Baza Genetica Moleculara in Talasemii

download Baza Genetica Moleculara in Talasemii

of 58

description

Baza Genetica Moleculara in Talasemii

Transcript of Baza Genetica Moleculara in Talasemii

  • BAZA GENETICAMOLECULARA ASINDROAMELOR

    TALASEMICE

    Asist. Univ. Dr. Rodica TALMACI2015

    BAZA GENETICAMOLECULARA ASINDROAMELOR

    TALASEMICE

    Asist. Univ. Dr. Rodica TALMACI2015

  • MoleculaMolecula dede hemoglobinhemoglobin esteeste unun tetramertetramer formatformat dindin 44 gruprigrupri hemicehemice(hem)(hem) ii globinaglobina constituitconstituit dindin 22 perechiperechi dede lanurilanuri polipeptidicepolipeptidice..PePe perioadaperioada dezvoltrii,dezvoltrii, lala omom sese sintetizeazsintetizeaz maimai multemulte tipuritipuri dede Hb,Hb,implicndimplicnd 66 tipuritipuri dede lanurilanuri polipeptidicepolipeptidice:: ,, ,, ,, ,, ,, ii ..MoleculeleMoleculele hemoglobinelorhemoglobinelor suntsunt constituiteconstituite dindin asociereaasocierea aa 22 lanurilanuri tiptip cucu::22 lanurilanuri nn hemoglobinahemoglobina AA (adult(adult major)major) 9696--9898%%22 lanurilanuri nn hemoglobinahemoglobina AA22 (adult(adult minor)minor) 11--33%%22 lanurilanuri nn hemoglobinahemoglobina FF (fetal)(fetal) 00,,55--11%%22 lanurilanuri nn hemoglobinahemoglobina EE (embrionar)(embrionar)

    HEMOGLOBINELE NORMALE

    Hemoglobina embrionar (HbE):Gower I - 22Portland - 22Gower II - 22

    Hemoglogina fetal (HbF) - 22Hemoglobina adult (HbA) - 22Hemoglobina 2 adult (HbA2) - 22

    Tipurile de lanuri globinice sintetizate ladiferite etape de dezvoltare

    Molecula tetramerica de Hb

  • InainteInainte dede natere,natere, cndcnd sintezasinteza catenelorcatenelor nceteaz,nceteaz, iariar locullocul dede sintezsintez aa HbHb sesedeplaseazdeplaseaz nn mduvamduva osoas,osoas, suntsuntsintetizatesintetizate catenelecatenele ii (Hb(Hb A)A)mpreunmpreun cucu ctevacteva polipeptidepolipeptide dede tiptip (Hb(Hb AA22))..

    HEMOGLOBINA ADULTA

    Locul de sintez a lanurilor globinice pe durata dezvoltrii

    HbA2 (22)

  • CECE SUNT SINDROAMELESUNT SINDROAMELE TALASEMITALASEMICECE ??Talasemiile reprezinta conditii genetice, caracterizate prin scaderea cantitatii dehemoglobina.Sediul hemoglobinei se afla in eritrocite. Daca hemoglobina este scazutaeritrocitele sunt mai mici si mai goale. Este ceea ce se numeste anemie hipocromasi microcitara.

  • HEMOGLOBINOPATII

    CANTITATIVE

    SINDROAMELE TALASEMICE

    CALITATIVE

    HEMOGLOBINE ANORMALE

  • Molecula integrala de hemoglobina este un tetramer 22.

    http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/chr11.html

    BAZA GENETICA MOLECULARA ABAZA GENETICA MOLECULARA ATALASEMIEITALASEMIEI

    Reprezentarea schematic a genelor globinice

    Mutatii produse in aceste gene determina aparitia talasemiilor. In prezent, in gena -globinei, se cunosc aproape 300 de mutaii ce determina transformarea in gene talasemice.

