ANALIZELE PROBELORANALIZELE PROBELORBIOLOGICEBIOLOGICE

-- BIOANALIZABIOANALIZA --

Prof.dr.ing. GabrielProf.dr.ing. Gabriel--Lucian RADULucian RADU

14 cursuri14 cursuriStandardizarea procesului de analizăStandardizarea procesului de analizăC9

Procedee de analiză complexăProcedee de analiză complexăC8.

Biosenzori cu aplicaBiosenzori cu aplicattiiii îîn bioanalizăn bioanalizăC7.

Metode imunochimice de analizăMetode imunochimice de analizăC6.

Metode electroanaliticeMetode electroanaliticeC5.

Metode spectrometrice de analizăMetode spectrometrice de analizăC4.

MetodeMetode ssi tehnici de separarei tehnici de separareC3.

Metode de prelevare a probelor biologice siMetode de prelevare a probelor biologice siprelucrarea in vederea analizeiprelucrarea in vederea analizei

C2.

PrincipiilePrincipiile ssi aplicai aplicattiile bioanalizeiiile bioanalizeiC1.

ConConttinuturiinuturiCapitolul

TITULARI DISCIPLINAProf.dr.ing. Gabriel-Lucian RADU

S.l.Dr. Emanuela CRACIUN

Studenţii vor fi evaluaţi în mod continuu, atât în cursul semestrului, cât şi lafinal, alocându-se următoarele ponderi în notarea finală:

Activitate la curs (răspuns la întrebări, implicareîn activitatea din cadrul cursului, teme de casă) 10% din nota finalăPerformanţa în activităţile aplicative 40% din nota finalăExamen 50% din nota finală

•Activităţile evaluate şi ponderea:10% activitatea pe parcurs, 40% evaluare laborator, 50% examen

b) Cerinţele minimale pentru promovare:Parcurgerea tuturor lucrărilor de laborator;

Obţinerea a 50% din punctajul total;Obţinerea a 50% din examenul final.

c) Calculul notei finale:Calculul notei finale prin rotunjirea punctajului final total.

EVALUARE

Domenii de aplicabilitateDomenii de aplicabilitate

monitorizareamonitorizarea calitatiicalitatii vietiivietii sisi mediuluimediului

valorificareavalorificarea deseurilordeseurilor

iindustriandustria chimicochimico--farmaceuticafarmaceutica

biologiebiologie--bbiotehnologieiotehnologie

medicinamedicina

aparareaparare

INSTRUMENTUL BIOANALITICINSTRUMENTUL BIOANALITICidealideal

selectivselectiv

specificspecific

reproductibilreproductibil

utilizareutilizare simplasimpla

compactcompact

rapidrapid

ieftinieftin

fiabilfiabil

AlegereaAlegereametodeimetodei sisi instrumentuluiinstrumentului

probaproba

instrumentinstrument

metodametoda

**stareastarea dede agregareagregare

**omogenitateaomogenitatea

**istoriaistoria probeiprobei

**securitateasecuritatea

**sensibilitateasensibilitatea

**mediumediu (t, p, etc.)(t, p, etc.)

**acceptabilitateaacceptabilitatea

TEHNICATEHNICAMETODAMETODA

PROCEDEUPROCEDEUPROTOCOLPROTOCOL SP

ECIF

ICIT

ATEA

•• CALITATIVACALITATIVA•• SEMISEMI--CANTITATIVACANTITATIVA

•• CANTITATIVACANTITATIVA

INFORMATIAANALITICA

•• SCREENINGSCREENING•• RUTINARUTINA

•• RECUNORECUNOASTEREASTERE•• STANDARDSTANDARD•• REFERINTAREFERINTA

•• PRIMARAPRIMARA

INCR

EDER

EA

Clasificarea metodelor analitice în funcţie decantitatea de determinat

10-2μgSub-micro1 μgUltra-micro1 mgMicro10 mgSemi-micro100 mgMacro

Marimeaaproximativa

Metoda

Tehnicile de analiză si principalele aplicatii

Calitativa si cantitativa pentruCalitativa si cantitativa pentrumajoritatea.majoritatea.

