Aparatul Genetic

20
1. APARATUL GENETIC AL CELULEI I. DATE TEORETICE A. GENETICA - ŞTIINŢA EREDITĂŢII ŞI VARIABILITĂŢII 1. DEFINIŢII a. EREDITATEA Ereditatea reprezintă capacitatea unui individ de a transmite la urmaşi caracterele sale personale, precum şi pe cele ale speciei căreia îi aparţine. Deoarece copiii nu sunt niciodată identici cu părinţii lor, ereditatea este procesul prin care se realizează similitudinea biologică între părinţi şi descendenţi. Părinţii, însă, nu transmit la copii caractere, ci informaţiile necesare pentru realizarea lor. În acest context, ereditatea este un proces informaţional care presupune stocarea, transmiterea şi expresia informaţiei ereditare pentru formarea caracterelor morfofuncţionale specifice unui individ. b. VARIABILITATEA Variabilitatea cuprinde fenomenele care produc diferenţele genetice dintre indivizii unei populaţii precum şi dintre populaţii diferite. 2. ADN - SUBSTRATUL BIOCHIMI C AL EREDITĂŢII Principalele surse de variabilitate genetică sunt: mutaţiile, recombinările genetice şi migraţiile. Datorită acestor procese, fiecare individ are o structură genetică unică. Ereditatea este o funcţie care are ca substrat molecular acidul deoxiribonucleic (ADN). ADN-ul îndeplineşte trei funcţii majore, care reprezintă esenţa eredităţii (figura 1.1.): ADN deţine informaţia genetică codificată pentru realizarea caracterelor specifice unui organism. Unitatea de informaţie ereditară este gena, un segment de ADN ce deţine informaţia necesară pentru realizarea unui caracter ("o genă un caracter"). Alterarea

Transcript of Aparatul Genetic

Page 1: Aparatul Genetic

1. APARATUL GENETIC AL CELULEI

I. DATE TEORETICE

A. GENETICA - ŞTIINŢA EREDITĂŢII ŞI VARIABILITĂŢII

1. DEFINIŢII

a. EREDITATEA Ereditatea reprezintă capacitatea unui individ de a transmite la urmaşi caracterele sale personale, precum şi pe cele ale speciei căreia îi aparţine. Deoarece copiii nu sunt niciodată identici cu părinţii lor, ereditatea este procesul prin care se realizează similitudinea biologică între părinţi şi descendenţi. Părinţii, însă, nu transmit la copii caractere, ci informaţiile necesare pentru realizarea lor. În acest context, ereditatea este un proces informaţional care presupune stocarea, transmiterea şi expresia informaţiei ereditare pentru formarea caracterelor morfofuncţionale specifice unui individ.

b. VARIABILITATEA Variabilitatea cuprinde fenomenele care produc diferenţele genetice dintre indivizii unei populaţii precum şi dintre populaţii diferite.

2. ADN - SUBSTRATUL BIOCHIMIC AL EREDITĂŢII

Principalele surse de variabilitate genetică sunt: mutaţiile, recombinările genetice şi migraţiile. Datorită acestor procese, fiecare individ are o structură genetică unică.

Ereditatea este o funcţie care are ca substrat molecular acidul deoxiribonucleic (ADN). ADN-ul îndeplineşte trei funcţii majore, care reprezintă esenţa eredităţii (figura 1.1.): ADN deţine informaţia genetică codificată pentru realizarea caracterelor specifice unui

organism. Unitatea de informaţie ereditară este gena, un segment de ADN ce deţine informaţia necesară pentru realizarea unui caracter ("o genă un caracter"). Alterarea

Page 2: Aparatul Genetic

Aparatul genetic al celulei 2

accidentală a structurii genei se numeşte mutaţie; ea poate duce la modificarea caracterului respectiv (caracter mutant).

ADN exprimă informaţia genetică, prin sinteza unor proteine specifice care determină caracterele organismului ("o genă o proteină") (figura 1.1. A). La realizarea acestor caractere participă însă şi factorii de mediu. Ansamblul de caractere manifeste şi specifice unui organism, determinate de ereditate şi mediu, se numeşte fenotip.

A B

Figura 1.1. Reprezentarea schematică a funcţiilor ADN A. Gena este un segment de ADN care deţine codificat, sub forma unei secvenţe de nucleotide, informaţia genetică pentru un caracter. Această informaţie este copiată (pe bază de complementaritate) în ARNm şi

Cat

enă

sens

Page 3: Aparatul Genetic

Aparatul genetic al celulei

3

apoi decodificată (translată) sub forma unei secvenţe specifice de aminoacizi, constituind o proteină care stă la baza unui anumit caracter fenotipic. B. Transmiterea informaţiei genetice prin biosinteza ADN-ului (replicare semiconservativă) şi diviziunea celulei. ADN transmite informaţia genetică în succesiunea generaţiilor de celule sau organisme,

prin replicare (biosinteza, pe baza informaţiei conţinute de cele două catene ale moleculei de ADN iniţială, a două molecule noi de ADN identice) urmată apoi de distribuirea egală a moleculelor de ADN în cursul diviziunii celulei (figura 1.1. B).

Genetica este ştiinţa eredităţii şi variabilităţii Ereditatea este proprietatea unui individ de a transmite la urmaşi caracterele sale personale, precum şi cele de specie. Variabilitatea cuprinde fenomenele care produc diferenţele genetice dintre indivizii unei populaţii şi dintre populaţii diferite. Substratul molecular al eredităţii este ADN. ADN-ul conservă, exprimă şi transmite informaţia genetică

B. APARATUL GENETIC AL CELULEI Structurile celulare care conţin ADN (nucleul şi mitocondriile) precum şi cele care intervin în realizarea funcţiilor sale (ribosomii şi centriolii) alcătuiesc aparatul genetic al celulei (figura 1.2.).