  • CLASIFICAREA GENETICA ACLASIFICAREA GENETICA ATALASEMIILORTALASEMIILOR

    IN FUNCTIE DE GENA AFECTATA:1. .-TALASEMIE

    2. .-TALASEMIE

    3. .-TALASEMIE

    4. .-TALASEMIE

    IN FUNCTIE DE GENA AFECTATA:1. .-TALASEMIE

    2. .-TALASEMIE

    3. .-TALASEMIE

    4. .-TALASEMIE

  • CE ESTECE ESTE --TALASEMIA ?TALASEMIA ?DEFECTE GENETICE IN GENELE -GLOBINICE PRODUC -TALASEMIA

    Cromozomii11

  • MUTATII CE DETERMINAMUTATII CE DETERMINA-- TALASEMIATALASEMIA

  • MUTATII IN PROMOTORUL GENEIMUTATII IN PROMOTORUL GENEI --GLOBINAGLOBINA

    ATAAAAATAAAA

    CCAATCCAAT

    CCACACCCCCACACCC

    CCTCACCCCCTCACCC--3131--7676--9393--108108 --globinaglobina

    CCAATCCAATCCTCACCCCCTCACCC

    G G CG

    GTT

    --globinaglobina

  • ARNmARNm

    ADNADN

    EROARE DE SPLICING IN GENA GLOBINEI:IVS I -110 situs acceptor nou

    ADNADNARNmARNm

    IVS1 +110 G>AIVS1 +110 G>A

  • FORMELE HETEROZIGOTEDE TALASEMIE:Talasemia minima/silentioasa ++/ NTalasemia minora +/N sau0/N

    MANIFESTARILE FENOTIPICE (CLINICE)MANIFESTARILE FENOTIPICE (CLINICE)ININ --TALASEMIETALASEMIE

    FORMELE HETEROZIGOTEDE TALASEMIE:Talasemia minima/silentioasa ++/ NTalasemia minora +/N sau0/N

    Cariotip normal, 46, XY

    FORMELE HOMOZIGOTE DETALASEMIE:Talasemia intermediara +/+ sau 0/+Talasemia major 0/0

  • HeterozigotHeterozigot compuscompus ==DubluDublu heterozigotheterozigot

    HeterozigotHeterozigot

    HomozigotHomozigot

    HeterozigotHeterozigot compuscompus ==DubluDublu heterozigotheterozigot

  • Daca ambii parinti sunt purtatoride gena -globinica defecta existariscul de 25% ca la fiecare sarcinasa se nasca un copil cu -talasemie majora sau anemieCooley.

  • CE ESTECE ESTE --TALASEMIA ?TALASEMIA ?

    Cromozomii16

    DEFECTE GENETICE IN GENELE -GLOBINICE PRODUC

    -TALASEMIA

    Daca o persoana are o singura gena -globinica defecta (din cele patru), aceasta nu va avea nici un fel de manifestareclinica. Aceasta situatie se numeste conditie de purtator silentios de -talasemie. Diagnosticul este pus numai prin testegenetice si este mai curand un diagnostic deductiv la o persoana aparent sanatoasa care are un copil cu -talasemie.Daca persoana are doua gene -globinice defecte, atunci diagnosticul va fi de -talasemie minora. De regula, nu existamanifestari clinice, iar in hemograma aceasta va avea o anemie usoara hipocroma microcitara. De obicei, pacientul estegresit diagnosticat cu anemie prin lipsa de fier. Diagnosticul corect implica mai multa experienta din partea hematologului,deoarece inclusiv electroforeza de hemoglobina este normala. Genele alfa defecte pot fi situate pe acelasi cromozom(pozitie cis) sau pe fiecare cromozom din pereche (pozitie trans). Daca un parinte are -talasemie minora cu genele defectein pozitie cis (situate pe acelasi cromozom), iar celalat parinte are conditia de purtator silentios (o singura gena estedefecta), exista riscul de 25% ca la fiecare sarcina sa se nasca un copil cu trei gene -talasemice defecte, adica boala HbH. Daca ambii parinti au -talasemie minora cu genele defecte in pozitie cis (pe acelasi cromozom) exista riscul de 25% cala fiecare sarcina sa apara -talasemia majora, in care toate genele -globinice sunt defecte, adica Hemoglobina Bart -Hidrops Fetalis si produsul de conceptie nu este viabil si va muri in uter.

  • DELETIIDELETII --TALASEMITALASEMICECE

  • Daca ambii parinti au -talasemieminora cu genele defecte inpozitie trans (pe cromozomidiferiti) copiii lor vor mosteni -talasemie minora.

  • Daca ambii parinti au -talasemieminora cu genele defecte in pozitie cis(pe acelasi cromozom) exista riscul de25% ca la fiecare sarcina sa apara -talasemia majora, in care toate genele-globinice sunt defecte, adicaHemoglobina Bart - Hidrops Fetalissi produsul de conceptie nu este viabilsi va muri in uter.

