INTRODUCERE Obiectul de studiu al Microbiologiei este biologia microorganismelor, adic studiul organismelor mici, vizibile numai la microscop. Etimologic, noiunea de microorganism are sensul de organism mic. Cu acelai sens se folosete noiunea de microb, mai ales in cazul microorganismelor patogene. Dei utilizat n mod curent, termenul de microb nu este tiinific. Noiunea de microb a fost introdus de Sedillot (l878), cu sensul ei tiinific: micro + bios = via scurt. Termenul s-a pstrat i a dat numele domeniului Microbiologiei. Noiunea de microorganism nu are semnificaie taxonomic, deoarece reunete un grup vast i heterogen de organisme diferite ca poziie sistematic i ca organizare structural, dar care se aseamn prin trei proprieti comune: - toate au dimensiuni microscopice, ceea ce le face invizibile cu ochiul liber; - n general au organizare unicelular. Chiar dac unele microorganisme formeaz asociaii pluricelulare, ele rmn, n esen, organisme unicelulare, deoarece, o celul izolat din complexul multicelular i pstreaz viabilitatea, crete, se divide i reface asociaia; - structura lor intern este relativ simpl, comparativ cu a macroorganismelor. Heterogenitatea microorganismelor este definit de alte trei caracteristici: - poziia sistematic a microorganismelor este foarte diferit; - activitile biologice (fiziologice) pe care le desfoar sunt foarte diversificate - morfologia si structura intern a diferitelor grupe de microorganisme sunt foarte diferite. Cadrul larg al noiunii de microorganism cuprinde urmtoarele grupe: 1. Eubacteria (bacterii adevrate); 2. Cyanobacteria (fostele alge albastre-verzi) 3. Archaea, un grup de microorganisme asemntoare cu bacteriile adevrate, din punct de vedere morfologic i structural. Toate cele trei grupe au organizare celular de tip procariot. Celelalte microorganisme, cu poziie sistematic heterogen au organizare celular de tip eucariot: 1. Fungii microscopici, cu un numr mare de reprezentani; - levurile cu organizare unicelular - mucegaiurile (fungi filamentoi), cu organizare pluricelular; 2. Algele microscopice 3. Protozoarele. Denumirea de bacterie a fost introdus de Ehrenberg (l838). El a creat denumiri de gen: Bacterium, Spirillum, Spirochaeta, fr s stabileasc deosebiri ntre bacterii i protozoare. Dei virusurile nu sunt microorganisme, aceast lucrare cuprinde un capitol de Virologie n care sunt prezentate, ntr-o form general, virusurile i entitile moleculare infecioase cu organizare subviral (viroizii i prionii). Virusurile sunt entiti infecioase cu un nivel nalt de organizare, alctuite n esen, din proteine i un acid nucleic (ADN sau ARN). Studiul interaciunii virus-celul (in special fagul lambda-E. coli) a avut un rol decisiv in dezvoltarea biologiei moleculare. Viroizii sunt entiti infecioase alctuite dintr-o molecul de ARN pur, patogene pentru unele plante de cultur. Prionii sunt entiti infecioase de natur proteic. Pentru studiile referitoare la natura lor, modalitatea de transmitere i la mecanismele patogenezei, lui S. Prusiner, n l997 i s-a decernat Premiul Nobel. Evoluia Microbiologiei ca tiin

Microbiologia este o tiin relativ tnr. Ea s-a cristalizat ca un domeniu particular al tiinelor biologice, n a II-a jumtate a secolului l9. In l655, A. Kircher a intuit existena unor forme de via, invizibile cu ochiul liber. Primele microorganisme au fost vzute cu ajutorul unui aparat optic de mrire a imaginii, de ctre olandezul A.van Leevenhoek in l676. Cu aparatele sale de construcie proprie, el a examinat picturi de ap din diferite surse naturale sau de saliv cu raclaj dentar i a observat o lume fascinant, cu densiti neobinuite, ntr-o micare perpetu. In descrierile i n desenele sale pe care le-a prezentat Societaii Regale din Londra, printre alte organisme se recunosc bacteriile. Din acest motiv, pn n l976, Leevenhoek a fost considerat descoperitorul bacteriilor. Dar gndirea de atunci nu a reuit s reuneasc lumea microorganismelor cu restul lumii vii. In l976, la 300 de ani de la descrierea lor, chiar cercettorii olandezi au considerat c este nedrept ca Leevenhoek s fie considerat descoperitorul bacteriilor, deoarece el nu a intuit particularitile structurale i funcionale ale acestor organisme, ci le-a considerat ca fiind nite pui ai animalelor acvatice mai mari. De aceea le numea animalcule. Dei lupele sale aveau o putere de mrire net superioar celor de azi, Leevenhoek nu a sesizat noutatea lumii pe care a vzut-o. Caracterele aparte ale microorganismelor au fost intuite de F. Cohn (l875). El le-a definit ca organisme microscopice, unicelulare, care se nmulesc prin diviziune direct i este considerat ntemeietorul Microbiologiei ca tiin. De o importan excepional pentru dezvoltarea Microbiologiei sunt descoperirile lui L. Pasteur (l822-l895). El era preocupat de activitile fziologice ale microorganismelor, n special fermentative i patologice. Pentru a le descrie, Pasteur folosete diferite denumiri: ciuperci, infuzori, bacterii, levuri, monade. El a nfiinat primele laboratoare de cercetare microbiologic. Contribuiile sale de excepie se nscriu n urmtoarele domenii: a demonstrat experimental, ca fermentaiile nu sunt procese pur chimice, ci sunt procese biologice, rezultatul activitii metabolice a microorganismelor anaerobe. A definit procesul fermentativ ca fiind rezultatul vieii fara aer a microorganismelor anaerobe. Odat cu descrierea proceselor fermentative, Pasteur a pus bazele Microbiologiei industriale; a pus bazele teoretice ale Microbiologiei medicaleumane i veterinare, demonstrnd cauzele producerii maladiilor infecioase. Pn atunci se cunotea caracterul transmisibil (contagios) al acestora, dar nu se tia ca ele sunt rezultatul ptrunderii in organism a unor ageni patogeni; a demonstrat ca proprietile de patogenitate si virulent a microorganismelor se pot modifica in vitro. Astfel, din culturile de bacterii patogene i virulente deriv culturi cu virulen atenuat, care se pot utiliza ca vaccinuri. Pasteur a pus astfel bazele unei activiti practice de o importan practic excepional vaccinarea; a fundamentat tiinific domeniul imunitii antiinfecioase, creind un domeniu nou al tiinelor biologice Imunologia, nscut ca o ramur a Microbiologiei, dar care ulterior s-a separat complet, ca un domeniu de sine stttor; este ntemeietorul primului Institut de Microbiologie din lume Institutul Pasteur din Paris; n plan teoretic, Pasteur a a rezolvat controversa generaiei spontane, demonstrnd cu argumente experimentale c microorganismele sunt forme de via cu un grad nalt de organizare, ce nu pot lua natere spontan din materia organic. Totdeauna microorganismele i au originea n alte celule, care contamineaz materia organic. In l897, Beijerinck a descoperit virusurile. El a intuit natura particular a agentului mozaicului la tutun i l-a considerat ca fiind contagium, vivum, fluidum (agent contagios, viucorpuscular-filtrabil). Iniial, Virologia s-a dezvoltat ca o ramur a Microbiologiei, dar raportndu-ne la natura particular a virusurilor, Virologia este o tiin independent.

