Asocieri inovative de fitocompusi ai -...

15
Asocieri inovative de fitocompusi ai speciilor de Solanum si Camelina sativa cu eficacitate dermo-epidermica demonstrata la nivel celular si molecular PROIECT 21 PTE BIOCAMISOL

Transcript of Asocieri inovative de fitocompusi ai -...

Page 1: Asocieri inovative de fitocompusi ai - biotehnos.robiotehnos.ro/biocamisol/wp-content/uploads/2018/09/Workshop-Asocieri... · Complementaritatea efectelor descrise de literatura de

Asocieri inovative de fitocompusi ai speciilor de Solanum si Camelina sativa cu

eficacitate dermo-epidermica demonstrata la nivel celular si molecular

PROIECT 21 PTE – BIOCAMISOL

Page 2: Asocieri inovative de fitocompusi ai - biotehnos.robiotehnos.ro/biocamisol/wp-content/uploads/2018/09/Workshop-Asocieri... · Complementaritatea efectelor descrise de literatura de

Complementaritatea efectelor descrise de literatura de specialitate pentru uleiul de camelina (proprietati emoliente, antioxidante, antiinflamatoare, hidratante si regeneratoare) si glicoalcaloizii steroidici (actiune ambivalenta antifungica, antimicrobiana, insecticida, pe de-o parte si antiproliferativa si antiinflamatoare pe de alta) a dus la ideea asocierii celor doua preparate, in scopul obtinerii unor prototipuri cu aplicatie directionata in agricultura, respectiv terapeutica medicala.

CONCEPT

Page 3: Asocieri inovative de fitocompusi ai - biotehnos.robiotehnos.ro/biocamisol/wp-content/uploads/2018/09/Workshop-Asocieri... · Complementaritatea efectelor descrise de literatura de

MECANISME CELULARE SI MOLECULARE RELEVANTE PENTRU TESTAREA PRINCIPIILOR ACTIVE LA NIVEL DERMO-EPIDERMIC

Tinta terapeutica: REGENERARE TISULARA SI INHIBAREA PROCESELOR INFLAMATORII

•la nivel de epiderm, primul strat cu funcţie de barieră a pielii (keratinocite) – inflamaţie, stress oxidativ, diferentiere epidermala si turn-over celular; • la nivel de derm, - status proliferativ, sinteza proteinelor din matrixul extracelular (colagen), inflamaţie, stress oxidativ, turn-over celular; •la nivel de endoteliu vascular, cu rol major în homeostazia pielii prin furnizarea de oxigen, nutrienţi şi hormoni (celule endoteliale umane) – inflamaţie, stress oxidativ.

SCREENING DE EFICACITATE PENTRU FITOCOMPUSI DIN SOLANUM SI CAMELINA

SCREENING DE CITOTOXICITATE PENTRU FITOCOMPUSI DIN SOLANUM SI CAMELINA, cu relevanta cutanata

Evaluarea activitatii metabolice corelativ cu eliberarea LDH (lactat dehidrogenazei) ca indicator de stress citotoxic pe culturi celulare de keratinocit, fibroblast si endoteliu vascular

Page 4: Asocieri inovative de fitocompusi ai - biotehnos.robiotehnos.ro/biocamisol/wp-content/uploads/2018/09/Workshop-Asocieri... · Complementaritatea efectelor descrise de literatura de

MATERIAL BIOLOGIC

• epiderm – reprezentat in modele experimentale de linia celulara standardizata HaCaT – celule imortalizate, cu potential de diferentiere dependent de calciu

•derm - reprezentat in modele experimentale de linia celulara standardizata HS27 – fibroblast dermic uman, pasaj 35-42 •endoteliu vascular - reprezentat in modele experimentale de linia celulara standardizata HUVEC – celule primare endoteliale umane din vena ombilicala COMPUSI BIOACTIVI

•GLY- glicoalcaloizi steroidici extrasi, purificati si standardizati din deseu vegetal Solanum sp. •Cam – ulei de camelina extras la rece din Camelina sativa soiul Madalina, cultura ecologica •Asocieri GLY/CAM in diferite proportii

Stimuli pro-inflamatori

•LPS- lipopolizaharid din Escherichia coli – mimarea atacului bacterian / fungic la nivel cutanat •TNFalfa –inductor al inflamatiei sistemice nespecifice

Page 5: Asocieri inovative de fitocompusi ai - biotehnos.robiotehnos.ro/biocamisol/wp-content/uploads/2018/09/Workshop-Asocieri... · Complementaritatea efectelor descrise de literatura de

IMPACT CITOTOXIC MINIM PENTRU FITOCOMPUSI DIN SOLANUM SI CAMELINA

Page 6: Asocieri inovative de fitocompusi ai - biotehnos.robiotehnos.ro/biocamisol/wp-content/uploads/2018/09/Workshop-Asocieri... · Complementaritatea efectelor descrise de literatura de