Caracteristicile radiaCaracteristicile radiaţţiilor ionizanteiilor ionizantenucleare emise de analitnucleare emise de analit

Analizaradiochimica

Calitativa si cantitativa pentruCalitativa si cantitativa pentrumajoritatea.majoritatea.

Proprietatile electrice ale analituluiProprietatile electrice ale analituluiin solutiein solutie

Analizaelectrochimica

Caracterizarea compusilorCaracterizarea compusilormajoritari sau minoritarimajoritari sau minoritarisinguri sau in amestecsinguri sau in amestec

Schimbări fizice sau chimiceSchimbări fizice sau chimice îînnanalit atunci când esteanalit atunci când este îîncălzit sauncălzit saurăcitrăcit

Analiza termica

Separarile cantitative siSepararile cantitative sicalitative ale amestecurilorcalitative ale amestecurilor

Diferite proprietăDiferite proprietăţţi fizicoi fizico--chimice alechimice aleanalianaliţţilor separatiilor separati

Cromatografia sielectroforeza

Calitativa sau structuralaCalitativa sau structuralapentru majoritatea majorepentru majoritatea majore îînnjos pentru a urmărijos pentru a urmăricomponentele nivel izotopcomponentele nivel izotopraporturiraporturi

Masa analitului sau fragmente din eaMasa analitului sau fragmente din eaSpectrometria demasa

Calitativa,cantitativa sauCalitativa,cantitativa saustructurala pentrustructurala pentrucomponentele majorecomponentele majore

Lungimea de undăLungimea de undă şşi intensitateai intensitatearadiaradiaţţiilor electromagnetice emiseiilor electromagnetice emisesau absorbite de analitsau absorbite de analit

Spectrometriaatomica simoleculara

Cantitativa pentru componenteCantitativa pentru componentemajore sau minoremajore sau minore

Volumul soluVolumul soluţţiei reactivului standardiei reactivului standardreacreacţţionează cu analitulionează cu analitul

Titrimetria

Cantitativa pentru componenteCantitativa pentru componentemajore sau minoremajore sau minore

Greutatea analitului pur sau compusGreutatea analitului pur sau compuscu stoichiometrie cunoscutacu stoichiometrie cunoscuta

Gravimetria

Principalele domeniiPrincipalele domeniide aplicarede aplicare

Proprietatea masurataProprietatea masurataTehnicaTehnica

TEHNICATEHNICA

M E T O D AM E T O D A

ProceduraProcedura

ProtocolProtocol

ProcesulProcesul bioanaliticbioanaliticPrelucrareaPrelucrarea

datelordatelorOperatiiOperatii

preliminarepreliminare

RezultateRezultateProbaProbabrutabruta

MasurareaMasurarea sisitrasabilitateatrasabilitatea

MODEL

PROBA

ANALIZA

PLAN

EVALUARE

Defineste scopul

Selecteaza procesul analitic,numarul analizelor si centrele deanaliza pe baza scopurilor sicosturilor

Colecteaza probele, testepreliminare

Efectueaza operatii de ajustareaconditiilor, separarea intereferente,efectueaza masurarile siachizitioneaza datele

Selecteaza dintre date valoarea ceamai buna, estimeaza sigurantavalorii, revizuieste si repeta daca estenecesar

REPREZENTAREA PROCESULUI ANALITIC GLOBALREPREZENTAREA PROCESULUI ANALITIC GLOBAL

Strategia analiticăObținerea probei

Pregătirea probei

Aplicarea metodei de analiză

Obținerea datelor legate de greutatea sau volumul probeipregătite

Prepararea soluțiilor standard ale analitului sau a altorsubstanțe care vor reacționa cu analitul

Standardizarea soluțiilor sau calibrarea echipamentului

Obținerea datelor experimentale

Raportarea rezultatelor

Prelucrarea datelor

BazeleBazele măsurării instrumentale măsurării instrumentaleTraductori, Procesoare de semnal, Afișatoare și Surse de Curent