La noi n ar, V. Babe, mpreun cu Cornil (Frana) este autorul primului Tratat de Bacteriologie din lume. In sistemul nervos al animalelor moarte de turbare a descris prezena incluziilor Babe-Negri. I. Cantacuzino este ntemeietorul Institutului de Microbiologie i mentorul colii de Microbiologie din perioada interbelic. Diviziunile Microbiologiei Procariotele populeaz orice mediu adecvat pentru formele superioare de via, dar i o varietate de medii cu condiii extreme, restrictive pentru majoritatea organismelor superioare. Diversitatea proceselor fiziologice bacteriene, precum i rolul lor esenial n ecosistemele naturale, dar i capacitatea de a sintetiza substane utile sau de a produce procese infecioase la organismele superioare au creat, nc de la nceputurile dezvoltrii sale ca tiin, premisele diversificrii domeniilor de studiu al microorganismelor, unele cu un accentuat caracter utilitar. Microbiologia industrial s-a dezvoltat pornind de la descoperirea proceselor fermentative de ctre Pasteur. Ea studiaz utilizarea microorganismelor productoare de substane utile pentru alimentaie, terapeutic sau pentru diferite industrii. Domeniul s-a extins la studiul proceselor de biosintez si bioconversie. Microbiologia solului studiaz ansamblul microorganismelor din sol, interrelaiile dintre ele, precum i interaciunile dintre microorganisme si plante, dar n mod deosebit, rolul microorganismelor n fertilitatea solului i n circuitul elementelor biogene n natur. Geomicrobiologia se distinge prin caracterul ei pregnant utilitar. Studiaz, n special, microbiologia petrolului: rolul microorganismelor n geneza petrolului; posibilitatea utilizrii microorganismelor n exploatarea petrolului; rolul microorganismelor n biodegradarea petrolului. Studiaz rolul microorganismelor n geneza zcmintelor minerale i posibilitatea utilizrii microorganismelor pentru exploatarea zcmintelor i pentru recuperarea metalelor din zcmintele srace. Hidromicrobiologia studiaz microorganismele din mediile aquatice i rolul lor n lanurile trofice. Microbiologia marin, ramur a Hidromicrobiologiei studiaz microorganismele din marile bazine de ap srat, dar n special rolul lor n circuitul elementelor biogene. Microbiologia insectelor studiaz relaiile dintre microorganisme i artropode. S-a concretizat ca domeniu de sine stttor datorit rolului important pe care l au artropodele n patologia uman, animal i vegetal, ca vectori ai unor microorganisme patogene i ai unor virusuri. Microbiologia medical studiaz microorganismele patogene pentru om i animale. Studiaz particularitile lor fundamentale, adic patogenitatea i virulena, factorii care condiioneaz virulena, precum i modul lor de transmitere i posibilitile de combatere. Ecologia microorganismelor este o stiin de sintez care stabilete legitile generale de evoluie i interaciune a microorganismelor n natur. Studiaz interaciunile dintre microorganisme, precum i interrelaiile microorganismelor cu macroorganismele. Genetica microorganismelor este o ramur tnr, conturat dup l940. Studiaz substratul molecular al ereditii i variabilitii microorganismelor i mecanismele de transfer al materialului genetic la bacterii. Microbiologia general este o tiin biologic fundamental, care studiaz particularitile generale ale organizrii structurale i funcionale ale celulei bacteriene, sistematica, rspndirea microorganismelor n natur, relaiile lor ecologice cu alte microorganisme i cu macroorganismele, originea i evoluia lor, fenomenele de ereditate i variabilitate microbian. Microbiologia general este o tiin de sintez i se bazeaz pe datele domeniilor aplicative ale microbiologiei. Cadrul larg al Microbiologiei generale, contribuia sa imens la dezvoltarea multor ramuri ale biologiei i implicaiile ei teoretice i practice n evoluia altor stiine, determinate de posibilitatea utilizrii microorganismelor ca model experimental fac,