Figura 1.2. Schema morfologiei nucleului interfazic

a. NUCLEUL Elementul principal al aparatului genetic este nucleul; el conţine 99,5% din ADN celular şi este centrul de comandă şi control al tuturor activităţilor celulare. În nucleu, fiecare moleculă de ADN se asociază specific cu anumite proteine (histonice şi

Microscop electronic

Mb.c membrana celulară R ribosomi RE reticul endoplasmatic M mitocondrii L lizozom C centriol Mb.Nc membrană nucleară Nc nucleol CR cromocentri CRT.X cromatina X CRM cromonemă

Microscop optic

Page 4: Aparatul Genetic

Aparatul genetic al celulei 4

nehistonice) şi formează, prin spiralizări succesive, fibrele de cromatină. La începutul diviziunii fibrele de cromatină se condensează şi formează cromosomii, substratul morfologic al eredităţii. Numărul şi forma cromosomilor sunt elemente caracteristice fiecărei specii. La om, în celulele somatice sunt 46 cromosomi (2n = număr sau set diploid). Informaţia genetică conţinută de genele din cei 46 de cromosomi este denumită genotip. În celulele sexuale mature (ovulul şi spermatozoidul) numărul de cromosomi este redus, prin meioză, la 23 cromosomi (n = set haploid). Informaţia genetică dintr-un set haploid de cromosomi se numeşte genom1

b. MITOCONDRIILE

. Cantitatea de ADN a genomului nucleului haploid este denumită valoare C şi este caracteristică şi constantă pentru fiecare specie. Conţinutul de ADN al celulelor diploide poate fi 2C sau 4C în funcţie de stadiul ciclului celular (vezi figura 1.3.). Anumite celule diferenţiate din organismul uman sunt tetraploide (unele hepatocite, cardiomiocite) sau chiar poliploide (celulele musculare scheletice) în timp ce altele sunt lipsite de nucleu şi implicit şi de cromosomi (hematii mature, trombocite) ca fenomen adaptativ pentru o mai bună realizare a funcţiilor celulare caracteristice.

Mitocondriile conţin 0,5 % din ADN-ul celular, responsabil de ereditatea citoplasmatică. Informaţia genetică din ADN mitocondrial se numeşte plasmotip şi provine exclusiv de la mamă (zigotul moşteneşte mitocondriile ovulului).

Structurile celulare care conţin ADN (nucleul şi mitocondriile) precum şi cele care participă la realizarea funcţiilor sale (ribosomii şi centriolii) alcătuiesc aparatul genetic al celulei. Elementul principal al aparatului genetic este nucleul, care conţine 99,5% din ADN şi a cărui morfologie depinde de fazele ciclului celular. Cromosomii sunt substratul morfologic al eredităţii.

C. CICLUL CELULAR

1. DEFINIŢIE. PERIOADE. DURATĂ Ciclul celular reprezintă succesiunea de evenimente biochimice şi morfologice care se produc în viaţa unei celule, din momentul formării şi până la sfârşitul diviziunii sale. Ciclul celular are două mari perioade: interfaza şi diviziunea (figura 1.3.).

a. INTERFAZA Interfaza reprezintă perioada cuprinsă între două diviziuni succesive, în care se desfăşoară toate activităţile specifice unei celule. Evenimentul cel mai important al interfazei este sinteza de ADN (replicare, prin care 1 Termeneul de genom este adesea folosit pentru a descrie totalitatea informaţiei genetice din celula umană. El este alcătuit dintr-un genom nuclear şi un genom mitocondrial. Pentru a face o distincţie între genomul celulelor somatice şi al gameţilor se mai folosesc termenii de genom diploid şi genom haploid

Page 5: Aparatul Genetic

Aparatul genetic al celulei

5

se dublează cantitatea de material genetic (4C). Ea se produce într-o perioadă limitată a interfazei, denumită faza S. Interfaza poate fi subdivizată în trei etape succesive: faza G1 (presintetică), faza S (de sinteză) şi faza G2

b. DIVIZIUNEA CELULARĂ (postsintetică sau premitotică).

Diviziunea celulară sau faza M ("mitotică") este alcătuită dintr-o serie de procese secvenţiale prin care materialul genetic (ADN) replicat în interfază, se distribuie egal şi total (segregare cromatidiană) formând doi nuclei distincţi, iar celula se împarte în două celule fiice (citokineză); acestea vor fi identice genetic cu celula din care au provenit (figura 1.1.B). Prin replicarea ADN-ului şi diviziune se asigură transmiterea fidelă a informaţiei genetice în succesiunea generaţiilor celulare.

c. DURATA CICLULUI CELULAR Durata ciclului celular poate varia mult între diferite ţesuturi, datorită duratei fazei G1, celelalte faze fiind relativ constante ca durată. Pentru o durată medie de 24 ore a ciclului de viaţă a celulelor eucariote superioare, duratele aproximative ale fazelor sunt: G1 = 10 ore, S = 9 ore, G2 = 4 ore, M = 1 oră.

Page 6: Aparatul Genetic

Aparatul genetic al celulei 6

2C

Figura 1.3. Ciclul celular mitotic (adaptat după Strachan şi Read, 1996)

2. FAZELE CICLULUI CELULAR MITOTIC

a. FAZA G În faza G

1

1

(engl. gap - interval) se produce o sinteză intensă de substanţe (ARN, proteine) necesare creşterii şi funcţionării celulei (tabelul 1.1.).