  • VARIANTE TALASEMICEVARIANTE TALASEMICE-TALASEMIAConditia de -talasemie rezulta prin reducerea sintezei lanturilor - si -globinice si se caracterizeazaprintr-o cantitate crescuta de Hb F, un nivel de Hb A2 normal sau scazut si un indice MCV scazut.Gena -globina, ce controleaza productia de lanturi - este localizata foarte aproape de gena - pecromozomul 11. Daca o gena este indepartata din cromozom in urma unei deletii, atunci si cealalta genapoate fi afectata. In functie de deletia produsa in cromozomi, se pot distinge: Macedonia Sicilia Lepore-talasemia homozigota este similaracu -talasemia, dar simptomele sunt maiusoare. Majoritatea pacientilor supravietuiescpana la viata adulta cu necesitati minime detransfuzie.-talasemia heterozigota este similara cu-talasemia minora, dar simptomele tind safie mai putin severe.

    -TALASEMIAConditia de -talasemie rezulta prin reducerea sintezei lanturilor - si -globinice si se caracterizeazaprintr-o cantitate crescuta de Hb F, un nivel de Hb A2 normal sau scazut si un indice MCV scazut.Gena -globina, ce controleaza productia de lanturi - este localizata foarte aproape de gena - pecromozomul 11. Daca o gena este indepartata din cromozom in urma unei deletii, atunci si cealalta genapoate fi afectata. In functie de deletia produsa in cromozomi, se pot distinge: Macedonia Sicilia Lepore-talasemia homozigota este similaracu -talasemia, dar simptomele sunt maiusoare. Majoritatea pacientilor supravietuiescpana la viata adulta cu necesitati minime detransfuzie.-talasemia heterozigota este similara cu-talasemia minora, dar simptomele tind safie mai putin severe.

    Hemoglobina LEPORE este un amestec in productia de lanturi non-. Capatul N-terminal al proteinei continesecventa aminoacidica a lantului -globinic, iar capatul C-terminal contine secventa aminoacidica a lantului -globinic. Exista mai multe variante de Hb Lepore, in functie de lungimea segmentelor fuzionate: Washington,Hollandia, Baltimore.In Hb Lepore homozigota nu exista productie normala de lanturi -globinice sau -globinice. Aspectele clinice sihemograma sunt identice cu cele de -talasemie majora.In Hb Lepore heterozigota aspectele clinice si de laborator sunt identice cu cele de -talasemie minora.

  • DIAGNOSTICUL MOLECULARDIAGNOSTICUL MOLECULAR

    IN TALASEMIIIN TALASEMII

  • PRINCIPALII INDICI HEMATOLOGICI IN -TALASEMIA HETEROZIGOTA

  • TESTELE DE GENETICA MOLECULARATESTELE DE GENETICA MOLECULARAIN TALASEMIEIN TALASEMIE

    STRATEGIA DE INVESTIGARE A MUTATIILOR TALASEMICE se refera la cautarea modificarilor

    produse in genele globinice normale ce au dus la transformarea lor in gene talasemice.

    -talasemiile si -talasemiile sunt consecinta unor deletii ale genelor globinice, in timp ce -talasemiile

    sunt produse ca rezultat al mutatiilor punctiforme aparute in ADN la nivelul acestor gene -globinice.

    In scopul identificarii mutatiilor -talasemice se procedeaza la urmatoarea etape:

    Recoltarea de sange periferic extractie ADN din sange amplificare prin PCR a genelor de investigat

    Prin metode de biologie moleculara se realizeaza identificarea mutatiilor produse la nivelul genelor de interes.

    Aceste metode ne indica exact mutatia produsa in gena studiata, fiind si metode de verificare, absolut necesare

    intr-un diagnostic molecular.

