Alexei Baerle Abstract

download Alexei Baerle Abstract

of 22

Transcript of Alexei Baerle Abstract

UNIVERSITATEA DE STAT DIN MOLDOVA

Cu titlu de manuscris C.Z.U.: 544.3 : 66.067 : 547.97

Alexei Baerle STUDIU PRIVIND SEPARAREA I STABILIZAREACOLORANILOR ANTOCIANICI DIN ARONIA MELANOCARPA

Specialitatea 02.00.04 Chimia Fizic

AUTOREFERAT

al tezei de Doctor n Chimie

Chiinu, 2006

Teza a fost elaborat n Catedra Chimie, Facultatea Inginerie i Management n Industria Alimentar a Universitii Tehnice a Moldovei Conductor tiinific: Vasile Guanu, dr. hab. n Chimie, prof. univ., Universitatea de Stat din Moldova Refereni oficiali: 1. T. Lupacu, dr.hab. n Chimie, prof. univ. Institutul de Chimie al A.. R.M. 2. T. Isac, dr. n Chimie. Universitatea de Stat din Moldova

Susinerea public a tezei va avea loc __________ 2006 ora ___ n edina consiliului tiinific specializat DH 30.02.00.04 din cadrul Universitii de Stat din Moldova Pe adresa: Chiinu, A. Mateevici, 60 (Blocul de studii IV al U.S.M.), aula _______. Teza de doctor i autoreferatul pot fi consultate n bibliotecile Universitii Tehnice a Moldovei i a Universitii de Stat din Moldova Autoreferatul a fost expediat la ________________ 2006 Secretar tiinific al Consiliului tiinific Specializat, dr. n Chimie, conf. _________________ Gona Maria Autor Baerle Alexei1

__________________Copyrights Alexei Baerle, 2006

CONSIDERAII GENERALEActualitatea temei: Conceptul de dezvoltare durabil a societii include utilizarea eficient i deplin a surselor materiale de origine natural. Aceast problema este extrem de important pentru Republica Moldova, fiind legat cu dezvoltarea agriculturii i a industriei alimentare ramuri strategice ale economiei naionale. Gradul de prelucrare a materiei prime organice autohtone este mic, iar importul adaosurilor alimentari mai mrete sinecostul produciei. Adaosuri alimentari sintetici au caliti nutritive dubioase, fiind alergeni, cancerigeni, etc. nlocuirea acestora cu substane inofensive naturale este o problema strategic global, legat de pstrarea sntii i a genofondului omenirii. Antocianii sunt colorani, caracteristici majoritii fructelor i legumelor. Ei posed proprieti homeostatice, hipotensive, cardioprotectoare i antitumorale. n Republica Moldova exist o diversitate de surse vegetale, care ar putea servi pentru obinerea antocianilor, dintre care una de perspectiv este scoruul negru (Aronia Melanocarpa), drept depozit natural al substanelor biologic active. Problema stabilitii antocianilor este foarte actual pentru industria alimentar. n literatura pur chimic acestei probleme sunt consacrate puine lucrri. Chimia fizic cu strategiile ei de cercetare permite de a studia diferite tipuri de obiecte i sisteme, inclusiv i cele naturale. Suportul puternic va aduce planificarea matematic a experimentului, care asigur cercetarea cantitativ, raional i multilateral a sistemului i aprecierea statistic a rezultatelor. Considerm, c prezenta lucrare va contribui n msura sesizabil la apropierea fizico-chimitilor ctre problemele industriei alimentare, concomitent, va permite tehnologilor s in cont de fizico-chimismul proceselor, care au loc cu antociani i n prezena acestora n sistemele model i, ndeosebi, n cele reale. Obiectivele investigaiilor: Obiectivul cadru const n cercetarea influenei cantitative a mai multor factori asupra stabilitii antocianilor. Atingerea acestui scop necesit realizarea urmtoarelor obiective operaionale: - Studierea influenei factorilor chimici i fizico-chimici asupra stabilitii antocianilor n decursul tuturor etapelor de prelucrare a acestora; - Elaborarea metodelor noi de cercetare a antocianilor, accesibile pentru laboratoarele care nu dispun de echipamentul de nalt performan; - Cercetarea proceselor de separare a antocianilor de substane balast i propunerea metodelor noi de obinere a antocianilor n stare pur, cristalin; - Cercetarea stabilitii antocianilor n contextul proprietilor lor biochimice i fizico-chimice antioxidante i antiradicalice. Inovaia tiinific i valoarea aplicativ a lucrrii: - a fost propus mecanismul, care elucideaz aportul solvenilor organici asupra stabilitii antocianilor n timpul extraciei i depozitrii extractelor; - au fost cercetate proprietile cromatografice ale antocianilor din Aronia i precizat profilul antocianic al fructelor;

2

Copyrights Alexei Baerle, 2006

au fost elaborate dou metode noi de analiza separat ale speciilor hidrosolubile i a agliconilor antocianici, care n perspectiv pot fi utilizate n condiii de cmp, n laboratoare industriale, de cercetare i didactice; - a fost evideniat fenomenul catalizei intensive acide a glucozidelor antocianice pn la aglicon n faza sulfocationitului n H-form, care elucideaz influena structurii sorbentului asupra stabilitii antocianilor; - a fost descoperit fenomenul sinergismului acido-alcoolic de desorbie a antocianilor din faza sulfocationitului i elucidate cauzele apariiei lui; - au fost elaborate metode noi, la nivel de invenie, de obinere a preparatelor antocianici n stare pur, cristalin; - au fost cercetate proprietile reductoare ale antocianilor, utiliznd metoda nou electrochimic, elaborata la Catedra Tehnologia Conservrii a U.T.M. Au fost constatate proprietile antioxidante i antiradicalice ale agliconului, respectiv, valoarea aplicativ a lui. Aprobarea lucrrii la foruri tiinifice naionale i internaionale: Rezultatele au fost expuse i discutate n cadrul conferinelor internaionale: a VI-a Conferina (Moscova, 2002); I-ul Simpozion Biochimie i Biotehnologii n Industria Alimentar (Chiinu, 2002); I-a Conferina Internaional a Societii Chimice din Moldova Achievements and Perspectives in the Modern Chemistry (Chiinu, 2003); a XXVIII-a Conferina Naional de Chimie (Vlcea, Romnia). Rezultatele de asemenea au fost expuse n cadrul Conferinelor Tehnico-tiinifice a Studenilor i Doctoranzilor U.T.M. (Chiinu, 2002, 2003); Conferinei Tehnico-tiinifice Jubiliare a Profesorilor, Doctoranzilor i Studenilor U.T.M. (2004). Inveniile au fost apreciatele n cadrul salonului Chiminvent-2005 (Iai) cu medalia de argint Petru Poni. Publicaii: La tema tezei au fost publicate 13 lucrri tiinifice: 4 articole tiinifice, 2 brevete de invenie, 7 rezumate. Structura i volumul tezei: Teza este expus pe 102 pagini dactilografiate i este alctuit de lista abrevierilor, introducere, analiza literaturii, descrierea metodelor de cercetare, discuia rezultatelor experimentale i concluzii. Bibliografia include 155 surse. Sunt prezentate adnotri n limbile romn, engleza i rus. Lucrarea include 6 scheme, 20 figuri i 25 tabele. Cuvinte cheie: antociani, planificarea matematic, separarea, stabilizarea, factori fizico-chimici, analiza cantitativ, schimbtori de ioni, sinergismul de desorbie, preparate cristaline, aciunea antiradicalic.