ca studiul principiilor fundamentale ale microbiologiei generale s fie de o necesitate absolut pentru orice biolog modern indiferent de domeniul sau de specialitate ca i pentru biochimist i biofizician, genetician, medic, agronom, cercettor n industria fermentativ etc. Importana practic a microorganismelor De la descoperirea lor i pn astzi, interesul pentru studiul microorganismelor a nregistrat o cretere permanent, deoarece un mare numr de specii desfoar activiti benefice, realiznd procese de o valoare imens pentru societatea uman sau produc infecii la om i animale, cu efecte patologice mai mult sau mai puin grave. In mediile naturale, microorganismele realizeaz treapta mineralizrii (descompunerii) materiei organice vegetale i animale, avnd astfel un rol decisiv pentru ncheierea ciclului unor elemente biogene n natur (C, N, P, S), fcndu-le disponibile pentru reintegrarea lor n circuitul vieii. Fertilitatea i productivitatea sistemelor agricole depind n mare msur de activiti fiziologice ale bacteriilor din sol. Fixarea N2 este o activitate fiziologic exclusiv a unor procariote (eubacterii, cianobacterii). Cele din g. Rhizobium produc nodoziti pe rdcinile plantelor leguminoase. Ele reduc N2 la NH4, pe care l pun la dispoziia plantei gazd, fiind utlizat pentru sinteza proteinelor proprii. Astfel, bacteriile simbiotice, dar ntr-o msur mai mic i cele libere reduc necesarul de fertilizatori industriali pentru producia agricol. Bacteriile produc amonificarea materiei organice din sol, iar cele nitrificatoare oxideaz NH4+ la nitrai, iar cele denitrificatoare, reduc nitraii diminund fertilitatea solului. Microorganismele care populeaz tractul digestiv al animalelor i al omului formeaz microbiota normal, ce sintetizeaz vitamina K, esenial pentru mamifere, acidul folic, nicotinic, pantotenic, tiamina, riboflavina, biotina. De o importan deosebit este microbiota din compartimentul ruminal al mamiferelor rumegtoare. Rumenul are rolul unui fermentator natural, n care substratul vegetal este transformat n mas celular, format n special din bacterii i protozoare. Microorganismele constituie adevrata surs de proteine a ierbivorelor. Fr microbiota ruminal, producia ierbivorelor ar fi imposibil. In industria farmaceutic, producia de antibiotice (circa loo ooo t/an) este rezultatul activitii microorganismelor. Microorganismele au roluri multiple in industria alimentar. Majoritatea microorganismelor contaminante au aciune degradativ si de aceea alimentele trebuie protejate prin conservare chimic, prin ngheare sau uscare. Unele microorganisme au efecte favorabile asupra unor produse alimentare: brnzeturile, iaurtul i alte derivate din lapte sunt rezultatul activitii fiziologice a unor microorganisme asupra substratului. Dospirea aluatului de pine, producerea vinului i berii sunt rezultatul fermentaiei alcoolice a levurilor. Conservarea alimentelor vegetale i a furajelor se bazeaz pe fermentaia lactic produs be bacterii. Microorganismele sunt utilizate pentru producerea buturilor acidulate. Acidul citric, adugat multor buturi pentru conferirea aciditii este produs industrial de Aspergillus. De multe ori, astfel de buturi conin fructoza, obinut din amidonul de porumb, prin aciunea bacteriilor amilolitice. Aspartamul, ca ndulcitor este un amestec de doi aminoacizi (acid aspartic si fenilalanina), ambii obinui pe cale microbiologic. Metanul este produs prin aciunea bacteriilor metanogene. Un interes deosebit prezint microorganismele n raport cu industria petrolului. Petrolul brut este supus atacului viguros al microorganismelor si de aceea forarea, exploatarea, dar in special depozitarea se fac in condiii care minimalizeaz aciunea microorganismelor.

Microorganismele fotosintetizante utilizeaz energia solar pentru producerea biomasei, care poate fi convertit, ca i deeurile vegetale, in biocombustibili (metan si etanol), de alte microorganisme. Activitatea uman diminu rezervele diferitelor substane (metale) i microorganismele se folosesc pentru recuperarea metalelor din minereurile srace. Unul dintre cele mai importante domenii practice ale Microbiologiei este biotehnologia. In sens larg, biotehnologia utilizeaz microorganismele n procesele industriale, dar n ultimii l5 20 de ani, biotehnologia folosete microorganisme reprogramate genetic, prin tehnicile de inginerie genic. Importana microorganismelor a fost subliniat de Pasteur n aseriunea rolul unor fiine infinit de mici este infinit de mare. Microorganismele nu sunt numai benefice pentru activitatea uman. Un numr relativ mic de microorganisme patogene cauzeaz o larg diversitate de procese patologice, de la infecii locale, pan la septicemii. Microorganismele triesc n mediile naturale (ap, sol), pe suprafaa tegumentului i n tractul digestiv al omului i animalelor. Majoritatea populeaz mediile cu condiii obinuite, dar bacteriile cresc n mediile care ofer condiii fiziologice i biochimice extreme. Condiiile extreme sunt acelea care se abat mult de la cele normale(pH neutru, atmosfer aerob, salinitate de 1,5%, substratul energetic glucoza). Bacteriile sunt importante att din punct de vedere practic ct i teoretic, pentru studiul proceselor vieii n condiii extreme. Unele bacterii supravieuiesc n condiiile cele mai neadecvate: temperaturi extreme, desicare, ngheare, iar bacteriile extremofile, pentru creterea optim, sunt dependente de condiii speciale de mediu: presiunea uria a abisurilor marine, temperaturi mai mari de l00 grade, concentraii saline apropiate de nivelul de saturare a soluiei de NaCl, pH mai mic de 2 sau mai mare de 10. Bacteriile cresc n condiiile stresului produs de substratul energetic (energie chimic limitat sau chiar n prezena substanelor toxice). Dintre bacteriile extremofile, speciile hipertermofile anaerobe (Pyrococcus furiosus) cresc la temperaturi mai mari de 100o. Exist habitate naturale cu temperaturi crescute: solurile expuse radiaiei solare, platformele de gunoi (cu temperaturi de 60-70o), pn la lava vulcanic, de circa 1000o. Care este temperatura care permite desfurarea proceselor vieii ? Dup Brock, bacteriile cresc la orice temperatur la care exist ap lichid, chiar deasupra punctului de fierbere. Pn de curnd, mediile naturale cunoscute ca fiind populate de bacterii au avut circa 100o. In ultimele decade s-au identificat medii cu temperaturi de peste 350o, n emanaiile de pe fundul oceanelor, ridicnd problema existenei vieii n aceste medii. Din astfel de medii s-au izolat specii hipertermofile anaerobe, ce cresc la peste 100o. Deoarece legturile covalente ale proteinelor, ale ARN, ADN, ATP i NADP hidrolizeaz la 250 o i pentru c structura teriar a celor mai multe macromolecule este alterat la temperaturi mult mai mici, temperatura limit pentru procesele vieii pare a fi de peste 100o, dar mult sub 250o. Cel mai interesant grup de bacterii termofile este cel hipertermofil. Izolarea lor a ridicat pragul termic la care se cunoate c exist via. Pyrodictium occultum crete la 110o. Poziia microorganismelor in sistemele de clasificare a lumii vii In sistemul vechi de clasificare al lui Aristotel, lumea vie este mparit n dou regnuri: Plantae si Animalia. Odat cu descoperirea altor grupe de organisme, aceast clasificare a devenit nesatisfctoare, astfel nct numrul regnurilor s-a extins treptat Hogg (l86o) si Haeckel (l866) au sesizat dificultile de incadrare a unor organisme (Euglena, Chlamydomonas) si au propus un nou regn - Protista , pe care ulterior Hogg l-a denumit Protoctista , alturi de Plantae i Animalia. Acest sistem de clasificare a fost ameliorat de R. Stanier, prin diviziunea regnului Protista in dou subregnuri:

