AgO = lant O din LPZAg R = miez PZ din LPZAg K = capsulaAg H = flagelAg F = pili

1. Microbiologia. Obiectul de studiu. Disciplinile microbiologice si obiectele de studiu. Etapele istorice de dezvoltare a microbiologiei. Rolul savantilor A. Leeuwenhoek, L. Pasteur, R. Koch, I.Mecinicov in dezvoltarea microbiologiei.

Obiectul de studiu: 1. mi/o si activitatea lor vitala (forma, structura, metabolism, crestere si multiplicare)

identificare2. relatiile mi/o cu mediul ambiant si cu organismul-gazda

Scopurile studierii mi/o:1) patogene, oportuniste = prevenire maladii infectioase2) utile, inofensive = productie AB, medicamente prin ADNrec (streptokinaza, insulina),

alimente (unt, brinza)3) insecticide „biologice”4) fabricare plastic biodegradabil ???5) decompunere deseuri, metan

Disciplini microbiologice: particularitati biologice mi/o

• bacteriologie• virologie• protozoologie• micologie, etc

habitat mi/o• microbiologia solului• ... marina• ... cosmica

implicatii in activitatea umana• microbiologia medicala• ... veterinara• ... alimentara, etc

Genetica microbiana Ecologia microbiana

Microbiologia medicala studiaza:a) relatia mi/o-gazda umanab) capacitatile patogene mi/oc) capacitatile antiinfectioase organism umand) metode de diagnostic etiologic al bolilor infectioasee) metode de terapie/profilaxie antimicrobiana

Etape istorice in dezvoltarea microbiologiei:I. empirica (pina in sec. 15)II. morfologica (sec. 16-18)

A. von Leewenhoek: 1673 – prima observare si descriere a mi/oIII. fiziologica (sec. 19)

L. Pasteur: prepararea vaccinurilor contra antraxului, turbarii, holerei; sustine necesitatea sterilizarii instrumentelor, bandajelorR. Koch: introducerea mediilor de cultura solide; izolare agent antrax, tbc; elaborare teorie despre rolul etiologic al mi/o in bolile infectioase (postulatele lui Koch)I. Mecinicov: argumentare rolul florei intestinale (antagonism); descoperire fagocitoza si rolul antimicrobian al inflamatiei

2. Tipurile de laboratoa re microbiologice si sarcinile lor. Regimul si regulile de lucru in laboratorul microbiologic. Clasificarea laboratoarelor in functie de exigenta sigurantei antiinfectioase.

1

3. Notiune de microorganisme. Categoriile taxonomice, tipuri acelulare si celulare. Deosebirile dintre microorganismele procariote si eucariote.

Mi/o = organisme microscopice (micro-nano- metri) + alge, protozoare, virusuri, agenti subvirali (prioni), cipuerci microscopice (fungi, micete)Clasificari mi/o:

fenotipica (prima tentativa – Carl von Linne) genotipica filogenetica (bazata pe studiul fosilelor sau al HLA)

Grupe taxonomice: domeniu regn increngatura clasa ordin familie gen specieTaxoni infraspecifici din cadrul speciei, care prezinta anumite diferente:

biovar (activitate biochimica/fiziologica) serovar (structura Ag) patovar (grad de patogenitate) lizovar (sensibilitate la bacteriofagi) antibiovar (sensibilitate la AB)

Rolul taxonilor infraspecifici: markeri epidemiologici!Clasificare mi/o:

forme acelulare (virusuri, viroizi, prioni) forme celulare:

bacteria = procariote, eubct1) G-2) G+3) micoplasme (lipsite de PC)

archaea = procariote, PC fara peptidoglican, habitat in conditii extremale eucarya = eucariote (fungi, protozoare)

4. Metodele microbiologice de diagnostic si esenta lor. Metoda microscopica in diagnosticul bolilor infectioase. Tipurile de microscoape, utilizarea practica, particularitatile si rolul uleiului de emersie.

Metode microbiologice de diagnostic: diagnostic direct (detectare agent patogen sau a produselor lui)

1. microscopic (orientativ) prezenta bct, nr, forma, structura2. bacteriologic izolare culturi pure de bct, identificare si testare la AB3. biologic (experimental) inoculare produs patologic la animale de laborator,

provocare maladie tipica4. depistare Ag mi/o in lichide biologice5. identificare AN mi/o prin tehnici de biologie moleculara

diagnostic indirect (imunologic)1. serodiagnostic detectare si titrare Ac specifici in serul bolnavului2. intradermoreactie introducere alergen microbian epidermal/intradermal; reactie

pozitiva = aparitie eritem hipersensibilitate specifica (intilnire repetata cu Ag)5. Morfologia bacteriilor. Grupurile morfologice de bacterii. De desenat.

Caracterele tinctoriale ale bacteriilor. Colorantii de baza utilizati in microbiologie. Metodele de colorare. Aplicarea practica.

Bct = mi/o, unicelular, procariot, autonomGrupe morfologice de bct:

• coci:1. micro2. diplo (neisseria=bob de cafea, pneumococi=lanceolati)3. tetra4. strepto (lant) + enterococcus, lactococcus5. stafilo (gramezi)6. sarcine (pachete 8-16-32 coci)

• bastonase1. bacterium – capete rotunjite, nu formeaza spori (ex. E. coli)2. bacillus – capete retezate, formeaza spori ce nu depasesc diametrul celulei (ex. B.

anthracis); posibilitate formare lanturi = streptobacili

2

3. clostridium – capete rotunjite, formeaza spori ce depasesc diametrul celulei (ex. C. perfringens)

• spiralate/incurbate1. vibrio (ex. V. cholarae)2. campylo-/helico- bacter = 2 apire. aspect de pasare in zbor (ex. C. jejuni)3. spirillum = cel. spiralate rigide4. spirochaeta = cel. spiralate flexibile, 5-25 spire (ex. Treponema, Leptospira,

Borrelia)• polimorfe (Actinomyces, Rickettsia, Chlamydia, Mycoplasma)6. Etapele si tehnica de pregatire a frotiurilor din culturile bacteriene crescute pe

medii lichide. Tehnica de pregatire a frotiurilor din biosubstrate: sputa si frotiuri amprente. Metodele de fixare.

Pregatirea frotiurilor examen microscopicEtape in pregatirea frotiului:

1) etalare material microbian2) uscare3) fixare oamoara bct, mareste afinitatea pt colorant4) colorare asigura contrast intre mi/o si fundal5) examinare (microscop optic cu imersie)

Caracter tinctorial = capacitatea mi/o de a fixa colorantul7. Etapele si tehnica de pregatire a frotiurilor din culturile bacteriene crescute pe

medii solide. Tehnica de pregatire a frotiurilor din biosubstrate: singe, puroi. Metodele de fixare.

8. Structura celulei bacteriene. Enumerati elementele permanente (obligatorii) si nepermanente (neobligatorii) de structura. Membrana citoplasmatica si citoplasma. Structura, compozitia chimica si functiile biologice. Metodele de evidentiere.

Elemente permanente:1. PC2. MCt3. Ct4. nucleoid5. ribosomi6. mezosomi G+ (E, citocromi)

Elemente nepermanente:1. capsula2. spor3. flageli4. fimbrii5. plasmide6. incluziuni celulare

MCt:• mozeic fluid Singer• lipsa colesterol, contin sterol-like molecules hopanoizi• mai bogata in prot. decit eucariotele fctii multiple (la eucariote indeplinite de organite)

PBP – catalizare transpeptidare si sinteza PC permeaze – transport prot. sist. de secretie receptori E lant respirator

Rol MCt:1. Bariera semipermeabila, selectiva difuziune simpla, facilitata2. Permeaze transport activ3. E activitate metabolica4. Metabolism energetic

3

5. Participa la diviziunea celulara6. Sinteza PG si fosfolipidelor7. Chemotaxis (R specifici)

Mezozomi: cresc S MCt cresc activitatea metabolica, energetica

Ct:• Lipsesc organitele• Prezenta: ribozomi, nucleoid, inclusiuni, plasmide• pH acid

Rol Ct: sediul proceselor metabolice9. Peretel e celular bacterian, functiile. Particularitatile de structura ale peretelui

celular al bacteriilor gram pozitive. Coloratia Gram. Tehnica si mecanismul de colorare. Importanta practica. Exemple de bacterii gram pozitive.

PC = invelis rigid ceinconjoara protoplastul; e constituit din PG.PG = mureina = heteropolimer macromolecular, format din 2 parti:

• Partea glicanica (PZ) = catene liniare paralele: NAG + NAM• Partea peptidica = peptide 4*aa (izoforme D si L) legate de NAM protectie de proteaze

G-: tetrapeptidele unite direct (bidimensional) G+: tetrapeptidele unite prin punti interpeptidice 5*Gly (tridimensional)Structuri prezente doar la procariote:

1. ac. diaminopimelic (tetrapeptid, la G+)2. izoforma D aa3. NAM

Fragmente solubile de mureina (PG) interactiune cu toll-likeR/CD14R de pe macrofage

secretie citokine soc septic!Rol PC:

1. Protectie de liza osmotica2. Forma3. Factor de patogenitate (soc septic)4. Protectie contra subst. toxice (AgO, E din spatiul periplasmatic)5. Tinta de atac a unor substante: Lizozim – scindare legaturi din catena glicanica (intre NAG si NAM) AB – inhibitie proces de transpeptidare

PC G+: Componente:

PG (tridimensional) 40-80% ac. teichoici (fixati de NAG), ac. lipoteichoici (fixati de MCt) = polimeri de ribitol,

glicerol-fosfat;o sarcina electrica negativao transfer de ionio fctie Ago activare complement pe cale alternativao stimulare secretie citokineo adeziune intercelulara

prot. asociate PCo Streptococcus pyogenes = prot. Mo Staphylococcus aureus = prot. A (clumping factor), prot. fixatoare de

fibronectina Uniform Grosime 80 nm

10. Peretele celular bacterian, functiile. Particularitatile de structura ale peretelui celular al bacteriilor gram negative. Coloratia Gram. Tehnica si mecanismul de colorare. Importanta practica. Exemple de bacterii gram negative.

PC G-: Componente:

4

PG (bidimensional) 1-10% MEx: existenta situsuri de comuniune intre MEx si MCt rol in transport

o Prot. majore: porine, receptori (pili, fagi)o Prot. minore: E de captare si transport a subst.

LP Braun = uneste Mex si PG stabilizare MEx LPZ (cel mai neobisnuit component) stabilizare MEx

o Lipid A – localizat in MEx; endotoxina (stimuleaza secretia citokinelor)o Miex PZ – transport unele subst.; AgR specificitate de geno Lant O (OZ) – sarcina negativa, impiedica fagocitoza; AgO specificitate

de specie N.B. Bct au capacitatea de a modifica structura AgO capacitate de a amagi apararea imuna

Neomogen Grosime 12 nm

Spatiul periplasmatic: E si prot. fixate de MCtRol e: hidroliza, sinteza PC, detoxifiere (ex. Beta-lactamaze)

Coloratia GRAM1. Violet de gentiana Ct violeta 2. Spalare cu apa, tratare cu sol. Lugol (iodin) formare complex insolubil violet-iodin

fixare colorant in celule3. Tratare cu alcool 95%

o eliminare colorant din bct G- pori mai mari in PG, continut mai mare de lipide (solubile in alcool), pH slab acid

o mentinere colorant in bct G+ pori mai mici, continut scazut de lipide alcoolul dehisrateaza peretele si reduce diametrul porilor

4. Recolorare cu fuxina apoasa Rezultat:G-: rosuG+: violet

Utilizarea coloratiei Gram:a. Diagnosticb. Sensibilitate la AB

Forme particulare, osmotic sensibile:• Protoplast = G+, fara PG• Sferoplast = G-, MCt+MEx, partial fara PG• Forme L = bct lipside de PC, din cauza AB, (i)reversibile

Mycoplasma – lipsite de PC, osmotic rezistente rezistenta marita MCt; forma pleiomorfa11. Particularitatile de structura si compo zitia chimica a peretelui celular al

bacteriilor acidorezistente. Coloratia Ziehl-Neelsen. Componentele, tehnica si mecanismul de colorare. Exemple de bacterii acidorezistente.

Coloratia Ziehl-Neelsen:1. Colorare cu fuxina fenicata + incalzire lama pina la aparitia vaporilor2. Spalare cu apa, tratare cu sol. ac. sulfuric 5%3. Spalare cu apa, recolorare cu albastru de metilen

Rezultat:Acidorezistente: rosuAcidonerezistente: albastru

12. Aparatul nuclear al bacteriilor. Compozitia chimica si functiile biologice. Metodele de evidentiere. Plasmidele bacteriene, tipurile si functiile lor.

Aparatul nuclear = nucleoid, ADN bicatenar circular – 1 crsADN bicatenar circular – 1 crsN.B. date recente ca V. cholerae contine > 1 crsN.B. date recente ca V. cholerae contine > 1 crsADN: pliat în bucle, ADN: pliat în bucle, stabilizat prin ARN şi proteine (diferite de histone). Fiecare bucl –ăstabilizat prin ARN şi proteine (diferite de histone). Fiecare bucl –ă hiperspiralizat sub ac iunea ADN-girazei şi topoizomerazei IV (se întâlnesc doar la bacterii). Peă ţhiperspiralizat sub ac iunea ADN-girazei şi topoizomerazei IV (se întâlnesc doar la bacterii). Peă ţ ADN sunt fixate enzime de sintez (ADN - , ARN – polimeraze).ăADN sunt fixate enzime de sintez (ADN - , ARN – polimeraze).ă

5

Metode speciale de colorMetode speciale de colorare (Feulgen): are (Feulgen): HCl….aldehida….react. Shiff….culoare rosie ???HCl….aldehida….react. Shiff….culoare rosie ???

Plasmide: elemente genetice (ADN) extracromozomiale, capabile de replicare autonom .ăelemente genetice (ADN) extracromozomiale, capabile de replicare autonom .ă Confer bacteriăConfer bacteriă eei caractere suplimentare. Se transmit celulelor-fiice la diviziunea bacteriei.i caractere suplimentare. Se transmit celulelor-fiice la diviziunea bacteriei. Plasmidele conjugative Plasmidele conjugative F F se transmit prin conjugare. se transmit prin conjugare. EpisomEpisom - plasmida integrat - plasmida integratăă îîn cromosomn cromosomTipuri de plasmide:Tipuri de plasmide:

F – factor de fertilitate, conjugativeF – factor de fertilitate, conjugative (sinteza pililor F) (sinteza pililor F)R – rezisten la antibioticeţăR – rezisten la antibioticeţăEnt – producerea enterotoxineiEnt – producerea enterotoxineiHly – producerea hemolizineiHly – producerea hemolizineiCol – producerea de bacteriocineCol – producerea de bacteriocine

Utilizarea practic : în tehnologii de ADN-recombinantăUtilizarea practic : în tehnologii de ADN-recombinantă

13.Sporii bacterieni. Compozitia chimica si functiile biologice. Etapele sporogenezei. Amplasarea sporului in celula. Exemple de specii patogene sporulate, de desenat. Metodele de evidentiere a sporilor.

Bacterii sporogeneBacterii sporogene, G+: Bacillus, Clostridium., G+: Bacillus, Clostridium.F. vegetativa = activa metabolicF. vegetativa = activa metabolicSpor:Spor:

Inactiv metabolicInactiv metabolic Con inut sc zut de ap liberţ ă ă ăCon inut sc zut de ap liberţ ă ă ă Con inut mare (pân la 10%) în dipicolinat de calciuţ ăCon inut mare (pân la 10%) în dipicolinat de calciuţ ă Rezistent la temperaturi şi pH extreme, desicare, radia ii, agen i chimici şi fiziciţ ţRezistent la temperaturi şi pH extreme, desicare, radia ii, agen i chimici şi fiziciţ ţ În condi ii favorabile sporul germineaz , dezvoltându-se forma vegetativ .ţ ă ăÎn condi ii favorabile sporul germineaz , dezvoltându-se forma vegetativ .ţ ă ă Forma sporului (sferic , oval ) şi pozi ia în celul (central , subterminal , terminal ) suntă ă ţ ă ă ă ăForma sporului (sferic , oval ) şi pozi ia în celul (central , subterminal , terminal ) suntă ă ţ ă ă ă ă

caractere utile în identificarea bacteriilor.caractere utile în identificarea bacteriilor.Pozitia sporului in celula:Pozitia sporului in celula:

•• centralcentral•• subterminalsubterminal•• terminalterminal•• terminal, cu deformarea celuleiterminal, cu deformarea celulei

Structura sporului:Structura sporului: exosporexospor tunica externa = straturi proteice tunica externa = straturi proteice rezistenta la subst. chimice (ex. apa oxigenata) rezistenta la subst. chimice (ex. apa oxigenata) tunica interna ???tunica interna ??? cortex = PG cortex = PG inlaturare osmotica a apei inlaturare osmotica a apei dehidratare dehidratare PC sporalPC sporal protoplast = nucleoid + ribosomi + E de reparare ADNprotoplast = nucleoid + ribosomi + E de reparare ADN

15% masa uscata spor = dipicolinat de Ca, localizat in protoplast 15% masa uscata spor = dipicolinat de Ca, localizat in protoplast stabilizare ADN stabilizare ADNADN asociat la DNA binding proteins ADN asociat la DNA binding proteins protectie contra temperaturii inalte, radiatiilor, desicatiei protectie contra temperaturii inalte, radiatiilor, desicatiei

Stadiile sporogenezeiStadiile sporogenezei (durata 36-72 ore); stimul – carenta alimetara (durata 36-72 ore); stimul – carenta alimetaraStadiul I – se formeaz filamentul axial, compus din ADNăStadiul I – se formeaz filamentul axial, compus din ADNăStadiul II – divizarea asimetric a citoplasmei printr-un sept, formarea ăStadiul II – divizarea asimetric a citoplasmei printr-un sept, formarea ă presporuluipresporului, care, care con iţcon iţ nne un filament de ADN. MCt înglobeaz presporul.ăe un filament de ADN. MCt înglobeaz presporul.ăStadiul III – înglobarea complet a presporului, care este limitat de 2 membraneăStadiul III – înglobarea complet a presporului, care este limitat de 2 membraneăStadiul IV – formarea Stadiul IV – formarea cortexuluicortexului de PG între cele 2 membrane de PG între cele 2 membraneStadiile V-VI – formarea Stadiile V-VI – formarea tunicii proteicetunicii proteice la exterior şi maturarea sporului. Uneori se formează la exterior şi maturarea sporului. Uneori se formează un înveliş extern suplimentar - exosporiuun înveliş extern suplimentar - exosporiuStadiul VII – sporul Stadiul VII – sporul matur matur este eliberat iar celula-mam se dezintegreaz ă ăeste eliberat iar celula-mam se dezintegreaz ă ă

Germinarea sporuluiI. activare (reversibil)II. germinatieIII. crestere

Eviden iereaţEviden iereaţ sporilor sporilor: colorarea dup AUJESZKYă: colorarea dup AUJESZKYă

6

14. Capsula bacteriilor. Compozitita chimica si functiile biologice. Metodele pozitive si negative de colorare a capsulei. Exemple de bacterii capsulate, de desenat.

Capsula formata din polimeri organici sintetizati in mediul natural de existenta al bct.Se disting: Se disting:

• CapsCapsula adev rată ăula adev rată ă (peste 0,2 (peste 0,2µµm), vizibil la microscopul opticăm), vizibil la microscopul optică• MicrocapsulaMicrocapsula, detectat la microscopul electronică, detectat la microscopul electronică• Capsula flexibilăCapsula flexibilă (slime, glicocalix), o re ea lax de fibre poliţ ă (slime, glicocalix), o re ea lax de fibre poliţ ă zzaharidice, care difuzeaz înăaharidice, care difuzeaz înă

mediu. Nu se eviden iaz microscopicţ ămediu. Nu se eviden iaz microscopicţ ă . A. Asigur formarea biofilmelor bacteriene – ansambluăsigur formarea biofilmelor bacteriene – ansambluă structurat de celule bacteriene înglobate întro matrice de polimeri de origine bacterian ,ăstructurat de celule bacteriene înglobate întro matrice de polimeri de origine bacterian ,ă care poate adera la suprafe e inerte (ex.: cateter, stimulator cardiac, endoproteze, sondeţcare poate adera la suprafe e inerte (ex.: cateter, stimulator cardiac, endoproteze, sondeţ de intubare, etc) sau esuturi vii. ţde intubare, etc) sau esuturi vii. ţ

Compozi ia chimicţ ăCompozi ia chimicţ ă: ap şi substan e organice (poliă ţ: ap şi substan e organice (poliă ţ zzaharide, mucopolizaharide, peptide) aharide, mucopolizaharide, peptide) • Bacillus anthracis – Bacillus anthracis – acid glutamicacid glutamic• Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae – Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae – PZPZ• Streptococcus pyogenes – Streptococcus pyogenes – acid hialuronicacid hialuronic

Func iile capsuleiţFunc iile capsuleiţ : : 1. Impiedic desicarea bacteriei ([apa] marita)ăImpiedic desicarea bacteriei ([apa] marita)ă2. Barier de permeabilitate pentru substan e toxice (ă ţBarier de permeabilitate pentru substan e toxice (ă ţ antibioticeantibiotice, ioni metalici), ioni metalici)3.3. Barier protectoare fa a de factori antiinfec ioşi (complement, fagocite), bacteriofagi,ă ţ ţBarier protectoare fa a de factori antiinfec ioşi (complement, fagocite), bacteriofagi,ă ţ ţ

protozoareprotozoare4.4. Rezerv nutritivă ăRezerv nutritivă ă5. Aderarea bacteriei la substraAderarea bacteriei la substrat – esuturi sau suporturi inerteţt – esuturi sau suporturi inerteţ6. Specificitate Ag de specie sau tip (Specificitate Ag de specie sau tip (Ag KAg K))

S. pneumonia: patogenitate marita in prezenta capsuleiS. pneumonia: patogenitate marita in prezenta capsuleiEviden ierea capsuleiţEviden ierea capsuleiţColoraţColoraţia Burri-Hinss – ia Burri-Hinss – coloratie negativăcoloratie negativă

Pe lam se amestec suspensia bacterian cu tuş de China, se etaleaz , se usucă ă ă ă ăPe lam se amestec suspensia bacterian cu tuş de China, se etaleaz , se usucă ă ă ă ă Frotiul se fixeaz cu alcoolă Frotiul se fixeaz cu alcoolăSe coloreaz frotiul cu fucsină ăSe coloreaz frotiul cu fucsină ă apoas apoasăăRezultatulRezultatul: capsula apare ca un halou incolor pe fondul negru. Citoplasma : capsula apare ca un halou incolor pe fondul negru. Citoplasma bacteriilor bacteriilor sese coloreaz în roşu.ăcoloreaz în roşu.ă

Colora ia Romanovski – Giemsa (capsula se coloreaz în roz) – ţ ăColora ia Romanovski – Giemsa (capsula se coloreaz în roz) – ţ ă colora ie pozitivţ ăcolora ie pozitivţ ă

15. Flagelii. Structura si compozitia chimica. Clasificarea bacteriilor dupa amplasarea si numarul flagelilor. Metodele directe de studiere si evidentiere a flagelilor. Coloratia Loeffler. Pilii bacterieni, tipurile.

Flageli = Flageli = structuri filamentoase proteice.structuri filamentoase proteice.Rol:Rol:

1.1. mobilitatemobilitate2.2. Ag HAg H

Tipurile de bacterii dup dispozi ia flageliloră ţTipurile de bacterii dup dispozi ia flageliloră ţ monotrichemonotriche (Pseudomonas) (Pseudomonas) lofotrichelofotriche = un m nunchi de flageli la o extremitate (Spirillum)ă = un m nunchi de flageli la o extremitate (Spirillum)ă amfitricheamfitriche = câte = câte un flagel sau un flagel sau un m nunchi ăun m nunchi ă de flageli de flageli la fiecare extremitatela fiecare extremitate peritricheperitriche = flageli pe toat suprafa a celulei (Proteus vulgaris)ă ţ = flageli pe toat suprafa a celulei (Proteus vulgaris)ă ţ

La spirochete flagelii se plaseaz în spa iul periplasmic – flageli interni, periplasmatici.ă ţLa spirochete flagelii se plaseaz în spa iul periplasmic – flageli interni, periplasmatici.ă ţStructura flagelStructura flagel

1. filament = helicoidal, alcatuit din flagelina2. cirlig de articulatie3. corp bazal

G+ inel intern (MCt) inel extern (PG)

G-

7

disc M (Mct) disc S (spatiu periplasmatic) disc P (PG) disc LPZ (MEx)

Sinteza flagel = proprietate de autoasamblareRotire flagel E. coli = 270/sMotilitatea e determinate de chemotaxis. Bct nu allege directia de miscare, cid oar determina daca trebuie sau nu sa continuie miscarea in aceeasi directie.Evidentierea flagelilor:

microscopie electronic coloratie Loeffler (mordansarea cu tanin , s ruri de aluminiu, fer, apoi colorarea cuă ă(mordansarea cu tanin , s ruri de aluminiu, fer, apoi colorarea cuă ă

fucsin sau albastru de metilen)ăfucsin sau albastru de metilen)ăPilii comuni (fimbriile)Pilii comuni (fimbriile) – – elemente proteice fine, rigide, scurte, pe bct G-. elemente proteice fine, rigide, scurte, pe bct G-.Structura: prot. pilina, fixate de MEx. Num rul fimbriilor per celulă ăStructura: prot. pilina, fixate de MEx. Num rul fimbriilor per celulă ă:: sute. sute.Rol pili:Rol pili:

1.1. adeziunea bacteriilor la suprafe e inerte, la celule sau alte bacteriiţadeziunea bacteriilor la suprafe e inerte, la celule sau alte bacteriiţ2.2. Ag FAg F

PilPili conjugativii conjugativi – structuri capiliforme de natur proteic , prezen i în num r de 1-10 per celulă ă ţ ă ă – structuri capiliforme de natur proteic , prezen i în num r de 1-10 per celulă ă ţ ă ă (codificati de plasmide conjugative F).(codificati de plasmide conjugative F).Rol pili conjugativi:Rol pili conjugativi:

1. transferutransferul de ADN prin conjugarel de ADN prin conjugare2.2. R pentru unii bacteriofagiR pentru unii bacteriofagi

Eviden ierea pililorţEviden ierea pililorţ : microscopia electronică: microscopia electronică

16.Metodele indirecte de studiere a mobilitatii bacteriilor. Pregatirea preparatelor native. Metodele de examinare. Principiul microscopiei cu fond negru si cont rast de faza.

Studierea preparatelor native “pic tur suspendat ” sau “între lam şi lamel ” (microscopia cuă ă ă ă ăStudierea preparatelor native “pic tur suspendat ” sau “între lam şi lamel ” (microscopia cuă ă ă ă ă contrast de faz sau pe fond negru)ăcontrast de faz sau pe fond negru)ă ..Îns mân area ă ţÎns mân area ă ţ culturii bacteriene culturii bacteriene înîn medii semisolide (medii semisolide (se observse observăă turbiditate) .turbiditate) .Creşterea Creşterea culturii culturii “în v l” pe suprafa a mediului solid.ă ţ“în v l” pe suprafa a mediului solid.ă ţ

17.Granulatiile de volutina. Compozitia chimica si functiile biologice. Metodele de evidentiere. Coloratia Loeffler si Neisser. Mecanismul si tehnica de colorare. Exemple de bacterii cu granulatii de volutina. Importanta practica.

Tipuri de incluziuni Ct: glicogen sau PHB (poli-beta-hidroxibutirat) vacuole de gaz plutire (ex. cianobacterii) magnetosomi = incluziuni de Fe sub forma de magnetit --. orientare in cimpul magnetic

al pamintului granule de volutina (polimetafosfat) = granule metacromatice

La tratarea cu unii coloran i bazici granulele de volutin se coloreaz în alt culoare, de ex. înţ ă ă ăLa tratarea cu unii coloran i bazici granulele de volutin se coloreaz în alt culoare, de ex. înţ ă ă ă roşu-violet roşu-violet la colorarea la colorarea cu albastru de metilen – fenomenul metacromaziei.cu albastru de metilen – fenomenul metacromaziei.Rol granule de volutina:

1. rezerva energetic2. sursa de fosfati sinteza AN3. scadere presiune osmotic

Interesul medicalInteresul medical: la agen: la agentultul difteriei, difteriei, Corynebacterium diphtheriae,Corynebacterium diphtheriae, granulele de volutin seă granulele de volutin seă localizeaz la extremit ile celulei, iar la corynebacterii nepatogene sunt repartizate ă ăţlocalizeaz la extremit ile celulei, iar la corynebacterii nepatogene sunt repartizate ă ăţ neuniformneuniform în citoplasm .ăîn citoplasm .ăEviden iereaţEviden iereaţ : metoda Loeffler, metoda Neisser: metoda Loeffler, metoda Neisser

18. Morfologia si ultrastructura spirochetelor. Clasificarea. Metodele de studiere. Speciile patogene si diferen ierea lor.ţ

19. Morfologia si ultrastructura micoplasmelor si chlamidiilor. Metodele de studiere. Speciile patogene.

8

20. Notiuni de sterilizare, obiect steril si nesteril. Sterilizarea cu vapori fluizi si sub presiune. Obiectele si regimurile sterilizarii. Controlul eficien eiţ steriliz rii.ă

21. Notiuni de sterilizare, obiect steril si nesteril. Sterilizarea cu aer fierbinte. Obiectele si regimurile sterilizarii. Controlul eficien ei steriliz rii.ţ ă

22.Notiuni de sterilizare, aseptica si antiseptica. Metoda mecanic de sterilizare.ă Aplicarea practica. Tipurile de filtre. Conservantii.

23.Metabolismul microbian. Particularit ile. Enzimele bacteriene. Clasificarea,ăţ rolul in fiziologia microbian . Aplicarea practic in microbiologieă ă .

Metabolismul bacterian = ansamblu de reac ii biochimice care au loc în celula vie, format dinţ cata- si ana- bolism.Particularit ile metabolismului bacterianăţ :

1. metabolism unicelular, necompartimentat (toate procesele metabolice intr-o singură celul )ă

2. foarte flexibil, diverse c i metabolice (adaptare rapida la condi iile mediului)ă ţ3. foarte intens (viteza reac iilor este mare)ţ4. produsele intermediare din procesele catabolice pot fi utilizate direct în calitate de

precursori pentru reacţiile anabolice (amfibolism) 5. prezenta catalizatori proteici specifici – enzime

Caracter special al E bct: active în limite largi de temperaturi (0-65°C) şi de pH (2-9) Clasificare E:

Constitutive, permanente Inductive, adaptive, se sintetizeaz în prezen a substratului (ex.: lactaza)ă ţ Represive, sinteza lor este inhibat de acumularea în exces a proă dusului reac ieiţ

catalizateDup locul de ac iuneă ţ (exoenzime, endoenzime)Dup tipul reac iei catalizată ţ e (oxido-reductaze, hidrolaze, transferaze, liaze, izomeraze, ligaze)Dup impactul asupra ma/oă

Enzime metabolice Enzime de patogenitate (hialuronidaza, colagenaza, plasmocoagulaza, hemolizina,

fibrinolizina, lecitinaza)

Importan a practic a studierii eţ ă nzimelor1. Identificarea şi clasificarea bacteriilor (enzimele determin activitatea biochimică ă

specific a bacteriilor)ă2. Substrat pt unele AB3. Determinarea mecanismelor patogenezei infec iilor (unele enzime sunt responsabile deţ

producerea leziunilor în esutul gazdei)ţ4. Aplicarea industrial a enzimelor ă

24. Nutri ia bacteriilor. Tipul nutri iei si mecanismele transportului nutrien ilor inţ ţ ţ celula bacterian . Clasificarea m/o dupa sursele de carbon. Notiune de m/oă saprofite si parazite.

Nutri iaţ – modalit ile prin care bacteriile asimileaz din mediu substan ele necesare pentruăţ ă ţ metabolism. Modul (tipul) de nutri ie = ţ absorbtiv. Nutritii se obtin prin solvire (s ruri minerale, COă 2, O2) sau dup o ă digestie prealabil (proteine,ă polizaharide, lipide).Digestia:

G+ extracelular ă G- în spa iul periplasmicţ

Transportul transmembranar 1. Difuzie simplă: O2, CO2, AG, nutrien i liposolubiliţ2. Difuzie facilitat (permeaze)ă : molecule mari

9

3. Transport activ (proteine de transport specifice = ABCtransportori)4. Transloca ieţ – substratul este modificat (ex.: fosforilat) în timpul transportului membranar; necesit energie. ex. PEP + glucid ă piruvat + glucid-P5. transport Fe = secretie siderofori

N.B. G-: necesitate traversare prealabila a MEx MEx contine prot. de transport specfice (OmpE, prot. speciale pt vit. B12)Excre ia metaboli ilor – difuzie, proteine de transport, liza bacterieiţ ţ

Necesit ile nutritive ale bacteriilorăţ• Necesit i elementareăţ , de baz : C, H, O, N în cantit i importante, S, P, Fe, Ca, Mg, K înă ăţ

cantit i mici şi urme de Co, Cu, Zn, Moăţ• Necesit i specificeăţ :

bct prototrofe = capabile a-şi realiza integral sinteza metaboli ilor esen ialiţ ţ bct auxotrofe - solicit suplimentar compuşi organici preforma iă ţ (factori de

creştere), care nu pot fi sintetiza i de ţ bacterie (ex.: AA, baze purinice, pirimidinice, vitamine). Prezen a lor în mediul de cultur este indispensabil creşterii acestorţ ă ă bacterii.

Clasificarea bacteriilor dup sursa de carbonăBacterii autotrofe – utilizeaz COă 2 ca unic surs de carbon (nepatogene)ă ăBacterii heterotrofe – utilizeaz carbonul din compuşii organici (glucide, acizi graşi, alcooli,ă etc)

Bacteriile care utilizeaz materia organic moă ă art ă sunt saprofite (reciclarea materiei organice)Bacteriile parazite (obligate, facultative) tr iesc pe contul organismelor vii, aducându-leă prejudiciiBacteriile patogene reprezint parazită e care afecteaz grav gazda, provocând maladie sauă moarte.

Surse de azot AA sau acizi nucleiciS ruri de amoniu, nitri i, azot atmosferică ţ

Surse de substan e mineralţ e: S - din AA, sulfuri, sulfa i; ţP - din fosfa iţ ;K, Mg, Ca, Na - din s ruri minerale; ăZn, Cu, Mn, Mo – din apă

25. Clasificarea m/o dupa sursele de energie. Mecanismele de obtinere a energiei la bacteriile chemoorganotrofe. Clasificarea m/o dupa tipul de respiratie. Exemple.

Clasificarea bacteriilor dup sursa de energieă fototrofe – utilizeaz energia solar (fotosint)ă ă chemotrofe – folosesc energia degajat din reac iile chimice de oxido-reducere. Eleă ţ

necesit un substrat ă donor de hidrogen (e- şi H+) şi un substrat acceptor de hidrogen.• chemolitotrofe – donorul de H = substan anorganicţă ă• chemoorganotrofe – donorul de H = substan organic (glucoza, lipide...)ţă ă

Bacteriile patogene sunt chemoorganotrofeMecanismele de ob inere a energieiţ la chemoorganotrofe în func ie de acceptorul final de H : ţ

Respira ie aerobţ ă. Acceptorul final este oxigenul gazos. Implic lan ul respirator deă ţ transport al electronilor asociat MCt. Produs final – H2O sau H2O2 .

Respira ie anaerobţ ă. Acceptori finali – compuşi anorganici (nitrat, sulfat, S). Transportul de electroni prin lan ul respirator. Produse finale – nitritul, amoniacul,ţ sulfura (în prezenţa O – H2O2).

Fermenta ieţ . Substratul organic este metabolizat f r interven ia unui agent oxidantă ă ţ extern. Const în procese de ox-red care realizeaz numai o oxidare par ial aă ă ţ ă substratului, donorul şi acceptorul de H+ fiind substan e organice. Astfel se ajunge deţ la un substrat mai redus la o molecul mai oxidat (ex.: fermentare lactic ,ă ă ă

10

fermentare alcoolic , acid mixt , acetoinic , etc). Fermenta ia se poate desf şura înă ă ă ă ţ ă prezen a O2, dar f r interven ia acestuia.ţ ă ă ţ

Clasificarea bacteriilor dup sursele de energie şi carbonă :Bacterii fotoautotrofe (energie solar , COă 2)Bacterii fotoheterotrofe (en. sol., subst.org) Bacterii chemoautotrofe Bacterii chemoheterotrofe (chemolitoheterotrofe, chemoorganoheterotrofe)

26. Cresterea si multiplicarea bacteriilor. Fazele multiplicarii culturilor periodice (discontinue) de bacterii. Cultivarea bacteriilor si conditiile (principiile) necesare pentru cultivare.

Creşterea – m rirea coordonat a masei şi volumului structurilor bacteriene ca rezultat ală ă proceselor de sintez .ăMultiplicarea – creşterea num rului de celule pe o unitate de suprafa sau de volum.ă ţă

Diviziune binară Înmugurire (levuri, ciuperci levuriforme) Autoreproducere (virusuri) Spori (micete) Fragmentare (actinomicete)

Ciclul celular – procesele care au loc de la formarea celulei pâna la următoarea diviziune.Faza C – replicarea ADNFaza G – de laten , segregarea cromozomilorţăFaza D – de diviziune, formarea septului

Replicarea ADN depinde de masa critic a celulei, iar separarea cromozomilor şi diviziuneaă intervin în momentul când celula atinge o lungime – limit .ă

Perioada dintre 2 diviziuni reprezintă timpul (perioada) de genera ieţ (TG). Durata TG depinde de specie şi de condi iile de creştere (condi ii optime ţ ţ vitez maxim ).ă ăCreşterea bacteriilor în laborator – cultivare izolareRolul izolarii bct:

1. Identificarea mi/o (scop de diagnostic) 2. Testatea sensibilit ii lor fa de ABăţ ţă3. Ob inere ţ produşi de biosintez (AB, aa), bioconversie (hormoni steroizi), fermentareă

(alcooli, acizi organici, etc), producerea vaccinurilor, probioticelor...

Pentru creştere bacteriile au nevoie de nutrien i şi condi ii fizico-chimice adecvate. ţ ţCondi iile (principiiţ le) de cultivare:

1. Surs nutritiv adecvată ă ă2. Surs de energieă3. Apă4. Temperatura potrivită5. pH adecvat6. Concentra ie optim a oxigenului şi a ţ ă CO2 7. Presiune osmotic adecvată ă

Temperatura de creştereExist temperaturi minime, maxime şi optime de dezvoltare a bacteriilor. În raport cuă temperatura optim deosebim:ă

psichrofile – tº optim 10-20ă º C. Cresc şi la 0º C. mezofile – optimum 30-37º C (limite 15-45º C) termofile – optimum 50-60º C (pân la 95ă º C) hipertermofile (cresc la 70–110º C)

pH neutrofile (majoritatea, inclusiv cele patogene) – pH 6-7,5 acidofile – pH 2-6 (Lactobacillus) alcalofile – pH >8 (Pseudomonas, Vibrio)

Presiunea osmotică

11

halotolerante (osmotolerante) – cresc în concentra ii reduse de NaCl (mediu izotonicţ cu mediul intern al gazdei) – mi/o patogene

halofile – prefer concentra ii mari de NaCl (1-30%) – stafilococi, vibrioni (ă ţ Vibrio parahaemolyticus)

Oxigenul strict aerobe – cresc doar în prezen a Oţ 2. Ob in energia prin respira ie aerob ţ ţ ă microaerofile – necesit concentra ii reduse de Oă ţ 2 şi 2-10% CO2. Ob in energia prinţ

respira ie sau fermenta ie. ţ ţ Neisseria, Brucella, Campylobacter strict anaerobe – cresc doar în absen a Oţ 2. Ob in energia prin fermenta ie sau uneoriţ ţ

respira ie anaerob . Absen a catalazei, superoxid dismutazei, peroxidazei.ţ ă ţ Clostridium, Bacteroides

anaerobe aerotolerante – pot creşte în prezen a Oţ 2, ob in energia prin fermenta ie,ţ ţ posed peroxidaz ă ă Lactobacillus, streptococi

facultativ anaerobe – cresc în orice condi ii, ob in energia prin respira ie sauţ ţ ţ fermenta ie ţ

27.Mediile de cultura. Principiile de clasificare. Mediile uzuale. Componenta.

Destinatia lor. Manifestarea cresterii bacteriilor in medii lichide si solide. MC = solu ii/substrate solide, asigur nutrien ii şi condi iile fizico-chimice pt cultivarea bct. ţ ă ţ ţPot fi utilizate pt:

1. cultivarea (izolarea) bacteriilor2. testarea sensibilit ii la ăţ AB3. stocarea sau transportul culturilor bacreiene.

Cerin ele fa de ţ ţă MC:a. necesit ile nutritive şi energeticeăţ bctb. umiditate optimalăc. pH optimal (7,2-7,4) şi constant (caracter de tampon) d. poten ial de oxido-reducere optimal (anaerobi -ţ rH2<5, aerobi – rH2>10)e. izotonic (0,5% NaCl)f. steril şi transparent

Clasificarea MC: Dup provenienă ţă

• Empirice, naturale. Au la baz produse de origine animal sau vegetal (sânge, ser,ă ă ă lapte, ou , cartof, extracte din carne, cord, creier, ficat, peşte, levuri, etc)ă . Compozi iaţ chimic precis nu poate fi controlat .ă ă ă

• Sintetice – includ ingrediente chimice pure, compozi ia chimic este cunoscut cuţ ă ă exactitate

• Semisintetice Dup consistenă ţă

• Lichide (bulion)– utilizate pentru ob inerea biomasei bacterieneţ şi a produselor lor (AB, E, toxine)

• Solide – con in 10-15% gelatin sau 2-3% agar-agar (polizaharid extras din alge roşii,ţ ă t° topire – 80-100°C, solidificare – 42°C). Placa de geloz în cutii Petri ă izolarea culturilor pure; geloza înclinat (în pant ) ă ă acumularea culturilor pure.

• Semisolide – 0,2 – 0,5 % agar-agar. Se utilizeaz pentru ă studierea activit ii biochimiceăţ sau a mobilit ii bacteriilor.ăţ

Dup compozi ia chimic ă ţ ă (complexitate) şi destina ieţ• Medii uzuale (universale, simple)

Ap peptonată ă (ap +1% pepton +0,5% NaCl)ă ă Bulion peptonat – BP (extract apos din carne + 1% pepton +0,5% NaCl)ă Geloza nutritiv ă (BP + 2-3% agar-agar) Gelatina nutritivă (BP + 10-15% gelatin )ă

Sunt utilizate pentru creşterea bacteriilor nepreten ioase la cultivareţSterilizarea prin autoclavare: 120°C, 20 min

• Medii complexe:

12

elective selective:

pe mediu solid pe mediu lichid = mediu de imbogatire

diferential-diagnostice (DD) izolare cultura pura multitest, pt acumulare cultura pura si identificare preliminara identificare finala

speciale de transport

Medii elective – formate din medii simple cu adaos de componente care permit creşterea mi/o exigente nutritiv (bulion-ser, bulion glucozat, geloz -sânge – ă streptococi, neisserii; ser coagulat – corinebacterii, etc)Medii selective – medii solide cu adaos de componente sau cu condi ii fizico-chimiceţ particulare care stimuleaz creşterea unor specii şi inhib creşterea altor speciiă ă (geloza salin -ă stafilococi, geloza alcalin - ă vibrioni, mediul Ploskirev - Salmonella, Shigella, etc) Mediile de îmbog ireăţ reprezint medii selective lichide, utilizate pentru îmbog irea floreiă ăţ patogene şi inhibarea florei de asocia ie dintr-un prelevat plurimicrobian (ex: materii fecale)ţ

a. Mediul Muller (BP+Lugol+CaCO3+hiposulfit)b. Mediul Kauffmann (mediul Muller+bil +verde de briliant) – ă Salmonellac. Bulion cu selenit – Shigella, Salmonellad. Ap peptonat alcalin (pHă ă ă =8) –Vibrio choleraee. Kitt-Tarrozzi (BP+0,5% glucoz +buc i de ficat) – ă ăţ pentru anaerobi

Medii diferen ial-diagnostice (DD)ţ – permit diferen ierea speciilor bacteriene în bazaţ activit ii lor biochimiceăţ (zaharolitice, proteolitice, lipolitice, de oxido-reducere…)Sunt construite dup urm toarea schem : Baz nutritiv +substrat+indicator (la necesitate)ă ă ă ă ăMedii DD pentru izolarea culturii pure

Studierea propriet ilor ăţ zaharolitice Endo (geloz +lactoz +fucsin +hiposulfită ă ă de Na)Levin (geloz +lactoz +eozin +albastru metilen)ă ă ăPloskirev (geloz +lactoz +roşu neutru+s ruri de acizi biliari+verde de briliant)ă ă ăColoniile lactozo-pozitive vor fi colorate (roşii pe Endo, Ploskirev, albastru-violete pe Levin)

Studierea propriet ilor de oxido-reducereăţ Mediul cu sulfit de Bi – pentru Salmonella (colonii negre – reducerea sulfitului în sulfura de Bi)Mediul Klauberg (geloz -sânge cu telurit de K) –pentru ă Corynebacterium diphtheriae

Studierea propriet ilor lipoliticeăţ Geloza cu g lbenuş de ou – bacteriile cu lecitinaz formeaz un halou opac ă ă ă în jurul coloniei

Studierea propriet ilor hemoliticeăţ Geloza-sânge (geloza+5-15% sânge defibrinat) – in cazul hemolizei în jurul coloniilor apare o zon clară ăMedii DD multitest pentru acumularea culturii pure şi identificare preliminar ăRussel –geloz +1% lactoz , 0,1% glucoz , indicatoră ă ăKligler – identic Russel+sulfat de Fe (detectarea H2S)Olkeni ki – identic Kligler+1% zaharoz +ureeţ ăIndicatorul Andrede – fucsin +NaOH ă

Scindarea glucidelor (acid - A, acid şi gaz - AG) duce la modificarea pH şi virajul culorii mediului din roşu în galben. În pant ă se apreciaz lactoza/zaharoză a (oxidare), în coloan -glucoza (fermentare).ă

Producerea H2S – înnegrirea mediului Medii DD pentru identificarea finalăŞirul pestri Hiss (lichid sau semisolid): tuburi ce con in solu ii 0,5% de diferite glucide şiţ ţ ţ indicator. Aprecierea – dup modificarea culorii (acid - A) şi apari ia bulelor de gaz (acid şi gaz -ă ţ AG)Medii cu AA (lizin , arginin , ornitin ) şi indicatoriă ă ăMedii speciale – pentru izolarea unor anumite bacterii (Finn, Popescu, Lowenstein-Jensen –pentru agen ii tuberculozeiţ , Sabouraud – fungi)

13

Medii de transport – transportare/stocare material (prelevat). Men ine în via bacteriile, fţ ţă ără a favoriza multiplicarea lor.Mediul cu glicerin 30%ăSolu ie tampon-fosfatţSolu ie NaCl 3%ţMediul Cary-BlairMediul Stuart (NaCl, 0,5% agar, tioglicolat de Na, albastru de metilen) – pentru anaerobi, neisserii, etc

Pentru cultivarea bacteriilor o cantitate mic de material ce con ine bacterii (ă ţ inoculum) se întroduce într-un mediu de cultur (ă îns mân are, inoculareă ţ ), care ulterior va fi incubat în termostat (pentru asigurarea temperaturii optime). În timpul incub rii (18-24-48 oreă …..) bacteriile cresc şi se divid, formând o cultur bacteriană ă (totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicare intr-un mediu). M.tuberculosis – 3-5 s pt mâniă ăV.cholerae – 6-12 ore

Cultur pură ă – format din bacterii de aceeaşi specie (indispensabil identific rii)ă ă ăCultur mixtă ă – compus din bacterii de specii diferiteăTulpină – popula ie microbian constituit din descenden ii unei singure izol ri în cultur pur ,ţ ă ă ţ ă ă ă care va fi studiat ulterior.ă Clon ă – popula ie care rezult din multiplicarea unei singure celuleţ ă

Manifestarea creşterii şi multiplic rii bacteriilor ă• În mediu lichid

Turbiditate uniformăFormarea unei pelicule la suprafa a mediului (vibrioni, yersinia - agentul pestei)ţFormarea unui sediment la fundul tubului sau pe pere i (streptococi, ţ Bacillus anthracis)

• În mediu solid – formarea coloniilor

Colonie – o aglomerare de bacterii care se dezvolt dintr-o singur celul sau un grup de celuleă ă ă (UFC - unitate formatoare de colonii) pe suprafa a unui mediu solidţ . Fiecare specie bacteriană formeaz colonii specifice (caracter util în identificare).ăCaracteristica coloniilor

a. Dimensiuni – colonii mici (0,1-1mm), medii (1-2mm), mari (2-3mm)b. Contur (margini) – neted, ondulat, zim at, lobat, etcţc. Suprafa – plat , bombat , convex , ombilicat , etcţă ă ă ă ăd. Form – punctiform , circular , filamentoas , neregulată ă ă ă ăe. Culoare (pigmenta ie) – alb , galben , aurie, etcţ ă ăf. Densitate – opac , transparent , etcă ăg. Consisten – cremoas , untoas , uscat , mucoidţă ă ă ă ă

Tipurile de colonii Colonii S (smouth) – rotunde, netede, umede, lucioase Colonii R (rough) – margini neregulate, suprafa a uscat , rugoasţ ă ă

Caracterele de cultur aleă bacteriilor = exigen ele nutritive (medii, temperatur , pH, aerare,ţ ă etc), viteza şi manifestarea creşterii pe medii lichide şi solide

Dinamica multiplic rii bacteriilor în culturiăÎn func ie de modul de dezvoltare a culturilor bacteriene se disting:ţ

Culturi discontinue Culturi continue Culturi sincrone

Culturile discontinue se ob in la cultivarea bacteriilor în volum limitat de mediu. Astfel de culturiţ sunt ob inute şi utilizate în laboratorul microbiologicţFazele dezvolt rii unei culturi discontinueă

14

I. Faza de lag – faza de adaptare la condi iile mediului, bacteriile sunt active metabolic, cresc înţ dimensiuni, dar nu se divid. Durata este variabil (2-4 ore); depinde de starea bacteriei,ă condi iile mediului, etcţII. Faza logaritmică – bacteriile cresc şi se divid cu vitez maximal constant , curba evoluează ă ă ă exponen ial. Bacteriile sunt foarte sensibile la agen i antimicrobieni (ţ ţ culturi utile pentru testarea sensibilit ii la antibioticeăţ ). Durata – 8-10 ore.III. Faza sta ionarţ ă – rata celulelor care se multiplic scade treptat, num rul celulelor vii r mâneă ă ă constant mai multe ore. Cauza – consumarea nutrien ilor, acumularea metaboli ilor toxici.ţ ţ Morfologia bacteriilor este tipic speciei, apar incluziuni, spori (ă culturi utile pentru identificare). Sensibilitatea la agen iţ i antimicrobieni scade. Durata – 10-12 ore.IV. Faza de declin (letalitate) – bacteriile mor progresiv. Cultura continuă – se realizeaz când mediul de cultur este continuu reînnoit şi îmbog it cuă ă ăţ oxigen cu evacuarea unei cantit i de cultur . Se realizeaz în ăţ ă ă chemostate sau turbidostate, cultura aflându-se permanent în faza exponen ialţ ă. Se utilizeaz în microbiologia industrial . Înă ă intestin – culturi continue.Culturi sincrone – culturi în care bacteriile se divid în acelaşi timp. ???

28.Metoda bacteriologic in diagnosticul bolilor infec ioase. ă ţ Scopul. Prelevate de la pacien i si din mediul ambiant. Principiile de recoltare, ambalare siţ transportare in laborator. Pregatirea probelor pentru investigatiile de laborator.

29.Examenul bacterio logic. Etapele de izolare a culturilor pure de bacterii aerobe. Volumul de lucru la fiecare etapa. Principiile de identificare a culturii pure.

Examenul bacteriologic = inocularea prelevatel pe MC izolare cultura pura identificare, testare sensibilitate la AB, eventual conservare.Etape examen bacteriologic:

1. Faza pre-analitică (responsabilitatea medicului)Prescrierea investiga iei (în func ie de datele examenului clinic şi paraclinic). În ordonan seţ ţ ţă fixeaz identitatea medicului, a pacientului, scopul analizei, manifest rile patologice, locul, dataă ă apari iei, alte date: imunosupresie, ţ tratament cu antibiotice, graviditate, etc.

2. Prelevarea probelor Alegerea prelevatului (de la poarta de intrare, locul multiplic rii sau/şi din c ile de eliminare aă ă agentului patogen)Modul de prelevare (recoltare) :

În recipiente sterile Respectând regulile de autoprotec ieţ La debutul bolii Pân la administrarea antibioticeloră

3. Transportarea Imediat sau utilizând medii de transport, cu ă respectarea condi iilor speciale dupţ ă

necesitate În ambalaj special (cutii metalice, pungi din plastic...)

În fişa de înso ire s fie indicat identitatea pacientului, vârsta, sexul, natura prelevatului, data,ţ ă ă ora prelev rii, scopul investiga iei)ă ţMateriale de examinat (prelevate) de la pacien iţ :

Secre ii rino-faringieneţ Spută Puroi Exudate Sânge LCR Urină Mase fecale Bioptate Material cadaveric

15

Materiale de examinat din mediul extern: Apă Alimente Sol Aer Lavaje Vectori, etc

EXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU CULTURILE AEROBEPrelevatul este supus examenului macroscopic (modificarea aspectului, a mirosului, etc) - orientare în diagnostic Dup necesitate, probele sunt supuse preg tirii pentru investiga ie (diluare, omogenizare,ă ă ţ centrifugare, etc)Examinarea microscopică (preparate native, Gram, Ziehl-Neelsen, Burri-Hinss...) – prezen aţ mi/o, forma, cantitatea, G+/-.

I etapă – IZOLAREA CULTURILOR PURE Scopul izol riiă - de a obţine o cultură pură dintr-un melanj de celule bacteriene sau dintr-un produs patologic. Tehnici utilizate:

o Prin epuizarea inoculului pe suprafa a gelozei din cutia Petri (îns mân are în striuriţ ă ţ paralele, îns mân are în cadrane, etalarea consecutiv pe trei cutii).ă ţ ă

o Metoda dilu iilor logaritmice a inoculului în geloz topit şi r cit la 50º C (10ţ ă ă ă ă -1, 10-2,...), apoi turnate în cutii Petri sau eprubete.

Incubare în termostat la 37º C, 18-24 h (în func ie de Tţ G).Metode speciale de izolare în culturi pure:bct sporulate: înc lzirea prealabil a prelevatului 80ă ă º C – 20 minbct acido-rezistente: tratarea prealabil cu acid a prelevatului şi neutralizarea ulterioar cu oă ă bazăbct din asocia ii cu num r minim de mi/o patogene: îmbog irea prealabil a florei patogeneţ ă ăţ ă utilizând medii de îmbog ireăţbct cu virulen înalt şi preten ioase la cultivare: inocularea ţă ă ţ la animalele de laborator sensibile II etapă – ACUMULAREA CULTURII PUREExaminarea macroscopic a coloniilor crescute (form , culoare, dimensiuni, etc)ă ăExaminarea microscopic (frotiu Gram) a coloniilor suspecte ă confirmarea purit ii culturiiăţRepicarea coloniilor suspecte pe geloz în pant ă ă acumularea culturii pureTermostat, 37º C, 18-24 oreIII etapă – IDENTIFICAREA CULTURII PUREVerificarea purit ii culturii (frotiu Gram)ăţIdentificarea culturii pure const în eviden ierea unor caractere specifice ale ă ţ acestei culturi pentru a o include într-o familie, gen, specie, variantăSe studiaz caracterele:ă

1. Morfologice2. Tinctoriale3. De cultură4. Biochimice 5. Antigenice (seroidentificarea)6. De patogenitate7. Sensibilitatea la bacteriofagi (fago-identificarea)8. Sensibilitatea la AB

IV etapă – EVALUAREA REZULTATELOR, FORMULAREA SI ELIBERAREA R SPUNSULUIĂCompararea rezultatelor ob inute cu caracterele speciilor bacteriene cunoscute pentru a g siţ ă asem n ri.ă ăExemplu de r spuns: Din proba examinat a fost izolat tulpina de ă ă ă Corynebacterium diphtheriae, biovar gravis, tox+, sensibil la ...., rezistent la ..... ă ă

STUDIEREA ACTIVIT II BIOCHIMICE A BACTERIILORĂŢActivitatea zaharolitic (şirul Hiss, coagularea lapteluiă , etc)

16

Activitatea proteoliticăDegradarea proteinelor native (lichefierea gelatinei sau a serului coagulat, peptonizarea laptelui, etc)Eviden ierea enzimelor specifice (ureaz , decarboxilaze, dezaminaze, etc) prin detectareaţ ă produsele finale ale reac iilor: Hţ 2S, NH3, indol… o Depistarea producerii H2S: formarea sulfurii de fer de culoare neagr în mediile multitest –ă

Kligler, Olkeni ki, etc; plasarea unei benzi de hârtie de filtru îmbibat cu acetat de Pbţ ă deasupra BP în care creşte cultura studiat (formarea sulfurii de Pb înnegreşte hârtia)ă

o Depistarea indolului (produs al metaboliz rii triptofanului) – benzi de hârtie îmbibate cu acidă oxalic. În prezen a indolului indicatorul vireaz în roz.ţ ă

o Depistarea amoniacului (ureaza) – hârtia de turnesol se coloreaz în albastru.ăo Depistarea catalazei (H2O2 .... H2O + O2): cultura se amestec cu o pic tur de ap oxigenată ă ă ă ă

– apari ia bulelor de gazţo Depistarea oxidazei (detectarea prezen ei citocromoxidazei din lan ul respirator)ţ ţReactiv – di (tetra)metil-parafenilen-diamină (benzi sau rondele de hârtie îmbibate cu reactiv, creioane, etc)Oxidarea reactivului – culoare violet -neagră ăOxidazo+ : Neisseria, Vibrio, PseudomonasOxidazo- : Enterobacteriaceae o Depistarea lecitinazei – mediu cu g lbenuş de ou 10% - formarea unui halou opac în jurulă

coloniiloro Depistarea lipazei – mediu cu Twin 80 1%– halou opac în jurul coloniilor (precipitarea acizilor

graşi)o Depistarea hemolizinei – geloz -sânge 5-10% - zon clar în jurul colonieiă ă ăo Depistarea ADNazei, fosfatazei, etc Probele sunt incubate la 37º C, 18-24 h

Identificarea rapidăUtilizarea galeriilor miniaturizate standarde (economie de timp, spa iu, material)ţSistemul API – o galerie din plastic format din numeroase alveoleă care con in fiecare un mediuţ deshidratat diferit (glucide, AA, etc). Alveolele sunt inoculate cu o suspensie bacterian testată ă şi incubate. Ulterior la necesitate se adaug reactive pentru detectarea metaboli ilor particulariă ţ .Lectura – conform unui cod de cifre sau computerizat

30.Metodele de creare a condi iilor de anaerobioz pentru cultivarea anaerobilor.ţ ă Izolarea culturilor pure prin metoda Zeissler. Volumul de lucru la fiecare etapa. Particularitatile de identificare a culturilor pure.

EXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU CULTURI ANAEROBE (clostridiene, neclostridiene)Condi ia principal – cultivare în absen a oxigenului ţ ă ţUtilizarea mediilor anaerobe (Kitt-Tarrozzi regenerat - 100º C, 20 min, r cit, acoperit cuă vazelină; îns mân area în geloz în coloan )ă ţ ă ă

Crearea condi iilor de anaerobiozţ ăMetoda fizică – utilizarea anaerostatuluiMetoda chimică – în exicator se întroduc substan e ce fixeaz oxigenul (pirogalol+baz );ţ ă ă utilizarea gas-pachetelorMetoda biologică Fortner – cultivarea concomitent a aerobilor şi anaerobiloră

Recoltarea – cu precau ie, evitând contactul cu aerul (în seringi, utilizând medii speciale)ţI etapă – ÎMBOG IREA ANAEROBILORĂŢ

Îns mân area prelevatului în 2 eprubete cu medă ţ iul Kitt-Tarrozzi regenerat Înc lzirea unui tub la 80ă º C, 20 min – distrugerea florei nesporogeneIncubarea la 37º C, 24-48 h (va avea loc înmul irea anaerobilor)ţ

II etapă - IZOLAREA CULTURII PURE DE ANAEROBIStudierea caracterelor de cultur – tulburarea mediului, descompunerea buc ilor de ficat,ă ăţ etc

17

Izolarea culturii pure de anaerobi prin metoda Zeissler (îns mân area a 0,1 ml din mediul K-ă ţT pe 3 cutii cu geloz -sânge glucozat consecutiv). Incubarea în anaerostat/exicator/gaă ă s-pack, 24-48 h

Metoda Weinberg – dilu ii succesive a culturii în geloz glucozat lichefiat şi aspirarea în tuburiţ ă ă ă lungi şi înguste, închise ermetic. Incubarea în termostat, 24 hIII etapă - ACUMULAREA CULTURII PURE

Studierea macroscopic a coloniilorăExaminarea microscopic (frotiu Gram) a coloniilor suspecteăRepicarea în mediul K-T regenerat pentru acumularea culturii pureIncubarea în termostat, 24 h

IV etapă - IDENTIFICAREA CULTURII PURE DE ANAEROBIVerificarea purit ii ăţ culturii pure (frotiu Gram)Studierea caracterelor culturii pure izolate (cu respectarea condi iilor de anaerobioz )ţ ă

V etapă - EVALUAREA REZULTATELOR, FORMULAREA ŞI ELIBERAREA R SPUNSULUIĂ

31. Antagonismul microbian. Tipurile. Mecanismele. Metodele de studiere. Aplicarea practica. Eubioticele. Exemple.

BIOTOP – spa iu cu condi ii de via particulare (conjunctiva, mucoasa intestinal , orofaringe,ţ ţ ţă ă vagin, tegument, etc), populat şi transformat de asocia ii de fiin e vii.ţ ţMICROBIOCENOZ (comunitate microbian ) – asocia ii microbiene ce populeaz un biotop.Ă ă ţ ăMicroorganismele prezente într-un biotop particular constituie microflora acestui habitat (m/f cutanat , intestinal , etc)ă ă . Aceasta joac un rol important în protejarea gazdei fa de o invazieă ţă microbian ulterioar , actionând prin urm toarele mecanisme:ă ă ă

1. competi ia pentru aceiaşi nutrienţ i; ţ2. competi ia pentru aceiaşi ţ R de pe celulele gazdei;3. producţia de bacteriocine; vitamine;4. producerea de acizi graşi volatili sau al i metaboli i; ţ ţ5. stimularea continu a sistemului imun;ă6. stimularea producerii unor factori imuni de protec ie (anticorpii naturali). ţ

Între microorganismele unui biotop se pot stabili rela ii:ţ Indiferente (neutralism) Favorabile (comensalism/satelitism, simbioz /mutualism, sinergism)ă Defavorabile (parazitism, antagonism) Antagonism – o specie inhib sau omoar alt specie prin mecanisme specifice sauă ă ă

nespecificeMi/o care manifest activitate inhibitoare – antagonistă (A), mi/o care sufer – concurentă (C).Antagonism nespecific:Antagonistul este mai activ, utilizând nutrien ii, oxigenul.ţAntagonistul produce metaboli i toxici (acizi, indol, Hţ 2S, amoniac, peroxid, etc).Antagonism specific – antagonistul produce substan e cu ac iune specific asupra unţ ţ ă ui sau mai multor concuren i (AB, bacteriocine).ţEfectul ac iunii unui antagonist asupra concurentului poate fi ţ bacteriostatic sau bactericid (uneori bacteriolitic).Utilizarea practic a antagonismului microbiană :

1. depistarea mi/o – producen i de antibiotice (micete, actinomicete, bacterii)ţ2. ob inerea produselor biologice curative de origine microbian (probiotice,ţ ă

eubiotice/sinbiotice): Lactobacterina, Colibacterina, Bifidumbacterina, Bificol, etc3. crearea biocenozelor favorabile organismului

METODELE DE STUDIU AL ANTAGONISMULUI În mediu solid (metoda tranşeei) – antagonistul se îns mân eaz în centrul cutiei,ă ţ ă

concuren ii – perpendicular. ţ Termostat 24h. Aprecierea – dup dimensiunea zonei deă inhibi ie a creşterii culturii concurentului.ţ

În mediu semisolid – I strat – antagonistul, II strat – concurentul. Termostat 24h. Aprecierea – zon clar între straturi.ă ă

Îns mân ară ţ ea în mediu lichid (BP) a unui num r egal de A şi C. Dup 24 h de incuba ie seă ă ţ reîns mân eaz 0,1 ml pe placa cu geloz . Se compar num rul coloniilor de A şi C. ă ţ ă ă ă ă

18

32.Antibioticele. Notiune. Clasificarea dupa producent, spectrul si efectul de actiune asupra c elulei bacteriene. Mecanismele de actiune a antibioticelor. Exemple.

ANTIBIOTICE ANTIBIOTICE (AB)(AB)– produse de origine natural (microbian , animal sau vegetal ), deriva iă ă ă ă ţ– produse de origine natural (microbian , animal sau vegetal ), deriva iă ă ă ă ţ semi-sintetici sau produse sintetice care inhib sau omoar ă ăsemi-sintetici sau produse sintetice care inhib sau omoar ă ă selectiv selectiv unele mi/o sau/şi celuleunele mi/o sau/şi celule tumoraletumorale, f, f r a exercita ca regul efecte toxice asupra macroorganismului. ă ă ăr a exercita ca regul efecte toxice asupra macroorganismului. ă ă ăClasificarea ABClasificarea AB

Dup efectul asupra celuleiăDup efectul asupra celuleiă• Bacteriostatic (tetraciclina, cloramfenicolBacteriostatic (tetraciclina, cloramfenicol……))•• Bactericid (streptomicina, polimixina)Bactericid (streptomicina, polimixina)•• Bacteriolitic (peniciline, cefalosporine)Bacteriolitic (peniciline, cefalosporine)

Dup spectăDup spectă rul de activitaterul de activitate• spectru restrâns (îngust) de ac iune (AB anti-G+, anti-G-, anti-tuberculoase, anti-ţspectru restrâns (îngust) de ac iune (AB anti-G+, anti-G-, anti-tuberculoase, anti-ţ

micotice, anti-tumorale)micotice, anti-tumorale)•• spectru larg de ac iune (G+ şi G-)ţspectru larg de ac iune (G+ şi G-)ţ

Dup producent (origine)ăDup producent (origine)ă•• fungic (peniciline, cefalosporine,...)ăfungic (peniciline, cefalosporine,...)ă• actinomicetaactinomiceta (aminoglicozide, macrolide, cloramfenicol, etc) (aminoglicozide, macrolide, cloramfenicol, etc)• microbian (bacitracina din ămicrobian (bacitracina din ă Bacillus subtilisBacillus subtilis, gramicidina din , gramicidina din Bacillus brevisBacillus brevis, polimixina, polimixina

din din Bacillus polimyxaBacillus polimyxa))•• vegetal – fitoncidele (alicina, rafanin , imanin )ă ă ăvegetal – fitoncidele (alicina, rafanin , imanin )ă ă ă•• animal (lizozimul – din albuş de ou, ecmolina – din oase de peşte, eritrina – din masă ăanimal (lizozimul – din albuş de ou, ecmolina – din oase de peşte, eritrina – din masă ă

eritrocitar , splenocitina – din splin )ă ăeritrocitar , splenocitina – din splin )ă ă Dup ăDup ă compocompozi ia chimic (beta-lactamice, macrolide, aminoglicozide, fenicoli, polipeptide,ţ ăzi ia chimic (beta-lactamice, macrolide, aminoglicozide, fenicoli, polipeptide,ţ ă

poliene, sulfamide, chinolone şi fluorochinolone, nitrofurani, etc)poliene, sulfamide, chinolone şi fluorochinolone, nitrofurani, etc)

Mecanismul de ac iune al AţMecanismul de ac iune al Aţ BBo AB cu AB cu ac iune asupra sintezei peretelui celularţac iune asupra sintezei peretelui celularţ (dereglarea sintezei peptidoglicanului) (dereglarea sintezei peptidoglicanului)

Beta-lactamice (peniciline, cefalosporine). Deregleaz procesul de sintez a PG, inhibândă ăBeta-lactamice (peniciline, cefalosporine). Deregleaz procesul de sintez a PG, inhibândă ă transpeptidazele ( inta - PFP)ţtranspeptidazele ( inta - PFP)ţVancomicina, teicoplanina (blocheaz transferul pentapeptidului din MCP spre peretele celular)ăVancomicina, teicoplanina (blocheaz transferul pentapeptidului din MCP spre peretele celular)ăBacitracina (blocheaz reciclarea moleculelor de transport transmembranar - bactoprenol)ăBacitracina (blocheaz reciclarea moleculelor de transport transmembranar - bactoprenol)ăFosfomicina (blocheaz piruviltransferaza, implicat în sinteza acidului N-acetil muramic) ă ăFosfomicina (blocheaz piruviltransferaza, implicat în sinteza acidului N-acetil muramic) ă ăEfectul acestor AB este bactericid/litic, doar celulele metabolic active sunt omorâte.Efectul acestor AB este bactericid/litic, doar celulele metabolic active sunt omorâte. Nu Nu afecteaafecteaz celulele eucariote (lipsa PG).ăz celulele eucariote (lipsa PG).ă

o AB cu AB cu ac iune asupra MEx şi a MCtţac iune asupra MEx şi a MCtţAB polipeptidiceAB polipeptidice (polimixina, colistina). Se fixeaz pe membrane bacteriene (în special pe lipidulă (polimixina, colistina). Se fixeaz pe membrane bacteriene (în special pe lipidulă A (ME la bacterii G-), provocând dezorganizarea lor. Efect bactericid.A (ME la bacterii G-), provocând dezorganizarea lor. Efect bactericid.AB polieniceAB polienice (nistatina, levorina, amfotericina B, etc). Se fixeaz pe sterolii MCP ale micetelor,ă (nistatina, levorina, amfotericina B, etc). Se fixeaz pe sterolii MCP ale micetelor,ă perturbând respira ia şi dezorganizând MCP (permeabilitate excesiv şi moartea celulei).ţ ăperturbând respira ia şi dezorganizând MCP (permeabilitate excesiv şi moartea celulei).ţ ăAceste AB ac ioneaz şi asupra celulelor în repaos. Relativ toxice, în special nefro.ţ ăAceste AB ac ioneaz şi asupra celulelor în repaos. Relativ toxice, în special nefro.ţ ă

o AB cu AB cu ac iune asupra ribozomilorţac iune asupra ribozomilorţ30S (aminoside: streptomicina, kanamicina, 30S (aminoside: streptomicina, kanamicina, gentamicina, gentamicina, tobramicina, amikacina; tetracicline)tobramicina, amikacina; tetracicline)50S (cloramfenicol, triamfenicol; macrolide: eritromicina, oleandomicina; lincosamide:50S (cloramfenicol, triamfenicol; macrolide: eritromicina, oleandomicina; lincosamide: clindamicina, lincomicina).clindamicina, lincomicina).Se leag pe receptori specifici de pe subunit ile 30S sau 50S, perturbând sinteza proteică ăţ ăSe leag pe receptori specifici de pe subunit ile 30S sau 50S, perturbând sinteza proteică ăţ ă (inhibi ia transpeptidazei, a transloca iei peptidelor, etc). Rezult inhibi ia sintezei proteice sauţ ţ ă ţ(inhibi ia transpeptidazei, a transloca iei peptidelor, etc). Rezult inhibi ia sintezei proteice sauţ ţ ă ţ sinteza proteinelor nefunc ionale. Efectul este bacteriostatic (aminosidele – bactericid), doarţsinteza proteinelor nefunc ionale. Efectul este bacteriostatic (aminosidele – bactericid), doarţ asupra celulelor active metabolic. asupra celulelor active metabolic.

o AB cu AB cu ac iune asupra acizilor nucleiciţac iune asupra acizilor nucleiciţRifampicinaRifampicina – inhib ARN-polimeraza ADN-dependent . Rezult stoparea sintezei ARNmă ă ă – inhib ARN-polimeraza ADN-dependent . Rezult stoparea sintezei ARNmă ă ăNoNovobiocina vobiocina , , Chinolonele Chinolonele (acidul nalidixic, ciprofloxacina, ofloxacina) – blocheaz activitateaă(acidul nalidixic, ciprofloxacina, ofloxacina) – blocheaz activitateaă topo-izomerazelor, intervenind în conforma ia ADN-ului. Efect bactericid. ţtopo-izomerazelor, intervenind în conforma ia ADN-ului. Efect bactericid. ţSulfamidele şi trimetoprimulSulfamidele şi trimetoprimul perturb sinteza acidului folic şi fola ilor (cofactori în sinteza AN).ă ţ perturb sinteza acidului folic şi fola ilor (cofactori în sinteza AN).ă ţ Activitate bacteriostatic .ăActivitate bacteriostatic .ă

Producerea ABProducerea AB

19

Metoda biologicăMetoda biologicăMetoda sinteticăMetoda sinteticăMetoda semi-sinteticăMetoda semi-sintetică

Etapele metodei biologice:Etapele metodei biologice:1. Cultivarea tulpinilor-producente (ex.: Cultivarea tulpinilor-producente (ex.: Penicillium notatum, Actinomyces griseum, etcPenicillium notatum, Actinomyces griseum, etc) în) în

mediu lichid adecvatmediu lichid adecvat2. Extragerea ABExtragerea AB3.3. Purificarea şi concentrarea ABPurificarea şi concentrarea AB4.4. Controlul toxicit iiăţControlul toxicit iiăţ5.5. Determinarea activit ii ABăţDeterminarea activit ii ABăţ

Activitatea AB se m soar în unit i de mas (g, mg, ă ă ăţ ăActivitatea AB se m soar în unit i de mas (g, mg, ă ă ăţ ă µµg) sau de ac iune (UA). ţg) sau de ac iune (UA). ţ1 UA – cantitatea minimal de AB care inhib creşterea unei tulpini de referin în condi iiă ă ţă ţ1 UA – cantitatea minimal de AB care inhib creşterea unei tulpini de referin în condi iiă ă ţă ţ standarde.standarde.Penicilina – 1UA = 0,6 Penicilina – 1UA = 0,6 µµg de substan purţă ăg de substan purţă ă

Cerin ele fa de AB:ţ ţăCerin ele fa de AB:ţ ţă1.1. Toxicitate selectivăToxicitate selectivă2.2. Efect terapeutic cu doze minimeEfect terapeutic cu doze minime3.3. Activitate de lung durată ăActivitate de lung durată ă4.4. Spectru restrâns de ac iuneţSpectru restrâns de ac iuneţ5.5. S fie solubile şi absorbite uşorăS fie solubile şi absorbite uşoră6. S nu provoace efecte secundareăS nu provoace efecte secundareă7.7. S nu se dezvolte rezisten a contra ABă ţS nu se dezvolte rezisten a contra ABă ţ8.8. S fie ieftineăS fie ieftineă

33. Rezisten a microbilor la antibiotice, tipurile. Mecanismele rezisten eiţ ţ dobindite si manifestatea ei. Combaterea rezisten ei.ţ

Cauzele:Cauzele:Factori genetici, proprii bacteriilorFactori genetici, proprii bacteriilorFactori ce favorizeaz selec ia şi difuzarea tulpinilor bacteriene rezistente ă ţFactori ce favorizeaz selec ia şi difuzarea tulpinilor bacteriene rezistente ă ţ

Tipurile de rezisten :ţăTipurile de rezisten :ţăoo Natural , ereditar , de specie, prezent la to i membrii unei specii sau genă ă ă ţNatural , ereditar , de specie, prezent la to i membrii unei specii sau genă ă ă ţ

lipsa inteiţlipsa inteiţ – ex.: micoplasme, micete; – ex.: micoplasme, micete; imposibilitatea de a atinge intaţimposibilitatea de a atinge intaţ – ex.: Mycobacterium (cerurile, lipidele împiedică – ex.: Mycobacterium (cerurile, lipidele împiedică

p trunderea AB în citoplasm ); ă ăp trunderea AB în citoplasm ); ă ă bacteriile nu efectueaz procesul inhibat de ABăbacteriile nu efectueaz procesul inhibat de ABă – ex.: acidul folic este preluat din – ex.: acidul folic este preluat din

mediu – rezisten la sulfamideţămediu – rezisten la sulfamideţăo Achizi ionat , dobândit , afecteaz tulpinile unei specii sensibile. Depinde de ac iunea deţ ă ă ă ţAchizi ionat , dobândit , afecteaz tulpinile unei specii sensibile. Depinde de ac iunea deţ ă ă ă ţ

selec ie exercitat de AB utilizate în tratament, urmat de r spândirea ei (între bacterii,ţ ă ă ăselec ie exercitat de AB utilizate în tratament, urmat de r spândirea ei (între bacterii,ţ ă ă ă interinteruman, transmisie de origine animal ).ăuman, transmisie de origine animal ).ă

Diminuarea permeabilit ii membranareăţDiminuarea permeabilit ii membranareăţ Modificarea intei moleculareţModificarea intei moleculareţ Eliminarea excesiv a AB ăEliminarea excesiv a AB ă Inactivarea enzimatic a AB, care poate fi hidrolizat (penicilinaz , cefalosporinaz )ă ă ăInactivarea enzimatic a AB, care poate fi hidrolizat (penicilinaz , cefalosporinaz )ă ă ă

sau modificat structural (acetilaze, adenilaze, fosforilaze), etc. sau modificat structural (acetilaze, adenilaze, fosforilaze), etc. Rezisten a dobândit se poate manifesta fenotipic (bacteriile în faza de repaos, formele “L” deţ ăRezisten a dobândit se poate manifesta fenotipic (bacteriile în faza de repaos, formele “L” deţ ă bacterii) sau genetic (bacterii) sau genetic (genotipic)genotipic)Rezisten a geneticţ ăRezisten a geneticţ ă poate fi: poate fi:CromozomialăCromozomială, determinat de muta ii (10%)ă ţ, determinat de muta ii (10%)ă ţ

MecanismeMecanisme: modificarea intei moleculare, diminuarea permeabilit ii membranareţ ăţ: modificarea intei moleculare, diminuarea permeabilit ii membranareţ ăţPlasmidicăPlasmidică, epidemic , realizat prin transfer de gene prin intermediul plasmidelor R (poate fiă ă, epidemic , realizat prin transfer de gene prin intermediul plasmidelor R (poate fiă ă rezisten multipl ).ţă ărezisten multipl ).ţă ă

Mecanisme:Mecanisme: inactivarea enzimatic , modificarea intei, substitu ia/supraproduc ia intei,ă ţ ţ ţ ţ inactivarea enzimatic , modificarea intei, substitu ia/supraproduc ia intei,ă ţ ţ ţ ţ excre ie excesiv a AB.ţ ăexcre ie excesiv a AB.ţ ă

Prevenirea rezisten eiţPrevenirea rezisten eiţ1.1. Supravegherea epidemiologic a tulpinilor rezistenteăSupravegherea epidemiologic a tulpinilor rezistenteă2.2. Politic strict de prescriere a ABă ăPolitic strict de prescriere a ABă ă

20

3.3. Respectarea dozelor terapeutice corecte şi a timpului de tratament necesarRespectarea dozelor terapeutice corecte şi a timpului de tratament necesar4.4. Asocierea AB cu mecanisme de ac iune diferiteţAsocierea AB cu mecanisme de ac iune diferiteţ5. Prescrierea AB care nu sunt sensibile la beta-lactamaze, utilizând inhibitori (acidulPrescrierea AB care nu sunt sensibile la beta-lactamaze, utilizând inhibitori (acidul

clavulanic, sulbactamul, tazobactamul). Ex.: augmentina – amoxicilina+acidclavulanic, sulbactamul, tazobactamul). Ex.: augmentina – amoxicilina+acid clavulanicclavulanic

6.6. Reciclarea ABReciclarea AB7.7. Producerea AB noiProducerea AB noi

Efectele negative ale antibioticoterapieiEfectele negative ale antibioticoterapiei1.1. Efect toxic (streptomicina – surditate, cloramfenicolul – toxic pentru m duva osoas ,ă ă ăEfect toxic (streptomicina – surditate, cloramfenicolul – toxic pentru m duva osoas ,ă ă ă

polipeptidele – nefrotoxice, etc)polipeptidele – nefrotoxice, etc)2.2. Efect teratogenEfect teratogen3.3. Ac iune sensibilizant (penicilina, etc)ţ ăAc iune sensibilizant (penicilina, etc)ţ ă4.4. DisbacteriozăDisbacterioză5.5. Dereglarea imunogenezeiDereglarea imunogenezei6.6. Selec ia suşelor rezistenteţSelec ia suşelor rezistenteţ

BacteriocineleBacteriocinele – substan e proteice bactericide produse de numeroase specii bacteriene şiţ – substan e proteice bactericide produse de numeroase specii bacteriene şiţ active asupra altor tulpini ale aceeaşi specii sau asupra speciilor înrudite. Producereaactive asupra altor tulpini ale aceeaşi specii sau asupra speciilor înrudite. Producerea bacteriocinelor este determinat plasmidic (plasmide Col). ăbacteriocinelor este determinat plasmidic (plasmide Col). ăTipuri de bacteriocine: colicine (secretate de Tipuri de bacteriocine: colicine (secretate de Escherichia coliEscherichia coli), corinecine (Corynebacterium),), corinecine (Corynebacterium), vibriocine (Vibrio), piocine (Pseudomonas), etc.vibriocine (Vibrio), piocine (Pseudomonas), etc.Studiul sensibilit ii unei tulpini la bacteriocine (ăţStudiul sensibilit ii unei tulpini la bacteriocine (ăţ bacteriocinotipiabacteriocinotipia) se utilizeaz în scopuriă) se utilizeaz în scopuriă epidemiologice.epidemiologice.

34. Notiuni de tulpini bacteriene sensibile, intermediare si rezistente la antibiotice. Metodele de determinare a sensibilit tii microbilor la antibiotice:ă difuzimetrica (rondelelor), dilu iilor succesive. No iune de concentra ie minimţ ţ ţ ă de inhibi ie (CMI) si concentra ie minim bactericid (CMB).ţ ţ ă ă

Sensibilitatea microbilor la ABSensibilitatea microbilor la ABÎn func ie de rezultatele clinice, bacteriile se divizeaz în 3 clase: ţ ăÎn func ie de rezultatele clinice, bacteriile se divizeaz în 3 clase: ţ ă sensibile la AB (S), rezistentesensibile la AB (S), rezistente (R) şi intermediare (I, moderat sensibile).(R) şi intermediare (I, moderat sensibile).

Tulpinile S – efectul terapeutic este ob inut cu doze terapeutice uzualeţTulpinile S – efectul terapeutic este ob inut cu doze terapeutice uzualeţTulpinile R – efectul terapeutic nu poate fi ob inut cu doze terapeuticeţTulpinile R – efectul terapeutic nu poate fi ob inut cu doze terapeuticeţTulpinile I – succesul terapeutic este imprevizibil. Ar fi posibil cu doze mari sau laTulpinile I – succesul terapeutic este imprevizibil. Ar fi posibil cu doze mari sau la administarea local a AB.ăadministarea local a AB.ă

Fiecare tulpin izolat manifest sensibilitate particular . Ea poate fi studiat în laboratoră ă ă ă ăFiecare tulpin izolat manifest sensibilitate particular . Ea poate fi studiat în laboratoră ă ă ă ă pentru determinarea profilului de sensibilit i al acestei tulpini, ceea ce constituie oăţpentru determinarea profilului de sensibilit i al acestei tulpini, ceea ce constituie oăţ antibiogramăantibiogramă..

Testarea sensibilit ii bacteriilor la ABăţTestarea sensibilit ii bacteriilor la ABăţoo Metoda difuzimetric (rondelelor). ăMetoda difuzimetric (rondelelor). ă

Utilizat uzual în infec ii banale.ă ţUtilizat uzual în infec ii banale.ă ţCondi ii: mediu standard, concentra ie standard de mi/o (10ţ ţ ăCondi ii: mediu standard, concentra ie standard de mi/o (10ţ ţ ă 55/ml), rondele/discuri (comprimate)/ml), rondele/discuri (comprimate) cu % standarde de AB, condi ii standarde.ţcu % standarde de AB, condi ii standarde.ţMediul este inoculat cu suspensia bacterian . Dup uscare în termostat se aplic rondelele –ă ă ăMediul este inoculat cu suspensia bacterian . Dup uscare în termostat se aplic rondelele –ă ă ă 24h, 3724h, 37°°C.C.LecturaLectura – diametrul zonei de inhibi ie a creşterii culturii bacteriene este comparat cu diametreleţ – diametrul zonei de inhibi ie a creşterii culturii bacteriene este comparat cu diametreleţ standarde pentru fiecare AB. Valori sub acest diametru – tulpina este R, dac este dep şit – S.ă ăstandarde pentru fiecare AB. Valori sub acest diametru – tulpina este R, dac este dep şit – S.ă ă

oo Metoda dilu iilorţMetoda dilu iilorţÎntr-un şir de tuburi cu 1 ml BP se efectueaz dilu ia AB (256 UA, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0,5,ă ţÎntr-un şir de tuburi cu 1 ml BP se efectueaz dilu ia AB (256 UA, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0,5,ă ţ etc). Se adaug în fiecare tub (cu excep ia celui martor) 0,1 ml de suspensie bacterian 10ă ţ ăetc). Se adaug în fiecare tub (cu excep ia celui martor) 0,1 ml de suspensie bacterian 10ă ţ ă 55/ml./ml. Termostat - 24h.Termostat - 24h.LecturaLectura – cea mai mic doz de AB care inhib creşterea culturii dup 24h de incubare (mediuă ă ă ă – cea mai mic doz de AB care inhib creşterea culturii dup 24h de incubare (mediuă ă ă ă clar) constituie Concentra ia Minim de Inhibi ie (CMI) a AB pentru tulpina testat . ţ ă ţ ăclar) constituie Concentra ia Minim de Inhibi ie (CMI) a AB pentru tulpina testat . ţ ă ţ ă CMI m soară ăCMI m soară ă efectul bacteriostatic. efectul bacteriostatic. Concentra ia Minim Bactericid (CMB) – cantitatea minim de AB care omoar 99,9% dinţ ă ă ă ăConcentra ia Minim Bactericid (CMB) – cantitatea minim de AB care omoar 99,9% dinţ ă ă ă ă inoculum dup 18h de incubare.ăinoculum dup 18h de incubare.ă Determinarea CMB – din ultimele tuburi f r creştere se repică ă ă Determinarea CMB – din ultimele tuburi f r creştere se repică ă ă

21

0,1 ml de mediu pe placa cu geloz . Dup 24h se compar num rul celulelor ce au supravie uită ă ă ă ţ0,1 ml de mediu pe placa cu geloz . Dup 24h se compar num rul celulelor ce au supravie uită ă ă ă ţ cu nr ini ial de bacterii (10ţcu nr ini ial de bacterii (10ţ 55/ml)./ml).

Corela ia dintre studii ţCorela ia dintre studii ţ in vitroin vitro şi rezultate şi rezultate in vivoin vivoÎn studii În studii in vitroin vitro parametrii (densitatea suspensiei bacteriene, concentra ia AB, etc) nu seţ parametrii (densitatea suspensiei bacteriene, concentra ia AB, etc) nu seţ modific în timp. ămodific în timp. ă In vivoIn vivo, la pacien i, concentra ia AB variaz în timp şi în func ie de esut. ţ ţ ă ţ ţ, la pacien i, concentra ia AB variaz în timp şi în func ie de esut. ţ ţ ă ţ ţPentru a stabili dac tulpina izolat este sensibil sau rezistent la un AB se cere cunoaştereaă ă ă ăPentru a stabili dac tulpina izolat este sensibil sau rezistent la un AB se cere cunoaştereaă ă ă ă Concentra iei TerapeuticeţConcentra iei Terapeuticeţ ((CTCT) (cantitatea de AB prezent în focarul infec ios în cursulţ) (cantitatea de AB prezent în focarul infec ios în cursulţ tratamentului cu doze terapeutice) a fiec rui AB testat.ătratamentului cu doze terapeutice) a fiec rui AB testat.ă

TulpTulpini Sensibile – CMI/CT ini Sensibile – CMI/CT <<1, ex.: 2/8, 2/16 - efect terapeutic posibil cu doze uzuale1, ex.: 2/8, 2/16 - efect terapeutic posibil cu doze uzualeTulpini Rezistente – CMI/CTTulpini Rezistente – CMI/CT>>1, ex.: 8/2, efect terapeutic imposibil1, ex.: 8/2, efect terapeutic imposibilTulpini Intermediare – CMI/CT=1, efect terapeutic imprevizibil. Pot fi utilizate doze maximeTulpini Intermediare – CMI/CT=1, efect terapeutic imprevizibil. Pot fi utilizate doze maxime de AB sau administrarea lor localăde AB sau administrarea lor locală

Testarea CMI / CMB este indicat în tratamentul infec iilor grave : meningite, septicemii,ă ţTestarea CMI / CMB este indicat în tratamentul infec iilor grave : meningite, septicemii,ă ţ endocardite, infec ii cronice sau la persoane cu imunosupresie.ţendocardite, infec ii cronice sau la persoane cu imunosupresie.ţ

Monitorizatea (supravegherea) tratamentului cu AB. Verificarea eficacit iiăţMonitorizatea (supravegherea) tratamentului cu AB. Verificarea eficacit iiăţ antibiotantibioterapiei.erapiei.

1.1. Determinarea concentra iilor umorale sau tisulare ale ABţDeterminarea concentra iilor umorale sau tisulare ale ABţIndica ii:ţIndica ii:ţUtilizarea unui AB toxicUtilizarea unui AB toxicÎn caz când bolnavul sufer de deficien e metabolice sau excretoare (renale, hepatice)ă ţÎn caz când bolnavul sufer de deficien e metabolice sau excretoare (renale, hepatice)ă ţSe compar concentra iile ob inute cu CMI a antibioticului testat (sau cu CT).ă ţ ţSe compar concentra iile ob inute cu CMI a antibioticului testat (sau cu CT).ă ţ ţ

2.2. Studiul activit ii inhibitorii a lichidelor biologice (NEI)ăţStudiul activit ii inhibitorii a lichidelor biologice (NEI)ăţIndica ii: infec ii grave care nu r spund rapid la tratament.ţ ţ ăIndica ii: infec ii grave care nu r spund rapid la tratament.ţ ţ ăEfectuarea: la dilu ii duble (1/2, ¼...) aţEfectuarea: la dilu ii duble (1/2, ¼...) aţ lele lichidului examinat (ser, LCR, urin ) se adaugă ă lichidului examinat (ser, LCR, urin ) se adaugă ă suspensia bacterian (din tulpina izolat de la bolnav). ă ăsuspensia bacterian (din tulpina izolat de la bolnav). ă ăLectura: dup 24h de incuba ie la 37ă ţLectura: dup 24h de incuba ie la 37ă ţ °° C se apreciaz dilu ia maxim cu efect bacteriostatic/cid. ă ţ ă C se apreciaz dilu ia maxim cu efect bacteriostatic/cid. ă ţ ăNEI ≥1:8NEI ≥1:8 reflect eficien aă ţ reflect eficien aă ţ antibioticoterapieiantibioticoterapiei

35.Bac teriofagul. Natura. Caracterele morfobiologice. Profagul. Lizogenia. Aplicarea practica a bacteriofagului.

BBacterioacterioffagagii == virus virusuriuri ce ce infectinfecteazeaz bacteriă bacteriă ileile. Para. Parazziţiţii intracelular intracelularii obligator obligatoriiii aiai bct bct.. TTooaate bacterite bacteriilile pe poot t fifi infect infectatate dee de c căătretre bacterio bacterioffagagii. . In majoritatea cazurilorIn majoritatea cazurilor, un , un ffag ag anumeanume infecte infecteazaz ă ă doardoar celule celulelele un unuiui s singuringur gen, gen, uunenei anumitei anumite specspeciiii sausau a a uneuneii tulpini -tulpini - specificitspecificitatateeaa ffagagului ului preprezzenţenţaa R pt R pt aacecestst ffag la suag la supprraafaţfaţaa bct bct--gazdgazd .ă.ăStructurStructuraa bacteriofaguluibacteriofaguluiSStructurtructuraa fagilor corespundefagilor corespunde reg regulilor ulilor generalegenerale ce se refer ce se referăă la la structur structuraa virus virusurilorurilor. .

1. AAcid nucleicid nucleicc ((ADN ADN sausau ARN ARN, , mai frecvent dublmai frecvent dubluuccatenaratenar).).2. InveliInveliş proteiş proteicc == capsidăcapsidă prote proteccţţie aie a materi materiaalluluiului geneti geneticc. Poseda R la suprafa ţă. Poseda R la suprafa ţă

infec iţinfec iţ aa gazdeigazdei. . CapsidaCapsida est estee constitu constituitit dă dă inin su subbunităţunităţii protei proteicece, , capsomerecapsomere, aran, aranjatejate simetric simetric îîntr-ontr-o ordine distinctordine distinctăă, conferind forma fagului, conferind forma fagului. .

3. UniiUnii ffagagii pot pot con ineţcon ineţ şşii enzenziimeme ((ex.: ex.: lizozim, neuraminidaza)lizozim, neuraminidaza). . EExist 3 forme morăxist 3 forme moră ffologiologicce e principale principale de de ffagagii:: Fag iFag icosaedricosaedricc:: form să form să fferiericc , 20 feă ţ, 20 feă ţee tri triuungngiiulareulare, 30 muchii , 30 muchii şşi 12 vi 12 vâârfuri (simetrie cubicrfuri (simetrie cubic aă aă

capsidei). capsidei). Fag ciFag cilindrilindric:c: bastonabastonaşşee protei proteicce forme formateate dindin caps capsomeromere, ase, asaamblmblateate î într-ontr-o structură structură

tubular (simetrie helicoidal a capsidei).ă ătubular (simetrie helicoidal a capsidei).ă ă Fag cFag complex:omplex: constitu constituitit d dinin capcap icosaedri icosaedricc ataş ataşatat lla a o o coadcoad helicoidală ă helicoidală ă. . Coada Coada estestee

formatformat ă ă dindin d douaoua tub tuburiuri concentri concentricce, un tub intern rigid - e, un tub intern rigid - canalcanalulul axial axial, , carecare est estee inconjuratinconjurat de de teaca coziiteaca cozii, un man, un manşşon on contractil. contractil. Gulerul Gulerul cozii cozii (colul) (colul) se aflse aflăă la jonc la joncţţiunea capului cuiunea capului cu coada. Lcoada. La partea parteaa distal ă distal ă aa cozii se aflcozii se aflăă o o plaplacc hexagonal , ă ă hexagonal , ă ă plaplacaca ba bazzalăală, , la fiecare apexla fiecare apex fiind ancoratefiind ancorate ccââte un te un croşetcroşet ş şii o o fibrăfibră. . EleEle repre reprezzent săent să iistemstemulul de fixa de fixarere aa ffagaguluiului pepe bacteribacteriaa recept receptoaoare şre şii contribu contribuiie e lla injec iţa injec iţ aa materi materiaalluluiului geneti geneticc î înn celul .ă celul .ă

Nu toNu toţţi fagii au o astfel dei fagii au o astfel de mor morffologie. ologie. Unii au Unii au coadcoad lă lă uungngaa ş şii non non--contractilcontractilaa, , alalţţii ii - - coadacoada sscurt , saăcurt , saă u u farăfară coad coad . ă. ă EExist şăxist şă ii ffagagii filament filamentooşşii..

Interac iunea dintre bacterioţInterac iunea dintre bacterioţ ffag şi celula-gazdăag şi celula-gazdă

22

BacteriofBacteriofagagiiii exist îă exist îă n staren stare de de virionvirionii extracelular extracelularii, i, iar laar la infect infectareaarea une uneii bacteri bacteriii eiei potpot duceduce llaa ddouaoua t tiippuriuri d de e infec iţinfec iţ ii::

• • IInfec iţnfec iţ ee l liititiccăă ffagagiiii virulenţ virulenţii. . LLa fina fineleele c ciiclcluluiului de multiplica de multiplicarere bacteri bacteriaa infect infectatat esteă esteă lizat ălizat ă eeliberânliberândd ffagagii nou-formatiii nou-formati. . • • IInfectinfectiee nelitica saunelitica sau l lizizogenăogenă ffagagiiii temper temperaaţţi (moderai (moderaţţi)i). . Ei Ei infecteinfecteazaz bacteriă bacteriă ililee ffăărrăă a le a le ddisistrutrugge.e.

INFECTIINFECTIAA L LIITITICC (cĂ (cĂ iiclclulul biologi biologicc alal ffagaguluiului virulent) virulent)AdsorbAdsorbţţiaia.. ciocnire int ciocnire intââmplmplăătoaretoare ffagagulul se fixe se fixeazaz ă ă prin prin intermediintermediulul plă plăciicii ba bazzale (ale (la inceputla inceput prinprin fibre fibrele salele sale, ap, apoioi prin croprin croşşeteete) d) dee un R specifi un R specificc de pe PC de pe PC bacteribacteriaann (uneori flageli sau pili) (uneori flageli sau pili). . PenetraPenetrarearea.. fixare ireversibilfixare ireversibilăă a f a fagaguluiului pepe PC PC ac iţac iţ uunnee E E ( (ex. lex. lizizozoziimm)) perforare PC perforare PC

contrac iţcontrac iţ ee manmanşşonon apro apropipiere ere capcap de pla de placaca ba bazzal ăal ă canal canalulul axialaxial penetre penetreazaz MCt ă MCt ă AADNDN ffagiagicc est estee inject injectatat inin bacterie. bacterie.ExpresExpresiaia genom genomuluiului viral (biosinteza componentelor fagice, maturizarea) viral (biosinteza componentelor fagice, maturizarea). penetra. penetrarere AADN viral îDN viral înn bacterie bacterie ((fag vegetativfag vegetativ) ) timp de aproximativtimp de aproximativ 12 minute virion 12 minute virionulul nu estenu este depistat depistat îînn bacteri bacteriaa infect infectatat = ă = ă ffaazaza d de e eclipsăeclipsă. . Ea Ea coincidcoincidee cucu s siintentezaza enz enziimemelorlor virale virale carecare vorvor asigura ulteriorasigura ulterior::

replicareplicarearea AADN DN ffagiagicc;; ssiintentezaza proteine proteinelorlor ffagiagicece;; aassaamblamblarreeaa acestoracestor element elementee..

AsAsaamblamblarreeaa ffagagilorilor. . sinteza compusinteza compuşşi capsida i capsida şşi AN i AN îîn cantitn cantităţăţi suficiente i suficiente asamblarea asamblarea spontanspontanăă a particulelor noi de fagi, prin incorporarea acidului a particulelor noi de fagi, prin incorporarea acidului nucleinucleicc î în capsidn capsid .ă.ăElEliberaiberarearea. . MMajoritateaajoritatea f fagagiilor, lor, dupdup maturiă maturiă zarezare, s, suunt nt eeliberliberaaţţii î în urman urma l lizizeeii p peerreteluietelui bacteri bacteriaann cu enzime ale bacteriofaguluicu enzime ale bacteriofaguluiTiTimpmpulul didintre infectintre infectiee ş şii eeliberaliberarere (ciclul de reproducere) (ciclul de reproducere) estestee d de e 20-60 minute 20-60 minute lla 37°C, a 37°C, ffagagiiii ssuunt nt eeliberliberaaţţii î în n vavalluuriri de 50-1000 de 50-1000 ffagagii p peer celul . ăr celul . ă

INFECTIINFECTIAA NON L NON LIITITICC Ă Ă SAUSAU L LIZIZOGEN : ĂOGEN : Ă FFAGAGIIII TEMPER TEMPERAAŢŢIIFFagagiiii temper temperaaţţii (modera i)ţ (modera i)ţ atunci candatunci cand infecte infecteazaz ă ă oo bacterie p bacterie poott::

1. sau inducesau induce un c un ciiclcluu complet de multiplica complet de multiplicare, ce duce re, ce duce la la llizaiza bacterie bacterieii, , 2. sau,sau, mai frecvent, mai frecvent, dupdup injectă injectă areaarea AADNDN-ului-ului, , ssăă integreintegreze aze acecestst AADN îDN înn cromo cromozzomomulul

bacteribacteriaan prin recombinare specificăn prin recombinare specifică, , formâformândnd un un proproffagag (lizogenizare) (lizogenizare)3. sausau sa ramsa ramâânnăă îînn Ct su Ct subb form de ă form de ă plasmidăplasmidă. .

In ultimele douIn ultimele douăă cazuri cazuri bacteribacteriaa n nuu m moaoarre e şşii,, multiplimultipliccânându-sedu-se, repli, replicc genomă genomă ulul viral viral concomitent cuconcomitent cu propr propriul siul săăuu genom: bacteri genom: bacteriaa (cultura) (cultura) estestee numitnumit ă ă llizizogenăogenă.. Ea Ea posed şăposed şă ii transmtransmiittee descend descendeenţnţilorilor capacitateacapacitatea de de a a produproducce e fafaggii în absenţ în absenţaa infec iţ infec iţ eiei. .

ProprietăţProprietăţileile culturilorculturilor l lizizogeneogeneInducInducţţia ciclului liticia ciclului litic. Profagul p. Profagul păăstreazstreazăă virulen virulenţţa potena potenţţialialăă. Me. Men iţn iţ nneerearea ststăării derii de l lizizogenogenieie impliimplicc ă ă ss ii ntente zaza un un uiui repres repres oo r proteir protei cc , cod, cod ificat dificat d e e ff agag . . DDispari iţispari iţ aa lui duce la lui duce la induc iţinduc iţ aa ciciclcluluiului l liititic.c. IInduc iţnduc iţ aa se se ppoaoattee declandeclanşşaa spontan spontan la un numar limitat de celule sau la un numar limitat de celule sau p poaoattee fifi provo provocatcat ă ă lala majoritmajoritateaatea celule celulelorlor, , dede ex ex.., , la acla acţţiuneaiunea unor mutageniunor mutageni, c, caa ra razelezele ultraviolet ultravioletee sausau mitom mitomiicincinaa C.C. SSiistemstemulul SOS activ SOS activatat prot. prot. RecA RecA scindeazascindeaza repres represoorrulul protei proteicc alal ffagagului ului expresiexpresiaa c ciiclcluluiului lliititicc. . Pentru aPentru aceaceastasta pro proffagagul trebuie sa fieul trebuie sa fie exciexcizatzat - opera iţ - opera iţ ee invers integră ă invers integră ăriirii. . EExcixcizziiaa est estee efectuefectuatat ă ă dede ccăătretre protein proteinaa xisxis, cod, codificatificat ă ă dde e ffag. ag. UrmeazUrmeazăă replicarea g replicarea genomenomuluiului, , sintezasinteza componcomponenenttelorelor ffagaguluiului ş şii ffagagiiii as asaamblmblaaţţii s suunt nt eeliberliberaaţţii pr prinin l lizaiza celule celulei (i (prpr oo ff agag ulul - - gen poten iă ţgen poten iă ţ aa ll letalletal !ă!ă ))..În timpul replic rii fagului moderat fragmente de ADN bacterian pot fi întroduse din eroare înăÎn timpul replic rii fagului moderat fragmente de ADN bacterian pot fi întroduse din eroare înă particulele virale. Aceşti fagi pot în contiparticulele virale. Aceşti fagi pot în continuare întroduce în cromosomul altor bacterii ADNnuare întroduce în cromosomul altor bacterii ADN bacterian capturat = proces de transfer genetic = bacterian capturat = proces de transfer genetic = transduc ieţtransduc ieţ . Natura genelor bacteriene. Natura genelor bacteriene transferate poate fi diferit : gene din apropierea locului de inser ie a fagului ă ţtransferate poate fi diferit : gene din apropierea locului de inser ie a fagului ă ţ (transduc ieţ(transduc ieţ specific )ăspecific )ă sau fragmente de ADN bacterian întroduse din întâmplare în capsida fagului sau fragmente de ADN bacterian întroduse din întâmplare în capsida fagului (transduc ie generalizat )ţ ă(transduc ie generalizat )ţ ăIImunitmunitateate contr contraa su supraprainfectiinfectieiei. B. Bacteriacteriileile l lizizogene sogene suunt nt imune imune lala ffagagulul virulent omologvirulent omolog profagului gprofagului găăzduitzduit. . AcAceestst ffag sag se e aaddsosoaarbe, injecterbe, injecteazaaza AADNDNulul, , dardar ffăărrăă a se replica sau provoca a se replica sau provoca lizaliza..Conversie fagicConversie fagic ă ă (modificarea fenotipului celulei cauzat de genele profagului)ă(modificarea fenotipului celulei cauzat de genele profagului)ă ..

23

BBacteriacteriileile infect infectateate cucu un un ffag pag poot pret prezzententaa uneleunele caractere absente caractere absente lala celule celulelele n neeinfectinfectatate. e. CConversionversiee ffagagicicăă cau cauzatzat ă ă de:de:

1. expresiexpresiaa unorunor gene gene aleale ffagaguluiului de cde căătretre celule celule2. inactivainactivarearea unorunor gene cromo gene cromozzomomaleale la la integraintegrarearea prprooffagaguluiului. .

De De ex ex.., , tulpiniletulpinile de de Corynebacterium diphtheriaeCorynebacterium diphtheriae carecare provo provoacac diă diă ffteriteriaa s suunt lnt lizizogeniogenizatezate dede un un anumitanumit t tiip de p de ffagagii carecare code codeazaaza ş şii exprim ă exprim ă oo toxin puteă toxin puteă rnicrnic ; toxina eritrogen aă ă; toxina eritrogen aă ă Streptococcus pyogenesStreptococcus pyogenes, etc , etc

CCulturulturaa ş şii titra titrarearea bacteriofbacteriofagagilorilor. . EEfefeccttulul ffagagilorilor virulenţ virulenţii aasusupprraa cultur culturilorilor bacterienebacterieneBacteriofagii sunt cultivaBacteriofagii sunt cultivaţţi i îîn laborator n laborator îîn mediu de culturn mediu de culturăă lichid sau solid lichid sau solid în prezen a bacteriilorţ în prezen a bacteriilorţ omologeomologe. . Cultivarea în medCultivarea în mediu lichid:iu lichid: Bacteriile sensibile Bacteriile sensibile şşi fagii se i fagii se îîntroduc ntroduc îîntr-un bulion nutritiv (ntr-un bulion nutritiv (nr fagi < nr bctnr fagi < nr bct). Amestecul este). Amestecul este incubat pentru a permite bacteriilor sincubat pentru a permite bacteriilor săă se multiplice se multiplice şşi de a fi infectate de ci de a fi infectate de căătre fagi tre fagi num număărulrul fagilor crefagilor creşşte mai rapid decte mai rapid decâât cel al bacteriilor pt cel al bacteriilor pâânnăă la un punct critic c la un punct critic câând numnd număărul fagilorrul fagilor prezenprezenţţi este suficient pentru a infecta toate bacteriile culturii. i este suficient pentru a infecta toate bacteriile culturii. Toate celulele bacteriene suntToate celulele bacteriene sunt lizate lizate îîn acelan acelaşşi timp, ce duce la dii timp, ce duce la dispari iţspari iţ a completa completăă a turbidit a turbidităţăţii culturii (clarificarea mediului).ii culturii (clarificarea mediului).Cultivarea fagilor în mediu solid:Cultivarea fagilor în mediu solid: A Amestecul bacterii-fagi poate fi admestecul bacterii-fagi poate fi adăăugat ugat la geloza topit şiăla geloza topit şiă r cit la 45ă ăr cit la 45ă ă °° C C şşi apoi turnat i apoi turnat îîn cutia Petri. Bacteriile crescn cutia Petri. Bacteriile cresc, se multiplic , formând o peliculă ă, se multiplic , formând o peliculă ă fin , iarăfin , iară fagii continu fagii continuăă s săă infecteze provoc infecteze provocâând liza confluentnd liza confluentăă a culturii bacteriene. a culturii bacteriene. Aceste Aceste “colonii” de fagi se manifest sub forma unor pete sterile (plaje). Num rul plajelor indică ă ă“colonii” de fagi se manifest sub forma unor pete sterile (plaje). Num rul plajelor indică ă ă num rul fagilor infec ioşi în prelevat (fiecare colonie se formeaz pe contul multiplic rii unuiă ţ ă ănum rul fagilor infec ioşi în prelevat (fiecare colonie se formeaz pe contul multiplic rii unuiă ţ ă ă virion fagic).virion fagic).BacteBacteriofagii pot fi intâlni i în diferite prelevate umane sau din mediul extern. ţriofagii pot fi intâlni i în diferite prelevate umane sau din mediul extern. ţ Fagii indicăFagii indică prezen a bacteriilor sensibile.ţprezen a bacteriilor sensibile.ţ

IZOLAREA BACTERIOFAGILORIZOLAREA BACTERIOFAGILORPrelevate: ap , sol, materii fecale, puroi, etcăPrelevate: ap , sol, materii fecale, puroi, etcăIzolarea directăIzolarea directă – filtrarea prelevatelor prin filtre bacteriene, ultracentrifugare. – filtrarea prelevatelor prin filtre bacteriene, ultracentrifugare.Izolare prin metoda de îmbog ire f r îns mân areăţ ă ă ă ţIzolare prin metoda de îmbog ire f r îns mân areăţ ă ă ă ţ – materialul de examinat se – materialul de examinat se inoculeaz într-un mediu nutritiv lichid (pentru multiplicare bacteriile omologe fagului c utat).ă ăinoculeaz într-un mediu nutritiv lichid (pentru multiplicare bacteriile omologe fagului c utat).ă ă Peste 10 ore de incubare la 37Peste 10 ore de incubare la 37°° C bulionul este supus filtr rii. In filtrat s-au acumulat fagii careă C bulionul este supus filtr rii. In filtrat s-au acumulat fagii careă s-au inmul it pe contul bacteriilor omologe din prelevat. ţs-au inmul it pe contul bacteriilor omologe din prelevat. ţIzolare prin metoda de îmbog ire cu îns mân areăţ ă ţIzolare prin metoda de îmbog ire cu îns mân areăţ ă ţ – inocularea prelevatului într-o – inocularea prelevatului într-o suspensie bacterian omolog fagului c utat. Cultura bacterian asigur îmbog irea fagilor.ă ă ă ă ă ăţsuspensie bacterian omolog fagului c utat. Cultura bacterian asigur îmbog irea fagilor.ă ă ă ă ă ăţ Peste 10 ore de incubare la 37Peste 10 ore de incubare la 37°° C bulionul este supus filtr rii. ă C bulionul este supus filtr rii. ă

INDICAREA BACTERIOFAGILORINDICAREA BACTERIOFAGILORMetoda OTTOMetoda OTTO. Pe placa de geloz din cutia Petri se îns mân eaz în gazon suspensia deă ă ţ ă. Pe placa de geloz din cutia Petri se îns mân eaz în gazon suspensia deă ă ţ ă bacterii omologe fagului. În continuare se aplic o pic tur de filtrat care con ine fag (cutiaă ă ă ţbacterii omologe fagului. În continuare se aplic o pic tur de filtrat care con ine fag (cutiaă ă ă ţ poate fi înclinat ca pic tura s se preling ). Cutia se incubeaz la 37ă ă ă ă ăpoate fi înclinat ca pic tura s se preling ). Cutia se incubeaz la 37ă ă ă ă ă °° C timp de 24 ore. C timp de 24 ore. ApreciereaAprecierea: dac în filtrat se aflau fagi omologi culturii bacteriene, în locul aplic rii filtratului seă ă: dac în filtrat se aflau fagi omologi culturii bacteriene, în locul aplic rii filtratului seă ă observ o zon de liz (colonie negativ de fag). ă ă ă ăobserv o zon de liz (colonie negativ de fag). ă ă ă ăMetoda FURTMetoda FURT. . Filtratul ce con ine fagi se amestec cu geloz topit şi se toarn în cutia Petri.ţ ă ă ă ăFiltratul ce con ine fagi se amestec cu geloz topit şi se toarn în cutia Petri.ţ ă ă ă ă Suprafa a cutiei se împarte în 4 sectoare. În fiecare sector se îns mân eaz în striuri culturiţ ă ţ ăSuprafa a cutiei se împarte în 4 sectoare. În fiecare sector se îns mân eaz în striuri culturiţ ă ţ ă cunoscute de diferite bacterii. Incubare la 37cunoscute de diferite bacterii. Incubare la 37°°C 24 ore.C 24 ore.ApreciereaAprecierea: lipsa creşterii bacteriilor într-un sector indic prezen a fagului omolog.ă ţ: lipsa creşterii bacteriilor într-un sector indic prezen a fagului omolog.ă ţMetoda FISHERMetoda FISHERSimilar cu metoda Furt, doar c suprafa a cutiei se împarte în 10 cadrane, astfeă ă ţSimilar cu metoda Furt, doar c suprafa a cutiei se împarte în 10 cadrane, astfeă ă ţ l pot fil pot fi îns mân ate 10 culturi bacteriene şi pot fi indica i concomitent mai mul i fagi. ă ţ ţ ţîns mân ate 10 culturi bacteriene şi pot fi indica i concomitent mai mul i fagi. ă ţ ţ ţ

TITRAREA BACTERIOFAGILORTITRAREA BACTERIOFAGILOREste utilizat pentru determinarea num rului de fagi virulen i în prelevat sau cultur .ă ă ţ ăEste utilizat pentru determinarea num rului de fagi virulen i în prelevat sau cultur .ă ă ţ ăMetodele de titrare a bacteriofagului Metodele de titrare a bacteriofagului Titrarea bacteriofagului în mediu lichid (metoda Appelman)Titrarea bacteriofagului în mediu lichid (metoda Appelman)Titrarea bacteriofagului în mediu solid (metoda Gratia)Titrarea bacteriofagului în mediu solid (metoda Gratia)

24

APPELMAN – la dilu ii logaritmice a culturii de fag (10ţAPPELMAN – la dilu ii logaritmice a culturii de fag (10ţ -1-1.....10.....10-10-10) în bulion peptonat se adaugă) în bulion peptonat se adaugă suspensie bacterian omolog fagului examinat. Dup 24 ore de incubare la 37ă ă ăsuspensie bacterian omolog fagului examinat. Dup 24 ore de incubare la 37ă ă ă °° C se apreciază C se apreciază titrul faguluititrul fagului: : dildiluu ia maxim a fagului care înc mai provoac liza bacteriilor (mediu clar).ţ ă ă ăia maxim a fagului care înc mai provoac liza bacteriilor (mediu clar).ţ ă ă ăGRATIA.GRATIA. Dup dilu ia logaritmic a fagului şi ad ugarea culturii bacterieneă ţ ă ăDup dilu ia logaritmic a fagului şi ad ugarea culturii bacterieneă ţ ă ă , , con inutul fiec ruiţ ăcon inutul fiec ruiţ ă tub se amestec cu geloz topit şi amestecul se toarn în cutii Petriă ă ă ătub se amestec cu geloz topit şi amestecul se toarn în cutii Petriă ă ă ă . . Dup 24 ore de incubareăDup 24 ore de incubareă la 37la 37°°C se num r plajele formate (coloniile negative de fagi).ă ăC se num r plajele formate (coloniile negative de fagi).ă ă Num rul plajelor corespunde cuăNum rul plajelor corespunde cuă nr de fagi virulen i din materialul de examinat. ţnr de fagi virulen i din materialul de examinat. ţ

APLICAREA PRACTIC A FAGILORĂAPLICAREA PRACTIC A FAGILORĂÎn domeniul În domeniul terapeuticterapeuticTratamentul şi profilaxia maladiilor infec ioaseţTratamentul şi profilaxia maladiilor infec ioaseţÎn domeniul În domeniul diagnosticdiagnosticFago-identificareaFago-identificarea – identificarea tulpinilor bacteriene necunoscute cu ajutorul fagilor omologi – identificarea tulpinilor bacteriene necunoscute cu ajutorul fagilor omologi (metoda Otto, Furt, etc)(metoda Otto, Furt, etc)LizotipizareaLizotipizarea (fagotipajul). Permite diferen ierea unor tulpini din cadrul aceleeaşi speciiţ (fagotipajul). Permite diferen ierea unor tulpini din cadrul aceleeaşi speciiţ (subdivizarea speciei în lizotipuri/fagovaruri). Este utilizat pentru tulpini de (subdivizarea speciei în lizotipuri/fagovaruri). Este utilizat pentru tulpini de StaphylococcusStaphylococcus aureus,aureus, SalmonellaSalmonella Typhi, ş.a. Typhi, ş.a.Lizotipul reprezint un marker epidemiologic.ăLizotipul reprezint un marker epidemiologic.ăFagii reprezint un model de studiu pentru geneticieni, fagii tempera i se utilizează ţ ăFagii reprezint un model de studiu pentru geneticieni, fagii tempera i se utilizează ţ ă în ingineria genetic (ei pot asigura transferul de material genetic prin transduc ie).ă ţîn ingineria genetic (ei pot asigura transferul de material genetic prin transduc ie).ă ţ

36. Virusurile. Natura. Particularit ile biologice. Principiile de clasificare. Formaăţ si dimensiunile virusurilor. Metodele de studiu.

Virusuri = gene vagabonde = particule infectioase autonome, caracterizate prin :1. structura speciala : proteine + AN2. lipsa sist. metabolice3.

myxovirusuri : AN + capsida = nucleocapsidareovirusuri : ARN dublu catenarParticularit ile virusurilorăţReprezint structuri acelulare cu poten ial infec iosă ţ ţSunt lipsite de metabolism propriu, fiind parazi i obliga i intracelulariţ ţNu cresc pe medii artificiale, numai pe celule viiGenomul viral este constituit dintr-un singur tip de AN (ADN sau ARN)Nu cresc şi nu se divid, ci se reproduc în celule viiDimensiuni de rangul nm (20-400 nm)Rezisten natural la antibioticeţă ă

Rol capsida :1. adsorbtie (exceptie – virusuri cu supercapsida)2. antigenitate virala specifica ???

Virusurile cu supercapsida realizeaza absorbtia prin intermediul ei utilizarea detergentilor pt inlaturararea supercapsidei inlaturare virulenta.

CLASIFICAREA VIRUSURILORDup tipul AN (ă cu genom ARN/ADN)Dup dimensiuniă (mici – 20-50 nm, medii – 50-150 nm, mari – peste 150 nm)Dup tipul de simetrie a capsideiă (helicoidal , cubic , mixt )ă ă ă Dup gazdă ă (om, animal, insect , bacterie)ăDup sensibilitatea în mediul externă , etcVirusuri ADN : Parvoviridae, Hepadnaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, PoxviridaeVirusuri ARN+: Picornaviridae, Caliciviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, RetroviridaeVirusuri ARN- : Rhabdoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, FiloviridaeVirusuri ARNd.c. : Reoviridae

Virion – unitate structural infec ioas a virusului ă ţ ăViroid – ARNm.c., circular, asociat cu boli la plante

25

Prion – protein termostabil infec ioas , cauzeaz la om boala ă ă ţ ă ă Kuru, Creutzfeldt-Jacob, sindromul Gerstmann-Straussler, scrapie la oi

COMPOZI IA CHIMIC ŞI STRUCTURA VIRIONULUIŢ ĂVirusurile simple – AN şi înveliş proteic – capsida (nucleocapsid )ăVirusurile complexe – nucleocapsid şi un înveliş extern, lipoglicoproteic (supercapsid , peplos)ă ă

AN – ADN sau ARN, mono- sau bicatenar, linear, circular sau fragmentat.ARN monocatenar : ARN+ (caten cu sens, ARNm) sau ă ARN- (caten f r sens)ă ă ăFunc ia ANţ – asigurarea replic rii şi expresia genomului pentru sinteza proteică ăCapsida – format din unit i proteice, ă ăţ capsomere, aranjate simetric.