-

CONINUTUL LUCRRIICapitolul I. INTRODUCERE Acest compartiment conine argumentarea actualitii temei abordate, obiectivele i sarcinile investigaiilor. Sunt reflectate noutatea tiinific i valoarea aplicativ a rezultatelor. Este indicat valoarea publicaiilor tiinifice, n care a fost expus coninutul tezei.3 Copyrights Alexei Baerle, 2006

Capitolul II. ANALIZA LITERATURII II.1. Diversitatea i unele propriei ale fenolilor vegetali Fenolii vegetali se mpart n fenoli neflavonici, flavonoizi i taninuri. Aceste substane determin n mare msura gustul, aroma i culoarea produselor vegetale, de asemenea manifest proprieti farmacologice remarcabile. II.2. Clasificarea antocianilor Termenul antocian provine de la cuvintele anthos (floarea) i cyanos (albastru). Pigmenii cu structura flavilic se caracterizeaz printr-o diversitate natural mare, amplificat datorit variaiilor structurale n funcie de pH i de complexare. OH8 7 6 5 4

O

+

2'

3'

4' 3 6' 5'

HO

O

+

I.

II.OH

O HO

1

OH HO O6

OH

inelul A inelul B HO Fig.1. I. Numerotarea cationului de flaviliu; II. 3-(1-O-glucozid) de cianidin

II.3. Extracia antocianilor din materii prime Tehnologia utilizat de extracie trebuie s asigure extracia cea mai ampl a produsului necesar, contaminarea minim cu substane parazite, evitarea descompunerii enzimatice i neenzimatice a extractului. II.4. Obinerea preparatelor antocianice Metoda eficient de purificare a antocianilor const n folosirea cromatografiei de adsorbie, inclusiv pe cationii. Cromatografia n stratul subire se folosete pentru identificarea i pentru separarea antocianilor. Cromatografia lichid de performan nalt (HPLC) ofer posibilitatea separrii preparative ale antocianilor puri, ns, nu poate fi utilizat pentru obinerea lor pe scara industrial. II.5. Stabilitatea antocianilor Stabilitatea antocianilor este influenat interdependent i complex de aciditatea soluiei, temperatur, lumin, coninutul O2 dizolvat, polifenoli, glucide, SO2, etc. Stabilitatea n mediul acid crete n irul acetilderivaii > glucozide > aglicon. n mediul bazic se destabilizeaz nsi agliconul. Stabilitatea termic scade cu reducerea numrului i volumului substituenilor al sistemului flavilic. II.6. Metodele spectroscopice de cercetare Spectrele electronice (UV-Vis) conin dou benzi informative: I ( = 220 280 nm) i II ( = 465 550 nm). Interpretarea lor trebuie s in cont de copigmentare. Spectroscopia de vibraie (IR) poate fi folosit pentru identificare a agliconilor i a derivailor acetilai. Rezonana magnetic nuclear (RMN) este important pentru descifrarea structurii fine ale antocianilor. Spectroscopia de mas se folosete pentru determinarea maselor molare ale substanei i ale intermediarilor, obinui la degradarea acesteia.4 Copyrights Alexei Baerle, 2006

II.7. Importana antocianilor n sistemele in vivo Antocianii mresc randamentul fotosintezei, regleaz schimbul elementelor nutritive. Proprietile antioxidante i antiradicalice ofer antocianilor rolul de fitoconservani. Ei provoac scderea masei trombocitelor i mrirea timpului de coagulare a sngelui. Antocianii suprim dezvoltarea celulelor cancerice. Puterea inhibatoare a extractelor vegetale asupra celulelor de cancer se micoreaz cu creterea stabilitii antocianilor din plantele respective. II.8. Caracteristica biochimic a speciei Aronia melanocarpa Aronia Melanocarpa Elliot (engl: chokeberry, mountain ash, rus: ) prezint un arbust din familia Roseaceae, care se caracterizeaz prin diversitatea i concentraia sporit a substanelor biologic active. Are un profil antocianic simplu, ns exist divergene n descifrarea lui definitiv. Capitolul III. PARTEA EXPERIMENTAL Au fost utilizai reactivii comerciali clasificai ... i ..., cei de tipul i au fost purificai suplimentar. Purificarea cationiilor a fost efectuat pn la nlturarea urmelor de Fe3+. Probele cationiilor n forme flavilice au fost pstrate la t = 20C. Au fost preparai reactivi cu compoziia original: A.) Diluant soluie , ce conine etanol (minimum 85 % (v)) i HCl 1 % (m), se obine prin adugarea a 4 mL HCl(conc.) la 200 mL etanol, sau prin adugarea 20 mL soluie de 4M HCl la 180 mL etanol. B.) Piroclorur se obine prin dizolvarea a 10 g de pirocatehol n soluie de 1M HCl, pn la volumul 100 mL. C.) Amestecuri pentru Cromatografia n Stratul Subire au fost pregtii direct n camer cromatografic nemijlocit naintea msurrilor. Controlul pH a fost efectuat n regim automat de termocompensaie, cu electrodul saturat de AgCl/Ag de referin, electrodul -43-07 de msurare. Reglarea vitezei volumetrice de curgere a fost realizat cu micropompa MC760.1. Termostatarea probelor a fost efectuat n termostat, nzestrat cu hidropompa i cu un termometru de precizie (0.1C); n baia de apa cu termoreleu, 3C. Utilizarea metodei factorilor polivariabili a permis variaia concomitent a tuturor parametrilor, care influeneaz proprietile sistemului. Optimizarea condiiilor a fost realizat prin metoda micrii pe gradient. Au fost utilizate metodele de cercetare UV-Vis, IR, RMN, spestroscopic de mas, metodele de cercetare a proprietilor antioxidante i antiradicalice. Capitolul IV. REZULTATE ORIGINALE I DISCUIA LOR IV.1. Modelarea matematic i optimizarea procesului de extracie Degradarea antocianilor n procesul obinerii produselor alimentare se reflect negativ asupra proprietilor organoleptice ale acestora. Stabilizarea antocianilor trebuie s aib un raionament economic, prin reducerea cheltuielilor energetice i optimizarea procesului tehnologic. Noi am cercetat influena diferitor5 Copyrights Alexei Baerle, 2006

factori asupra extraciei antocianilor i, concomitent, a altor substane biologic active: zaharurilor reductori, polifenolilor, substanelor uscate. IV.1.1. Extracia cu etanol aceton eter dietilic HCl ap (I) Dintr-o singur partid de fructe dezgheate i strivite de Aronia au fost pregtite concomitent toate probele de pulp, fiind asigurat repartizarea uniform a fraciei solide i a sucului ntre probe. Probele au fost imediat etanate i congelate. Extractele obinute au fost diluate pn la volumul de 250 mL i centrifugate. Tabelul 1. Codificarea i limitele de variaie ale parametrilor de influien Cod Factorul de influen Minim () Centrul Maxim (+) X1 Concentraia etanol, % (v) 20 30 40 X2 Concentraia HCl, % (m) 1.0 1.5 2.0 40 45 50 X3 C Temperatura, X4 Concentraia acetonei, % (v) 0 5 10 X5 Volumul extractantului, mL 75.0 87.5 100 X6 Concentraia (C2H5)2O, % (v) 0 5 10 X7 Durata de extracie, min 30 60 90 Au fost cercetate urmtoarele rspunsuri ale sistemului: Y1 masa antocianilor extractai, mg/g; Y2 masa substanelor uscate, mg/g; Y3 masa zaharurilor reductori, mg/g. Valorile rspunsurilor au fost raportate la 1 g de fructe. n baza datelor obinute au fost calculate ecuaiile regresionale i apreciate valorile criteriilor de validitate bcritic: Y1 = 0.855 + 0.030X1 0.025X2 + 0.081X3 + 0.068X4 + + 0.053X5 + 0.161X6 + 0.026X7 bcritic = 0.019 {IV.1.1.} Y2 = 129.9 + 2.5X1 7.3X2 + 15.4X3 + 3.0X4 + + 1.1X5 + 10.8X6 + 3.0X7 bcritic = 1.2 {IV.1.2.} Y3 = 42.7 + 0.7X1 + 0.7X2 + 1.5X3 + 0.8X4 + + 0.8X5 + 0.8X6 + 0.5X7 bcritic = 1.1 {IV.1.3.} n ecuaiile {IV.1.1.} i {IV.1.2.} coeficienii pe lng X sunt semnificativi, adic, mai mari, dect bcritic corespunztor. Extracia antocianilor i a substanelor uscate (SU) este influenat pozitiv de temperatur, de concentraiile eterului i ale acetonei. Influena pozitiv a eterului este surprinztoare, innd cont, c antocianii sunt practic insolubili n acest solvent. Fenomenul influenei pozitive poate fi explicat prin faptul, c eterul contribuie la agitarea intens a probei n timpul extraciei. Nu sunt excluse i interaciunile sinergetice ntre solveni, care, ns, nu pot fi apreciate conform matricei de planificare elaborate. Influena negativ a HCl asupra extraciei SU poate fi explicat prin formarea compuilor volatili i prin efectul deshidratant al HCl n timpul determinrii SU. Ecuaia {IV.1.3.} denot, c extracia zaharurilor reductori depinde semnificativ doar de temperatur. Valorile celorlali factori sunt mai mici, dect bcritic , ceea ce indic atingerea strii aproape staionare a suprafeei de rspuns. n cadrul optimizrii rspunsului Y1 se observ o cretere moderat a rspunsului Y3 , fr atingerea maximumului, ceea ce denot, c influena pozitiv a temperaturii se datoreaz hidrolizei polizaharidelor. n schimb se ating valorile maxime ale rspunsurilor Y1 i Y2 . Rezultatele6 Copyrights Alexei Baerle, 2006