protiste inferioare, in care include microorganismele cu organizare de tip procariot (bacterii si cianobacterii) ; protiste superioare, corespunznd microorganismelor eucariote si care cuprind algele, fungii si protozoarele. In aceas clasificare, regnul Protista include toate microorganismele eucariote i procariote, dar i un numr de macroorganisme pluricelulare nedifereniate (alge marine, bazidiomicete) . Copeland (l938) a propus sistemul celor patru regnuri de clasificare a lumii vii: l. Regnul Monera, n care sunt incluse bacteriile i cianobacteriile. 2. Regnul Protoctista, cuprinznd organismele eucariote inferioare, cu organizare, n esen, unicelular, sinciial sau multicelular, fr difereniere celular avansat (alge, fungi, mixomicete si protozoare). 3. Regnul Plantae cuprinde plantele terestre i acvatice. 4. Regnul Animalia. Whittaker (l969) a propus un nou sistem de clasificare, care mparte lumea vie n 5 regnuri: Monera, Protoctista, Fungi, Plantae, Animalia. Bergey a schimbat denumirea regnului Monera, n cel de Procaryota. Criteriile de grupare ale sistemului se bazeaz pe trei niveluri de organizare: procariot; eucariot unicelular i pluricelular, precum i pe existena a trei modaliti principale de nutriie: fotosintetic si secundar absorbtiv caracteristic plantelor, ingestiv, tipic pentru majoritatea animalelor i absorbtiv, caracteristic fungilor. In acord cu aceste principii, sistemul de clasificare a celor 5 regnuri are urmtoarea structur: l. Regnul Monera include organisme unicelulare, cu organizare de tip procariot: bacterii, cianobacterii, actinobacterii. Toate sunt unicelulare sau unicelular-coloniale, cu excepia actinomicetelor, care au o organizare de tip micelial. Modul de nutriie este absorbtiv, iar metabolismul este de tip foto- sau chimiosintetizant. 2. Regnul Protoctista cuprinde microorganismele eucariote: algele microscopice, fungii acvatici flagelai i protozoarele. Limitele sale fa de celelalte regnuri nu sunt bine precizate. Termenul de Protoctista este preferat celui de Protista, deoarece, pe lng protozoare sunt incluse i organisme pluricelulare (alge marine, fungi inferiori), dar datorit absenei diferenierii tisulare sunt mai apropiate de organismele unicelulare. Metabolismul este foto- sau chimiosintetizant, iar nutriia este absorbtiv sau ingestiv. 3. Regnul Fungi cuprinde organisme eucariote imobile ce formeaz spori. Din spori, prin germinare se formeaz hifele, compartimentate n celule, prin septuri transversale. O aglomerare de hife formeaz miceliul. Prezint procese sexuale de tip connjugativ, rezultatul fiind un miceliu dicarion. Starea dicariot este eventual urmat de fuziune, iar diploidia este tranzitorie, deoarece prin diviziuni meiotice se formeaz spori haploizi. In absena procesului sexual, sporii se formeaz pe cale asexuat la vrful unor hife specializate i se numesc conidii. La germinare, sporii sexuai sau asexuai formeaz o hif. Aproape toi fungii sunt aerobi, dar sunt heterotrofi fr excepie. Nutriia este de tip absorbtiv. Fungii secret enzime care degradeaz moleculele nutritive complexe din mediul extern. Moleculele simple sunt transportate prin peretele i membrana fungic. 4. Regnul Plantae este mprit n dou grupe: plante nevasculare (briofite) i plante vasculare (trachaeofite). Ultimele au esuturi conductoare (xilem si floem). Xilemul transport apa i ionii de la rdcini spre parile aeriene, iar floemul transport seva elaborat n fotosintez, de la nivelul frunzelor, n toat planta. Plantele se dezvolt din embrioni diploizi. Spre deosebire de animale, formate n cea mai mare parte din celule diploide i de fungi care sunt organisme haploide sau dicariote, plantele alterneaz n ciclul lor de dezvoltare, generaiile haploid i diploid. Generaia haploid se numete gametofit, iar cea diploid se numete sporofit. La