Tabelul 1.1. Caracteristicile principale ale fazelor ciclului celular mitotic2

PERIOADA FAZA ŞI DURATA

(ore)

EVENIMENTE CANTITATE ADN

ASPECT LA MICROSCOPUL ELECTRONIC

Interfază G1 Sinteză intensă de ARN şi 10h 2C 2n cromosomi monocromatidieni 2 Ciclul celular meiotic are o serie de particularităţi (vezi capitolul 2)

4 catene de ADN per

cromosom 46 cromosomi

condensaţi bicromatidieni

2 catene de ADN per cromosom

92 de cromosomi monocromatidieni, ce vor fi împărţiţi la cele două celule

fiice

4 catene de ADN per

cromosom

46 cromosomi despiralizaţi

Sinteză de ADN

2 catene de ADN per

cromosom

46 cromosomi monocromatidieni

Page 7: Aparatul Genetic

Aparatul genetic al celulei

7

proteine S 9h Sinteză de ADN şi histone 4C G2 Sinteza proteinelor fusului

de diviziune 4h

Sinteza factorului de declanşare al mitozei

4C 2n cromosomi bicromatidieni despiralizaţi

Diviziune M 1h Profază Metafază Anafază

4C 4C

Cromosomi bicromatidieni condensaţi (vizibili la microscopul optic)

Telofază 2C 2C Cromosomi monocromatidieni Fiecare cromosom (puternic despiralizat) este monocromatidian, fiind alcătuit dintr-o singură moleculă de ADN. Cantitatea de material genetic este 2C molecule de ADN, sub forma a 2n (46) cromosomi despiralizaţi (figura 1.3.). În prima parte a fazei G1 (G1A), celulele acumulează ARN şi proteine până la o concentraţie prag, numită punct de restricţie "R", după care trec în subfaza G1B, fiind pregătite să intre în faza S (figura 1.4.).3

În anumite condiţii (lipsa factorilor de creştere, a aminoacizilor sau prezenţa unor inhibitori ai sintezei proteinelor etc.) celulele aflate în subfaza G

1A trec într-o fază de activitate metabolică redusă, numită faza G0 sau G1

Dacă condiţiile restrictive dispar, celulele G

Q (engl. "quiescent" - inert, liniştit) în care rămân viabile şi pot supravieţui timp îndelungat.

0 pot reveni în G1 şi apoi pot progresa spre faza S, deoarece îşi păstrează capacitatea de diviziune. Fazele G1 şi G0

Unele celule aflate în subfaza G

sunt două stări fiziologice distincte ale celulei.

1A părăsesc definitiv ciclul celular şi trec în faza G1

b. FAZA S D, ce corespunde celulelor diferenţiate; ele nu se mai divid şi mor după un anumit timp.

Faza S (engl. "synthesis" - sinteză) se caracterizează prin sinteza de ADN (realizată prin replicare semiconservativă) şi sinteza de histone; se produce astfel o dublare a cantităţii de material genetic (4C), condiţie obligatorie pentru desfăşurarea diviziunii celulare. Numărul de cromosomi rămâne 46, dar fiecare cromosom va fi bicromatidian, alcătuit din două cromatide identice ("surori") ce conţin două molecule identice de ADN.

3 Poziţia punctului de oprire R este incertă, fie aproape de faza S, fie la mijlocul fazei G1

Page 8: Aparatul Genetic

Aparatul genetic al celulei 8

Figura 1.4. Fazele ciclului celular mitotic şi evoluţia celulelor rezultate prin diviziune

Replicarea ADN în faza S este asincronă: unele segmente de ADN (bogate în perechi de baze G-C) se replică precoce, la începutul fazei S, iar alte segmente (bogate în perechi de baze A-T) se replică tardiv, la sfârşitul fazei S. Informaţii precise despre sinteza/replicarea ADN pot fi obţinute fie prin autoradiografie (cu ajutorul unui izotop radioactiv, de regulă timidină tritiată T3

c. FAZA G

H) fie prin utilizarea bromodeoxiuridinei (BrdU), un analog al timinei. Ele se vor încorpora în molecula nou sintetizată, marcând-o radioactiv, în primul caz, sau modificându-i configuraţia, în al doilea caz.

Faza G2

2 se caracterizează prin sinteza unor proteine specifice şi a unor mici cantităţi de ADN (necesar în procesul de "corectare" a erorilor de replicare). Fiecare cromosom este bicromatidian (cantitatea de ADN este 4C) dar despiralizat. Spre sfârşitul fazei G2

În lipsa factorului de condensare, celulele se opresc în faza G

se activează/ sintetizează "factorul de declanşare al mitozei" (MPF) ce determină condensarea filamentelor de cromatină în cromosomi şi formarea fusului de diviziune. O demonstraţie elegantă a existenţei MPF este fenomenul de "condensare prematură a cromosomilor", realizat prin fuziunea unei celule în diviziune (metafază) cu o celulă în interfază (figura 1.5.); se produce rapid o condensare precoce a filamentelor de cromatină interfazică, care în mod obişnuit, sunt puternic despiralizate şi deci invizibile la microscopul optic, iar membrana nucleară se dezasamblează.

2

d. FAZA M

şi pot abandona ciclul celular, formându-se celule tetraploide (4n cromosomi); unele dintre ele devin prin amitoză, celule binucleate (de exemplu, o parte din cardiomiocite adulte) (figura 1.4.).

Faza M corespunde mitozei şi durează aproximativ 1 oră. Ea începe cu diviziunea nucleului (mitoză) şi se termină cu diviziunea citoplasmei (citokineză). În această etapă, materialul genetic dublat în interfază (4C molecule ADN - 46 cromosomi bicromatidieni) segregă, adică se distribuie în mod egal şi total celulelor "fiice" (2C molecule ADN - 46

Page 9: Aparatul Genetic

Aparatul genetic al celulei

9

cromosomi monocromatidieni) care vor fi identice cu celula din care provin. Procesul de "distribuţie" (segregarea cromatidelor surori) a materialului genetic prin diviziune se desfăşoară, de obicei, cu mare precizie asigurând fidelitatea transmiterii informaţiei genetice în succesiunea generaţiilor de celule. El poate suferi însă şi erori, care vor genera anomalii cromosomice (vezi capitolul 2).

