Dr. Geta Hilma Medic primar microbiolog, Dr. St. Med.

DEFINITIIAntibiograma (ABG) = testarea

sensibilitatii unei tulpini bacteriene, izolata dintr-un produs patologic, la agentii antimicrobieni.

Antifungigrama (AFG) = testarea sensibilităţii fungilor la antifungice.

Prin antibiograma selectam antibioticele cele mai active fata de microorganismul testat.

Conditiile efectauarii antibiogramei1. ABG se face dupa stabilirea diagnosticului

etiologic, prin izolarea in cultura pura si prin identificarea agentului patogen.

2. Prin antibiograma alegem antibioticul cel mai eficace fata de care bacteria izolata are cea mai mare sensibilitate.

3. Daca tratamentul cu antibiotice este de lunga durata ABG se repeta ( microorganismul poate dobandi rezistenta pe parcursul tratamentului si se pot produce dismicrobisme care pot duce la infectii supra adaugate).

PRINCIPIUL ANTIBIOGRAMEI

Anibiograma se bazeaza pe efectul bactericid( omoara bacteria)

sau bacteriostatic(opreste multiplicarea) al antibioticelor fata de speciile bacteriene.

Metoda difuzimetricaSe efectueaza pe medii solide turnate in placi

Petri pe care s-a insamantat in panza cultura bacteriana.

Pe suprafata mediului se dispun rondele de antibiotice astfel incat in jurul acestora se va realiza un gradient de concentratie prin difuziunea locala a Ab ( in imediata vecinatate a rondelei se realizeaza o concentratie care scade pe masura indepartarii de rondela.)

Metoda da informati asupra sensibilitatii speciei testate fata de Ab utilizate, dar nu stabileste CMI ( cc. minima inhibitorie).

Metodologia standardizată de lucru

Mediul gelozatMediul de testare universal recomandat este Muller-Hinton

agar.Acest mediu nesuplimentat a fost ales pentru mai multe

motive:a demonstrat o bună reproductibilitate de la un lot la altulconţine puţini inhibitori de sulfonamide şi trimetoprimeste un bun mediu de cultură pentru majoritatea germenilor

nepretenţioşi, patogenieste folosit cu succes de mulţi ani, demonstându-şi calităţile.Formula mediului este:Extract de carne……………………..300,0gHidrolizat de cazeină…………………17,5gAmidon…………………………………1,5gAD……………………………………..1000ml

Ab germeni pretentiosiGermenii pretenţioşi, cum sunt Haemophilus,

Neisseria şi streptococii nu pot creşte satisfăcător pe acest mediu nesuplimentat, dar ei pot fi testaţi prin metoda difuzimetrică, prin suplimentarea mediului de bază Muller-Hinton cu factori de creştere specifici (adăugarea de sânge defibrinat sau chocolatizat, adăugarea de factori X şi V), incubarea în atmosferă de CO2 şi prelungirea perioadei de incubaţie.

Pt. Mycobacterium tuberculosis se foloseste mediul Lowenstein Jensen.

Turnare mediiGrosimea mediului, de 4 mm, este

importantă, deoarece AB difuzează în mediu atât în suprafaţă cât şi în profunzime, deci, o grosime mai mare duce la false rezistenţe (zone de inhibiţie eronat mai mici), în timp ce o grosime mai mică de 4 mm duce la creşteri false ale zonelor de inhibiţie, deci false sensibilităţi.

Controlul mediilorFiecare lot de mediu nou preparat

trebuie testat pentru asigurarea unui pH mediu de 7,2-7,4 la temperatura camerei; valori scăzute ale pH-ului pot altera rezultatele pentru aminoglicozide şi macrolide (false rezistenţe), sau ale penicilinelor (false sensibilităţi).