Soluții standardSoluții cu probe Traductor Procesoare

de semnal

Sursă de curent

Dispozitivde afișare

Traductor - convertește o proprietate a soluției în semnal electric

Procesoare de semnal - convertește semnalul într-o formăutilizabilă

Dispozitiv de afișare - afișează semnalul într-o formă ce poate fiînțeleasă de analist

ComponentComponentele de baza aleele de baza ale unuiunuiiinstrumentnstrument

GENERATOR

SEMNAL

Detector

Tranductor

Procesor

SemnalInregistrator

SURSA DECURENT

Semnal

analitic

SemnalSemnal

electricelectricmecanicmecanicopticoptic

Semnal

iesire

- semnal electric proporțional cu concentrația

TendinteleTendintele inin domeniuldomeniul dezvoltariidezvoltariiinstrumentelorinstrumentelor bioanaliticebioanalitice

prezentprezent

viitorviitor multinivelmultinivel

multimod

multimod

modmod

dimensiunedimensiune

mul

tidi

men

sion

alm

ulti

dim

ensi

onal

com

plex

itat

eco

mpl

exit

ate

MULTIFUNCTIONALMULTIFUNCTIONAL

hardware

marimeamarimea ((u.au.a.).)

inte

rfet

ein

terf

ete

elec

tron

ice

elec

tron

ice software

Molaritatea: Numarul de moli dintr-o substantaintr-un dm3de solutie Un mol: egal cu masa moleculara a

substantei Masa moleculara:

Da: daltonikDa: Kilodaltoni = 1000 DaMr: nici o unitate

Masa moleculara relativa== MasaMasa molecularmolecularaa aa unei substanunei substanttee iinn

raport curaport cu 1/12 din1/12 din masa atomicmasa atomicaa aa 1212CC.. 17

Unitatea S.I. pentru exprimareaconcentratiilor

• Conversie mol, mmol si µmol in volume diferitepentru a da diferite concentratii

•• SubstanteleSubstantele biologicebiologice suntsunt frecventfrecvent prezenteprezente ininconcentratiiconcentratii relativrelativ scazutescazute. In. In sistemelesistemele ““in vitroin vitro””volumelevolumele solutiilorsolutiilor utilizateutilizate frecventfrecvent inin scopuriscopuriexperimentaleexperimentale suntsunt, de, de asemeneaasemenea,, micimici.. ConsecintaConsecintaesteeste caca solutiilesolutiile experimentaleexperimentale suntsunt, de, de obiceiobicei inin mmolmmoldmdm --33,, µµmol dmmol dm--33 sisi nmolnmol dmdm--33 decatdecat molar.molar.

RaportulRaportul SemnalSemnal // ZgomotZgomotSemnalSemnal == informainformattiaia despredespre analitanalit carecare

este de interes pentru chimisteste de interes pentru chimistZgomotZgomot == informainformattiaia externexternaa care nucare nu

esteeste necesarnecesaraa deoarecedeoarece degradeazdegradeazaaacurateacuratetteaea ssii precizia analizeiprecizia analizei ssiimicmicssoreazoreazaa cantitatea decantitatea de analitanalit carecarepoate fipoate fi detectatdetectatS/Z = meS/Z = mediadia//deviadeviaţţiaia standard = x/sstandard = x/sS/Z = 1/ RSDS/Z = 1/ RSD

undeunde RSD =>RSD => deviadeviaţţiaia standardstandard relativărelativă, s/x, s/x

Surse deSurse de zgomotzgomotîîn analizelen analizele intrumentaleintrumentale

•• Zgomot chimicZgomot chimic•• rezultă din variabilerezultă din variabile iincontrolabilencontrolabile

ccareare afectează analiza chimică afectează analiza chimică•• Zgomot instrumentalZgomot instrumental•• TTipuriipuri•• Zgomot termicZgomot termic•• ZgomotZgomot ţţintăintă•• Zgomot slabZgomot slab•• Zgomot de mediuZgomot de mediu