  • SINDROAMELE TALASEMICESINDROAMELE TALASEMICE

    -talasemie

    -talasemie

    -talasemie

    -talasemie

    -talasemie

    -globina

    -globina

    -talasemie

    -talasemie

    -talasemie

    -talasemie

    -talasemie

    -globina

    -,-globina

    -,-,-globina

  • EXTRACTIEEXTRACTIE

    ADNADN

    EXTRACTIEEXTRACTIE

    ADNADN

    gena de interes

    ADN genomiccelulanucleata

    SCHEMA DE REALIZARE ADIAGNOSTICULUI MOLECULAR

    gena de interes

    PCRPCRcucu primeriprimeri specificispecifici

    PCRPCRcucu primeriprimeri specificispecifici

    DETECTIEDETECTIEprinprin motodamotoda electroforeelectroforeticatica

    DETECTIEDETECTIEprinprin motodamotoda electroforeelectroforeticatica

    >106 copii>106 copii

  • EXTRACTIE ADNETAPE:

    1. Liza celulara

    2. Liza nucleara

    3. Deproteinizare

    4. Precipitare ADN

    5. Purificare ADN

    6. Obtinere ADN genomic concentrat, foarte pur

  • Replicarea ADNsemiconservativa

    PRINCIPIUL PCR(Polymerase Chain Reaction)

    Principul PCR: Sinteza unei regiuni ADN prinrefacerea structurii dublu catenare pe bazacomplementaritatii nucleotidelor:A (adenina) T (timina)G (guanina) C (citozina)

  • REACTIA DE POLIMERIZARE IN LANT PCR

    ADN genomic

    gena de interes

    http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/pcr.html

    3 ETAPE:3 ETAPE:

    20-30

    cicl

    uri

    1. Denaturare1. Denaturare 9090--9595ooCC 1 min1 min

    2. Alinierea primerilorAlinierea primerilor 5555--6565ooCC -- 0,5 min0,5 min

    3. PolimerizarePolimerizare 7272ooCC 2 min2 min

  • Amestec de reactie PCR:

    ADN (template) Amestec tampon PCR:

    Tris-HCl, KCl, (NH4)2SO4, MgCl2 Primer F (forward) Primer R (reverse) Nucleotide (dATP, dTTP,

    dGTP, dCTP) ADN polimeraza (Taq DNA

    polynerase)

    ADN (template) Amestec tampon PCR:

    Tris-HCl, KCl, (NH4)2SO4, MgCl2 Primer F (forward) Primer R (reverse) Nucleotide (dATP, dTTP,

    dGTP, dCTP) ADN polimeraza (Taq DNA

    polynerase)

  • PCRPCRPolymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction

  • AMPLIFICAREA EXPONENTIALA

  • DETECTIE PRIN ELECTROFOREZA INGEL DE AGAROZA

  • ToateToate genelegenele globiniceglobinice auau oo structurstructur similarsimilar..SecveneleSecvenele codificatoarecodificatoare sese aflafl nn 33 exoni,exoni,separaiseparai dede 22 introniintroni ..

    FiecareFiecare gengen deasemenea,deasemenea, areare secvenesecvenepromotoarepromotoare 55',', regiuniregiuni netranslatenetranslate 55''((55'' UTR)UTR) ii 33'' ((33'' UTR)UTR)..

    STRUCTURA GENELOR GLOBINICE

    Structura genei -globinei - secvena nucleotidic

  • METODE DE IDENTIFICARE AMETODE DE IDENTIFICARE AMUTATIILORMUTATIILOR --TALASEMICETALASEMICE

    ELECTROFOREZA IN GELELECTROFOREZA IN GELCU GRADIENT DECU GRADIENT DE

    DENATURARE (DGGE)DENATURARE (DGGE)

    Amplificare seriata afragmentelor -globinice:Fr.F, Fr.I, Fr.II, Fr.III, Fr.IV

    AMPLIFICARE SPECIFICAAMPLIFICARE SPECIFICAA ALELELOR MUTANTEA ALELELOR MUTANTE

    (ARMS(ARMS--PCR)PCR)

    ANALIZA SITUSULUI DEANALIZA SITUSULUI DERESTRICTIE IN FRAGMENTERESTRICTIE IN FRAGMENTE

    DE AMPLIFICARE PCRDE AMPLIFICARE PCR(PCR(PCR--RFLP)RFLP)

    Amplificarea fragmentelorgenice -globinice urmata

    de restrictie enzimatica

    Electroforezafragmentelor F, I, II, III, IVin gel de poliacrilamida

    Electroforeza in gel deagaroza

    Electroforeza in gel deagaroza

  • ELECTROFOREZA N GELCU GRADIENT DE

    DENATURARE (DGGE)

    Amplificare seriat afragmentelor -globinice:Fr.F, Fr.I, Fr.II, Fr.III, Fr.IV

    AMPLIFICARE SPECIFICA ALELELOR MUTANTE

    (ARMS-PCR)