3. EVOLUŢIA CELULELOR REZULTATE PRIN DIVIZIUNE

Celulele rezultate după diviziune pot evolua în trei direcţii: proliferare, diferenţiere şi trecerea în stadiul de repaus.

a. PROLIFERAREA Celulele parcurg un nou ciclu celular şi se divid repetat; aceste "celule ciclice" alcătuiesc compartimentul proliferativ al organismului şi se găsesc în ţesuturile embrionare, măduva hematogenă, stratul bazal al epidermului ş.a.

b. DIFERENŢIEREA Celulele părăsesc definitiv ciclul celular şi se transformă în celule specializate, cu anumite structuri şi funcţii, care nu se mai divid şi mor după un timp determinat. De exemplu: neuronii, celulele musculare, granulocitele, hematiile mature etc.

c. STADIUL DE REPAUS Unele celule (de ex.: celulele "stem", limfocitele ş.a.) părăsesc ciclul celular în faza G1 şi rămân în faza G0

Un exemplu edificator îl reprezintă activarea limfocitelor T din sângele periferic sub acţiunea fitohemaglutininei (PHA); ele se transformă în limfoblaste, celule tinere, care se divid intens. Acest fenomen este utilizat pentru studiul cromosomilor prin culturi de limfocite (vezi capitolul 3).

, având o activitate metabolică minimă, dar păstrându-şi capacitatea de diviziune. Aceste celule formează compartimentul neproliferativ. În condiţii speciale, ele reacţionează la anumiţi stimuli din mediu (factori de creştere, unii hormoni, substanţe mitogene etc.) şi pot reintra în ciclul de diviziune.

4. CONTROLUL CICLULUI CELULAR Progresia ordonată şi desfăşurarea normală a ciclului celular sunt realizate prin

reacţii biochimice în care multiple kinaze dependente de cicline (CDK)(1-7) sunt

Figura 1.5. Fenomenul de condensare

prematură a cromosomilor

Page 10: Aparatul Genetic

Aparatul genetic al celulei 10

activate, prin fixarea unor proteine numite cicline (A-H). După activare, fiecare complex proteic CDK-ciclină fosforilează anumite proteine sepecifice, necesare pentru reacţiile care au loc într-o anumită fază a ciclului. Apoi, complexul CDK-ciclină poate fi inactivat, fie prin degradarea proteolitică a ciclinei (de către ubiquitină) fie prin intervenţia unor molecule inhibitoare CKI (p27, p21 ş.a) .

Interacţiunea dintre activarea şi inactivarea activităţilor CDK, în diferite momente cheie, asigură progresia normală şi reglarea ciclului celular. Fiecare fază a ciclului are un control specific (fig. 1.6) realizat în G1

de complexul CDK4-ciclina D, la tranziţia G1/S de complexul CDK2-ciclină E, în faza S de complexul CDK2-ciclină A, iar în fazele G2 şi M de complexul CDC2-ciclină B.

Figura 1.6. Reprezentare schematică a reglării fazelor ciclului celular prin intermediul complexelor CDK-ciclină

(adaptat după Jameson et al., 1998) Tranziţia de la o fază la alta a ciclului celular este controlată prin mecanisme specifice, care acţionează în anumite puncte de control şi verifică dacă anumite procese sunt terminate înaintea începerii altora sau dacă nu există alterări ale componentelor ”maşinăriilor” de replicare şi segregare cromatidiană; în cazul identificării unor defecte se blochează progresia în ciclul celular (prin inactivarea CDK) şi se induce ”repararea” sau, dacă aceasta nu este posibilă, apoptoza (moartea celulară programată). Pe parcursul ciclului celular se produc următoarele evenimente corelate cu reglarea

Ciclină D CDK4/6

Ciclină E

CDK2

Rb E2F

P

P

CAK (ciclină H/CDK7)

P

Mitogeni, factori nutriţionali, factori de creştere

p21, p27, p57

p21, p27, p57

p15, p16, p18, p19

p21, p27, p57

MPF

G0 2C

G1 2C

G2 4C

Mitoză 4C/2

Faza S 2C 4C

puncte de restricţie sau de control CDK2

Ciclină A

CDK2

Ciclină A

Ciclină B

CDC

Page 11: Aparatul Genetic

Aparatul genetic al celulei

11

ciclului: ▪ Celulele aflate în faza “de start” G1 reacţionează la stimuli externi (mitogeni, factori de creştere)

formându-se complexul CDK4-ciclină D, care fosforilează şi deci activează diferite proteine ce funcţionează în această fază. Printre acestea, un rol important îl are proteina Rb, care (după fosforilare) eliberează un factor activator (E2F) al transcripţiei genelor ce funcţionează în faza S şi realizează replicarea ADN.

▪ Intrarea în faza S este determinată de un semnal activator, complexul CDK2-ciclină E. Formarea acestui complex este însă blocată de inhibitorul p27 al CDK; trecerea în faza S implică mai întâi degradarea p27 (de către ubiquitină)

▪ În punctul de control G1/S are loc o verificare a parametrilor de evoluţie normală a celulei: orice alterare a ADN, depleţie de oxigen / metaboliţi / energie sau pertrurbare fiziologică declanşează sinteza proteinei p53 (“gardianul” genomului uman) care activează transcripţia genei ce codifică proteina p21, un inhibitor al complexelor CDK-ciclină. Celulele sunt oprite în G1, oferindu-li-se timp de corecţie; dacă alterările (în special cele din structura ADN) nu sunt reparate, celula va fi direcţionată spre apoptoză

▪ Progresia ulterioară prin faza S şi replicarea ADN sunt reglate de către CDK2-ciclina A. ▪ În faza G2, la punctul de control G2/M, se decide dacă celula intră în mitoză; acest lucru este

determinat de activarea bruscă a complexului CDC2-ciclină B (numit anterior şi factorul MPF, de la “Mitosis Promoting Factor”). Celulele cu aberaţii cromosomice sau defecte ale aparatului mitotic sunt oprite să intre în mitoză (prin acţiunea p53 →p21, care blochează formarea complexului CDC2-ciclina B)).