briofite predomin faza de gametofit, iar sporofitul este mic i cu aspect total diferit. La tracheofite, predomin sporofitul, iar gametofitul este constituit dintr-un grup de celule dependente de sporofit. 5. Regnul Animalia cuprinde organisme multicelulare, cu nutriie de tip ingestiv. Celulele sunt diploide si se dezvolt din doi gamei haploizi: ovulul si spermatozoidul. Dup fertilizare rezult celula ou diploid, ce strbate etapele de blastul i gastrul. Celulele animale sunt lipsite de perete i de plastide, dar au o difereniere tisular foarte inalt. Sistemele de clasificare cu 4 i 5 regnuri scot n eviden heterogenitatea microorganismelor. In sistemul celor 5 regnuri, microorganismele aparin regnurilor Monera, Protoctista i Fungi. Bacteriile se disting de celelalte organisme prin organizarea celular de tip procariot., pe care Chatton a evideniat-o nc din l925. Toate sistemele moderne de clasificare rezerv bacteriilor o poziie sistematic separat. Incadrarea lor alturi de plante este arbitrar si nelogic (Stanier, l977), iar pstrarea ei n pofida numeroaselor argumente tiinifice care probeaz contrariul este rezultatul refuzului de a privi lucrurile n fa. Criteriile de evaluare a diversitii bacteriilor Estimarea diversitii vieii este o provocare permanent a biologiei. Pentru microorganisme, scopul este complicat de faptul c subiectul inventarierii nu este vizibil cu ochiul liber i nici nu se difereniaz pe criterii morfologice. Estimrile anterioare ale numrului de specii bacteriene erau de 107- 109. Clasificarea microorganismelor, anterior utilizrii analizei moleculare, s-a fcut pe baza urmtoarelor criterii: morfologice (coci, bacili, spirili) tinctoriale (reacia Gram) structurale metabolice (prin evidenierea capacitii de a metaboliza anumite glucide sau aminoacizi) biochimice prin evidenierea markerilor moleculari caracteristici (mureina, acizii teichoici, lipidele cu legturi eterice din membrana Archaea etc). Criteriile clasice de clasificare a bacteriilor s-au dovedit utile pentru determinrile curente de laborator, dar nu au permis elaborarea unui sistem de clasificare bazat pe criterii naturale i nici explicarea legturilor filogenetice dintre procariote i eucariote. Pornind de la observaia lui Chatton (l925), n acord cu care exist dou tipuri distincte de organizare a lumii vii, procariot i eucariot, R. Stanier (n anii 60) a elaborat conceptul clasic, unificator, privind structura i funciile celulei bacteriene, pe baza unor criterii discriminatorii de tipul "totul sau nimic". Procariotele au fost definite pe baza diferenelor de compoziie chimic i a funciilor pe care le ndeplinesc structurile omologe ale organismelor procariote i eucariote. Conceptul elaborat de Stanier, dei a dominat gndirea microbiologic circa 30 de ani, nu corespunde realitii tiinifice, deoarece nu cuprinde toate procariotele. Clasificarea lumii vii n 3 domenii pe baza criteriilor moleculare In ultimii 15-20 de ani, locul criteriilor clasice a fost luat de metodele de analiz molecular. Descoperirea organismelor procariote, grupate n domeniul Archaea a invalidat conceptul clasic de bacterie, bazat pe particulariti biochimice i funcionale discriminatorii, n raport cu celula eucariot. Microorganismele Archaea creeaz o punte de legtur ntre tipul de

organizare procariot i eucariot (Woese, l994), permind elaborarea unui arbore filogenetic comun al organismelor procariote i eucariote. Metodele de biologie moleculara, de secventiere a proteinelor si acizilor nucleici (denumite semantide Zuckerkandl si Pauling, 1965) au permis conturarea filogeniei bacteriene intr-un sistem de clasificare care cuprinde toate procariotele. Cu cat secventele semantidelor a doua organisme sunt mai asemanatoare, cu atat ele sunt mai apropiate filogenetic. Acest criteriu presupune ca genele codificatoare sa nu se transfere pe orizontala, de la o celula la alta. La bacterii, secvenierea proteinelor pentru scopuri filogenetice este neadecvat, pentru c uneori, o protein are o distribuie limitat sau este greu de secveniat (Zinder, l998). Metodele de biologie molecular au fost orientate n primul rnd asupra studiului acizilor nucleici. S-a determinat procentul G + C din ADN, dar testul nu este edificator, deoarece dou organisme cu secvene diferite de ADN pot avea aceeai proporie de G + C. Testul ramne valabil pentru a caracteriza un organism nou. Tehnica secvenierii ADN a revoluionat sistemele de clasificare a bacteriilor, deoarece a permis accesul la informaia coninut n ADN. Un alt test furnizat de biologia molecular, util pentru studiul filogeniei bacteriene este hibridarea ADN-ADN. ADN se denatureaz prin tratament termic sau cu baze. Metoda evideniaz capacitatea unei secvene de ADN monocatenar al unui organism de a forma un heteroduplex cu ADN monocatenar de la alt organism, pe baza omologiei secvenei de baze. Dac deosebirile secvenei de baze sunt mai mari de l5%, heteroduplexul nu se formeaz, astfel c acest test este negativ pentru organismele ndeprtate filogenetic, dar este decisiv pentru delimitarea speciei bacteriene. Woese i Fox au propus, ca instrument filogenetic pentru evaluarea raportului evolutiv dintre microorganisme, analiza secvenei ADN din care este transcris ARNr 16S (ribotipia). Ribotipia presupune folosirea probelor capabile s detecteze genele ce codific ARNr. Utilizarea genelor ARNr pentru identificarea bacteriilor i are originea n gradul nalt de conservare a genelor codificatoare a ARNr. Genele pentru sinteza ARNr sunt organizate n operoni, n care genele individuale sunt adeseori separate prin ADN necodificator. O prob de ARNr marcat sau ADN de la o specie va hibrida cu variate regiuni ale ADN de la specii bacteriene nenrudite. Tehnica de ribotipie implic izolarea ADN total al celulei bacteriene i fragmentarea sub aciunea unei enzime de restricie. Rezult astfel o colecie de fragmente de ADN cu o distribuie uniform a dimensiunilor. Fragmentele se separ prin electroforez n gel de agaroz i se transfer pe o membran de nitroceluloz prin capilaritate (blotting). Apoi fragmentele sunt hibridate cu o prob marcat care conine genele ARNr (ARNr de E. coli). Hibridarea apare numai n acele fragmente cromosomale care conin secvenele genelor ARNr. Ribotipia a fost una dintre primele tehnici moleculare folosit cu succes pentru taxonomia vibrionilor. Astfel s-au identificat (i s-au depozitat n GenBank) peste 78 000 secvene ale genei pentru sinteza ARNr 16S, izolate de la bacterii cultivate sau obinute prin amplificare, direct de la probele din sol, fr cultivare. In anii 70, C. Woese a iniiat studiul secvenei ARNr (16S), ca un posibil marker filogenetic, folosind ARNr l6S cu lungimea l500-l600 nucleotide, component al subunitii mici (30 S) a ribosomului. Tehnica presupune izolarea ARNr i digestia sa cu RN-aza T1, care cliveaz dup fiecare rest de G. Rezult o varietate de fragmente de oligoribonucleotide, cu lungimea de l25 baze, fiecare terminndu-se cu G. Amestecul se separ prin metoda electroforezei bidimensionale. Se nregistreaz tabloul oligonucleotidelor i se compar cu cel obinut de la alte organisme, stabilindu-se un coeficient de asemnare, a crui valoare variaz ntre 0 (pentru neasemnare) i 1 pentru identitatea complet. Astfel s-a evideniat c Cyanobacteria sunt asemntoare cu cloroplastele. Secvenele obinute prin amplificarea direct a probei din mediu, ofer singura informaie disponibil pentru 99% dintre procariotele din mediile naturale.