    ANALIZA SITUSULUI DERESTRICIE N FRAGMENTE

    DE AMPLIFICARE PCR(PCR-RFLP)

    Amplificarea fragmentelorgenice -globinice urmat

    de restricie enzimatic

    METODE DE IDENTIFICARE A MUTAIILOR-TALASEMICE

    Electroforezafragmentelor F, I, II, III, IV

    n gel de poliacrilamid cugradient de denaturare

    Electroforeza n gel deagaroz

    Electroforeza n gel deagaroz

  • ELECTROFOREZA N GEL CUGRADIENT DENATURANT (DGGE)

    Scanarea intregii gene -globinice pentru identificarea mutatiilor

    Intr-o prima etapa se amplifica seriat 5 fragmentece compun intreaga gena -globinica

    In urmatoarea etapa se realizeaza electroforezafragmentelor amplificate in DGGE.

    In functie de modelul electroforetic obtinut avem informatiadespre prezenta sau absenta unei mutatii in fragmentulanalizat si locul genic al mutatiei.Daca utilizam probe control, prin compararea modelelorelectroforetice, obtinem informatia privind mutatia exacta.

  • DGGEGena -globinei a fost mprit n 5fragmente diferite (Fr. F, Fr. I, Fr. II,Fr. III, Fr. IV), ce acoper ntreagaregiunea de codificare i secveelede flancare 5' i 3'.

    Fragmentele de amplificare din gena -globinei pentruelectroforeza n gel cu gradient denaturant. Poriunilenegre reprezint exonii, iar poriunile albe intronii. 5UTR i 3 UTR regiunile netranslate 5 i 3

    350 pb

    Fr. F

    cd 2/N -87/N N/N +20/N N/N +20/N +20/+20 cd2/N -101/N N/N N/N -87/N N/N

    cd 2/N -87/N N/N cd2/N +20/N N/N N/N -101/N N/N cd2/N cd2/N cd2/N cd2/cd2 N/N

    Fr. F

    Fragmentele de amplificare din gena -globinei pentruelectroforeza n gel cu gradient denaturant. Poriunilenegre reprezint exonii, iar poriunile albe intronii. 5UTR i 3 UTR regiunile netranslate 5 i 3

    Cele mai frecvente mutaii identificate n fragmentul F:Mutatia 87 (C-G) - ++Polimorfismul +20 (C-T) lincat cu mutaia IVS II-745 (C-G) - +Polimorfismul cd2 (C-T)

  • DGGE

    Fragmentele de amplificare din gena -globinei pentruelectroforeza n gel cu gradient denaturant. Poriunilenegre reprezint exonii, iar poriunile albe intronii. 5UTR i 3 UTR regiunile netranslate 5 i 3.

    250 pb

    N/N +20/+20 cd 6/N N/N +20/N N/N + 20/N N/N cd 2/N N/N cd 5/N

    Fr.I

    +20/+20 +20/N cd 2/N cd2/N N/N cd2/N cd6/N

    Fr. I

    Fragmentele de amplificare din gena -globinei pentruelectroforeza n gel cu gradient denaturant. Poriunilenegre reprezint exonii, iar poriunile albe intronii. 5UTR i 3 UTR regiunile netranslate 5 i 3.

    Cele mai frecvente mutaii identificate in fragmentul I:cd 6 (-A) - 0Polimorfismul +20 (C-T) lincat cu mutaia IVS II-745 (C-G) - +Polimorfismul cd 2 (C-T)

  • DGGE

    Fragmentele de amplificare din gena -globinei pentruelectroforeza n gel cu gradient denaturant. Poriunilenegre reprezint exonii, iar poriunile albe intronii. 5UTR i 3 UTR regiunile netranslate 5 i 3

    370 pb

    Cele mai frecvente mutatii identificate infragmentul II:IVS I-1 (G-A) - 0IVS I-6 (T-C) - +IVS I-110 (G-A) - +cd 39 (C-T) - +

    Cd 39/N N/N cd 39/N N/N IVS I-1/N IVS I-1/N

    Fr. II

    IVS I-110/N N/N IVS I-110/ cd39/N IVS I-110/N IVS I-6/N cd 39/N

    IVS I-110

    Fr. II

    Cele mai frecvente mutatii identificate infragmentul II:IVS I-1 (G-A) - 0IVS I-6 (T-C) - +IVS I-110 (G-A) - +cd 39 (C-T) - +

    IVS I-110/N N/N N/N cd 39/N N/N IVS I-110/N

    Fr. II

  • DGGE

    Fragmentele de amplificare din gena -globinei pentruelectroforeza n gel cu gradient denaturant. Poriunilenegre reprezint exonii, iar poriunile albe intronii. 5UTR i 3 UTR regiunile netranslate 5 i 3.

