (eroarea) medie este nul, ceea ce, evident, nu corespunde realitii. De aceea, pentru calculul abaterii medii se consider abaterile pariale n modul (valoare absolut). Media aritmetic a abaterilor pariale (n modul) se numete abatere (eroare) absolut a irului de msurtori i este dat de relaia:

Eroarea absolut X se mai numete i abatere medie sau eroare medie i uneori se noteaz prin D (deviaie).