Studiile recente sugereaz c numrul total al speciilor bacteriene, evaluat prin secvena de baze a genelor pentru ARNr 16S, este de peste 1030, grupate n cel puin 50 de filumuri bacteriene. Jumtate dintre ele sunt alctuite n ntregime din bacterii necultivabile. Alte 3 filumuri sunt formate din specii cultivate n proporie mai mic de 10%. Membrii a numai 6 filumuri au fost cultivai n proporie de peste 90%. Rezultatele cercetrilor de nivel molecular au artat ca sistemul de clasificare a lumii vii n cele 5 regnuri nu este corect din punct de vedere filogenetic, din mai multe motive: cele dou regnuri de microorganisme eucariote Protista i Fungi sunt artificiale; plantele i animalele (Metaphyta i Metazoa) au evoluat din organisme eucariote unicelulare; n sistemul celor 5 regnuri, diferenele dintre Monera (Procaryotae) i celelalte 4 regnuri sunt mult mai mari dect diferenele ntre reprezentanii celor 4. Noul sistem de clasificare accept c forma de organizare eucariot nsumeaz o multitudine de caractere comune i definete o unitate filogenetic. Regnul Procaryotae (Monera) reunete diviziunea EUBACTERIA i ARCHAEA. La nivel citologic, ambele sunt procariote, dar la nivel molecular ARCHAEA se disting de EUBACTERIA. Ele nu constituie o unitate filogenetic, deoarece nu ntrunesc caractere unitare. La nivel molecular, organismele ARCHAEA se aseamn mai mult cu EUCARIOTELE dect cu EUBACTERIILE. Din aceast cauz, regnul Procaryotae (Monera) este un taxon nevalidat de datele de ordin molecular. Woese (l990) consider c noul sistem filogenetic, pe baza criteriilor moleculare, permite mprirea lumii vii n trei sisteme primare distincte. Clasificarea trebuie s recunoasc, n primul rnd, cele trei tipuri fundamentale de organisme: Eubacteria, Archaea i Eucaryotae. Gruprile trebuie s aib statutul de domenii, o categorie taxonomic superioar regnului. Autorul propune abandonarea denumirii de Archaebacteria, deoarece sugereaz nrudirea strns cu Eubacteria, care n realitate nu exist. Cele trei domenii se numesc Bacteria (sinonim Eubacteria), Archaea si Eucarya (sinonim Eucaryotae), care include organismele eucariote (protozoare, alge, fungi, plante, animale). Din punct de vedere fiziologic, microorganismele domeniului Archaea aparin la trei tipuri: metanogene, halofile i sulf-dependente. Metanogenele sunt strict anaerobe i produc gaz metan ca produs final al fermentaiei. Cele sulf-dependente triesc n medii termofile i reduc sulful elementar sau oxideaz compuii sulfului pentru a obine energie sub forma potenialului reductor. Sunt specii aerobe si anaerobe. Halofilele triesc n medii hipersaline i unele se protejeaz de lumin cu un pigment care conine carotenoizi. Sunt aerobe obligate. Din punct de vedere filogenetic, domeniul Archaea are dou diviziuni distincte (Kandler, l993): Crenarchaeota (crenos = izvor) cuprinde exclusiv microorganisme hipertermofile dependente de sulf, care i dobndesc energia prin reacii de reducere a sulfului (Thermoproteus, Pyrodictium etc.), sau de oxidare a compuilor cu sulf (Sulfolobus). Sunt rspndite n mediul marin i n mediile vulcanice terestre; Euryarchaeota cuprinde metanogenele chimiolitotrofe hipertermofile strict anaerobe ce cresc la ll0o (Methanopyrus) i metanogenele mezofile (din ap, sol, intestinul animalelor). Ali reprezentani sunt halofilele extreme ce triesc n soluii saturate de NaCl (Halobacterium halobium), sulfat-reductorii termofili (Thermococcus, Pyrococcus). Clasificarea lumii vii in trei domenii recunoate independena filogenetic a bacteriilor (Eubacteria) i a reprezentanilor Archaea.

Nici unul dintre sistemele de clasificare a lumii vii nu include virusurile. Ele formeaz un grup de entiti infecioase fr echivalent n lumea vie, dar au relaii foarte strnse cu aceasta, deoarece se multiplic numai n substratul celular viu.

Fig. 1: Arborele filogenetic universal, bazat pe secvena ARNr a subunitaii ribosomale mici, care cuprinde cele trei domenii (dupa Woese, 1991)

Caracteristicile distinctive ale organismelor celor trei domenii Particularitile lumii bacteriene au fost sesizate de F. Cohn, in perioada l850-l875. El lea definit ca organisme de dimensiuni microscopice, unicelulare, care se nmulesc prin diviziune direct. Din acest motiv, F. Cohn este considerat intemeietorul microbiologiei ca tiin. Arhitectura celular a organismelor grupate in domeniul Archaea se aseamn cu cea a eubacteriilor. Moleculele componente ale celulelor Archaea se aseamn, unele cu ale eubacteriilor, altele cu ale eucariotelor, dar exist i molecule specifice (tabel nr. 1).Tabel nr. 1: Caracterele structurale si funcionale ale eubacteriilor, Archaea si eucariote Caracter Dimensiuni Perete celular Eubacterii Civa m Prezent constant (cu excepia micoplasmelor). Conine un peptidoglican (mureina), totdeauna cu acid muramic. Permeabilitate foarte selectiv (pentru ap i molecule cu diametrul mai mic de o,8 nm), pentru enzimele degradative i pentru fragmente mici de ADN. Nu fac endocitoz sau Archaea Civa m Conine proteina denumit pseudomurein fr acid muramic. Lipsete la Thermoplasma. Idem Eucariote Celule mult mai mari (zeci de um). Unele eucariote sunt unicelulare Lipsete la celulele animale. La cele vegetale conine celuloz, iar la fungi conine chitin.