    420 pb

    300 pb

    Fragmentele de amplificare din gena -globinei pentruelectroforeza n gel cu gradient denaturant. Poriunilenegre reprezint exonii, iar poriunile albe intronii. 5UTR i 3 UTR regiunile netranslate 5 i 3.

    Poli A cd+6/N poli A

    (+1480)

    Fr. IV

    Cele mai frecvente mutatii produse in fragmnetul IV:

    mutaia n semnalul de poliadenilare (AATAAA-AATGAA) - +

    mutatia +1480 (C-G) - +

  • ELECTROFOREZA N GELCU GRADIENT DE

    DENATURARE (DGGE)

    Amplificare seriat afragmentelor -globinice:Fr.F, Fr.I, Fr.II, Fr.III, Fr.IV

    AMPLIFICAREA SELECTIVA ALELELOR MUTANTE

    (ARMS-PCR)

    ANALIZA SITUSULUI DERESTRICIE N FRAGMENTE

    DE AMPLIFICARE PCR(PCR-RFLP)

    Amplificarea fragmentelorgenice -globinice urmat

    de restricie enzimatic

    METODE DE ANALIZ A MUTAIILOR-TALASEMICE

    Electroforezafragmentelor F, I, II, III, IV

    n gel de poliacrilamid cugradient de denaturare

    Electroforeza n gel deagaroz

    Electroforeza n gel deagaroz

  • AMPLIFICAREA SELECTIV AALELELOR SPECIFICE

    Metoda se aplica pentru identificarea mutaiilor punctiforme cunoscute. In amplificarea PCR seutilizeaza un primer care prezinta aceeasi secventa de nucleotide cu ADN matrita, cu exceptianucleotidului terminal 3. Acesta este complementar cu nucleotidul modificat prin mutatie.Taq-polimeraza necesita o complementaritate perfecta a primerului la capatul 3' pentru a putea realizapolimerizarea.Astfel, alela dorita este intens amplificata. In cazul neamplificarii rezultatul este nepotrivirea dintreADN matrita si oligonucleotidul primer.Pentru a confirma aceasta conditie, in amestecul de reactie se introduc 2 primeri control careamplifica un fragment de alta dimensiune.

    Banda control de861 pb

    Banda specificmutaiei IVS I-110 de 390 pb

    Mutatia IVS I-110 (G-A)

  • ELECTROFOREZA N GELCU GRADIENT DE

    DENATURARE (DGGE)

    Amplificare seriat afragmentelor -globinice:Fr.F, Fr.I, Fr.II, Fr.III, Fr.IV

    AMPLIFICAREA SELECTIVA ALELELOR MUTANTE

    (ARMS-PCR)

    ANALIZA SITUSULUI DERESTRICIE N FRAGMENTE

    DE AMPLIFICARE PCR(PCR-RFLP)

    Amplificarea fragmentelorgenice -globinice urmat

    de restricie enzimatic

    METODE DE ANALIZ A MUTAIILOR-TALASEMICE

    Electroforezafragmentelor F, I, II, III, IV

    n gel de poliacrilamid cugradient de denaturare

    Electroforeza n gel deagaroz

    Electroforeza n gel deagaroz

  • ENZIME DERESTICTIE

    EcoRI (Escherichia coli)

  • ANALIZA SITUSULUI DE RESTRICIEANALIZA SITUSULUI DE RESTRICIEPRIN METODA PCRPRIN METODA PCR -- RFLPRFLP

    Unele mutaii punctiforme potcrea sau desfiina un situs derestricie n secvena ADN.Aceste mutatii pot fiidentificate prin analizasitusului de restricie.

    Prin stabilirea polimorfismului lungimii fragmentelor de restrictie ne damseama daca s-a produs mutatia cautata.