Stocare mediiPlăcile cu mediu pot fi stocate la

frigider mai multe zile, în pungi de plastic pentru a evita deshidratarea, iar înainte de utilizare vor fi introduse în incubator (10-30 min) pentru echilibrare termică şi îndepărtarea condensului format.

Inoculul Procedeele de inoculare Inoculul se prepara direct prin suspensia

câtorva colonii în SF, sau bulion Muller-Hinton, până la o turbiditate de 0,5 U Mac Farland (corespunzător cu 1-2 x 108 UFC) .

Standardizarea turbidităţii inoculului la 0,5 U Mac Farland se realizeaza cu un nefelometru standardizat produs de BioMérieux, sau cu densitometrul electric DENSIMAT (BioMérieux).

Inocularea gelozei Muller-Hinton cu această suspensie se va realiza în răstimpul a 15 min. de la preparare, pentru a preveni modificarea turbidităţii prin începerea creşterii bacteriene.

Insamantarea culturiiInocularea se va realiza cu tampoane de vată

sterile îmbibate în suspensia bacteriană, bine stoarse de excesul de lichid, prin ştergerea întregii suprafeţe a mediului gelozat în 3 direcţii, prin rotarea plăcii Petri , acoperind astfel întreaga suprafaţă. Geloza Muller-Hinton astfel inoculată va fi lăsată să absoarbă toată cantitatea de inocul depusă cca 5 min.( nu se vor depăşi 15 min. pentru a nu începe multiplicarea bacteriană), după care se pot aplica discurile cu AB.

Scopul final al inoculării mediului este realizarea unei creşteri bacteriene uniforme, sub formă de colonii confluente (sau semiconfluente după standardul francez, ce utilizează un inocul mai slab).

Discurile de antibiotice

În răstimpul celor 15 min. de la inoculare discurile de antibiotice vor fi aplicate ferm pe mediul gelozat, păstrând o distanţă între discuri de minimum 24 mm (de la centru la centru) pentru a evita suprapunerea zonelor de inhibiţie.

Unele antibiotice încep să difuzeze în mediu imediat după aplicare, astfel că odată aplicate pe mediu ele nu mai pot fi mutate.

Aplicarea discurilor se poate face fie individual, cu pense sterile, fie cu dispensere speciale care permit aplicarea concomitentă a 8-16 discuri, în funcţie de mărimea placii Petri utilizate (pe o placă Petri rotundă de 90 mm încap 6 discuri, pe una de 100 mm, 8 discuri, pe cea de 150 mm, 12 discuri, iar pe plăcile pătrate de 120/120 mm, 16 discuri).

Trusele de antibiotice Seturile de antibiotice utilizate set pentru stafilococi din infecţii localizate (cuprinzând : P, OX, E, L,

CM, RA,VA, GM, AN, NET, CIP, SXT) şi pentru stafilococi din hemoculturi (aceleaşi plus TEC, LZD şi furantoin, novobiocina în scop taxonomic) ;

set pentru bacili gram negativ din infecţii urinare (AM, AMC, CZ, CXM, CAZ, CRO/CTX, FOX, GM, NA, NOR, SXT, FT) şi pentru bacili gram negativ din infecţii sistemice (aceleaşi plus PIP, TZP, TIC, TCC, ATM, FEP, AN, NET, TM, IPM, CIP înlocuind NOR şi fără FT, SXT)

set pentru bacili gram negativ nefermentativi (ATM, CAZ, CFP, FEP, IPM, PIP, TZP, TIC, TCC, GM, TM, AN, NET, CIP, SXT, CS)

set pentru pneumococi (OX, E, CM, VA, SXT, OFX, RA, suplimentat pentru tulpinile invazive rezistente la P, cu E-test la AMX, CRO/CTX, CXM, MEM)

set pentru enterococi urinari (AM, FT, NOR, SXT, GMH, STRH) şi enterococi din hemoculturi (AM, VA, TEC, LZD, E, CM, RA, CIP, GMH, STRH)

set pentru Haemophillus (AM, AMC, CEC/CXM, CRO, SXT, RA, CIP ± IPM dacă tulpină invazivă)