experienelor micrii pe gradient confirm corectitudinea planificrii etapei de cercetare, de asemenea faptul, c ecuaiile {IV.1.1.} {IV.1.3.} sunt adecvate. IV.1.2. Extracia cu sistemul etanol HCl ap (II). Am observat, c n spectrele electronice ale extractelor apar picuri suplimentare, ce indic degradarea componenilor. De asemenea exist necesitatea de a obine extracte de uz alimentar, care nu ar conine reactivi toxici, cum sunt eterul dietilic i aceton. Acestea ne-au determinat s efectum experiena numai n prezena etanolului. Intervalul de variaie a fost ales n baza rezultatelor optimizrii cu sistemul I. n extractele obinute au fost determinate rspunsurile : coninutul total de colorani Y4, mg/g; concentraia compuilor fenolici Y5, mg/g; substanelor uscate Y6, mg/g. Extractele diluate au fost trecute prin H-cationit, i dup diferena a densitilor optice a fost apreciat cantitatea coloranilor n forma srurilor de flaviliu Y7, mg/g. n filtratul prin cationit a fost determinat coninutul substanelor fenolice Y8, mg/g . Reieind din rezultatele experienelor au fost calculate ecuaiile regresionale: Y4 = 3.174 + 0.160X1 + 0.014X2 + 0.083X3 + 0.014X4 + + 0.054X5 + 0.029X1X2 + 0.007X2X3 bcritic = 0.093 {IV.1.4.} Y5 = 7.419 + 0.365X1 + 0.051X2 + 0.181X3 0.067X4 0.064X5 + 0.181X1X2 + 0.125X2X3 bcritic = 0.184 {IV.1.5.} Y6 = 170.7 + 2.0X1 0.3X2 0.3X3 + 0.1X4 + + 0.2X5 + 0.6X1X2 + 0.1X2X3 bcritic = 1.5 {IV.1.6.} Y7 = 2.241 + 0.088X1 0.021X2 + 0.023X3 + 0.014X4 + 0.067X5 + 0.012X1X2 + 0.040X2X3 bcritic = 0.076 {IV.1.7.} Y8 = 6.424 + 0.448X1 + 0.229X2 + 0.059X3 0.067X4 + 0.027X5 + 0.120 X1X2 + 0.109X2X3 bcritic = 0.202 {IV.1.8.} Ecuaiile {IV.1.4.} {IV.1.8.} demonstreaz, c centrul experienei se afl n regiunea strii aproape staionare. Observm, c sistemul de extracie II este mai eficient, dect sistemul I. Acest fapt confirm odat n plus corectitudinea planificrii experimentului i rezultatele ascensiunii dup gradient n sistemul I i interpretarea lor, permind de a efectua optimizarea rspunsurilor Y4 Y8, doar variind temperatura extragentului. Valorile optime ale factorilor X2 X5 corespund centrului experimentului de modelare: X2 = 45 % (v), X3 = 50 min., X4 = HCl 0.45 % (m), X5 = 4.5 mL/g. Valoarea gradientului temperaturii a alctuit X1 = + 4 C. Condiiile optime pentru rspunsurile Y4, Y6 i Y7 se realizeaz n apropierea experienei nr. 10II, la temperatura 70C. Rspunsurile Y5 i Y8 ating valorile maxime la 82C. Aceasta nseamn, c creterea coninutului substanelor fenolice n extract nu corespunde creterii concentraiei antocianilor fotocolorimetric activi. Prezint interes comparaia valorilor optime ale factorilor de influen, obinute de noi pentru antocianii din Aronia, cu valorile respective pentru antocianii din Hibiscus Sabdariffa ( etanol 70% (v), HCl 4% (m), Vextr./mprob = 10.0 mL/g ). Cauzele posibile ale acestor divergene substaniale sunt surse vegetale diferite i n msura mai mare, lipsa studierii influenei factorului de temperatur n lucrarea respectiv. Ultima presupunere se confirm cu datele experimentale privind optimizarea extraciei antocianilor din tescovina de struguri, conform crora concentraia optim a etanolului la t = 30C este 70 % (v).7 Copyrights Alexei Baerle, 2006

Prezena maximumelor de extracie la 70-73 C poate s indice concuren proceselor de extracie a antocianilor i de descompunere a lor. La temperaturi mai mari de 66 C n cromatogramele extractelor se evideniaz spotul agliconului, adic, crete ponderea produsului de hidroliza n extract (Figura 2).cianidin t-ra 20C t-ra 66 C t-ra 74 C cianidin forme native monomerice

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

0.55

0.60

Piroclorur

Fig.2. Cromatogramele obinute prin eluarea ascendent pe hrtie. Valorile Y4, Y6 i valorile Y1, Y2 reflect aceeai parametri de ieire, respectiv, n cadrul utilizrii sistemului extractant I i II. Cantitatea antocianilor, extrai cu sistemul II este considerabil mai mare, dect cu sistemul I, care conine eter dietilic i aceton. Am demonstrat astfel, c acetona i eterul dietilic au aciune controvers: mresc eficacitatea extraciei i, concomitent, contribuie la destabilizarea antocianilor. IV.2. Influena solvenilor organici asupra stabilitii antocianilor IV.2.1. Solveni destabilizatori. Expunerea ndelungat a extractelor, ce conin acetona i eterul dietilic la temperatura camerei, duce la degradarea vizibil a antocianilor, care se exprim prin apariia precipitatelor de A culoare cafenie n prezena 0.5 acetonei i prin decolorarea extractelor, care conin eter 0.4 dietilic. Merit s fie cercetat 1 influena acestor solveni, 0.3 folosii tradiional pentru obinerea i purificarea prepa2 0.2 ratelor antocianici. n spectrele electronice de rezoluie joas se 0.1 3 observ prbuirea picului la 0.0 490 nm, care corespunde descompunerii flaviliului. 300 400 500 600 nm Spectrele, obinute la 50C, au o Fig.3. Spectrele UV-Vis ale extractului deosebire considerabil: concoantocianic cu C(aceton) = 60 % (v), obinute mitent cu scderea densitii la 50 C: 1 0 ore; 2 - 24 ore; 3 48 ore. optice la 490 nm, se observ8 Copyrights Alexei Baerle, 2006