▪ În cursul mitozei, în metafază, mai există un punct de control M în care diviziunea se opreşte şi este verificată alinierea perfectă a cromosomilor, înaintea separării cromatidelor surori. Acţiunea este realizată de către o proteină inhibitoare ISS; degradarea proteolitică a acestei proteine (determinată de ubiquitină) declanşează anafaza prin separarea cromatidelor.

▪ La sfârşitul mitozei are loc degradarea bruscă a ciclinei B (produsă de către ubiquitină) şi inactivarea CDC2, fenomene ce permit celulei să treacă într-o nouă fază G1.

Proliferarea celulară este reglată pe o durată limitată de factori extracelulari (hormoni, factori de creştere etc.) precum şi de anumite gene de proliferare sau "mitogene" (ce codifică cicline, receptori ai factorilor de creştere, proteine necesare sintezei de ADN, etc.). Deoarece prin mutaţia şi activarea lor anormală se produce o proliferare celulară anormală şi cancer, aceste gene normale mai sunt numite şi proto-oncogene. O altă categorie de gene, numite antiproliferative, au rolul de a inhiba proliferarea celulară. De aceea aceste gene mai sunt numite gene supresoare de tumori sau antioncogene. În cancer se produce o perturbare a desfăşurării normale a ciclului celular. Celulele canceroase, purtătoare de mutaţii, "scapă" de controlul mecanismelor care reglează proliferarea normală, parcurg rapid şi repetat ciclul celular, multiplicându-se permanent şi anarhic. Multe medicamente anticanceroase (citostatice) determină "blocarea" proliferării celulelor, prin oprirea evoluţiei lor în diferite faze ale ciclului celular. Ciclul celular reprezintă o succesiune de evenimente biochimice şi morfologice care se produc în viaţa unei celule. El prezintă două perioade: interfaza şi diviziunea. Interfaza, perioada cuprinsă între două diviziuni, este alcătuită din trei faze succesive: G1, S, G2; în faza S, se produce sinteza de ADN, prin replicare semiconservativă, iar cantitatea de material genetic se dublează (4C).

Page 12: Aparatul Genetic

Aparatul genetic al celulei 12

Prin diviziune (faza M) conţinutul nuclear dublat în interfază se distribuie egal şi total celulelor fiice. Prin aceasta se asigură transmiterea fidelă a informaţiei genetice în succesiunea generaţiilor celulare. Celulele rezultate după diviziune pot evolua în trei direcţii: proliferarea (printr-o nouă diviziune) diferenţierea (specializarea celulelor), trecerea în stadiul de repaus G0 Ciclul celular este reglat prin intervenţia genelor proliferative (proto-oncogene) şi a genelor antiproliferative (gene supresoare de tumori) a căror mutaţie produce cancer.

(celule cu activitate metabolică redusă).

D. NUCLEUL Elementul principal al aparatului genetic este nucleul, centrul de comandă şi control al tuturor activităţilor celulelor eucariote. În nucleu, fiecare moleculă de ADN se asociază specific cu anumite proteine (histonice sau nehistonice) şi constituie un complex supramolecular deoxiribo-nucleoproteic. El formează prin spiralizări succesive fibre de cromatină (“cromoneme”) din care, printr-o condensare progresivă, se formează la începutul diviziunii cromatida unui cromosom (figura 1.7.). Fiecare cromatidă a unui cromosom bicromatidian este alcătuită dintr-o singură moleculă de ADN. La sfârşitul diviziunii se produce fenomenul invers, de despiralizare a cromosomilor. Cromosomii sunt structuri permanente ale nucleului, dar ei sunt vizibili la microscopul optic numai în diviziune. În interfază cromosomii sunt despiralizaţi şi nu se observă la microscopul optic.

1. NUCLEUL INTERFAZIC Nucleul interfazic este alcătuit din membrana nucleară, nucleoplasmă, cromatină şi nucleol(i) (figura 1.2.). Constituentul cel mai important este cromatina, forma interfazică a materialului genetic.

a. COMPOZIŢIA CHIMICĂ A CROMATINEI Cromatina este alcătuită din ADN, proteine histonice, ARN, ioni bivalenţi etc. Dintre acizii nucleici predomină ADN, care se evidenţiază histochimic prin reacţia Feulgen (ADN se colorează în roşu-violet) sau coloraţia cu verde de metil pironină (ADN se colorează în verde, iar ARN din nucleol şi citoplasmă, în roşu cărămiziu).

b. ASPECTUL CROMATINEI LA MICROSCOPUL OPTIC La microscopul optic cromatina se observă sub forma unor granule mici, fine, slab colorate, printre care se găsesc corpusculi mari, condensaţi şi intens coloraţi bazofil, numiţi cromocentri; ei reprezintă părţi din cromosomi care nu s-au despiralizat în interfază. Cromatina se prezintă sub două forme sau stări morfo-funcţionale: eucromatină şi heterocromatină, diferenţiate prin gradul de condensare, intensitatea coloraţiei, momentul replicării, compoziţia chimică şi activitatea genetică (tabelul 1.2).