Simetrie helicoidală – capsomerele se fixeaz pe catena de AN, form de bastonaşă ăSimetrie cubică (icosaedric ) – capsomerele se aranjeaz în jurul AN, formând un icosaedruă ă (poliedru regulat cu 20 fe e triungiulare şi 12 vârfuri),ţ eikos=20Simetrie mixtă (bacteriofagii, poxvirusurile)

Func iaţ – protec ia AN, rol antigenic, adeziuneţSupercapsida – structur glucido-lipido-proteic , derivat din membrana celuleiă ă ă gazd (lipidele din membrana celular , glicoproteinele proprii)ă ăFunc ieţ – protec ie, antigene de suprafa , adeziuneţ ţăUnele virusuri con in enzime – polimeraze, transcriptaze, etc. ţ

Ac iunea factorilor fţ izici, chimiciVirusurile sunt foarte sensibile la c ldur , desicare, UV. Detergen ii şi solven iiă ă ţ ţ inactiveaz virusurile cu supercapsid . ă ăPot fi conservate prin liofilizare sau la -80 C

REPRODUCEREA VIRUSURILORI ADSORB IA virusului la celula-gazd prin Ţ ă intermediul receptorilor specifici (tropism)II PENETRAREA virusului în celulă

Pinocitoz (viropexis) ăFuziunea membranelorTranslocareInjectarea AN în citoplasmă

III DECAPSIDAREA (enzime celulare)IV BIOSINTEZA (sinteza proteinelor şi replicarea AN)Are loc în citoplasm (virusuri cu ARN) sau nucleul celulei (virusuri cu ADN)ă

Biosinteza virusurilor ADNADNdc transcrierea ARNm transla ia (precoce, tardiv ), replicareaţ ă sinteza proteică

Biosinteza virusurilor ARN ARN+ transla ie, replicare sinteza proteicţ ăARN- transcriere ARNm transla ie, replicare sinteza proteicţ ă Retrovirusuri (ARN+) transcriere ADN- ADNdc transcriere ARNm replicare, transla ie, sinteza pr. (sau integrare în cromosom)ţ

V. MORFOGENEZA (asamblarea) virionilorProteinele capsidale particip la formarea nucleocapsidei (nucleu,citoplasm ),ă ă glicoproteinele sunt inserate în MCP, substituind proteinele celulare. Contribuie la apari iaţ incluziunilor sau a corpusculilor elementari.VI. ELIBERAREA virionilor (liza celulei, înmugurire, exocitoz ) ăInterferen a viralţ ă – fenomen în care, consecutiv infec iei unei celule cu 2 virusuri,ţ multiplicarea unuia este inhibat (virus interferat / virus interferent)ă

37. Virusurile simple si complexe. Structura virionului. Etapele de interactiune a virionului cu celula gazda.

RELA II VIRUS-CELULA GAZDŢ ĂInfec ie viral productiv , citocidţ ă ă ăVirusul este infec ios iar celula permisiv . La nivelul ma/o corespunde infec iilor acute,ţ ă ţ aparente sau inaparente (grip , rujeol )ă ăInfec ii virale persistenteţCelulele infectate supravie uiesc cu producerea permanent sau intermitent a virusului.ţ ă ă

26

Infec ii abortive ţ cu virioni defectivi – infec ia nu se exprim , are loc transformarea celulelorţ ă prin proteine virale. Ele devin int pentru efectorii imunit ii (macrofage, T-limfocite) înţ ă ăţ cursul unor infec ii cronice (PESS post-rujeolic )ţ ăInfec ii integrateţ (virusuri ADN sau copii ADN ale Retrovirusurilor)Transformarea malign a celulei gazd ă ăManifestarea infec iei dup o perioad de incuba ie îndelungat cu expresia integral aţ ă ă ţ ă ă genomului viral (HIV-SIDA) – infec ii lenteţReactiv ri ocazionale, repetate ale infec iei cu exprimarea integral a informa iei geneticeă ţ ă ţ virale (infec ia herpetic ) – infec ii latenteţ ă ţInfec ii cronice – perioade de remisie şi acutizare, virusul este prezent permanent, chiar înţ absen a simptomelor (hepatita viral B)ţ ăTERAPIA ANTIVIRALĂDificult iăţ :Toxicitate (imposibil de a distruge virusul f r afectarea celulei!)ă ăApari ia mutantelor rezistenteţActivitate asupra virusului în faz de multiplicare ăCostul avansat al tratamentuluiPrimele preparate antivirale – anticanceroase.Preparatele antivirale contemporane:Nu manifest activitate virucid , doar inhib reproducerea virală ă ă ăSunt dirijate contra etapelor reproducerii virale Adeziunea virusului la celulăMecanismul – blocarea receptorilor celulari (HIV-oligopeptidul T, care reproduce gp120; CD4 solubili)Dificult i: afinitate redus , degradare rapidăţ ă ăFuziunea, penetrareaReprezint peptide sintetice (ă pentafuzida-T20, T1249) blocheaz fuziunea virusului HIV cuă membrana celular (dificultate – injec ii s/c zilnice)ă ţDecapsidareaAmantadina, rimantadina inhib decapsidarea virusului gripal AăUtilizare limitat – dezvoltarea rezisten eiă ţ

ReplicareaMecanismul – blocheaz activitatea enzimelor virale de reproducere (transcriptaze,ă polimeraze, replicaze)Avantaj – nu influen eaz componentele celulei-gazdţ ă ăAnalogi nucleozidiciSe disting de nucleozidele naturale prin modificarea componentului glucidic sau a bazei purinice sau pirimidinice. Blocheaz elongarea catenei de ADN în curs de formare. ăAntiherpetice (aciclovir, ganciclovir, penciclovir, idoxuridin)Anti-HIV (zidovudin, didanozin, zalcitabin, stavudin, lamivudin, etc)Anti-HBV (entecavir, LdT, LdC – faz de cercetare) ă

Analogi nucleotidici Cidofovir-CMV, HSV adefovir- HIV, HBV, HSV, CMV tenofovir – HIV, HBVAnalog al pirofosfatului Foscarnet – HSV, CMV (HIV, HBV -?)Inhibitori nenucleozidici ai RT HIV (nevirapin, delavirin, efavirenz)

Blocarea activit ii polimerazelor virale se realizeaz prin:ăţ ăCompeti ie cu substratul natural al enzimeiţÎngr m direa steric a centrului activ al enzimei ă ă ăIncorporarea în catena de ADN în curs de sintezăBlocarea procesului de elongare a catenei de ADN prin incapacitatea de a fixa un alt nucleozid pe analogul s u artificialăAsamblarea, eliberarea

27

Inhibitori ai proteazei HIV (sanquinavir, ritonavir, indinavir, amprenavir, lopinavir, nelfinavir, etc) – toxicitate, rezistenţăInhibitori ai neuraminidazei virusurilor gripale (zanamivir, oseltamivir). Activ contra gripei Aă şi B (efect preventiv, curativ, rezisten rar )ţă ă

INTERFERONII (IFN)IFN – ansamblu de proteine capabile s confere celulelor o stare de rezisten la o infec ieă ţă ţ viral .ăIFN tip 1 (clasic, antiviral):IFN-alfa (leucocitar)IFN-beta (fibroblastic) Inductori: virusuri, LPS, ARN bicatenarIFN-gama, tip 2, imun, produs de LT activate, NK. Manifest activitate imunomodulatoareăIFN ac ioneaz asupra ciclului de replicare viral prin intermediul celulei: interac iunea IFN-ţ ă ă ţalfa cu receptorul s u induce sau stimuleaz expresia unor gene celulare, rezultând oă ă activitate antiviral (blocarea transla iei ARNm viral, degradarea ARNm viral). Este posibil şiă ţ ă blocarea asambl rii şi înmuguririi virusului (HIV)ăIFN m resc expresia moleculelor clasa I a CMH, iar IFN-gama şi a celor de clasa II ăIFN m resc activitatea intrinsec şi extrinsec a macrofagelor şi manifest activitateă ă ă ă antiproliferativăIFN-gama activeaz celulele NK ă

Utilizarea terapeutică a IFN–hepatite B şi C cronice, infec ii herpetice, sarcomul Kaposi,ţ limfome, leucemiiAlte citokine (TNF-a, IL-2, IL-4, IL-10, IL-12) sunt la etapa de testare in vitro.TERAPIA CELULAR (CĂ MV, EBV)Fondat pe administrarea CTL (limfocite Tc) autologe.ăPrelevarea sângelui de la bolnavIzolarea CTL specificeClonarea şi proliferarea CTL in vitroReinjectarea la pacient VIITOR: fototerapia, imunizarea intracelular (introducerea unei gene ce codific un anticorpă ă antiviral)

38.Culturile celulare. Tipurile. Izolarea virusurilor pe culturi de celule. Metodele de indicare si i dentificare a virusului izolat.

CULTIVAREA VIRUSURILORVirusurile sunt cultivate pentru:Stabilirea diagnosticului etiologicTestarea infec iozit ii virusurilorţ ăţTestarea preparatelor antiviraleProducerea vaccinurilorSISTEME DE CULTIVARECulturi de celuleOu embrionat de g ină ăAnimale de laborator

Animalele de laborator se utilizeaz limitat (receptivitate selectiv , preexisten a infec iilor,ă ă ţ ţ cost avansat). Se recurge numai când nu exist alte posibilit i (VHB, HIV, Coxsackie, etc).ă ăţ Constituie modele de cercetare sau de control al vaccinurilor. Animalele utilizate curent – şoriceii albi nou-n scu i, dar pot fi utiliza i şobolani, cobai, maimu e, etc. ă ţ ţ ţRegulile de lucru cu animalele de laborator (selectare, inoculare, examinare) sunt identice cu cele din infec iile bacteriene. ţOul embrionat de g ină ă (5-13 zile) reprezint un mediu de celule nediferen iate, cuă ţ multiplicare activ , steril şi lipsit de mijloace de ap rare antiinfec ioas . Se utilizeaz înă ă ţ ă ă prepararea unor vaccinuri virale (ex.: gripal)Ini ial se verific viabilitatea embrionului la ovoscop în camera obscur . ţ ă ăPrelevatul se inoculeaz steril cu seringa în cavitatea amniotic sau alantoidean , sau peă ă ă membrana chorioalantoidean (utilizând metoda deschis sau închis ). ă ă ă

28

Orificiul se parafineaz şi se incubeaz la 35-37 C timp de 48-72 ore ă ă

Culturile de celule (1949 - Enders, Weller, Robbins). Celulele provenite din esuturi adulte sau embrionare, normale sau tumorale, plasate într-unţ mediu adecvat (nutrien i, pH, t) r mân viabile şi se multiplic . Pentru cultivarea virusurilorţ ă ă se utilizeaz culturile în monostrat celular.ăTipurile de culturi de celule:Culturi primare (primar tripsinizate). Sunt ob inute din esuturi adulte sau embrionare deţ ţ origine animal sau uman . Suport 4-6 pasaje (subcultiv ri)ă ă ă ăCulturi diploide. Ob inute din esut embrionar (MRS5, fibroblaste umane). Pot fi subcultivateţ ţ 40-50 genera ii ţLinii continui de celule. Ob inute din esut tumoral. Pot fi subcultivate nelimitat.ţ ţHeLa – carcinom de col uterinKB – tumoare a rinofaringeluiHep-2 – tumoare canceroas a laringelui ă

Ob inera culturilor de celule primar tripsinizateţ :Prelevarea esutului (ex.: rinichi de maimu )ţ ţăFragmentarea şi sp larea cu sol fiziologică ăDezagregarea tisular cu enzime proteoliticeăSepararea celulelor prin centrifugareDozarea suspensiei 105 – 106 celule/ml Întroducerea celulelor în mediu nutritiv şi repartizarea în recipiente sterileIncubarea pân la formarea monostratului celular (inhibi ie de contact)ă ţMonostratul poate fi infectat cu virus sau serveşte drept surs de celule pentru o nouă ă cultivare (pasaj)

Mediile de cultură pentru culturi de celule con in AA, Vit, factori de creştere, s ruri mineraleţ ă (Eagle, Hanks, 199, hidrolizat de lactalbumină, etc), roşu fenol pentru monitorizarea pH (vireaz în galben în mediu acid)ăMediile de creştere sunt îmbog ite cu ser sangvin (uman, animal) – pentru cultivarea CCăţMediile de între inereţ se utilizeaz pentru men inerea monostratului în procesul reproduceriiă ţ virale. Nu con in ser. ţCC reprezint sistemul virus-gazd predilect în virologia clinic şi cercetare.ă ă ăInocularea CC Se aleg tuburi cu monostrat bine formatSe înl tur mediul de creştere, se spal cu sol. Hanks ă ă ăSe inoculeaz 0,1 – 0,2 ml de prelevatăPeste 30-60 min în tuburi se toarn câte ă1 ml mediu de între inereţSe întroduc în termostat la t adecvat 3-4 zile ă

39.Izolarea virusurilor in ou embrionar de gaina. Metodele de infectare. Indicarea si identificarea virusului izolat.

40.Metoda virusologica in diagnosticul virozelor. Materiale de examinat (prelevate) de la bolnav. Regulile de recoltare, ambalare si conditiile de transportare in laborator. Pregatirea pobelor pentru examinare in metoda virusologica. Etapele si esenta lor.

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL VIROZELORIndica iiţ : Boli cu m suri terapeutice sau profilactice speciale (SIDA, hepatite, rubeola, etc)ăElucidarea etiologiei virale a unor izbucniri epidemice (meningite, gastro-enterite, pneumonii, etc)Supravegherea epidemiologicăPrelevate: LCR, sânge, exsudate, secre ii nazale, rino-faringiene, mase fecale, urin , veziculeţ ă şi ulcera ii cutaneo-mucoase, bioptate, etc.ţ

29

Eficacitatea diagnosticului este condi ionat de:ţ ăAlegerea corect a prelevatelor, calitatea lor şi transportarea în laboratorăExaminarea precoce (la debutul bolii)Transportarea rapid a probelor sau utilizarea mediului de transport ăRespectarea regulilor de autoprotec ie şi de protec ie a anturajului la recoltare, transportareţ ţ şi examinarea probelor

METODELE DE DIAGNOSTIC AL VIROZELORMETODE DIRECTEExamenul virusoscopic (eviden ierea direct a virionului sau a componentelor lui înţ ă prelevate)Examenul virusologic (izolarea şi identificarea virusului)Detectarea Ag virale în prelevatIdentificarea genomului viral (hibridizarea AN, amplificarea genic – PCR)ăMETODE INDIRECTESerodiagnosticul (creşterea de cel pu in 4 ori a titrului Ac în dinamic )ţ ăEXAMENUL VIRUSOSCOPICMicroscopia optică – depistarea în prelevat a incluziunilor virale specifice (corpusculii Guarnieri în variol , Babeş-Negri în rabie) sau nespecifice, citoplasmatice sau nucleare. Seă prepar frotiuri sau frotiuri-amprente colorate Ră omanovschi-Giemsa sau cu fluorocrom Microscopia electronicăImunoelectronomicroscopia – mai sensibil , mai specific . Se examineaz complexele imuneă ă ă virus – AcImunofluorescen a ţ (direct şi indirect ) – utilizat în diagnosticul rapid al virozelor ă ă ăEXAMENUL VIRUSOLOGICPrelucrarea prealabil a prelevatelor:ăOmogenizarea (dup necesitate) ăÎnl turarea elementelor celulare, inclusiv bacteriene (centrifugare, ultrafiltrare)ăTratarea cu antibiotice pentru prevenirea creşterii bacteriilor şi fungilor contaminan iţ (penicilin - 500 UA/ml, streptomicin – ă ă500 UA/ml, nistatin - 20 UA/ml)ăEtapele diagnosticului virusologicIzolarea virusuluiEviden ierea (indicarea) reproducerii viraleţIdentificarea virusuluiIzolarea virusului se realizeaz prin inocularea cu material de examinat a animalelor deă laborator, embrionilor de g in sau a culturilor de celule. Alegerea sistemului de cultivare seă ă efectueaz în func ie de particularit ile biologice ale agentului etiologic probabil şiă ţ ăţ posibilit ile laboratorului.ăţINDICAREA VIRUSULUIÎn culturi de celuleECP – modific ri degenerative şi distrugere celular , rezultat al multiplic rii virale (rotunjireă ă ă sau retrac ie celular , citoliz , apari ia vacuolelor sau granulelor în citoplasm , picnozaţ ă ă ţ ă nucleului, fuziunea membranelor, etc). ECP poate fi studiat la microscopul optic pe celule necolorate sau colorate cu hematoxilin-eozin , Giemsa, fluorocrom. ăIncluziuni viraleReprezint acumul ri paracristaline de virioni sau de componente virale în aria de replicareă ă şi asamblare a virusurilor (citoplasm , nucleu). Colora ia Giemsa, hem-eozin , fluorocrom.ă ţ ă Localizarea, forma şi afinitatea tinctorial (bazofile, acidofile) sunt particularit i diagnosticeă ăţ pentru unele viroze.Interferen a ţEx.: V.rubeolic nu produce ECP, dar determin fenomenul de interferen . Pentru detectareaă ţă V.rubeolei se infecteaz CC cu virus citopatogen. Lipsa multiplic rii acestui virus confirmă ă ă prezen a V.rubeolei. ţHemadsorb ia (RHAd) – pentru virusuri cu HAţUnele virusuri posed în componen a capsidei, în special supercapsidei, glicoproteine careă ţ pot adera la suprafa a hematiilor – HA.ţÎn timpul eliber rii din celul prin înmugurire a acestor virusuri, HA lor se afl deja înserate înă ă ă MCP la nivelul mugurelui. Dac la aceasta etap în recipientul cu monostrat celular seă ă

30

adaug suspensie de hematii şi se men ine 15-20 min la t caracteristic fiec rui virus, laă ţ ă ă microscop pot fi urm rite hematiile fixate la suprafa a celulelor infectate (RHAd).ă ţ

Hemaglutinarea (RHA)Pentru virusurile cu HA acumulate în mediul de între inere. În acest caz mediul de între inereţ ţ aglutineaz eritrocitele unor specii de mamifere sau p s ri.ă ă ăFormarea plajelor Reprezint focare de celule alterate în monostratul celular acoperit cu agar. Num rareaă ă plajelor permite cuantificarea virusului infectant.Proba culoriiMetabolismul celular neafectat – virajul culorii mediului din roşu în galben (pH acid)Metabolismul celular inhibat – culoarea mediului nu se modific ă

Indicarea virusului în oul embrionat de g ină ăOu le se r cesc 18 ore la +4 grade C pentru o vazoconstric ie maxim , apoi aseptic se taieă ă ţ ă coaja, se recolteaz lichidul alantoic sau amniotic, iar MCA şi embrionul se întroduc în cutiiă Petri sterile. Se observ :ăMoartea embrionuluiApari ia modific rilor (hemoragii, pustule) pe MCAţ ăAcumularea de HA în lichideIndicarea virusului pe animale de laboratorBoala manifest a animalului, decesăUrm rirea virusului în organele- int :ă ţ ăHemaglutinareInfec iozitatea omogenatelorţExamene histopatologice (leziuni inflamatorii, degenerare, incluzii virale specifice: corp. Babeş-Negri în neuronii infecta i cu V.rabic, etc)ţIdentificarea virusurilorDeterminarea genului, speciei şi serotipului de virus prin stabilirea structurii antigenice. Se efectueaz cu ajutorul serurilor ă imune specifice antivirale în diferite reac ii serologice:ţRNRIHA/RIHAdRFCRIFRIE (ELISA) ARI, etc

DETECTAREA AG VIRALE ÎN PRELEVATEAvantaje: simplitatea şi rapiditatea examenului, nu necesit men inerea infec iozit iiă ţ ţ ăţ virusuluiDezavantaje: sensibilitate direct propor ional cu cantitatea virusului din prelevatţ ăSe utilizeaz Ac policlonali de origine uman (seruri imune) sau Ac monoclonali (de origineă ă murin )ăReac ii: ţ RHAI, RLA, RIF, RIE, Western-blot, ARI, etc.IDENTIFICAREA GENOMULUI VIRAL(punerea în eviden a AN virali din prelevate în cursul infec iilor virale acute sau cronice şiţă ţ monitorizarea tratamentului).Pot fi examinate toate esuturile şi lichidele biologice.ţHibridizarea acizilor nucleici f r amplificareă ăHibridizarea dup amplificare (PCR şi variantele ei)ăDIAGNOSTICUL SEROLOGICEsen aţ : depistarea Ac sintetiza i de gazd în r spuns la o infec ie viral .ţ ă ă ţ ăDup o primo-infec ie are loc inducerea form rii Ac, iar dup o reinfec ie sau reactivare titrulă ţ ă ă ţ Ac creşte în dinamic . ăÎn serodiagnosticul virozelor este obligator de a examina 2 probe de ser de la bolnav : prima prelevat la debutul bolii, al doilea prelevat peste 15 zile. ăAc sunt depista i în ser, uneori în LCR, exsudate, lichid articular, etc. ţ

31

Pentru depistarea Ac se utilizeaz Ag virale de referin (suspensie viral inactivat , proteineă ţă ă ă virale native sau recombinante, oligopeptide sintetice).Tehnici utilizate: RFC, RIHA, RHAI, RN, RIFI, ARI, AIE (ELISA), etc. Semnifica ie diagnosticţ ă prezint ă trecerea titrului de Ac de la 0 la pozitiv (seroconversie, primo-infec ie) sau ţ creşterea titrului Ac de cel pu in 4 oriţ în cursul infec iei. Ambele seruriţ vor fi testate în aceeaşi zi, prin tehnici identice şi în acelaşi laborator.

41. Rolul microorganismului in procesul infec tios. Notiune de mi/o patogene. Patogenitatea si virulenta mi/o. Unitatile de virulenta. Utilizarea practica a atenuarii dirijate a virulentei.INFEC IA – totalitatea proceselor biologice care se produc în ma/o în urma penetr rii mi/oŢ ăINFEC IA – totalitatea proceselor biologice care se produc în ma/o în urma penetr rii mi/oŢ ă patogene sau ppatogene sau potenotenţţial ial ppatogene (PP)atogene (PP). . PROCESUL INFEC IOS – interac iunea dintre mi/o şi ma/o în diverse condi ii ale mediuluiŢ ţ ţPROCESUL INFEC IOS – interac iunea dintre mi/o şi ma/o în diverse condi ii ale mediuluiŢ ţ ţ ambiant. Manifestarea lui poate fi ambiant. Manifestarea lui poate fi inaparentăinaparentă / / asimptomaticăasimptomatică (stare de portaj s n tos,ă ă (stare de portaj s n tos,ă ă eliminarea rapid a mi/o) sau ăeliminarea rapid a mi/o) sau ă simptomaticăsimptomatică..MALADIA INFEC IOAS – manifestarea suprem a procesului infec ios Ţ Ă ă ţMALADIA INFEC IOAS – manifestarea suprem a procesului infec ios Ţ Ă ă ţ diferite simptomediferite simptome efectele metaboli ilor microbieni (toxine, enzimeţefectele metaboli ilor microbieni (toxine, enzimeţ , etc, etc) sau de reac ia imun a gazdei laţ ă) sau de reac ia imun a gazdei laţ ă prezen a bacteriei. ţprezen a bacteriei. ţ

Particularit ile bolii infec ioaseăţ ţParticularit ile bolii infec ioaseăţ ţ1. provocatprovocata de agen i patogeni ţa de agen i patogeni ţ2. Contagiozitate (capacitatea de a se transmite de la o surs la ăContagiozitate (capacitatea de a se transmite de la o surs la ă o o persoan receptiv )ă ăpersoan receptiv )ă ă3. Specificitate (un agent provoac o infec ie, ex.: ă ţSpecificitate (un agent provoac o infec ie, ex.: ă ţ Clostridium tetaniClostridium tetani este agentul este agentul

tetanosului, etc.)tetanosului, etc.)4. Evolu ie clinic ţ ăEvolu ie clinic ţ ă stadialăstadială5. Imunitate la reinfec ieţImunitate la reinfec ieţ (durat variabil )ă ă(durat variabil )ă ă6. Apari ia maladiei depinde de multipli factori, în special de ţApari ia maladiei depinde de multipli factori, în special de ţ capacitatea agentului cauzalcapacitatea agentului cauzal

de a provoca maladiade a provoca maladia şi de şi de gradul de rezisten aţăgradul de rezisten aţă ll gazdei gazdei la aceast invazieă la aceast invazieă

ROLUL MICROORGANISMULUI ÎN PROCESUL INFEC IOS. PATOGENITATEA ŞIŢROLUL MICROORGANISMULUI ÎN PROCESUL INFEC IOS. PATOGENITATEA ŞIŢ VIRULEN AŢVIRULEN AŢRela iile dintre mi/o şi ma/o gazd : ţ ăRela iile dintre mi/o şi ma/o gazd : ţ ăComensalismComensalism (flora bucal , intestinal , etc)ă ă (flora bucal , intestinal , etc)ă ăParazitism Parazitism (prezen a mi/o este nociv pentru ma/o) ţ ă(prezen a mi/o este nociv pentru ma/o) ţ ăOrice mi/o “parazit” capabil s provoace o infec ie (în condi ii adecvate) este consideră ţ ţOrice mi/o “parazit” capabil s provoace o infec ie (în condi ii adecvate) este consideră ţ ţ at at p a t op a t o g e n. g e n. Exist 2 tipuri de mi/o patogene:ăExist 2 tipuri de mi/o patogene:ă

Obligat (cert) patogeneObligat (cert) patogene, care infecteaz persoane imunocompetente cu doze mici ă, care infecteaz persoane imunocompetente cu doze mici ăPoten ial patogeneţPoten ial patogeneţ (oportuniste), care pot cauza infec ie numai cu doze mari sau laţ (oportuniste), care pot cauza infec ie numai cu doze mari sau laţ persoane imunocompromise (deseori fac parte din flora normal a organismului)ăpersoane imunocompromise (deseori fac parte din flora normal a organismului)ă

Mi/o patogene pot fi g zduite uneori f r a provoca maladia, astfel de persoane sunt numiteă ă ăMi/o patogene pot fi g zduite uneori f r a provoca maladia, astfel de persoane sunt numiteă ă ă purt tori ăpurt tori ă s n toşi de germeni.ă ăs n toşi de germeni.ă ăMicroorganismele patogene se caracterizeaz prin:ăMicroorganismele patogene se caracterizeaz prin:ă

• PatogenitatePatogenitate – capacitatea unei bacterii de a declanşa infec ia. Este ţ – capacitatea unei bacterii de a declanşa infec ia. Este ţ un un caracter de speciecaracter de specie determinat genetic (cromozom, plasmide, bacteriofagi). În cadrul unei specii patogene potdeterminat genetic (cromozom, plasmide, bacteriofagi). În cadrul unei specii patogene pot exista tulpini cu manifestare variat a patogenit ii – de la absen a total pân la foarteă ăţ ţ ă ăexista tulpini cu manifestare variat a patogenit ii – de la absen a total pân la foarteă ăţ ţ ă ă înalt .ăînalt .ă

• VirulenţăVirulenţă – gradul de patogenitate a – gradul de patogenitate all unei unei tulpinitulpini (m sur cantitativ a patogenit ii). Seă ă ă ăţ (m sur cantitativ a patogenit ii). Seă ă ă ăţ apreciaz prin infectarea animalelor de laborator cu cantit i diferite de mi/o.ă ăţapreciaz prin infectarea animalelor de laborator cu cantit i diferite de mi/o.ă ăţ

Unit ile de virulen :ăţ ţăUnit ile de virulen :ăţ ţăDLM – num rul de bacterii necesar pentru a ucide 80% ăDLM – num rul de bacterii necesar pentru a ucide 80% ă din din animaleanimalelele infectate infectateDLDL50 50 – 50% letalitate– 50% letalitateDCL – 100% letalitateDCL – 100% letalitateDIDI5050/DI/DI – provoac boala la 50%ă – provoac boala la 50%ă / 80% / 80% animale animale

Modificarea virulen ei:ţModificarea virulen ei:ţAmplificareaAmplificarea prin transfer prin transfer şi recombinare genetic , condi ii optime pentru creştereă ţşi recombinare genetic , condi ii optime pentru creştereă ţ

32

ReducereaReducerea (atenuarea) prin men inerea bacteriilor în condi ii nefavorabile (t, factori chimici,ţ ţ (atenuarea) prin men inerea bacteriilor în condi ii nefavorabile (t, factori chimici,ţ ţ etc)etc), muta, muta iiţiiţ

42. Caracteristica mi/o patogene. Factorii de patogenitate. Clasificarea. Rolul factorilor de patogenitate de structura si al enzimelor de patogenitate in evolutia infectiei.Bacteria patogen trebuie:ăBacteria patogen trebuie:ă

1. S fie capabil de a se ă ăS fie capabil de a se ă ă transmitetransmite între gazde între gazde2. S ăS ă penetrezepenetreze în organismul-gazdă în organismul-gazdă3. S se ăS se ă r spândească ăr spândească ă prin organism prin organism4. S se ăS se ă multiplice şi s persisteămultiplice şi s persisteă (evitând sau distrugând sistemul imun al gazdei) (evitând sau distrugând sistemul imun al gazdei)5. S ăS ă produc leziuniăproduc leziuniă

Aceste capacit i sunt asăţAceste capacit i sunt asăţ iigurate de gurate de factorii de patogenitate.factorii de patogenitate.

Factorii de patogenitate ai bacteriilorFactorii de patogenitate ai bacteriilorFactori structurali (somatici)Factori structurali (somatici)

• AdezineAdezine - fimbriile, glicocalixul, proteine de adeziune ale peretelui celular. Asigură- fimbriile, glicocalixul, proteine de adeziune ale peretelui celular. Asigură aderarea bacteriilor la receptorii de pe suprafa a celulelor- int sau la proteine matricialeţ ţ ăaderarea bacteriilor la receptorii de pe suprafa a celulelor- int sau la proteine matricialeţ ţ ă extracelulare extracelulare (colagen, fibronectin , laminin , elastin , etc) ă ă ă(colagen, fibronectin , laminin , elastin , etc) ă ă ă

• Proteine ale sistemelor de secre ieţProteine ale sistemelor de secre ieţ (tipuri I-IV) (tipuri I-IV)• CapsulaCapsula – antifagocitar, anti-complement – antifagocitar, anti-complement Ag KAg K• Antigenul OAntigenul O - antifagocitar - antifagocitar• PeptidoglicanulPeptidoglicanul (adeziune, agresie tisular )ă (adeziune, agresie tisular )ă• Acizii Acizii teichoici/lipoteichoiciteichoici/lipoteichoici (adeziune, toxicitate) (adeziune, toxicitate)• Proteina AProteina A la stafilococi la stafilococi (ac iune antifagocitar prin fixarea Fc a IgG)ţ ă (ac iune antifagocitar prin fixarea Fc a IgG)ţ ă• Proteina MProteina M la streptococi la streptococi (adeziune, antifagocitar) (adeziune, antifagocitar)

Enzime de patogenitate Enzime de patogenitate (responsabile de persisten , diseminare şi producerea leziunilor)ţă(responsabile de persisten , diseminare şi producerea leziunilor)ţă• PlasmocoagulazaPlasmocoagulaza ( (formarea trombilor septici-formarea trombilor septici-efect antifagocitar, efect antifagocitar, propagarepropagare îîn organism)n organism)• FibrinolizinaFibrinolizina (eliberarea bacteriilor din trombi) (eliberarea bacteriilor din trombi)• HialuronidazaHialuronidaza (di (diseminarseminare, e, leziunileziuni tisular tisularee))• ColagenazaColagenaza (identic) (identic)•• Neuraminidaza (lichefierea mucusului)Neuraminidaza (lichefierea mucusului)•• Proteaze (ex.: distrugerea Ig A secretorii)Proteaze (ex.: distrugerea Ig A secretorii)•• DezaminazeDezaminaze•• Decarboxilaze Decarboxilaze •• Fosfataze, etc Fosfataze, etc

Toxine bacteriene Toxine bacteriene (responsabile de leziuni)(responsabile de leziuni)• ExotoxineExotoxine (proteice, secretate în mediul extracelular) (proteice, secretate în mediul extracelular)• EndotoxineEndotoxine (LPZ, legate de celula bacterian )ă (LPZ, legate de celula bacterian )ă

Moduline şi invazineModuline şi invazineInjectate la suprafa a sau direct în interiorul celulei- intţ ţ ăInjectate la suprafa a sau direct în interiorul celulei- intţ ţ ăInducInduc penetrarea (internalizarea) şi propagarea bacteriană penetrarea (internalizarea) şi propagarea bacterianăSe întâlnesc la Yersinia, Shigella, Salmonella, EscherichiaSe întâlnesc la Yersinia, Shigella, Salmonella, Escherichia

Al i factori ce asigur persisten a mi/o:ţ ă ţAl i factori ce asigur persisten a mi/o:ţ ă ţVaria ii antigenice ţVaria ii antigenice ţMimicria antigenicăMimicria antigenică

43. Toxinele microbiene. Tipurile de toxine si caracteristica lor . Rolul in patogeneza infectiei.Caracteristica exotoxinelorCaracteristica exotoxinelor :: Proteine produse de bacterii G+/G-Proteine produse de bacterii G+/G-Pot fi secretate în mediul extern, eliberate în spa iul periplasmic sau fixate pe suprafa a celuleiţ ţPot fi secretate în mediul extern, eliberate în spa iul periplasmic sau fixate pe suprafa a celuleiţ ţTermolabile (excep ie – enterotoxina stafilococic şi TSţ ăTermolabile (excep ie – enterotoxina stafilococic şi TSţ ă (toxina termostabil ) a ă(toxina termostabil ) a ă E. coliE. coli))Hidrosolubile şi ac ioneaz la distanţ ă ţăHidrosolubile şi ac ioneaz la distanţ ă ţăEfectul se instaleaz dup o perioad de incuba ieă ă ă ţEfectul se instaleaz dup o perioad de incuba ieă ă ă ţ

33

Manifest tropism (specificitate de ac iune)ă ţManifest tropism (specificitate de ac iune)ă ţToxicitate înalt (DLM de ordinul ng/kg)ăToxicitate înalt (DLM de ordinul ng/kg)ăExotoxinele sunt imunogene (induc sinteza Exotoxinele sunt imunogene (induc sinteza antianticcorpilororpilor - antitoxine) - antitoxine)Antitoxinele neutralizeaz activitatea exotoxinei (faza de fixare pe receptorii celulari)ăAntitoxinele neutralizeaz activitatea exotoxinei (faza de fixare pe receptorii celulari)ăExotoxinele tratate cu formol 0,4% şi men inute la 39-40ţExotoxinele tratate cu formol 0,4% şi men inute la 39-40ţ °° C timp de 3-4 s pt mâni seă ăC timp de 3-4 s pt mâni seă ă transform în anatoxine. Ele sunt lipsite de toxicitate dar p streaz imunogenitatea (utilizate înă ă ătransform în anatoxine. Ele sunt lipsite de toxicitate dar p streaz imunogenitatea (utilizate înă ă ă calitate de vaccin).calitate de vaccin).Suportul genetic al exotoxinelor: Suportul genetic al exotoxinelor: cromozomcromozom (dizenteric ), ă (dizenteric ), ă plasmide plasmide (toxina antraxului, toxina(toxina antraxului, toxina tetanic ), ătetanic ), ă profagi profagi (toxina difteric , botulinic ).ă ă(toxina difteric , botulinic ).ă ă

Tipurile de exotoxine:Tipurile de exotoxine:Toxine citolitice Toxine citolitice

Deregleaz membranele celulare prin ac iune enzimatic (fosfolipaza /lecitinaza,ă ţ ăDeregleaz membranele celulare prin ac iune enzimatic (fosfolipaza /lecitinaza,ă ţ ă sfingomielinaza) sau prin formarea porilor (streptolizinsfingomielinaza) sau prin formarea porilor (streptolizina O, a O, αα-toxina/hemolizina -toxina/hemolizina S.aureusS.aureus,, leucocidina)leucocidina)

Toxine citotoxiceToxine citotoxice, de tip A-B (ac ioneaz în interiorul celulei). Ex.: toxina difteric , botulinic ,ţ ă ă ă, de tip A-B (ac ioneaz în interiorul celulei). Ex.: toxina difteric , botulinic ,ţ ă ă ă tetanic , holeric , etcă ătetanic , holeric , etcă ă

Au structur bipartit : frac ia polipeptidic ă ă ţ ăAu structur bipartit : frac ia polipeptidic ă ă ţ ă B B ((cell bindingcell binding) este responsabil de legarea deă) este responsabil de legarea deă receptorii specifici din membrana celulei- int , frac ia polipeptidic ţ ă ţ ăreceptorii specifici din membrana celulei- int , frac ia polipeptidic ţ ă ţ ă AA ( (activeactive) p trunde înă) p trunde înă celul (prin endocitoz sau translocare) şi determin activitatea toxic .ă ă ă ăcelul (prin endocitoz sau translocare) şi determin activitatea toxic .ă ă ă ă

Fiecare Fiecare citocitotoxin ac ioneaz strict ă ţ ătoxin ac ioneaz strict ă ţ ă specificspecific::toxtoxinaina difteric – inhib sinteza proteinelor,ă ă difteric – inhib sinteza proteinelor,ă ătoxtoxinaina botulinic şi tetanic – neurotoxine, inhib eliberarea neurotransmi torilor, ă ă ă ţă botulinic şi tetanic – neurotoxine, inhib eliberarea neurotransmi torilor, ă ă ă ţătoxtoxinaina holeric şi pertusic – activeaz adenilat-ciclaza membranar , etcă ă ă ă holeric şi pertusic – activeaz adenilat-ciclaza membranar , etcă ă ă ă

Ob inerea exotoxinelor bacterieneţOb inerea exotoxinelor bacterieneţCultivarea tulpinii toxigene în mediu licCultivarea tulpinii toxigene în mediu lichidhidFiltrarea culturii pentru separarea toxineiFiltrarea culturii pentru separarea toxineiPurificarea toxineiPurificarea toxineiConcentrarea toxineiConcentrarea toxineiDeterminarea activit ii ăţDeterminarea activit ii ăţ toxinei (se mtoxinei (se măăsoarsoarăă in unit in unităţăţi de floculare – i de floculare – Lf Lf ))

Caracteristica endotoxinelor:Caracteristica endotoxinelor:CComplexe LPZ din peretele celular G- (cel mai toxic component este lipidul A).omplexe LPZ din peretele celular G- (cel mai toxic component este lipidul A).Este eliberat în urma lizei bacteriilor (sub influen a sistemului imun al gazdei sau a unor AB). ă ţEste eliberat în urma lizei bacteriilor (sub influen a sistemului imun al gazdei sau a unor AB). ă ţTermostabilăTermostabilăNe-imunogenăNe-imunogenăNu poate fi transformat în anatoxină ăNu poate fi transformat în anatoxină ăDLM de ordinul mg/kgDLM de ordinul mg/kgEfectul se manifest imediatăEfectul se manifest imediatăDetermin efecte generale, indiferent de provenien ă ţăDetermin efecte generale, indiferent de provenien ă ţă

Mecanismul de ac iune al endotoxineiţMecanismul de ac iune al endotoxineiţ : : LPZ induce secre ia unor substan e biologic active (citokine pro-inflamatoare: IL-1, IL-6, IL-8, IL-ţ ţLPZ induce secre ia unor substan e biologic active (citokine pro-inflamatoare: IL-1, IL-6, IL-8, IL-ţ ţ12, TNF-a) de c tre macrofage şi alte celule.ă12, TNF-a) de c tre macrofage şi alte celule.ăIni ial LPZ se leag de o protein seric ţ ă ă ăIni ial LPZ se leag de o protein seric ţ ă ă ă (LPS-binding protein) (LPS-binding protein) acest complex interac ioneazţ ăacest complex interac ioneazţ ă cu CD 14 de pe membrana macrofagului. Exist şi molecule solubile de CD 14, astfelăcu CD 14 de pe membrana macrofagului. Exist şi molecule solubile de CD 14, astfelă endotoxina poate s ac ioneze asupra altor celule, de ex.: celulele epiteliale. Un alt receptoră ţendotoxina poate s ac ioneze asupra altor celule, de ex.: celulele epiteliale. Un alt receptoră ţ macrofagic poate interac iona cu LPZ – receptorul ţmacrofagic poate interac iona cu LPZ – receptorul ţ toll-liketoll-like (TLR4). (TLR4). În doze mari citokinele pot provoca şocul endotoxinic (septic), comun pentru toate bacteriile G-:În doze mari citokinele pot provoca şocul endotoxinic (septic), comun pentru toate bacteriile G-: Febr (eliberarea pirogenilor IL-1, TNF de c tre celulele care au captat endotoxina)ă ăFebr (eliberarea pirogenilor IL-1, TNF de c tre celulele care au captat endotoxina)ă ă Leucopenie, urmat de leucocitoză ăLeucopenie, urmat de leucocitoză ă Tulbur ri de coagulare (activarea factorului XII – formarea fibrinei şi obstruc ia capilareloră ţTulbur ri de coagulare (activarea factorului XII – formarea fibrinei şi obstruc ia capilareloră ţ

sanguine – coagulare intravenoas diseminat )ă ăsanguine – coagulare intravenoas diseminat )ă ă Hemoragii (consumarea factorilor de coagulare) în diverse organe (rinichi, suprarenale,Hemoragii (consumarea factorilor de coagulare) în diverse organe (rinichi, suprarenale,

pl mâni, creierăpl mâni, creieră )) Vazodilatare, urmat de colaps vascular (sechestrarea periferic a sângelui, hipovolemie,ă ăVazodilatare, urmat de colaps vascular (sechestrarea periferic a sângelui, hipovolemie,ă ă

acidoz metabolic , sc derea brusc a presiunii sanguine)ă ă ă ăacidoz metabolic , sc derea brusc a presiunii sanguine)ă ă ă ă

34

În consecin au loc leziuni hemoragice şi necroz în diverse organe (rinichi, suprarenale,ţă ăÎn consecin au loc leziuni hemoragice şi necroz în diverse organe (rinichi, suprarenale,ţă ă pl mâni, creier...). ăpl mâni, creier...). ă

Pronosticul este foarte sever.Pronosticul este foarte sever.

44. Rezistenta nespecifica a macroorganismului. Notiune. Factorii care asigura rezistenta nespecifica. Rolul factorilor tisulari (de bariera) si umorali in prevenirea infectiei.P A T O G E N E Z A BOLII INFEC IOASEŢP A T O G E N E Z A BOLII INFEC IOASEŢSursa de infec ieţSursa de infec ieţ : : omulomul bolnav, reconvalescent, purt tor s n tos (infec ii antroponoze) sauă ă ă ţ bolnav, reconvalescent, purt tor s n tos (infec ii antroponoze) sauă ă ă ţ animalele animalele (infec ii zooantroponoze).ţ(infec ii zooantroponoze).ţMecanismele de transmitereMecanismele de transmitere

Prin contact (direct, indirect)Prin contact (direct, indirect) Fecal-oral (alimentar, hidric, etc)Fecal-oral (alimentar, hidric, etc) Aerogen (aer-praf, aer-pic turi) ăAerogen (aer-praf, aer-pic turi) ă TransmisiTransmisivv ( (prin intermediul prin intermediul vectorivectorilorlor)) Vertical (transplacentar) Vertical (transplacentar)

Microbii penetreaz prin tegument, mucoase sau direct în sânge (por i de intrare). Un microbă ţMicrobii penetreaz prin tegument, mucoase sau direct în sânge (por i de intrare). Un microbă ţ poate avea una sau mai multe por i de intrare.ţpoate avea una sau mai multe por i de intrare.ţDoza critic – ex.: dizenterie – 10ăDoza critic – ex.: dizenterie – 10ă 2 2 mi/o, febr tifoid – 10ă ămi/o, febr tifoid – 10ă ă 55 , holer – 10ă , holer – 10ă 99 . .

La poarta de intrare bacteria ader la celule (ăLa poarta de intrare bacteria ader la celule (ă adeziuneaadeziunea) şi se multiplic local (ă) şi se multiplic local (ă colonizareacolonizarea),), formând formând focarul primar de infec ieţfocarul primar de infec ieţ . Infec ia poate r mâne localizat sau poate s seţ ă ă ă. Infec ia poate r mâne localizat sau poate s seţ ă ă ă r spândeasc ă ăr spândeasc ă ă (invazia) (invazia) pe cale pe cale limfatic , sanguină ălimfatic , sanguină ă, , pe calea nervilorpe calea nervilor sau prin sau prin continuitatecontinuitate (din (din aproape în aproape). În esutul afectat mi/o se multiplic şi provoac leziuni direct prinţ ă ăaproape în aproape). În esutul afectat mi/o se multiplic şi provoac leziuni direct prinţ ă ă intermediul enzimelor sau toxinelor sau indirect, via mecanisme imune. intermediul enzimelor sau toxinelor sau indirect, via mecanisme imune. Mi/o se elimin cu diferite secrete sau excrete ale ma/o, prin care are loc contaminarea altorăMi/o se elimin cu diferite secrete sau excrete ale ma/o, prin care are loc contaminarea altoră gazdegazde sau obiecte. sau obiecte.Dinamica evolu iei bolii infec ioaseţ ţDinamica evolu iei bolii infec ioaseţ ţ1. Perioada de Perioada de incuba ieţincuba ieţ (de la penetrarea mi/o pân la apari ia primelor simptome). Durata –ă ţ (de la penetrarea mi/o pân la apari ia primelor simptome). Durata –ă ţ

variabil (ore – ani). Microbul se adapteaz , se multiplic , produce toxine, enzime, etc.ă ă ăvariabil (ore – ani). Microbul se adapteaz , se multiplic , produce toxine, enzime, etc.ă ă ă2. Perioada de Perioada de invazieinvazie (prodromal , de debut). Apar primele semne clinice, nespecifice (febr ,ă ă (prodromal , de debut). Apar primele semne clinice, nespecifice (febr ,ă ă

frison, inapeten , astenie, etc). Durata – 2-3 zile.ţăfrison, inapeten , astenie, etc). Durata – 2-3 zile.ţă3. Perioada de Perioada de starestare (a manifest rilor clinice specifice). Durata variabil .ă ă (a manifest rilor clinice specifice). Durata variabil .ă ă4. Perioada Perioada terminalăterminală (convalescen şi vindecare, sau cronicizare, sau stare de portaj, sauţă (convalescen şi vindecare, sau cronicizare, sau stare de portaj, sauţă

deces)deces)Criteriile de apreciere a rolului etiologic al agentului cauzal în survenirea infec iilorţCriteriile de apreciere a rolului etiologic al agentului cauzal în survenirea infec iilorţ specifice (postulatele lui Koch) specifice (postulatele lui Koch)

Bacteria trebuie s fie prezent ă ăBacteria trebuie s fie prezent ă ă la toate persoanele bolnave.la toate persoanele bolnave.Bacteria trebuie s fie izolat de la bolnav şi men inut în cultur pur .ă ă ţ ă ă ăBacteria trebuie s fie izolat de la bolnav şi men inut în cultur pur .ă ă ţ ă ă ăCultura pur inoculat la un voluntar sau la un animal experimental trebuie s reproducă ă ă ăCultura pur inoculat la un voluntar sau la un animal experimental trebuie s reproducă ă ă ă simptomele bolii.simptomele bolii.Aceeaşi bacterie trebuie s fie reizolat de la voluntară ăAceeaşi bacterie trebuie s fie reizolat de la voluntară ă ulul sau animalul infectat. sau animalul infectat.

Actualmente se insist pe genomul bacterian ăActualmente se insist pe genomul bacterian ă (prezen a genelor de patogenitate).ţ(prezen a genelor de patogenitate).ţ

Rolul mediului ambiant şi social în infec ie (condi iile economice, condi iile de via , catastrofeţ ţ ţ ţăRolul mediului ambiant şi social în infec ie (condi iile economice, condi iile de via , catastrofeţ ţ ţ ţă ecologice sau naturale, progresul în igiena public , etc).ăecologice sau naturale, progresul în igiena public , etc).ă Maladii Maladii sociale: tuberculoza, pediculozasociale: tuberculoza, pediculoza (tifosul exantematic), sifilisul, etc.(tifosul exantematic), sifilisul, etc.

Rolul macroorganismului în procesul infec ios. Rezisten a nespecific a ma/o.ţ ţ ăRolul macroorganismului în procesul infec ios. Rezisten a nespecific a ma/o.ţ ţ ăPentru men inerea coeren ei celulelor şi esuturilor şi p strarea integrit ii sale ma/o pune în jocţ ţ ţ ă ăţPentru men inerea coeren ei celulelor şi esuturilor şi p strarea integrit ii sale ma/o pune în jocţ ţ ţ ă ăţ 2 categorii de procese ap rute succesiv în cursul evolu iei:ă ţ2 categorii de procese ap rute succesiv în cursul evolu iei:ă ţRezisten a nespecific , înn scut – dezvoltat filogenetic, asigurat de factori constitu ionali.ţ ă ă ă ă ă ţRezisten a nespecific , înn scut – dezvoltat filogenetic, asigurat de factori constitu ionali.ţ ă ă ă ă ă ţ R spuns maxim imediat, nespecific, antigen-independent.ăR spuns maxim imediat, nespecific, antigen-independent.ăImunitatea (rezisten a specific ) – s-a dezvoltat ontogenetic, Ag-dependent şi Ag-specific ,ţ ă ă ăImunitatea (rezisten a specific ) – s-a dezvoltat ontogenetic, Ag-dependent şi Ag-specific ,ţ ă ă ă r spuns maxim peste câteva zile de la agresie, se caracterizeaz prin memorie imunologic . ă ă ăr spuns maxim peste câteva zile de la agresie, se caracterizeaz prin memorie imunologic . ă ă ă

Rezisten a nespecificţ ăRezisten a nespecificţ ăRezisten a nespecific este asigurat de factori tisulari (de barier ), factori celulari şi umorali.ţ ă ă ăRezisten a nespecific este asigurat de factori tisulari (de barier ), factori celulari şi umorali.ţ ă ă ăFactori tisulari (de barier )ăFactori tisulari (de barier )ă

35

1. TegumentulTegumentul ( (barier mecanic ă ăbarier mecanic ă ă - integritatea, descuamarea stratului cornos; - integritatea, descuamarea stratului cornos; barierăbarieră biologic ăbiologic ă -flora normal , ă-flora normal , ă chimic ăchimic ă - pH acid al tegumentului)- pH acid al tegumentului)

2. MucoaseleMucoasele ( (barier mecanic ă ăbarier mecanic ă ă - integritatea, mişcarea cililor, scurgerea secretelor;- integritatea, mişcarea cililor, scurgerea secretelor; chimic ăchimic ă -secre iile digestive, pH acid al urinei; ţ-secre iile digestive, pH acid al urinei; ţ biologic ăbiologic ă -flora normal ; ă-flora normal ; ă barier enzimatică ăbarier enzimatică ă – enzimele din secre iile mucoaselor, ex.: lizozimul, lactoferina) ţ– enzimele din secre iile mucoaselor, ex.: lizozimul, lactoferina) ţ

Dac barierele au fost dep şite, atunci organismul dispune de al i factori de rezistenă ă ţ ţăDac barierele au fost dep şite, atunci organismul dispune de al i factori de rezistenă ă ţ ţă nespecific : factori celulari şi umorali. ănespecific : factori celulari şi umorali. ă

Factori umorali de rezisten nespecificţă ăFactori umorali de rezisten nespecificţă ăReactivi de faz acut ă ăReactivi de faz acut ă ă – organismul supus unei agresiuni reac ioneaz prin sinteza şi secre iaţ ă ţ– organismul supus unei agresiuni reac ioneaz prin sinteza şi secre iaţ ă ţ crescut a unor proteine plasmatice: ăcrescut a unor proteine plasmatice: ă

inhibitori de proteazeinhibitori de proteaze proteine ale sistemulproteine ale sistemului complement şi ale coagul riiăui complement şi ale coagul riiă proteina C reactivăproteina C reactivă protrombina, fibrinogenul, etc. protrombina, fibrinogenul, etc.

Acestea m resc rezisten a gazdeiă ţAcestea m resc rezisten a gazdeiă ţ , limiteaz leziunile tisulare si favorizeaz vindecarea.ă ă, limiteaz leziunile tisulare si favorizeaz vindecarea.ă ă

1. ComplementulComplementul – reprezint un sistem complex de proteine termolabile solubile şiă – reprezint un sistem complex de proteine termolabile solubile şiă membranare. Se întâlnesc în plasma sangvin , limf şi exsudate. Nu se detecteaz în saliv ,ă ă ă ămembranare. Se întâlnesc în plasma sangvin , limf şi exsudate. Nu se detecteaz în saliv ,ă ă ă ă lacrimi, urin , transsudate.ălacrimi, urin , transsudate.ă

Exist peste 30 de frac ii ale C. C1-C9 sunt solubile, celelalte au rol de receptori membranari.ă ţExist peste 30 de frac ii ale C. C1-C9 sunt solubile, celelalte au rol de receptori membranari.ă ţFrac iile C1-C9 circul în ser sub form inactiv , care în procesul activ rii cap t propriet iţ ă ă ă ă ă ă ăţFrac iile C1-C9 circul în ser sub form inactiv , care în procesul activ rii cap t propriet iţ ă ă ă ă ă ă ăţ enzimatice.enzimatice.Activitatea biologic a complementului:ăActivitatea biologic a complementului:ă

Opsonizarea bacteriilor Opsonizarea bacteriilor Ac iune citoliticţ ăAc iune citoliticţ ă Activitate anafilactic – stimulare chimiotaxis ăActivitate anafilactic – stimulare chimiotaxis ă activare neutrofilele, degranularea activare neutrofilele, degranularea

mastocitelor,bazofilelormastocitelor,bazofilelorActivarea limfocitelor BActivarea limfocitelor B

2. ProperdinaProperdina – proteine serice care particip la activarea complementului pe cale alternativ .ă ă – proteine serice care particip la activarea complementului pe cale alternativ .ă ă3. ββ-lizinele-lizinele – proteine serice termostabile (63 grade) cu activitate antimicrobian asupraă – proteine serice termostabile (63 grade) cu activitate antimicrobian asupraă

bacteriilor G+ în specialbacteriilor G+ în special4. X – lizinaX – lizina, protein seric termostabil (70-100 grade), produce liza bacteriilor G –ă ă ă, protein seric termostabil (70-100 grade), produce liza bacteriilor G –ă ă ă5. Lizozimul Lizozimul – prezent în lacrimi, saliv , ser sanguin, favorizeaz liza bacteriiloră ă– prezent în lacrimi, saliv , ser sanguin, favorizeaz liza bacteriiloră ă6.6. Anticorpii normaliAnticorpii normali7. Interferonii Interferonii (glicoproteine cu ac iune antiviral , antiproliferativ şi imunomodulatoare)ţ ă ă(glicoproteine cu ac iune antiviral , antiproliferativ şi imunomodulatoare)ţ ă ă

45. Rezistenta nespecifica a macroorganismului. Notiune. Factorii celulari de rezistenta nespecifica. Fagocitoza: celulele fagocitare, etapele fagocitozei. Notiune de opsonine si opsonizare. Rolul fagocitozei in initierea raspunsului imun.Factori celulari de rezisten nespecificţă ăFactori celulari de rezisten nespecificţă ăReac ia inflamatoareţReac ia inflamatoareţ . Împiedic multiplicarea şi r spândirea microbilor şi asigur distrugereaă ă ă. Împiedic multiplicarea şi r spândirea microbilor şi asigur distrugereaă ă ă lor.lor.FagocitozaFagocitoza (component al reac iei inflamatoare). Asigur captarea şi distrugerea substan elorţ ă ţ (component al reac iei inflamatoare). Asigur captarea şi distrugerea substan elorţ ă ţ str ine, inclusiv a mi/o, celulelor infectate, celulelor tumorale.ăstr ine, inclusiv a mi/o, celulelor infectate, celulelor tumorale.ăCelulele fagocitare (fagocitele)Celulele fagocitare (fagocitele)

1.1. Leucocitele PMNLeucocitele PMN2. Macrofagele (Macrofagele (monocitemonocite – în sânge, – în sânge, macrofage fixemacrofage fixe – cel. Kupffer, macrofage alveolare, – cel. Kupffer, macrofage alveolare,

osteoclaste, microglia, macrofage din splin şi ganglioni limfatici).ăosteoclaste, microglia, macrofage din splin şi ganglioni limfatici).ăPentru a interveni, fagocitele trebuie s recunoasc bacteriile ca particule str ine. ă ă ăPentru a interveni, fagocitele trebuie s recunoasc bacteriile ca particule str ine. ă ă ăExist molecule solubile şi membranare care pot recunoaşte componente bacteriene: ăExist molecule solubile şi membranare care pot recunoaşte componente bacteriene: ă

SolubileSolubile – lectinele care se pot lega de manoza din PC; proteine plasmatice ce leag LPZă – lectinele care se pot lega de manoza din PC; proteine plasmatice ce leag LPZă bacterianbacterian

MembranareMembranare – pe macrofage exist receptori de manoz , receptorul CD 14 pentru LPZ,ă ă – pe macrofage exist receptori de manoz , receptorul CD 14 pentru LPZ,ă ă receptori receptori Toll-likeToll-like (TLR). TLR pot recunoaşte diferite molecule bacteriene: LPZ, PG, (TLR). TLR pot recunoaşte diferite molecule bacteriene: LPZ, PG, lipoproteine, acizi lipoteichoici, flagelina. lipoproteine, acizi lipoteichoici, flagelina.

Al i receptoriţAl i receptoriţ : receptori pentru Fc al IgG, pentru complement (CR1, CR3, CR4), pentru: receptori pentru Fc al IgG, pentru complement (CR1, CR3, CR4), pentru interferon, limfokine, lectine, fibronectin , ş.a. ăinterferon, limfokine, lectine, fibronectin , ş.a. ă

36

FAZELE FAGOCITOZEIFAZELE FAGOCITOZEI1. Chemotaxisul (atractan i – proteine bacteriene, fragmente de ţChemotaxisul (atractan i – proteine bacteriene, fragmente de ţ PC, capsule, LPZ,PC, capsule, LPZ,

chemokine, etc) chemokine, etc) 2. Adeziunea mi/o la fagocitAdeziunea mi/o la fagocit (fagocitul recunoa (fagocitul recunoaşte molecule str ine de pe suprafa aă ţşte molecule str ine de pe suprafa aă ţ

bacteriilor – monomeri de PG, acizi teichoici, LPZ, acid micolicbacteriilor – monomeri de PG, acizi teichoici, LPZ, acid micolic, AD, ADN bacterianN bacterian, ARNd.c., ARNd.c. viralviral, manoza,, manoza, glicani din fungi, etc glicani din fungi, etc ))

Inhibitori Inhibitori – capsula, Ag O, prot. M, prot. A, plasmo-coagulaza– capsula, Ag O, prot. M, prot. A, plasmo-coagulaza, etc, etc. Bacteriile patogene care nu. Bacteriile patogene care nu pot fi fagocitate se numesc pot fi fagocitate se numesc extracelulare.extracelulare.StimulatoriStimulatori – cationi de Ca – cationi de Ca2+2+, prot. C -, prot. C - reactiv , ăreactiv , ă opsonineopsonine (frac ii de complement (C3b),ţ (frac ii de complement (C3b),ţ fibronectina, unii Ac). Datorit receptorilor opsoninele acoper suprafa a bacteriiloră ă ţfibronectina, unii Ac). Datorit receptorilor opsoninele acoper suprafa a bacteriiloră ă ţ (opsonizare). Fagocitele de asemenea posed receptori pentru opsonine şi astfel facilitează ă(opsonizare). Fagocitele de asemenea posed receptori pentru opsonine şi astfel facilitează ă adeziunea şi ingestia mi/o. adeziunea şi ingestia mi/o.

3.3. Ingestia (înglobarea) şi formarea fagosomei.Ingestia (înglobarea) şi formarea fagosomei.

4. Distrugerea (digestia) intracitoplasmaticăDistrugerea (digestia) intracitoplasmatică. Fagosoma fuzioneaz cu Lz ă. Fagosoma fuzioneaz cu Lz ă fagolizosom fagolizosom mi/o va fi omorât sub ac iunea E, anionilor superoxizi, Hţmi/o va fi omorât sub ac iunea E, anionilor superoxizi, Hţ 22OO22, pH acid, apoi digerat de E, pH acid, apoi digerat de E hidrolitice.hidrolitice.

5. Produsele degradate pot fiProdusele degradate pot fi eliminate eliminate din celul (PMN, macrofagele) sau dup o selec ie şiă ă ţ din celul (PMN, macrofagele) sau dup o selec ie şiă ă ţ preg tire prealabil ă ăpreg tire prealabil ă ă (processing)(processing) unele peptide vor fi unele peptide vor fi expuse pe membrana macrofagelorexpuse pe membrana macrofagelor în asocia ie cu molecule ale CMH.ţîn asocia ie cu molecule ale CMH.ţ Ele vor contribui la stimularea imunit ii prinăţ Ele vor contribui la stimularea imunit ii prinăţ interac iunea cu receptorul pentru Ag de pe limfocitele T. Aceasta este ţinterac iunea cu receptorul pentru Ag de pe limfocitele T. Aceasta este ţ fagocitozafagocitoza completăcompletă..

Fagocitoza incompletăFagocitoza incompletă – agentul persist şi se multiplic în fagocit (micobacterii, gonococi). ă ă – agentul persist şi se multiplic în fagocit (micobacterii, gonococi). ă ăCauze:Cauze: inhibi ia form rii fagolizosomei, eliminarea bacteriei din fagosom înainte de fuziunea cuţ ă ă inhibi ia form rii fagolizosomei, eliminarea bacteriei din fagosom înainte de fuziunea cuţ ă ă lizosoma, etc). Aceştia sunt patogenilizosoma, etc). Aceştia sunt patogeni facultativ intracelulari. facultativ intracelulari.