ModalităModalităţţi pentru reducereai pentru reducerea zzgomotuluigomotuluiÎÎmpământarempământare şşi protejarei protejareAmplificatori diferiAmplificatori diferiţţiiFiltrareFiltrareModulareModulare““TăiereaTăierea”” semnaluluisemnaluluiBlocarea amplificatorilorBlocarea amplificatorilor

MetodeMetode SoftwareSoftware-- S/ZS/Z intensitatea laintensitatea la nn0.50.5,, undeunde nn este mediaeste media mmaasursuraarilorrilor-- AdunareaAdunarea intensitatiiintensitatii medii amedii a semnalelorsemnalelor

Media semnalelor 1Media semnalelor 1--3, 53, 5--7,etc7,etc..-- FiltrareFiltrare DigitalDigitalaa-- Metode de CorelareMetode de Corelare-- AdunareaAdunarea intensitatiiintensitatii medii amedii a semnalelorsemnalelor

Adunarea intensităţii medii a semnalelor

Se observă că scalaverticală este maimică decât numărulscanărilor. Astfel,zgomotul creşte învaloare absolutăodată cu creştereanumărului scanărilor.Totusi, valoarearelativă a semnaluluianalitic creşte.

Efectul medierii semnalelor

SurseleSursele dede eroareeroare inin bioanalizabioanaliza

100%100%

10%10%

1%1%

samplingsampling analizaanalizapropriupropriu--zisazisa

prelucrareaprelucrareadatelordatelor

coeficientcoeficientdede variatievariatie

timptimp40%40% 30%30%20%20%

Erori de masurare: Toate procesele de masurare sunt supuse erorilorce afecteaza datele numerice si care decurg dintr-o varietate de cauze.

Erori absolute si relative: O eroare absoluta este diferenta numericadintre o valoare masurata si o valoare reala sau o valoare acceptata. Eroarearelativa este eroarea absoluta impartita la valoarea reala sau acceptata.

Erori determinate: Sunt cunoscute ca fiind erori sistematice, eleaparand, in general, din surse determinate, identificabile, care duc lavarierea valorilor masurate de la valoarea reala la cea acceptata.

Erori nedeterminate: Sunt cunoscute si sub numele de erori aleatorii,ele aparand dintr-o varietate de surse necontrolate si cauzeaza mici variatiialeatorii in masuratorile cantitative cand masurarea este repetata de unnumar de ori.

Erori cumulate: Cand diferite masuratori sunt combinate pentru acalcula un rezultat analitic global, erorile asociate acestor masurariindividuale contribuie la erori totale sau acumulate.

ERORI IN MASURARILE ANALITICE

SurseleSursele dede erorierori (I)(I)ErorileErorile de lade la reactivireactivi-- Reactivii si solvenReactivii si solvenţţii suntii sunt impuri.impuri.-- Depozitarea improprie de reactivi.Depozitarea improprie de reactivi.-- Neglijarea datei de expirare a reactivului.Neglijarea datei de expirare a reactivului.-- Evaporarea reactivilor.Evaporarea reactivilor.-- Respectare gradelor siRespectare gradelor si puritpuritaaţţilorilor diferite.diferite.Erorile materialului de referinţă- Impuritatea materialelor de referinţă.- Erorile de la introducerea unor substanţe.- Schimbările datoritã depozitãriinecorespunzãtoare.- Erorile în pregãtirea materialul de referintă.- Utilizarea materialul de referintă expirat.