  • SECVENTIEREA ADNSECVENTIEREA ADNMetoda prin care se poate afla secventa in baze azotate a unuifragment ADN de interes

  • REAL TIME PCRREAL TIME PCR

  • REAL TIME PCR GENOTYPING

    Detectie prin metoda

    Melting Curve Analysis

    IVS I-110 mutation

  • IDENTIFICAREA DELEIILORIDENTIFICAREA DELEIILOR -- SiSi --TALASEMICETALASEMICE GENICE GLOBINICE PRINGENICE GLOBINICE PRIN

    METODA GAPMETODA GAP--PCRPCRMetoda GAP-PCR se aplica inidentificarea deletiilor genice mari.Metoda se bazeaza pe tehnica deamplificare PCR cu 3 primeri specificipentru fiecare deletie. Acestia suntutilizati in aceeasi reactie deamplificare, conducand la amplificareaunui singur produs specific deletiei sio banda control, de marime diferita,corespunzatoare alelei normale.

    Metoda GAP-PCR se aplica inidentificarea deletiilor genice mari.Metoda se bazeaza pe tehnica deamplificare PCR cu 3 primeri specificipentru fiecare deletie. Acestia suntutilizati in aceeasi reactie deamplificare, conducand la amplificareaunui singur produs specific deletiei sio banda control, de marime diferita,corespunzatoare alelei normale.

    0 MED-I (17,5 kb) / +(3.7kb) = Boala Hb H

    -talasemia

    MED-I/ MED-I/ 20,5/ MED-I/ 20,5/

    deleia Macedonia (11,5 kb)-talasemia

  • STUDIUL TALASEMIEI IN ROMANIASTUDIUL TALASEMIEI IN ROMANIASPECTRUL MUTATIILOR -TALASEMICE IDENTIFICATE

    IN ROMANIA

    -talasemia MED/N 3.7/N

    0 MED-I (17,5 kb) / +(3.7 kb) = Boala Hb H/N

    -talasemiadeleia Macedonia (11,5 kb)

    deleia Lepore

  • O NOUA MUTATIE IN SITUSUL CAPAL GENEI -GLOBINEI - MUTATIA

    CAP+3 (A-T)

  • Probele de material fetal se obtin prinAMNIOCENTEZA sau prelevare de probedin VILOZITATILE CORIALE. Ambele pot fiefectuate numai in centre specializate subcontrol ecografic.Amniocenteza se efectueaza dupasaptamana a 15-a de sarcina prin recoltareade 10-15 ml de lichid amniotic.Biopsia din vilozitatile coriale se poateefectua in saptamana 10-12 de sarcina prinrecoltare de fragmente foarte mici de tesutcu origine fetala.

    TESTAREA PRENATALA PENTRUTESTAREA PRENATALA PENTRUTALASEMIETALASEMIE

    Pentru cuplurile la care diagnosticul detalasemie minora a fost pus la ambii parinti,dupa ce partenera a ramas insarcinata, serecomanda efectuarea testelor de geneticamoleculara la fat pentru a identifica prezentamutatiilor talasemice.

    Probele de material fetal se obtin prinAMNIOCENTEZA sau prelevare de probedin VILOZITATILE CORIALE. Ambele pot fiefectuate numai in centre specializate subcontrol ecografic.Amniocenteza se efectueaza dupasaptamana a 15-a de sarcina prin recoltareade 10-15 ml de lichid amniotic.Biopsia din vilozitatile coriale se poateefectua in saptamana 10-12 de sarcina prinrecoltare de fragmente foarte mici de tesutcu origine fetala.

    ADNul extras din lichid amniotic sau vilozitati corialeeste analizat prin metodele moleculare pentruidentificare i caracterizare de mutaii -talasemiceprezente n genotip.Prin aceste metode se stabileste diagnosticul dehomozigot (bolnav) sau heterozigot (purtator) al -talasemiei, se identifica mutatia exacta prezenta la fatsi se anticipeaza fenotipul sau.

    ANALIZA ADN

    Pentru cuplurile la care diagnosticul detalasemie minora a fost pus la ambii parinti,dupa ce partenera a ramas insarcinata, serecomanda efectuarea testelor de geneticamoleculara la fat pentru a identifica prezentamutatiilor talasemice.

  • PRIMUL CAZPRIMUL CAZ

    Fragmente de amplificare din gena -globinei pentruelectroforeza in gel cu gradient denaturant.

    250 pb

    SCANAREA GENICA PENTRU IDENTIFICARE DE MUTATII

    Fragmentele de amplificare din gena -globinei pentruelectroforeza in gel cu gradient denaturant.