Aprecierea st rii func ionale a fagociă ţAprecierea st rii func ionale a fagociă ţ telortelorProcentul fagociProcentul fagocitetelor activlor activee (N - 30-60%) – ponderea fagocitelor care au înglobat cel pu in unţ (N - 30-60%) – ponderea fagocitelor care au înglobat cel pu in unţ mi/omi/oNum rul fagocitar (N - 4 - 24) – nr de mi/o înglobate în mediu de un fagocităNum rul fagocitar (N - 4 - 24) – nr de mi/o înglobate în mediu de un fagocită

Alte celule cu activitate nespecific : celulele K şi NKăAlte celule cu activitate nespecific : celulele K şi NKă

46. Notiune de anti gen. Proprietatile de baza ale antigenelor (imunogenitatea si antigenitatea). Antigenele complete si incomplete (haptenele), caracteristica lor. Antigenele T-dependente si T-independente. Determinantele antigenice (epitopii), tipurile. Valenta antigenului.ANTIGENELEANTIGENELE – substan e str ine ţ ă – substan e str ine ţ ă (non-self)(non-self) de natur endo-/exo-gen capabile s declanşezeă ă ă de natur endo-/exo-gen capabile s declanşezeă ă ă un r spuns imun (umoral, celular, toleran imunologic , memorie imunologic , paralizieă ţă ă ăun r spuns imun (umoral, celular, toleran imunologic , memorie imunologic , paralizieă ţă ă ă imunologic ).ăimunologic ).ăPropriet ile de baz ale Ag:ăţ ăPropriet ile de baz ale Ag:ăţ ă

Imunogenitatea – capacitatea Ag de a Imunogenitatea – capacitatea Ag de a fi recunoscut ca strfi recunoscut ca străăin in şşi de ai de a induce r spuns imună induce r spuns imună specific specific

Antigenitatea (specificitatea) – capacitatea Ag de a interac iona specific cu Ac sau cuţAntigenitatea (specificitatea) – capacitatea Ag de a interac iona specific cu Ac sau cuţ receptorul pentru Ag complementar al limfocitelor sensibilizate receptorul pentru Ag complementar al limfocitelor sensibilizate

Antigenele care posed ambele caractere sunt ăAntigenele care posed ambele caractere sunt ă Ag completeAg complete. . Cerin ele fa de Ag complete:ţ ţăCerin ele fa de Ag complete:ţ ţă

S fie substan e str ine ă ţ ăS fie substan e str ine ă ţ ăS fie formate din gruparea ăS fie formate din gruparea ă carrier carrier (purt tor) şi ă(purt tor) şi ă epitopi (determinante antigenice)epitopi (determinante antigenice)S aib o greutate molecular ă ă ăS aib o greutate molecular ă ă ă de de peste 10 kDapeste 10 kDaS aib structur chimic complex (ă ă ă ă ăS aib structur chimic complex (ă ă ă ă ă proteine, PZproteine, PZ, LPZ, etc), LPZ, etc)S aib o conforma ie spa ial stabilă ă ţ ţ ă ăS aib o conforma ie spa ial stabilă ă ţ ţ ă ă

Antigenele incomplete (haptenele)Antigenele incomplete (haptenele) posed antigenitate dar sunt lipsite de imunogenitate. ă posed antigenitate dar sunt lipsite de imunogenitate. ăCerinte fata de AgCerinte fata de Ag incomplete (haptenele): incomplete (haptenele):

Au mas molecular mică ă ăAu mas molecular mică ă ă

37

Pot deveni imunogene combinându-se cu macromolecule purt toare (proteine sauăPot deveni imunogene combinându-se cu macromolecule purt toare (proteine sauă polizaharide)polizaharide)

Exemple de hapteneExemple de haptene: s ruri ale metalelor grele (Cr, Ni), substan e de origine vegetal ,ă ţ ă: s ruri ale metalelor grele (Cr, Ni), substan e de origine vegetal ,ă ţ ă medicamente, coloran i, oligonucleotide.ţmedicamente, coloran i, oligonucleotide.ţSuperSuperAgAg – molecule proteice particulare (enterotoxinele stafilococice, toxina şocului toxic – molecule proteice particulare (enterotoxinele stafilococice, toxina şocului toxic stafilococicstafilococic, toxina exfoliativ a stafilococilor, nucleocapsida virusului rabic), capabile să ă, toxina exfoliativ a stafilococilor, nucleocapsida virusului rabic), capabile să ă stimuleze un num r mare de limfocite T (10-40%). N – 0.01%. SuperAg provoac reac iiă ă ţstimuleze un num r mare de limfocite T (10-40%). N – 0.01%. SuperAg provoac reac iiă ă ţ imunopatologice.imunopatologice.

Se disting arbitrar:Se disting arbitrar: Ag solubileAg solubile: proteine plasmatice, : proteine plasmatice, toxine, toxine, enzime, hormoni, etcenzime, hormoni, etc Ag figurateAg figurate (celulare, corpusculare): celule, bacterii, parazi i, etc.ţ (celulare, corpusculare): celule, bacterii, parazi i, etc.ţ

În func ie de provenien se deosebesc:ţ ţăÎn func ie de provenien se deosebesc:ţ ţă• Ag heterofileAg heterofile – Ag comune mai multor specii animale. Ex.: – Ag comune mai multor specii animale. Ex.: Ag polizaharidiceAg polizaharidice

ForssmanForssman, prezent, prezentee în hematiile de cal, câine, oaie, cobai; în hematiile de cal, câine, oaie, cobai; sistemul Rhsistemul Rh al eritrocitelor al eritrocitelor se întâlneşte la om şi maimu ele Macaccus ţse întâlneşte la om şi maimu ele Macaccus ţ rrhesus, etc hesus, etc

• Ag Ag heterologeheterologe (xeno-Ag, hetero-Ag) – Ag provenite din organismul altei specii (xeno-Ag, hetero-Ag) – Ag provenite din organismul altei specii• Izo-AgIzo-Ag (alo-Ag) – Ag de grup în cadrul unei specii (sistemul ABO şi Rh (alo-Ag) – Ag de grup în cadrul unei specii (sistemul ABO şi Rh, clasele de , clasele de Ig)Ig)• IdioantigeneIdioantigene – antigenele specifice unui individ. Corespund moleculelor CMH – antigenele specifice unui individ. Corespund moleculelor CMH• AutoantigeneAutoantigene – Ag proprii unui organism, devenite imunogene în anumite condi iiţ – Ag proprii unui organism, devenite imunogene în anumite condi iiţ

(spermatozoizii, tiroglobulina, insulina, cristalinul, esutul nervos, etc)ţ(spermatozoizii, tiroglobulina, insulina, cristalinul, esutul nervos, etc)ţ• ExoantigeneExoantigene ( (provenite din compartimentul extracelular - provenite din compartimentul extracelular - bacterii, fungi, protozoarebacterii, fungi, protozoare

fagocitatefagocitate))• EndoantigeneEndoantigene ( (provenite din citoplasma celulelor,provenite din citoplasma celulelor, reprezint proteine proprii ă reprezint proteine proprii ă modificatemodificate

sau proteine virale sintetizate de celulele macroorganismului)sau proteine virale sintetizate de celulele macroorganismului)

Structura antigenic ăStructura antigenic ă a celulei bacterienea celulei bacterieneAg structuraleAg structurale (Ag O/R – somatice, LPZ, termostabile; Ag H – flagelar, proteic, (Ag O/R – somatice, LPZ, termostabile; Ag H – flagelar, proteic, termolabiltermolabil; Ag K –; Ag K – capsular, capsular, termovariabiltermovariabil; ; Ag F – fimbrial)Ag F – fimbrial) Ag solubileAg solubile (enzime de patogenitate, exotoxine) (enzime de patogenitate, exotoxine)Antigene virale:Antigene virale: proteine/GP proteine/GP de invelisde invelis, , nucleoproteine, nucleoproteine, enzimeenzime

DeterminanDeterminanteletele antigenic antigenicee (epitopii) (epitopii)Imunogenitatea este o caracteristic a întregii macromolecule Ag. ăImunogenitatea este o caracteristic a întregii macromolecule Ag. ăAntigenitatea (specificitatea) este determinat de anumite secven e ale Ag.ă ţAntigenitatea (specificitatea) este determinat de anumite secven e ale Ag.ă ţSuprafe e limitate din macromolecula Ag apte s se combine cu Ac specifici sau cu receptoriiţ ăSuprafe e limitate din macromolecula Ag apte s se combine cu Ac specifici sau cu receptoriiţ ă de pe limfocitele sde pe limfocitele sensibilizate se numescensibilizate se numesc determinandeterminantete antigenic antigenicee sau sau epitopi.epitopi.La glucideLa glucide epitopul este format din 4-6 monozaharide. Polizaharidele sunt formate dintr-un epitopul este format din 4-6 monozaharide. Polizaharidele sunt formate dintr-un epitop repetat sau dintr-un num r redus de epitopiăepitop repetat sau dintr-un num r redus de epitopiă diferi diferiţţii. . Polizaharidele sunt Ag T-independente, pot induce sinteza Ac f r interven ia TL.ă ă ţPolizaharidele sunt Ag T-independente, pot induce sinteza Ac f r interven ia TL.ă ă ţEpitopul proteicEpitopul proteic este constituit din câ iva ţ este constituit din câ iva ţ aminoacizi (aminoacizi (AAAA))..

• Epitopii Epitopii linliniiariari (secven iali) sunt determina i de structura primar a AA (8ţ ţ ă (secven iali) sunt determina i de structura primar a AA (8ţ ţ ă -30-30 AA) AA)• Epitopii Epitopii conforma ionaliţconforma ionaliţ sunt determina i de structura secundar sau ter iar a moleculeiţ ă ţ ă sunt determina i de structura secundar sau ter iar a moleculeiţ ă ţ ă

proteice (juxtapozi ia în spa iu a AA situa i la distan ). Se modific la denaturareaţ ţ ţ ţă ăproteice (juxtapozi ia în spa iu a AA situa i la distan ). Se modific la denaturareaţ ţ ţ ţă ă proteinei.proteinei.

Fiecare molecul proteic reprezint un mozaic de epitopi, fie diferi i, fie identici.ă ă ă ţFiecare molecul proteic reprezint un mozaic de epitopi, fie diferi i, fie identici.ă ă ă ţProteinele sunt Ag T-dependente, deoarece ele induc sProteinele sunt Ag T-dependente, deoarece ele induc sinteza Ac inteza Ac doar doar prin cooperarea dintre T şiprin cooperarea dintre T şi B limfocite.B limfocite.Num rul de epitopi de pe o molecul imunogen reprezint ă ă ă ăNum rul de epitopi de pe o molecul imunogen reprezint ă ă ă ă valen a Ag.ţvalen a Ag.ţ

47. Sistemul imun, functiile. Organele sistemului imun. Rolul organelor centrale si periferice ale sistemului imun. Celulele sistemului imun si functiile lor.IMUNITATEIMUNITATE – nereceptivitatea organismului la orice agen i str ini din punct de vedere genetic,ţ ă – nereceptivitatea organismului la orice agen i str ini din punct de vedere genetic,ţ ă inclusiv la mi/o şi toxinele lor.inclusiv la mi/o şi toxinele lor.IMUNITATE IMUNITATE – capacitatea de ap rare specific a organismului fa de agresori externi (virusuri,ă ă ţă– capacitatea de ap rare specific a organismului fa de agresori externi (virusuri,ă ă ţă bacterii, fungi, protozoarebacterii, fungi, protozoare, toxine, toxine) cât şi fa de propriile molecule şi unele celule degradate sauţă) cât şi fa de propriile molecule şi unele celule degradate sauţă modificate.modificate.

38

Sarcina fundamental a imunit ii – distinc ia dintre moleculele şi celulele proprii (ă ăţ ţSarcina fundamental a imunit ii – distinc ia dintre moleculele şi celulele proprii (ă ăţ ţ selfself) şi cele) şi cele str ine (ăstr ine (ă non-selfnon-self))

TIPURILE DE IMUNITATETIPURILE DE IMUNITATEEreditarăEreditară (natural , de specie). Poate fi absolut (lipsa intei) sau relativ .ă ă ţ ă (natural , de specie). Poate fi absolut (lipsa intei) sau relativ .ă ă ţ ăDobândităDobândită (achizitionata, adaptativa) (achizitionata, adaptativa)ActivActiv ă ă

• NaturalNatural (postinfec ioas )ă ţ ă (postinfec ioas )ă ţ ă• ArtificialArtificial (în urma ă (în urma ă vaccinvaccin rii) ării) ă

PasivPasivăă• NaturalNatural (transplacentar , prin lapteă ă (transplacentar , prin lapteă ă le maternle matern))• ArtificialArtificial (administrarea Ac ă (administrarea Ac ă / / seruri imuneseruri imune sau a limfocitelor) sau a limfocitelor)

Imunitatea dobândităImunitatea dobândită se caracterizeaz prin:ă se caracterizeaz prin:ă1. Dezvoltare lenta si manifestare tardiva Dezvoltare lenta si manifestare tardiva (câteva zile, s pt mâniă ă(câteva zile, s pt mâniă ă dupa contactul cu un Ag) dupa contactul cu un Ag) 2. Specificitate fa de ţăSpecificitate fa de ţă Ag Ag (capacitatea de a recunoaste si raspunde specific la numeroase(capacitatea de a recunoaste si raspunde specific la numeroase

substante straine, inclusiv agenti infectiosi)substante straine, inclusiv agenti infectiosi)3. Memorie imunologic ăMemorie imunologic ă (capacitatea de a elabora raspuns mai rapid, mai intens si eficace(capacitatea de a elabora raspuns mai rapid, mai intens si eficace

la intalniri repetate cu un Ag)la intalniri repetate cu un Ag)Imunitatea dobândit poate fi: ăImunitatea dobândit poate fi: ăImunitate antibacterian , antiviral , antimicotic , antitoxic , antitumoral , etc.ă ă ă ă ăImunitate antibacterian , antiviral , antimicotic , antitoxic , antitumoral , etc.ă ă ă ă ăÎn func ie de mecanismele reac iilor imune:ţ ţÎn func ie de mecanismele reac iilor imune:ţ ţ

Imunitate umoralăImunitate umorală, , exercitatexercitatăă prin intermediul unor proteine numite prin intermediul unor proteine numite anticorpi (Ac, Ig) anticorpi (Ac, Ig) limf. Blimf. B. . Fiind secretate in sange si lichide biologice neutralizeaza si elimina microbiiFiind secretate in sange si lichide biologice neutralizeaza si elimina microbii extracelulari si toxinele lor.extracelulari si toxinele lor.

Imunitate celularăImunitate celulară, , eficienta in eliminarea parazitilor intracelulari sau a celulelor tumorale.eficienta in eliminarea parazitilor intracelulari sau a celulelor tumorale. Este exercitatEste exercitatăă prin intermediul limf. T (citotoxicitate directa, activarea macrofagelor, prin intermediul limf. T (citotoxicitate directa, activarea macrofagelor, celulelor NK, secrecelulelor NK, secreţţia citokinelor).ia citokinelor).

În dependen de persisten a mi/oţă ţÎn dependen de persisten a mi/oţă ţ :: Imunitate sterilăImunitate sterilă – se manifest dup ă ă – se manifest dup ă ă eliminareeliminarea agen ilor patogeni din organism (ex.:ţa agen ilor patogeni din organism (ex.:ţ

rujeol )ărujeol )ă Imunitate nesterilăImunitate nesterilă – nereceptivitatea se p streaz doar în perioada afl rii mi/o înă ă ă – nereceptivitatea se p streaz doar în perioada afl rii mi/o înă ă ă

organism (tbc, sifilis).organism (tbc, sifilis).

Sistemul ImunSistemul Imun reprezinta un ansamblureprezinta un ansamblu de celule de celule, molecule , molecule şi şi tesuturi (tesuturi (organeorgane)) distribuite în distribuite în tot organismultot organismul, care participa la instaurarea imunitatii, care participa la instaurarea imunitatii..Functiile Sistemului Imun:Functiile Sistemului Imun:

1.1. Aparare contra infectiilor Aparare contra infectiilor 2. Recunoasterea tesuturilor si proteinelor straine si raspunsul la eleRecunoasterea tesuturilor si proteinelor straine si raspunsul la ele3.3. Protectie contra tumorilorProtectie contra tumorilor

TESUTURILE SISTEMULUI IMUNTESUTURILE SISTEMULUI IMUNOrganele centrale (primare) ale SIOrganele centrale (primare) ale SI – m duva osoas şi timusul la vertebrate (ficatul înă ă – m duva osoas şi timusul la vertebrate (ficatul înă ă perioada embrionar ), bursa Fabricius la p s ri. Apar primele în timpul vie ii embrionare. ă ă ă ţperioada embrionar ), bursa Fabricius la p s ri. Apar primele în timpul vie ii embrionare. ă ă ă ţRolulRolul – sursa celulelor-stem, – sursa celulelor-stem, “instruirea”,“instruirea”, maturizarea maturizarea şişi selectia selectia celulelor imunocompetente celulelor imunocompetente (limfocitele T şi B).(limfocitele T şi B).În m duva osoas se afl celulele-stem, precursori ai T şi B-limfocitelor. Pre-T limfociteleă ă ăÎn m duva osoas se afl celulele-stem, precursori ai T şi B-limfocitelor. Pre-T limfociteleă ă ă migreaz ulterior în timus, unde va avea loc ămigreaz ulterior în timus, unde va avea loc ă instruirea şi maturizareainstruirea şi maturizarea lor, devenind celule lor, devenind celule imunocompetente, capabile s recunoasc specific un singur Ag (prin achizi ionarea unoră ă ţimunocompetente, capabile s recunoasc specific un singur Ag (prin achizi ionarea unoră ă ţ receptori specifici). Instruirea receptori specifici). Instruirea si maturizarea si maturizarea B-limfocitelor are loc în m duva osoas . ă ăB-limfocitelor are loc în m duva osoas . ă ă AcesteAceste procese sunt independente de orice stimulare antigenic a organismului.ăprocese sunt independente de orice stimulare antigenic a organismului.ăDup p r sirea organelor centrale limfocitele nu mai revin aici, ele seă ă ăDup p r sirea organelor centrale limfocitele nu mai revin aici, ele seă ă ă stabilesc în organelestabilesc în organele limfoide secundare, limfoide secundare, rerecirculâcirculândnd prin sânge, limf .ă prin sânge, limf .ăOrganele periferice (sOrganele periferice (secundare) ale SI ecundare) ale SI În ele se realizeaz contactul dintre ăÎn ele se realizeaz contactul dintre ă Ag, Ag, celulele prezentatoare de antigencelulele prezentatoare de antigen ( CPA) ( CPA) şi celuleleşi celulele imuno-competente, cimuno-competente, cu inducerea unui raspuns imunu inducerea unui raspuns imun. . Ganglionii limfaticiGanglionii limfatici (raspuns imun contra Ag transportate cu limfa) (raspuns imun contra Ag transportate cu limfa)SplinaSplina (raspuns imun contra Ag transportate cu sangele) (raspuns imun contra Ag transportate cu sangele)

39

Forma iunile limfoide ale mucoaselor digestive şi respiratorii (amigdale, pl ci Peyer, apendice),ţ ăForma iunile limfoide ale mucoaselor digestive şi respiratorii (amigdale, pl ci Peyer, apendice),ţ ă esutul limfoid asociat tegumentuluiţesutul limfoid asociat tegumentuluiţ (raspuns imun contra Ag ce penetreaza prin epitelii) (raspuns imun contra Ag ce penetreaza prin epitelii)

Ariile Ariile timo-dependentetimo-dependente (populate de limfocite T) sunt: (populate de limfocite T) sunt: zona paracorticala a ganglionilorzona paracorticala a ganglionilor limfaticilimfatici (paracortex), (paracortex), manşonul limfoid periarteriolar al pulpei albe a splinei şi zonele interfoliculare alemanşonul limfoid periarteriolar al pulpei albe a splinei şi zonele interfoliculare ale plãcilor Peyer. plãcilor Peyer.

48. Celulele imunocompetente. Dezvoltarea limfocitelor T si B, receptorii de suprafata. Diferentierea limfocitelor T si B naive la un stimul antigenic. Functiile celulelor efectoare.Limfocitele Limfocitele (celule imunocompetente, recunoasterea Ag)(celule imunocompetente, recunoasterea Ag)Celulele efectoare Celulele efectoare (eliminarea microbilor)(eliminarea microbilor)Celulele prezentatoare de Ag (CPA) Celulele prezentatoare de Ag (CPA) (captarea si prezentarea Ag microbiene )(captarea si prezentarea Ag microbiene )

LIMFOCITELELIMFOCITELEToate limfocitele provin din celule-stem ale maduvei osoase, cu o etapa ulterioara deToate limfocitele provin din celule-stem ale maduvei osoase, cu o etapa ulterioara de maturizare si selectie.maturizare si selectie.Limfocitele T si B sunt unicele celule ce poarta receptori specifici de Ag Limfocitele T si B sunt unicele celule ce poarta receptori specifici de Ag ((celule imuno-celule imuno-competentecompetente)), fiind mediatorii principali ai imunitatii adaptative, fiind mediatorii principali ai imunitatii adaptativeMaturizarea Maturizarea limf. Blimf. B are loc în m duva osoas prin intermediul interac iunii directe cu celuleleă ă ţ are loc în m duva osoas prin intermediul interac iunii directe cu celuleleă ă ţ stromei, iar în stadiile tardive sub ac iunea citokinelor secretate de celulele stromale (în specialţstromei, iar în stadiile tardive sub ac iunea citokinelor secretate de celulele stromale (în specialţ IL-7).IL-7). Limf. B sunt supuse unei Limf. B sunt supuse unei selectii pozitiveselectii pozitive in favoarea expresiei de receptori intacti si unei in favoarea expresiei de receptori intacti si unei selectii negativeselectii negative contra recunoasterii puternice a antigenelor proprii. contra recunoasterii puternice a antigenelor proprii.In organelor limfoide secundare limf. B se localizeaza in In organelor limfoide secundare limf. B se localizeaza in foliculii cortexului externfoliculii cortexului extern din ganglioniidin ganglionii limfatici, foliculii din plãcile Peyer şi foliculii zonei periferice din pulpa albã a splinei limfatici, foliculii din plãcile Peyer şi foliculii zonei periferice din pulpa albã a splinei (arii timo-(arii timo-independente). independente).

Limf. B mature se caracterizeaz prin prezen a urm torilor receptori de suprafa :ă ţ ă ţăLimf. B mature se caracterizeaz prin prezen a urm torilor receptori de suprafa :ă ţ ă ţă1. Receptorul pentru Ag (BCR).Receptorul pentru Ag (BCR). Este reprezentat de molecule de Este reprezentat de molecule de Ig – Ig – monomeri de Ig M şi Igmonomeri de Ig M şi Ig

D. Interac ioneaz cuţ ăD. Interac ioneaz cuţ ă molecule antigenice dinmolecule antigenice din solu ii sau fixate peţsolu ii sau fixate peţ membrane celularemembrane celulare (macromolecule native – proteine, glucide, AN, etc)(macromolecule native – proteine, glucide, AN, etc)

2. Receptorul pentru Receptorul pentru fragmentul fragmentul Fc al IgGFc al IgG3. Receptor pentru frac iunea C3b a complementuluiţReceptor pentru frac iunea C3b a complementuluiţ4. Receptori pentru interleukineReceptori pentru interleukine (IL) (IL)5.5. Proteine ale Complexului Major de Histocompatibilitate - CMHProteine ale Complexului Major de Histocompatibilitate - CMH6.6. Alte proteine specifice – CD79, CD19 – asociate BCR Alte proteine specifice – CD79, CD19 – asociate BCR

Organismul contine 10Organismul contine 1077-10-109 9 clone diferite de limf.B, fiecare cu BCR unic. clone diferite de limf.B, fiecare cu BCR unic. BCR recunoaşteBCR recunoaşte antigenele dup configura ia lor.ă ţantigenele dup configura ia lor.ă ţ Limf. B stimulate de Ag se multiplic şi se diferen iaz în ă ţ ăLimf. B stimulate de Ag se multiplic şi se diferen iaz în ă ţ ă celulecelule efectoare - efectoare - plasmocite secretoare de Ig (Ac) şi în celule B-memorie.plasmocite secretoare de Ig (Ac) şi în celule B-memorie.

Precursorii Precursorii limf. Tlimf. T migreaz în timus, unde sub influen a celulelor stromale şi a corpusculiloră ţ migreaz în timus, unde sub influen a celulelor stromale şi a corpusculiloră ţ Hassal se diferen iaz în limf. T mature. Migra ia limf. T din cortex spre medulara timic esteţ ă ţ ăHassal se diferen iaz în limf. T mature. Migra ia limf. T din cortex spre medulara timic esteţ ă ţ ă înso it de achizi ia unor proteine de suprafa specifice (receptoriţ ă ţ ţăînso it de achizi ia unor proteine de suprafa specifice (receptoriţ ă ţ ţă : TCR, CD3, CD4, CD8, etc: TCR, CD3, CD4, CD8, etc).). La o etapa precoce de selectie doarLa o etapa precoce de selectie doar limfocitele cu TCR functional vor supravietui. limfocitele cu TCR functional vor supravietui. DezvoltareaDezvoltarea ulterioara a ulterioara a limf. T este caracterizatălimf. T este caracterizată printr-o selec ie pozitiv (supravie uiesc TL care recunoscţ ă ţprintr-o selec ie pozitiv (supravie uiesc TL care recunoscţ ă ţ moleculele moleculele CMH propriu).CMH propriu). Aceste molecule sunt prezente pe suprafata celulelor dendritice si a Aceste molecule sunt prezente pe suprafata celulelor dendritice si a macrofagelor din timus.macrofagelor din timus.LLimfocitele Timfocitele T care care au trecut selecau trecut selecţţia pozitivia pozitivăă, dar care sunt capabile s, dar care sunt capabile săă recunoasc recunoascăă cu afinitate cu afinitate inalta peptide proprii asociate cu CMHinalta peptide proprii asociate cu CMH suport o selec ie negativ (moarte programat prină ţ ă ă suport o selec ie negativ (moarte programat prină ţ ă ă apoptoz ). ăapoptoz ). ă Selec ia constã în eliminarea clonelor de limfocite poten ial autoreactiveţ ţSelec ia constã în eliminarea clonelor de limfocite poten ial autoreactiveţ ţ (poten ial reactive fa ã de moleculele proprii).ţ ţ(poten ial reactive fa ã de moleculele proprii).ţ ţ “Timusul selec ioneaz utilul, ignor inutilul şi distruge nocivul.” ţ ă ă“Timusul selec ioneaz utilul, ignor inutilul şi distruge nocivul.” ţ ă ă ( Von Boehmer )( Von Boehmer )..La etapa finala limf. T care sunt capabile sa recunoasca peptide in asociatie cu moleculele CMHLa etapa finala limf. T care sunt capabile sa recunoasca peptide in asociatie cu moleculele CMH I pierd receptorul CD4 (devenind celule TCD8), iar cele ce recunosc complexe peptid-CMH III pierd receptorul CD4 (devenind celule TCD8), iar cele ce recunosc complexe peptid-CMH II pierd receptorul CD8 (devenind celule TCD4)pierd receptorul CD8 (devenind celule TCD4)

Receptorii TL:Receptorii TL:40

1. TCRTCR, , rreceptorul pentru Ag -eceptorul pentru Ag - format din 2 catene polipeptidice format din 2 catene polipeptidice αα şi şi ββ (90%) sau (90%) sau γγ şi şi δδ. . TCRTCR poate recunoaşte poate recunoaşte doar doar peptide antigenice asociate cu molecule ale CMH, localizate pepeptide antigenice asociate cu molecule ale CMH, localizate pe suprafa a unei CPA. Nu interac ioneaz cu Ag solubileţ ţ ăsuprafa a unei CPA. Nu interac ioneaz cu Ag solubileţ ţ ă . .

2. CD3 CD3 (Cluster Differentiation 3)(Cluster Differentiation 3) – asociat TC – asociat TCRR, ajut la transmiterea în celul a semnaluluiă ă, ajut la transmiterea în celul a semnaluluiă ă de recunoaştere a Agde recunoaştere a Ag si de activare a limfocitului si de activare a limfocitului..

3. CD2– prezent la toate limf. T, fixeaz hematii, poate fi deăCD2– prezent la toate limf. T, fixeaz hematii, poate fi deă ppiiststat prin testul de formare aat prin testul de formare a rozetelor.rozetelor.

Unii Unii markeri (recmarkeri (receeptori) de suprafa definesc 2 ţăptori) de suprafa definesc 2 ţă varietvariet i principale de Lăţi principale de Lăţ TT: limf. : limf. T T CD4+CD4+ şi şi TTCD8+CD8+CD4CD4 – exprimat pe 60% din TL – exprimat pe 60% din TL.. Recunosc Ag peptidice legate cu moleculele CMH II (exprimate Recunosc Ag peptidice legate cu moleculele CMH II (exprimate pe celulele dendritice, macrofage şi limf. pe celulele dendritice, macrofage şi limf. BB). Limfocitele TCD4). Limfocitele TCD4 (T4) (T4) au func ia de coordonatorţ au func ia de coordonatorţ central al r spunsului imun şi ăcentral al r spunsului imun şi ă la activare se diferenla activare se diferen iaz în subpopula ia de Thelper (ţ ă ţiaz în subpopula ia de Thelper (ţ ă ţ ThTh). ). ThTh aac ioneaz prin producerea citokinelor. În func ie de profilul de citokine elaborate se disting 2ţ ă ţc ioneaz prin producerea citokinelor. În func ie de profilul de citokine elaborate se disting 2ţ ă ţ grupe de Th: Th1 şi Th2. grupe de Th: Th1 şi Th2. Diferen ierea în ţDiferen ierea în ţ Th1Th1 este favorizat deă este favorizat deă IL-12 produs ăIL-12 produs ă de macrofagede macrofage.. Citokinele secretate deCitokinele secretate de Th1 Th1 (IL-2, (IL-2, TNF şi IFN-TNF şi IFN-γγ)) ffavorizeaz r spunsul imun celulară ăavorizeaz r spunsul imun celulară ă şi hipersensibilitatea tardivăşi hipersensibilitatea tardivă (activarea(activarea macrofagelor macrofagelor pentru distrugerea mi/o intracelulare, pentru distrugerea mi/o intracelulare, proliferarea şi diferen ierea limf.ţproliferarea şi diferen ierea limf.ţ T citotoxice (T citotoxice (TcTc))).). Th2Th2 recunosc Ag prezentate recunosc Ag prezentate în special de în special de limf. Blimf. B.. Secret IL-4, IL-5, IL-10 şi IL-13, responsabileăSecret IL-4, IL-5, IL-10 şi IL-13, responsabileă de imunitatea umoral . Favorizeaz ă ăde imunitatea umoral . Favorizeaz ă ă proliferarea si diferentiereaproliferarea si diferentierea limf. B şi producerea limf. B şi producerea anticorpilor (anticorpilor (Ac, IgAc, Ig)). . Exist o competi ie între cele dou tipuri de Th: IFN-ă ţ ăExist o competi ie între cele dou tipuri de Th: IFN-ă ţ ă γγ inhib diferen ierea şi proliferarea Th2, iară ţ inhib diferen ierea şi proliferarea Th2, iară ţ IL-4 inhib activitatea Th1. ăIL-4 inhib activitatea Th1. ă

CD8 CD8 – exprimat pe 40% LT– exprimat pe 40% LT.. Recunosc Ag peptidice asociate cu moleculele CMH I (exprimate pe Recunosc Ag peptidice asociate cu moleculele CMH I (exprimate pe toate celulele nucleate). Pot produce citokine, dar în special manifest ătoate celulele nucleate). Pot produce citokine, dar în special manifest ă activitateactivitate citotoxic citotoxicaa. La. La activare se diferen iaz în limf. Tţ ăactivare se diferen iaz în limf. Tţ ă citotoxice (citotoxice (TcTc) şi T) şi T- - supresoare (supresoare (TsTs). ). TcTc distrug celulele infectate cu virus, distrug celulele infectate cu virus, cu cu bacterii intracelulare sau celulele canceroase, intervinbacterii intracelulare sau celulele canceroase, intervin în respingerea grefelor (imunitatea celular ). ăîn respingerea grefelor (imunitatea celular ). ăTsTs suprim r spunsul imună ă suprim r spunsul imună ă fiind fiind responsabile de toleran a imunologic .ţ ă responsabile de toleran a imunologic .ţ ăT-memorieT-memorie asigur memoria imunologic .ă ă asigur memoria imunologic .ă ă

Raportul limfocitelor CD4/CD8 este de 1,5Raportul limfocitelor CD4/CD8 este de 1,5

Limfocitele B şi T naiveLimfocitele B şi T naive sunt celulele care sunt celulele care inca nu s-au inca nu s-au întâln întâlnitit cu un Ag. Dup interac iuneaă ţ cu un Ag. Dup interac iuneaă ţ cu Ag urmeaza activarea lor, proliferarea şi diferen ierea în ţcu Ag urmeaza activarea lor, proliferarea şi diferen ierea în ţ celule efectoarecelule efectoare (LB – în(LB – în plasmocite, LT în Th, Tc)plasmocite, LT în Th, Tc), , care vor elimina microbii sau neutraliza toxinele lor prin diferitecare vor elimina microbii sau neutraliza toxinele lor prin diferite mecanisme.mecanisme.LBreprezint 10-15% din popula ia limfocitar , cu o durat de via scurt , de 3-5 zile, iar ă ţ ă ă ţă ăLBreprezint 10-15% din popula ia limfocitar , cu o durat de via scurt , de 3-5 zile, iar ă ţ ă ă ţă ă LTLT constituie 70% cu o durat de via lung (luni, ani). ă ţă ăconstituie 70% cu o durat de via lung (luni, ani). ă ţă ă

Alte celule limfocitaAlte celule limfocitare (nule, neimuno-competente) –re (nule, neimuno-competente) – 15% 15%Celule NKCelule NK, capabile s distrug spontan celule canceroase şi celule infectate cu virus.ă ă, capabile s distrug spontan celule canceroase şi celule infectate cu virus.ă ăCelule KCelule K, posed pe membrana lor receptori pentru fragmentul Fc al Ig. Distrug celulele- intă ţ ă, posed pe membrana lor receptori pentru fragmentul Fc al Ig. Distrug celulele- intă ţ ă acoperite cu Ac (Ig) – fenomen de citotoxicitate Ac-dependent .ăacoperite cu Ac (Ig) – fenomen de citotoxicitate Ac-dependent .ă

49. Recunoasterea antigenului de catre T si B limfocite. Celulele prezentatoare de antigen, functiile lor. Complexul major de histocompatibilitate. Clasele moleculelor CMH si implicarea lor in raspunsul imun umoral si celular.CELULECELULELELE PREZENTATOARE DE ANTIGEN (CPA) PREZENTATOARE DE ANTIGEN (CPA)BL recunosc direct prin intermediul BCR epitopi antigenici conforma ionali solubili sau fixa i peţ ţBL recunosc direct prin intermediul BCR epitopi antigenici conforma ionali solubili sau fixa i peţ ţ membrane celulare. membrane celulare. TL pot recunoaşte numai epitopi proteici linTL pot recunoaşte numai epitopi proteici liniiari asocia i cu molecule ale CMH expuşi peţari asocia i cu molecule ale CMH expuşi peţ suprafa a unor celule specializate – ţsuprafa a unor celule specializate – ţ CPACPA (restric ie CMH).ţ(restric ie CMH).ţ

CPACPA “profesioniste” “profesioniste” includinclud celulele dendriticecelulele dendritice foliculare şi tisulare foliculare şi tisulare, , monocitelemonocitele // macrofagmacrofageleele şişi limfocite limfocitelele B BFuncFuncţţiile iile CPACPA

41

1. CaptaCaptarea, rea, fragmentafragmentarea rea ( (processingprocessing-ul-ul)) Ag proteice, selectia Ag proteice, selectia şi expune şi expunerearea pe suprafa a saţ pe suprafa a saţ a a peptidepeptidelor lor antigenice antigenice (epitopi liniari)(epitopi liniari) asociate cu moleculele CMH. asociate cu moleculele CMH.

2. Transportarea acestorTransportarea acestor complex complexe spre tesutul limfoid periferic, unde e spre tesutul limfoid periferic, unde complexul complexul CMH-peptidCMH-peptid va fi prezentat va fi prezentat LT naivLT naiv cu TCR specific, cu TCR specific, declanşadeclanşandnd activarea activarea luilui..

3. CPA care exprima peptide asociate cu CMH I vor interactiona cu limfocite TCD8, iar CPACPA care exprima peptide asociate cu CMH I vor interactiona cu limfocite TCD8, iar CPA care exprima peptide in asocoatie cu CMH II – cu TCD4.care exprima peptide in asocoatie cu CMH II – cu TCD4.

4. Producerea semnalelor secundare de activare a LT (Producerea semnalelor secundare de activare a LT (secre ia unor citokineţsecre ia unor citokineţ ).).

COMPLEXUL MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATECOMPLEXUL MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATEMoleculele CMH reprezint un ansamblu unic de glicoproteine exprimate pe suprafa a celuleloră ţMoleculele CMH reprezint un ansamblu unic de glicoproteine exprimate pe suprafa a celuleloră ţ organismului, care sunt veritabili markeriorganismului, care sunt veritabili markeri/Ag/Ag de identitate a de identitate aii fiec rui individ. ă fiec rui individ. ăRolul moleculelor CMH:Rolul moleculelor CMH:

1. Particip la prezentarea Ag peptidice TL.ăParticip la prezentarea Ag peptidice TL.ă2. Responsabilitate în respingerea greResponsabilitate în respingerea grefelor.felor.

CMH este transmis genetic. Genele CMH sunt situate pe cromozomul 6 la om, locus numit HLACMH este transmis genetic. Genele CMH sunt situate pe cromozomul 6 la om, locus numit HLA ((Human Leukocyte AntigenHuman Leukocyte Antigen). Moleculele CMH sunt formate din 2 catene polipeptidice,). Moleculele CMH sunt formate din 2 catene polipeptidice, constituite din domenii extracelulare, un fragment transmembranar şi o regiuneconstituite din domenii extracelulare, un fragment transmembranar şi o regiune intracitoplasmatic . Structura tridimensional a moleculei duce la formarea uneă ăintracitoplasmatic . Structura tridimensional a moleculei duce la formarea uneă ă ii cavit i, laăţ cavit i, laăţ fundul c reia se ăfundul c reia se ă aflafl R care vor interac iona cu peptide antigenice proprii sau str ine.ă ţ ă R care vor interac iona cu peptide antigenice proprii sau str ine.ă ţ ă Al Al iţiţ receptori receptori ai CMH ai CMH interac ioneaz cu moleculele CD4 sau CD8 de pe TL.ţ ăinterac ioneaz cu moleculele CD4 sau CD8 de pe TL.ţ ă

Se disting molecule (antigene) CMH de clasa I şi de clasa II.Se disting molecule (antigene) CMH de clasa I şi de clasa II.Moleculele Moleculele CMH ICMH I sunt exprimate pe toate celulele nucleate ale organismului. sunt exprimate pe toate celulele nucleate ale organismului. CMH ICMH I recunoaste si recunoaste si interac ioneaz cu receptorul ţ ăinterac ioneaz cu receptorul ţ ă CD8 CD8 de pe TL. de pe TL. CMH I pCMH I particip la prezentarea peptidelor ăarticip la prezentarea peptidelor ă antigenice antigenice scurte (9 AA) ob inute în cursul degrad riiţ ăscurte (9 AA) ob inute în cursul degrad riiţ ă inin citoplasma citoplasma (de c tre proteasome) a ă (de c tre proteasome) a ă Ag endogeneAg endogene ((molecule proprii sau proteine viralemolecule proprii sau proteine virale sintetizate de CPAsintetizate de CPA)). . Complexul Complexul peptid/CMH Ipeptid/CMH I de pe suprafa a CPAţde pe suprafa a CPAţ (macrofage, celule dendritice) poate fi recunoscut (macrofage, celule dendritice) poate fi recunoscut de complexul de complexul TCR/CD8 TCR/CD8 complementar de pe TCD8 naive complementar de pe TCD8 naive activarea limfocitelor, diferen iereaţ activarea limfocitelor, diferen iereaţ lor în limf. Tc - lor în limf. Tc - ini ierea r spunsului imun celularţ ăini ierea r spunsului imun celularţ ă ))Complexul Complexul peptidpeptid /CMH I/CMH I dede pe suprafa a celulelor infectate sau ţpe suprafa a celulelor infectate sau ţ a a celulelor tumoralecelulelor tumorale poate fi poate fi recunoscut de complexul recunoscut de complexul TCR/CD8 TCR/CD8 complementar de pe limfocitele efectoare Tc complementar de pe limfocitele efectoare Tc distrugerdistrugereaea celulelor ce con in Ag endogenţ celulelor ce con in Ag endogenţ ..

Moleculele Moleculele CMH de clasa IICMH de clasa II sunt exprimate pe celulele specializate în prezentarea Ag pt sunt exprimate pe celulele specializate în prezentarea Ag pt TTCDCD44:: limf. B, celule dendritice, monocite, macrofage. Ele pot prezenta peptide din 12-3limf. B, celule dendritice, monocite, macrofage. Ele pot prezenta peptide din 12-300 AA derivate AA derivate din degradarea îdin degradarea în fagolizosomen fagolizosome a a AgAg exogene exogene ( (bacterii, protozoare, fungibacterii, protozoare, fungi, virioni liberi). , virioni liberi). Complexul Complexul peptid/CMH IIpeptid/CMH II de pe celulele prezentatoare de Ag interac ioneaz cu complexulţ ă de pe celulele prezentatoare de Ag interac ioneaz cu complexulţ ă TCR/CD4TCR/CD4 de pe limfocitele de pe limfocitele CDCD4 naive sau efectoare (Th1, Th2). 4 naive sau efectoare (Th1, Th2). Astfel moleculele CMH II sunt implicate în ambele tipuri de imunitate: umoral şi celular .ă ăAstfel moleculele CMH II sunt implicate în ambele tipuri de imunitate: umoral şi celular .ă ă

Prezentarea Ag limfocitelor T.Prezentarea Ag limfocitelor T. Ag este prezentat receptorului TCR sub form de peptideă Ag este prezentat receptorului TCR sub form de peptideă asociate moleculelor CMH de clasa I sau IIasociate moleculelor CMH de clasa I sau II de pe CPA de pe CPA..Limf. TLimf. TCD8CD8 recunosc în special recunosc în special Ag endogeneAg endogene, provenite din proteine citoplasmatice (molecule, provenite din proteine citoplasmatice (molecule proprii modificate sau proteine virale) degradate de c tre proteasome. Aceste ăproprii modificate sau proteine virale) degradate de c tre proteasome. Aceste ă peptide din 9peptide din 9 AAAA sunt prezentate în asocia ie cu ţ sunt prezentate în asocia ie cu ţ moleculele CMH de clasa Imoleculele CMH de clasa I de pe de pe macrofage, celulemacrofage, celule dendriticedendritice, dar şi de pe suprafa a ţ, dar şi de pe suprafa a ţ tuturor celulelor nucleatetuturor celulelor nucleate ale organismului. ale organismului. Limf. TLimf. TCD4CD4 recunosc recunosc Ag Ag exogeneexogene ( (provenite din provenite din bacterii, protozoarebacterii, protozoare, virusuri libere, virusuri libere)).. Prezentarea este asigurat de c tre ă ăPrezentarea este asigurat de c tre ă ă celule dendritice tisulare, celule Langerhans dincelule dendritice tisulare, celule Langerhans din epiderm , limf. B, monocite/macrofage ăepiderm , limf. B, monocite/macrofage ă (celule fagocitare)(celule fagocitare). . DupDupăă captarea Ag şi fragmentareacaptarea Ag şi fragmentarea lor lor (în fagolizosome) (în fagolizosome) peptidele antigenicepeptidele antigenice selectate selectate (15-(15-30 AA)30 AA) sunt atasunt ataşşate de ate de moleculele CMH IImoleculele CMH II şşi expuse pe suprafai expuse pe suprafaţţa CPA pentru a fi prezentatea CPA pentru a fi prezentate limf. limf. TCD4 naiveTCD4 naive activarea şi diferen ierea lor în celule efectori Th1 sau Th2ţ activarea şi diferen ierea lor în celule efectori Th1 sau Th2ţPrezentarea Ag limfocitelor BPrezentarea Ag limfocitelor B poate fi realizata prin intermediul poate fi realizata prin intermediul celulelceluleloror dendritice dendritice folicularefoliculare din splin şi ganglioni limfatici. Aceste celule nefagocitare fixeaz prin intermediulă ă din splin şi ganglioni limfatici. Aceste celule nefagocitare fixeaz prin intermediulă ă receptorilor membranari Ag polizaharidice sau proteice prezentându-le ulterior limfocitelor B. receptorilor membranari Ag polizaharidice sau proteice prezentându-le ulterior limfocitelor B.

42

50. Imunoglobulinele (Ig) si anticorpii. Structura monomerului de Ig. Valenta Ig, anticorpii completi si necompleti. Clasele de Ig si proprietatile lor.IMUNOGLOBULINELE (ANTICORPII)IMUNOGLOBULINELE (ANTICORPII) = = glicoproteine din frac ia ţglicoproteine din frac ia ţ γγ -globulinelor. Se disting Ig -globulinelor. Se disting Ig membranare (BCR) şi Ig membranare (BCR) şi Ig solubile (solubile (secretatesecretate)) – Ac ca atare. – Ac ca atare.Ac Ac = molecule glicoproteice produse de plasmocitele derivate din limf. = molecule glicoproteice produse de plasmocitele derivate din limf. B B activate de Ag. Acactivate de Ag. Ac circul în sânge şi p trund în esuturi. Sunt eficien i contra bacteriilor, toxinelor microbiene şiă ă ţ ţcircul în sânge şi p trund în esuturi. Sunt eficien i contra bacteriilor, toxinelor microbiene şiă ă ţ ţ virusurilor în pozi ie extracelular .ţ ăvirusurilor în pozi ie extracelular .ţ ă

STRUCTURA ŞI PROPRIET ILE IgĂŢSTRUCTURA ŞI PROPRIET ILE IgĂŢUNITATEA DE STRUCTUR a Ig (monomerul) este constituit din Ă ăUNITATEA DE STRUCTUR a Ig (monomerul) este constituit din Ă ă 2 lan uriţ2 lan uriţ glicoproteice (catene) glicoproteice (catene) identice identice uşoare Luşoare L ( (LightLight) şi ) şi 2 2 catene catene grele Hgrele H ( (HeavyHeavy), legate între ele prin pun i disulfidice.ţ), legate între ele prin pun i disulfidice.ţExist 2 tipuri de catene L – ăExist 2 tipuri de catene L – ă κκ şi şi λλ, identice într-o molecul de Ig.ă, identice într-o molecul de Ig.ăSe disting 5 clase de lan uri H: ţSe disting 5 clase de lan uri H: ţ γγ, , αα, , µµ, , δδ, , εε, ce corespund celor 5 clase , ce corespund celor 5 clase (izotipuri) (izotipuri) de Ig: de Ig: Ig G, IgIg G, Ig A, Ig M, Ig D, Ig E.A, Ig M, Ig D, Ig E.În componen a lan urilor se disting ţ ţÎn componen a lan urilor se disting ţ ţ regiuni variabile regiuni variabile (aminoterminale) şi (aminoterminale) şi regiuni constanteregiuni constante (carboxilterminale). (carboxilterminale). Regiunile variabileRegiunile variabile ale catenelor L şi H formeaz o cavitate tridimensional - centrul activă ăale catenelor L şi H formeaz o cavitate tridimensional - centrul activă ă (paratopul) al moleculei de Ig, care va reac iona specific cu determinanta antigenic (epitopul)ţ ă(paratopul) al moleculei de Ig, care va reac iona specific cu determinanta antigenic (epitopul)ţ ă Ag corespunz torăAg corespunz toră ,, constituit din 5-7 AA sau 3-4 reziduuri glucidice. Regiunea constituit din 5-7 AA sau 3-4 reziduuri glucidice. Regiunea variabilvariabil constituieă constituieă fragmentul Fabfragmentul Fab ( (aantigen ntigen bbindinginding) al moleculei de Ig. ) al moleculei de Ig. Regiunea Regiunea constantconstant corespundeă corespundeă fragmentului Fcfragmentului Fc (constant, cristalizabil). Este (constant, cristalizabil). Este purt tor deăpurt tor deă receptorireceptori şi responsabil de activitatea biologic a Ig:ă şi responsabil de activitatea biologic a Ig:ă

1.1. Transportul transplacentar al unor Ig (Ig G)Transportul transplacentar al unor Ig (Ig G)2. FFixaixarearea pe diferite celule (mastocite, pe diferite celule (mastocite, bazofile, bazofile, fagocite, limfocite, fagocite, limfocite, etc.etc.))3.3. Capacitatea de a fixa complementulCapacitatea de a fixa complementul4. Capacitatea de fixare a prot. A a stafilococilorCapacitatea de fixare a prot. A a stafilococilor5.5. Defineşte clasele şi subclasele de Ig (specificitatea antigenic a catenei H)ăDefineşte clasele şi subclasele de Ig (specificitatea antigenic a catenei H)ă

Monomerul de Ig este constituit din 2 fragmente Fab şi unul Fc. Între ele se afl ăMonomerul de Ig este constituit din 2 fragmente Fab şi unul Fc. Între ele se afl ă zona balamazona balama,, responsabil de flexibilitatea moleculei de Ig.ăresponsabil de flexibilitatea moleculei de Ig.ăNum rul paratopilor determin ă ăNum rul paratopilor determin ă ă valen aţvalen aţ Ig. Ig. Ac cu 2 sau mai mul i paratopi se numesc AcţAc cu 2 sau mai mul i paratopi se numesc Acţ comple i, cei cu un singur paratop – Ac incomple i.ţ ţcomple i, cei cu un singur paratop – Ac incomple i.ţ ţIg G, Ig Ig G, Ig DD şi Ig E sunt monomeri, Ig A din ser – monomeri, din secretele mucoaselor – dimeri, Ig şi Ig E sunt monomeri, Ig A din ser – monomeri, din secretele mucoaselor – dimeri, Ig M sunt pentameri.M sunt pentameri.

Propriet ile claselor de IgăţPropriet ile claselor de IgăţIg GIg G (4 subclase IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) – 75% din ansamblul Ig serice. CS = 7S, GM = 150kDa. (4 subclase IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) – 75% din ansamblul Ig serice. CS = 7S, GM = 150kDa. Sunt unicele Ig capabile s traverseze bariera placentar .ă ăSunt unicele Ig capabile s traverseze bariera placentar .ă ă Fc a Fc all IgG a IgG arere centre de fixare a centre de fixare a complementului (activarea C pe cale clasic ), a ăcomplementului (activarea C pe cale clasic ), a ă mmacrofagelor şi neutrofilelor (rol în opsonizare),acrofagelor şi neutrofilelor (rol în opsonizare), a prot. A a stafilococilor. Perioada de semi-via 21 zile.ţăa prot. A a stafilococilor. Perioada de semi-via 21 zile.ţăManifest activitate opsonizant , antibacterian , antitoxic , antivirală ă ă ă ăManifest activitate opsonizant , antibacterian , antitoxic , antivirală ă ă ă ă. . Ig MIg M – 5-6% din totalul Ig. Pentamer. CS = 19S, GM = 900kDa. Se distrug sub ac iuneaţ – 5-6% din totalul Ig. Pentamer. CS = 19S, GM = 900kDa. Se distrug sub ac iuneaţ mercapto-etanolului sau cisteinei. Semi-via a – 5 zile. Fixeaz si activeaz complementul peţ ă ămercapto-etanolului sau cisteinei. Semi-via a – 5 zile. Fixeaz si activeaz complementul peţ ă ă cale clasic . Nu traverseaz placenta, ă ăcale clasic . Nu traverseaz placenta, ă ă prezen a Ig M la nou-n scut denot infec ie intrauterin .ţ ă ă ţ ăprezen a Ig M la nou-n scut denot infec ie intrauterin .ţ ă ă ţ ă Sunt primele care apar dup un stimul antigenic primar şi indic un proces infec ios acut.ă ă ţSunt primele care apar dup un stimul antigenic primar şi indic un proces infec ios acut.ă ă ţ Monomeri de IgM constituie BCR pe B-limfocite. Monomeri de IgM constituie BCR pe B-limfocite. Ig AIg A – 15% din totalul Ig. CS = 7S, GM = 160 kDa. Bogate în glucide. Se disting 2 subclase: IgA1 – 15% din totalul Ig. CS = 7S, GM = 160 kDa. Bogate în glucide. Se disting 2 subclase: IgA1 (93%) şi IgA2 (7%). Semivia a – 6 zile, nu traverseaz placenta, ţ ă(93%) şi IgA2 (7%). Semivia a – 6 zile, nu traverseaz placenta, ţ ă nu activeaz complementul peănu activeaz complementul peă cale clasicăcale clasică. . Ig A serice (monomeri) – 6% din totalul Ig serice. Agregate de IgA pot activa complementul peIg A serice (monomeri) – 6% din totalul Ig serice. Agregate de IgA pot activa complementul pe cale alternativ .ăcale alternativ .ăIg A secretoare (sIg A) – saliv , lacrimi, colostrum, lapte, secre ii gastro-intestinale, nazale,ă ţIg A secretoare (sIg A) – saliv , lacrimi, colostrum, lapte, secre ii gastro-intestinale, nazale,ă ţ bronhice. Dimer. Asigur protec ia mucoaselor, blocând ataşarea bacteriilor şi virusurilor deă ţbronhice. Dimer. Asigur protec ia mucoaselor, blocând ataşarea bacteriilor şi virusurilor deă ţ receptorii mucoaselor.receptorii mucoaselor.Ig DIg D – 0,2% din totalul Ig. CS – 6,5S, GM – 170 kDa. Semi-via a – 3 zile. ţ – 0,2% din totalul Ig. CS – 6,5S, GM – 170 kDa. Semi-via a – 3 zile. ţ Rolul – receptor pentruRolul – receptor pentru Ag (BCR) pe LB; posibil particip ăAg (BCR) pe LB; posibil particip ă lala eliminarea limfocitelor B care produc autoAc (Ac eliminarea limfocitelor B care produc autoAc (Ac autoreactivi).autoreactivi).Ig EIg E – 0,002 - 0,01%, CS – 7,9S, GM – 185 kDa. Semivia a – 2-3 zile. Nu traverseaz placenta, nuţ ă – 0,002 - 0,01%, CS – 7,9S, GM – 185 kDa. Semivia a – 2-3 zile. Nu traverseaz placenta, nuţ ă fixeaz complementul. Termolabile (inactivate la 56ăfixeaz complementul. Termolabile (inactivate la 56ă °°C în 30 min). C în 30 min). Se pot fixa pe suprafa aţSe pot fixa pe suprafa aţ mastocitelor şi bazofilelor, determinând degranularea lor cu eliberarea unor amine vazo-activemastocitelor şi bazofilelor, determinând degranularea lor cu eliberarea unor amine vazo-active

43

(şoc anafilactic, deregl ri alergice). ă(şoc anafilactic, deregl ri alergice). ă Eficiente în afec iuni parazitare (opsonizarea helmin ilor şiţ ţEficiente în afec iuni parazitare (opsonizarea helmin ilor şiţ ţ artropodelor) .artropodelor) .

51. Raspunsul imun, conse cintele. Etapele raspunsului imun. Notiuni de imunitate umorala si celulara. Functiile si efectorii. RI RI = proces complex, indus de p trunderea unui Ag. Are loc în organele limfoide secundare şiă= proces complex, indus de p trunderea unui Ag. Are loc în organele limfoide secundare şiă prevede implicarea mai multor celule (CPA, limfocite T, B, ş.a.) şi substan e solubile (citokine).ţprevede implicarea mai multor celule (CPA, limfocite T, B, ş.a.) şi substan e solubile (citokine).ţConsecin ele unui r spuns imun:ţ ăConsecin ele unui r spuns imun:ţ ă

•• Imunitate (umoral , celular )ă ăImunitate (umoral , celular )ă ă•• Hipersensibilitate (imediat , tardiv )ă ăHipersensibilitate (imediat , tardiv )ă ă•• Memorie imunologicăMemorie imunologică•• Toleran imunologicţă ăToleran imunologicţă ă•• Paralizie imunologicăParalizie imunologică

AAcc sunt efectorii principali ai sunt efectorii principali ai imunit ii umoraleăţimunit ii umoraleăţ , iar , iar limfocitele Tc şi macrofagelelimfocitele Tc şi macrofagele activateactivate – ale – ale imunit ii celulareăţimunit ii celulareăţ . . Imunitatea umoral este eficace contra bacteriilor non-invazive (extracelulare)ăImunitatea umoral este eficace contra bacteriilor non-invazive (extracelulare)ă , virusurilor libere, virusurilor libere şi contra toxinelor. şi contra toxinelor. Imunitatea celular intervine în special contra parazi ilor intracelulari (bacterii, virusuri) şiă ţImunitatea celular intervine în special contra parazi ilor intracelulari (bacterii, virusuri) şiă ţ celulelor proprii modificate (tumorale)celulelor proprii modificate (tumorale)Etapele unui r spuns imunăEtapele unui r spuns imună

1. Întâlnirea Ag cu CPA, T-, B-limfocite. Întâlnirea Ag cu CPA, T-, B-limfocite. Are loc în organele limfoide Are loc în organele limfoide secundsecundare.are.2. Recunoaşterea Recunoaşterea specific a Ag, asigurat de limfocitele B şi T ă ăspecific a Ag, asigurat de limfocitele B şi T ă ă naïve naïve prin receptorii pentruprin receptorii pentru

Ag (BCR, TCR). BL pot recunoaşte epitopi superficiali Ag (BCR, TCR). BL pot recunoaşte epitopi superficiali conformationali conformationali ale moleculelor deale moleculelor de Ag native. TL recunosc doar Ag native. TL recunosc doar epitopi lineari din Ag proteiceepitopi lineari din Ag proteice prezentate de CPA prezentate de CPA in in asociaasociatietie cucu moleculel moleculelee CMH. CMH.

3. Activarea, proliferarea şi diferen ierea T sau B limfocitelorţActivarea, proliferarea şi diferen ierea T sau B limfocitelorţ în celule efectoare şi în celule efectoare şi celule Bcelule B sau T-memoriesau T-memorie.. Coordonarea acestor procese este asigurat de contacte celulare directeă Coordonarea acestor procese este asigurat de contacte celulare directeă şi de citokine, eliberate de diverse celule.şi de citokine, eliberate de diverse celule.

4. Realizarea efectului (neutralizare, opsonizare, liz , etc)ăRealizarea efectului (neutralizare, opsonizare, liz , etc)ă ..

52. Raspunsul imun umoral (RIU). Destinatia. Factorii implicati in declansarea si dezvoltarea RIU. Fazele RIU. RIU primar si secundar.RIU = RIU = form a imunit ii achizi ionate asigurat de Ac. Are func ia de a neutraliza şi eliminaă ăţ ţ ă ţform a imunit ii achizi ionate asigurat de Ac. Are func ia de a neutraliza şi eliminaă ăţ ţ ă ţ microbii extracelulari şi toxinele microbiene.microbii extracelulari şi toxinele microbiene. In acest proces particip In acest proces participăă Ag, CPA, limf T4, limf B. Ag, CPA, limf T4, limf B. Fazele r spunsului imun umoralăFazele r spunsului imun umorală ::

1. Intalnirea Ag cu limfocitele B.Intalnirea Ag cu limfocitele B. Are loc in organele limfoide secundare. Are loc in organele limfoide secundare. Ag patrunde Ag patrunde direct îdirect în sn sâânge nge int intââlnirea are loc lnirea are loc îîn splinn splin .ă.ă Ag penetreazAg penetreazăă prin tractul respirator prin tractul respirator amigdale amigdale şşi i ţţesutul limfoid asociat bronhilor esutul limfoid asociat bronhilor şşii

mucoaselormucoaselor Ag penetreazAg penetreazăă îîn tractul intestinal n tractul intestinal pl plăăcile Peyer, foliculii solitaricile Peyer, foliculii solitari Ag patrundAg patrundee prin tegument prin tegument ţţesutul limfoid asociat tegumentului.esutul limfoid asociat tegumentului.

2. RecunoaRecunoaşşterea epitopilor terea epitopilor unui Ag de cunui Ag de căătre receptortre receptorulul specific ( specific (BBCR) de pe suprafaCR) de pe suprafaţţa Ba B limfocitelor naive (seleclimfocitelor naive (selecţţia clonala)ia clonala) şşi activarea lor.i activarea lor.