IMPACT CITOTOXIC MINIM PENTRU FITOCOMPUSI DIN SOLANUM SI CAMELINA asociati

Cresterea concentratiei de ulei de camelina in combinatiile de fitocompusi reduce limita de citotoxicitate

Page 7: Asocieri inovative de fitocompusi ai - biotehnos.robiotehnos.ro/biocamisol/wp-content/uploads/2018/09/Workshop-Asocieri... · Complementaritatea efectelor descrise de literatura de

EFECT antiinflamator semnificativ al GLY pe KERATINOCITE si FIBROBLASTI – exprimat prin inhibarea citokinelor proinflamatorii IL6 si IL8

linia celulara HaCaT

linia celulara HS27

Efectul GLY la doze mari (1-4μg/ml) il recomanda ca antiinflamator semnificativ, prin reducerea drastica a citokinelor IL6 si IL8 atat la keratinocite, cat si fibroblasti

Complexul Cam are un rol complementar, acela de a reface vasculatura dermica in cadrul procesului de regenerare tisulara, sugerat de stimularea factorului pro-angiogenic VEGF.

Efectele au fost confirmate si prin studii PCR de modulare la nivel genic a mediatorilor de inflamatie IL6 si IL8

Page 8: Asocieri inovative de fitocompusi ai - biotehnos.robiotehnos.ro/biocamisol/wp-content/uploads/2018/09/Workshop-Asocieri... · Complementaritatea efectelor descrise de literatura de

Efect antiinflamator endotelial la nivel de expresie a moleculelor de adeziune ICAM si VCAM

In procesul de inflamatie la nivel vascular, celulele endoteliale sunt activate si exprima molecule cu rol in adeziunea monocitelor la endoteliu: VCAM-1 SI ICAM-1. Desi expresia ambelor molecule este crescuta in inflamatie, VCAM-1 are un rol predominant in initierea acestui proces. ICAM -1 este exprimat cu preponderenta in microvasculatura.

In cazul stimularii cu LPS (mimare atac bacterian) cele mai active componente antiinflamatoare pe vase sanguine mici sunt Gly 50ng/ml si combinatia A1, iar pe vase de sange mari Cam 0.04%. In cazul stimularii nespecifice cu TNF alfa, toate componentele testate reduc expresia VCAM (molecula de adeziune endoteliu-monocit specifica vaselor mari), precum si expresia ICAM caracteristica microvasculaturii, cu exceptia combinatiei A4.

Page 9: Asocieri inovative de fitocompusi ai - biotehnos.robiotehnos.ro/biocamisol/wp-content/uploads/2018/09/Workshop-Asocieri... · Complementaritatea efectelor descrise de literatura de

Efect antioxidant intracelular prin monitorizarea speciilor de oxigen reactive (peroxid de hidrogen si anion superoxid) – marcare cu DCFH-DA, respectiv HE – citometrie in flux

Compusii Gly, Cam si variantele de asociere A1, A2, A3 reduc radicalii liberi oxigenati prezenti intracelular ca urmare a stimularii pro-inflamatorii, atat sistemica (TNFα), cat si bacteriana (LPS). A4 se remarca in inflamatia bacteriana in reducerea O2

-

Linie endoteliala HUVEC

Page 10: Asocieri inovative de fitocompusi ai - biotehnos.robiotehnos.ro/biocamisol/wp-content/uploads/2018/09/Workshop-Asocieri... · Complementaritatea efectelor descrise de literatura de

Efect antioxidant intracelular prin monitorizarea speciilor de oxigen reactive (peroxid de hidrogen si anion superoxid) – marcare cu DCFH-DA, respectiv HE – citometrie in flux

Linia HS27 – fibroblasti dermici

Page 11: Asocieri inovative de fitocompusi ai - biotehnos.robiotehnos.ro/biocamisol/wp-content/uploads/2018/09/Workshop-Asocieri... · Complementaritatea efectelor descrise de literatura de

Efect antioxidant intracelular prin monitorizarea speciilor de oxigen reactive (peroxid de hidrogen si anion superoxid) – marcare cu DCFH-DA, respectiv HE – citometrie in flux

Linia HaCaT – keratinocit uman imortalizat

Page 12: Asocieri inovative de fitocompusi ai - biotehnos.robiotehnos.ro/biocamisol/wp-content/uploads/2018/09/Workshop-Asocieri... · Complementaritatea efectelor descrise de literatura de

Efect antioxidant intracelular prin monitorizarea speciilor de oxigen reactive (peroxid de hidrogen si anion superoxid) – marcare cu DCFH-DA, respectiv HE – citometrie in flux

GLY este un agent puternic in prevenirea stresului oxidativ produs de inflamatie, inhiband ambele specii de oxygen reactive. CAM reduce in special anionul superoxid intracelular din fibroblasti si peroxidul de hidrogen din keratinocite, sugerand un efect de potentare a Gly la acest nivel

Linia HaCaT – keratinocit uman imortalizat

Este de mentionat efectul antioxidant celular al Gly si Cam in conditii inflamatorii asociate cu stimuli bacterieni (LPS), inhibitia speciilor reactive de oxygen ducand la protectia celulara in patologii cutanate cu componenta inflamatorie.