apariia picului la 440 nm, care corespunde produilor de condensare a antocianilor. Viteza de degradare a antocianilor crete odat cu creterea concentraiei acetonei. Analiza curbelor cinetice de degradare a antocianilor ne-a permis s determinm ordinele globale de reacie. n modul surprinztor, se observ abateri substaniale de la valoarea ordinului global de reacie, egal cu 1. Tabelul 2. Caracteristicile cinetice ale reaciilor de degradare a antocianilor Concentraia acetonei, % (v) 0% 20% 40% 60% Solubilitatea oxigenului, mg % 7.48 7.33 9.31 8.73 Potenialul redox, V 0,422 0,406 0,394 0,393 Ordinul de reacie la 25C 2.80 1.02 0.35 Ordinul de reacie la 50C 1.92 1.39 0.74 Timpul de njumtire, 25C, ore ~ 240 130 40 38 Timpul de njumtire, 50C, ore ~ 12 10 10 7 Energia de activare, kJ/mol 95.9 82.1 44.4 54.2 Dependena ordinului de reacie de temperatur i de concentraia acetonei denot mecanismul complex al reaciei de descompunere. Scderea ordinului de reacie la creterea concentraiei acetonei permite a presupune, c cinetica descompunerii este influenat de reacii radicalice. Evident, c cinetica procesului de degradare poate fi influenat de concentraia acetonei i n modul indirect, prin intermediul altor factori, valorile crora sunt dependente de compoziia sistemului. n particular, se observ creterea moderat a solubilitii oxigenului n sistemul aceton-ap cu creterea concentraiei acetonei. De asemenea am demonstrat, c n sistemul etan distrugerea antocianilor are loc mai lent, dect n extractele de aceiai compoziie, ns cu accesul liber de aer. La hidroliza glucozidelor de cianidin i separarea ulterioar a cianidinei cristaline, are loc distrugerea rapid a cianidinei din soluia supranatant, cu formarea produilor, asemntori celor, care se obin n prezena acetonei. n aceste condiii soluie conine glucoz, adic, o aldoz. Presupunem, c efectul distrugtor al acetonei i al glucozei asupra antocianilor se datoreaz grupei funcionale CO cu capacitatea remarcabil de condensare. Influena eterului dietilic asupra stabilitii antocianilor este chiar simpl. Nu se formeaz precipitatele ale produilor cafenii de degradare-condensare, soluia devene incolor. Scderea rapid liniar a densitii optice presupune ordinul zero al reaciei, ce servete drept un indice al desfurrii reaciilor radicalice. Mecanismul radicalic de degradare a glucozidelor n soluii apoase se manifest n prezena urmelor de alcool izoamilic. La agitarea sistemului aquaorganic, care conine acest alcool, faza apoas se satur cu aer. Descompunerea antocianilor n fazele apoase astfel obinute se desfoar rapid (cca. 18 ore), pn la soluii incolore. Aadar, n prezena oxigenului alcoolul izoamilic manifest acelai comportament faa de antociani, ca i eterul dietilic. IV.3. Transformrile antocianilor n faza solid a adsorbantului IV.3.1. Particularitile cromatografice ale antocianilor din Aronia. La trecerea extractelor antocianice prin cationit o bun parte din colorani se absorb9 Copyrights Alexei Baerle, 2006

rapid. Filtratul, trecut prin cationit, capt o nuan portocalie. n spectrele electronice ale lui se observ micorarea substanial a extinciei srurilor de flaviliu. La diluarea filtratelor cu ap se formeaz sisteme cu opalescen, din care la centrifugarea sau sedimentarea ndelungat se separ precipitate colorate n rouportocaliu. Astfel, o parte a antocianilor se afl n extract n forma care nu se absoarbe, pasiv. Aceste forme se evideniaz prin cromatografierea extractelor crude (I), filtratelor prin cationit (II) i eluatelor de pe cationit (III). Pentru a clarifica numrul real de specii din profilul antocianic al Aroniei, am utilizat diferite combinaii a eluanilor. Eluantul butanol-acetique evideniaz 3 spoturi, ce semnaleaz despre prezena speciilor (GluGlu)Agl sau (GluAc)Agl. Totodat, 3,5-diglucozida trebuie s asigure apariia a 4 spoturi cu acest eluant. Soluia dilemei s-a dovedit a fi simpl. n urma cromatografierii preparatului pur de cianidin se ivesc 2 spoturi separate a aceleiai substane. Evident, c efectul n cauz apare ca rezultat al reducerii timpului de eluare prin substituirea hrtiei Whatmann cu hrtie de filtru cu o densitate sczut, i datorit compoziiei critice a fazei mobile. Soluia apoas de acid citric, folosit n calitate de eluant, de asemenea evideniaz lipsa 3,5-diglucozidei cianidinei. Astfel, este demonstrat cu certitudine, c glucozidele antocianice ale speciei Aronia Melanocarpa sunt 3-monoderivaii cianidinei. IV.3.2. Transformarea antocianilor polimerici sub influena cationitului. La expunerea ndelungat a extractelor formelor pasive ale antocianilor pe H-sulfocationitul proaspt, are loc adsorbia acestor forme. Fiecare poriune nou de cationit, adugat n faza lichid, adsoarbe aceeai cantitate de antociani. Capacitatea de sorbie a cationitului n aceste condiii este aproximativ de 100 de ori mai mic, dect capacitatea de sorbie a cationitului fa de cianidina pur. Structura polimeric a formelor pasive nu le permite s difuzeze n interiorul granulelor cationitului, ce duce la scderea uria a capacitii de sorbie. Desorbia antocianilor pasivi duce la apariia spotului agliconului n eluat. Aceasta indic, c formele respective sufer transformarea n form activ (aglicon) sub influena grupelor funcionale ale cationitului. Toate ncercrile de a obine spoturile glucozidelor n eluat de pe cationit dup saturarea lui cu formele pasive" au euat. ns s-a stabilit cu certitudine, c n faza cationitului glucozidele se transform n aglicon, cu o viteza de 10 ori mai mare, dect cea a scindrii polimerilor antocianici n monomeri. Reieind din acestea, am propus mecanismul transformrilor reciproce ale speciilor antocianice n prezena sulfocationitului. IV.3.3. Particularitile hidrolizei glucozidelor n faza solid a sulfocationitului. Aflndu-se n faza sulfocationitului, glucozidele sufer hidroliza pn la aglicon. n acelai timp, formarea agliconului n soluii ncepe cu viteze considerabile doar la temperaturi mai mari de 60 C. De pild, la 25 C gradul de hidroliza n faza cationitului atinge 50 % n 7 zile. La aceleai concentraii ale H+ n faza lichid formarea agliconului la 25 C nu se observ n decurs de cteva luni. Mai mult ca att, la temperatura camerei n soluii se observ polimerizarea lent a antocianilor n forme condensate, depistabile cromatografic. Hidroliza se desfoar foarte rapid n H-cationitul mbibat cu ap, terminndu-se n 2 3 zile.10 Copyrights Alexei Baerle, 2006