Limf B naïveLimf B naïve recunosc epitopii prin intermediul moleculelor de Ig recunosc epitopii prin intermediul moleculelor de Ig M şi Ig D M şi Ig D (BCR) de pe(BCR) de pe suprafata lor, capabile ssuprafata lor, capabile săă lege epitopi omologi cu forma complementara. lege epitopi omologi cu forma complementara. Antigenele T-independente (polizaharide, LPZ) la fixarea lor pe BCR activeaza direct limf B. Antigenele T-independente (polizaharide, LPZ) la fixarea lor pe BCR activeaza direct limf B. La interactiunea BCR/Ag T-dependent (proteine), limf B naiv se comporta ca o CPA (inglobareaLa interactiunea BCR/Ag T-dependent (proteine), limf B naiv se comporta ca o CPA (inglobarea Ag, degradarea lui, selectarea peptidelor antigenice si prezentarea pe suprafata celulara aAg, degradarea lui, selectarea peptidelor antigenice si prezentarea pe suprafata celulara a complexului peptid/CMH IIcomplexului peptid/CMH II pentru a fi recunoscute de limf TCD4).pentru a fi recunoscute de limf TCD4). Primul semnal activator reprezinta interactiunea BCR cu epitopul Ag corespunzator. SemnalePrimul semnal activator reprezinta interactiunea BCR cu epitopul Ag corespunzator. Semnale secundare intervin ulterior (ex.:fixarea pe limf B a fracsecundare intervin ulterior (ex.:fixarea pe limf B a fracţţiei C3d a complementului). Astfel limf Biei C3d a complementului). Astfel limf B naiv este activat, fiind capabil sa producnaiv este activat, fiind capabil sa producăă cantitati mari de molecule CMH II, molecule co- cantitati mari de molecule CMH II, molecule co-stimulatoare stimulatoare şşi receptori pentru citokinele produse de limf Th.i receptori pentru citokinele produse de limf Th.

3. Proliferarea limfocitelor B Proliferarea limfocitelor B activateactivate si diferentierea lor si diferentierea lor DupDup activarea Lă activarea Lă B B de un de un Ag Ag T-independentT-independent urmeaza urmeaza proliferarea proliferarea lui intr-o clona de celulelui intr-o clona de celule identice identice (expansiunea clonala)(expansiunea clonala) şi şi diferen iereaţdiferen iereaţ în plasmocite, care vor sintetiza si secreta Ac în plasmocite, care vor sintetiza si secreta Ac din clasa (izotipul) Ig M, memoria imunologica lipseste. din clasa (izotipul) Ig M, memoria imunologica lipseste.

44

Dac ăDac ă LB a fost activat de un LB a fost activat de un Ag T-dependentAg T-dependent, stimularea prolifer rii se va produce numai prină, stimularea prolifer rii se va produce numai prină interac iunea dintre ţinterac iunea dintre ţ LB activat si limfLB activat si limfocitulocitul Th Th activat de acelaşi Ag activat de acelaşi Ag. LB şi LT au aceeaşi. LB şi LT au aceeaşi specificitate antigenic , doar ca LB recunoaşte epitopi nativi (conformationali), iar L Thăspecificitate antigenic , doar ca LB recunoaşte epitopi nativi (conformationali), iar L Thă recunoaşte fragmente peptidice ale acestui Ag. recunoaşte fragmente peptidice ale acestui Ag. Producerea limf Th are loc Producerea limf Th are loc de asemenea de asemenea în organele limfoide secundareîn organele limfoide secundare (zonele timo- (zonele timo-dependente)dependente), unde limfocitele TCD4 naive interac ioneaz cu peptidul antigenic de pe CPA,ţ ă, unde limfocitele TCD4 naive interac ioneaz cu peptidul antigenic de pe CPA,ţ ă urmând proliferarea şi diferen ierea lor în limf efectoare (Th1, Th2), produc toare de citokine.ţ ăurmând proliferarea şi diferen ierea lor în limf efectoare (Th1, Th2), produc toare de citokine.ţ ă Th2 migreaz spre foliculii limfoizi, unde are loc întâlnirea lor cu limf B activat.ăTh2 migreaz spre foliculii limfoizi, unde are loc întâlnirea lor cu limf B activat.ăComplexul TCR/CD4 de pe limf Th recunoaşte complexul peptid/CMH II de pe limf B activat.Complexul TCR/CD4 de pe limf Th recunoaşte complexul peptid/CMH II de pe limf B activat. Ulterior se formeaza alte legaturi co-stimulatoare. Astfel limf Th devin capabile sa secrete Ulterior se formeaza alte legaturi co-stimulatoare. Astfel limf Th devin capabile sa secrete citokine: IL- 4, 5, 10, 13, care vor actiona asupra LB activat . Aceste citokine induc citokine: IL- 4, 5, 10, 13, care vor actiona asupra LB activat . Aceste citokine induc proliferareaproliferarea LB activate, stimuleaza LB activate, stimuleaza diferentiereadiferentierea lor in lor in plasmocite secretoare de Acplasmocite secretoare de Ac Ig M cu paratopul Ig M cu paratopul (centrul activ) identic cu BCR de pe LB (2000 Ac/sec sintetizate de un plasmocit)(centrul activ) identic cu BCR de pe LB (2000 Ac/sec sintetizate de un plasmocit). Sub influen aţ. Sub influen aţ citokinelor produse de limf Th unele LB pot s se diferen ieze în plasmocite secretoare de Ig dină ţcitokinelor produse de limf Th unele LB pot s se diferen ieze în plasmocite secretoare de Ig dină ţ alte clase (IFN –IgGalte clase (IFN –IgG2; 2; IL-4 –IL-4 –Ig G4, Ig G4, IgEIgE; ; TGF beta- IgA). TGF beta- IgA). Plasmocitele r mân în organele limfoide periferice, iar Ac secreta i p trund în circula iaă ţ ă ţPlasmocitele r mân în organele limfoide periferice, iar Ac secreta i p trund în circula iaă ţ ă ţ sangvin . Unele plasmocite migreaz spre m duva osoas , continuând s produc Ac mult timpă ă ă ă ă ăsangvin . Unele plasmocite migreaz spre m duva osoas , continuând s produc Ac mult timpă ă ă ă ă ă (luni, ani), chiar dup eliminarea Ag. In caz de infectie a mucoaselor, plasmocitele se vor afla laă(luni, ani), chiar dup eliminarea Ag. In caz de infectie a mucoaselor, plasmocitele se vor afla laă nivelul mucoaselor (în nivelul mucoaselor (în Lamina propria)Lamina propria), producand Ac (sIg A) care vor fi transportati la suprafata, producand Ac (sIg A) care vor fi transportati la suprafata mucoaselor. mucoaselor. O parte din LB activate se transform în celule memorie. Limf B memorie nu secret Ac, eleă ăO parte din LB activate se transform în celule memorie. Limf B memorie nu secret Ac, eleă ă circul prin sânge şi supravie uiesc mai multe luni sau ani fiind gata sa reac ioneze la oă ţ ţcircul prin sânge şi supravie uiesc mai multe luni sau ani fiind gata sa reac ioneze la oă ţ ţ p trundere repetat a Ag.ă ăp trundere repetat a Ag.ă ă

4. Efectul iEfectul interac iunţnterac iunţ iiii dintre Ag şi Ac dintre Ag şi Ac in vivoin vivo depinde de natura Ag şi de tipul de Ac şi se depinde de natura Ag şi de tipul de Ac şi se poate manifesta prin:poate manifesta prin: Opsonizarea Opsonizarea bacteriilor bacteriilor şi intensificarea fagocitozei şi intensificarea fagocitozei Activarea complementului pe cale clasic ăActivarea complementului pe cale clasic ă citoliz (inclusiv bacterioliz )ă ă citoliz (inclusiv bacterioliz )ă ă Neutralizarea toxinelor, enzimelorNeutralizarea toxinelor, enzimelor Inhibi ia adeziunii bacteriilor, virusurilor (IgA)ţInhibi ia adeziunii bacteriilor, virusurilor (IgA)ţ Neutralizarea virusurilor extracelulareNeutralizarea virusurilor extracelulare Imobilizarea bacteriilor si protozoarelorImobilizarea bacteriilor si protozoarelor Citotoxicitatea mediat celular Ac-dependent (celulele acoperite de Ac sunt distruseă ăCitotoxicitatea mediat celular Ac-dependent (celulele acoperite de Ac sunt distruseă ă

de celulele K)de celulele K)

R spunsul umoral primar – la primul contact cu AgăR spunsul umoral primar – la primul contact cu AgăI faz – ăI faz – ă de latenţăde latenţă – dureaz 4-7 zile, pân la apari ia primilor Ac. ă ă ţ – dureaz 4-7 zile, pân la apari ia primilor Ac. ă ă ţ In acest timp aIn acest timp are locre loc recunoaşterea, degradarea Ag, diferen ierea T,B limfocitelor.ţrecunoaşterea, degradarea Ag, diferen ierea T,B limfocitelor.ţII faz –ăII faz –ă logaritmic ă logaritmic ă – Titrul Ac creşte, atingând max în a 10-15 zi. Ini ial ţ– Titrul Ac creşte, atingând max în a 10-15 zi. Ini ial ţ are loc producerea are loc producerea IgIg M, peste 4-5 zile M, peste 4-5 zile - - IgGIgG sau alte izotipuri de Ig (prin comutatie de clasa sub influenta citokinelor sau alte izotipuri de Ig (prin comutatie de clasa sub influenta citokinelor produse de Th)produse de Th)..III faz – ăIII faz – ă de producere maxim a Acăde producere maxim a Acă – Durata variaz în func ie de Ag.ă ţ – Durata variaz în func ie de Ag.ă ţIV faz – ăIV faz – ă de dde diminuaiminuare a titrului de Acre a titrului de Ac (declin)(declin)– În cazul Ag proteice – În cazul Ag proteice dureazadureaza s pt mâni, Agă ă s pt mâni, Agă ă polizaharidice – luni, Ag virale – ani).polizaharidice – luni, Ag virale – ani).R spunsul umoral secundarăR spunsul umoral secundară (la un contact repetat cu acelaşi Ag). (la un contact repetat cu acelaşi Ag).

Este asigurat de LB-memorieEste asigurat de LB-memorie Perioad de laten scurt (ore)ă ţă ăPerioad de laten scurt (ore)ă ţă ă Ascensiune rapid a titrului AcăAscensiune rapid a titrului Acă Titru maxim de Ac men inut o durat mai mareţ ăTitru maxim de Ac men inut o durat mai mareţ ă Afinitate crescut a Ac fa de Agă ţăAfinitate crescut a Ac fa de Agă ţă Producerea anticorpilor Ig GProducerea anticorpilor Ig G

Serul sangvin ob inut de la un organism imunizat cu un Ag con ine o mare varietate deţ ţSerul sangvin ob inut de la un organism imunizat cu un Ag con ine o mare varietate deţ ţ molecule de Ac, produşi de molecule de Ac, produşi de diferitdiferite clone de LB. Aceşte clone de LB. Aceştiia sunt a sunt Ac policlonaliAc policlonali..Ac monoclonaliAc monoclonali sunt absolut identici. Se ob in prin fuzionarea LB cu o celul tumoral .ţ ă ă sunt absolut identici. Se ob in prin fuzionarea LB cu o celul tumoral .ţ ă ă Hibridomul ob inut se multiplic ca o celul tumoral şi secret Ac omogeni, idţ ă ă ă ăHibridomul ob inut se multiplic ca o celul tumoral şi secret Ac omogeni, idţ ă ă ă ă eentici ntici cu cu BCR.BCR. Servesc la detectarea receptorilor de pe suprafa a celulelorţServesc la detectarea receptorilor de pe suprafa a celulelorţ , tratament etc, tratament etc. .

53. Raspunsul imun celular (RIC) . Destinatia. Factorii implicati in declansarea si dezvoltarea RIC. Fazele RIC.

45

Rolul Rolul RIC = a elimina microbii care pot supravie ui în vacuole fagocitare sau în citoplasmaţRIC = a elimina microbii care pot supravie ui în vacuole fagocitare sau în citoplasmaţ celulelor infectate. Accelulelor infectate. Acest tip de imunitate est tip de imunitate este asigurat deeste asigurat de limfocitele T limfocitele T.. Principalii Principalii efectoriefectori ai RIC ai RIC sunt limfocitele sunt limfocitele TTcitotoxice (Tc) derivate din limf TCD8 (T8)citotoxice (Tc) derivate din limf TCD8 (T8),, care care au capacitatea de a distruge celulele infectate cu virus sau tumorale şi au capacitatea de a distruge celulele infectate cu virus sau tumorale şi de a de a lilizza macrofaga macrofageleele infectainfectatete cu bacterii cu bacterii facultativ facultativ intracelulare.intracelulare. Ambele tipuri de limfocite (TCD8 Ambele tipuri de limfocite (TCD8 naive naive si Tc) si Tc) poseda TCR si molecule CD8.poseda TCR si molecule CD8.MacrofagMacrofageleele activa activatete reprezint al i efectori ai RIC. Eă ţ reprezint al i efectori ai RIC. Eă ţ lele sunt atra sunt atrasese în focarul infec ios, apoiţ în focarul infec ios, apoiţ activaactivatete, devenind capabil, devenind capabilee s distrug bacteriile intracelulare.ă ă s distrug bacteriile intracelulare.ă ăCelulele K şi NKCelulele K şi NK particip de aă particip de aă ssemenea la realizarea citotoxicit iiăţemenea la realizarea citotoxicit iiăţ (nu sunt angajate imun) (nu sunt angajate imun)..LLimfocitele TCD4+imfocitele TCD4+ participa indirect la dezvoltarea raspunsului imun celular participa indirect la dezvoltarea raspunsului imun celular, , deoarece deoarece în urmaîn urma recunoaşterii Agrecunoaşterii Ag vor produce un num r mare de citokine care vor ac iona asupra diferitoră ţvor produce un num r mare de citokine care vor ac iona asupra diferitoră ţ celulecelule: monocite, limfocite TCD8, TCD4, celule NK, etc.: monocite, limfocite TCD8, TCD4, celule NK, etc.Dezvoltarea r spunsului imun celularăDezvoltarea r spunsului imun celularăI etapa –Prezentarea Ag LT naïveI etapa –Prezentarea Ag LT naïve. Procesul are loc în organele limfoide periferice (OLP).. Procesul are loc în organele limfoide periferice (OLP).CPA profesioniste (macrofage, celule dendriticeCPA profesioniste (macrofage, celule dendritice)) capteaza Ag (ex.: celule infectate cu virus sau capteaza Ag (ex.: celule infectate cu virus sau celule tumorale) celule tumorale) fagocitoza fagocitoza unele proteine virale pot fi transferate din fagosome in Ct unele proteine virale pot fi transferate din fagosome in Ct

ele vor fi fragmentate de catre proteasome ele vor fi fragmentate de catre proteasome asamblarea cu moleculele CMH I asamblarea cu moleculele CMH I complexul complexul peptid/CMH I este scos la suprafata CPA (peste 250.000 complexe per celula) peptid/CMH I este scos la suprafata CPA (peste 250.000 complexe per celula) CPA cu limfa CPA cu limfa sunt transportate in ganglionii limfatici, unde ele vor fi capabile sa prezinte Ag limfocitelorsunt transportate in ganglionii limfatici, unde ele vor fi capabile sa prezinte Ag limfocitelor TCD8 naïve. TCD8 naïve. II etapa – Recunoasterea epitopilor AgII etapa – Recunoasterea epitopilor Ag de catre TCR unui LT CD8 naiv si activarea lui. de catre TCR unui LT CD8 naiv si activarea lui. LimfLimf T8 naïveT8 naïve vor recunoaste peptide asociate cu CMH I de pe suprafata CPA care au captat celule vor recunoaste peptide asociate cu CMH I de pe suprafata CPA care au captat celule infectate cu virus. Epitopul trebuie sa corespunda cu TCR de pe limfocitul T8, iar CMH I vainfectate cu virus. Epitopul trebuie sa corespunda cu TCR de pe limfocitul T8, iar CMH I va recunoaste situsuri de pe CD8. Aceaste interactiuni, precum si alte legaturi moleculare intrerecunoaste situsuri de pe CD8. Aceaste interactiuni, precum si alte legaturi moleculare intre CPA si limf T8, participa la activarea limf T8 naïve (costimulare). Citokinele eliberate de CPA seCPA si limf T8, participa la activarea limf T8 naïve (costimulare). Citokinele eliberate de CPA se implica de asemenea. implica de asemenea. III etapa – Proliferarea limfocitelor T8III etapa – Proliferarea limfocitelor T8 (expansiune (expansiuneaa clonala) clonala) si diferentierea lorsi diferentierea lor.. DupaDupa activare, sub influenta unor citokine eliberate de limf Th1 (in special IL-2), are loc proliferareaactivare, sub influenta unor citokine eliberate de limf Th1 (in special IL-2), are loc proliferarea limf T8 si diferentierea lor in limf T8 si diferentierea lor in celule efectoare Tccelule efectoare Tc, capabile sa lupte cu infectia intracelulara, capabile sa lupte cu infectia intracelulara sau celulele tumorale. Proliferarea incepe la 2 zile de la activarea limfocitelor şi se producesau celulele tumorale. Proliferarea incepe la 2 zile de la activarea limfocitelor şi se produce rapid (peste o s pt mân dup infectare pân la 10-20% din toate limf din OLP pot fi specificeă ă ă ă ărapid (peste o s pt mân dup infectare pân la 10-20% din toate limf din OLP pot fi specificeă ă ă ă ă pentru un Ag. N – 1:10pentru un Ag. N – 1:1066 ). Diferentierea in celule Tc are loc in paralel cu proliferarea. ). Diferentierea in celule Tc are loc in paralel cu proliferarea.Celulele efeCelulele efectoare ctoare Tc Tc p r sesc OLP şi migreaz spre ă ă ăp r sesc OLP şi migreaz spre ă ă ă tesutultesutul infec infectattat, unde, recunoscând Ag, vor, unde, recunoscând Ag, vor elimina infec ia. Unele limfocite T se diferen iaz în limfocite ţ ţ ăelimina infec ia. Unele limfocite T se diferen iaz în limfocite ţ ţ ă T memorieT memorie, durat de via lung ,ă ţă ă, durat de via lung ,ă ţă ă inactive func ional, dar sunt gata s reac ioneze rapid la o nou expozi ie la acelasi microbţ ă ţ ă ţinactive func ional, dar sunt gata s reac ioneze rapid la o nou expozi ie la acelasi microbţ ă ţ ă ţ (r spuns celular secundar).ă(r spuns celular secundar).ăIVIV etapa – Realizarea efectului etapa – Realizarea efectului IC.IC.

CitotoxicitateaCitotoxicitatea este rezultatul contactului specific este rezultatul contactului specific direct direct dintre clona de Tc şi inta lor (celuleţdintre clona de Tc şi inta lor (celuleţ infectate cu virus sau bacterii intracelulare, celule tumorale). Celulele infectate prezint peăinfectate cu virus sau bacterii intracelulare, celule tumorale). Celulele infectate prezint peă suprafa a sa peptide antigenice asociate cu moleculele CMH I, fiind recunoscute de c tre TCR şiţ ăsuprafa a sa peptide antigenice asociate cu moleculele CMH I, fiind recunoscute de c tre TCR şiţ ă CDCD88 de pe limf Tc. de pe limf Tc. Reac ia citotoxicţ ăReac ia citotoxicţ ă: contact membranar dintre Tc şi celula- int ţ ă: contact membranar dintre Tc şi celula- int ţ ă limfocitele Tc eliberează limfocitele Tc eliberează perforine care se insereaz în membrana celulei- int ă ţ ăperforine care se insereaz în membrana celulei- int ă ţ ă formare pori. Paralel, limf Tc secretă formare pori. Paralel, limf Tc secretă enzime (granzime) care penetreaz în Ct celuleiăenzime (granzime) care penetreaz în Ct celuleiă prin pori prin pori apoptoza ei. apoptoza ei. IFN produs si secretat de Th1 este un activator puternic al macrofagelor, stimuland capacitateaIFN produs si secretat de Th1 este un activator puternic al macrofagelor, stimuland capacitatea lor de a distruge patogeni intracelulari. De asemenea, citokinele mentionate activeaza limf Tc silor de a distruge patogeni intracelulari. De asemenea, citokinele mentionate activeaza limf Tc si celulele NK, promoveaza celulele NK, promoveaza proliferareaproliferarea limf T4, stimuleaza producerea opsoninelor (intensificarea limf T4, stimuleaza producerea opsoninelor (intensificarea fagocitozei), activeaza neutrofilele, stimuleaza cresterea productiei de monocite in maduvafagocitozei), activeaza neutrofilele, stimuleaza cresterea productiei de monocite in maduva osoasa, etc. osoasa, etc.

Memorie imunologicaMemorie imunologica – Capacitatea sistemului imun de a elabora raspuns mai rapid, mai – Capacitatea sistemului imun de a elabora raspuns mai rapid, mai intens si mai eficace la intalniri repetate cu acelasi Ag.intens si mai eficace la intalniri repetate cu acelasi Ag.TolerantaToleranta – absenta raspunsului imun la antigene proprii (self). Este determinata de – absenta raspunsului imun la antigene proprii (self). Este determinata de inactivarea si eliminarea limfocitelor autoreactive in procesul de maturizare a limfocitelor T si B.inactivarea si eliminarea limfocitelor autoreactive in procesul de maturizare a limfocitelor T si B.

CITOKINELECITOKINELE

46

Citokinele sunt molecule care permit diferitor celule s comunice între ele în producerea uneiăCitokinele sunt molecule care permit diferitor celule s comunice între ele în producerea uneiă reac ii.ţreac ii.ţCitokinele reunesc un grup heterogen de molecule: interleukine (IL), limfokine, monokine,Citokinele reunesc un grup heterogen de molecule: interleukine (IL), limfokine, monokine, interferoni (IFN), factori de stimulare a coloniilor (CSF), factori de necroz a tumorilor (TNF), etc.ăinterferoni (IFN), factori de stimulare a coloniilor (CSF), factori de necroz a tumorilor (TNF), etc.ă Citokinele permit celulelor Sistemului Imun s se multiplice şi s se diferen ieze (ex.: IL-2 esteă ă ţCitokinele permit celulelor Sistemului Imun s se multiplice şi s se diferen ieze (ex.: IL-2 esteă ă ţ un factor de creştere al TL, iar IL-4 stimuleaz BL şi diferen ierea lor în plasmocite produc toareă ţ ăun factor de creştere al TL, iar IL-4 stimuleaz BL şi diferen ierea lor în plasmocite produc toareă ţ ă de Ig E)de Ig E)Citokinele sunt glicoproteine care ac ioneaz asupra celulelor prin intermediul receptorilorţ ăCitokinele sunt glicoproteine care ac ioneaz asupra celulelor prin intermediul receptorilorţ ă membranari, care nu sunt întotdeauna activi. Expresia lor poate fi indus de o alt citokin (ex.:ă ă ămembranari, care nu sunt întotdeauna activi. Expresia lor poate fi indus de o alt citokin (ex.:ă ă ă IL-1 induce receptorul pentru IL-2 pe T şi BL) .IL-1 induce receptorul pentru IL-2 pe T şi BL) .Receptorii citokinelor sunt prezente şi pe alte celule ale organismului. Astfel ele ar putea servi laReceptorii citokinelor sunt prezente şi pe alte celule ale organismului. Astfel ele ar putea servi la comunicarea între Sistemul Imun şi alte sisteme ale organismului, ca SNC şi sistemul endocrin.comunicarea între Sistemul Imun şi alte sisteme ale organismului, ca SNC şi sistemul endocrin.

54. Reactiile de hipersensibilitate (RHS). Definitie. Particularitatile RHS. Clasificarea RHS in functie de mecanismele imunologice efectuate. Hipersensibilitate – raspunsuri imune excesive sau anormale, capabile sa provHipersensibilitate – raspunsuri imune excesive sau anormale, capabile sa provoace leziunioace leziuni tisulare si maladii. tisulare si maladii. Aceste reac ii se pot dezvolta în cadrul mecanismelor de ap rare fa de unţ ă ţăAceste reac ii se pot dezvolta în cadrul mecanismelor de ap rare fa de unţ ă ţă microb patogen. În acelaşi timp, reac ii similare pot fi dirijate contra substan elor ţ ţmicrob patogen. În acelaşi timp, reac ii similare pot fi dirijate contra substan elor ţ ţ de origine ne-de origine ne-infectioasainfectioasa..Particularit ile RHS:ăţParticularit ile RHS:ăţ

RHS sunt sRHS sunt specifice de Ag/alergen.pecifice de Ag/alergen. RHS sunt induse de un contact primar cu Ag/alergenul care provoac r spunsul imună ăRHS sunt induse de un contact primar cu Ag/alergenul care provoac r spunsul imună ă

specific (umoral, celular).specific (umoral, celular). RHS sunt declanşate la contacte ulterioare repetate cu acelaşi Ag/alergen.RHS sunt declanşate la contacte ulterioare repetate cu acelaşi Ag/alergen.

Clasificarea RHS dup mecanismele imunologice eăClasificarea RHS dup mecanismele imunologice eă fectuate (Gell, Coombs)fectuate (Gell, Coombs)Hipersensibilitatea de tipul I (reac ii imediate, anafilactice)ţHipersensibilitatea de tipul I (reac ii imediate, anafilactice)ţHipersensibilitatea de tipul II (citolitic-citotoxic )ăHipersensibilitatea de tipul II (citolitic-citotoxic )ăHipersensibilitatea de tipul III (prin complexe imune)Hipersensibilitatea de tipul III (prin complexe imune)Hipersensibilitatea de tipul IV (tardiv )ăHipersensibilitatea de tipul IV (tardiv )ăHipersensibilitatea de tipul V (prin autoAc)Hipersensibilitatea de tipul V (prin autoAc)

55. Reactiil e de hipersensibilitate de tip I (imediate, anafilactice). Factorii implicati, alergenii. Anafilaxia locala si generala, mecanismul reactiilor. Depistarea RHS de tipul I. Combaterea reactiilor anafilactice.RHS imediate mai sunt numite “alergie” sau “atopie”. Persoanele predispuse la astfel de reactiiRHS imediate mai sunt numite “alergie” sau “atopie”. Persoanele predispuse la astfel de reactii sunt numite “atopice”sunt numite “atopice”. Antigenele care declanseaza o hipersensibilitate imediata sunt calificate. Antigenele care declanseaza o hipersensibilitate imediata sunt calificate ca “alergeni”.ca “alergeni”.Manifest rile patologice survin timp de 15-30 min dup reîntroducerea ă ăManifest rile patologice survin timp de 15-30 min dup reîntroducerea ă ă alergenului alergenului înîn organismul sensibilizat.organismul sensibilizat.În reac iile anafilactice particip Ig E. ţ ăÎn reac iile anafilactice particip Ig E. ţ ă la persoanele predispuse la alergii intalnirea cu unele Agla persoanele predispuse la alergii intalnirea cu unele Ag determina activarea limf Th2 si producerea Ac Ig E. determina activarea limf Th2 si producerea Ac Ig E. Fiind sintetizate în timpul primului contactFiind sintetizate în timpul primului contact cu alergenul, IgE se fixeaz pe receptori ai mastocitelor (în special din esutul conjunctiv sau dină ţcu alergenul, IgE se fixeaz pe receptori ai mastocitelor (în special din esutul conjunctiv sau dină ţ mucoase), persistând mai multe luni.mucoase), persistând mai multe luni.

La p trunderea repetat (percutan, prin mucoase, intravenos) antigenul omolog leagă ă ăLa p trunderea repetat (percutan, prin mucoase, intravenos) antigenul omolog leagă ă ă încrucişat fragmentele Fab ale Ig E vecineîncrucişat fragmentele Fab ale Ig E vecine de pe mastocite de pe mastocite. Aceasta duce la eliberarea din. Aceasta duce la eliberarea din celule a unor mediatori, substan e biologic active (histamin , serotonin , Factorul deţ ă ăcelule a unor mediatori, substan e biologic active (histamin , serotonin , Factorul deţ ă ă Necroz al Tumorilor, prostaglandine, leucotriene). Ele se fixeaz pe receptorii termina iiloră ă ţNecroz al Tumorilor, prostaglandine, leucotriene). Ele se fixeaz pe receptorii termina iiloră ă ţ nervoase inducând contrac ia musculaturii ţnervoase inducând contrac ia musculaturii ţ netede (netede (bronşice, intestinale, uterinebronşice, intestinale, uterine)),, vasodilata ie, creşterea permeabilit ii vasculare cu edem, reac ie urticarian în tegument şiţ ăţ ţ ăvasodilata ie, creşterea permeabilit ii vasculare cu edem, reac ie urticarian în tegument şiţ ăţ ţ ă hipersecre ie de mucus la nivelul bronşic. ţhipersecre ie de mucus la nivelul bronşic. ţ Aceste reactii survin la cateva minute de laAceste reactii survin la cateva minute de la reintroducerea Ag.reintroducerea Ag.Alti mediatori ai mastocitelor – citokinele – recruteaza, pe parcursul al catorva ore, neutrofileAlti mediatori ai mastocitelor – citokinele – recruteaza, pe parcursul al catorva ore, neutrofile si eozinofile la nivelul localizarii reactiei. Acest proces inflamator al RHS imediate reprezintasi eozinofile la nivelul localizarii reactiei. Acest proces inflamator al RHS imediate reprezinta faza tardiva a reactiei. Este responsabila de leziunile tisulare provocate de catre atacurilefaza tardiva a reactiei. Este responsabila de leziunile tisulare provocate de catre atacurile repetate de hipersensibilitate imediata. repetate de hipersensibilitate imediata. Anafilaxia general (şocul anafilactic)ăAnafilaxia general (şocul anafilactic)ă

47

Este cea mai brutal şi grav reac ie declanşat de un Ag/alergen. Se manifest în câtevaă ă ţ ă ăEste cea mai brutal şi grav reac ie declanşat de un Ag/alergen. Se manifest în câtevaă ă ţ ă ă secunde dup administrarea parenteral a dozelor mari de Ag/alergen cu semne cliniceă ăsecunde dup administrarea parenteral a dozelor mari de Ag/alergen cu semne cliniceă ă sistemice: urticarie, asfixie, colaps circulator şi şoc. Poate duce la deces subit.sistemice: urticarie, asfixie, colaps circulator şi şoc. Poate duce la deces subit.Ag responsabile de şocul anafilactic:Ag responsabile de şocul anafilactic: medicamente (analgezice, anestetice, AB, seruri medicamente (analgezice, anestetice, AB, seruri sangvine sangvine de animale, enzime), venin de viespi, de albine, alimente.de animale, enzime), venin de viespi, de albine, alimente.Anafilaxia local (alergenul administrat în doz foarte mic sau depus pe o mucoas ) ă ă ă ăAnafilaxia local (alergenul administrat în doz foarte mic sau depus pe o mucoas ) ă ă ă ăLa nivelul mucoaselor:La nivelul mucoaselor: conjunctivita alergic , rinita, astmul şi traheita spasmodic (alergeni:ă ă conjunctivita alergic , rinita, astmul şi traheita spasmodic (alergeni:ă ă polenuri, dejecte de acarieni din praful de cas )ăpolenuri, dejecte de acarieni din praful de cas )ăForme cutanateForme cutanate: dermatita atopic şi urticariaă: dermatita atopic şi urticariaăAlergia alimentarăAlergia alimentară: manifest ri extradigestive (urticarie, edem Quincke, astm, anafilaxie) şiă: manifest ri extradigestive (urticarie, edem Quincke, astm, anafilaxie) şiă digestive (diaree, vome)digestive (diaree, vome)Depistarea RHS tipul I:Depistarea RHS tipul I:Teste cutanateTeste cutanate prin aplicarea cutanat sau administrarea intradermic a alergenilor. Reac ieă ă ţ prin aplicarea cutanat sau administrarea intradermic a alergenilor. Reac ieă ă ţ pozitiv – peste 15 min local apare o reac ie eritemo-papuloas .ă ţ ăpozitiv – peste 15 min local apare o reac ie eritemo-papuloas .ă ţ ăTeste de provocareTeste de provocare – se efectueaz la astmatici, prin administrarea alergenului în aerozolă – se efectueaz la astmatici, prin administrarea alergenului în aerozolă (pe cale nazal , ocular , oral ) şi m surând modific rile imediate şi tardive a volumuluiă ă ă ă ă(pe cale nazal , ocular , oral ) şi m surând modific rile imediate şi tardive a volumuluiă ă ă ă ă expirat maxim.expirat maxim.Dozarea imunoenzimatic sau radioimun a Ig Eă ăDozarea imunoenzimatic sau radioimun a Ig Eă ăPPrincipii de tratamentrincipii de tratamentEvitarea alergenuluiEvitarea alergenuluiDesensibilizarea prin administrarea Desensibilizarea prin administrarea repetata a dozelor mici de repetata a dozelor mici de AgAg, , care induce sinteza Ac Igcare induce sinteza Ac Ig GGTratament simptomatic (inhibitori ai degranul rii mastocitelor, anti-histaminice, etc)ăTratament simptomatic (inhibitori ai degranul rii mastocitelor, anti-histaminice, etc)ă

56. Reactiil e de hipersensibilitate de tip II (citolitic-citotoxice). Factorii implicati, consecintele. Diagnosticul si combaterea RHS de tipul II.

RHS de tipul II (citolitic-citotoxice)RHS de tipul II (citolitic-citotoxice)Implic Ac (Ig G sau Ig M) dirija i contra unui Ag natural sau exogen fixat pe suprafa a uneiă ţ ţImplic Ac (Ig G sau Ig M) dirija i contra unui Ag natural sau exogen fixat pe suprafa a uneiă ţ ţ celule sau a unui esut. Se dezvolt în câteva minute sau ore. ţ ăcelule sau a unui esut. Se dezvolt în câteva minute sau ore. ţ ăAfecteaz în special celulele sângelui, provocând citoliza prin activarea complementului sauăAfecteaz în special celulele sângelui, provocând citoliza prin activarea complementului sauă prin opsonizare şi fagocitoz de c tre macrofage. Celulele K de asemenea pot distrugeă ăprin opsonizare şi fagocitoz de c tre macrofage. Celulele K de asemenea pot distrugeă ă celulele opsonizate.celulele opsonizate.Aceste mecanisme cauzeaz citopenie.ăAceste mecanisme cauzeaz citopenie.ăReac ii transfuzionale (prezen a Ac anti-hematii în timpul unei transfuzii sanguine poateţ ţReac ii transfuzionale (prezen a Ac anti-hematii în timpul unei transfuzii sanguine poateţ ţ induce hemoliz intravascular prin activarea C pe cale clasic ).ă ă ăinduce hemoliz intravascular prin activarea C pe cale clasic ).ă ă ăMaladia hemolitic perinatal prin incompatibilitate Rhesus. Mama Rh- se imunizeaz înă ă ăMaladia hemolitic perinatal prin incompatibilitate Rhesus. Mama Rh- se imunizeaz înă ă ă cursul primei gravidit i contra f tului Rh+ la trecerea hematiilor fetale în sângele matern (laăţ ăcursul primei gravidit i contra f tului Rh+ la trecerea hematiilor fetale în sângele matern (laăţ ă naştere, în timpul unui avort). La o graviditate ulterioar , mama pre-imunizat contraă ănaştere, în timpul unui avort). La o graviditate ulterioar , mama pre-imunizat contraă ă factorului Rh+ poate sintetiza Ig G anti-Rh+, dac f tul este iar şi Rh+. ă ă ăfactorului Rh+ poate sintetiza Ig G anti-Rh+, dac f tul este iar şi Rh+. ă ă ăAceşti Ac pot traversa bariera placentar şi liza hematiile f tului la finele gravidit ii,ă ă ăţAceşti Ac pot traversa bariera placentar şi liza hematiile f tului la finele gravidit ii,ă ă ăţ provocând o hemoliz grav .ă ăprovocând o hemoliz grav .ă ăPrevenireaPrevenirea: administrarea Ac anti-Rh+ tuturor femeilor Rh- în primele 48 ore de la naşterea: administrarea Ac anti-Rh+ tuturor femeilor Rh- în primele 48 ore de la naşterea unui copil Rh+ sau a unui avort. Aceşti Ac opsonizeaz hematiile fetale din sângele matern şiăunui copil Rh+ sau a unui avort. Aceşti Ac opsonizeaz hematiile fetale din sângele matern şiă provoac eliminarea lor rapid .ă ăprovoac eliminarea lor rapid .ă ă3. Hemoliza imun de origine medicamentoas (medicamentul se depune pe membranaă ă3. Hemoliza imun de origine medicamentoas (medicamentul se depune pe membranaă ă eritrocitar şi Ac anti-medicament distrug eritrocitele acoperite ăeritrocitar şi Ac anti-medicament distrug eritrocitele acoperite ă de acest medicament).de acest medicament).4. Trombocitopenii şi granulocitopenii.4. Trombocitopenii şi granulocitopenii.DiagnosticDiagnostic::Depistarea Ac contra celulelor ( esuturilor) implicareţDepistarea Ac contra celulelor ( esuturilor) implicareţPrezen a Ac şi C în leziuni, depista i prin RIFţ ţPrezen a Ac şi C în leziuni, depista i prin RIFţ ţ

57. Reactiile de hipers ensibilitate de tip III (mediate de complexe imune solubile). Factorii implicati. Mecanismul, manifestarile patologice. Depistarea RHS de tipul III.

RHS de tipul III (mediate de complexe imune Ag-Ac solubile)RHS de tipul III (mediate de complexe imune Ag-Ac solubile)În mod normal CI sunt eliminate repede din organism. În unele circumstan e CI persistţ ăÎn mod normal CI sunt eliminate repede din organism. În unele circumstan e CI persistţ ă perioade îndelungate. Cauze: perioade îndelungate. Cauze: IInfec ii cronice: angine streptococice, endocardite bacteriene, hepatite virale, parazitoze, etcţnfec ii cronice: angine streptococice, endocardite bacteriene, hepatite virale, parazitoze, etcţesuturi proprii devenite auto-reactive în urma unor procese distructive (ex.: colagenoze)Ţesuturi proprii devenite auto-reactive în urma unor procese distructive (ex.: colagenoze)Ţ

Introducerea albuminei serice în cantit i mari (tratament cu seruri imune)ăţIntroducerea albuminei serice în cantit i mari (tratament cu seruri imune)ăţ48

Mecanismul:Mecanismul: Complexele Ag-Ac solubile activeaz C şi determin leziuni în locul form riiă ă ă Complexele Ag-Ac solubile activeaz C şi determin leziuni în locul form riiă ă ă sau depunerii lor în esuturi sau pe endoteliul vascular.ţsau depunerii lor în esuturi sau pe endoteliul vascular.ţFenomene patologice localeFenomene patologice locale: reac ia Arthus, glomerulonefrita, artrit , poliatrerite. Se producţ ă: reac ia Arthus, glomerulonefrita, artrit , poliatrerite. Se producţ ă în exces de Ac dup 3-10 ore de la contactul cu Ag.ăîn exces de Ac dup 3-10 ore de la contactul cu Ag.ăFenomene patologiceFenomene patologice generalegenerale: boala serului (în exces de Ag).: boala serului (în exces de Ag).Depistarea RHS de tipul III:Depistarea RHS de tipul III:Eviden ierea CI în biopsii tisulare. Se efectueaz utilizând RIF, RIE sau ARIţ ăEviden ierea CI în biopsii tisulare. Se efectueaz utilizând RIF, RIE sau ARIţ ăTitrarea Complementului seric (diminuarea titrului)Titrarea Complementului seric (diminuarea titrului)

58. Reactiil e de hipersensibilitate de tip IV (mediate celular, tardive). Tipurile. Factorii implicati, alergenii. Depistarea RHS de tipul IV.

RHS de tipul IV (mediate celular, tardive, întârziate)RHS de tipul IV (mediate celular, tardive, întârziate)Sunt determinate de limfocite T CD8 (Tc) sau TCD4 (Th1) activate la contactul secundar cuSunt determinate de limfocite T CD8 (Tc) sau TCD4 (Th1) activate la contactul secundar cu Ag sensibilizant.Ag sensibilizant.Sunt cunoscute 3 modele de hipersensibilitate tardiv :ăSunt cunoscute 3 modele de hipersensibilitate tardiv :ăHipersensibilitatea tuberculinicăHipersensibilitatea tuberculinicăReac ia granulomatoasţ ăReac ia granulomatoasţ ăDermatitele de contactDermatitele de contact

Hipersensibilitatea tuberculinicăHipersensibilitatea tuberculinică este indus de infec ii bacteriene, virale, fungice sauă ţ este indus de infec ii bacteriene, virale, fungice sauă ţ parazitare, prin vaccinare cu vaccinuri vii atenuate sau cu proteine fixate pe un adjuvantparazitare, prin vaccinare cu vaccinuri vii atenuate sau cu proteine fixate pe un adjuvant complet. complet. P trunderea repetat a Ag activeaz limdocitele Th1 specifice de acest Ag, ducând laă ă ăP trunderea repetat a Ag activeaz limdocitele Th1 specifice de acest Ag, ducând laă ă ă activarea Tc şi eliberarea unor citokine, responsabile de acumularea local a celulelorăactivarea Tc şi eliberarea unor citokine, responsabile de acumularea local a celuleloră mononucleate cu apari ia eritemului şi formarea unui infiltrat, în unele cazuri chiar şiţmononucleate cu apari ia eritemului şi formarea unui infiltrat, în unele cazuri chiar şiţ necroz . Leziunea apare peste 48 ore şi dispare în 3-5 zile. ănecroz . Leziunea apare peste 48 ore şi dispare în 3-5 zile. ă

Hipersensibilitatea granulomatoasăHipersensibilitatea granulomatoasă apare în cursul sensibiliz rii cu substan e insolubile sauă ţ apare în cursul sensibiliz rii cu substan e insolubile sauă ţ greu digerabile (constituien ii unor parazi i, compuşi lipoidici ai micobacteriilor, brucelelor,ţ ţgreu digerabile (constituien ii unor parazi i, compuşi lipoidici ai micobacteriilor, brucelelor,ţ ţ etc). În aceste cazuri RHS se prelungeşte şi se manifest prin formarea, în câteva s pt mâniă ă ăetc). În aceste cazuri RHS se prelungeşte şi se manifest prin formarea, în câteva s pt mâniă ă ă sau luni, a unui granulom.sau luni, a unui granulom.În componen a granulomului se disting 3 zone: central , din celule epitelioide, intermediarţ ă ăÎn componen a granulomului se disting 3 zone: central , din celule epitelioide, intermediarţ ă ă – din limfocite şi fibroblaste şi periferic – din leucocite PMN, limfocite B şi plasmocite.ă– din limfocite şi fibroblaste şi periferic – din leucocite PMN, limfocite B şi plasmocite.ă Granulomul poate fi supus fibrozei şi calcifierii, persistând mai mul i ani.ţGranulomul poate fi supus fibrozei şi calcifierii, persistând mai mul i ani.ţ

Hipersensibilitatea de contactHipersensibilitatea de contact este determinat de haptene (metale grele - Ni, Cr, substan eă ţ este determinat de haptene (metale grele - Ni, Cr, substan eă ţ chimice – cauciuc, clei, pesticide, vopsele, produse cosmetice, medicamente). chimice – cauciuc, clei, pesticide, vopsele, produse cosmetice, medicamente). Aplicate percutanAplicate percutan se combin cu proteinele membranare, în special ale celulelor Langerhansăse combin cu proteinele membranare, în special ale celulelor Langerhansă din epiderm . Aceasta duce la expansiunea clonal a limfocitelor TCD8+. La contacteă ădin epiderm . Aceasta duce la expansiunea clonal a limfocitelor TCD8+. La contacteă ă repetate cu aceeaşi hapten , citokinele eliberate de limfocitele activate determin infiltrareaă ărepetate cu aceeaşi hapten , citokinele eliberate de limfocitele activate determin infiltrareaă ă celular a glandelor sudoripare, sebacee, a foliculilor piloşi, a epidermei. Peste 48-72 oreăcelular a glandelor sudoripare, sebacee, a foliculilor piloşi, a epidermei. Peste 48-72 oreă local se observ eritem, edem şi formarea veziculelor.ălocal se observ eritem, edem şi formarea veziculelor.ăExplorarea hipersensibilit ii tardiveăţExplorarea hipersensibilit ii tardiveăţT e s t e c u t a n a t e (in vivo)T e s t e c u t a n a t e (in vivo)Dermatitele de contactDermatitele de contact se depisteaz prin aplicarea cutanat a haptenelor şi examinareaă ă se depisteaz prin aplicarea cutanat a haptenelor şi examinareaă ă eritemului, infiltratului cutanat şi a veziculelor ap rute peste 48 ore.ăeritemului, infiltratului cutanat şi a veziculelor ap rute peste 48 ore.ăHipersensibilitatea tuberculinicăHipersensibilitatea tuberculinică se exploreaz prin introducerea intradermic a ă ă se exploreaz prin introducerea intradermic a ă ă alergeniloralergenilor microbieni: microbieni: tuberculina (derivat proteic al unei culturi de tuberculina (derivat proteic al unei culturi de Mycobacterium tuberculosisMycobacterium tuberculosis),), brucelina, tularina, antraxina, dizenterina, etc.brucelina, tularina, antraxina, dizenterina, etc.Peste 48 ore se m soar diametrul eritemului şi indura ieă ă ţPeste 48 ore se m soar diametrul eritemului şi indura ieă ă ţ i. i. Reac ia pozitiv denot c organismul a fost în contact cu alergenul (infec ie anterioar sauţ ă ă ă ţ ăReac ia pozitiv denot c organismul a fost în contact cu alergenul (infec ie anterioar sauţ ă ă ă ţ ă actual , vaccinare) şi c acesta persist în macrofagele organismului. Pentru confirmareaă ă ăactual , vaccinare) şi c acesta persist în macrofagele organismului. Pentru confirmareaă ă ă maladiei sunt necesare investiga ii suplimentare. ţmaladiei sunt necesare investiga ii suplimentare. ţ

T e s t e i n T e s t e i n v i t r ov i t r oTestul de transformare limfoblasticăTestul de transformare limfoblastică (limfocitele unei persoane cu hipersensibilitate tardivă (limfocitele unei persoane cu hipersensibilitate tardivă cultivate in vitro în prezen a Ag /alergenului suport o transformare blastic cu proliferareţ ă ăcultivate in vitro în prezen a Ag /alergenului suport o transformare blastic cu proliferareţ ă ă ulterioar ).ăulterioar ).ă

49

Testul de inhibi ie a migr rii leucocitelorţ ăTestul de inhibi ie a migr rii leucocitelorţ ă (activarea limfocitelor T de c tre Ag specifice duceă (activarea limfocitelor T de c tre Ag specifice duceă la secre ia citokinelor care inhib migrarea leucocitelor) ţ ăla secre ia citokinelor care inhib migrarea leucocitelor) ţ ă

59. Imunizarea artificiala activa. Vaccinurile. Caracteristica imunitatii postvaccinale. Vaccinarea primara si de rapel. Cerintele fata de vaccinuri. Notiuni de vaccinoterapie si vaccinoprofilaxie.

60. Vaccinurile vii atenuate. Obtinerea, avantajele si dezavantajele vaccinurilor vii. Exemple.

61. Vaccinurile inactivate (omorate). Obtinerea, avantajele si dezavantajele vaccinurilor inactivate. Exemple. Autovaccinul, utilizarea practica. 62. Vaccinurile subunitare (fragmentate, chimice) si anatoxinele. Obtinerea, avantajele si dezavantajele vaccinurilor subunitare. Notiune de adjuvant. Vaccinurile adsorbite.

63. Imunizarea artificial a pasiva, caracteristica. Preparatele biologice cu anticorpi, tipurile, cerintele fata de ele.

64. Clasificarea serurilo r imune curative dupa provenienta si modul de actiune. Caracteristica lor, avantajele si dezavantajele serurilor omoloage si heteroloage.

65. Utilizarea practica a preparatelor biologice cu anticorpi. Modul de administrare, reactiile adverse si prevenirea lor.

66. Rectiile antigen (Ag) – anticorp (Ac) in vitro. Caracteristica legaturii Ag-Ac. Fazele interactiunii Ag-Ac. Aplicarea practica a reactiilor serologice. Serurile imune diagnostice, diagnosticurile: obtinerea, aplicarea practica.

Studiul şi aprecierea imunit ii poate fi efectuat prin intermediul diferitor teste realizate ăţ ăStudiul şi aprecierea imunit ii poate fi efectuat prin intermediul diferitor teste realizate ăţ ă inin vitrovitro sau sau in vivo in vivo (reac ii imunologice).ţ(reac ii imunologice).ţPentru aprecierea r spunsului imun umoral se studiaz interac iunea dintre Ag şi Ac, iară ă ţPentru aprecierea r spunsului imun umoral se studiaz interac iunea dintre Ag şi Ac, iară ă ţ pentru aprecierea imunit ii celulare se determin num rul total de limfocite, subclaseleăţ ă ăpentru aprecierea imunit ii celulare se determin num rul total de limfocite, subclaseleăţ ă ă limfocitelor T, se evalueaz citokinele, etc. ălimfocitelor T, se evalueaz citokinele, etc. ăREACREACŢŢIIILEILE ANTIGEN-ANTICORP in vitro (REAC ANTIGEN-ANTICORP in vitro (REACŢŢIIILEILE SEROLOGI SEROLOGICCE)E)RReaceacţţiiaa Ag-Ac est Ag-Ac estee d determinat de ăeterminat de ă interacinteracţţiiuunneaea specifi specificăcă dintre epitop dintre epitopiiii A Antintiggenuluienului şişi paratopparatopiiii A Antinticcorpilororpilor. . În acest proces intervin patruÎn acest proces intervin patru t tiippuriuri de l de leg turiăeg turiă : l: leg turi deăeg turi deă h hiidrogen,drogen, lleg turiăeg turiă electrostati electrostaticce, fore, forţţeelele Van der Waals Van der Waals şişi l leg turiăeg turiă h hiidrodroffobe.obe.

Leg tura ăLeg tura ă Ag-Ac a Ag-Ac arere tr treei caracteristii caracteristicici: est: estee exotermi exotermicăcă, specifi, specificăcă şişi reversib reversibiillăă..AAfinitfinitatateeaa un unuiui Ac p Ac pentruentru un un Ag specifiAg specificc caracteri caracterizzeeazăază intensitintensitatateeaa for forţţeelorlor de l de leg tură ăeg tură ă aa complexcomplexuluiului Ag-Ac. Ag-Ac. E Eaa depinde de cdepinde de complementaritomplementaritatateeaa steri stericăcă didintre paratop ntre paratop şişi epitop epitop.. AAviditviditatateeaa uunnuiui Ac p Ac pentru un entru un Ag specifiAg specificc reprezint reprezintăă rapiditrapiditatateeaa apari apariţţiieiei manifest rii ămanifest rii ă reacreacţţiieiei Ag-AcAg-Ac ((precipitaprecipitarere, aglutina, aglutinare, etc.)re, etc.). E. Eaa dep depiindndee de constant de constantaa d de e asociasociereere, de , de vvalenalen aţaţ Ac, d Ac, dee nnuummăărrulul d de e epitopepitopii, de temperatur, de temperaturăă, d, dee pH, de for pH, de for aţaţ ioni ionicăcă aa m mediuluiediului..Un paratop se Un paratop se poate poate combina combina cu cu unun singur singur epitop, epitop, numitnumit “specifi “specificc”. ”. AstfelAstfel,, dac esteădac esteă ccuunnoscutoscut un unulul d dinin element elementeleele reac reacţţiieiei - Ag - Ag sausau Ac, p Ac, poaoatte fie fi identifi identificatcat cel laltăcel laltă

Reac iile Ac-Ac (reac iile serologice) au dou direc ii de aplicare practic :ţ ţ ă ţ ăReac iile Ac-Ac (reac iile serologice) au dou direc ii de aplicare practic :ţ ţ ă ţ ăSSeroidentificaeroidentificare: re: DDetectetectareaarea şişi do dozzaarreeaa Ag Ag ((element element necunoscutnecunoscut - - tulpin tulpinii microbienemicrobiene izolate din diferite prelevate)izolate din diferite prelevate) cu ajutorul cu ajutorul Ac specifiAc specifici cunoscu iţci cunoscu iţ .. PoPott fi fi utili utilizatezate d douăouă sur surssee dde e Ac: Ac: Ac monoclonAc monoclonaliali, , absolut absolut omogenomogeni, dar care i, dar care recrecuunnoosscc doardoar un singurun singur epitop epitop şişi Ac polAc poliiclonclonaliali, , ce se ce se concon inţinţ înîn seruri imune (seruri imune (antiseruriantiseruri)), , carecare perm permiitt lleg turiăeg turiă de avidit de aviditatatee înaltă înaltă cucu Ag. Ag. Serurile imune se ob inţSerurile imune se ob inţ prinprin injecta injectarearea lla un animal de laborator a un animal de laborator aa antigene antigenelorlor c cununooscscuutete.. Dup o perioad deă ăDup o perioad deă ă t tiimp, serump, serull animalu animaluluilui va va conconţţiinne anticorpe anticorpii contr contraa aceacesstortor antigene. antigene. DarDar natura exact a Ac din acest ser nu poate fi cunoscut cu exactitate (Ac policlonali)ă ănatura exact a Ac din acest ser nu poate fi cunoscut cu exactitate (Ac policlonali)ă ă .. SSpecificitpecificitatateeaa seru seruluilui trebuie s fie permanent controlat şi ă ătrebuie s fie permanent controlat şi ă ă Ac Ac nedori i trebuie s fieţ ănedori i trebuie s fieţ ă eliminelimina iţa iţ pr prinin adsor adsorbţbţiiee..

50

SSerodiagnosticerodiagnostic:: DDetectetectareaarea şişi titra titrarreeaa Ac Ac din serul bolnavilor din serul bolnavilor (component necunoscut)(component necunoscut) fa de uţăfa de uţă n Ag specifin Ag specificc c cununooscutscut ( (con inut în diagnosticuriţcon inut în diagnosticuriţ )).. Unele Unele reacreacţţiiii Ag-Ac se manifest Ag-Ac se manifestăă direct direct şi pot fi şi pot fi observatobservatee de experimentatde experimentatoor: r: dede exempl exempluu precipitaprecipitarearea sasau u aglutinaaglutinarearea complexe complexelorlor Ag-Ac Ag-Ac, , llizaiza unor celule purt toare de Ag peăunor celule purt toare de Ag peă membrana lor membrana lor (hemol(hemolizăiză, bacteriol, bacteriolizăiză, etc)., etc).AlteAlte reac reacţţiiii Ag-Ac n Ag-Ac nuu se vi se vizzualiualizzeeazăază “spontan” in vitro. “spontan” in vitro. În acest caz se vaÎn acest caz se va recur recurge lage la niştenişte artificartificiiii experimenta experimentale, cum ar fi utilizareale, cum ar fi utilizarea Ac “mar Ac “marca iţca iţ ”:”:Ac marAc marca iţca iţ cucu un fluorocrom: un fluorocrom: imunofluorescen imunofluorescen aţaţ ..Ac marAc marca iţca iţ cucu un i un izzotop radioactiv: otop radioactiv: analiza radio-imun analiza radio-imunăă..Ac marAc marca iţca iţ cu ocu o enz enziimmăă:: analiza imunoenz analiza imunoenziimatimaticăcă..INTERAC IŢINTERAC IŢ UNUNEAEA ANTIGEN-ANTICORP ANTIGEN-ANTICORPFaza specificăFaza specifică: are loc interac iunea dintre Ag şi Ac specific corespţ: are loc interac iunea dintre Ag şi Ac specific corespţ uunz torănz toră . . Este Este unun ffenomen rapid, invienomen rapid, invizzibibiil, comun l, comun pentrupentru to toateate reac reacţţiiileile Ag-Ac. Ag-Ac. Decurge la temperatura de 37 Decurge la temperatura de 37 C, în prezen a unui electrolit (sol. fiziologic ).ţ ăC, în prezen a unui electrolit (sol. fiziologic ).ţ ă Faza nespecificăFaza nespecifică,, vivizzibibiillăă a uniunii Ag-Ac, se manifest prinăa uniunii Ag-Ac, se manifest prină precipit precipitararee, , aglutinaaglutinarere, , liz , etcăliz , etcă -- fenomene determinate de anumite condi ii (valen a Ac, dimensiunile Ag, etc).ţ ţ fenomene determinate de anumite condi ii (valen a Ac, dimensiunile Ag, etc).ţ ţ

67. Reactia de aglutinare (RA) . Componentele, mecanismul. Reactiile de aglutinare directa (pe lama, in tuburi). Lectura si aprecierea rezultatelor reactiilor. Aplicarea practica.

REAC IA DE AGLŢREAC IA DE AGLŢ UTINAREUTINAREDin latinăDin latină – agglutinatio - încleiere – agglutinatio - încleiereReac ia Ag-Ac se poate manifesta prin ţReac ia Ag-Ac se poate manifesta prin ţ aglutinareaglutinare atunci când determinantele antigenice atunci când determinantele antigenice sunt purtate de sunt purtate de particule figurateparticule figurate (Ag insolubile, corpusculare), iar (Ag insolubile, corpusculare), iar AcAc specifici sunt specifici sunt comple iţcomple iţ (cel pu in bivalen i). ţ ţ (cel pu in bivalen i). ţ ţAglutinarea este determinat de formarea unei re ele între Ag şi Ac, ce permite apropiereaă ţAglutinarea este determinat de formarea unei re ele între Ag şi Ac, ce permite apropiereaă ţ unui num r suficient de particule figurate pentru a constitui aglutinate vizibile cu ochiulăunui num r suficient de particule figurate pentru a constitui aglutinate vizibile cu ochiulă liber. Ac IgM cu 10 epitopi poten iali aglutineaz mai activ decât Ac IgG. ţ ăliber. Ac IgM cu 10 epitopi poten iali aglutineaz mai activ decât Ac IgG. ţ ăClasificarea reac iilor de aglutinareţClasificarea reac iilor de aglutinareţAglutinare “Aglutinare “activăactivă” sau “” sau “directădirectă”, în care particula figurat (Ag corpuscular) este el însuşiă”, în care particula figurat (Ag corpuscular) este el însuşiă purt tor de determinante antigenice specifice (hematii, leucocite, trombocite, spermatozoizi,ăpurt tor de determinante antigenice specifice (hematii, leucocite, trombocite, spermatozoizi,ă bacterii)bacterii)Aglutinare “Aglutinare “pasivăpasivă” sau “” sau “indirectăindirectă”, în care particula serveşte doar de suport pentru un”, în care particula serveşte doar de suport pentru un determinant antigenic solubil fixat artificial determinant antigenic solubil fixat artificial pepe suprafa a sa. Frecvent sunt utilizate ţ suprafa a sa. Frecvent sunt utilizate ţ ca suportca suport hematii formolate, particule de latex sau microcristale de colesterol.hematii formolate, particule de latex sau microcristale de colesterol.ReactiReactiii d de e aglutinaaglutinarere activ activaa (direct (directaa))Aspect Aspect ccalitatialitativvRReactieactiaa p poateoate fi fi efectuefectuataata pepe lam lamaa de de sticlasticla sau isau in tubn tuburiuri..RReactieactiaa pepe lam lama a Se amesteca o picatura dSe amesteca o picatura de sere ser si o picatura si o picatura de suspensi de suspensiee bacteriana (Ag)bacteriana (Ag). . LLecturecturaa se fa se facece lala microscop microscop sasau u cu ochiul libercu ochiul liber. . IIn can cazz de reacti de reactiee po pozzitivitiva apar conglomerate, iar a apar conglomerate, iar lichidul lichidul se se clarificaclarifica; ; iin can cazz de reacti de reactiee negativ negativaa,,lichidullichidul r ramaneamane tulburetulbure. .

RReactieactiaa iin tubn tuburiuriIn eprubeta se amestecaIn eprubeta se amesteca seru serull sisi Ag figur Ag figurateate (hemati (hematiii, bacteri, bacteriii)).. RReactieactiaa po pozzitivitivaa se se manifestamanifesta pr prinin forma formarearea un unuiui sediment sediment ccu aspect de u aspect de umbrelaumbrela invers inversataata lala f fuundndulul tub tuburilor (peste 20-24 ore)urilor (peste 20-24 ore) şi clarificarea lichidului. şi clarificarea lichidului. Aprecierea intensita Aprecierea intensita ii reac ieiţ ţii reac ieiţ ţ se efectueaza dupa sistema de 4 plusuri (++++).se efectueaza dupa sistema de 4 plusuri (++++). CCeluleelulelele n neeaglutinaglutinatate e se se sedimentesedimenteazaaza lala f fuundndulul tub tuburilorurilor su subb form formaa de buton de buton sasau u inelinel (reacti(reactiee negativ negativaa). ). LLecturecturaa se fa se facece cu ochiul liber saucu ochiul liber sau folosind folosind oglinda oglinda concav concavaa a a microscopului.microscopului.Aspect Aspect ccantitatiantitativvMMetodetodaa diluti dilutiilorilor succesive succesiveInitial se efectueaza dilutii succesive ale serului (1/50, 1/100, 1/200, etc) in care se introducInitial se efectueaza dilutii succesive ale serului (1/50, 1/100, 1/200, etc) in care se introduc ulterior culterior cantitantitatiati egale egale dde e Ag. Ag. Termostat – 2 ore, apoi la t camerei Termostat – 2 ore, apoi la t camerei 18-20 ore18-20 ore. . ApreciereaAprecierea: cea mai mare dilutie a serului in care se manifesta aglutinare de cel putin : cea mai mare dilutie a serului in care se manifesta aglutinare de cel putin 33 “+” (+++)“+” (+++) se numeste se numeste titrul titrul aanticorpilor aglutinantinticorpilor aglutinanti (titrul serului aglutinant) (titrul serului aglutinant)..