Page 13: Asocieri inovative de fitocompusi ai - biotehnos.robiotehnos.ro/biocamisol/wp-content/uploads/2018/09/Workshop-Asocieri... · Complementaritatea efectelor descrise de literatura de

Reepitelizare prin diferentiere keratinocite (evidentierea straturilor epidermei: bazal, granulos si cornos prin expresia keratinei 5/14; transglutaminazei-1 si involucrinei), corelata cu stimularea multiplicarii celulare;

Uleiul de camelina stimuleaza expresia citokeratinei, inducand diferentiere keratinocitara inca din stratul bazal. Gly induce preponderent supraexpresiei transglutaminazei-1, deci progresia stratului spinos. Compusii bioactivi stimuleaza turn-overul keratinocitelor atat in conditii nediferentiate (mediu sarac in calciu), cat si de inducere a diferentierii (12mg calciu), efect ce sustine procesul de regenerare epidermala.

Concentratia externa de calciu regleaza diferentierea keratinocitelor „in vitro”. Evidentierea celor trei proteine membranare – markeri de diferentiere a fost realizata prin marcarea cu anticorpi specifici.

Page 14: Asocieri inovative de fitocompusi ai - biotehnos.robiotehnos.ro/biocamisol/wp-content/uploads/2018/09/Workshop-Asocieri... · Complementaritatea efectelor descrise de literatura de

Determinarea colagenului total - marcare cu Sirius Red/Fast Green- In urma colorarii cu Sirius Red se observa fibrile roz de colagen, cu verde fiind marcata proteina non-colagenoasa.

Crestere a sintezei de colagen in celulele tratate cu Camelina 0.04% (143%) dar si in cazul fibroblastilor tratati cu Gly 50ng/ml (146%), precum si a combinatiilor Cam+Gly

REFACERE DERMICA PRIN STIMULAREA DINAMICII CELULARE A FIBROBLASTILOR SI A SINTEZEI DE COLAGEN

Regenerarea dermica modulata de extractele vegetale a fost evaluata prin determinarea statusului proliferativ la nivelul secventialitatii ciclului celular.

In conditii pro-inflamatorii mimate prin stimularea cu TNFα, cand rata de proliferare este in declin, uleiul de camelina amplifica progresia mitotica, marind rata de diviziune celulara, ceea ce sugereaza un rol important in procesele de regenerare dermica dupa agresiunea bacteriana/ fungica, asociata cu inflamatia cutanata.

Page 15: Asocieri inovative de fitocompusi ai - biotehnos.robiotehnos.ro/biocamisol/wp-content/uploads/2018/09/Workshop-Asocieri... · Complementaritatea efectelor descrise de literatura de

• Modelele experimentale utilizate in acest screening au avut o mare complexitate si au urmarit simularea „in vitro” a conditiilor unui atac bacterian sau fungic (tratare cu LPS), dar si cele ale instalarii unui status inflamator sistemic nespecific (TNFalfa). • Efectul antiinflamator a fost demonstrat prin qRT-PCR si citometrie in flux la nivelul factorilor pro-inflamatori IL6, IL8, VEGF si a moleculelor de adeziune ICAM si VCAM in special pentru GLY 50ng/ml si combinatia A4= Cam 0.04%+Gly 70ng/ml; •GLY a indus efect antioxidant marcant prin reducerea speciilor reactive de oxigen intracelulare,corelativ cu modularea catalazei/superoxid-dismutazei, completat de actiunea moderata si selectiva pe anumiti radicali liberi a Cam . •Inducerea regenerarii cutanate prin reepitelizare prin diferentiere keratinocite (supraexpresia keratinei 5/14; transglutaminazei-1 si involucrinei), corelata cu stimularea multiplicarii celulare; •Refacere dermica prin stimularea dinamicii celulare si a sintezei de colagen a fost realizata in sistemele experimentale investigate de ambii compusi si de asocierea lor, acestia potentandu-si reciproc anumite cai de actiune celulara.

CONCLUZII - Explorarea unor mecanisme celulare, completate de expresie genotipica, pentru demonstrarea efectelor antiinflamator, antioxidant si de regenerare cutanata

Prin evidentierea acestor efecte induse de GLY si Cam s-a realizat largirea spectrului de activitate biologica si s-au identificat noi tinte terapeutice, diferite de efectul antimicrobian clasic ce conduc la dezvoltarea de noi produse bazate pe valorificarea potentialului agricol (deseuri de planta, respectiv specii cu adaptabilitate mare si potential agricol imens)