SuSurserselele dede erorierori (II)(II)MetodeleMetodele generale alegenerale ale erorilorerorilor-- Devierea de la procedura deDevierea de la procedura de analizanalizaa-- NeluareaNeluarea iinn seama a limitei deseama a limitei de detectdetectieie-- NeluareaNeluarea iinn seama aseama a spaspattiuluiiului dede cocollectareectare-- Calcularea erorilorCalcularea erorilor (dilu(diluaariri, amestecuri,, amestecuri,adadaaugari)ugari)

-- FFolosiolosirearea unorunor procedurprocedurii analiticanaliticee inincorectcorectee

ErorileErorile dede calibrarecalibrare-- Erorile aleErorile ale mmaasurarilorsurarilor volumetricevolumetrice-- Erorile deErorile de ccaantarirentarire-- ReglareaReglarea inexactinexactaa aa echipamentechipamentuluiului

SurseleSursele dede erorierori (III)(III)ErorileErorile dede lala echipamentechipamentEchipamentul nu este curat.Echipamentul nu este curat.IIntretinereantretinerea lui estelui este neglijatneglijataa..InfluenInfluenttaa temperaturii,temperaturii, electricielectricitattatiiii sisi influeninfluenttaa mmagneticagneticaa..EroriErori îîn folosirea auton folosirea auto--pipetepipetelorlor necalibratenecalibrate, pipetele, pipetele nunu

suntsunt ataatassateate in modin mod corectcorect sausau sunt contaminasunt contaminatte.e.EroriErori iinn folosirea pipetelor defolosirea pipetelor de sticlsticlaa (se pot(se pot deterioara,deterioara,

materialemateriale de calitate mai slaba,de calitate mai slaba, eleele potpot fifi ccontaminaontaminatteeanterioranterior).).

ErorileErorile lala spectrospectrometrumetru (lungimea de undã gre(lungimea de undã greşşita, lampã deita, lampã deintensitate insuficientã, optica murdarintensitate insuficientã, optica murdarăă, ignorarea efectului de, ignorarea efectului deddeviaeviaţţieie,, îîn mod incorect zeroul configurat, introducerea probein mod incorect zeroul configurat, introducerea probeiîîntrntr--o camera luminoasa).o camera luminoasa).

Erorile cuveErorile cuveii (defecte ce nu sunt luate(defecte ce nu sunt luate îîn consideran consideraţţie,sticlaie,sticlanecorespunzãtoare de cuvnecorespunzãtoare de cuvaa, cantitate insuficienta, umedã, cantitate insuficienta, umedã ppeeexterioar, bulele de aer, contaminareexterioar, bulele de aer, contaminare))..

SurseleSursele dede erorierori (IV)(IV)InregistrareaInregistrarea semnalelorsemnalelor sisi descriereadescrierea erorilorerorilor-- Domeniul incorect deDomeniul incorect de raportareraportare-- Erorile deErorile de citirecitire-- EErorilerorile dede scrierescriere-- Schimburile deSchimburile de informainformaţţiiii

CalcululCalculul erorilor.erorilor.-- Erorile aritmeticErorile aritmeticee, erorile de, erorile de virgulvirgulaa,,

unitunitaattii incorecteincorecte-- ErorileErorile circularecirculare-- NeluareaNeluarea iinn calculcalcul aa valorilvaloriloror volumuluivolumului

dede reactivreactiv adaugatadaugat-- ErorileErorile iinn factorul defactorul de diluarediluare

VARIABILITATEA BIOLOGICAVARIABILITATEA BIOLOGICA

Identificarea naturii variaIdentificarea naturii variațțieiieibiologicebiologice

Ce seCe se îînnțțelege prin termenul deelege prin termenul devariavariațției biologică in contextuliei biologică in contextulbiochimiei clinice?biochimiei clinice?

O componentă a diversităO componentă a diversitățțiiiimăsuratorilor biochimiei determinatemăsuratorilor biochimiei determinatede fiziologia subiectelor observate.de fiziologia subiectelor observate.