n cazul probelor uscate, hidroliza se ncetinete pe parcursul termostatrii. S-a demonstrat, c procesul de hidroliz a antocianilor n interiorul fazei sulfocationitului se datoreaz n exclusivitate apei libere. Procesul de hidroliza n faza cationitului, care conine doar ap legat, nu este stopat complet, ce se datoreaz, probabil, echilibrului dinamic de hidratare-deshidratare a grupelor funcionale. O concluzie important este aceea, c cationitul uscat n H-form poate servi drept depozit al antocianilor. IV.4. Analiza cantitativ separat a antocianilor hidrosolubili i a agliconului. Transformarea glucozidelor n aglicon prezint interes pentru cercetarea stabilitii antocianilor n produsele alimentare. Obiectivul nostru principal a constituit elaborarea i evaluarea metodei, care ar include procedee simple, ieftine i rapide de analiza cantitativ separat, i care ulterior ar putea fi aplicat cu succes n laboratoarele industriale, didactice i de cercetare din ara noastr. IV.4.1. Analiza prin metoda cromatografic pe hrtie. Spre deosebire de procedeele cunoscute, unde se utilizeaz hrtia Whatmann, am utilizat hrtia ordinar de filtru. n calitate de eluant am folosit pentru prima dat amestecul de pirocatechol : HCl 1M (1 : 9 (m : v); piroclorur), care s-a demonstrat ca excelent stabilizant al componenilor pe cromatogram, i care asigur separarea definitiv a speciilor. Cromatografierea are loc 1.5 2.5 ore pn la separarea complet. Cromatograma se usuc la t < 40 C. Din ea se taie 3 benzi cu dimensiuni egale: de cianidin (C) (Rf = 0.350.41), de glucozide (G) (Rf = 0.560.62) i steril (S) n zona frontului solventului. Benzile se extrag 10 min. cu poriuni a cte 5 mL de diluant. Extractele obinute se centrifugheaz pentru eliminarea fibrelor de hrtie. Densitatea optic a soluiilor C i G se msoar fa de soluia S. Raportul densitilor optice (DC DS) / (DG DS) prezint raportul aglicon / glucozide n amestecul analizat, reflectnd gradul de transformare a glucozidelor n aglicon. Analizei pot fi supuse doar soluii foarte concentrate ( > 500 mg/L ), astfel ca densitile optice ale extractelor C i G s se ncadreze n limitele 0.20.4. IV.4.2. Analiza prin extracia fracionat a agliconului. n scopuri extragerii agliconului din faza apoas se utilizeaz alcoolii grai, de pild, izoamilic. Noi am observat, c acesta formeaz emulsii U/A stabile, stratificarea crora necesit cca. 0.5 ore. Pentru a reduce timpul stratificrii, am modificat compoziia fazei organice, adugnd solveni apolari. Eterul de petrol, benzenul, xilenul i heptanul au redus timpul de spargere a emulsiilor iAmOH / Ap pn la 5 s 3 min. Pe neateptate am observat, c primii trei solveni, chiar n cantiti mici, resping agliconul din faza organic n faza apoas, ceea ce complet nu corespunde scopului abordat. Pentru heptan efectul n cauz a fost observat la concentraii > 20 % (v). Concentraia heptanului < 10 % (v) nu contribuie la spargerea rapid a emulsiei. Raportul alcool izoamilic : heptan = 85 : 15 ( v : v ), notat iAmOH-Heptan, a dovedit s fie optimal n acest caz separarea rapid a fazelor este mbinat cu eficacitatea extraciei agliconului n faza organic. Valoarea experimental a constantei de repartiie KOrg/Aq(Cy) este de 201 uniti. Acest fapt permite micorarea substanial a volumului fazei organice, respectiv11 Copyrights Alexei Baerle, 2006

reducerea costului analizei. Trebuie de inut cont, c la concentraiile etanolului de cca. 10 % (v) se observ trecerea considerabil a glucozidelor n Org i a agliconului n Aq. La concentraiile etanolului > 15-20 % se formeaz faza aqua etanolic, unde sunt concentrai antocianii, i faza steril heptanic. Proba, care conine antociani, se dilueaz cu soluie 0.2 M HCl astfel, ca soluia rezultant s conin cel mult 5 % (v) etanol i cca. 17 55 mg antociani ntr-un litru. n aceast soluie se determin concentraia total de antociani (). 15 mL soluie se trec n plnia separatoare cu capacitatea de 50 mL i se extrag cu 3 mL amestec iAmOH-Heptan. Proba se agit intens, apoi se las s se stratifice. Extracia i separarea fazelor se repet nc de 2 ori, obinndu-se faza apoas, care nu conine aglicon. n aceast faza se determin coninutul glucozidelor (). Coninutul agliconilor () se calculeaz din diferena: = . Timpul unei analize prin extracia fracionat alctuiete cca. 15 min. Metoda elaborat este pe bun dreptate expres, de aceea am acceptat-o ca pe o metod curent de lucru. IV.5. Influena diferitor factori asupra proceselor de sorbie / desorbie Procesele de sorbie i de desorbie ale antocianilor pe cationii dau naterea metodelor industriale de perspectiv de separare a acestor colorani n stare pur. IV.5.1. Procesul de sorbie. A fost cercetat influena ctorva factori (tab.2.). Am presupus, c influena factorilor micti X1X2X3 i X1X3 este nul, ce a permis s le nlocuim cu factorii semnificativi suplimentari. Asemenea raionamente nu sunt valabile pentru factorul mixt X1X2, deoarece etanolul nsi va suferi o repartizare cromatografic n timpul filtrrii. La viteze mari de filtrare poate s aib loc i strecurarea solventului, adic, acesta nu va influena procesele de sorbie i de desorbie n aceiai msura, ca i n cazul vitezelor mici. Tabelul 3. Factorii de influen i valoarile lor n variabile codificate Factor de influen Cod Min. Centru Max. Viteza filtrrii, mL / min. X1 0.60 0.80 1.00 Concentraia etanol, % (v) X2 15 20 25 Concentraia HCl, % (m) X3 0.60 1.00 1.40 Raza granulelor, mm X4 = X1X2X3 0.18 0.27 0.36 Temperatura, C X5 = X1X3 32 38 44 Analiza matematic a curbelor de sorbie n coordonatele D = f(Vfiltrat) a permis s apreciem: Y1 Sorbia total, mg/g ; Y2 Cantitatea antocianilor, necesar pentru saturaia polimerului, mg/g ; Y3 Viteza relativ de sorbie, % ; Y4 Capacitatea dinamic de sorbie, mg/g. Dup analiza statistic se obin ecuaiile regresionale: Y1 = 38.50 8.50X1 5.71X2 10.37X3 10.84X4 + + 7.97X5 + 0.27X1X2 0.81X2X3 bcritic = 2.07; IV.5.1. Y2 = 156.3 17.6X1 10.1X2 15.9X3 38.0X4 + bcritic = 2.0; IV.5.2. + 20.3X5 21.2X1X2 13.1X2X3 Y3 = 23.70 2.43X1 2.13X2 3.65X3 1.28X4 + + 0.95X5 + 2.01X1X2 + 0.16X2X3 bcritic = 1,09; IV.5.3. Y4 = 2.545 0.293X1 0.038X2 0.001X3 0.004X4 + + 0.010X5 + 0.066X1X2 + 0.031X2X3 bcritic = 0.034; IV.5.4.12 Copyrights Alexei Baerle, 2006