Page 13: Aparatul Genetic

Aparatul genetic al celulei

13

Figura 1.7. Relaţia ADN - fibre de cromatină - cromosomi (după Strachan şi Read, 1996)

Tabelul 1.2 Caracteristicile eucromatinei şi heterocromatinei

CARACTERISTICI EUCROMATINĂ HETEROCROMATINĂ Condensare Fin dispersată Puternic condensată (cromocentri) Colorare Slabă Intensă Replicare în faza S Precoce Tardivă Activitate genetică Activă Inactivă Compoziţie chimică Predomină p.b. C-G şi

ADN nerepetitiv Predomină p.b. A-T şi ADN repetitiv

Heterocromatina poate fi de două feluri: heterocromatină constitutivă, prezentă în toate celulele în poziţii identice la ambii

cromosomi omologi, fie la centromer, fie în diferite segmente cromosomice; heterocromatină facultativă, este prezentă fie numai în anumite celule sau ţesuturi, fie

numai la un anumit sex (de exemplu cromatina sexuală X la femei şi cromatina sexuală Y la bărbaţi - vezi capitolul 3).

c. ASPECTUL CROMATINEI LA MICROSCOPUL ELECTRONIC La microscopul electronic cromatina apare ca o aglomerare de filamente de grosimi

Cromatide surori 80 Mb de

ADN 80 Mb de

ADN

Centromer 2 nm

600 nm

600 600 nm nm

Dublu helix

Zonă inter-nucleosomală

Nucleosomi 10 nm

10 nm Filament cu nucleosomi

30 nm Fibră de cromatină

300 nm Fibre de cromatină pliate în bucle

laterale (≈75 kb)

Page 14: Aparatul Genetic

Aparatul genetic al celulei 14

diferite, spiralizate şi condensate neregulat4

2. NUCLEUL ÎN DIVIZIUNE

. Filamentele cele mai groase, din care la începutul diviziunii se formează cromosomii, se mai numesc cromoneme (figura 1.7.).

Nucleul în diviziune îşi pierde aspectul caracteristic interfazei. Materialul cromatinian se prezintă sub formă de cromosomi. Ei rezultă printr-o accentuare a spiralizării cromonemelor, care se condensează, se scurtează şi se "acoperă" cu un înveliş proteic, devenind vizibili la microscopul optic (figura 1.7.).

a. NUMĂRUL CROMOSOMILOR Numărul şi morfologia cromosomilor sunt elemente caracteristice fiecărei specii. La om în celulele somatice sunt 46 de cromosomi (2n = număr diploid). Celulele sexuale mature (gameţii) au 23 de cromosomi (n = număr haploid); după fecundarea gameţilor, la zigot se reface numărul diploid de 46 cromosomi.

b. CROMOSOMII OMOLOGI În celulele somatice cromosomii se găsesc în perechi de omologi, identici ca mărime şi formă, dar diferiţi ca origine (unul matern, altul patern). Din cele 23 de perechi de cromosomi, 22 sunt identice la cele două sexe şi se numesc autosomi, iar o pereche diferă la cele două sexe, XX la femeie şi XY la bărbat, numindu-se gonosomi (heterosomi sau cromosomi sexuali). Cromosomii X şi Y, deşi sunt "omologi" ca funcţie (în determinismul sexual) se prezintă morfologic diferit: cromosomul Y este mult mai mic decât cromosomul X.

C. MORFOLOGIA CROMOSOMILOR Morfologia cromosomilor poate fi uşor analizată în metafază. În această fază cromosomii ajung la condensarea maximă, sunt bine individualizaţi şi se găsesc în acelaşi plan, în placa ecuatorială. Cromosomul metafazic (figura 1.8.) este alcătuit din două cromatide paralele, identice ca mărime şi formă (“cromatide surori"), unite într-o regiune, mai slab colorată, numită centromer. El conţine două structuri specializate numite kinetocori, prin care cromosomul se fixează pe filamentele fusului de diviziune (vezi figura 2.2.A). În zona centromerului se realizează o îngustare pe traiectul cromosomului numită constricţie primară. Centromerul împarte cromatidele în două braţe, egale sau inegale, notate convenţional cu "p" - braţul scurt - şi "q" - braţul lung. Poziţia centromerului (figura 1.8.) poate fi: mediană, la cromosomii metacentrici (M); submediană, la cromosomii submetacentrici (SM); aproape terminală, la cromosomii acrocentrici (A). Pe unii cromosomi se observă şi constricţii secundare, produse prin îngustarea cromatidelor; ele conţin heterocromatină. Părţile terminale ale cromatidelor sunt denumite telomere. Cromosomii acrocentrici prezintă constricţii secundare aproape de extremitatea braţelor scurte; ele determină separarea unor mici mase de heterocromatină, cunoscute sub numele de sateliţi. 4 Relaţia ADN → fibre cromatină → cromosomi va fi discutată la curs

Page 15: Aparatul Genetic

Aparatul genetic al celulei

15

Cromatide surori Telomer

Metacentric Submetacentric Acrocentric

Figura 1.8. Morfologia diferitelor tipuri de cromosomi Clasificarea cromosomilor după poziţia centromerului

(după Thompson, 1991)

În nucleul interfazic materialul genetic se găseşte sub formă de cromatină, alcătuită din ADN, proteine şi ARN. La microscopul optic cromatina se prezintă sub două forme: eucromatină (activă genetic) şi heterocromatină (inactivă genetic). La microscopul electronic cromatina apare formată din fibre de ADN şi proteine. La începutul diviziunii fibrele de cromatină se condensează, transformându-se în cromosomi. În celulele somatice se găsesc 46 de cromosomi (2n = număr diploid). Celulele sexuale mature (gameţi) au 23 de cromosomi (n= număr haploid). După fecundarea gameţilor, la zigot se reface numărul 2N = 46 de cromosomi. De aceea, în celulele somatice, cromosomii se găsesc în perechi de cromosomi omologi, identici ca mărime, formă şi conţinut genetic, dar diferiţi ca origine (unul matern şi altul patern). Din cele 23 de perechi de cromosomi omologi, 22 sunt identice la cele două sexe şi se numesc autosomi; o pereche este diferită: XX la femeie şi XY la bărbat, numindu-se cromosomi sexuali sau gonosomi. Cromosomul metafazic este alcătuit din două cromatide, unite prin centromer; acesta împarte cromatidele în braţe scurte (notate cu "p") şi lungi (notate cu "q").