ComponenteleComponentelevarianvarianțțeiei îînnmăsurarilemăsurarilebioanaliticebioanalitice

•• VarianVarianțța analiticăa analitică•• VarianVarianțță biologică la un subiectă biologică la un subiect•• VarianVarianțță biologicăă biologică îîntre subiecntre subiecțții

Surse deSurse deVariaVariațțieie

BiologicăBiologică

•• Ritmuri biologice(timpulRitmuri biologice(timpul))•• HomeostazieHomeostazie•• VârstăVârstă•• SexSex•• EtnieEtnie•• PatologiePatologie•• StimuliStimuli

CuantificareaCuantificarea variatieivariatiei biologicebiologice

•• Cum se faceCum se face cuantificareacuantificarea variatieivariatiei biologicebiologice??TrebuTrebuie analizateie analizate componentelecomponentele varianteivariantei::

σσ²²totaltotal ==σσ²²analiticanalitic ++ σσ²²iindividualndividualăă ++ σσ²²ggruprup

σσ²² analiticanalitic ==VariaVariannțțaa mediemedie dede testeteste identiceidentice îînn termentermen dede varianvarianțțăăanaliticanaliticăă

σσ²² iindividualndividualăă =Media biologic=Media biologicăă îînn varianvarianțțaa subiecsubiecțțilorilor

σσ²²ggruprup=Varian=Varianțțaa valorilor mijlociivalorilor mijlocii îîntre subiecntre subiecțți. Variani. Varianțța in punctele dea in punctele desetare homeostaticesetare homeostatice

CuantificareaCuantificareavariavariațțieiiei biologicebiologice

•• Cum se faceCum se face experimentulexperimentul??–– SubiectiSubiecti CCââțți?i?

–– ColectareaColectarea exemplarelorexemplarelorNumNumăăr?Frecver?Frecvennțța?a?

–– AnalizareaAnalizarea exemplareloexemplareloDiminuareaDiminuarea σσ²²analiticanalitic ??

–– AnalizareaAnalizarea datelordatelorValoriValori extreme?Statisticextreme?Statisticăă??

–– AplicareaAplicarea rezultatelorrezultatelor analizeianalizei

VariaVariațția biologicăia biologică șși utilizareai utilizareaintervalelor de referinintervalelor de referințțăă

ProceduriProceduri--ProtocoaleProtocoale•• Erorile analitice trebuie reduse cât mai mult.Erorile analitice trebuie reduse cât mai mult.•• Analiza idealăAnaliza ideală::

•• Un singur tip de reactivi de testareUn singur tip de reactivi de testare•• Un singur analizorUn singur analizor șși sistem analitici sistem analitic•• Număr cât mai mic de seriiNumăr cât mai mic de serii

CondiCondițțiile ar trebui sa reducă variabilele preiile ar trebui sa reducă variabilele pre--analitice.analitice.•• SubiecSubiecțți sănătoi sănătoșșii•• Moduri normale de viaModuri normale de viațțăă•• Fără droguriFără droguri(alcool , tutun )(alcool , tutun )•• Flebotomie de la aceeaFlebotomie de la aceeașși persoanăi persoană•• AcelaAcelașși moment al zilei la intervale regulatei moment al zilei la intervale regulate•• Stabilirea unor reguli pentru transportulStabilirea unor reguli pentru transportul

probelor, prelucrareprobelor, prelucrare șși păstrarei păstrare

CantitateUnități

Grup Medie CVI CVG Indicele deindividuali

tate

µµmol/Lmol/L bărbatbărbat (7)(7) 83.983.9 3.43.4 6.86.8 0.540.54

µµmol/Lmol/L FeFemeiemeie(8)(8) 71.471.4 4.94.9 11.811.8 0.410.41

µµmol/Lmol/L** totitoti (15)(15) 83.983.9 4.14.1 14.114.1 0.290.29

µµmol/Lmol/L ?? ?? 5.35.3 14.214.2 0.40.4

µµmol/Lmol/L**** N= 20N= 20BarbatBarbat 77FFeemeiemeie 1313

7777 4.74.7 14.414.4 0.330.33

Creatininaµmol/LCreatininaµmol/L

Probabilitate (%)Probabilitate (%)

Creatininade start

96 µmol/L

•• Limite de referintă superioarLimite de referintă superioaree ::–– BarbatBarbat= 106= 106 µµmol/Lmol/L–– FemFemeieeie= 80= 80 µµmol/Lmol/L

•• CVCV mai mare pentru bărbamai mare pentru bărbațțiidecât pentru femeidecât pentru femei