51

AAglutinaglutinarearea direct directaa est estee utili utilizatazata p pententrruu determin determinaarreaea grupe grupelorlor sang sangvvininee sasau u inin diagnostic diagnosticulul unorunor maladi maladiii infecti infectioaoase (seroidentificarea Ag sau depistarea şi titrarea Ac din serulse (seroidentificarea Ag sau depistarea şi titrarea Ac din serul bolnavilor) .bolnavilor) .ReactiReactilele d de e aglutinaaglutinarere pasiv pasivaa (indirect (indirectaa))AAglutinaglutinarearea pasiv pasivaa const constaa inin fix fixaarreaea un unuiui Ag solub Ag solubiil (l (sasau u alal unui unui Ac) Ac) pepe un suport un suport corpuscularcorpuscular inertinert, care nu , care nu intervinterviinnee inin reacti reactiaa Ag-Ac. Ag-Ac. In calitate de suport inert pot servi hematiile,In calitate de suport inert pot servi hematiile, particule particule de latex, de latex, ccristaristalele de colesterol. de colesterol. SSuspensiuspensiaa de particule de particule sensibilizate cu Ag sau Acsensibilizate cu Ag sau Ac estestee pusa inpusa in contact contact ccu seruu serull imun ( imun (respectivrespectiv cucu Ag), Ag), ca si in cazul aglutinarii directe. ca si in cazul aglutinarii directe.

Avantajele Avantajele reactireactiilorilor indirecte indirecte:: facilit facilitatateeaa lectur lecturiiii sisi sensibilit sensibilitatateea inaltaa inalta. . RReactieactiaa d de e hemaglutinahemaglutinarere indirect indirecta a ((pasivpasivaa) – RHAI / RHAP) – RHAI / RHAP Unele Unele antigeneantigene de origine polizaharidica de origine polizaharidica se fixe se fixeazaaza pra pracctiticc spontanspontan, , dupadupa oo sscurtcurtaa incubati incubatiee,, pe suprafatape suprafata hemati hematiilor. Ailor. Antigenentigenelele protei proteicece se fixe se fixeazaaza doar dupadoar dupa oo pre preggatiatirere prealab prealabiillaa aa hematihematiilorilor ( (de ex.: tratarea cu de ex.: tratarea cu tanitaninana, formol). , formol). RHAIRHAI se efectuează se efectuează in godeurile in godeurile uneuneii pla placi din polistirenci din polistiren. . RReactieactiaa po pozzitivitivaa se se manifestamanifesta pr prinin aglutinaaglutinarearea eritrocitelor eritrocitelor sensibilizate sensibilizate (umbrela inversata de culoare bruna(umbrela inversata de culoare bruna la fundul la fundul godeurilorgodeurilor))..În reac ia de latex-aglutinare Ac sau Ag sunt fixa i pe particule de latex. Reac ia seţ ţ ţÎn reac ia de latex-aglutinare Ac sau Ag sunt fixa i pe particule de latex. Reac ia seţ ţ ţ efectueaz pe lama de sticl . ă ăefectueaz pe lama de sticl . ă ă

Reac ia de latex-aglutinare este utiliţReac ia de latex-aglutinare este utiliţ zatazata iin identificarea factn identificarea factoorrulului rui reeumatoid umatoid lala bolnavibolnavi suspectsuspectii de pol de poliiartritartritaa r reeumatoidumatoidaa, , iin bacteriologie pn bacteriologie pentruentru identificarea rapid a mi/o sau Agă identificarea rapid a mi/o sau Agă lor în prelevate, sau identificarea tulpinilor izolate, de asemenea pentru serodiagnosticullor în prelevate, sau identificarea tulpinilor izolate, de asemenea pentru serodiagnosticul unor infec ii.ţunor infec ii.ţ

Reac ia de Co-aglutinare. ţReac ia de Co-aglutinare. ţLa baza acestei reac ii se afl proprietatea unei bacterii – ţ ăLa baza acestei reac ii se afl proprietatea unei bacterii – ţ ă Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus (tulpina (tulpina CowanCowan) - ce are în componen a peretelui celular proteina Aţ) - ce are în componen a peretelui celular proteina Aţ - - s fixeze Ig G prin intermediulă s fixeze Ig G prin intermediulă fragmentului Fc. Astfel se formeaz diagnosticuri cu Ac, cu ajutorul carora pot fi identificareăfragmentului Fc. Astfel se formeaz diagnosticuri cu Ac, cu ajutorul carora pot fi identificareă Ag respective necunoscute. Reac ia se efectueaz pe lam .ţ ă ăAg respective necunoscute. Reac ia se efectueaz pe lam .ţ ă ăREAC IA COOMBSŢREAC IA COOMBSŢUnii Ac (monovalen i) nu sunt aglutinan i în condi ii normaleţ ţ ţUnii Ac (monovalen i) nu sunt aglutinan i în condi ii normaleţ ţ ţ , fiind monovalenti , fiind monovalenti (ex.:(ex.: anticorpii anti-Rh, responsabili de incompatibilitatea materno-fetal în sistemul Rh). Ei pot fiăanticorpii anti-Rh, responsabili de incompatibilitatea materno-fetal în sistemul Rh). Ei pot fiă depista i gra ie testelor Coombs.ţ ţdepista i gra ie testelor Coombs.ţ ţSunt posibile 2 tehnici, în func ie de prelevat: sânge de la nou-n scut sau de la femeiaţ ăSunt posibile 2 tehnici, în func ie de prelevat: sânge de la nou-n scut sau de la femeiaţ ă gravid .ăgravid .ă

Tehnica Coombs direct .ăTehnica Coombs direct .ă La un nou-n scut se caut prezen a Ac materni anti-Rh fixa i peă ă ţ ţ La un nou-n scut se caut prezen a Ac materni anti-Rh fixa i peă ă ţ ţ hematii, dac mama este Rh-. La aceste hematii suspecte se adaăhematii, dac mama este Rh-. La aceste hematii suspecte se adaă uug un ser anti-Ig uman .ă ăg un ser anti-Ig uman .ă ă Acest ser nu aglutineaz hematiile normale, din contra, el provoac aglutinarea hematiiloră ăAcest ser nu aglutineaz hematiile normale, din contra, el provoac aglutinarea hematiiloră ă pe care sunt fixa i Ac anti-Rh.ţpe care sunt fixa i Ac anti-Rh.ţTehnica Coombs indirect . ăTehnica Coombs indirect . ă La o femeie gravid Rh- Ac anti-Rh sunt prezen i în ser. Ini ială ţ ţLa o femeie gravid Rh- Ac anti-Rh sunt prezen i în ser. Ini ială ţ ţ la acest ser se agala acest ser se agauug hematii Rh+ (pentru formarea complexului Ag-Ac), apoi se aplică ăg hematii Rh+ (pentru formarea complexului Ag-Ac), apoi se aplică ă serul anti-Ig.serul anti-Ig.

68. Reactia de hemaglutinare indirect a (RHAI) cu scop de seroidentificare. Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor RHAI. Aplicarea practica.

69. Reactia de hemaglutinare indirecta (RHAI) cu scop de seroidiagnostic. Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor RHAI. Aplicarea practica.

70. Reactiile de aglutinare pasiva (indirecta). Reactiile de latexaglutinare si de co- aglutinare. Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor reactiilor. Aplicarea practica.

71. Reactia Coombs. Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor reactiilor. Aplicarea practica.

52

72. Reactiile de precipitare. Mecanismul. Conditiile formarii retelei de precipitare. Reactia de precipitere inelara. Componentele. Lectura si aprecierea rezultatelor reactiilor. Aplicarea practica.

73. Reactiile de precipitare in gel. Clasificarea. Reactia de imunodifuzie dubla (tehnicile Elek, Ouchterlony). Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor reactiilor. Aplicarea practica.

REACTIILE DE PRECIPITAREREACTIILE DE PRECIPITAREImunoprecipitarea se manifesta doar atunci cand Imunoprecipitarea se manifesta doar atunci cand Ag solubilAg solubil este amestecat cu Ac este amestecat cu Ac corespunzator. Ea poate fi observata sau in mediu lichid, sau solid, fiind sau calitativa, saucorespunzator. Ea poate fi observata sau in mediu lichid, sau solid, fiind sau calitativa, sau cantitativa. Acestea sunt reactii specifice dar putin sensibile, ce necesita cantitati importantecantitativa. Acestea sunt reactii specifice dar putin sensibile, ce necesita cantitati importante de anticorpi. de anticorpi. Precipitarea complexelor moleculare rePrecipitarea complexelor moleculare rezzultate din uniunea Ag-Ac este determinata deultate din uniunea Ag-Ac este determinata de formarea unei retele tridimensionale de Ag reunite prin Ac.formarea unei retele tridimensionale de Ag reunite prin Ac.ConCondi iile de formare a ţdi iile de formare a ţ rereţţelei de precipitare:elei de precipitare:Ac sa fie cel putin bivalent (Ac completi)Ac sa fie cel putin bivalent (Ac completi)Ag sa fie multivalent (haptenele nu pot fi precipitate)Ag sa fie multivalent (haptenele nu pot fi precipitate)Precipitarea maxima corespunde cu zona de echivalenPrecipitarea maxima corespunde cu zona de echivalenţăţă, unde Ac si Ag sunt in raport, unde Ac si Ag sunt in raport optimal de concentraoptimal de concentraţţie, ce permite precipitarea tuturor moleculelor de Ac cu Agie, ce permite precipitarea tuturor moleculelor de Ac cu Ag corespunzator.corespunzator. În exces de Ag sau de Ac precipitatul nu se formeaz .ă În exces de Ag sau de Ac precipitatul nu se formeaz .ăUtilizare:Utilizare: în în medicina legala (determinarea apartenenmedicina legala (determinarea apartenenţţei de specie a diferitor proteineei de specie a diferitor proteine:: sânge, sperm , etcăsânge, sperm , etcă ),), în în igiena alimentar igiena alimentarăă ( (depistarea depistarea falsificfalsificăărriiii alimentelor), alimentelor), în în diagnosticuldiagnosticul maladiilor infectioase, etc maladiilor infectioase, etc PRECIPITAREA IN MEDIU LICHIDPRECIPITAREA IN MEDIU LICHIDReactia de precipitare inelaraReactia de precipitare inelaraIntr-un tub cu diametrul de cinci millimetri se introduce Intr-un tub cu diametrul de cinci millimetri se introduce serul imunserul imun; pipeta se inclina si pe; pipeta se inclina si pe peretii ei se lasa sa se prelinga incet solutia de Ag, ca sa nu se amestece cu serul. Daca Acperetii ei se lasa sa se prelinga incet solutia de Ag, ca sa nu se amestece cu serul. Daca Ac din ser corespund cu Agdin ser corespund cu Ag, in zona de separare a celor doua lichide, in zona de separare a celor doua lichidese formeaza un inel alb, ceea ce se formeaza un inel alb, ceea ce semnifica precipitarea semnifica precipitarea complexului Ag-Ac. complexului Ag-Ac. Avantajul metodeiAvantajul metodei – rapiditatea – rapiditateasi simplicitatea. si simplicitatea. Utilizarea practicaUtilizarea practica: identificarea : identificarea petelor de sange, depistarea falsificarilorpetelor de sange, depistarea falsificarilorproduselor alimentare, depistarea produselor alimentare, depistarea antigenului polizaharidic al agentului antigenului polizaharidic al agentului antraxului in omogenat antraxului in omogenat dde organe (reactia Ascoli).e organe (reactia Ascoli).Reac ia de floculare (tehnica Ramon)ţReac ia de floculare (tehnica Ramon)ţSe efectueaz dilu ia succesiv a serului imun (Ac) la care se adaă ţ ăSe efectueaz dilu ia succesiv a serului imun (Ac) la care se adaă ţ ă uuga cantit i egale de Ag.ăţga cantit i egale de Ag.ăţ Se întroduc probele în termostat şi periodic se examineaz pentru depistarea tubului în careăSe întroduc probele în termostat şi periodic se examineaz pentru depistarea tubului în careă apare apare precipitatul ini ial (zona de echivalen ).ţ ţăprecipitatul ini ial (zona de echivalen ).ţ ţăUtilizare:Utilizare: pentru determinarea cantit ii de toxin , antitoxin sau anatoxin .ăţ ă ă ă pentru determinarea cantit ii de toxin , antitoxin sau anatoxin .ăţ ă ă ă

PRECIPITAREA ÎN MEDIU SOLID (ÎN GEL)PRECIPITAREA ÎN MEDIU SOLID (ÎN GEL)În aceste reac ii Ag şi Ac difuzeaz unul spre altul prin geloz şi în zona de concentra ieţ ă ă ţÎn aceste reac ii Ag şi Ac difuzeaz unul spre altul prin geloz şi în zona de concentra ieţ ă ă ţ optim a acestor dou reactive se produce precipitarea sub form de linii albe-cenuşii. Dacă ă ă ăoptim a acestor dou reactive se produce precipitarea sub form de linii albe-cenuşii. Dacă ă ă ă exist mai multe sisteme Ag-Acăexist mai multe sisteme Ag-Acă ,, se vor forma linii de precipitare distincte. Poate fi utilizat înă se vor forma linii de precipitare distincte. Poate fi utilizat înă analiza calitativ a unui ăanaliza calitativ a unui ă amestecamestec de Ag într-o solu ie. ţ de Ag într-o solu ie. ţImunodifuzia simpl radial (tehnicaă ăImunodifuzia simpl radial (tehnicaă ă Mancini) Mancini)Se efectueaz pe o plac acoperit cu geloz , în care sunt încorpora i Ac specifici. Ag esteă ă ă ă ţSe efectueaz pe o plac acoperit cu geloz , în care sunt încorpora i Ac specifici. Ag esteă ă ă ă ţ depus în godeurile din stratul de geloz . Ag difuzeaz radial în geloz pe parcursul a 48 ore.ă ă ădepus în godeurile din stratul de geloz . Ag difuzeaz radial în geloz pe parcursul a 48 ore.ă ă ă Dac Ag corespunde Ac, atunci are loc formarea de discuri de precipitare, cu suprafa aă ţDac Ag corespunde Ac, atunci are loc formarea de discuri de precipitare, cu suprafa aă ţ propor ional concentra iei Ag din godeu. Se utilizez pentru depistarea şi cuantificarea Ig,ţ ă ţ ăpropor ional concentra iei Ag din godeu. Se utilizez pentru depistarea şi cuantificarea Ig,ţ ă ţ ă hormonilor, enzimelor, etc.hormonilor, enzimelor, etc.Imunodifuzie dubl ăImunodifuzie dubl ă(tehnicile Ouchterlony şi Elek)(tehnicile Ouchterlony şi Elek)Se acoper cu geloz o plac de sticl sau se toarn ă ă ă ă ăSe acoper cu geloz o plac de sticl sau se toarn ă ă ă ă ă geloza în cutia Petri. geloza în cutia Petri.

53

În tehnica Ouchterlony Ag şi Ac difuzeaz din godeurile situate la o distan de 15 mm unulă ţăÎn tehnica Ouchterlony Ag şi Ac difuzeaz din godeurile situate la o distan de 15 mm unulă ţă de altul. de altul. În tehnica Elek cele 2 reactive difuzeaz din benzile de hârtie plasate pe suprafa a gelozei. ă ţÎn tehnica Elek cele 2 reactive difuzeaz din benzile de hârtie plasate pe suprafa a gelozei. ă ţMoleculele difuzeaz în gel în func ie de greutatea lor şi formeaz ă ţ ăMoleculele difuzeaz în gel în func ie de greutatea lor şi formeaz ă ţ ă linii de precipitarelinii de precipitare pentru pentru fiecare sistem Ag-Ac ce corespund în zona lor de echivalen . Dac dou Ag sunt identice,ţă ă ăfiecare sistem Ag-Ac ce corespund în zona lor de echivalen . Dac dou Ag sunt identice,ţă ă ă liniile lor se unesc, dac sunt diferite – se intersecteaz . ă ăliniile lor se unesc, dac sunt diferite – se intersecteaz . ă ă UtilizareaUtilizarea – determinarea toxinelor – determinarea toxinelor (toxigeneza), antitoxinelor, Ag proteice (toxigeneza), antitoxinelor, Ag proteice

Contraimunoelectroforeza (CIEF)Contraimunoelectroforeza (CIEF)Este util la examinarea amestecurilor antigenice complexe. ăEste util la examinarea amestecurilor antigenice complexe. ă Lectura este posibila peste 90Lectura este posibila peste 90 minute.minute.Geloza este turnat pe o plac de sticl , Ag şi Ac sunt dispuşi în rezervoare circulare de 2ă ă ăGeloza este turnat pe o plac de sticl , Ag şi Ac sunt dispuşi în rezervoare circulare de 2ă ă ă mm diametru, la o distan de 10 mm. În timpul ţămm diametru, la o distan de 10 mm. În timpul ţă electroforezeielectroforezei Ag, înc rcat negativ,ă Ag, înc rcat negativ,ă migreaz spre polul pozitiv, întâlnind Ac care migreaz spre catod. ă ămigreaz spre polul pozitiv, întâlnind Ac care migreaz spre catod. ă ă LLa interac iunea Ag şi Acţa interac iunea Ag şi Acţ omologi are loc formarea liniei de precipitare. CIEF serveşte la examinarea componenteloromologi are loc formarea liniei de precipitare. CIEF serveşte la examinarea componentelor Ag din lichide biologice: LCR, urin , lichid pleural, ascit , etc.ă ăAg din lichide biologice: LCR, urin , lichid pleural, ascit , etc.ă ă

74. Reactia de fixare a complementului (RFC) cu scop de seroidiagnostic. Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor reactiei. Aplicarea practica.

75. Reactia de fixare a complementului (RFC) cu scop de seroidentificare. Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor reactiei. Aplicarea practica.

76. Reactia de imunofluorescenta (RIF, reactia Coons) directa. Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor reactiei. Aplicarea practica.

REAC II DE CITOLIZ IMUNŢ Ă ĂREAC II DE CITOLIZ IMUNŢ Ă Ă (cu participarea complementului) (cu participarea complementului)Activarea frac iilor complementului (C) duce la liza particulei purt toare de Ag (hematii,ţ ăActivarea frac iilor complementului (C) duce la liza particulei purt toare de Ag (hematii,ţ ă bacterii, diverse celule...)bacterii, diverse celule...)Activarea complementuluiActivarea complementuluiCalea clasicăCalea clasicăCalea alternativăCalea alternativăCalea lectinicăCalea lectinică

Activarea C pe cale clasicăActivarea C pe cale clasicăActivatorulActivatorul î îll constituie constituie complexe Ag-Accomplexe Ag-Ac (IgG, IgM) (IgG, IgM)Consecutivitatea activ rii C: Ag-Ac fixeaz frac ia C1qrs, care că ă ţConsecutivitatea activ rii C: Ag-Ac fixeaz frac ia C1qrs, care că ă ţ aap t ulterior activitateă ăp t ulterior activitateă ă esterazic (în prezen a obligatorie a Caă ţesterazic (în prezen a obligatorie a Caă ţ ++++) ) C1 activeaz C4, cu formarea complexului AgAcC1C4b. Este apoi activat C2ăC1 activeaz C4, cu formarea complexului AgAcC1C4b. Este apoi activat C2ă (AgAcC1C4bC2a), complexul C4bC2a devenind convertaz ce ac ioneaz asupra C3ă ţ ă(AgAcC1C4bC2a), complexul C4bC2a devenind convertaz ce ac ioneaz asupra C3ă ţ ăUrmeaz clivarea C3 în C3a (anafilotoxin ) şi C3b, care se uneşte de complexă ăUrmeaz clivarea C3 în C3a (anafilotoxin ) şi C3b, care se uneşte de complexă ă (AgAcC1C4bC2aC3b)(AgAcC1C4bC2aC3b), , formând C5-convertaza, care cliveaz C5 în C5a şi C5băformând C5-convertaza, care cliveaz C5 în C5a şi C5bă

C5b se leag de membrana celulei- int . Urmeaz fixarea simultan a C,6,7. La final seă ţ ă ă ăC5b se leag de membrana celulei- int . Urmeaz fixarea simultan a C,6,7. La final seă ţ ă ă ă fixeaz C8, apoi C9, formând “complexul de atac membranar”. Fixarea lor produce leziuniăfixeaz C8, apoi C9, formând “complexul de atac membranar”. Fixarea lor produce leziuniă ireversibile – liza celulei.ireversibile – liza celulei.Calea alternativ de activare a CăCalea alternativ de activare a CăActivatori:Activatori: endotoxine, celule infectate cu virus, levuri, parazi i, venin de cobr , agregţ ăendotoxine, celule infectate cu virus, levuri, parazi i, venin de cobr , agregţ ă aate dete de IgA sau IgEIgA sau IgE. C1,4 şi 2 nu intervin şi reac ia începe cu C3. Properdina, factorul B şi ionii deţ. C1,4 şi 2 nu intervin şi reac ia începe cu C3. Properdina, factorul B şi ionii deţ MgMg++ ++ sunt obligatorii în procesul de activare pe cale alternativ .ăsunt obligatorii în procesul de activare pe cale alternativ .ă

Calea lectinicăCalea lectinică de activare a C este determinat de legarea unor lectine pe unele grup riă ă de activare a C este determinat de legarea unor lectine pe unele grup riă ă de manoz , carbohidrat prezent în componen a multor mi/o şi absent la ma/o. Lectina esteă ţ ăde manoz , carbohidrat prezent în componen a multor mi/o şi absent la ma/o. Lectina esteă ţ ă echivalent frac iei C1q. Alte 2 molecule se asociaz , formând o enzim similar C1, ceea ceă ţ ă ă ăechivalent frac iei C1q. Alte 2 molecule se asociaz , formând o enzim similar C1, ceea ceă ţ ă ă ă duce la formarea complexului C4bC2a (C3-convertaza) duce la formarea complexului C4bC2a (C3-convertaza) Componentele reac iilor de liz :ţ ăComponentele reac iilor de liz :ţ ă

54

Ag (celule bacteriene, hematii, etc)Ag (celule bacteriene, hematii, etc)Ac (lizine - IgG şi IgM)Ac (lizine - IgG şi IgM)Complement– ser proasp t de cobai sau ser de cobai liofilizatăComplement– ser proasp t de cobai sau ser de cobai liofilizatăReac ia de bacterioliz (RBL)ţ ăReac ia de bacterioliz (RBL)ţ ăAg – suspAg – suspensie de bacterii vii (vibrioni, leptospire...)ensie de bacterii vii (vibrioni, leptospire...)Ac – serul imun sau serul bolnavuluiAc – serul imun sau serul bolnavuluiComplement Complement RBL in vitroRBL in vitroSe efectueaz dilu ia succesiv a seruluiă ţ ăSe efectueaz dilu ia succesiv a seruluiă ţ ăSe adaog suspensie microbian vieă ăSe adaog suspensie microbian vieă ăSe adaog complementăSe adaog complementă(martor: Ag+ser fiziologic+C)(martor: Ag+ser fiziologic+C)Incubare 2 h la 37Incubare 2 h la 37°°CCReîns mân are pe cutii cu geloz câte 0,1 ml din fiecare dilu ie (24h – 37ă ţ ă ţReîns mân are pe cutii cu geloz câte 0,1 ml din fiecare dilu ie (24h – 37ă ţ ă ţ °° C) C)LecturaLectura – se compar nr coloniilor crescute din martor şi probele studiateă – se compar nr coloniilor crescute din martor şi probele studiateăTitrulTitrul – cea mai mare dilu ie a serului în care au fost lizate cel pu in 50% din celuleţ ţ – cea mai mare dilu ie a serului în care au fost lizate cel pu in 50% din celuleţ ţ

RBL in vivRBL in vivooAmestecul dintre Ag şi Ac se inoculeaz intra-peritoneal la animale de laborator (ex.: şoareciăAmestecul dintre Ag şi Ac se inoculeaz intra-peritoneal la animale de laborator (ex.: şoareciă albi)albi)Peste fiecare 10 min, timp de o or , se extrage lichidul peritoneal, se preg teşte un preparată ăPeste fiecare 10 min, timp de o or , se extrage lichidul peritoneal, se preg teşte un preparată ă nativ şi se examineaz pe fond negru sau cu contrast de faz .ă ănativ şi se examineaz pe fond negru sau cu contrast de faz .ă ăRezultat pozitiv – num rul bacteriilor scade treptat pân la dispari ie.ă ă ţRezultat pozitiv – num rul bacteriilor scade treptat pân la dispari ie.ă ă ţUtilizarea RBLUtilizarea RBL – diagnosticul holerei (RVL), leptospirozelor (RALL) – diagnosticul holerei (RVL), leptospirozelor (RALL)Reac ia de hemoliz (RHL)ţ ăReac ia de hemoliz (RHL)ţ ăAgAg – hematii de berbec, suspensie de 3% – hematii de berbec, suspensie de 3%AcAc – ser imun de iepure anti-hematii de berbec (serul hemolitic) – ser imun de iepure anti-hematii de berbec (serul hemolitic)ComplementComplement Principiul reac ieiţPrincipiul reac ieiţ : complexele Ag-Ac formate fixeaz C şi-l activeaz pe cale clasic ,ă ă ă: complexele Ag-Ac formate fixeaz C şi-l activeaz pe cale clasic ,ă ă ă provocând hemoliza.provocând hemoliza.Intensitatea hemolizei se apreciaz vizual (++++) sau prin m surarea densit ii optice aă ă ăţIntensitatea hemolizei se apreciaz vizual (++++) sau prin m surarea densit ii optice aă ă ăţ hemoglobinei eliberate.hemoglobinei eliberate.Utilizarea practic a RHLăUtilizarea practic a RHLă : pentru dozarea C, precum şi în montarea reac iei de fixare aţ: pentru dozarea C, precum şi în montarea reac iei de fixare aţ complementului. complementului. REAC IA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI (RFC)ŢREAC IA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI (RFC)ŢEste o reac ie complex , constituit din 2 sisteme Ag-Ac şi cu participarea C.ţ ă ăEste o reac ie complex , constituit din 2 sisteme Ag-Ac şi cu participarea C.ţ ă ăÎn RFC particip Ig capabile s fixeze C – IgM şi IgG. ă ăÎn RFC particip Ig capabile s fixeze C – IgM şi IgG. ă ăRFC se utilizeaz în diagnosticul virozelor, infec iilor bacteriene, etcă ţRFC se utilizeaz în diagnosticul virozelor, infec iilor bacteriene, etcă ţToate componentele RFC sunt utilizate în acelaşi volum fiind titrate în prealabil pentruToate componentele RFC sunt utilizate în acelaşi volum fiind titrate în prealabil pentru aprecierea dozelor de lucru.aprecierea dozelor de lucru.Reac ia este înso it de martori ai tuturor componen ilorţ ţ ă ţReac ia este înso it de martori ai tuturor componen ilorţ ţ ă ţReac ia se efectueaz în 2 etape utilizând 2 sisteme.ţ ăReac ia se efectueaz în 2 etape utilizând 2 sisteme.ţ ăI etapăI etapă – – Sistemul de bazăSistemul de bază este constituit din Ag1 (diagnosticuri sau Ag necunoscute), Ac1 este constituit din Ag1 (diagnosticuri sau Ag necunoscute), Ac1 (serul bolnavului sau serul imun) şi complement în doza de lucru. Amestecul este incubat 1h(serul bolnavului sau serul imun) şi complement în doza de lucru. Amestecul este incubat 1h la 37la 37°° C sau men inut 16-18 ore la 4ţ C sau men inut 16-18 ore la 4ţ °° C. Dac Ac se combin cu Ag omolog va avea loc şiă ă C. Dac Ac se combin cu Ag omolog va avea loc şiă ă fixarea C (efect frecvent invizibil).fixarea C (efect frecvent invizibil).II etapăII etapă – la sistemul de baz se adaog ă ă – la sistemul de baz se adaog ă ă sistemul indicator (hemolitic),sistemul indicator (hemolitic), constituit din constituit din hematii de berbec (Ag2) combinate cu Ac specifici (Ac2). Peste 1h incubare la 37hematii de berbec (Ag2) combinate cu Ac specifici (Ac2). Peste 1h incubare la 37°° C reac iaţ C reac iaţ este terminat .ăeste terminat .ăEvaluarea rezultatelorEvaluarea rezultatelor – dac complementul a fost fixat de primul sistem Ag-Ac hemoliza nuă – dac complementul a fost fixat de primul sistem Ag-Ac hemoliza nuă se observ (rezultat pozitiv). Dac Ag1 nu corespunde cu Ac1, complementul r mâneă ă ăse observ (rezultat pozitiv). Dac Ag1 nu corespunde cu Ac1, complementul r mâneă ă ă disponibil pentru fixare pe sistemul indicator Ag2-Ac2, provocând hemoliza (rezultat negativ)disponibil pentru fixare pe sistemul indicator Ag2-Ac2, provocând hemoliza (rezultat negativ)Complement FixationComplement FixationTehnici serologice cu utilizarea Ac marca iţTehnici serologice cu utilizarea Ac marca iţÎn unele cazuri este imposibil de a detecta o reac ie Ag-Ac: unii Ac nu precipiteaz , al ii niciţ ă ţÎn unele cazuri este imposibil de a detecta o reac ie Ag-Ac: unii Ac nu precipiteaz , al ii niciţ ă ţ nu precipiteaz , nici nu aglutineaz , exist complexe Ag-Ac care nu fixeaz C. În acesteă ă ă ănu precipiteaz , nici nu aglutineaz , exist complexe Ag-Ac care nu fixeaz C. În acesteă ă ă ă cazuri pot fi utiliza i Ac marca i pentru a vizualiza Ag respectiv. Conjugarea Ac cu marcan iţ ţ ţcazuri pot fi utiliza i Ac marca i pentru a vizualiza Ag respectiv. Conjugarea Ac cu marcan iţ ţ ţ nu afecteaz propriet ile lor imunologice.ă ăţnu afecteaz propriet ile lor imunologice.ă ăţAceste reac ii se monteaz pe suport solid (lam , pl ci din plastic)ţ ă ă ăAceste reac ii se monteaz pe suport solid (lam , pl ci din plastic)ţ ă ă ă

55

Marcan ii utiliza i uzual:ţ ţMarcan ii utiliza i uzual:ţ ţFluorocromi (rodamina, fluoresceina), care emit respectiv o lumin roşu-oranj sau verde-ăFluorocromi (rodamina, fluoresceina), care emit respectiv o lumin roşu-oranj sau verde-ăgalben ăgalben ă la tratarea lorla tratarea lor cu raze UV (Reac ia de Imuno-Fluorescen )ţ ţă cu raze UV (Reac ia de Imuno-Fluorescen )ţ ţăEnzime (fosfataza alcalin , peroxidaza), capabile s modifice culoarea unui substrat (Reac iaă ă ţEnzime (fosfataza alcalin , peroxidaza), capabile s modifice culoarea unui substrat (Reac iaă ă ţ Imuno-enzimatic )ăImuno-enzimatic )ăRadio-izotopi (Radio-izotopi (125125J sau J sau 33H), care emit respectiv raze gamma şi beta (Analiza Radio-Imun )ăH), care emit respectiv raze gamma şi beta (Analiza Radio-Imun )ăReac ia de imunofluorescen (RIF, reac ia COONS)ţ ţă ţReac ia de imunofluorescen (RIF, reac ia COONS)ţ ţă ţMetoda directăMetoda directă (numai în scop de seroidentificare). Din materialul ce con ine Ag (materialţ (numai în scop de seroidentificare). Din materialul ce con ine Ag (materialţ nativ, cultur pur , biopsie tisular ) se prepar un frotiu, peste care se aplic serul imună ă ă ă ănativ, cultur pur , biopsie tisular ) se prepar un frotiu, peste care se aplic serul imună ă ă ă ă specific cu Ac marca i cu fluorocrom. Peste 20 min de incubare într-o camer umedţ ă ăspecific cu Ac marca i cu fluorocrom. Peste 20 min de incubare într-o camer umedţ ă ă preparatul este studiat la microscopul luminiscent. În caz de reac ie pozitiv se observţ ă ăpreparatul este studiat la microscopul luminiscent. În caz de reac ie pozitiv se observţ ă ă luminiscen local . ţă ăluminiscen local . ţă ă Inconvenient Inconvenient – necesitatea de a avea seruri imune marcate specifice– necesitatea de a avea seruri imune marcate specifice pentru fiecare Ag.pentru fiecare Ag.Metoda indirectăMetoda indirectă. Poate fi utilizat pentru sero-identificare şi sero-diagnostic.ă. Poate fi utilizat pentru sero-identificare şi sero-diagnostic.ăPe frotiul ce con ine Ag se aplic Ac corespunz tori nemarca i. Peste 20 min se spalţ ă ă ţ ăPe frotiul ce con ine Ag se aplic Ac corespunz tori nemarca i. Peste 20 min se spalţ ă ă ţ ă minu ios preparatul, apoi se adaog anti-Ig fluorescent , care se va combina cu Ac dinţ ă ăminu ios preparatul, apoi se adaog anti-Ig fluorescent , care se va combina cu Ac dinţ ă ă complex. Acest reactiv poate fi utilizat în numeroase reac ii.ţcomplex. Acest reactiv poate fi utilizat în numeroase reac ii.ţAnti-Ig se ob ine prin imunizarea iepurilor (sau altor animale) cu Ig.ţAnti-Ig se ob ine prin imunizarea iepurilor (sau altor animale) cu Ig.ţTehnica fondat pe fixarea C:ăTehnica fondat pe fixarea C:ă Markerul fluorescent este un ser anti-complement care se Markerul fluorescent este un ser anti-complement care se va lega de complementul fixat pe complexul Ag-Ac.va lega de complementul fixat pe complexul Ag-Ac.RIF se utilizeaz pentru identificarea rapid a Ag din biosubstrate sau pentru serodiagnostic.ă ăRIF se utilizeaz pentru identificarea rapid a Ag din biosubstrate sau pentru serodiagnostic.ă ăReac ia Imuno-Enzimatic (RIE, ELISAţ ăReac ia Imuno-Enzimatic (RIE, ELISAţ ă - -Enzyme Linked Immunosorbent Enzyme Linked Immunosorbent AAssaysssays).). RIE direct (metoda sandwich).ăRIE direct (metoda sandwich).ă Utilizat doar în sero-identificarea Ag.ăUtilizat doar în sero-identificarea Ag.ă În godeurile din În godeurile din placa de polistiren în care sunt fixa i Ac cunoscu i se toarn solu ia de Ag necunoscut. Seţ ţ ă ţplaca de polistiren în care sunt fixa i Ac cunoscu i se toarn solu ia de Ag necunoscut. Seţ ţ ă ţ incubeaz 1h. Dup o sp lare minu ioas a godeurilor se adaog Ac marca i cu enzime, careă ă ă ţ ă ă ţincubeaz 1h. Dup o sp lare minu ioas a godeurilor se adaog Ac marca i cu enzime, careă ă ă ţ ă ă ţ se fixeaz pe epitopii liberi ai Ag polivalent. Dup incubare de 30 min-1h se spal iar şiă ă ă ăse fixeaz pe epitopii liberi ai Ag polivalent. Dup incubare de 30 min-1h se spal iar şiă ă ă ă godeurile. Prezen a complexului Ac-Ag-Ac-marcat se depisteaz cu ajutorul substratuluiţ ăgodeurile. Prezen a complexului Ac-Ag-Ac-marcat se depisteaz cu ajutorul substratuluiţ ă cromogen (substan ini ial incolor , dar care se coloreaz sub ac iunea enzimei, ex. apaţă ţ ă ă ţcromogen (substan ini ial incolor , dar care se coloreaz sub ac iunea enzimei, ex. apaţă ţ ă ă ţ oxigenata si orthofenilendiamina). oxigenata si orthofenilendiamina). RIE indirect .ăRIE indirect .ă Utilizat în serodiagnosticăUtilizat în serodiagnostică . Ag cunoscut este fixat la fundul godeurilor. Ac. Ag cunoscut este fixat la fundul godeurilor. Ac (serul testat) se întroduce în godeu, dup 1h se spal totul şi se adaog ligandul marcat cuă ă ă(serul testat) se întroduce în godeu, dup 1h se spal totul şi se adaog ligandul marcat cuă ă ă enzim (anti-Ig sau proteina A cuplate cu enzim ). Acest ligand se fixeaz pe Ac testa i. Seă ă ă ţenzim (anti-Ig sau proteina A cuplate cu enzim ). Acest ligand se fixeaz pe Ac testa i. Seă ă ă ţ adaog apoi substratul cromogen. Cantitatea de Ac se m soar dup densitatea optic aă ă ă ă ăadaog apoi substratul cromogen. Cantitatea de Ac se m soar dup densitatea optic aă ă ă ă ă lichidului din godeuri.lichidului din godeuri.

Tehnica imunoblot (western blot)Tehnica imunoblot (western blot) permite identificarea Ag dintr-un amestecpermite identificarea Ag dintr-un amestec..I etap – electroforeza în gel a probei de AgăI etap – electroforeza în gel a probei de AgăII etap – transferul electric al Ag pe membrana de nitroceluloză ăII etap – transferul electric al Ag pe membrana de nitroceluloză ăIII etap – pe membran sunt aplica i succesiv Ac dirija i contra Ag, apoi conjugatul marcată ă ţ ţIII etap – pe membran sunt aplica i succesiv Ac dirija i contra Ag, apoi conjugatul marcată ă ţ ţ cu enzim , care permite depistarea Ac fixa i. Dup o sp lare se adaog substratulă ţ ă ă ăcu enzim , care permite depistarea Ac fixa i. Dup o sp lare se adaog substratulă ţ ă ă ă cromogen. Fiecare complex Ag-Ac formeaz zone colorate distincte. ăcromogen. Fiecare complex Ag-Ac formeaz zone colorate distincte. ă UtilizareUtilizare: depistarea Ac: depistarea Ac anti-HIV, caracterizarea Ac monoclonali...anti-HIV, caracterizarea Ac monoclonali...Proteinele sunt separate electroforetic în gel poliacrilamid. Sub ac iunea câmpului electricţProteinele sunt separate electroforetic în gel poliacrilamid. Sub ac iunea câmpului electricţ are loc difuzia proteinelor conform greut ii moleculare, aranjându-se în zone liniare sub iriăţ ţare loc difuzia proteinelor conform greut ii moleculare, aranjându-se în zone liniare sub iriăţ ţ diferite: mai aproape de start se aranjeaz proteinele cu mas molecular mare (120-150ă ă ădiferite: mai aproape de start se aranjeaz proteinele cu mas molecular mare (120-150ă ă ă kDa), la final se aranjeaz proteinele cu mas molecular mic (5-10kDa).ă ă ă ăkDa), la final se aranjeaz proteinele cu mas molecular mic (5-10kDa).ă ă ă ă

Apoi lamela de gel este transferat pe o foaie de nitroceluloz amplasat între electrozii uneiă ă ăApoi lamela de gel este transferat pe o foaie de nitroceluloz amplasat între electrozii uneiă ă ă surse de curent continuu. Sub ac iunea câmpului electric are loc trecerea proteinelor din gelţsurse de curent continuu. Sub ac iunea câmpului electric are loc trecerea proteinelor din gelţ pe nitroceluloz , unde se fixeaz foarte bine pe hârtie. ă ăpe nitroceluloz , unde se fixeaz foarte bine pe hârtie. ă ă

Proteinele fixate sunt marcate cu o enzim (e.g. alkaline phosphatase sau peroxidase)ăProteinele fixate sunt marcate cu o enzim (e.g. alkaline phosphatase sau peroxidase)ă incolor . ăincolor . ă

Procedura ulterioar de montare a reac iei este similar tehnicii ELISA.ă ţ ăProcedura ulterioar de montare a reac iei este similar tehnicii ELISA.ă ţ ă

56

Analiza radioimun (ARI)ăAnaliza radioimun (ARI)ăPrincipiul este identic cu cel al RIEPrincipiul este identic cu cel al RIEAg se fixeaz la fundul godeurilor din placa de plastic. Se adaog Ac testa i care se voră ă ţAg se fixeaz la fundul godeurilor din placa de plastic. Se adaog Ac testa i care se voră ă ţ combina cu Ag omolog. Dup sp larea godeurilor, se adaă ăcombina cu Ag omolog. Dup sp larea godeurilor, se adaă ă uug un ligand radiomarcat (anti-Ig).ăg un ligand radiomarcat (anti-Ig).ă Dup eliminarea excesului de izotopi prin sp lare, se m soar radio-activitatea: ea esteă ă ă ăDup eliminarea excesului de izotopi prin sp lare, se m soar radio-activitatea: ea esteă ă ă ă propor ional cu concentra ia Ac doza i. ţ ă ţ ţpropor ional cu concentra ia Ac doza i. ţ ă ţ ţReac ia de neutralizare (RN):ţReac ia de neutralizare (RN):ţ formarea complexelor Ag-Ac duce la neutralizarea formarea complexelor Ag-Ac duce la neutralizarea efectului biologic al Ag (neutralizarea toxinelor, enzimelor, virusurilor).efectului biologic al Ag (neutralizarea toxinelor, enzimelor, virusurilor).Reac ia de imobilizareţReac ia de imobilizareţ Unii anticorpi anti-bacterieni pot provoca imobilizarea bacteriilor mobile (vibrioni, spirochete)Unii anticorpi anti-bacterieni pot provoca imobilizarea bacteriilor mobile (vibrioni, spirochete)

77. Reactia de imunofluorescenta (RIF, reactia Coons) indirecta. Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor reactiei. Aplicarea practica.

78. Reactia imunoenzimatica (RIE, ELISA) directa (tehnica “sandwich”). Componentele, mecanismul. Lectura si ap recierea rezultatelor reactiei. Aplicarea practica.

79. Reactia imunoenzimatica (RIE, ELISA) indirecta. Componentele, mecanismul. Lectura si a precierea rezultatelor reactiei. Aplicarea practica.

80. Reactiile de hemaglutinare (RHA) si de inhibare a hemaglutinarii (RIHA). Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor reactiilor. Aplicarea practica.

81.Infectiile stafilococice. Clasificarea stafilococilor (familie, gen, sp.) . Factorii de patogenitate. Habitatul, infectiile cauzate. Diagnosticul microbiologic. Prelevatele. Metoda microscopica, izolarea si identificarea culturii pure. Markerii epidemiologici. Profilaxia si tratamentul specific al infectiilor stafilococice.

CARACTERISTICA GENERAL A GRUPULUI COCILOR PIOGENIĂFamilia StaphylococcaceaeGenuri: Staphylococcus

GamellaMacrococcusSalinicoccus

Familia StreptococcaceaeGenuri: Streptococcus

LactococcusFamilia NeisseriaceaeGenul: NeisseriaCaracter comun – capacitatea de a condi iona procese supurative-distructive.ţ

57

Morfologic reprezint coci (sferici, lanceola i, riniformi), imobili, nesporogeni, unele speciiă ţ formeaz capsule. ăÎn func ie de caracterele tinctoriale se disting:ţ

• Coci G+ (Staphylococcaceae, Streptococcaceae)• Coci G- (Neisseriaceae)

Cocii piogeni se deosebesc prin:a. Caractere de cultur (exigen e nutritive, tipul de respira ie, etc)ă ţ ţb. Caractere biochimicec. Factori de patogenitate

Rolul în patologia uman :ăInfec ii nespecifice ţInfec ii specifice (gonoreea, scarlatina, etc)ţ

GENUL STAPHYLOCOCCUSSe disting 2 grupuri (variet i):ăţ

Stafilococi coagulazo-pozitivi - SCP – foarte virulen i (ţ S.aureus, S.intermedius)Stafilococi coagulazo-negativi – SCN – poten ial-patogeni (aproximativ 30 specii:ţ S.epidermidis, S. saprophyticus, S. capitis, S.haemolyticus, S.hominis, etc)

Habitat: 20-70% din popula ie sunt purt tori: ţ ă S.aureus - cavitatea nazal , intestin,ă S.epidermidis – narine, tegument, S.saprophyticus - tegument.

Staphylococcus aureusCaracterele morfobiologiceCaractere morfo-tinctoriale: coci gram+, în frotiu se aranjeaz în gr mezi neregulate (greac :ă ă ă staphylos-ciorchine, kokkos – gr unte), în perechi sau izolat . Imobili, nesporogeni, necapsula iă ţ (uneori microcapsule)Caractere de cultură: facultativ anaerobi, nepreten ioşi la cultivare, cresc pe medii uzuale.ţ Temperatura optima 37°C, pH-7,0–7,5. În BP – turbiditate uniformăGeloza salin cu g lbenuş de ouă ă -GGO (3 % NaCl) Mediul Chapman (7,5 % NaCl, manitol) Geloz -sângeăColonii S, opace, pigmentate (auriu, citric, alb), pe geloz -sânge cauzeaz hemoliz . Pe GGOă ă ă coloniile sunt înconjurate cu un halou opac (ac iunea lecitinazei).ţCaractere biochimice: catalazo-pozitivi, fermenteaz manitolulă

Factori de patogenitateI. Factori structurali:

peptidoglicanul (induce secre ia citokinelor de c tre celulele limfocitare, responsabile deţ ă starea de şoc)

acizii lipoteichoici (induc o hipersensibilitate tardiv ) ă proteina A (asigur fixaă rea Fc al IgG, împiedic opsonizarea şi fagocitoza)ă adezine, care permit fixarea S.aureus pe diverse molecule plasmatice ale gazdei:

Fibronectin şi laminină ă. Fibronectina este prezent pe suprafe e epiteliale şiă ţ endoteliale, precum şi în chiaguri sanguine.

Fibrinogen. Fixarea de fibrinogen asigur aderarea la chiaguri şi esuturi lezate.ă ţ Colagen. Tulpinile ce posed astfel de adezine cauzeaz osteomielite şi artriteă ă

septice Microcapsula, rol antifagocitar

II. Toxine1. A lfa-toxina (alfa-hemolizina). Efect citolitic fa de trombocite, monocite, hematii, cuţă

eliminarea citokinelor, care pot fi cauza şocului septic stafilococic.2. Beta-toxina (sfingomielinaza). Prezent la tulpinile izolate de la bovine cu mastit . ă ă3. Gamma şi delta-toxine . Efect leuco- şi hemolitic. 4. Leucocidina , efect litic fa de leucţă ocite şi macrofage, factor important în procese

dermonecrotice5. Exfoliatine (epidermolizine) A şi B. Manifest tropism cutanat. ă

58

6. Mecanism: se fixeaz de unele proteine cutanate (profilagrin şi filagrin ), inducândă ă ă desprinderea intra-epidermic dintre ă stratum granulosum şi stratum spinosum, cu formarea leziunilor buloase (impetigo bulos, sindromul pielii op riteă ).

7. Enterotoxine: A, B, C1, C2, C3, D, E, G . Termostabile, rezistente la ac iunea enzimelorţ proteolitice ale tubului digestiv. Determin intoxica ii alimentare (enterotoxina B poateă ţ cauza şoc toxic).

8. Toxina sindromului toxic stafilococic (TSST-1). Determin stare de şoc stafilococic.ăToate toxinele sunt imunogene.Enterotoxinele, TSST-1 reprezint superantigene, activând 20% de limfocite T (particip laă ă declanşarea st rii de şoc) ă

III. CoagulazeleCoagulaza liberă - protein extracelular care se leag de protrombina gazdei cu formarea unuiă ă ă complex. Astfel activat , trombina determin conversia fibrinogenului în fibrin cu coagulareaă ă ă plasmei. Reprezint cauza tromboflebitelor septice şi protejeaz cocii de fagocitoz . ă ă ăCoagulaza legată (clumping factor) este un determinant superficial al S.aureus fixator de fibrinogen. Antifagocitar. Provoac fenomenul de aglutinare a stafilococilor în prezen aă ţ fibrinogenului.

IV. Stafilokinaza (fibrinolizina) – activator al plasminogenului (asociat cu bacteriofagi lizogeni). Complexul stafilokinaz -plasminogen manifest activitate proteolitic , cauzândă ă ă dizolvarea trombilor (responsabil de localiz ri septice secundare).ă ă

V. Enzime de patogenitate:Hialuronidaza – faciliteaz diseminarea bacteriilorăAlte enzime: proteaze, lipaze (inclusiv lecitinaza), ADN-aze, fosfataze, etc. Rol în diseminarea infec iei şi producerea leziunilor.ţ

Se disting multiple serotipuri de S.aureus, iar receptorii pentru bacteriofagi permit clasificarea în lizotipuri (fago-variante).

Epidemiologia infecţiilor stafilocociceSursa de infec ie: omul bolnav sau purt tori s n toşi de germeni. ţ ă ă ăRareori – bovinele bolnave de mastit .ăMecanismele şi c ile de transmitere: ă

Contact direct sau diseminare manuportată Contact indirect (alimente, praf, îmbr c minte, etc) ă ă

Factori favorizan iţ : diabet, tratament imunosupresiv, arsuri, pl gi, etcă

Formele clinice ale infec iilor cu ţ S.aureusInfec ii supurativeţI nfec ii cutanateţ : foliculite, furuncule, carbuncule, abcese, panari iu, infec ie de plag (frecventţ ţ ă de origine nosocomial ). Exfoliatina determin ă ă sindromul pielii op rite (sindromul Lyel)ă la copii, pemfigus epidemic la nou-n scu i (boala Ritter) şi ă ţ impetigo bulos la maturi.Infec ii ale mucoaselorţ : mastoidite, sinusite, otite, angine...Infec ii ale seroaselorţ : artrite, pleurezie, peritonită, meningit ...ăInfec ii osoase:ţ osteomielit , spondilodiscit , infec ie de proteză ă ţ ăInfec ii visceraleţ : abces pulmonar, cerebral, flegmon perirenal, pielonefrite, etcSepticemii şi endocardite. Cauzate şi între inute de un focar infec ios primar complicat deţ ţ tromboflebit . În mediu spitalicesc au caracter nosocomial (catetere intravasculare, protezeă valvulare cardiace, articulare, stimulatoare cardiace...)Manifest ri digestiă veIntoxica ii alimentareţ (doza toxic - 1ă µg la 100 g aliment). Vome, diaree, deshidratare, absen aţ febreiEnterocolite consecutive unei antibioterapiiSindromul şocului toxic stafilococic: febr , hipotensiune arterial , erup ie cutanată ă ţ ă scarlatiniform , stare de şoc, leziuni viscerale (cerebrale, renale, hepatice, musculare). Descrisă în 1978 în SUA la femei care utilizau tampoane periodice şi sufereau de vaginit cu ă S. aureus. Tulpini responsabile de acest sindrom pot fi izolate din diverse leziuni stafilococice.

Infec ii cauzate de SCNţ

59

S.epidermidis determin infec ii asociate cu proteze şi catetere, frecvent de origineă ţ nosocomial (endocardite, endoftalmii, peritonite la pacien i cu dializ peritoneal , bacteriemii).ă ţ ă ă S.epidermidis produce un polizaharid de adeziune, care-l fixeaz pe implante din plastic.ăS.saprophyticus şi S.haemolyticus pot cauza infec ii ale tractului urinarţS.lugdunensis – infec ii de plag , endocarditeţ ă

Imunitatea antistafilococic ă este mixt : celular şi umorală ă ă

Diagnostic de laboratorMateriale de examinat – în func ie de forma clinicţ ăDiagnostic direct

Examen microscopic direct (Gram, RIF)Examen bacteriologic. La interpretare se ine cont de datele clinice. În caz de infec iiţ ţ nosocomiale sau otr vire alimentar se identific markerii epidemiologici (lizotip, serotip,ă ă ă antibiotip). Determinarea antibiogramei este obligatorie (tulpini multirezistente).Identificarea acizilor nucleici prin tehnici de biologie molecularăÎn cazuri particulare se caut ă prezen a toxinelorţ (reac ia de latex-aglutinare, ELISA)ţ

Diagnostic indirect (serologic)Se examineaz seruri sanguine pentru depistarea anticorpilor anti-stafilolizine-alfa (titruă > 2 UI/ml) – în caz de infec ii profunde sau cronice, sau anti-acizi teichoici (titruţ > 1:16) – în caz de endocardite sau focare inaccesibile.

Tratamentul specific al infec iilor stafilococice: autovaccinuri, vaccinuri inactivate, seruriţ imune (în infec ii cronice)ţAntibiotice: peniciline semi-sintetice (oxacilin ), augmentin , imipenem, aminoside, macrolide,ă ă fluorochinolone, glicopeptide (vancomicin , teicoplanin ) cotrimoxazol, fosfomicin , rifampicin ,ă ă ă ă acidul fuzidic, etc

Profilaxia specifică: plasm antistafilococic , Ig antiă ă -stafilococic , ser hiperimun, anatoxină ă stafilococică

82.Infectiile strepto cocice. Clasificarea streptococilor (familie, gen, sp.). Clasificarea dupa aspectul hemolizei si structurii antigenice. Factorii de patogenitate (structurali,exotoxinele, enzimele de patogenitate). Infectiile cauzate de S.pyogenes. Diagnosticul microbiologic. Prelevate patologice. Metoda microscopica, izolarea culturii pure, identificarea. Serodiagnosticul scarlatinei si reumatismului.

FAMILIA STREPTOCOCCACEAEGenul Streptococcus (fragili şi exigen i la cultivare)ţGenul Lactococcus (anterior streptococi din grupul N)

Genul StreptococcusReuneşte specii facultativ anaerobe caracterizate prin morfologie tipic (coci gram+ înă lan uri, imobili, nesporogeni, capsula i), metabolism fermentativ şi lipsa catalazei.ţ ţClasificarea streptococilor

Dup aspectul hemolizei pe geloz -sângeă ăStreptococi beta-hemolitici (hemoliz complet , zon clar în jurul coloniilor)ă ă ă ăStreptococi alfa-hemolitici (hemoliz incomplet , zon verzuă ă ă ie în jurul coloniilor) Streptococi nehemolitici (gamma-hemoliz )ă

2. Clasificarea imunologic LancefieldăDup antigenul polizaharidic C din peretele celular se disting 20 grupe serologice (A – H,ă K – W). Streptococii care nu posed acest Ag nu se încadreaz în clasificarea Lancefieldă ă (ex.: S.pneumoniae). Ei se identific dup caractere de cultur şi biochimice.ă ă ă3.Dup habitat şi patogenitateă

Streptococi piogeni, virulen i, beta-hemolitici (apar in grupurilor A,B,C,G)ţ ţStreptococi orali, comensali, nehemolitici sau alfa-hemolitici, negrupabili dup LancefieldăStreptococi fecali, specii comensale sau condi ionat patogene ale tractului digestiv uman şiţ animalStreptococi lactici, reprezint flora laptelui şi produselor lactateă

60

Diferen ierea streptococilor patogeni de cei saprofi i se efectueaz de asemenea în bazaţ ţ ă criteriilor Cherman:

Creşterea la 10 şi 45° CCreşterea în bulion cu 6,5% NaClCreşterea în mediu cu pH 9,6Hidroliza esculinei pe mediu cu 40% bilăLiza culturii în bulion biliatSensibilitatea la bacitracin şi optochină ăHidroliza hipuratului de sodiu

Streptococcus pyogenes (gr. A)Bacterie strict uman , posibil portaj oro- şi nasofaringean (20%).ăCaractere morfologice: lan uri scurte sau perechi de coci sferici gram+, imobili,ţ capsula i, nesporogeni. ţCaractere de cultură: facultativ-anaerobi, cultiv pe medii elective. Pe geloz -sânge,ă ă dup 18-24 ore incubare la 37ă ° C – colonii S mici, cu zon de ă β-hemoliz . În bulionă glucozat, bulion-ser formeaz depozit la fundul şi pe pere ii tubului. ă ţS.pyogenes este sensibil la bacitracin . ăStructura antigenic a S.pyogenes (Lancefield-Griffith):ă

Polizaharidul C din peretele celular, specific pentru grupul A (dup Lancefield). Poate fiă identificat în RP, latexaglutinare, co-aglutinare.Proteinele de suprafaţă: M (fimbriale), R şi T (uneori asociate cu acizii lipo-teicoici), care permit diferen ierea în 90 serotipuri (dup Griffith). Proteina M manifest reactivitate imunologicţ ă ă ă încrucişat ă (mimicrie antigenică) cu constituen i normali ai organismului (miozin , sarcolem ,ţ ă ă sinoviale), determinând procese imunopatologice (manifest ri post-streptococice). ă

Ag proteice de tip se identific prin RP (Ag M) şi ăRA (Ag T).3. În MCP exist ă Ag comun cu membrana bazal a glomerulilor renaliă

Factori de patogenitateFactori de structurăCapsula din acid hialuronic, neimunogen . Efect antifagocitarăProteina M, adeziune, antifagocitarAcizii lipoteichoici, adeziune la celule epitelialeProteina F, receptor de fibronectină

2. Toxine Streptolizinele O (oxigen-labil ) şi S (oxigen-stabil ). Sunt toxine citolitice. SLO manifestă ă ă efect cardiotoxic, hemolitic. Inhib chimiotactismul PMN şi reduce activitatea celuleloră imunocompetente.Induce formarea Ac neutralizan i – antistreptolizine (ASLO).ţSLS nu este imunogen . Manifest activitate citolitic şi leucotoxic .ă ă ă ă

Toxinele eritrogene (pirogene) A, B şi C sunt determinate de fagi modera i. Au activitate deţ superantigen, producând inflama ie asociat cu stare de şoc. Mitogene şi imunosupresive.ţ ă

Tulpinile lizogene determin scarlatină a. 3. Enzime de patogenitate: hialuronidaza, streptodornaza B (ADNaza), lipoproteinaza, streptokinaza (fibrinolizina)

Epidemiologia infec iilor provocate de ţ S.pyogenesSursa de infec ieţ : bolnavii şi purt tă orii s n toşi (faringe şi amigdale, mai rar – anus, vagin,ă ă tegument). Mecanismele şi c ile de transmitereă :Aerogen (pic turi Pflugge)ăContact direct (leziuni cutanate)

Patogenia şi formele clinice ale infec iilor provocate de ţ S.pyogenesInfec ii ale mucoaselorţSfera ORL: rinite, faringite, angine eritematoase (risc de reumatism articular acut), abcese periamigdaliene, adenite cervicale, sinusite, otite, mastoidite.Scarlatina (angin streptococic înso it de erup ie cutanată ă ţ ă ţ ă). Infec ii cutanate şi subcutanateţ : erizipel, impetigo, celulit , fasciit necrozant , mionecroză ă ă ă (sindromul Meleney), eritemul nodos, infec ii ale pl gilor şi arsurilorţ ă

61

SepticemiiSindromul şocului toxic streptococic, secundar unei infec ii locale, în special subcutanatţ ăAlte infec iiţ : endometrite, pneumoniiInfec ii post-streptocociceţ

RAA (reumatismul articular acut), mai frecvent la copii de vârst şcolar . Apare după ă ă infec ii faringiene şi este determinat de ac iunea direct a streptolizinei, depozite deţ ă ţ ă complexe imune (RHS III), precum şi prin interac iunea autoAc şi al Ac anti-streptocociciţ cu autoantigene din miofibrile, valvule cardice şi sinoviale (RHS II).

Glomerulonefrita acut (GNA)ăMaladie a copilului de vârst preşcolar . Survine dup 10-20 zile de la o infec ieă ă ă ţ cutanat , mai rar faringean . Se caracterizeaz prin perturbarea func iei renale, edem şiă ă ă ţ hipertensiune arterial .ăPatogenie: efect toxic direct, reac ii autoimune, bazate pe asem narea unor Agţ ă streptococice din MCP şi membrana bazal glomerular (RHS II şi III), persisten aă ă ţ formelor L.

Imunitatea antistreptococic este specific de tip, asigurat de Ac anti-proteina M. Acă ă ă anti-eritrotoxin protejeaz de eritemul scarlatinos.ă ă

Streptococcus agalactiae (gr. B)Alfa-hemolitic. Streptococ piogen animal (bovidee), ocazional g zduit de om înă orofaringe, vagin şi intestin.Rol în patologie:

La gravide: infec ie urinar , infec ie de plag , amniotite, endometrite, avort sau naştereţ ă ţ ă prematurăLa nou-n scută : infec ie precoce (septicemie, pneumopatie în primele 10 zile de via ) sauţ ţă tardiv (meningit )ă ăLa adult: infec ie de plag , osteo-artrite, infec ii uro-genitale, septicemii, endocardite,ţ ă ţ meningite.Streptococi din grupul C (S.equisimilis, S.equi) şi din grupul G Beta-hemolitici cu rezervor animal şi uman (tegument, mucoase).