Din {IV.5.1.} {IV.5.3.} rezult, c creterea vitezei filtrrii, concentraiilor etanolului i a HCl, razei granulelor polimerului, defavorizeaz procesul de sorbie. Se observ, c coeficienii b1b4 n {IV.5.2.} sunt de 23 ori mai mari, dect n {IV.5.1}, ce nseamn, c creterea valorilor factorilor de influen mai degrab micoreaz eficacitatea sorbiei, dect modific capacitatea de schimb a polimerului. De asemenea, valorile coeficienilor b1b4 a ecuaiei {IV.5.3.} sunt negative. n ecuaia {IV.5.4.} viteza filtrrii manifest influena cea mai pronunat. Astfel se confirm faptul, c la viteze mari componenii extractului se strecoar prin polimer. Influena negativ a acidului clorhidric (b3) n ecuaiile {IV.5.1IV.5.4} dovedete existena schimbului ionic clasic: RSO3H + Cy+ (CyGlu+) RSO3Cy (CyGlu) + H+ Interaciunile solvent-antocian-polimer devin vizibile datorit influenei semnificative a concentraiei de etanol (X2). Coeficienii b5 sunt pozitivi. Asemenea influen a temperaturii se explic prin hidroliza CyGlu pn la Cy, adsorbit respectiv de cca. 4 ori mai bine, dect CyGlu. IV.5.2. Procesul de desorbie. Experimentul separat de desorbie poate s completeze tabelul privind cauzele i mecanismul influenei diferitor factori. Experimentul de desorbie a fost efectuat conform planului de tipul EFF72 (tab.3.). Tabelul 4. Codificarea factorilor cercetai n experinentul de desorbie Factorii de influen Cod Min. (-) Centrul Max. (+) Viteza filtrrii, mL / min. X1 0.40 0.50 0.60 Concentraia etanol, % (v) X2 40 50 60 Concentraia HCl, % (m) X3 1.00 1.25 1.50 Raza granulelor, mm X4 = X1X2X3 0.18 0.27 0.36 Temperatura, C X5 = X1X3 40 50 60 nlocuirea factorilor micti cu factorii noi de influena a fost 1.2 efectuat n acelai fel, ca i n experimentul de sorbie IV.5.1., 0.8 pentru a putea compara rezultatele. Prin coloan au fost 0.4 trecute poriuni a cte 50 mL de extractani cu compoziii 0.0 prestabilite (factorii X2 i X3, mL 0 10 20 30 40 tab.3). n eluat au fost Fig. 4. Curbele tipice de eluare determinate: concentraia total a antocianilor (); raportul concentraiilor / . Au fost construite curbe de desorbie n coordonatele C(), C(), C() = f(Vextractant) (Figura 4). Picuri ascuite la Vpic 1/6 din volumul total al extractantului, dovedesc eficacitatea mare a desorbiei. Curbele de desorbie se apropie din ce n ce mai lent de axa absciselor, ce dovedete existena difuziei antocianilor n faza cationitului. Analiza curbelor de eluare permite calcularea rspunsurilor sistemului: Y5 Gradul de desorbie a antocianilor din cationit, % ; Y6 Cantitatea total de antociani desorbii, mg/g ;13 Copyrights Alexei Baerle, 2006 1.6 , mg/mL

Y7 Cantitatea desorbit de CyGlu, mg/g ; Y8 Cantitatea desorbit de Cy, mg/g ; Y9 Gradul de hidroliz a CyGlu, % ; Y10 Concentraia sumar a antocianilor n maximumul curbei de eluare, mg/mL ; Y11 Concentraia glucozidelor n maximumul curbei de eluare , mg/mL ; Y12 Concentraia agliconilor n maximumul curbei de eluare, mg/mL . Y5 = 63.76 + 0.77X1 + 1.35X2 + 1.20X3 6.69X4 + + 10.79X5 0.48X1X2 + 2.28X2X3. bcritic = 1.07 {IV.5.5.} Y6 = 23.641 + 0.272X1 + 0.468X2 + 0.426X3 2.439X4 + + 3.831X5 0.173X1X2 + 0.809X2X3. bcritic = 0.380 {IV.5.6.} Y7 = 16.440 + 1.752X1 + 0.035X2 + 0.544X3 1.885X4 + + 2.427X5 0.137X1X2 + 0.589X2X3. bcritic = 0.462 {IV.5.7.} Y8 = 6.201 1.480X1 + 0.433X2 0.118X3 0.554X4 + + 1.403X5 0.310X1X2 + 0.219X2X3. bcrit. = 0.192 {IV.5.8.} Y9 = 27.19 6.94X1 + 1.44X2 0.02X3 + 0.47X4 + + 1.91X5 1.01X1X2 0.59X2X3. bcritic = 0.94 {IV.5.9.} Y10 = 1.956 + 0.102X1 + 0.492X2 + 0.281X3 0.137X4 + + 0.506X5 0.054X1X2 + 0.104X2X3. bcritic = 0.033 {IV.5.10.} Y11 = 1.633 + 0.065X1 + 0.379X2 + 0.225X3 0.176X4 + + 0.391X5 0.070X1X2 + 0.104X2X3. bcritic = 0.077 {IV.5.11.} Y12 = 0.323 + 0.037X1 + 0.113X2 + 0.056X3 + 0.039X4 + + 0.115X5 + 0.016X1X2 + 0.000X2X3. bcritic = 0.051 {IV.5.12.} Viteza de eluare nu afecteaz rspunsurile sistemului n aceeai msur, ca n cadrul sorbiei. Influena negativ puternic asupra procesului de desorbie o are mrirea granulelor cationitului (X4). Este remarcabil, c acest factor influeneaz negativ i procesul de sorbie. Aadar, cinetica global a proceselor sorbie / desorbie este determinat de fenomenul de difuzie n faza polimerului. Temperatura (X5) influeneaz semnificativ pozitiv procesul de desorbie. Mrirea concentraiei de etanol duce la mbogirea eluatului cu aglicon {IV.5.8.}. Fenomenul se datoreaz faptului, c etanolul asigur solubilitatea mai mare a agliconului n faza lichid i, de asemenea, are efectul stabilizator. Influena acidului clorhidric (X3), pe neateptate, a dovedit s fie mic. Acest fapt, la fel ca i forma curbelor de eluare, indic c antocianii sunt reinui nu numai cu fore electrostatice, adic, desorbia lor nu este un proces pur de schimb ionic. Mrirea temperaturii, concentraiilor etanolului i a HCl, contribuie esenial la creterea concentraiei antocianilor n maximumul curbei de eluare ({IV.5.10} (IV.5.12}). IV.5.3. Sinergismul acido-etanolic de desorbie. Influena negativ a razei granulelor polimerului asupra concentraiei maximale a CyGlu n filtrat i pozitiv asupra concentraiei maximale a Cy se explic prin hidroliz intrafazal a glucozidelor, i prin vitezele diferite de difuzie a CyGlu i Cy. Influena factorului mixt X2X3 n ecuaiile {IV.5.5.} {IV.5.7.} este considerabil mai mare, dect a factorilor X2 i X3, luai aparte. Aadar, se observ un efect sinergetic a acestor doi factori, cu inversiunea semnelor pentru procesele de sorbie, respectiv, desorbie. Mai mult ca att, la aciunea etanolului neutru, sau a soluiei apoase de acid, desorbia antocianilor din sulfocationit practic nu are loc. Sinergismul se manifest14 Copyrights Alexei Baerle, 2006

la concentraia etanolului > de 40 % (v) i atinge valori remarcabile la 60 90 % (v) etanol i 0.4 M HCl. Noi am demonstrat, c efectul sinergetic se datoreaz strii macromoleculare ale antocianilor n interiorul fazei cationitului. IV.5.4. Procesul de hidroliza n faza polimerului. Influena vitezei de eluare n ecuaiile {IV.5.7.} i {IV.5.8. } este foarte apropiat dup valoarea numeric, ns este pozitiv pentru glucozide i negativ pentru aglicon. Noi explicm aceast inversare a semnelor prin aceea, c la creterea vitezei de eluare scade timpul de retenie a glucozidelor pe polimer, ce micoreaz gradul de hidroliza a lor. Asupra hidrolizei influeneaz mrirea temperaturii (X5), n timp ce influena HCl (X2) este mic. Coeficienii ecuaiilor {IV.5.10} {IV.5.12} de asemenea demonstreaz, c acumularea cianidinei n eluat este condiionat de hidroliza ndelungat a CyGlu n interiorul fazei polimerului. IV.6. Separarea antocianilor n starea pur IV.6.1. Obinerea coloranilor antocianici fr substane balast. Se propune un procedeu de obinere a colorantului rou din materia prim vegetal, care include mrunirea materiei prime vegetale (scorue negre), extracie cu soluie, care conine alcool etilic 40 50 % (v), HCl 0.5 1.0 % (m) timp de 0.5 ore la temperatura camerei, raportul masei materiei prime (g) ctre volumul soluiei (mL) fiind egal cu 1 : 0.3. Procedura de extracie din aceeai mas de materie prim se repet nc de 4 ori. Poriunile extractului obinut se unesc i se dilueaz de 2-3 ori cu ap, se centrifugheaz i se prelucreaz cu sulfocationit n H-form pentru sorbia coloranilor A antocianici, timp de 2 ore, masa sulfocationitului introdus n soluie fiind de 1.0 1.5 g la 100 mg colorani. 1 Dup sorbia cationitul se separ de soluie, se spal consecutiv cu ap i cu 3 2 etanol 70 % (v), apoi se prelucreaz n condiii dina200 300 400 500 600 nm mice cu eluantul, care conine 60-80% (v) etanol, 40Fig. 5. Spectrele electronice ale: 1 - CyGlu; 60% (v) ap, 0.7-1.5% (m) 2 Cy; 3 filtratului prin sulfocationit. HCl pentru a efectua desorbia. La 1 g de cationit se iau 5-10 mL de eluant. Eluantul se trece prin cationit la 4050C cu viteza 13 mL/min., iar filtratul obinut, care conine colorantul pur, se supune concentrrii prin distilarea la presiunea de pn la 100 Pa i temperatura t = 35 0C. Rezultatul tehnic al procedeului const n obinerea amestecului pur de colorani naturali din materie prim vegetal, folosind mijloace i resurse minime. IV.6.2. Obinerea preparatului de glucozid de cianidin. Se propune un procedeu de obinere a glucozidei de cianidin (CyGlu) din fructe de scorue15 Copyrights Alexei Baerle, 2006