Membrana plasmatic

Are o plasticitate accentuat. Celula face endocitoz prin fagocitoz sau pinocitoz. Sterolii sunt prezeni constant.

exocitoz. Lipsesc sterolii (cu excepia micoplasmelor). Lipidele sunt esteri ai acizilor grai cu glicerolul.

Lipidele au legturi eter ntre glicerol i catenele de C. Au catene izoprenoidice ramificate cu metil. Unele lipide sunt tetraeteri. Transformri reversibile sol-gel. Prezint cureni citoplasmatici. Idem

Citoplasma

Membrane intracitoplasmaice Organite care conin ADN Citoschelet Organite de locomoie

Este ntr-o permanent stare de gel, necesar meninerii integritii structurii materialului nuclear. Lipsesc membranele interne. Curenii citoplasmatici sunt abseni. Dimensiunile mici ale celulei uureaz difuzia substanelor nutritive i de catabolism. Absente. Membrana poate trimite invaginri la nivelul crora se desfoar activiti respiratorii --------------Flagelul cu structur simpl, format din molecule de flagelin, aezate dup o simetrie helical. Flagelul este pus n micare de un motor rotativ situat ntre perete i membrana. Energia de micare este produs de un gradient protonic de o parte i de alta a membranei Diviziunea este simpl (direct). Rareori are loc o diviziune asimetric prin nmugurire. Bacteriile filamentoase sufer diviziuni multiple prin segmentare sau fragmentare. Un cromosom circular ce conine o,6l26 perechi de baze. Material genetic accesoriu (plasmide) Un echivalent nuclear denumit nucleoid cu aspect de mas fibrilar, nedelimitat de membran, ce corespunde cromosomului bacterian. Absena membranei delimitante a materialului genetic este particularitatea fundamental a organizrii celulare de tip procariot. Cromosomul mezosom este legat fizic de

Idem

Au organite delimitate de o membran cu o structur trilaminar de unit membrane. Mitocondrii, cloroplaste

--------------

Prezent Accesorii. Dac exist sunt cili sau flageli de tip eucariot, cu o structur complex de 2 x 9 + 2 tubuli.

Idem

Tipul diviziune

de

Diviziunea este indirect, cu aparatul mitotic si fazele caracteristice. Idem Un cromosom circular cu l-4 x lo6 baze perechi i plasmide. Un numr constant de cromosomi, cu caracter de specie. ADN este asociat cu proteine histonice. In mitocondrii i cloroplaste, ADN dublu catenar circular nu conine histone. Nucleu tipic, cu nucleol. Idem

Cromosomi

Nucleul

Distribuia materialului genetic dup diviziune

Prin intermediul aparatului mitotic Idem

Ribosomi* Introni

70 S Abseni

70 S Prezeni n genele ce codific ARNr si ARNt. Genele ce codific proteinele sunt continui. Ribosomii lor sunt 70 S, dar sunt rezisteni la inhibitorii clasici ai sintezei proteice la Eubacteria (streptomicin i cloramfenicol) (--)

80 S. In mitocondrii si cloroplaste sunt ribosomi 70 S. Prezeni n genele ce proteinele, ARNr i ARNt.

codific

Sensibilitatea ribosomilor la streptomicin (inhiba initierea catenei polipeptidice) i la cloramfenicol (inhiba alungirea catenei polipeptidice. Sensibilitatea ribosomilor la cicloheximid (inhiba alungirea catenei polipeptidice. Sensibilitatea ribosomilor la toxina difteric

+

Nu inhiba sinteza proteinelor in citoplasma, dar cele doua antibiotice inhiba sinteza proteinelor in cloroplaste si mitocondrii pentru ca au ribosomi cu caracteristici functionale de tip procariot.

_

_

Cicloheximida inhiba specific functia ribosomilor celulei eucariote.

_

Toxina difterica inhiba alungirea catenei peptidice, la Archaea, pentru ca inactiveaza un factor de alungire. (+) Metionina Complex (minimum 7 subuniti). + Proteina care se leag de secvena TATA 110 grade

Efectul inhibitor asupra sintezei proteinelor la eucariote se produce dupa acelasi mecanism ca si la Archaea.

Aminoa-cidul iniator al catenei polipepti-dice Structura ARNpolimerazei** Operoni Iniierea transcrierii Tempera-tura maxim de cretere Sinergonul respirator i fotosintetic

N-formyl-metionina

Metionina Idem _ Idem 60 grade Cele dou funcii au sedii diferite i se desfoar independent. Sinergonul

Simpl (5 subuniti) + Factorul sigma 95 grade Sinergonul se definete ca un ansamblu de enzime ce functioneaz coordonat pentru realizarea unei ci

Formarea endosimbiontilor Capacitatea de a forma organisme multicelulare Capacitatea de difereniere celular Mecanisme de transfer genetic

metabolice. Cele dou sinergoane sunt nempachetate, sediul lor structural fiind membrana plasmatic. De aceea, cele dou funcii sunt interrelate, modificarea uneia antrennd modificarea celeilalte Nu adpostesc niciodata endosimbioni Absenta. Sunt organisme unicelulare. Uneori formeaz asociaii coloniale, dar totdeauna fiecare celul i pstreaz individualitatea structural i funcional. Prin diviziune reface asociaia. Foarte rar si limitat la structuri de rezisten (sporul i echivalentul sau chistul). Fac excepie mixobacteriile, care au ciclu de dezvoltare i capacitate de difereniere Sunt heterospecifice. Transferul informatiei genetice se face ntre specii i chiar ntre genuri diferite. Informaia genetic este ntr-o permanent mobilitate, ceea ce face dificil definirea speciei bacteriene.

Idem

respirator este localizat n mitocondrii, iar cel fotosintetic, n cloroplaste.

Idem

Inglobeaz frecvent celule pe care le pstreaz ca endosimbioni Uneori, celula eucariot constituie organisme unicelulare, dar de cele mai multe ori formeaz organisme multicelulare.