Responsabili de infec ii cutanate, faringite, septicemii post-partum, infec ii osteo-ţ ţarticulare, meningite, pneumopatii. Rareori urmate de GNA. Excep ional pot cauzaţ scarlatin .ă

Streptococii din grupul D (S.bovis, S.equinus)Fac parte din flora comensal a tubului digestiv al omului şi animalelor. ăRolul în patologia uman : endocardite, infec ii neonatale, că ţ holecistite, peritonite, infec iiţ urinare, septicemii.

83.I nfectiile pneumococice. Clasificarea agentului (familie, gen, sp.). Factorii de patogenitate. Infectiile cauzate. Diagnosticul microbiologic. Prelevatele. Microscopia directa, izolarea si identificarea culturii pure, diferentierea de S.pyogenes. Profilaxia specifica a infectiilor pneumococice.

Streptococii negrupabili (lipsi i de antigene de perete)ţStreptococcus pneumoniae (prezent pe mucoasele omului şi ale unor mamifere, în special în nasofaringe)Al i streptococi negrupabili (ţ S.mitis, S.mutans, S.oralis, S.sanguis). Prezen i în cavitatea bucal ,ţ ă joac rol în geneza cariei dentare, în infec ii materno-fetale, bacteriemii şi endocarditeă ţStreptococcus pneumoniaeCaractere morfo-tinctoriale: diplococi ovoizi sau lanceola i, gram+, imobili, nesporogeni,ţ capsula i.ţCaractere de cultur : cultiv pe medii elective (geloz -sânge, geloz -ser, bulion-ser), pH optimală ă ă ă 7,8. Pe geloz -sânge, peste 18-24 ore de incubare la 35-37ă ° C în atmosfer cu 5-10% COă 2, formeaz colonii S mici, cu o zon de hemoliz alfa (verzuă ă ă ie). Din cauza autolizei pneumococilor centrul coloniilor se deprim . Tulpinile necapsulate formeaz colonii R. ă ăStructura antigenicăAntigene capsulare, de origine polizaharidic . Permit clasificarea pneumococilor în 90 serotipuri.ăAntigenul proteic R, mascat de Ag capsulareAntigenul proteic M, specific de tip

62

Factori de patogenitate:Capsula (rol antifagocitar)AdezinesIgA - proteazăAcidul lipoteichoic (implicat în reac ii inflamatoare cu semne generale şi leziuni tisulare, posibilţ şoc)Autolizinele (eliberarea unor factori bacterieni cu rol în virulen )ţăPneumolizina (hemolizina). Efect citotoxic asupra celulelor epiteliale şi endoteliale. Reduce activitatea bactericid a PMN.ăHialuronidaza Neuraminidaza S.pneumoniae se diferen iaz de al i streptococi prin:ţ ă ţSensibilitatea la optochinăLiza culturii de pneumococi în prezen a s rurilor biliare (activarea autolizinelor) – testul deţ ă solubilitate în bilăPatogenitatea pneumococilor pentru şoarecePrezen a capsuleiţHidroliza inulinei

Epidemiologia infec iilor cu pneumocociţSursa de infec ieţ – purt torii s n toşi (naso-faringe) sau bolnaviiă ă ăCalea de transmitere – aerogenăInfec iile cauzateţ de S.pneumoniaeInfec ii respiratorii: pneumonia franc lobar acut , broncho-pneumonii, bronşite, otite, sinusite,ţ ă ă ă mastoidite.Meningite (în special la copii) Bacteriemii cu artrite, peritonit , pericardit , endocardit .ă ă ă

Imunitatea antipneumococic este specific de tip, prin Ac anti-capsulari.ă ă

Diagnosticul de laborator al infec iilor streptocociceţPrelevate – în func ie de forma clinic (tampon faringean sau cutanat, punc ie a esutului sub-ţ ă ţ ţcutanat, LCR, puroi, sânge, etc)Metodele de diagnosticDiagnosticul directExamenul microscopic (frotiu Gram – orientativ, RIF)

Examenul bacteriologic (de baz )ăDetectarea serologic a Ag specificeăIdentificarea ADN prin tehnici de biologie molecularăDiagnosticul indirect (util în infec ii post-streptococice)ţEviden ierea Ac ASLO în cazul RAA (titru diagnostic ţ > 200 UA/ml) Ac antistreptodornaz B (titru diagnostic ă > 240 UA/ml) + ASLO în cazul GNA Dozarea Ac anti-hialuronidaz (titru diagnostic ă > 350 UA/ml) şi anti-streptokinaz (titruă diagnostic > 160 UA/ml)

Diagnosticul scarlatinei Pentru identificarea eritemului scarlatinos se utilizeaz reac ia Schultz-Charlton (anti-ă ţeritrotoxina inoculat în erup ie determin dispari ia exantemului)ă ţ ă ţReac ia Dick pentru depistarea Ac anti-eritrotoxinţ ă (determinarea receptivităţii la scarlatină). I/dermic se inoculeaz 0,1 ml eritrotoxin . ă ă

Rezultat pozitiv: peste 24 ore eritem local peste 10 mm (lipsa anti-eritrotoxinei, receptivitate)Rezultat negativ: absen a eritemului (anticorpi prezen i, persoan imun la scarlatin ) ţ ţ ă ă ă

Profilaxia specific a infec iilor streptocociceă ţVaccin contra S.pyogenes nu exist (variabilitatea proteinei M, Ag comune cu esuturileă ţ umane)Femeile purt toare de ă S.agalactiae sunt imunizate cu vaccin din polizaharide capsulareExist un vaccin anti-pneumococic, constituit din antigene capsulare mai frecventă întâlnite în regiune

63

Tratamentul infec iilor streptocociceţS.pyogenes este sensibil la penicilina G şi macrolide. Tratamentul anginelor previne complica iile post-streptococice.ţS.pneumoniae este sensibil la peniciline şi cefalosporine. Exist tulpini rezistente laă tetraciclin , eritromicin , macrolide. ă ă

Familia EnterococcaceaeGenul Enterococcus

Specii: E.faecalis, E.faecium, E.durans, etcCaractere morfo-biologice: coci ovoizi, gram+, dispuşi în perechi sau lan uri scurte. Anaerobiţ facultativi.Diferen ierea de genul Streptococcusţ : cresc la 10 şi 45 grade C, se multiplic în prezen a aă ţ 6,5% NaCl, hidrolizeaz esculina în mediu cu 40% bil şi produc piridonil arilamidaz . ă ă ă

Habitat: comensali ai intestinului omului şi animalelor, uneori se întâlnesc pe mucoasa genital , în orofaringe şi pe tegument. Reprezint markeri microbiologici de poluare fecal aă ă ă mediului. Rezisten i în mediul extern şi la antibiotice.ţRolul în patologia umană: endocardite, infec ii urinare, meningite, infec ii neonatale.ţ ţ Frecvent infec ii cu caracter nosocomial (infec ie de plag ).ţ ţ ă

84.In fectiile meningococice. Clasificarea meningococilor (familie, gen, sp.). Factorii de patogenitate. Infectiile cauzate. Diagnosticul microbiologic. Prelevatele. Metoda microscopica. Izolarea si identificarea culturii pure. Depistarea antigenelor meningococice in LCR. Profilaxia specifica.

Clasificarea (Bergey's 2001) :Familia – NeisseriaceaeGenurile - Neisseria, Kingella, Chromobacterium, Aquaspirillum Genul Neisseria include dou ă specii patogene umane importante N. gonorrhoeae şi N.meningitidis (neisserii “preten ioase”)ţ . Specii comensale, g zduite pe mucoasele ă tractului respirator şi digestiv, conjunctiv ,ă vagin, uretra distal (neisserii “nepreten ioase”)ă ţ : Neisseria flava; Neisseria flavescens; Neisseria subflava; Neisseria perflava; Neisseria lactamica; Neisseria mucosa; Neisseria pharyngis; Neisseria polysaccharea; Neisseria sicca; Neisseria sp. In unele condiţii se pot comporta ca patogeni oportunişti. Caractere generale ale genului NeisseriaCoci gramnegativi, asocia i în diplococi, uneori tetrade, imobiliţBacterii carboxifile, cu metabolism respiratorCatalazo- şi oxidazo-pozitiveSunt g zduite ă pe mucoasele omului şi animalelorSpeciile patogene sunt exigente la cultivare

Neisseria meningitidis1884 - Marchiafava si Celli observă diplococi gramnegativi în LCR al unui pacient cu meningită1887 - Weichselbaum izolează bacteria din LCR şi demonstrează rolul ei etiologicBacterie strict uman ă care colonizeaz rinoă faringele la un numar mare de purtători s nă ătoşi (5-30%). Portajul poate avea o durată de la câteva zile la câteva luni. In unele cazuri şi cu frecvenţă redus estă e capabil ă să provoace septicemie şi/sau o meningit cerebrospinal .ă ă

Caractere morfobiologiceN.meningitidis se prezintă sub formă de coci imobili, gram-, in frotiu se aranjează in diplococi cu suprafeţele adiacente aplatizate sau pu in concaveţ (aspect riniform, de “boabe de cafea”). Posedă capsul şă i fimbrii.Structura antigenică a N.meningitidis Ag polizaharidice capsulare permit caracterizarea a 13 serogrupe: A, B, C, D, X, Y, Z, 29E, W135, H, I, K et L. Mai frecvent intâlnite sunt serogrupele A, B, C, Y şi W135. Ag proteice din membrana extern ă (cinci proteine majore) permit distinc iţ a tipurilor serologice Ag lipo-oligozaharidice (serotipuri)

64

Aceste antigene servesc în calitate de markeri epidemiologici.

Caractere de culturăN.meningitidis este un mi/o carboxifil, foarte exigent la cultivare. Se cultivă doar pe medii îmbog iăţ te cu sânge sau ser: geloză-ser, geloză-sânge, geloză-ciocolată, mediul Mueller-Hinton şi preîncălzite în termostat. Coloniile S, mici (1-2 mm), cu marginile netede, bombate, translucide apar peste 24-48 ore de incubare la 37 C în atmosfer umed îmbog it ă ă ăţ ă cu 5-10% CO2. Activitate biochimicăN.meningitidis posedă catalaz şă i oxidază, scindeaza glucoza şi maltoza fără a produce gaz.Rezistenţa în mediul extern: N.meningitidis este o bacterie deosebit de fragilă, sensibilă în special la desicare, radia ii solare, varia ii de pH şţ ţ i refrigerare; temperaturi sub 37 C determină autoliza bacteriilor.

Factorii de patogenitateAdezine (fimbriile şi proteine ale ME)Capsula – rol antifagocitarsIg A-proteaza – descompune sIg A de pe mucoaseEndotoxina – declanşeaza secreţia diferitor citokine Receptori şi captatori de Fe (receptori membranari pentru transferin şă i lactoferină, care permit captarea directa a Fe din aceste substanţe, precum şi extragerea lui directă din hemoglobin )ă Epidemiologia infectiilor meningocociceSursa de infecţie – bolnavii cu meningită sau rinofaringită meningococică sau purtătorii de germeniTransmiterea – aerogen, prin picături Pflugge, prin obiecte contaminate (jucării…) - exceptionalPatogeneza infectiilor meningocociceMeningococul ader ă la epiteliul rinofaringelui, provocând sau o infec iţ e locală (rinofaringita), sau o infectie inaparent . ă In caz de diminuare a rezistenţei organismului, bacteria trece în submucoas şă i apoi în circula iţ a sanguin general (meningococcemia). ă ă Aceast transloca iă ţ e este favorizat ă de inflama iţ i rinofaringiene, în special virale.

In circula iţ a general , gră aţie capsulei, bacteria este protejat de mă ijloacele de rezisten ţă a organismului. Prin tropism pentru celulele plexului choroid, meningococul ader ă la acest nivel şi, prin transloca iţ e, trece în spaţiul meningean, inducând meningita cerebrospinal .ăOdată cu dispari iţ a anticorpilor materni, N. meningitidis devine principala bacterie responsabil de meningite ă la nou-născuţi. Ulterior, imunitatea antimeningococică se instaleaz progresiv şă i frecvenţa meningitelor meningococice diminuează.Formele clinice de infectii meningocociceRinofaringita (forma clinică cea mai frecventă, deseori asimptomatică)Septicemia (meningococcemia). Reprezintă etapa a doua a maladiei. Complicaţii: meningococcemie fulminantă (sindromul Waterhouse-Friderichsen) în 10 - 20 % de cazuri (şoc endotoxinic, purpură extensivă indusă de coagulopatie de consumare (coagulare intra-vascular dă iseminat ))ă .Meningita cerebrospinală epidemică. Este precedat de o faringit şi înso it deă ă ţ ă bacteriemie. Este caracterizat prin febr înalt , cefalee, vom , fotofobie, hiperestezieă ă ă ă cutanat . Poate fi prezent pozi ia caracteristic în "cocoş de puşc " dat de sindromul deă ă ţ ă ă ă contractur . Frecvent se întâlneşte herpesul labial, peteşii cutanate sau artralgii. Afectareaă sistemului nervos se face în grade variabile, cu delir, agita ie psihomotorie, somnolen ,ţ ţă uneori com , pareze şi paralizii, convulsii. ăEvolu ia ţ în absen a tratamentului se face spre deces în 80-90% din cazuri, restulţ prezentând sechele grave.

Alte forme: infecţii bronhopulmonare, endocardite, pericardite, osteomielite, artrite (determinate de formarea de complexe imune), conjunctivite, angine. Diagnosticul de laborator al infectiilor meningococicePrelevate: in funcţie de forma clinic se prelev exă ă sudatul nasofaringean, sânge pentru hemocultură, LCR, lichidul articular, etc.

65

Probele se prelev înainte de a se administra antibiotice şi se transport rapid la laborator,ă ă ferite de varia ii de temperatur şi lumin . La necesitate se utilizeaz mediul de transportţ ă ă ă Stuart

Diagnosticul directExamenul LCR este primordial pentru diagnosticul meningitei. Prelevat în condi ii asepticeţ prin punc ie lombar , în volum de 4-6 ml în 2 eprubete de centrifug . ţ ă ăLCR este tulbure, conţine mii sau zeci de mii de elemente celulare, cu predominan a de 95-ţ100% a neutrofilelor. Aceast reac iă ţ e celular ă este insoţită de hipoglicorahie, de hiperalbuminorahie şi pH acid prin acumularea de acid piruvic şi lactic. Examenul microscopic al sedimentului LCR Frotiuri colorate cu albastru de metilen sau Gram: diplococi Gram-negativi riniformi în pozitie intra şi extracelular , ă dar densitatea bacterian estă e scăzut , şă i examenul este negativ în 1/3 cazuri. Prezen a leucocitelor în num r mare pledeaz pentru un prognostic favorabil. ţ ă ă b) RIF

Examenul bacteriologic Sedimentul din LCR se însemân eaz pe medii de cultur îmbog ite, cum sunt geloza-ţ ă ă ăţsânge, geloza-ciocolat , mediul Muă eller-Hinton preînc lzite la 37 C.ăExsudatul nazofaringean se însemân eaz imediat dup recoltare pe medii cu adaos deţ ă ă antibiotice (lincomicin , vancomicin , ristomicin ) pentru inhibarea altor specii microbieneă ă ă existente în exsudat. Sângele pentru hemocultur se însemân eaz direct pe medii de cultur lichide (bulionă ţ ă ă glucozat 2% respectând propor ia de 5 % sânge). Examin rile se fac zilnic timp de 5-7 zileţ ă prin subculturi.Identificarea şi diferen ierea de neisseriile comensale se bazeaz pe aspectul morfologicţ ă pe frotiuri colorate Gram, prin testul oxidazei care este pozitiv, scindarea numai a glucozei şi maltozei, identificarea serologic prin RA cu seruri imune specifice de grup.ăDecelarea directă în sânge şi LCR a antigenelor polizaharidice capsulare, utilizând reacţiile de contraimunoelectroforez , ELISA, latex şi coaglutinare cu antiseruri specifice deă grup. Detectarea acizilor nucleici

Diagnosticul indirectDiagnosticul serologic. Pot fi titra i Ac antimeningococici utilizând RA sau RHAI. Areţ valoare diagnostic redusă ă

Tratamentul trebuie instituit extrem de urgent, imediat după internare şi efectuarea punc iei lombare. ţTratamentul etiotrop const în administrarea de antibiotice timp de 7-10 zile: Penicilin ,ă ă Ampicilină, Cloramfenicol, Cefalosporine.Profilaxia specifică: imunizare activ ă cu vaccin polizaharidic antimeningococic monovalent sau polivalent (A, C, Y, W), care se poate administra intradermic sau subcutanat, dup vârsta de 3 luni (pentru grupul A), oferind protec ie de 95-100% pentru o durat de 2-3ă ţ ă ani; polizaharidul capsular de grup B este un homopolimer al acidului sialic şi nu este imunogen pentru oameni. Contac iiţ vor fi supraveghea i clinic timp de 10 zile. Chimioprofilaxia cu Penicilin V, timpţ ă de 7 zile, sau cu Rifampicin , 3 zile, se aplic în familii sau în colectivit i de preşcolari ă ă ăţPurt toriiă , depista i în focar, vor fi trata i timp de 7-10 zile cu Penicilin V.ţ ţ ăCazurile de meningită sau meningococcemie vor fi declarate în 24 de ore de la depistare

85. Infectia gonococic . Clasificarea gonocociloră (familie, gen, sp.). Factorii de patogenitate. Infectiile gonococice acute si cronice. Diagnosticul microbiologic. Prelevate. Microscopia directa, izolarea si identificarea culturii pure. Particularitatile de recoltare a prelevatelor si de diagnostic a gonoreei cronice.

MICROBIOLOGIA ŞI DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL GONOREEIGonoreea este o uretrită specifică, cu eliminare masivă de puroi, mai aparent la barbati decât la femei. Termenul "gonoreea", a fost utilizat prima data de Galen în secolul II şi înseamnă “scurgerea semin eiţ ". Multe secole gonoreea şi sifilisul erau confundate. Paracelsus (1530) credea ca gonoreea este un simptom precoce al sifilisului. Aceasta confuzie a fost întărită de

66

medicul englez John Hunter, în 1767. Hunter intenţionat şi-a inoculat puroi de la un bolnav cu simptome de gonoree, îmbolnavindu-se de sifilis! Agentul cauzal al gonoreei, Neisseria gonorrhoeae, a fost descris pentru prima oară de A. Neisser în 1879 în puroi de la un bolnav de gonoree. Mi/o a fost izolat în cultură pur îă n 1882 de c tre Loeffler pe ser coagulat şă i rolul său etiologic a fost stabilit ulterior pe voluntari umani (conform postulatelor lui Koch).

Neisseria gonorrhoeaeCaractere morfobiologiceNeisseria gonorrhoeae este un coc gram-negativ, cu diametrul de 0.6 - 1.0 µm, uzual observat în perechi cu suprafeţele concave alăturate. In prelevate patologice (puroi, exsudate) se localizează frecvent intracelular în leucocite polimorfonucleare (neutrofile). Imobil, posedă fimbrii cu lungimea de câţiva micrometri. În func ie deţ prezen aţ fimbriilor se cunosc patru tipuri de N. gonorrhoeae : T1, T2, T3, T4

Caractere de culturaGonococul este exigent la cultivare. Pentru izolarea lui se utilizează medii îmbogăţite cu ser sangvin, extract de drojdii, lichid ascitic, etc (mediul HYL, Thayer-Martin, geloz -ciocolat )ă ă . Culturile cresc la 35-36 C în atmosferă umedă cu 5-10 % CO2. Peste 24-48 ore apar colonii mici (0,5-1mm), netede, translucide. Dup aspectul coloniilor pot fi descrise 4 tipuri:ăColonii de tipul I şi II apar la izolare, corespund tulpinilor virulente, purt toare de piliă (fimbrii),Colonii de tipul III şi IV, apar la repicare, mai mari, corespund tulpinilor f r pili ă ă

Structura antigenică3 proteine majore din ME (Por / PI, Opa/PII, PIII) definesc multiple serotipuri (variante). Opa prezint o mare variabilitate antigenic , chiar în interiorul unei tulpini.ă ăLipopolizaharidul din MEProteina fimbriilor, cu o mare diversitate antigenicăCaractere biochimice: gonococii sunt oxidazo-pozitivi, scindeaza doar glucoza pâna la acid, nu atacă maltoza

Factorii de patogenitateAdezinele (fimbriile, unele proteine din membrana externă – Opa). Opa de asemenea induce transcitoza gonococilor în celulele epiteliale. sIgA-proteaze, cu rol in colonizarea mucoaselorProteine ale ME (Por), care inhib formarea fagolizosomei (supravie uirea şi multiplicareaă ţ gonococilor în fagocite)Endotoxina (rezisten la complement, secre ia citokinelor)ţă ţSisteme de captare a Fe (receptori membranari pentru transferin şă i lactoferin )ă Varia ia antigenic rapid a fimbriilor de adeziune şi a proteinei Opa (conversie,ţ ă ă hipermuta ie, transformare)ţRezistenţa în mediul externN. gonorrhoeae este un mi/o fragil, sensibil la variaţii de temperatură, desicare, raze UV şi alte condiţii ale mediului extern. Gonococul este inhibat de bumbacul din tampoane (hipoclorit...). Pentru prelev ri suntă indicate tampoane cu alginat de Ca sau din dacron.Epidemiologia infecţiei gonocociceSursa de infecţie – unica sursă este bolnavul cu gonoree, în special cu infec ie inaparentţ ăTransmiterea la maturi exclusiv prin contact sexual; la nou-născut – la trecerea prin canalul de naştere al mamei bolnavePatogeneza infecţiilor cauzate de N.gonorrhoeaeInfecţia gonococică este în general limitat laă mucoasele cu epiteliu columnar. Mai frecvent implicată este uretra, cervixul, rectul, faringele şi conjunctiva. Epiteliul scuamos al vaginului nu este sensibil la infecţia cu N. gonorrhoeae. Totuşi, la fetiţe gonococul poate provoca vulvovaginite.Infecţiile mucoaselor sunt caracterizate uzual prin secreţii purulente. Patogeneza gonoreeiPrin intermediul fimbriilor şi a unor proteine din ME (Opa) gonococii aderă la vilozităţile celulelor epiteliale columnare neciliate.

67

Urmează penetrarea lor în celulă (prin endocitoză), apoi vacuola este transportată la baza celulei, unde bacteria este eliberată prin exocitoz îă n ţesutul subepitelial. Pe parcursul infecţiei, lipopolizaharidul bacterian (LPZ/LOZ) şi peptidoglicanul sunt eliberate prin autoliza celulelor. Ambele substanţe activează complementul pe calea alternativă, LPZ de asemenea stimulează producţia factorului de necroză a tumorilor (TNF), care provoacă distugerea celulelor. Neutrofilele sunt imediat atrase în focar şi inglobeaza bacteriile. Mulţi gonococi sunt capabili să supravieţuieasca în interiorul fagocitelor până la moartea lor, cu eliberarea bacteriilor ingerate.

Particularitaţile gonoreei la bărbaţiIn majoritatea cazurilor decurge acut (85-95%), fiind manifestată clinic:Uretrita (secreţie uretrală alb – galbuie, durere şi usturime la mictiune, dizurie)ProstatitaOrhitaEpididimita Particularităţile gonoreei la femeiIn majoritatea cazurilor infecţia decurge asimptomatic (80% de cazuri), cu evoluţie spre cronicizare.Formele clinice:Cervicita (cu sau fără leucoree) – forma cea mai frecventăUretrita Bartolinita Salpingita (pericol de sterilitate, graviditate extrauterină)OvaritaEndometritaPeritonita

Alte forme clinice: Faringita şi proctita gonococicăDiseminarea infecţiei gonococice (1-3%) determin ă artrite, leziuni cutanate, septicemii, endocardite, meningite. Tulpinile de N. gonorrhoeae care cauzeaza infecţii diseminate sunt uzual rezistente la complement şi la reacţia bactericidă a serului. La nou-născut conjunctivita purulent cu extinderea rapid a infec iei la globul oculară ă ţ (ophtalmia neonatorum) poate fi urmare a contaminării la trecerea prin canalul de naştere Diagnosticul de laborator al gonoreeiPrelevate: La bărbaţi - secreţiile uretraleLa femei - secreţiile uretrale, vaginale, din endocol sau orificiile glandelor vulvarePot fi examinate conţinutul leziunilor cutanate, exsudat articular, nasofaringean, sânge, puroi din conjunctiv , ă LCR, tampon rectal.Pentru recoltarea acestor secreţii se foloseste un tampon de alginat de Ca (sau ansa bacteriologic ), ă care este apoi trimis imediat în laborator pentru testare (dupa necesitate se foloseste mediul de transport Stuart cu tioglicolat şi c rbune activată ). Daca eliminările sunt s raceă , se procede la stimularea secre iei (ţ reactivare, provocare):Alimentară (cu bauturi alcoolice – bere)Chimică (instilaţii cu nitrat de Ag – sol. 1% in uretră, 10% în colul uterin)Biologică (inocularea gonovaccinului, recoltarea secre iilor imediatţ dupa menstre la femei)Mecanică (masaj al prostatei)Termică (diatermie sau inductotermie)

Metodele de diagnosticExamenul microscopic (elocvent doar în cazul uretritelor acute la bărbaţi). In frotiuri din puroiul uretral colorate Gram sau cu albastru de metilen se observă diplococi gram- situaţi intra- sau extracelular.RIFExamenul bacteriologic (este obligator în forme asimptomatice sau cronice)

68

Gonococul fiind o bacterie foarte fragil , estă e obligator de a îns mână ţa imediat prelevatele sau de a utiliza un mediu de transport adaptat. Pentru izolare se folosesc medii îmbogatite (ex.: mediul Thayer-Martin, care este bogat în factori de creştere şi con inţ e antibiotice (vancomicina, colistina, amfotericina) care inhib ă alte bacterii din prelevat, geloza-ciocolata). Coloniile apar peste 18 - 24 h de incubare in atmosfer ă cu CO2.Identificarea N.gonorrhoeae se efectueaz în baza caracterelor morfotinctoriale, aspectulă coloniilor crescute pe medii selective, oxidaza +, scindarea doar a glucozei pân la acid.ă Seroidentificarea cu Ac monoclonali în reac ia de Co-aglutinare ţDepistarea direct a ă N. gonorrhoeae în prelevate poate fi realizat prin tehnici ELISA sau RIFăDetectarea acizilor nucleici prin hibridare sau amplificare genicăExamenul serologic (serodiagnosticul) RFCTratamentul gonoreeiAntibiograma este indispensabilă unui tratament eficient!PenicilineCefalosporine de generaţia IIIFluorochinoloneCotrimoxazol Profilaxia gonoreeiNespecifica (individual sau generală ă)Prevenirea oftalmiei gonococice se efectueaza prin instilarea intraconjunctival ă la nou-n scu iă ţ a soluţiei 1% de nitrat de Ag

86.Bruceloza. Clasificarea agentilor (familie, gen, sp.) . Patogeneza brucelozei. Diagnosticul microbiologic. Prelevate. Metoda microscopica, izolarea si identificarea speciilor de brucele. Diagnosticul imunologic (reactiile Huddelson, Wright), intradermoreactia Burnet. Profilaxia specifica a brucelozei.

87.Tularemia. Clasificare a agentului patogen (familie, gen, sp.) . Patogeneza, formele clinice ale infectiei. Diagnosticul microbiologic. Prelevate. Metoda microscopica, metoda biologica, izolarea si identificarea agentului. Metodele alergica si serologica. Profilaxia specifica a tularemiei.

Zooantroponozele = maladii ale animalelor care pot fi transmise oamenilor în rezultatul unui contact direct sau indirect cu populaţii animale infectate.Unele dintre aceste infecţii - antraxul, tularemia, pesta, bruceloza – fac parte din categoria infecţiilor extrem de periculoase.Sunt foarte contagioase (transmitere aerogenă, alimentară, prin contact direct, receptivitate generală).Se manifestă nu doar ca epidemii, ci şi ca pandemii.Reprezintă infecţii cu evoluţie foarte grav .ăAgenţii cauzali sunt rezistenţi în mediul extern.

Clasificarea Familia FrancisellaceaeGenul FrancisellaSpecii: F.tularensis (agentul cauzal al tularemiei)

F.philomiragia (infectii sistemice)Se cunosc 4 biovaruri (subspecii) de F.tularensis, care diferă dupa activitatea biochimică, virulenţă şi răspândire geografică:

1. F.tularensis tularensis (nearctica) (tip A; foarte virulentă, raspândită în America de Nord)2. F. tularensis holarctica (palearctica) (tip B; mai puţin virulentă, cu raspândire în Europa) 3. F. tularensis mediasiatica: virulenţă similară cu F. tularensis holarctica4. F. tularensis novicida: virulenţă redusă, cauzeaza infecţie numai la gazde

imunocompromise. Izolată în SUA.Prima descriere a tularemiei a fost realizată în Japonia în 1837. Denumirea agentului provine de la regiunea Tulare, California, unde, în 1911, în timpul unei epizootii printre veveriţele de pământ, a fost izolată tulpina bacteriană.

69

Dr Edward Francis, în 1928, studiază şi descrie agentul cauzal şi patogeneza maladiei prin experienţă personală în peste 800 cazuri. F. tularensis are răspâdire ubicvitară, parazitând peste 100 de specii de animale sălbatice (în special rozătoare), păsări şi insecte şi persistă în apa din zonele unde se întâlnesc aceste animale. Toate mamiferele fac o septicemie cu prezenţa bacteriilor în toate tesuturile.

Caracterele morfobiologice ale F.tularensisMorfologia: F.tularensis reprezintă o cocobacterie foarte mică (0.2-0.5 µm x 0.7-1.0 µm), gram-negativă, uneori se colorează mai intens la poli, pleomorfă, imobilă, asporogenă, tulpinile virulente posedă capsulă.

Caractere de cultură: bacteria nu poate fi cultivată pe medii uzuale. Pentru izolare se utilizează medii îmbogăţite:

1. mediul Francis (geloză + sânge de iepure + cisteină + glucoză)2. mediul McCoy (cu gălbenuş de ou)3. geloză-ciocolată

Cultivă la 35 - 37 grade, în aerobioză. Peste 2-4 zile apar colonii S, mici (1 - 2 mm în diametru), albe-cenuşii, mucoide, cu marginile regulate şi suprafaţa lucioasă. Caractere biochimice:F.tularensis este catalazo+ şi oxidazo-, nu descompune ureea, produce H2S, unele biovaruri fermentează glicerolul. Rezistenţa în mediul extern: Mi/organismele pot supravieţui perioade îndelungate de timp în apă, nămol, cadavre de

animale (mediu umed). F.tularensis este distrusă la 56 grade în 10 minute, dar congelarea permite conservarea

bacteriei.

Factorii de patogenitate :1. Capacitatea de a penetra în macrofage, supravieţuind şi multiplicându-se în interiorul

celulelor până la moartea lor (parazitism facultativ intracelular)2. Capsula (rol protector)3. Endotoxina (LPZ)

Epidemiologia şi patogeneza tularemieiSursa de infecţie – animale bolnave sau cadavre de animale, transmiterea de la om la om nu are loc. Rezervorul principal – mamifere mici şi medii (iepuri, veveriţe, şobolani, şoareci, rozătoare acvatice, lemingi). Omul, pisicile, câinii, anumite specii de păsări, peşti şi amfibii pot fi gazde accidentaleVectori – insecte (tăuni, ţânţari, căpuşe ) Porţi de intrare – tegumentul (chiar intact), mucoasele, conjunctivaTransmiterea:

1. Contact cu animale infectate, cadavre sau cu apa contaminată (lacuri, bazine, etc)2. Aerogen prin inhalare (vânători...)3. Alimentar, prin consum de apă sau alimente infectate4. Înţepătura artropodelor hematofage

Francisella tularensis este una dintre cele mai virulente bacterii. Câteva zeci de mi/o (10-50) pot provoca suferinţe grave.

Patogeneza şi formele clinice de tularemieFrancisella tularensis este o bacterie facultativ intracelulară. Iniţial infectează macro f age le , cu diseminarea mi/o şi afectarea diferitor organe, inclusiv plămânii, ficatul, splina, ganglionii limfatici. Un rol important în patogeneza leziunilor îl joacă hipersensibilitatea tardivă.Formele clinice de tularemie sunt în relaţie cu calea de pătrundere:

1. Forma ulceroganglionară (70-85% de cazuri), penetrarea agentului patogen prin tegument sau mucoase. Mi/o se multiplică local şi determină apariţia, peste 3-5 zile de la expoziţie, a unei papule la locul de inoculare. Peste cîteva zile se transformă în pustulă, care se ulcerează rapid. Ulcerul are 2 - 4 cm în diametru şi marginile neregulate. Uneori

70

ulcerul poate fi acoperit cu o crustă neagră (asemănătoare cu escara în antrax). Bacteriile se răspândesc spre ganglionii limfatici regionali, unde cauzează limfadenite necrotice, înconjurate de infiltrate granulomatoase (bubonul tularemic). Ganglionii limfatici afectaţi devin fluctuanţi, uneori creând canale de drenare în tegument. Mi/o pot disemina hematogen infectând multiple organe, cu dezvoltarea septicemiei.

2. Forma ganglionară se manifestă prin afectarea ganglionilor limfatici regionali, leziunea de la poarta de intrare lipseşte.

3. Forma oculoganglionară apare la pătrunderea agentului cauzal prin conjunctivă. Se dezvoltă necroza şi ulceraţia conjunctivei, cu infiltraţie limfocitară. Din conjunctivă bacteriile trec în ganglionii limfatici preauriculari, submandibulari sau cervicali, provocând leziuni similare cu cele din tularemia ulceroganglionară.

4. Forma orofaringeană (angino-ganglionară). Mi/o intră prin mucoasa orofaringelui în urma ingestiei sau inhalării lor. Uzual se dezvoltă faringite sau tonzilite exsudative, cu ulceraţie ulterioară. Pătrunderea în ganglionii limfatici cervicali determină necroză şi supuraţie.

5. Forma tifoidică (abdominală), cu afecţiuni generalizate. Mi/o pătrund în sânge prin tegument sau mucoase şi afectează plămânii şi organele reticulo-endoteliale. Determină frecvent septicemie şi şoc

6. Forma pneumonică, foarte gravă. Mi/o pătrund în plămâni aerogen sau hematogen.

Diagnosticul de laborator al tularemieiSe realizează doar în laboratoare specializate.Prelevate: în funcţie de forma clinică: serozitate din leziunea cutanată sau conjunctivă, exsudat faringean, punctat din ganglionul limfatic afectat, spută, sânge.Diagnosticul directExamenul microscopic direct este foarte dificil, aproape imposibil. RIF are o sensibilitate mai mare Examenul bacteriologic. Izolarea F.tularensis direct din prelevate este practic imposibilă. Uzual se utilizează inocularea prelevatelor la animale experimentale sensibile (şoareci, cobai). La necropsii se studiază frotiuri-amprente din organele afectate (Giemsa, RIF), se fac însămânţări pe medii speciale (Francis, Mc Coy). Tulpinile izolate sunt identificate morfologic, cultural, biochimic, antigenic (RA cu seruri anti-F.tularensis).Diagnosticul indirectSerodiagnosticul. Detectarea Ac este un element esenţial în diagnosticul tularemiei. Ac apar după ziua a 7 de boală, ating titrul maxim peste 1-2 luni (1:1000 sau mai mult) şi persistă mai mulţi ani. RA cu suspensie de bacterii omorâte este cea mai utilizată. Titrul diagnostic – 1:80, cu creşterea lui în dinamică de cel puţin 4 ori. ELISA este posibilă.Intradermoreacţia cu tularină. Hipersensibilitatea poate fi testată peste 5 zile de la debutul bolii.

Tratamentul tularemieiAntibiotice: aminozide (streptomicină, gentamicină), tetracicline, cloramfenicol, fluorochinolone, eritromicină (există şi tulpini rezistente).Profilaxia tularemiei

Informarea persoanelor expuse contaminăriiSupraveghere sanitarăVaccinarea contingentelor de risc cu vaccin viu atenuat asigură imunitatea pe o durată de 5-7 ani

88.Antraxul. Clasificarea agentului patogen (familie, gen, sp.). Factorii de patogenitate. Formele clinice de antrax. Diagnosticul microbiologic. Prelevate. Metoda microscopica. Izolarea si diferentierea de antracoizi. Metoda biologica, metodele rapide (reactia Ascoli), proba alergica. Profilaxia si tratamentul specific al antraxului.

Clasificarea:Familia BacillaceaeGenul: Bacillus

71

Specii: Bacillus anthracis (patogen, agentul antraxului)Bacillus cereus (intoxicaţii alimentare), Bacillus polymyxa (genul Paenibacillus), Bacillus brevis (genul Brevibacillus), Bacillus subtilis – bacili antracoizi, producenţi de AB

Bacillus anthracis a fost prima bacterie la care a fost demonstrat rolul ei în patogenia unei infecţii.În 1877, Robert Koch a izolat microorganismul în cultură pură, demonstrând capacitatea lui de a forma endospori şi a produs antraxul experimental inoculându-l la animale.

Caracterele morfobiologice ale B.anthracisBacil mare (5-6 µm x 1 µm), cu extremităţile drepte (tăiate), gram-pozitiv, imobil (antracoizii sunt mobili), în produse patologice se prezintă sub formă de lanţuri scurte, iar în cultură – lanţuri lungi (“tulpină de bambus”).Tulpinile virulente formează capsulă polipeptidică (acidul D-glutamic).Sporul este ovoid, în poziţie centrală, nu deformează celula. Sporogeneza are loc în cultură, în sol şi în ţesuturi şi exsudate din animale moarte (în prezenţa oxigenului), dar nu în sânge sau ţesuturi de animale vii. Caractere de culturăB.anthracis nu este exigent nutritiv, cultivă pe medii uzuale. Facultativ-anaerob, t optimă – 35-37 grade, pH 7-7,4.Peste 24 ore de incubare formează colonii R, mari, cu contur neregulat, opace, plate, uscate, rugoase (“coamă de leu”, “cap de meduză”). Nehemolitice pe geloză-sânge (antracoizii sunt hemolitici). Pe geloză-ser, în exces de CO2, formează colonii S (producerea capsulei). Pe mediu cu 0,5-1 UI de penicilină B.anthracis formează lanţuri din forme globulare - “colier de perle” (proprietate absentă la antracoizi).În bulion peptonat formează flocoane la fundul eprubetei, cu supernatantul clar. B.anthracis este sensibil la fagul gamma.Caractere biochimiceActivitate proteolitică – lichefiază gelatina în formă de “brad inversat”, peptonizează laptele, digeră serul coagulat, nu produce H2S.Activitate zaharolitică – fermentează unele glucide: glucoza, maltoza, zaharoza, tregaloza, etc. Nu fermentează lactoza şi arabinoza.

Rezistenţa în mediul extern: formele vegetative sunt slab rezistente, sporii rămân viabili în sol decenii, se distrug la fierbere în 30-40 min.

Factori de patogenitate Capsula polipeptidică, codificătă de plasmida pX02. Inhibă fagocitoza şi puterea bactericidă

a sângelui. Capsula joacă un rol important în etapele iniţiale ale infecţiei. Formarea capsulei are loc in vivo şi in vitro, pe medii cu ser şi în atmosferă cu 5 % CO2.

Exotoxina antraxului, codificată plasmidic (pX01). Este constituită din 3 componente:1. Factorul I, edematogen (EF), care este o adenilat-ciclază. Acumularea de cAMP

duce la modificarea permeabilităţii membranare cu producerea edemului. Ținta – celulele endoteliale (efect - șoc hipovolemic, șoc septic).

2. Factorul III, letal (LF), responsabil de efectele letale ale toxinei anthrax. Este o protează Zn++ dependentă care induce producerea citokinelor de către macrofage şi limfocite (efect – recție inflamatoare, șoc septic).

3. Factorul II, antigen protector (PA), induce sinteza Ac antitoxici protectori. PA este responsabil de fixarea toxinei pe receptorii celulelor sensibile.

Aparte, aceşti factori exercită activitate biologică nesemnificativă la animal. Din contra, combinaţii din doi sau trei factori toxici determină următoarele consecinţe la animale experimentale:

PA+LF = activitate letală PA+EF = produce edem PA+LF+EF = edem şi necroză cu efect letalEF+LF = inactiv

Acest experiment sugerează că toxina antraxului are structură clasică de citotoxină bacteriană de tip A-B cu PA în calitate de B-fragment (de fixare pe receptori celulari) şi cu factorii EF şi LF cu funcţie de fragment A (activ), care acţionează în interiorul celulei.

72

Structura antigenică a B.anthracisa. Ag polipeptidic capsular (induce Ac neprotectori)b. Ag polizaharidice somatice termostabile (depistate în reacţia de precipitare Ascoli)c. Toxina (componentul PA), induce formarea Ac protectori, neutralizanţi

Epidemiologia şi patogeneza antraxuluiSursa de infecţie – animalele erbivore bolnave de antrax (ovine, caprine, bovine, suine). Solul contaminat cu spori este un rezervor de germeni important şi permanent (decenii).Transmiterea:

• prin contact direct cu animalele bolnave sau produse contaminate (carne, piei, lână, blană, etc), p şă uni şi nutreţuri contaminate, cu pătrunderea agentului prin tegumentul lezat

• aerogen, prin inhalarea sporilor de B.anthracis• pe cale alimentară (consum de carne de la animale bolnave de antrax insuficient

prelucrate termic) În majoritatea cazurilor antraxul se manifestă ca boală profesională a îngrijitorilor de animale, personalului de la abatoare, întreprinderi de prelucrare a produselor animaliere, veterinarilor, zootehnicienilor, măcelarilor, tăbăcarilor, etc.

Formele clinice de antraxAntraxul cutanat , “pustula malignă” (forma cea mai frecventă). Sporii intră printr-o leziune a tegumentului, germinează şi proliferează la poarta de intrare, cu dezvoltarea unui edem gelatinos local caracteristic. La poarta de intrare, peste 12-36 ore de la penetrare, apare o papulă, care evoluează rapid într-o veziculă, apoi în pustulă cu conţinut sanguinolent. La spargerea pustulei se formează o leziune necrotică, prezentând în centru o escară neagră înconjurată de vezicule satelite. Leziunea se localizează mai frecvent pe mâini, faţă, ceafă, etc. Pătrunderea în sânge determină diseminarea sistemică a bacteriei.Antraxul pulmonar apare la inhalarea sporilor de B. anthracis , care sunt înglobaţi de macrofagele alveolare unde ei germinează şi se multiplică, determinând o pneumonie foarte gravă cu edem. Urmează infectarea ganglionilor limfatici mediastinali cu dezvoltarea unei necroze hemoragice. Pacientul manifestă febră, stare de rău, mialgie, tuse ne-productivă. Din ganglionii limfatici infecţia poate trece în sânge.Decesul poate surveni în 24 h. Antraxul digestiv apare în urma consumului de carne infectată. În mucoasa intestinală se dezvoltă procese identice cu cele din antraxul cutanat (enterocolită ulceroasă). Clinic: vomă şi diaree, cu sânge în masele fecale. Poate urma invazia ganglionilor limfatici mezenterici şi a sângelui, asociată cu prostraţie profundă, şoc şi moarte.Meningita poate apare (foarte rar) ca urmare a oricărei forme de antrax.

Diagnosticul de laborator al antraxuluiSe efectuează numai în laboratoare specializate cu respectarea unor reguli stricte de securitate.Prelevate (în funcţie de forma clinică): exsudat din leziunea cutanată, spută, sânge, LCR, materii fecale, bioptate din ganglioni limfatici, probe necroptice, probe de la animalul suspect şi elemente din mediul extern Examenul microscopic: direct, RIFÎn frotiuri pregătite din prelevate şi colorate Gram sau cu albastru de metilen se observă bacili mari cu morfologia caracteristică, izolaţi sau în lanţuri scurte. Sporii sunt rareori prezenţi.Examenul bacteriologic Prelevatele monomicrobiene se însămânţează pe geloză şi geloză-sânge, iar cele polimicrobiene se încălzesc în prealabil 10 min la 75 grade C. Incubarea la 37 C timp de 24 ore. Sângele – în bulion glucozat, repicări zilnice timp de 7 zile pe geloză-sânge. Examinarea coloniilor crescute, selecţia celor suspecte şi acumularea lor.Identificarea culturii pure acumulate şi diferenţierea de antracoizi. Examenul biologic

73

Se inoculează prelevatele la cobai sau şoareci, care sunt foarte sensibili la infecţie. După moartea lor (36-48h) bacilii sunt depistaţi în frotiuri din sânge şi organe.Depistarea Ag polizaharidice termostabile în prelevate (reacţia de precipitare inelară Ascoli)Diagnosticul serologic. Ac anti-antrax pot fi depistaţi la convalescenţi în RP sau RFCDiagnosticul imunologic (proba cutanată alergică). Se pune în evidenţă starea de hipersensibilizare prin inocularea intradermică a 0,1 ml de antraxină (extract din tulpina vaccinantă de B.anthracis). Reacţie pozitivă – edem şi hiperemie cu diametrul de peste 8 mm.

Tratamentul antraxuluiAntibiotice (peniciline, cefalosporine, fluorochinolone)Imunoglobulina antiantrax

Profilaxia specifică a antraxuluia. Depistarea şi izolarea animalelor bolnave, incinerarea animalelor moarte sau îngroparea

adâncă a cadavrelor şi acoperirea cu var nestins.b. Vaccinarea animalelor.c. Imunizarea personalului expus cu vaccin viu atenuat , vaccin acelular (elaborat din tulpini

acapsulate avirulente, conținând proteina PA). În curs de elaborare – vaccin cu PA și antigen capsular.

89.Pesta. Clasificarea agentului patogen (familie, gen, sp.). Factorii de patogenitate. Formele clinice de pesta. Diagnosticul microbiologic. Prelevate. Regulile de recoltare, transportare si examinare a prelevatelor. Metodele microscopica, bacteriologica si serologica. Profilaxia specifica a pestei.

Pesta (din latină pestis, maladie contagioasă) este o maladie cu multiple fațete mortale pentru om. Ea este cauzată de Yersinia pestis, descoperită de Alexandre Yersin de la Institutul Pasteur în 1894.ClasificareFamilia EnterobacteriaceaeGenul YersiniaSpecia Yersinia pestis Se disting 3 varietăți de tulpini - orientală, medievală și antică.

Caractere morfotinctoriale – yersiniile reprezintă bastonașe drepte, uneori coco-bacterii Gram negative, uneori colorate bipolar, acapsulate, asporulate, imobile la 37 C.Caractere de cultură – yersiniile sunt mi/o anaerobe facultative, cultivă pe medii uzuale la 25-28 C. În BP cultura se manifestă printr-un voal la suprafață și un aspect floconos în interior. Pe geloză peste 48h apar colonii R mari, cu margini neregulateActivitate biochimică – catalaza+, oxidaza-, fermentează glucoza, reduce nitrații în nitriți. Rezistenta: Yersiniile sunt rezistente în mediul extern şi în cadavre de animale.

Aspecte epidemiologiceRozătoarele sălbatice constituie rezervorul natural al maladiei. Yersinia este în principal vehiculată de un șobolan, Rattus rattus, care o transmite la om prin intermediul puricilor infectați (Xenopsylla cheopsis, Nosopsyllus fasciatus). Foarte rar omul se infecteaz prină muşc tura şobolanului infectat sau consumându-l. ă Iepurii și carnivorele pot infecta omul prin contact direct sau mușcătura animalului infectat.În epidemii transmiterea se poate efectua interuman pe cale aerogenă.

După în epţ ătura unui purice infectat, germenul se multiplică la locul de inoculare cu formarea unei vezicule-pustule apoi pătrund în sistemul limfatic și colonizează ganglionii regionali în care se multiplică. Peste 2-5 zile apar semne de limfadenit hemoragic ă ă (bubonul pestos). Pesta bubonică – 90% din cazurile de pestă. Diseminarea hematogenă permite bacteriilor să atingă ansamblul organelor cu apariția semnelor clinice de septicemie. Afectarea plămânilor duce la pesta pulmonară secundară, cu expectorații sanguinolente bogate în germeni, foarte contagioase. Contactul cu acești pacienți duce, prin contact direct, la apariția pestei pulmonare primare care prezintă o mortalitate de 90-100% în lipsă de tratament.

74

Diagnosticul de laborator al pesteiSe realizeaz în laboratoare specializate cu regim special strict.ăPrelevate: punctat din bubon, sput , sânge. ă Toate prelevatele de la o persoană infectată sunt foarte contagioase și manipularea lor cere măsuri special de precauție.Examenul direct Examenul microscopic al punctatului din bubon colorat Gram sau Giemsa poate fi evocator (bacterii Gram-, ovoide, cu colorație bipolară). RIF nu este destul de semnificativ, deoarece există recții încrucișate cu alte yesinii.Examenul bacteriologic (izolarea culturii pure cu identificarea ei ulterioară) este o investigație de bază. În pesta pulmonară, diagnosticul este confirmat prin izolarea culturii din spută sau din aspirat bronșic. Hemocultura (izolarea culturii din sânge) reprezintă examenul-cheie în forma septicemică.Pot fi examinate și probe necroptice, deoarece germenul este foarte rezistent în cadavre în curs de putrefacțieDepistarea rapidă a antigenelor F1.

Tratamentul pesteiAntibiotice (streptomicină, gentamicină, doxiciclină, cloramfenicol)

Profilaxia pesteiIzolarea bolnavilorPersoanele de contact – carantină 6 zile

90.Gangrena gazoasa. Clasificarea agentilor etiologici (familie, gen, sp.). Factorii de patogenitate (exotoxine, enzime). Manifestarile clinice in dependenta de specia microbiana. Diagnosticul microbiologic. Prelevate. Metoda microscopica, izolarea si identificarea culturii pure. Diagnosticul rapid. Profilaxia si tratamentul specific al gangrenei gazoase.

Particularit i ale bacteriilor anaerobe:ăţ Oxigenul este toxic (lipsa superoxid dismutazei/catalazei, peroxidazei) Cresc în lipsa oxigenului/poten ial redox sc zutţ ă Energia este ob inut prin fermentareţ ă

CIRCUMSTAN E CE FAVORIZEAZ INFEC IILE CU ANAEROBIŢ Ă Ţ• Hipoxii tisulare (ateroscleroz , necroz , tumoare malign , corp str in...)ă ă ă ă• Tratament prelungit cu aminozide• St ri de imunosupresie sau imunodepresieă

CLASIFICAREA ANAEROBILORBacterii telurice (sporogene). Prezente în sol, supravie uesc gra ie sporiţ ţ lor termorezisten i.ţFamilia BacillaceaeGenul Clostridium

C. perfringens, C.septicum, C.novyi (oedematiens), C.histolyticum – agen ii gangreneiţ gazoaseC.tetani – agentul tetanosuluiC.botulinum – agentul botulismuluiC.difficile – agentul colitei pseudomembranoase

Patogene, provoac infec ii specifice necontagioaseă ţBacterii anaerobe nesporogene (flora Veillon). Reprezint flora comensal şi saprofit aă ă ă omului (flor endogen ).ă ă

Coci gram+ (Peptococcus, Peptostreptococcus)Coci gram- (Veillonella)Bastonaşe gram+ (Eubacterium, Actinomyces, Bifidobacterium, Propionibacterium, Lactobacillus)Bastonaşe gram- (Fusobacterium, Bacteroides)Spirochete

Condi ionat patogene, pot cauza infec ii supurative, septicemii la persoane cu rezisten aţ ţ ţ sc zut sau în asocia ii cu alte mi/organismeă ă ţ

CLOSTRIDIILE GANGRENEI GAZOASE

75

Agen ii cauzali: ţC.perfringens (serotipuri A, B, C, D, E)C.novyi (oedematiens)C.septicumC.histolyticum

CARACTERE MORFOTINCTORIALEC. perfringens - bastonaş gram+ imobil, capsulat, sporogen (sporul oval sau rotund, central sau subterminal, deformeaz celula bacterian ). ă ăAlte clostridii – mobile, necapsulateCARACTERE DE CULTUR ŞI ENZIMATICEĂMedii de cultură: Kitt-Tarrozzi regenerat, geloz -sânge glucozat , geloz cu g lbenuş de ou şiă ă ă ă lactoz , mediul Wilson-Blair ăColonii – C.perfringens – lenticulare, hemolitice, clostridiile mobile – colonii R, pufoaseManifest activitate proteolitic (digestia cazeinei, producerea H2S, gelatinaza) şi zaharolitică ă ă cu producere abundent de gaz.ă

FACTORI DE PATOGENITATETOXINE

1. Toxina alfa (lecitinaza) – mionecroz , hemoliz , trombocitoliz , deregl ri de coagulare,ă ă ă ă creşterea permeabilit ii vasculare, inactivarea ATPazei musculare, hipotensiune,ăţ bradicardie, şoc

2. Toxina teta – necrozant , hemolitică ă3. Toxina beta – necroza epiteliului intestinal4. Enterotoxina – perturb transportul apei, ionilor şi a glucozei prin membrana enterociteloră

ENZIME DE PATOGENITATE – colagenaza (toxina kappa), proteinaza (toxina lambda), elastaza, hialuronidaza (toxina Mu), ADN-aza (toxina Nu), etc.CAPSULA – rol antifagocitar

HABITATMediul extern – sol, ap , aer, prafăIntestin, vagin, tract respirator superior (om şi animale)FORME CLINICE

Gangrena gazoas (post-traumatic , post-operatorie)ă ă Mionecroze Celulite, fasciite Septicemii Toxiinfec ii alimentareţ Enterita necrozantă

PATOGENIA GANGRENEI GAZOASEPor i de intrareţ – tegumentul sau mucoasele lezate.Omul se contamineaz :ăExogen - bacteria sau sporul p trunde în plaga contaminat cu sol, ap , praf (accidente rutiere,ă ă ă de munc , etc.) – ă gangrena gazoas post-traumatică ă; gangrena gazoas uterină ă (urmare a avortului septic).Endogen – flora intern a bolnavului contamineaz plaga (chirurgie septic visceral , chirurgiaă ă ă ă ortopedic , etc) - ă gangrena gazoas post-operatorie.ăGangrena spontan – ă in cancer intestinal.

Condi ii suplimentare pentru apari ia infec iei:ţ ţ ţ1. Traumatisme cu necroz tisular , hematom, corpuri str ineă ă ă2. Penetrare profund a germenului ă3. Poten ial rH2 sc zut (- 0,5 V)ţ ă4. Multiplicarea bacteriilor aerobe asociate (enterobacterii, enterococi, stafilococi)5. Imunitate deficitar (radioterapie, imunosupresori, antibioticoterapie neadecvat , etc)ă ă6. Injec ia substan elor vasoconstrictiveţ ţ

76

Multiplicându-se bacteriile degradeaz esuturile, distrugându-le din aproape în aproape, fiindă ţ responsabile de extensia infec iei şi de toxemie. Produsele gazoase formate produc disec iaţ ţ esuturilor.ţ

Clinic: durere local , edem, mionecroz , crepita ie la palpare, scurgeri seroă ă ţ -hemoragice, stare general grav (febr , hipotensiune, bradicardie, perturb ri de coagulare, şoc, posibil deces)ă ă ă ăAlte forme clinice cauzate de C. perfringens – celulite, fasciite, enterit necrozant ,ă ă toxiinfec ii alimentareţ

DIAGNOSTICUL GANGRENEI GAZOASE Clinic – crepita ie, miros fetid, scurgeri hemoragice din plagţ ăConfirmare prin diagnostic microbiologicPrelevate: puroi, sânge, lichid seros, bioptatePrecau ii la prelevareţ : excluderea contactului cu aerul, transportare imediat sau utilizareaă mediilor de transport lipsite de oxigen.DIAGNOSTIC DE LABORATORExamenul microscopic – bastonaşe gram+, în cantit i mari, asociate cu reac ie leucocitarăţ ţ ă slab – Interven ie chirurgical imediat !!!!!ă ţ ă ăExamenul bacteriologic – condi ii anaerobe (anaerostat, gaz-pachete, medii anaerobe),ţ metode clasice (Zeissler, Weinberg)Important: bacterii aerobe sau facultative asociateTehnici de amplificare genic ăDiagnostic rapid – Mediul Kitt-Tarrozzi, mediul cu lapte, mediul Wilson-Blair

TRATAMENT ŞI PROFILAXIETratament:

Chirurgical (debridarea pl gilor, eliminarea maselor necrotizate şi a corpurilor str ine,ă ă drenarea)

Administrarea serului antitoxic polivalent (anti-C.perfringens, C.novyi, C.septicum) Antibioterapia cu asocia ii de antibiotice (beta-lactamine, aminozide, metronidazol)ţ Oxigenoterapia hiperbar – incizii cutanateă

Profilaxia : prelucrarea minu ioas a pl gilor, eliminarea corpurilor str ine şi a esuturilorţ ă ă ă ţ necrotice, seroterapie preventiv , anatoxina, antibioterapie, supravegherea bolnaviloră

91.Tetanosul. Clasificarea agentului (familie, gen, sp.), factorii de patogenitate. Patogeneza tetanosului, evolutia simptomelor clinice. Diagnosticul microbiologic. Prelevate. Metoda microscopica, izolarea si identificarea culturii pure. Profilaxia si tratamentul specific al tetanosului.

Agentul cauzal – C.tetaniCaractere morfotinctoriale – bastonaş mobil, cu flageli peritrichi, sporogen. Sporul rotund este plasat terminal (bastonaş de tob ). Gram+. Inert biochimic.ăRezisten aţ – forma vegetativ este sensibil , sporul supravie uieşte în sol decenii.ă ă ţFACTORI DE PATOGENITATEToxina tetanică

Tetanolizina – hemoliză;Tetanospasmina – contracturi ai muşchilor stria i.ţ

Compus din 2 fragmente proteice: fragmentul ă A (toxic, neimunogen) şi fragmentul B (atoxic, imunogen).

PATOGENIA TETANOSULUIHabitat – sol, intestinul omului, animalelorPor i de intrareţ – tegumentul, mucoasele lezate (pl gi, arsuri, mucoasa uterin post-partum,ă ă interven ii chirurgicale, ulcere varicoase, focare dentare, droguri intravenoase, etc.), ţ cordonul ombilical la nou-n scu i.ă ţC. tetani este o bacterie ne-invaziv , multiplicându-se la poarta de intrare şi elaborând toxina,ă care difuzeaz în organism.ăMecanismul de ac iune al toxineiţ :la nivelul pl cii motrice neuro-musculare toxina complet penetreaz într-o vezicul deă ă ă ă endocitoz , fiind transportat pe calea retro-axonal pân la prima sinaps a m duvei spin rii.ă ă ă ă ă ă ă

77

Aici toxina traverseaz spa iul intersinaptic şi urmeaz calea spre SNC. Locul de atac al toxinei îlă ţ ă constituie sinapsa dintre motoneuron şi neuronii c ilor de inhibi ie. Tetanospasmina ă ţ blochează eliberarea glicinei (inhibitor al motoneuronului) de c tre interneuron şi permiteă contrac ia simultan a perechilor de muşchi protagonist-antagonist, producândţ ă paralizie spastic (rigid ) ă ă

CLINICA TETANOSULUIIncuba ia – 6-15 zile (3 zile-3 s pt mâni)ţ ă ăSemne clinice – trismus (contractur dureroas a muşchilor masticatori), facies sardonicusă ă (contrac ii ale muşchilor fe ei), anxietate, contracturi generalizate cu paroxisme spontane sauţ ţ declanşate de stimuli externi (zgomot, lumin , etc), pozi ia corpului în form de arcă ţ ă (opistotonus), deregl ri de vorbire. Febra lipseşte.ăMoarte prin asfixie (spasm laringean) sau stop cardiac.

DIAGNOSTICUL TETANOSULUIDiagnostic clinicDiagnostic de laborator

Prelevate: secre ii din plag , material de pansament, medicamente, etc.ţ ăExamenul microscopic (de orientare)Examenul bacteriologic (tardiv, de confirmare)Examenul biologic (depistarea toxinei prin infectarea şoriceilor cu apari ia semnelor cliniceţ ale maladiei peste 24-48 ore), identificarea toxinei prin RN cu anti-seruriExamenul serologic – dozarea antitoxinelor pentru studierea imunit ii popula iei (RP, RLA,ăţ ţ RHAI, ELISA)

TRATAMENTUL ŞI PROFILAXIA TETANOSULUITratament:

• Ser imun antitetanic (gama-globulin specific ) intramuscular, intravenosă ă• Anatoxin tetanică ă• Tratament simptomatic (sedative, miorelaxante, antibioterapie, respira ie asistat ,ţ ă

etc)Profilaxie:

Imunizarea activ cu anatoxin tetanic (conform calendarului vaccin rii – ADTP, ADT,ă ă ă ă AT)

În caz de plag : prelucrarea corect , anatoxin , ser imun antitoxică ă ă

92.Botulismul. Clasificarea agentului cauzal (familie, gen, sp.), factorii de patogenitate. Patogeneza botulismului, principalele simptome clinice ale intoxicatiei botulinice. Diagnosticul microbiologic. Materiale de examinat. Depistarea si identificarea toxinelor botulinice. Izolarea si identificarea C.botulinum. Profilaxia si tratamentul specific al botulismului.