negre, care include extracia i separarea glucozidei de cianidin de alte substane din extractul, care conine 10 % (v) etanol, 0.25 % (m) HCl i substane organice, prin tratarea la 20 C timp de 90 min cu H-sulfocationit n raportul 1.5 g cationit la 100 mL extract, desorbia colorantulului din cationit prin prelucrarea acestuia n condiii dinamice cu soluie, care conine 60 % (v) etanol i 1.5 % (m) HCl la 5060 C, dup care eluatul de pe sulfocationit se supune neutralizrii folosind OHanionit, se distileaz n vid cu scopul eliminrii etanolului, apoi se filtreaz i se distileaz n vid la presiunea de pn la 100 Pa, temperatura 40 C, pentru eliminarea apei, obinndu-se colorantul solid pur. Rezultatul tehnic al prezentei invenii const n obinerea colorantului CyGlu n starea lui nativ, ce se confirm cu datele spectrelor electronice (Figura 5). IV.6.3. Obinerea preparatului cristalin de clorur de cianidin. A fost elaborat procedeul de obinere a preparatului cristalin de clorur de cianidin (Cy) , veritabil pentru cercetrile tiinifice. Procedeul elaborat include sorbia antocianilor pe sulfocationit n H-form, splarea cationitului cu soluie aquaetanolic, termostatarea cationitului n CyGlu-form la 60 C, desorbia (eluarea) antocianilor de pe sulfocationit cu soluie etanolic acidulat, distilarea alcoolului din eluat, rcirea lent a rezidiului apos dup distilare, filtrarea precipitatului obinut. Spectrul electronic al cianidinei se caracterizeaz cu dou maxime puternice de adsorbie (Figura 5, spectrul 2). Valorile respective a max difer cel mult cu 1 nm de valorile, indicate n literatur, ce prezint o dovad a individualitii substanei obinute. Datele spectroscopiei RMN i a spectroscopiei de mas confirm puritatea nalt i identitatea preparatului de cianidin. IV.7. Proprietile antioxidante i antiradicalice ale antocianilor IV.7.1. Determinarea capacitii antioxidante. A fost utilizat metoda compensrii cu acid ascorbic, elaborat la Catedra Tehnologia Conservrii a U.T.M. Avantajele acestei metode const n utilizarea utilajului accesibil, realizarea rapid i reproductibilitatea nalt a rezultatelor. Cea mai remarcabil caracteristic a metodei const n faptul, c n proba supus analizei nu se adaug nici o substan strin. Instalaia experimental const din celula de msurare I, n care se introduce soluia substanei cercetate, care mai conine solveni , stabilizatori, modelatori de pH etc. (excipieni). n celula de referin II se introduce soluia-model, care conine aceeai excipieni, ns nu conine substana cercetat. Astfel, diferena de potenial ntre celulele I i II va fi determinat exclusiv de proprietile reductoare ale substanei cercetate. n celula II se dozeaz soluia-etalon, care conine acid ascorbic de concentraia cunoscut i aceeai excipieni, ca i sistemul cercetat. Acidul ascorbic se adaug pn la atingerea egalitii dintre potenialele celulelor I i II, semnalate de poteniometru. Capacitatea reductoare a sistemului cercetat se exprim n miligrame de acid ascorbic (AA) pe 1 g de substan uscat (SU). Sensul fizic al parametrului calculat K este cantitatea acidului ascorbic, care manifest aceleai proprieti reductoare, ca i 1 g de substan respectiv.16 Copyrights Alexei Baerle, 2006

Tabelul 5. Capacitatea reductoare a diferitor antioxidani Kmmol/mol Antioxidant Formula M, g/mol pH Kmg/g Acid ascorbic C6H8O6 176.0 1.00 1000 1000 8.69 Cy C15H11O6Cl 322.5 1.00 15.92 CyGlu C21H21O11Cl 484.5 1.00 11.75 4.27 Enotanin (C15OXHY)n > 1000 1.00 > 18 3.21* 0.00 Acid galic C7H6O5 170.0 1.00 0.00 96.39 Acid galic 170.0 3.50 93.10 C7H6O5 1.50 2.47 Catechol C15H14O6 290.0 1.00 Analiza valorilor constantelor de putere reductoare evideniaz urmtoarele: Valorile Kmg/g i Kmmol/mol ale antocianilor sunt mai mari, dect a catecholului i enotaninului. Astfel, antocianii monomerici sunt reductori mai puternici, dect majoritatea altor flavonoizi. Metoda utilizat semnaleaz, c cianidina este cu 25% mai reductoare, dect glucozidele ei, ce coreleaz, la rndul sau, cu datele referitor la stabilitile relative ale substanelor n cauz (mai activ = mai puin stabil). IV.7.2. Determinarea capacitii antiradicalice. Activitatea antiradicalic (ARA), a fost determinat fa de prob de control, care conine toi excipienii i nu conine antioxidant. Concentraia antioxidantului, care asigur inhibarea a 50% de radicali liberi, IC50 , a fost calculat din dependenele ARA de concentraie. Au fost cercetate sistemele, care conin antociani i ali componeni biologic activi: Extractul A: extractul fructelor de Aronia, obinut n modul dinamic, care conine CyGlu -1450 mg/L, forme condensate 140 mg/L, etanol 15 % (v), HCl 0.125M; Extractul B: extractul A, filtrat prin Na-cationit, care conine urme de antociani monomerici, forme antocianice condensate 140 mg/L, etanol 15 % (v), HCl 0.125M; Extractul C: antociani 1722 mg/L, etanol 45 % (v) i acid citric 2 % (m); Extractul D: extractul, preparat nemijlocit naintea determinrilor, prin extracia fructelor cu alcool 40 % (v), raportul fructe / alcool fiind de 1/5.; Soluia CyCl: 2500 mg / L n 90 % (v) etanol, HCl 0.125 n. Activitatea antiradicalic a extractelor de Aronia se micoreaz n irul extract D (31.10 %) > extract A (25.03 %) > extract C (22.22 %) : extract B (10.11 %). Analiza valorilor ARA evideniaz urmtoarele legiti : Cel mai activ este extractul proaspt neutru D. Activitatea deosebit a lui se datoreaz formelor labile. n acest extract antocianii degradeaz rapid, din care cauz el va pierde activitatea antiradicalic mai uor, dect celelalte extracte; Extractele A i C posed activitatea antiradicalic ridicat. Extractul A, acidulat cu HCl, este mai activ, dect extractul C, acidulat cu acid citric. Cel mai puin activ este extractul B, trecut prin sulfocationit, care nu conine formele monomerice ale antocianilor. Comparaia activitilor extractelor A i B demonstreaz, c nlturarea antocianilor naturali folosind fiiltrarea extractului prin sulfocationit produce scderea activitii antiradicalice cu cca. 2/3. Aadar, s-a confirmat, c n compoziia fructelor de Aronia Melanocarpa cele mai active specii captatori ai radicalilor liberi sunt antocianii monomerici.17 Copyrights Alexei Baerle, 2006