II. APLICAŢII PRACTICE

1. ASPECTUL CELULELOR PE PARCURSUL CICLULUI CELULAR Analizaţi (la microscop sau pe fotografii) preparate obţinute din culturi de limfocite şi stabiliţi în ce faze ale ciclului celular se găsesc diferite celule din seria limfocitară.

Sateliţi

Centromer

Page 16: Aparatul Genetic

Aparatul genetic al celulei 16

Precizaţi criteriile pe care se bazează opţiunile Dv.

2. SCHIMBURILE DINTRE CROMATIDELE SURORI Uneori, în faza S a ciclului celular mitotic se produce un "schimb egal de material genetic între cromatidele surori" (SCE - engl. ”sister chromatides exchanges”) care poate fi evidenţiat prin tehnici speciale aplicate în metafază. Acest fenomen este important din punct de vedere practic, deoarece frecvenţa schimburilor (normal 7-10 per metafază) creşte în anumite boli, precum şi după expunerea organismului la substanţe mutagene. Astfel SCE reprezintă o metodă de evaluare a acţiunii mutagene a diferiţilor agenţi din mediul ambiant.

a. PRINCIPIUL METODEI SCE Celulele în cultură efectuează două cicluri de replicare în prezenţa unui analog al timinei, numit 5-bromodeoxiuridină (BrdU). BrdU se încorporează, în locul timinei, în moleculele de ADN nou sintetizat, modificând proprietăţile de colorare ale cromatidelor. Folosind soluţia Giemsa sau colorantul fluorescent Hoechst 33258 se colorează cromatida în care numai o catenă a încorporat BrdU (figura 1.9.). În zonele în care se produce SCE se observă aspectul particular ("arlechin") al cromatidelor, cu zone colorate alternând cu zone necolorate.

Figura 1.9. Principiul metodei BrdU

Săgeţile indică cromosomii la nivelul cărora există schimburi între cromatidele surori (după Emery’s, 1998)

Identificaţi pe fotografii şi/sau preparate cromosomice "schimburile între cromatidele surori"; calculaţi numărul de schimburi per metafază şi evaluaţi dacă rezultatul obţinut este normal sau nu.

b. IDENTIFICAREA SCE

Page 17: Aparatul Genetic

Aparatul genetic al celulei

17

3. METODE DE EVALUARE A REPLICĂRII ASINCRONE A ADN Replicarea ADN în faza S este asincronă. Fenomenul poate fi studiat fie prin autoradiografie, cu ajutorul unui izotop radioactiv, fie cu ajutorul bromodeoxiuridinei, ambele substanţe încorporându-se în moleculele de ADN nou sintetizate.

a. PRINCIPIUL METODEI AUTORADIOGRAFICE În cazul autoradiografiei, în cultura de celule se adaugă timidină tritiată (3HT) care va fi încorporată numai în celulele/cromosomii care sintetizează activ ADN. Ulterior, celulele sunt fixate şi se realizează preparate pentru analiza cromosomică. Preparatele se acoperă cu o emulsie fotografică şi sunt păstrate câteva săptămâni la întuneric. 3HT, încorporată în celule, emite radiaţii care acţionează asupra granulelor de argint (AgBr) din emulsie. După developarea lamelor şi colorarea cromosomilor aceste granule negre de argint metalic sunt văzute numai pe cromosomii sau segmentele de cromosomi care au încorporat 3 Variind timpul de expunere la

HT în timpul sintezei ADN. 3

b. IDENTIFICAREA REPLICĂRII TARDIVE

HT al celulelor în cultură se poate stabili momentul replicării diferiţilor cromosomi sau segmente.

Pe metafaze cu cromosomi umani în care s-a încorporat 3

Observaţi pe fotografii de metafaze cu cromosomi umani aspectul cromatidelor în care s-a încorporat BrdU în cursul replicării ADN, ţinând cont de faptul că se colorează numai cromatidele în care numai o catenă a ADN a încorporat BrdU.

HT la sfârşitul fazei S, identificaţi cromosomii care se replică tardiv.

4. CONDENSAREA PREMATURĂ A CROMOSOMILOR Analizaţi în figura 1.5. modul de producere al fenomenului de "condensare prematură" a cromosomilor şi apoi studiaţi pe fotografii aspectul cromosomilor obţinuţi prin "condensare prematură" după hibridarea unor celule interfazice de şobolan cu celule umane HeLa în diviziune. După aspectul cromosomilor, stabiliţi fazele ciclului celular în care se găsesc celulele interfazice.

5. COMPOZIŢIA CHIMICĂ A CROMATINEI Observaţi la microscop sau pe fotografii preparate celulare colorate prin reacţia Feulgen şi reacţia cu verde de metil pironină. Precizaţi diferenţele observate şi explicaţi-le ţinând cont de specificitatea acestor reacţii.

6. ASPECTUL CROMATINEI LA MICROSCOPUL OPTIC Examinaţi la microscop şi pe fotografii aspectul nucleului interfazic la diferite tipuri de celule. Precizaţi tipurile de cromatină care se observă şi caracterizaţi-le morfologic.