    370 pb

    Fragmente de amplificare din gena -globinei pentruelectroforeza in gel cu gradient denaturant.

    Pattern-uri DGGE in fragmentul I.

    1-ADN mama (N), 2-ADN tata (pozitiv), 3-ADN bunic (pozitiv), 4-ADN fetal pozitivpentru mutatia IVS II-745 (C-G), 5-ADNbunica (N).

    Fragmentele de amplificare din gena -globinei pentruelectroforeza in gel cu gradient denaturant.

    Pattern-uri DGGE in fragmentul II.

    1-ADN bunica (N),2, 3-ADN fetal pozitiv pentru mutatia IVS I-110 (G-A),4-ADN mama (pozitiv),5-ADN control negativ.

    Allela IVS II-745

    Alela Normala

    Allela IVS I-110

    Alela Normala

  • REZULTATEREZULTATE

    GENOTIP FENOTIPFETUS Homozigot IVS I-110

    (G-A) / IVS II-745 (C-G).+/ +

    MAMA heterozigot IVS I-110 (G-A) / N

    .+/ A

    TATAL heterozigot IVS II-745(C-G) / N

    .+/ A

    BUNICUL PATERN heterozigot IVS II-745(C-G) / N

    .+/ A

    BUNICA PATERNA Normal .A/ A

  • AL DOILEA CAZAL DOILEA CAZ

    Fragmente de amplificare din gena -globinei pentruelectroforeza in gel cu gradient denaturant.

    250 pb Pattern-uri DGGE in fragmentul I.1-ADN control negativ,

    2-ADN fetal din proba de lichid amniotic (pozitiv-contaminare),

    3-ADN control pozitiv pentru polimorfism cd 2 instare heterozigota,

    4-ADN mama (pozitiv pentru mutatia cd 8 (-AA +polimorfism cd 2 in trans),

    5-ADN fetal din proba CVS, pozitiv pentru mutatia cd8 (-AA) in stare homozigota,

    6-ADN tata (pozitiv pentru mutatia cd 8 (-AA) in stareheterozigota,

    7-ADN control pozitiv pentru mutatia cd 8 (-AA) instare heterozigota,

    8-AND control pozitiv pentru mutatia cd 8 (-AA) instare homozigota.

    SCANAREA GENICA PENTRU IDENTIFICARE DE MUTATII

    Fragmente de amplificare din gena -globinei pentruelectroforeza in gel cu gradient denaturant.

    Pattern-uri DGGE in fragmentul I.1-ADN control negativ,

    2-ADN fetal din proba de lichid amniotic (pozitiv-contaminare),

    3-ADN control pozitiv pentru polimorfism cd 2 instare heterozigota,

    4-ADN mama (pozitiv pentru mutatia cd 8 (-AA +polimorfism cd 2 in trans),

    5-ADN fetal din proba CVS, pozitiv pentru mutatia cd8 (-AA) in stare homozigota,

    6-ADN tata (pozitiv pentru mutatia cd 8 (-AA) in stareheterozigota,

    7-ADN control pozitiv pentru mutatia cd 8 (-AA) instare heterozigota,

    8-AND control pozitiv pentru mutatia cd 8 (-AA) instare homozigota.

    Alela normala

    Alela -talasemicacd 8 (-AA)

  • REZULTATEREZULTATE

    GENOTIP FENOTIP

    FETUS Homozigot cd 8 (-AA) /cd 8 (-AA)

    .0/ 0

    MAMA heterozigot cd 8 (-AA)/ N .0/ A

    TATA heterozigot cd 8 (-AA)/ N .0/ A

  • RESULTSRESULTS

    GENOTYPE PHENOTYPEFETUS Homozygot IVS I-110 (G-A) / IVS II-745 (C-G) .+/ +

    MOTHER heterozygot IVS I-110 (G-A) / N .+/ A

    FATHER heterozygot IVS II-745 (C-G) / N .+/ A

    FETUS Homozygot CD 8 (-AA) / CD 8 (-AA) .0/0

    MOTHER heterozygot CD 8 (-AA)/N .0/A

    FATHER heterozygot CD 8 (-AA)/N .0/A

    FETUS Homozygot IVS I-110 (G-A) / IVS II-745 (C-G) .+/ 0

    MOTHER Heterozygot IVS II-745 (C-G) / N .+/ A

    FATHER Heterozygot IVS I-110 (G-A) / N .0/ A