Capitolul V. CONCLUZII 1. Rezultatele cercetrilor au demonstrat univoc, c profilul antocianic al Aroniei Melanocarpa const din monoglucozide cianidinice n cantiti considerabile, care permit utilizarea acestei culturi n calitate de materie prim autohton pentru obinerea coloranilor roii naturali individuali; 2. Din modelele matematice de evaluare a influenei factorilor i de optimizare rezult, c extracia antocianilor din Aronia trebuie s fie realizat n urmtoarele condiii: temperatura 70C, raportul Vextragent/mmateria prim = 4.5 mL/g , durata extraciei 50 minute cu extragentul, care conine 55 % (v) soluie apoas 0.225 M HCl i 45 % (v) etanol; 3. Au fost elaborat baza tiinific a tehnologiilor de separare a antocianilor din extractul policomponent, cu utilizarea schimbtorilor de ioni puternic acizi i puternic bazici i de obinere a 2 colorani individuali n starea pur (cianidina, glucozida de cianidina). Puritatea i individualitatea coloranilor obinui au fost confirmate cu datele analizelor cromatografice i a spectrelor UV-Viz, IR, RMN, de mas; 4. Pentru prima dat au fost elaborate 2 metode de analiza cantitativ a speciilor, care se deosebesc de cele cunoscute prin rapiditatea executrii i costul redus al ustensilelor i al reactanilor; 5. Se constat c stabilitatea antocianilor este influenat de natura i concentraia solvenilor organici (etanol, aceton, eter dietilic, butanol, alcool izoamilic, etilacetat etc.) i a sorbanilor solizi (schimbtori de ioni, celuloza, silicagel). Au fost calculate caracteristicile cinetice ale proceselor de degradare a antocianilor (ordinul de reacie, energia de activare, timpul de njumtire). Ordinul de reacie de degradare n faza lichid depinde de natura i de concentraia solventului; 6. Sulfocationiii n H-form favorizeaz transformarea antocianilor polimerici i a glicozidelor n aglicon. Hidroliza acid n faza schimbtorului de ioni este mult mai pronunat, dect n faza lichid acidulat. Sinergismul acido-alcoolic de desorbie a antocianilor din faza solid a polimerului se explic prin starea condensat a antocianilor n medii apoase; 7. Se demonstreaz, c antocianii naturali din Aronia manifest activitatea reductoare i antiradicalic pronunat, care depete indicii corespunztori ale altor polifenoli i a acidului ascorbic. Agliconul este un reductor i un agent antiradicalic mai puternic dect derivaii lui naturali, ce mrete valoarea aplicativ a agliconilor antocianici n industria alimentar i farmaceutic.18 Copyrights Alexei Baerle, 2006

CONINUTUL TEZEI A FOST EXPUS N LUCRRILE: 1. , .., , .., , .., , .. - . . . ., , 2005, 49, 7. . 1315-1319. Baerle, A. Dou metode noi de analiza separat a cianidinei i 3,5diglucozid-cianidinei din Aronia Melanocarpa. Analele tiinifice ale U.S.M. Seria tiine chimico-biologice. Chiinu, 2003. p. 339-342. Baerle, A., Guanu, V. Optimizarea extraciei antocianilor din fructe de scorue negre. Analele tiinifice ale U.S.M. Seria tiine chimicobiologice. Chiinu, 2003. p. 346-350. Baerle, A., Gutsanu, V. On the State Condition of Anthocyanins of the Natural Extract of the Black Mountain Ash. I-st International Conference of the Moldavian Chemical Society. Abstracts of Commun., Chiinu, 2003. p. 66. Baerle, A. Modelarea matematic a procesului de sorbie a antocianilor pe cationii puternic acizi. Iul Simp. Internaional Biochimie i Biotehnologii n Industria Alimentar. Materialele. Chiinu, 2002. p. 149-155. , .., , .. Aronia Melanocarpa. IV- . . , , 2002. . 54-55. Guanu, V., Baerle, A., Macari, A. Strategia raional de obinerea antocianilor. Abstracts of the 28-th Romanian Chemistry Conference, Climneti-Cciulata, Vlcea, Romnia, 2004. p. 334. Baerle, A., Guanu, V., Macari, A. Stabilitatea antocianilor: Influena solventului nu poate fi ignorat ! Abstracts of the 28-th Romanian Chemistry Conference, Climneti-Cciulata, Vlcea, Romnia, 2004. p. 335. , .., , .. , .. . Conferina Tehn.-t. Jubiliar a Colaboratorilor, Doctoranzilor i Studenilor U.T.M. Rezumatele lucrrilor. Chiinu, 2004, vol.1. p. 61. Baerle, A., Guanu, V. Procedeu de obinere a colorantului glucozid de cianidin. Brevet de invenie MD-2774 / BOPI, 2005, No. 5. p. 37 Baerle, A., Guanu, V. Procedeu de obinere a colorantului rou din materie prim vegetal. Brevet de invenie MD-2796 / BOPI, 2005, No. 6. p.37 Baerle, A. Particularitile hidrolizei acide a antocianilor n faza solid a cationitului puternic acid. Conferina Tehnico-tiinific a Studenilor i Doctoranzilor U.T.M. Rezumatele lucrrilor. Chiinu, 2003, vol.2. p. 19-20. Baerle, A. Cinetica transformrilor antocianilor n prezena acetonei. Conferina Tehnico-tiinific a Studenilor i Doctoranzilor U.T.M. Rezumatele lucrrilor. Chiinu, 2002, vol.2. p. 19-20.

2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

10. 11. 12. 13.

Autor __________________ Alexei Baerle19 Copyrights Alexei Baerle, 2006

: : : , , , , , , , . : 155 ; : 6; : 20; : 25. , , . . , . , . - / , . 85 : 15. , , . - . . , . . , . , .20 Copyrights Alexei Baerle, 2006

ANNOTATION For Doctors Dissertation in the Physical Chemistry Author: BAERLE ALEXEI Subject: STUDDING OF SEPARATION AND STABILISATION OF THE ANTHOCYANIC COLORANTS FROM ARONIA MELANOCARPA Key words: anthocyanines, mathematic modelling method, physical and chemical factors, quantitative analysis, ion-exchangers, sinegrism of desorbtion, cristalin preparates, anti radical activity. References: 155; Schemes: 6; Figures: 20; Tables: 25. This work deals with the studding of influence of different factors over the stability and the transformations of anthocyanines in the complex extracts, in the modelling systems and in the solid phase of the adsorbent. The mathematic modelling method and optimisation was widely applied. Was determined, that the nature of organic solvents and the solid substances are very important for anthocyanins stability. This influence is complicate, including the solubility of molecular oxygen, water activity and freeradicals generation in the liquid phase. Was elaborated a new express-method for quantitative determination of glycoside/aglicon ratio, which characterised the degree of hydrolysis and further degradation of natural anthocyanines. This method is based on the selective extraction of aglicon, with the solution 3-methyl-butanol-1 : n-heptane (85:15). The mechanism of transformation of the anthocyanines in the presence of sulphocationit includes depolymerisation and rapid acid hydrolysis, catalysed with the functional groups of the ion-exchanger. The bright acid-ethanol synergism of desorbtion of the anthocyanines from the sulphocationit is discovered. Cause of these unusual phenomena is the blockage of associated anthocyanines in the three-dimensional structure of ionexchanger and their decomposition under the influence of ethanol molecules. Two national patent (Republic of Moldova) for the new procedures of obtaining of extra-pure anthocyanines were registered. The antiradicalic and antioxidant activity of these samples is substantial. The antiradicalic activity of cyanidin is better, that of the ascorbic acid one. In the natural extracts of Aronia the basic antiradicalic agents are cyanidin-glycosides.

21

Copyrights Alexei Baerle, 2006