Idem

Absent

Foarte marcat

Fuziunea gameilor este intraspecific. Idem

*

Pentru proteinele ribosomale, omologia dintre Archaebacteria i Eucariotae nu are corespondent la Eubacteria (Kandler, l993). Dar Archaea i eucariotele sunt foarte diferite i se disting, fiecare n parte, de eubacterii.**

Eucariotele se disting prin existena a 3 ARN-polimeraze*: ARN-polimeraza I transcrie ARNr; ARNpolimeraza II transcrie ARNm; ARN-polimeraza III transcrie ARNt. Cele 12 subuniti ale ARN-pol II sunt codificate de de tot attea gene i sunt foarte bine conservate la eucariote. De exemplu, 6 subuniti ale ARN-pol II uman pot nlocui omologele lor la levuri. Toate cele 3 ARN-polimeraze ale celulelor eucariote sunt alctuite fiecare din 12 subuniti. 5 dintre ele sunt comune pentru toate cele 3 ARN-polimeraze, iar 3 dintre ele sunt specifice ARN-pol II. Astfel, ARN-polimerazele sunt asamblate din subuniti comune i subuniti specifice de clas.

Uneori, moleculele Aarchaea se aseamn cu omologele lor de la eucariote, mai mult dect cu ale eubacteriilor. Tipuri morfologice de bacterii Anatomia bacterian studiaz forma celulelor, ultrastructura si structura molecular a diferitelor organite celulare, in strns corelaie cu funciile pe care le indeplinesc. Forma celulelor bacteriene este controlat genetic i se realizeaz n mare masur prin intermediul peretelui care confer celulei un grad de rigiditate i prin aceasta, forma tipic (fig. 2). Peretele celular este rigid, dar n acelai timp, suplu i elastic, adic este deformabil.

Fig. 2: Tipuri morfologice de bacterii: A = diplococi; B = streptococi; C = stafilococi; D = bacili; E = cocobacili; F = bacili fusiformi; G = forme bacilare filamentoase; H = vibrioni; I = spirili; J = sarcina

Datorit elasticitii sale, forma celulei bacteriene, n diferite condiii de mediu are tendina s varieze ntre anumite limite, ns forma tipic a celulelor unei populaii rmne dominant. Celulele bacteriene aparin urmtoarelor tipuri morfologice: a. Forma sferic (sferoidal) denumit coc (coccus, latin = smn). Celulele sunt izodiametrice. Dup modul de grupare se disting urmtoarele subtipuri: cocul simplu (celule solitare) diplococ (celule perechi) streptococ (celule asezate n lan, streptos = lan) tetracoc (tetrada) sarcina (dou tetrade suprapuse) stafilococ (staphylos = ciorchine) La diplococi i streptococi, diviziunile celulare se succed dup un singur plan. La ali coci (Pediococcus, Thiopedia, Lampropedia, Deinococcus), prin diviziuni succesive se formeaz grupri de 4 celule aranjate n tetrade bidimensionale. Ulterior se formeaz tablete de form ptrat, de 16-64 celule, ceea ce denot existena a dou planuri de diviziune, perpendiculare unul pe cellalt i care se succed alternativ. La Sarcina i la Synechocystis, dup trei diviziuni celulare rezult 8 celule aranjate n pachete tridimensionale cuboide. Diviziunile se succed dup toate cele trei planuri ale spaiului, fiecare perpendicular pe celelalte dou. b. Forma bacilar (bacillus, latin = bastona). Diametrul mare (lungimea) depete de cteva ori pe cel transversal. Extremitile celulei sunt rotunjite sau tiate n unghi drept. Se disting mai multe subtipuri morfologice, n funcie de modul de grupare a celulelor: cocobacil, o forma intermediar intre coc si bacil diplobacil streptobacil rozet (stea)

palisad litere chinezeti c. Forma spiralat, cu cteva subtipuri: vibrion spiril spirochet La spirili, spirele sunt rigide i puine, iar la spirochete sunt laxe i numeroase. Celulele unei populaii bacteriene unitare, teoretic aparin aceluiai tip morfologic, dar frecvent apare un polimorfism, mai accentuat n mediile naturale (ap, sol, tractul digestiv). Morfologia celulelor este mai uniform n culturile bacteriene in vitro, dar se modific n cursul evoluiei unei populaii celulare. De aceea, pentru a evita confuziile, descrierile morfologice, considerate tipice pentru o populaie bacterian se refer la celulele cultivate n laborator pe medii optimale (medii care conin toate substanele necesare creterii celulelor), in condiii adecvate de temperatura, pH, grad de aerare. Deoarece n culturile bacteriene mbtrnite apar frecvent forme de involuie, cu morfologie atipic, forma caracteristic a celulelor unei specii este aceea a celulelor tinere, dintro cultur bacterian aflat la sfritul perioadei de multiplicare. Bacteriile care se abat de la tipurile morfologice eseniale sunt mai rare. Astfel se disting: bacterii ptrate, bacterii prostecate, bacterii cu apendice acelulare, bacterii cu trichoame (filamentoase), bacterii miceliene. Bacterile ptrate, au fost descrise de Walsby (l980) n apele hipersaline din peninsula Sinai. Pe seciune au aspect de lentil biconcav, datorit coninutului foarte mic de ap. Din aceast cauz, presiunea intern a celulei este practic nul. Nu se exercit presiune asupra nveliurilor celulare. Pentru ele s-a propus denumirea de gen Quadra i aparin archaebacteriilor. Bacteriile prostecate (prosteca = apendice, coad, anex, adaus). Caracteristica structural este existena prostecii, o prelungire semirigid n continuarea celulei, cu diametrul mai mic dect al celulei mature. Prosteca este o prelungire celular, ceea ce o deosebete de structurile apendiculare acelulare. Se disting dou categorii de bacterii prostecate: bacterii pedunculate (de exemplu, Caulobacter); bacterii prostecate care nmuguresc (de exemplu, Hyphomicrobium). Bacteriile cu apendice acelulare (de exemplu, Gallionella) sunt reniforme. De pe faa concav pornete un apendice acelular lung, format dintr-un produs de secreie a celulei Bacteriile ce formeaz trichoame (de exemplu Beggiatoa, Sphaerotilus) au aspectul unui filament multicelular, n care celulele vin n contact prin extremitile lor i sunt nvelite printr-un nveli parietal comun. Bacteriile miceliene (actinomicete, iar denumirea nou este aceea de actinobacterii) au un aparat vegetativ reprezentat de micelii fine, ramificate, cu organizare procariot.