Semnificatia prescurtarilorNB : AM-ampicilina, AMC-amoxi/clavulanic, AMX-

amoxicilina, ATM-aztreonam, AN-amikacina, CM-clindamicina, CAZ-ceftazidim, CRO-ceftriaxon, CFP-cefoperazona, CXM-cefuroxim, CZ-cefazolin, CIP-ciprofloxacina, CS-colistin, CTX-cefotaxim, CEC-ceclor, E-eritromicina, FOX-cefoxitin, FEP-cefepime, FT-furantoin, GM-gentamicina, GMH-gentamicina înaltă concentraţie, IPM-imipenem, L-lincomicina, LZD-linezolid, MEM-meropenem, NET-netilmicina, NOR-norfloxacina, NA-acid nalidixic, OX-oxacilina, OFX-ofloxacina, P-penicilina, PIP-piperacilina, Ra-rifampicina, SXT-biseptol, STRH-streptomicina înaktă concentraţie, TM-tobramicina, TIC-ticarcilina, TCC-ticarcilina/clavulanat, TEC-teicoplanina, TZP-piperacilina/tazobactam, VA-vancomicina.

Incubarea

După aplicarea discurilor de antibiotice şi nedepăşind cele 15 min.(spre a se evita predifuzia AB), plăcile sunt întoarse cu capacul în jos (pentru a nu se umezi de la condens) şi se introduc în incubator, la 350C, în atmosferă normală.

Incubarea în atmosferă ce conţine CO2 alterază rezultatele testării aminoglicozidelor, tetraciclinei şi macrolidelor, deaceea germenii nepretenţioşi care nu au nevoie de o astfel de atmosferă pentru creştere, vor fi incubaţi în atmosferă normală; dealtfel, criteriile de interpretare sunt valabile pentru aceste condiţii de incubare.

Pentru germenii pretenţioşi care cresc numai în atmosferă cu CO2 în concentraţie de 5%, ca şi pentru germenii anaerobi, criteriile de interpretare au fost stabilite ţinând cont de aceste condiţii de incubare.

Citirea şi interpretarea rezultatelor Toate plăcile cu germeni nepretenţioşi se

examineaza după 16-18 ore de incubaţie cu excepţia stafilococilor şi enterococilor, care necesită 20-24 de ore pentru detecţia meticilinorezistenţei şi respectiv rezistenţei la vancomicină.

Dacă plăcile au fost corect inoculate, zonele de inhibiţie sunt uniform circulare, iar coloniile crescute sunt confluente.

Diametrul zonei de inhibiţie completă este măsurat, incluzând şi diametrul discului, cu ajutorul unei rigle gradate, sau şubler.

Citirea şi interpretarea rezultatelorMăsurarea diametrelor pe plăcile cu Muller-Hinton

se poate realiza prin transparenţă, pe dosul plăcii, fără a o mai deschide, folosind o sursă de lumină oblică cu rigla sau cu sublerul.

Marginile zonei de inhibiţie sunt acelea unde nu există o creştere vizibilă a germenilor.

Interpretarea diametrelor măsurate pentru fiecare disc se face în concordanţă cu criteriile stabilite de normativul ales.

conform standardelor CLSI/NCCLS.Rezultatul se exprima in: S ( sensibil) I ( intermediar sensibil) R ( rezistent)

Tulpinile de referinţă

Setul de tulpini recomandate de CLSI/NCCLS şi utilizate pentru controlul AB: E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, S.aureus ATCC 25923, E. faecalis ATCC 29212, recomandat pentru controlul discurilor cu concentraţii înalte de gentamicină şi streptomicină, E. coli ATCC 35218, recomandat pentru controlul inhibitorilor de -lactamază, H. influenzae ATCC 49247 şi ATCC 49766, Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 şi S. pneumoniae ATCC 49619.