7. MORFOLOGIA CROMOSOMILOR Analizaţi la microscop şi pe fotografii morfologia cromosomilor umani în metafaze obţinute prin culturi de limfocite. Desenaţi o metafază şi identificaţi elementele principale descrise în morfologia

Page 18: Aparatul Genetic

Aparatul genetic al celulei 18

cromosomilor, precum şi diferitele tipuri de cromosomi după poziţia centromerului.

III. VERIFICAREA CUNOŞTINŢELOR

A. DEFINIŢI NOŢIUNILE URMĂTOARE: - EREDITATE - INTERFAZA - CROMATINĂ - GENOTIP - FAZA G - EUCROMATINĂ 1 - GENOM - FAZA S - HETEROCROMATINĂ - PLASMOTIP - FAZA G - CROMOSOMI 2 - FENOTIP - FAZA G - CROMATIDĂ 0 - CICLU CELULAR - DIVIZIUNE - CENTROMER

B. ÎNTREBĂRI CU RĂSPUNS SIMPLU 1. Părinţii transmit la descendenţi caracterele lor (adevărat/fals?) 2. De ce un individ are o structură genetică unică, specifică? 3. Nucleul, mitocondriile, centriolii şi ribosomii alcătuiesc aparatul genetic deoarece

conţin ADN (adevărat/fals?) 4. Genotipul este informaţia genetică a celulei somatice. (adevărat/fals?) 5. Genomul constituie ansamblul genelor din cromosomii gameţilor. (adevărat/fals?) 6. Contribuţia maternă la ereditatea copilului este reprezentată de genomul ovulului

(adevărat/fals?) 7. Ce eveniment major are loc în faza S a ciclului celular? 8. Celulele din faza G09. Cancerul poate fi considerat o boală produsă prin perturbarea mecanismelor de

control ale ciclului celular (adevărat/fals?)

se pot divide (adevărat/fals?)

10. În eucromatină se găseşte ADN inactiv genetic. (adevărat/fals?) 11. Câţi cromosomi se găsesc în nucleul celulelor somatice? Câţi provin de la mamă?

Câte cromatide se observă la cromosomii metafazici? 12. Gonosomii sunt cromosomii celulelor sexuale. (adevărat/fals?) 13. Toţi cromosomii au o constricţie primară. (adevărat/fals?)

C. TESTE CU ALEGERE MULTIPLĂ I. La următoarele întrebări răspundeţi alegând un singur răspuns, cel mai bun din cele enunţate ("complement simplu"):

1. Care din următoarele organite celulare NU face parte din aparatul genetic al celulei: A. Nucleul; C. Mitocondriile; E. Ribosomii. B. Centriolii; D. Lizozomii;

2. Care este cea mai scurtă fază a ciclului celular: A. Faza G1 B. Faza G

; C. Faza S; E. Faza M. 0; D. Faza G

2

Page 19: Aparatul Genetic

Aparatul genetic al celulei

19

3. Cromocentrii reprezintă: A. Corpusculi de cromatină cu replicare precoce a ADN; B. Porţiuni de cromatină mai condensată şi mai intens colorată; C. Zona cu care cromosomul se fixează pe filamentele fusului de diviziune; D. Organitele care formează fusul de diviziune; E. Zonele terminale ale cromosomilor.

II. La următoarele întrebări răspundeţi astfel ("complement grupat"): A - dacă sunt corecte răspunsurile 1,2,3; B - dacă sunt corecte răspunsurile 1,3; C - dacă sunt corecte răspunsurile 2,4; D - dacă este corect răspunsul 4; E - dacă sunt corecte răspunsurile 1,2,3,4.

4. Care din următoarele organite celulare conţin ADN: 1. Nucleul; 3. Mitocondriile; 2. Centriolii; 4. Ribosomii. 5. În ce faze ale ciclului celular o celulă somatică umană normală are 92 de molecule de ADN: 1. Sfârşitul fazei S şi faza G2 2. Fazele S şi anafază; 4. Fazele G

; 3. Profaza şi metafaza; 2 şi G1

.

6. Heterocromatina facultativă este: 1. Prezentă numai în anumite celule; 2. Prezentă numai la sexul feminin; 3. Inactivă genetic; 4. Constituită din ARN şi proteine.

7. Care din următoarele afirmaţii privind centromerul sunt corecte: 1. Formează constricţia secundară; 2. Împarte cromosomul în două braţe; 3. Separă sateliţii de telomer; 4. Poziţia sa clasifică cromosomii în trei categorii.

III. La următoarele întrebări răspundeţi astfel ("teste tip cauză-efect"): A - dacă ambele propoziţii sunt adevărate şi între ele există relaţie cauză-efect; B - dacă ambele propoziţii sunt adevărate, dar între ele nu există relaţie cauză-efect; C - dacă prima propoziţie este adevărată, iar a doua falsă; D - dacă prima propoziţie este falsă, iar a doua este adevărată; E - dacă ambele propoziţii sunt false.

8. ADN este substratul material al eredităţii deoarece conţine informaţia genetică codificată.

9. În faza G2

cromosomii sunt bicromatidieni, deoarece a apărut factorul de condensare al cromosomilor.

Page 20: Aparatul Genetic

Aparatul genetic al celulei 20

10. Cromosomii submetacentrici au sateliţi deoarece, centromerul realizează o constricţie aproape de extremitatea braţelor scurte.

IV. Asociaţi enunţurilor din coloana din stânga, notate cu cifre, enunţurile corespunzătoare din coloana din dreapta, notate cu litere:

Asociaţi structurile celulare din coloana din stânga cu definiţiile sau caracteristicile (funcţiile) care le corespund, din coloana din dreapta: 11. Nucleul A. Formează fusul de diviziune 12. Mitocondriile B. Aspectul materialului genetic în interfază 13. Ribosomii C. Elementul principal al aparatului genetic 14. Cromatina D. Participă la sinteza proteinelor 15. Centriolii E. Conţin 0,5 % din ADN-ul celulei