Controlul de calitate al testării difuzimetriceFrecvenţa testărilorToate loturile noi de mediu Muller-Hinton ca şi

cele de discuri trebuie testate cu tulpinile de referinţă înainte de a fi date în folosinţă pentru tulpinile clinice, iar controlul de calitate trebuie făcut regulat şi cât mai frecvent (cu o ritmicitate de unul pe lună pentru controalele uzuale, si in plus altele pentru loturile noi sau pentru combinaţiile deosebite germen/antibiotic).

Nu sunt permise abateri de peste 3 mm ale diametrelor de inhibiţie faţă de cele standard, iar atunci când aceasta se întâmplă, se iau măsurile corective necesare .

Antibiograma difuzimetrica

Antibiograma difuzimetrica

Antibiograma difuzimetrica

Metoda dilutiilor in medii lichideUrmareste derminarea limitei de sensibilitate a

germenului fata de substanta data, indicand cc. de antibiotic necesara pentru inhibarea dezvoltarii sale.

Tehnica-la dilutii crescande de AB facute direct in mediu de

cultura lichid, se insamanteaza cantitati egale de cultura bacteriana , stabilindu-se dilutia maxima de antibiotic in prezenta careia tulpina este inhibata.

-pentru fiecare AB se face o dilutie de pornire- mediul de cultura utilizat este bulionul glucozat 2%

Metoda dilutiilor in medii lichideSe utilizeaza 10 tuburi cu bulion glucozat 1

ml in fiecare tub. In primul tub se adauga 1 ml din sol de antibiotic , se omogenizeaza si se trece 1 ml in al doi-lea tub si asa mai departe pana pana in tubul 9 din care se arunca 1 ml.

Se insamanteaza tuburile cu cate o picatura din cultura de testat.

Tubul 10 este martorIncubare 18-20 h la 370C,

Metoda dilutiilor in medii lichideCitireUltimul tub limpede reprezinta limita

sensibilitatii germenului fata de antibioticul utilizat sau CMI= Concentratia Minima Inhibitorie.

Daca se adauga un indicator de ph cresterea bacteriana este pusa in evidenta in 4 h prin virarea culorii indicatorului de ph-ului.

METODA AUTOMATA :

Se realizeaza cu analizorul MiniAPI conform indicatiilor din prospect specifice fiecarui tip de germene, respectiv utilizandu-se urmatoarele galerii de antibiograma: ATB Staph, ATB Strep, ATB GN, ATB Enterococ. Se urmaresc indicatiile de realizare a inocului, de incubare si de interpretare specifice, descrise in inserturi.

Principiul este cel al unei antibiograme prin microdilutii cu puncte de ruptura.

Citirea se face automat prin softul analizorului MiniAPI, inclusiv interpretarea in sistem EXPERT.

E-TestulEste varianta perfectionata a metodei difuzimetrice

prin care se determina CMI a unui antibiotic.Metoda foloseste in locul microcomprimatelor cu

antibiotic cate un epsilometru pentru fiecare antibiotic ( fasii de material plastic, gadate, imbibate cu cate un antibiotic). Gradatiile indica valorile CMI in mcg/ml. Pe suprafata mediului insamantat se depun radial la distante convenabile epsilometrele si se incubeaza.

Zonele de inhibitie apar de-a lungul epsilometrului si au forma ovalara. Valoarea CMI se citeste pe epsilometru si corespunde gradatiei aflate la intersectia cu limita de inhibitie.

ANTIFUNGIGRAMA

Testarea sensibilităţii la antifungice este în prezent standardizată numai pentru metodele cu macro şi microdiluţie şi respectiv E-test. Deaceea în laboratoarele clinice obişnuite se practică fie antifungigrama pe galerii automate de tipul celor MiniAPI, ce au ca principiu metoda microdilutiilor, fie E-testul.

E-test