Agentul cauzal – C.botulinumCaractere morfotinctoriale – bastonaş mobil, sporogen, gram+. Sporul este ovoid, subterminal (aspect de rachet de tenis), termorezistent, distrus la 120 grade – 15 minuteă (autoclavare). Scindeaz proteinele şi glucidele cu formare de gaze şi acizi (acetic, butiric,ă lactic, etc).Factori de patogenitate – toxina botulinic serotipuri ă A,B,C,D,E,F,G. Este de natur proteic ,ă ă antigenic , specific de tip, transformabil în anatoxin . Doza letal pentru om – 1-2 ă ă ă ă ă μg. Stabilă în mediu acid şi la ac iunea enzimelor digestive. Poate fi distrus prin înc lzire 15 min la 80ţ ă ă grade sau 10 min la 100 grade.

PATOGENEZA BOTULISMULUIHabitat mixt – sol, ape şi flora comensal a omului şi animalelorăTransmiterea:A limentar ( alimente conservate în cas : cârna i, şunc , jambon, peşte s rat sau afumat,ă ţ ă ă conserve de fructe şi legume)Condi ii favorabile toxigenezeiţ :

-Salinitate insuficient (mai mic de 10 %)ă ă

78

-Temperatura peste 16 grade-Anaerobioz (alimente compacte sau ambalaje ermetice)ă-Prezen a glucidelor (conserve de fructe, legume)ţ-Timp suficient pentru producerea toxinei (cel pu in 8 zile)ţ

Botulismul infantil apare la sugari sub 6 luni (germinarea în intestin a sporilor vehicula i prinţ alimente)Perioada de incuba ie – 18-96 oreţToxina ingerat este absorbit în sistemul limfatic intestinal, apoi în sânge. Ac ioneaz la nivelulă ă ţ ă periferic asupra sinapselor cu acetilcolina ca mediator (jonc iunile neuro-musculare).ţMecanismul ac iunii botulotoxineiţ : inhib eliberarea acetilcolinei din veziculele sinapticeă rezultând blocarea stimul rii nervoase a muşchiului (paralizii flasce).ăSEMNE CLINICE

1. Paralizii în sfera nervilor cranieni: diplopie, ptoz palpebral , midriaz, disfagie,ă ă disartrie, senza ie de seteţ

2. Paralizii descendente3. Deregl ri digestive: nausee, vom , constipa ie ă ă ţ4. Lipsa febrei şi a deregl rilor cardiaceă

Cauza decesului: paralizie flasc a muşchilor respiratori sau stop cardiacă

DIAGNOSTICDiagnostic clinicDiagnostic microbiologicPrelevate: ser sangvin, extract din alimente, mase vomitive, mase fecaleDepistarea toxinei (RN pe şoareci, RP, RHAI, RCoA, RLA, ELISA)Tehnici de biologie molecularăExamenul bacteriologic este suplimentar!

TRATAMENTUL ŞI PROFILAXIA BOTULISMULUITratament specific: seroterapie precoce (ser polivalent, apoi monovalent) asociat cuă anatoxinoterapieProfilaxie: nespecific ă

INFEC II CAUZATE DE BACTERII ANAEROBE NESPOROGENEŢParte component a microbiocenozelor rino-faringiene, digestive şi genitaleăCondi ii ce favorizeaz multiplicarea:ţ ă

Leziuni necrotice Diminuarea poten ialului redoxţ Reducerea rezisten ei organismuluiţ Disbioze

FORME CLINICE Septicemii Procese supurative Supura ii abdominale (peritonite apendiculare, supura ii determinate de cancer digestiv,ţ ţ

supura ii post-operatorii, abcese)ţ Supura ii ale micului bazin (abces perirectal, piosalpinx, supura ii urinare)ţ ţ Supura ii pleuro-pulmonare, bucale, ORL (otite)ţ Abces al creierului şi meningite purulente

93.Difteria. Clasificarea agentului patogen (familie, gen, sp.). Factorii de patogenitate. Patogeneza difteriei si formele clinice. Diagnosticul microbiologic. Prelevate patologice. Microscopia directa, izolarea si identificarea culturii pure (proba Pizu, Zacs, determinarea toxigenezei, diferentierea biovariantelor). Profilaxia si tratamentul specific al difteriei.

DIFTERIA – toxiinfec ie acut , caracterizat printr-o angin pseudo-membranoas cu efecteţ ă ă ă ăDIFTERIA – toxiinfec ie acut , caracterizat printr-o angin pseudo-membranoas cu efecteţ ă ă ă ă toxice la distan (miocardul, SNC şi rinichii).ţătoxice la distan (miocardul, SNC şi rinichii).ţăEste provocat de mi/o din genul Corynebacterium.ăEste provocat de mi/o din genul Corynebacterium.ăGenul Corynebacterium se caracterizeaz prin prezen a in componen a peretelui celular:ă ţ ţGenul Corynebacterium se caracterizeaz prin prezen a in componen a peretelui celular:ă ţ ţ

79

oo Acidului mezo-diaminopimelicAcidului mezo-diaminopimelicoo Acizilor micolici cu caten scurt (22-38 atomi de C)ă ăAcizilor micolici cu caten scurt (22-38 atomi de C)ă ăoo Con inutul GC între 46-74 %.ţCon inutul GC între 46-74 %.ţ

Prezint asem n ri cu mi/o din genurile Mycobacterium şi Nocardia.ă ă ăPrezint asem n ri cu mi/o din genurile Mycobacterium şi Nocardia.ă ă ă

ClasificareaClasificarea genului Corynebacterium genului Corynebacterium Corinebacterii fitopatogeneCorinebacterii fitopatogene Corinebacterii patogene pentru animale, care afecteaz accidental omul:ăCorinebacterii patogene pentru animale, care afecteaz accidental omul:ă

C.pseudotuberculosis, C.ulceransC.pseudotuberculosis, C.ulcerans Corinebacterii cu tropism uman:Corinebacterii cu tropism uman:

Specie patogen : ăSpecie patogen : ă C.diphtheriaeC.diphtheriae (biovaruri (biovaruri gravis, mitis, intermediusgravis, mitis, intermedius))Specii comensale (specii pseudodifterice, difteroizi): Specii comensale (specii pseudodifterice, difteroizi): C.xerosis, C.pseudodiphthericum,C.xerosis, C.pseudodiphthericum, C.jeikeiumC.jeikeium, etc, etcCaractere morfotinctorialeCaractere morfotinctoriale ale ale C.diphtheriaeC.diphtheriaeBacterii (bastonaşe) drepte sau pu in încurbate, cu extremit ile rotunjite sau îngroşate (aspectţ ăţBacterii (bastonaşe) drepte sau pu in încurbate, cu extremit ile rotunjite sau îngroşate (aspectţ ăţ de halter sau de m ciuc ). În frotiuri se aranjeaz ungiular, în palisade sau sub formaă ă ă ăde halter sau de m ciuc ). În frotiuri se aranjeaz ungiular, în palisade sau sub formaă ă ă ă caracterelor chinezeşti, cifre romane sau litere majuscule: Y, M, N, V... Imobile, caracterelor chinezeşti, cifre romane sau litere majuscule: Y, M, N, V... Imobile, aasporogene,sporogene, nenecapsulate.capsulate.Se coloreaz ăSe coloreaz ă G+G+, pentru eviden ierea granula iilor de volutin - Loeffler, Neisser.ţ ţ ă, pentru eviden ierea granula iilor de volutin - Loeffler, Neisser.ţ ţ ăCaractere de cultur şi biochimiceăCaractere de cultur şi biochimiceăC.diphtheriaeC.diphtheriae este o specie facultativ anaerob , posed catalaz , citocromi a,b,c, oxidazo-.ă ă ă este o specie facultativ anaerob , posed catalaz , citocromi a,b,c, oxidazo-.ă ă ăTemperatura optim de cultivare 37ăTemperatura optim de cultivare 37ă °°C, pH 7,4.C, pH 7,4.

Medii de cultur elective:ăMedii de cultur elective:ăMediul Loeffler (ser bovin coagulat): colonii S, mici, netede, opace, albe-cenuşii, Mediul Loeffler (ser bovin coagulat): colonii S, mici, netede, opace, albe-cenuşii, apar apar peste 16-peste 16-24 ore de cultivare24 ore de cultivareGeloz -sângeăGeloz -sângeăMedii de cultur selective diferen ialeă ţMedii de cultur selective diferen ialeă ţMediul Clauberg (geloz -sânge cu telurit de potasiu). ăMediul Clauberg (geloz -sânge cu telurit de potasiu). ă C.diphtheriae gravis:C.diphtheriae gravis: colonii R, mari, colonii R, mari, negre, crenelate, aspect de “floare de margaret ”, nehemolitice; ănegre, crenelate, aspect de “floare de margaret ”, nehemolitice; ă mitismitis: colonii S, mijlocii, negre,: colonii S, mijlocii, negre, bombate, cu zon de hemoliză ăbombate, cu zon de hemoliză ăMediul Tinsdale (geloz -ser-cistin -telurit de potasiu-tiosulfat) - colonii negre cu halou brun ă ăMediul Tinsdale (geloz -ser-cistin -telurit de potasiu-tiosulfat) - colonii negre cu halou brun ă ăMediul Bucin (geloz -sânge cu hinozol) – colonii albastreăMediul Bucin (geloz -sânge cu hinozol) – colonii albastreăMedii de transportMedii de transportgeloz -ser semilichid cu telurit de Kă ăgeloz -ser semilichid cu telurit de Kă ăMediul OCST (ou-cistin -ser-telurit)ăMediul OCST (ou-cistin -ser-telurit)ăActivitatea biochimic a C.diphtheriae:ăActivitatea biochimic a C.diphtheriae:ă Proteolitic : ăProteolitic : ă

UUreaza- (testul Zaks), cistinaza+ (testul Pizu), indol-.reaza- (testul Zaks), cistinaza+ (testul Pizu), indol-.Zaharolitic : ăZaharolitic : ă

GravisGravis: glucoza+, amidon+, zaharoza-: glucoza+, amidon+, zaharoza- MitisMitis: glucoza+, amidon-, zaharoza-: glucoza+, amidon-, zaharoza-

Se disting 22 lizotipuri de Se disting 22 lizotipuri de C.diphtheriaeC.diphtheriae şi multiple serogrupuri (antigen O polizaharidic) şi şi multiple serogrupuri (antigen O polizaharidic) şi serovaruri (antigen K proteic).serovaruri (antigen K proteic).

Factori de patogenitateFactori de patogenitate1. Toxina difteric - origine proteic , secretat de tulpinile lizogene (profagi Tox+), ă ă ăToxina difteric - origine proteic , secretat de tulpinile lizogene (profagi Tox+), ă ă ă înîn

prezen a unor cantit i reduse de Fe. ţ ăţprezen a unor cantit i reduse de Fe. ţ ăţ Exotoxin tipic (fragmente polipeptidice A şi B).ă ăExotoxin tipic (fragmente polipeptidice A şi B).ă ă Mecanismul de ac iuneţMecanismul de ac iuneţ - stoparea sintezei proteice prin inactivarea factorului de elongare - stoparea sintezei proteice prin inactivarea factorului de elongare EF-2 (activitate de ADP-riboziltransferaz ). Conduce la moartea celulei afectate.ăEF-2 (activitate de ADP-riboziltransferaz ). Conduce la moartea celulei afectate.ă ToxinaToxina difuzeaz în organism perturbând func ionarea diferitor organe (SNC, cord, rinichi). Poateă ţdifuzeaz în organism perturbând func ionarea diferitor organe (SNC, cord, rinichi). Poateă ţ fi transformat în anatoxin , utilizat în vaccinare.ă ă ăfi transformat în anatoxin , utilizat în vaccinare.ă ă ă

2.2. Enzime de patogenitate: hialuronidaza, neuraminidazaEnzime de patogenitate: hialuronidaza, neuraminidazaPatogeneza şi formele clinice de difteriePatogeneza şi formele clinice de difterie Sursa de infec ieţSursa de infec ieţ : bolnavul cu difterie şi purt torii s n toşi de germeni (colonizează ă ă ă: bolnavul cu difterie şi purt torii s n toşi de germeni (colonizează ă ă ă rinofaringele, rareori tegumentul sau conjunctiva).rinofaringele, rareori tegumentul sau conjunctiva).Mecanismele şi c ile de transmitereăMecanismele şi c ile de transmitereă ::

•• Direct pe cale aerogen (pic turi) sau contact cu pl gi contaminate.ă ă ăDirect pe cale aerogen (pic turi) sau contact cu pl gi contaminate.ă ă ă

80

•• Indirect prin obiecte (juc rii, c r i), praf sau alimente contaminate (lactate).ă ă ţIndirect prin obiecte (juc rii, c r i), praf sau alimente contaminate (lactate).ă ă ţLa poarta de intrare bacteriile se multiplic şi provoac un focar inflamator local, determinat deă ăLa poarta de intrare bacteriile se multiplic şi provoac un focar inflamator local, determinat deă ă ac iunea toxinei, care fiind ulterior difuzat pe cale limfo- şi hematogen provoac starea deţ ă ă ăac iunea toxinei, care fiind ulterior difuzat pe cale limfo- şi hematogen provoac starea deţ ă ă ă intoxica ie general . Focarul inflamator se localizeaz în faringe (angina difteric ), mai rar înţ ă ă ăintoxica ie general . Focarul inflamator se localizeaz în faringe (angina difteric ), mai rar înţ ă ă ă laringe (crupul difteric), nas, urechi, conjunctiv , mucoasa organelor genitale, pl gi cutanate. ă ălaringe (crupul difteric), nas, urechi, conjunctiv , mucoasa organelor genitale, pl gi cutanate. ă ăLeziunile locale se caracterizeaz prin inflama ie fibrinoas . Exotoxina cauzeaz necroz ,ă ţ ă ă ăLeziunile locale se caracterizeaz prin inflama ie fibrinoas . Exotoxina cauzeaz necroz ,ă ţ ă ă ă dilatarea vaselor şi creşterea permeabilit ii, eliminarea fibrinogenului, care coaguleaz cuăţ ădilatarea vaselor şi creşterea permeabilit ii, eliminarea fibrinogenului, care coaguleaz cuăţ ă formarea unei pseudomembrane fibrinoase. Ea con ine bacterii, hematii, PMN şi celuleţformarea unei pseudomembrane fibrinoase. Ea con ine bacterii, hematii, PMN şi celuleţ necrozate. Se detaşeaz dificil, nu se dizolv în ap , este reproductibil ă ă ă ănecrozate. Se detaşeaz dificil, nu se dizolv în ap , este reproductibil ă ă ă ă in situin situ în câteva ore. în câteva ore. Membrana are tendin s se extind . ţă ă ăMembrana are tendin s se extind . ţă ă ăÎn forma malign difteria este înso it de edem al gâtului, semne toxice şi paralizia v luluiă ţ ă ăÎn forma malign difteria este înso it de edem al gâtului, semne toxice şi paralizia v luluiă ţ ă ă palatin.palatin.Intoxica ia general afecteaz SN (disfagie, paralizii), sistemul cardio-vascular (miocardite),ţ ă ăIntoxica ia general afecteaz SN (disfagie, paralizii), sistemul cardio-vascular (miocardite),ţ ă ă suprarenalele (insuficien a suprarenalelor), rinichii (nefroz ).ţă ăsuprarenalele (insuficien a suprarenalelor), rinichii (nefroz ).ţă ăTulpini de Tulpini de C.ulceransC.ulcerans pot produce toxin identic cu cea difteric .ă ă ă pot produce toxin identic cu cea difteric .ă ă ă

Diagnosticul de laborator al difterieiDiagnosticul de laborator al difterieiEste URGENT!!!Este URGENT!!!PrelevatePrelevate – în func ie de forma clinic , respectând strict regulile de prelevare şi transport. ţ ă – în func ie de forma clinic , respectând strict regulile de prelevare şi transport. ţ ăMetode de diagnosticMetode de diagnostic

1. Examenul microscopic (Gram, Loeffler, Neisser)Examenul microscopic (Gram, Loeffler, Neisser), m, microscopia icroscopia iimunofluorescent ămunofluorescent ă2. Examenul bacteriologic (izolarea, identificarea culturii pure). Studierea toxigenezei –Examenul bacteriologic (izolarea, identificarea culturii pure). Studierea toxigenezei –

obligator. Se efectueaz prin RN cu ser antitoxic ăobligator. Se efectueaz prin RN cu ser antitoxic ă in vivoin vivo (cobai), (cobai), in vitroin vitro (RP Elek), sau (RP Elek), sau depistarea genei depistarea genei ToxTox în prelevat sau în cultura pur prin PCR.ă în prelevat sau în cultura pur prin PCR.ă

3.3. Examenul serologic – retrospectiv, Examenul serologic – retrospectiv, RA cu seruri perechi (I s pt mân şi a IIIa) şi cultur de ă ă ă ăRA cu seruri perechi (I s pt mân şi a IIIa) şi cultur de ă ă ă ă C.diphtheriaeC.diphtheriae. . Titru sTitru semnificativ – emnificativ – 1:1001:100 sau sau creşterea titrului de Ac.creşterea titrului de Ac.Evaluarea titrului de antitoxine în serul bolnavului. La debutul bolii el este absent sau nuEvaluarea titrului de antitoxine în serul bolnavului. La debutul bolii el este absent sau nu dep şeşte 0,5 UI/mlădep şeşte 0,5 UI/mlăReceptivitatea la difterieReceptivitatea la difterie poate fi determinat prin:ă poate fi determinat prin:ă

Testul Schick (Testul Schick (in vivoin vivo)) RN RN in vitroin vitro RHAIRHAI ELISAELISA

Titru antitoxinelor Titru antitoxinelor >> 0,1 UI/ml – protector 0,1 UI/ml – protectorTitru inferior 0,01 UI/mTitru inferior 0,01 UI/mll – lipsa protec ieiţ – lipsa protec ieiţ

Tratamentul difterieiTratamentul difterieiSeroterapie precoce (ser antitoxic antidifteric, Ig). Neutralizeaz activitatea toxinei, blocândăSeroterapie precoce (ser antitoxic antidifteric, Ig). Neutralizeaz activitatea toxinei, blocândă fixarea ei pe receptorii celulari. fixarea ei pe receptorii celulari. Antibioticoterapie (macrolide, tetracicline, cloramfenicol, aminozide, beta-lactamine). AsigurăAntibioticoterapie (macrolide, tetracicline, cloramfenicol, aminozide, beta-lactamine). Asigură eradicarea germenilor.eradicarea germenilor.Tratament simptomaticTratament simptomaticProfilaxia specific a difterieiăProfilaxia specific a difterieiăVaccinarea obligatorie a copiilor conform calendarului de vaccin ri cu anatoxin difteric . Există ă ă ăVaccinarea obligatorie a copiilor conform calendarului de vaccin ri cu anatoxin difteric . Există ă ă ă vaccinuri asociate: ADT, ADTP.vaccinuri asociate: ADT, ADTP. Vaccinarea primara cu ADTP la 4-5-6 luni, revaccinarea la 22-24 Vaccinarea primara cu ADTP la 4-5-6 luni, revaccinarea la 22-24 luni cu ADTP, la 6-7, apoi la 14-15 ani cu ADT.luni cu ADTP, la 6-7, apoi la 14-15 ani cu ADT.Recent a fost ob inut un vaccin sintetic antidifteric. Reprezint un polipeptid situat la jonc iuneaţ ă ţRecent a fost ob inut un vaccin sintetic antidifteric. Reprezint un polipeptid situat la jonc iuneaţ ă ţ fragmentelor A şi B a toxinei difterice, o molecul peptidic “purt toare” şi un adjuvant sintetic.ă ă ăfragmentelor A şi B a toxinei difterice, o molecul peptidic “purt toare” şi un adjuvant sintetic.ă ă ă

94.Tusea convulsiva. Clasificarea agentului cauzal (familie, gen, sp.). Factorii de patogenitate. Patogeneza tusei convulsive, stadiile bolii. Diagnosticul microbiologic. Prelevate. Izolarea (metode de insamintare) si identificarea culturii pure, metoda serologica. Profilaxia si tratamentul specific al tusei convulsive.

FamiliaFamilia Halobacteriaceae HalobacteriaceaeGenulGenul Bordetella BordetellaSpecii:Specii:

81

Bordetella pertussisBordetella pertussis (agentul tusei convulsive) (agentul tusei convulsive) Bordetella parapertussisBordetella parapertussis (agentul parapertusei) (agentul parapertusei)Bordetella bronhisepticaBordetella bronhiseptica (pneumonii, bacteriemii) (pneumonii, bacteriemii)Bordetella aviumBordetella aviumBordetella holmensiiBordetella holmensii (izolat din hemoculturi)ă (izolat din hemoculturi)ăBordetella hinziiBordetella hinzii (izolat din prelevate respiratorii)ă (izolat din prelevate respiratorii)ăBordetella trematumBordetella trematum (infec ii cutanate şi auriculare)ţ (infec ii cutanate şi auriculare)ţ

Caractere morfobiologice B. pertussisCaractere morfobiologice B. pertussisCocobacterii Cocobacterii G-G-, asporogene, imobile, formeaz microcapsul , în frotiu se dispun separat, înă ă, asporogene, imobile, formeaz microcapsul , în frotiu se dispun separat, înă ă perechi sau lan uri scurte. Reprezint mi/o strict aerobe, foarte preten ioase la cultivare.ţ ă ţperechi sau lan uri scurte. Reprezint mi/o strict aerobe, foarte preten ioase la cultivare.ţ ă ţMedii speciale de izolare:Medii speciale de izolare:

mediul Bordet-Gengou (geloz -sânge cu amidon şi glicerin )ă ămediul Bordet-Gengou (geloz -sânge cu amidon şi glicerin )ă ă geloz -cazein -sânge-c rbune activată ă ăgeloz -cazein -sânge-c rbune activată ă ă

Mediul de transport Kuzne ovţMediul de transport Kuzne ovţ (solu ie tampon fosfat, 0,5% agar-agar, 0,2% c rbune activat)ţ ă (solu ie tampon fosfat, 0,5% agar-agar, 0,2% c rbune activat)ţ ăPeste 3-5 zile de incubare în atmosfer umed la 37ă ăPeste 3-5 zile de incubare în atmosfer umed la 37ă ă °° C apar colonii S mici, bombate, lucioase, C apar colonii S mici, bombate, lucioase, cu aspect de pic turi de mercur, hemolitice (corespund bacteriilor virulente – faza I), forme R –ăcu aspect de pic turi de mercur, hemolitice (corespund bacteriilor virulente – faza I), forme R –ă avirulente, faza IV.avirulente, faza IV.Coloniile de Coloniile de B.parapertussis B.parapertussis apar în 48 ore, apar în 48 ore, B.bronchisepticaB.bronchiseptica – în 24 ore – în 24 ore B.pertussis B.pertussis manifest activitate biochimic redus : oxidaza+, nu fermenteaz glucidele,ă ă ă ămanifest activitate biochimic redus : oxidaza+, nu fermenteaz glucidele,ă ă ă ă ureaza-, nitrat-reductaza- .ureaza-, nitrat-reductaza- .Structura antigenicăStructura antigenică a a B.pertussisB.pertussis este complex : ă este complex : ă

Ag capsulare polizaharidiceAg capsulare polizaharidice Ag proteiceAg proteice Ag fimbrial (hemaglutinina)Ag fimbrial (hemaglutinina) Ag lipopolizaharidic.Ag lipopolizaharidic.

Factorii de patogenitateFactorii de patogenitate1.1. Adezine:Adezine:

Hemaglutinina filamentoasăHemaglutinina filamentoasă (purtat de pili). Permite ataşarea bacteriei la mucoasaă (purtat de pili). Permite ataşarea bacteriei la mucoasaă tractului respirator, de asemenea se fixeaz pe macrofagi şi limfocite.ătractului respirator, de asemenea se fixeaz pe macrofagi şi limfocite.ăAglutinogeneAglutinogene. Proteine de suprafa situate pe fimbrii. Particip la ataşarea ţă ă. Proteine de suprafa situate pe fimbrii. Particip la ataşarea ţă ă B.pertussis B.pertussis lala celulele epiteliale.celulele epiteliale.PertactinaPertactina. Protein a membranei externe, permite fixarea pe membrana celulelor eucarioteă. Protein a membranei externe, permite fixarea pe membrana celulelor eucarioteăSubunitatea B a toxinei pertusiceSubunitatea B a toxinei pertusice. Se fixeaz pe leucocite şi împiedic migrarea lor spreă ă. Se fixeaz pe leucocite şi împiedic migrarea lor spreă ă focarul inflamator.focarul inflamator.

2. ToxineToxine Toxina pertussisToxina pertussis (citotoxin de tip A-B). Ac ioneaz asupra diferitor celule eucariote, m rindă ţ ă ă (citotoxin de tip A-B). Ac ioneaz asupra diferitor celule eucariote, m rindă ţ ă ă concentra ia intracelular de AMP ciclic (în special în celulele epiteliale ale TR). Provoacţ ă ăconcentra ia intracelular de AMP ciclic (în special în celulele epiteliale ale TR). Provoacţ ă ă hiperlimfocitoz , sensibilizare la histamin , hipersecre ie de insulin .ă ă ţ ăhiperlimfocitoz , sensibilizare la histamin , hipersecre ie de insulin .ă ă ţ ăAdenilat-ciclaza-hemolizinăAdenilat-ciclaza-hemolizină. Hemolizina provoac moartea macrofagelor şi monocitelor,ă. Hemolizina provoac moartea macrofagelor şi monocitelor,ă adenilat-ciclaza perturb activitatea bactericid a PMN, monocitelor şi macrofagelor şiă ăadenilat-ciclaza perturb activitatea bactericid a PMN, monocitelor şi macrofagelor şiă ă stimuleaz secre ia sero-mucoas a c ilor respiratorii.ă ţ ă ăstimuleaz secre ia sero-mucoas a c ilor respiratorii.ă ţ ă ăToxina dermonecroticăToxina dermonecrotică. Se elibereaz în urma lizei bacteriene.ă. Se elibereaz în urma lizei bacteriene.ăToxina citotrahealăToxina citotraheală. Glicopeptid care inhib sinteza ADN, provocând distrugerea celuleloră. Glicopeptid care inhib sinteza ADN, provocând distrugerea celuleloră ciliate ciliate EndotoxinaEndotoxina

Patogeneza tusei convulsivePatogeneza tusei convulsive Sursa de infec ieţSursa de infec ieţ – omul bolnav, în special în perioada de debut al bolii. – omul bolnav, în special în perioada de debut al bolii. Mecanismul de transmitereMecanismul de transmitere – aerogen, prin pic turi ă – aerogen, prin pic turi ăB.pertussisB.pertussis manifest tropism pentru mucoasa c ilor respiratorii: faringe, trahee, bronşii,ă ă manifest tropism pentru mucoasa c ilor respiratorii: faringe, trahee, bronşii,ă ă bronhiole, chiar alveole. Alterarea epitelilului ciliat împiedic eliminarea mucusului, el fiindăbronhiole, chiar alveole. Alterarea epitelilului ciliat împiedic eliminarea mucusului, el fiindă eliminat doar prin tuse. Tusea survine din cauza irita iei mucoasei de c tre endotoxinaţ ăeliminat doar prin tuse. Tusea survine din cauza irita iei mucoasei de c tre endotoxinaţ ă bacterian . Excita ia de lung durat a receptorilor terminali ai nervului pneumogastrică ţ ă ăbacterian . Excita ia de lung durat a receptorilor terminali ai nervului pneumogastrică ţ ă ă determin un flux continuu de impulsuri în bulbul rahidian, ce duce la formarea unui focat deădetermin un flux continuu de impulsuri în bulbul rahidian, ce duce la formarea unui focat deă excita ie dominant. El atrage excita ii nespecifice de la al i receptori, fapt ce determinţ ţ ţ ăexcita ie dominant. El atrage excita ii nespecifice de la al i receptori, fapt ce determinţ ţ ţ ă accesele de tuse, care devin tot mai grave şi mai frecvente. accesele de tuse, care devin tot mai grave şi mai frecvente.

82

Un stimul puternic poate stinge dominanta, cu atenuarea tusei. Focarul este foarte stabil,Un stimul puternic poate stinge dominanta, cu atenuarea tusei. Focarul este foarte stabil, persist şi dup dispari ia bacteriei din organism. ă ă ţpersist şi dup dispari ia bacteriei din organism. ă ă ţ

În evolu ia tusei convulsive se disting 4 stadii (perioade):ţÎn evolu ia tusei convulsive se disting 4 stadii (perioade):ţ Perioada de Perioada de incuba ieţincuba ieţ (3-15 zile) (3-15 zile) Perioada Perioada cataralăcatarală, foarte contagioas . Caracterizat prin tuse seac , rinoree (3-14 zile)ă ă ă, foarte contagioas . Caracterizat prin tuse seac , rinoree (3-14 zile)ă ă ă Perioada Perioada convulsivăconvulsivă (paroxistic ). Accese de tuse spasmodic , epuizant , asociat cuă ă ă ă (paroxistic ). Accese de tuse spasmodic , epuizant , asociat cuă ă ă ă

cianoz , vom , convulsii. (2-4 s pt mâni)ă ă ă ăcianoz , vom , convulsii. (2-4 s pt mâni)ă ă ă ă Perioada de Perioada de convalescenţăconvalescenţă (2-4 s pt mâni)ă ă (2-4 s pt mâni)ă ă

Complica ii grave sunt posibile la copiii sugari: bronho-pneumonii, encefalite.ţComplica ii grave sunt posibile la copiii sugari: bronho-pneumonii, encefalite.ţ

Imunitatea este durabil , umoral . Rol protector au Ac anti-toxin pertussis şi anti-ă ă ăImunitatea este durabil , umoral . Rol protector au Ac anti-toxin pertussis şi anti-ă ă ăhemaglutinin filamentoas .ă ăhemaglutinin filamentoas .ă ă

Diagnosticul de laborator al tusei convulsiveDiagnosticul de laborator al tusei convulsivePrelevatePrelevate: mucozit i nasofaringiene sau bronşice, recoltate cât mai precoce.ăţ: mucozit i nasofaringiene sau bronşice, recoltate cât mai precoce.ăţMetode de diagnosticMetode de diagnosticRIFRIFExamenul bacteriologic (îns mân are cu tamponul sau prin tehnic “pl cilor tuşite”)ă ţ ă ăExamenul bacteriologic (îns mân are cu tamponul sau prin tehnic “pl cilor tuşite”)ă ţ ă ăTehnnici de biologie molecular (PCR)ăTehnnici de biologie molecular (PCR)ăExamenul serologic (RA, RFC, ELISA). Reac iile se pozitiveaz din s pt mâna a II a perioadeiţ ă ă ăExamenul serologic (RA, RFC, ELISA). Reac iile se pozitiveaz din s pt mâna a II a perioadeiţ ă ă ă convulsive. Se examineaz seruri perechi prelevate la interval de 14-21 zile. Semnificativ esteă ăconvulsive. Se examineaz seruri perechi prelevate la interval de 14-21 zile. Semnificativ esteă ă o creştere de cel pu in 4 ori a titrului Ac.ţo creştere de cel pu in 4 ori a titrului Ac.ţ

Tratamentul tusei convulsiveTratamentul tusei convulsiveEritromicin sau cloramfenicol– cel pu in 10 zile (pân la apari ia Ac)ă ţ ă ţEritromicin sau cloramfenicol– cel pu in 10 zile (pân la apari ia Ac)ă ţ ă ţImunoglobulin uman antipertussisă ăImunoglobulin uman antipertussisă ăProfilaxia specificăProfilaxia specifică1.1. Imunizarea artificial obligatorie cu vaccin ADTP. Componentul antipertusic este reprezentatăImunizarea artificial obligatorie cu vaccin ADTP. Componentul antipertusic este reprezentată

de o suspensie de bordetele de faza I, adsorbite pe adjuvant. de o suspensie de bordetele de faza I, adsorbite pe adjuvant. 2.2. Vaccinul acelular con ine unele componente bacteriene (anatoxina pertussis, hemaglutininaţVaccinul acelular con ine unele componente bacteriene (anatoxina pertussis, hemaglutininaţ

filamentoas ). Este mai bine tolerat, dar mai pu in eficace.ă ţfilamentoas ). Este mai bine tolerat, dar mai pu in eficace.ă ţ3.3. Imunoglobulin uman antipertussisă ăImunoglobulin uman antipertussisă ă

95.Tuberculoza. Clasificarea agentilor cauzali (familie, gen, sp.). Factorii de patogenitate. Primoinfectia tuberculoasa - granulomul tuberculos, ”complexul primar”. Evolutia procesului infectios la indivizii cu rezistenta necompromisa. Diagnosticul microbiologic. Metoda alergica (proprietatile tuberculinei), metodele rapide. Profilaxia specifica a tuberculozei.

FamiliaFamilia Mycobacteriaceae MycobacteriaceaeGenulGenul Mycobacterium MycobacteriumSpecii:Specii:

o Responsabile de tuberculoza uman : ăResponsabile de tuberculoza uman : ă M.tuberculosis, M.bovis, M.africanumM.tuberculosis, M.bovis, M.africanum (“complex(“complex tuberculosis”)tuberculosis”)

o Agentul leprei: Agentul leprei: M.leprae M.leprae (strict uman )ă(strict uman )ăo Micobacterii “atipice”, condi ionat patogene: ţMicobacterii “atipice”, condi ionat patogene: ţ M.avium, M.ulcerans, M.fortuitumM.avium, M.ulcerans, M.fortuitum,,

M.kansasii, M.marinum, M.kansasii, M.marinum, etc. Cauzeaz micobacterioze la persoane imunocompromise.ăetc. Cauzeaz micobacterioze la persoane imunocompromise.ăo Micobacterii nepatogene: Micobacterii nepatogene: M.smegmatis, M.gastri, M.phley M.smegmatis, M.gastri, M.phley

Caracteristica general a micobacteriilorăCaracteristica general a micobacteriiloră : bastonaşe : bastonaşe G+G+ drepte sau uşor încurbate, necapsulate, drepte sau uşor încurbate, necapsulate, asporogene, imobile, acido-alcoolorezistente prin tehnica de colorare Ziehl-Neelsen.asporogene, imobile, acido-alcoolorezistente prin tehnica de colorare Ziehl-Neelsen.M.tuberculosisM.tuberculosis este o bacterie patogen strict uman , responsabil de tuberculoz . Esteă ă ă ă este o bacterie patogen strict uman , responsabil de tuberculoz . Esteă ă ă ă sensibil la c ldur , lumin solar direct , raze UV sau X. Rezistent la frig sau desicare. Esteă ă ă ă ă ă ăsensibil la c ldur , lumin solar direct , raze UV sau X. Rezistent la frig sau desicare. Esteă ă ă ă ă ă ă pu in sensibil la acizi, baze (se utilizeaz în decontaminarea prelevatelor) sau detergen i şiţ ă ă ţpu in sensibil la acizi, baze (se utilizeaz în decontaminarea prelevatelor) sau detergen i şiţ ă ă ţ foarte sensibil la solu ia de alcool de 70ă ţfoarte sensibil la solu ia de alcool de 70ă ţ °°. . Caractere morfotinctorialeCaractere morfotinctorialeM.tbcM.tbc este un bastonaş fin sau uşor încurbat, în frotiu se observ izolat, în gr mezi sau corzi. Seă ă este un bastonaş fin sau uşor încurbat, în frotiu se observ izolat, în gr mezi sau corzi. Seă ă coloreaz ăcoloreaz ă iin roşu prin tehnica Ziehl-Neelsen.n roşu prin tehnica Ziehl-Neelsen.

83

Caractere de culturăCaractere de culturăM.tbcM.tbc este o bacterie strict aerob , foarte exigent la cultivare. Toate mediile de izolare au laă ă este o bacterie strict aerob , foarte exigent la cultivare. Toate mediile de izolare au laă ă baz ou coagulat. Mediul de referin – ă ţăbaz ou coagulat. Mediul de referin – ă ţă Lowenstein-JensenLowenstein-Jensen (ou, glicerin , asparagin ). Alteă ă (ou, glicerin , asparagin ). Alteă ă medii solide – Popescu (acid glutamicmedii solide – Popescu (acid glutamic in locul asparaginei in locul asparaginei), Finn (glutamat de Na). ), Finn (glutamat de Na). Mediul lichid Mediul lichid SautonSauton. Contine saruri minerale, asparagina, glicerina. M.tbc creste in 8-10 zile. Contine saruri minerale, asparagina, glicerina. M.tbc creste in 8-10 zile sub forma de voal.sub forma de voal.Micobacteriile patogene cresc lent (perioada de genera ie – 20 ore), la 37ţMicobacteriile patogene cresc lent (perioada de genera ie – 20 ore), la 37ţ °°C, pH 6,8-7,0.C, pH 6,8-7,0.Coloniile de Coloniile de M.tbc M.tbc apar peste 2-4 s pt mâni, sunt colonii R, rugoase, friabile, conopidiforme,ă ăapar peste 2-4 s pt mâni, sunt colonii R, rugoase, friabile, conopidiforme,ă ă opace, de culoare crem-bej.opace, de culoare crem-bej.M.bovisM.bovis şi şi M.africanumM.africanum formeaz colonii S, mici, netede, nepigmentate, vizibile peste 4-8ă formeaz colonii S, mici, netede, nepigmentate, vizibile peste 4-8ă s pt mâni.ă ăs pt mâni.ă ăActivitatea biochimicăActivitatea biochimică a micobacteriilor patogene a micobacteriilor patogeneToate micobacteriile patogene produc o catalaz termolabil , distrus la 68ă ă ăToate micobacteriile patogene produc o catalaz termolabil , distrus la 68ă ă ă °°C timp de 20 min.C timp de 20 min. Celelalte micobacterii posed catalaz termostabil .ă ă ăCelelalte micobacterii posed catalaz termostabil .ă ă ăM.tbsM.tbs şi şi M.bovisM.bovis hidrolizeaz ureea.ă hidrolizeaz ureea.ăM.tbcM.tbc produce acid nicotinic (niacin ), reduce nitra ii în nitri i. ă ţ ţ produce acid nicotinic (niacin ), reduce nitra ii în nitri i. ă ţ ţ M.bovisM.bovis nu manifest astfel deă nu manifest astfel deă activitate.activitate.

Compozi ia chimic şi factorii de patogenitate ai micobacteriilorţ ăCompozi ia chimic şi factorii de patogenitate ai micobacteriilorţ ăLipideleLipidele constituie 20-45% din masa celulei. Sunt reprezentate de acizi micolici şi ceruri constituie 20-45% din masa celulei. Sunt reprezentate de acizi micolici şi ceruri (condi ioneaz transformarea macrofagelor în celule epitelioide şi celule gigante Langhans).ţ ă(condi ioneaz transformarea macrofagelor în celule epitelioide şi celule gigante Langhans).ţ ă Cord-factorul (sulfo-lipid) perturba respira ia în mitocondrii, induce cultivarea în corzi (cosi e) aţ ţCord-factorul (sulfo-lipid) perturba respira ia în mitocondrii, induce cultivarea în corzi (cosi e) aţ ţ M.tbcM.tbc. . Polizaharidele Polizaharidele joac un rol important în formarea Ac serici, conferind specificitateaăjoac un rol important în formarea Ac serici, conferind specificitateaă imunologic . ăimunologic . ăProteineleProteinele reprezint suportul imunit ii celulare şi a hipersensibilit ii tardive.ă ăţ ăţ reprezint suportul imunit ii celulare şi a hipersensibilit ii tardive.ă ăţ ăţ

Patogeneza şi formele clinice de tuberculozăPatogeneza şi formele clinice de tuberculozăSursa de infec ie – omul bolnav cu TBC cu leziuni pulmonare cavitare deschise în bronsii (ţSursa de infec ie – omul bolnav cu TBC cu leziuni pulmonare cavitare deschise în bronsii (ţ M.tbc,M.tbc, M.africanumM.africanum) sau bovinele bolnave () sau bovinele bolnave (M.bovisM.bovis).).Transmiterea se efectueaz pe cale aerian (pic turi, praf). Rareori este posibil contaminareaă ă ă ăTransmiterea se efectueaz pe cale aerian (pic turi, praf). Rareori este posibil contaminareaă ă ă ă prin obiecte, alimente (lapte nepasteurizat) sau mâini contaminate.prin obiecte, alimente (lapte nepasteurizat) sau mâini contaminate.Receptivitatea este influen at de vârst şi factorii de mediu: caren e nutritive, alcoolism,ţ ă ă ţReceptivitatea este influen at de vârst şi factorii de mediu: caren e nutritive, alcoolism,ţ ă ă ţ tratament imunosupresiv, etc tratament imunosupresiv, etc Primoinfec ia tuberculoas .ţ ăPrimoinfec ia tuberculoas .ţ ă Reprezinta un ansamblu de manifestari clinice, umorale si anatomice care se desfasoara inReprezinta un ansamblu de manifestari clinice, umorale si anatomice care se desfasoara in organism in urma primului contact cu agentul TBC.organism in urma primului contact cu agentul TBC.Dup contaminareăDup contaminareă (mai frecvent in copilarie) (mai frecvent in copilarie), la poarta de intrare (90% - tractul respirator),, la poarta de intrare (90% - tractul respirator), bacteriile sunt captate de macrofage în care se multiplic (bacterii facultativ intracelulare,ăbacteriile sunt captate de macrofage în care se multiplic (bacterii facultativ intracelulare,ă împiedic formarea fagolizosomei). Apare o leziune inflamatoare nespecific . Peste câtevaă ăîmpiedic formarea fagolizosomei). Apare o leziune inflamatoare nespecific . Peste câtevaă ă s pt mâni (4-12) se dezvolt o imunitate celular şi leziunea exsudativ evolueaz în leziuneă ă ă ă ă ăs pt mâni (4-12) se dezvolt o imunitate celular şi leziunea exsudativ evolueaz în leziuneă ă ă ă ă ă granulomatoas . Sub ac iunea unor citokine macrofagii activa i se diferen iaz în celuleă ţ ţ ţ ăgranulomatoas . Sub ac iunea unor citokine macrofagii activa i se diferen iaz în celuleă ţ ţ ţ ă epitelioide şi celule multinucleate gigante. Ele sunt înconjurate de limfocite şi fibroblaste.epitelioide şi celule multinucleate gigante. Ele sunt înconjurate de limfocite şi fibroblaste. Acesta este granulomul tuberculos, semn caracteristic primo-infec iei. Infec ia se extinde peţ ţAcesta este granulomul tuberculos, semn caracteristic primo-infec iei. Infec ia se extinde peţ ţ cale limfatic , cu afectarea ganglionilor regionali. ăcale limfatic , cu afectarea ganglionilor regionali. ăPrimoinfec ia inaparentţ ăPrimoinfec ia inaparentţ ă. La cca 85% leziunile se vindec şi se pot autosteriliza. Nici o expresieă. La cca 85% leziunile se vindec şi se pot autosteriliza. Nici o expresieă clinic sau radiologic .ă ăclinic sau radiologic .ă ăTuberculoza primar subclinică ăTuberculoza primar subclinică ă. Dac multiplicarea bacteriilor este masiv , în leziunileă ă. Dac multiplicarea bacteriilor este masiv , în leziunileă ă tuberculoase se realizeaz o necroz cazeoas (tuberculom). Frecvent are loc calcifiereaă ă ătuberculoase se realizeaz o necroz cazeoas (tuberculom). Frecvent are loc calcifiereaă ă ă tuberculomului (leziunea este vizibil radiologic), cu autosterilizarea spontan sau cuă ătuberculomului (leziunea este vizibil radiologic), cu autosterilizarea spontan sau cuă ă persisten a unor bacterii în leziune.ţpersisten a unor bacterii în leziune.ţConsecin ele primoinfec iei inaparente sau subcliniceţ ţConsecin ele primoinfec iei inaparente sau subcliniceţ ţ :: dezvoltarea imunit iiăţ dezvoltarea imunit iiăţ antituberculoase şi a sensibiliz rii tuberculinice.ăantituberculoase şi a sensibiliz rii tuberculinice.ăTuberculoza primar manifestă ăTuberculoza primar manifestă ă necomplicat .ănecomplicat .ă Pacien ii au febr , astenie, pierdere în greutate,ţ ă Pacien ii au febr , astenie, pierdere în greutate,ţ ă etc. Etapa ganglionar poate fi dep şit cu disemin ri hematogene şi afectarea pleurei,ă ă ă ăetc. Etapa ganglionar poate fi dep şit cu disemin ri hematogene şi afectarea pleurei,ă ă ă ă meningelui, m duvei osoase, parenhimei organelor. Leziunile pot evolua fie spre agravare, fieămeningelui, m duvei osoase, parenhimei organelor. Leziunile pot evolua fie spre agravare, fieă spre cicatrizare.spre cicatrizare.Primoinfec ia cu complica iiţ ţPrimoinfec ia cu complica iiţ ţ . Rareori (10% cazuri), evolu ia este defavorabil : masele necroticeţ ă. Rareori (10% cazuri), evolu ia este defavorabil : masele necroticeţ ă sunt evacuate în bronşii, vase sanguine, pleur sau pericard cu formarea unei caverne, undeăsunt evacuate în bronşii, vase sanguine, pleur sau pericard cu formarea unei caverne, undeă

84

bacteriile se multiplic intens. Fistulizarea într-un vas sangvin disemineaz infec ia sistemică ă ţbacteriile se multiplic intens. Fistulizarea într-un vas sangvin disemineaz infec ia sistemică ă ţ (tuberculoza miliar ). Starea general este alterat , apare febr , tuse, uneori hemoptizie.ă ă ă ă(tuberculoza miliar ). Starea general este alterat , apare febr , tuse, uneori hemoptizie.ă ă ă ă Bolnavul este contagios, eliminând bacterii cu sputa.Bolnavul este contagios, eliminând bacterii cu sputa.Tuberculoza secundarăTuberculoza secundară. Se manifest în condi ii de sc dere a reactivit ii imune, reinfec iiă ţ ă ăţ ţ. Se manifest în condi ii de sc dere a reactivit ii imune, reinfec iiă ţ ă ăţ ţ masive sau reactivarea unor focare latente. Focarele noi apar în ritm lent şi evolueaz cronicămasive sau reactivarea unor focare latente. Focarele noi apar în ritm lent şi evolueaz cronică f r tendin de vindecare spontan .ă ă ţă ăf r tendin de vindecare spontan .ă ă ţă ăAlte forme clinice de tuberculozăAlte forme clinice de tuberculoză: ganglionar , meningean , osteo-articular , uro-genital .ă ă ă ă: ganglionar , meningean , osteo-articular , uro-genital .ă ă ă ăImunitatea antituberculoasăImunitatea antituberculoasă este celular , nesteril . Hipersensibilitatea tardiv înso eşteă ă ă ţ este celular , nesteril . Hipersensibilitatea tardiv înso eşteă ă ă ţ imunitatea celular . Ac circulan i nu au rol protector.ă ţimunitatea celular . Ac circulan i nu au rol protector.ă ţ

96.Tuberculoza. Clasificare a agentilor patogeni, factorii de patogenitate. Evolutia procesului infectios in tuberculoza pulmonara la gazda inalt receptiva. Diagnosticul microbiologic. Prelevatele: recoltarea, omogenizarea, decontaminarea. Concentrarea micobacteriilor din sputa. Microscopia directa, izolarea si identificarea micobacteriilor. Determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotice si chimioterapice. Tratamentul specific al tuberculozei. Strategia DOTS.

Diagnosticul de laborator al tuberculozeiDiagnosticul de laborator al tuberculozeiPrelevatePrelevate: în func ie de forma clinic ţ ă: în func ie de forma clinic ţ ăÎn caz de necesitate se efectueaz omogenizarea (decontaminarea) şi concentrareaăÎn caz de necesitate se efectueaz omogenizarea (decontaminarea) şi concentrareaă prelevatelor.prelevatelor.Metode de diagnosticMetode de diagnosticExamenul microscopicExamenul microscopic – frotiuri colorate Ziehl-Neelsen (bastonaşe purpurii izolate) sau cu – frotiuri colorate Ziehl-Neelsen (bastonaşe purpurii izolate) sau cu auraminăauramină (bastonase galbene pe fondul negru) (bastonase galbene pe fondul negru)..Examenul bacteriologicExamenul bacteriologic – izolarea culturii pure pe mediile speciale, identificarea ei, testarea – izolarea culturii pure pe mediile speciale, identificarea ei, testarea sensibilit ii la chimioterapice (prin metoda dilu iilor în mediu solid)ăţ ţsensibilit ii la chimioterapice (prin metoda dilu iilor în mediu solid)ăţ ţPCRPCR pentru detectarea rapid a micobacteriilor direct în prelevateă pentru detectarea rapid a micobacteriilor direct în prelevateăIntradermoreac ia la tuberculinţ ăIntradermoreac ia la tuberculinţ ă (reac ia Mantoux). Se cerceteaz starea de hipersensibilitateţ ă (reac ia Mantoux). Se cerceteaz starea de hipersensibilitateţ ă cutanat la tuberculin . Tuberculina reprezint un filtrat dintr-o cultur bulionic autoclavat deă ă ă ă ă ăcutanat la tuberculin . Tuberculina reprezint un filtrat dintr-o cultur bulionic autoclavat deă ă ă ă ă ă M.tuberculosis. M.tuberculosis. Pe fa a anterioar a antebra ului se injecteaz i/dermic 2, 5 sau 10 UI de tuberculin în volumţ ă ţ ă ăPe fa a anterioar a antebra ului se injecteaz i/dermic 2, 5 sau 10 UI de tuberculin în volumţ ă ţ ă ă de 0,1 ml. Lectura peste 72 ore. Reac ia pozitiv se manifest printr-o indura ie şi congestie cuţ ă ă ţde 0,1 ml. Lectura peste 72 ore. Reac ia pozitiv se manifest printr-o indura ie şi congestie cuţ ă ă ţ diametrul superior sau egal cu 5 mm. Interpretarea se efectueaz în func ie de contextul clinică ţdiametrul superior sau egal cu 5 mm. Interpretarea se efectueaz în func ie de contextul clinică ţReac ia + indic c subiectul a fost infectat cu micobacterii (primoinfec ie), a fost vaccinat cuţ ă ă ţReac ia + indic c subiectul a fost infectat cu micobacterii (primoinfec ie), a fost vaccinat cuţ ă ă ţ BCG sau este bolnav de tuberculoz (în acest caz diametrul dep şeşte 10 mm).ă ăBCG sau este bolnav de tuberculoz (în acest caz diametrul dep şeşte 10 mm).ă ăReac ia negativ exclude diagnosticul de tuberculoz .ţ ă ăReac ia negativ exclude diagnosticul de tuberculoz .ţ ă ăTratamentul tuberculozeiTratamentul tuberculozeiAntibiotice cu spectru larg: rifampicin , streptomicin , kanamicină ă ăAntibiotice cu spectru larg: rifampicin , streptomicin , kanamicină ă ăFluorochinoloneFluorochinoloneChimioterapice care inhib sinteza acizilor micolici (Izoniazida, Pirazinamida, Etambutolul,ăChimioterapice care inhib sinteza acizilor micolici (Izoniazida, Pirazinamida, Etambutolul,ă Etionamida)Etionamida)Exigen ele terapiei antituberculoase: a împiedica selec ia mutan ilor rezisten i şi a sterilizaţ ţ ţ ţExigen ele terapiei antituberculoase: a împiedica selec ia mutan ilor rezisten i şi a sterilizaţ ţ ţ ţ definitiv focarul.definitiv focarul.În acest scop se utilizeaz asocierea a 3-4 droguri pe o perioad de 6-12 luni. ă ăÎn acest scop se utilizeaz asocierea a 3-4 droguri pe o perioad de 6-12 luni. ă ăProfilaxia specificăProfilaxia specificăVaccinarea obligatorie cu vaccinul BCG. El reprezint o tulpin vie avirulent de ă ă ăVaccinarea obligatorie cu vaccinul BCG. El reprezint o tulpin vie avirulent de ă ă ă M.bovisM.bovis. A fost. A fost ob inut de Calmette şi Guerin în 1921 dup multiple repic ri (230 pasaje) pe mediu cu cartof,ţ ă ă ăob inut de Calmette şi Guerin în 1921 dup multiple repic ri (230 pasaje) pe mediu cu cartof,ţ ă ă ă bil şi glicerin .ă ăbil şi glicerin .ă ăVaccinul se administreaz i/dermic la vârsta de ăVaccinul se administreaz i/dermic la vârsta de ă 4-54-5 zile de la naştere. zile de la naştere. Revaccinarea – la 7 ani, Revaccinarea – la 7 ani, apoi peste fiecare 5 ani (persoanele cu reactia Mantoux negativa).apoi peste fiecare 5 ani (persoanele cu reactia Mantoux negativa). Revaccinarea se efectuează Revaccinarea se efectuează la 7 ani persoanelor cu proba Mantoux negativ .ăla 7 ani persoanelor cu proba Mantoux negativ .ă

97.Sifilisul. Clasificarea agentului cauzal (familie, gen, sp.), factorii de patogenitate. Patogeneza si stadiile infectiei. Sifilisul congenital. Diagnosticul microbiologic al sifilisului. Prelevatele in dependenta de stadiile bolii. Metoda microscopica. Metoda serologica.

CLASIFICAREA SPIROCHETELORSpirochetele – bacterii helicoidale, flexibile şi mobile (fibrile interne), r spândite în natur ,ă ă unele comensale ale mucoaselor umane.

85

Familia: SpirochaetaceaeGenuri: Treponema, Borrelia, Spirochaeta, Cristispira

Familia: Leptospiraceae Genul: Leptospira

MICROBIOLOGIA ŞI DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL SIFILISULUIGenul TreponemaSpecii : T.pallidum (patogen )ăsubspecii (variante):

o T.pallidum pallidum (agentul sifilisului)o T.pallidum endemicum (agentul bejelului, sifilis endemic nevenerian – leziuni cutanate)o T. palidum pertenue (agentul pianului, maladie cutanat , nevenerian , zone tropicale şiă ă

subtropicale)o T. carateum (agentul pintei/carate, nevenerian , America Central şi de Sud) ă ă

Treponeme comensale:Orale (T.denticola, T.orale, etc)Genitale (T.phagedenis, T.refringens, etc)

CARACTERE MORFOLOGICE ŞI TINCTORIALET.pallidum – bacterie fin , helicoidal , cu 8-14 spire regulate şi capetele ascu ite, mobil cuă ă ţ ă mişc ri de flexie, înşurubare şi transla ie. ă ţ G -Eviden iereaţ :

1. preparate native (microscopul cu fond negru, contrast de faz ) ă2. nu se coloreaz dup Gramă ă3. Romanovsky-Giemsa – roz-pal4. impregna ie cu s ruri de argint (filamente negre-brune pe fondul galben)ţ ă5. frotiuri Burri – necolorate pe fondul negru

CARACTERE DE CULTURĂCultivarea T.pallidum in vitro – imposibilăPasaje succesive în testicule de iepure (tulpina Nichols de T.pallidum). Suspensii de astfel de treponeme supravie uiesc 72 ore în mediul Mayer-Nelson (la 25 grade în anaerobioz ).ţ ăSTRUCTURA ANTIGENICĂ

Haptene lipidice (antigen cardiolipidic / cardiolipin, Ag nespecific) – fosfolipid din MCP, prezent la treponeme patogene şi esuturi ale mamiferelor (extras din cord bovin)ţAntigen proteic (flagelar), de grup, comun treponemelor patogene şi nepatogene (ob inutţ din tulpina Reiter a T.phagedenis)Antigen lipoproteic din membrana extern , specifice ă T.pallidum (ob inute din tulpinaţ Nichols a T.pallidum)

FACTORI DE PATOGENITATE1. Factori de adeziune2. Factori de invazie (hialuronidaza)3. Factori de sensibilizare4. Endotoxina

Supresia r spunsului imun celular în stadiile ini iale ale boliiă ţ

PATOGENEZA SIFILISULUISursa de infec ieţ – omul bolnavC ile de transmitereă :

1. Sexual2. Contact indirect (s rut, obiecte, instrumente chirurgicale recent contaminate, transfuziiă

de sânge, etc.)3. Transplacentar (vertical)

Poarta de intrare – tegumentul lezat, mucoasa genital , ă anal , bucală ăPerioada de incuba ie – 2-6 s pt mâni (3)ţ ă ăEvolu ia sifilisuluiţSifilisul primar (4-6 s pt mâni)ă ă

La poarta de intrare apare şancrul sifilitic: ulcera ie cu baza indurat , nedureros, bogat înţ ă treponeme (99% localizare genital şi anal , 1% - bucal ).ă ă ă

Adenopatie satelit .ă

86

Vindecare spontan a şancrului ă este posibila (imunitatea local ).ăSifilisul secundar (urmare a disemin rii sangvine)ă – dup 6-8 s pt. de evolu ieă ă ţ

Manifest ri cutanate (rozeole, sifilide erozive,etc)ă , foarte contagioase Manifest ri ă la nivelul mucoaselor (pl ci mucoase)ă Poliadenopatie Leziuni ale organelor interne (hepatite, nefrite, periostite, meningite, etc) R spunsul imun poate duce la dispari ia leziunilor în 1-3 luniă ţ

Sifilisul latent (persoanele la care treponemele persist în ganglioni limfatici şi splin ) ă ă Lipsa semnelor clinice Necontagios Durata nedeterminata

Sifilisul ter iarţ (dup 4-30 ani de la contaminare)ă Afec iuni cardio-vasculare (aortite, anevrisme)ţ Afec iuni neurologice (tabes, paralizie general )ţ ă Afec iuni osoase şi cutanate (gome)ţ Deces posibil

Sifilisul congenital În timpul gravidit ii – moartea f tului prin afec iuni polivisceraleăţ ă ţ La finele gravidit ii sau la naştere – leziuni tardive (dentare, osoase, oculare)ăţ

Imunitatea (nesteril )ăo Umoral ăo Celular (protectoare, deprimat în sifilisul primar şi secundar) ă ă

DIAGNOSTICUL DE LABORATORPrelevate: serozitatea din leziunile primare sau secundare, punc ii din ganglioni limfatici, serulţ sangvin, LCRMetode de diagnostic

Examenul microscopic (sifilis primar, secundar)Microscopia pe fond negru, contrast fazăRIFImpregnare argentic , colora ia Giemsaă ţ

Examenul serologic (sifilis secundar, ter iar)ţI. Reac ii nespecificeţ (cu Ag cardiolipidice)Reac ia VDRL ţ (Veneral Disease Research Laboratory) – RP (RF)Ieftin , facil , specificitate redusă ă ăReac ii fals pozitive: viroze, colagenoze, paludism, ciroze, reumatism, graviditate, etc.ţRFC (Wassermann)

II. Reac ii specificeţ (cu Ag treponemice) RFC Wassermann sau KolmerRHAI (Ag – lizat din tulpina Nichols fixat pe hematii)RIFI (Ag – suspensie de T.pallidum fixat pe lam )ă ăRIT (testul Nelson) (Ag – tulpina Nichols a T.pallidum)RIE (ELISA)PCR (detectarea ADN) în LCR, lichidul amniotic, esutţ

EVOLU IA TITRURILOR DE ACŢRIFI se pozitiveaz la apari ia şancrului (o lun dup infectare)ă ţ ă ăVDRL – dup 6 s pt mâniă ă ăRHAIRIT – în stadiul secundar, 2 luni dup infectareă

Dup tratamentul sifilisuluiă :VDRL se negativeaz prima.ăAlte reac ii r mân pozitive.ţ ă

TERAPIA ŞI PROFILAXIA SIFILISULUIANTIBIOTERAPIA – beta-lactamine, tetracicline, macrolide (rezisten la aminoside)ţă

87

Reac ia Herxheimer este posibil (efectul endotoxinei)ţ ă .PROFILAXIA – depistarea sistematic activ şi tratarea bolnavilor.ă ă

98.Borrelioze le. Clasificarea agentilor cauzali ai febrei (tifosului) recurente epidemice si endemice (familie, gen, sp.). Factorii de patogenitate. Patogeneza febrei recurente, manifestarile clinice. Diagnosticul microbiologic al febrei recurente. Prelevate. Examenul microscopic. Metoda biologica.

CLASIFICARE:Familia SpirochaetaceaeGenul BorreliaSpecii: B.recurrentis (transmis prin p duchi)ă ăB.duttoni, B.hispanica, B.persica, B.burgdorferi, etc (transmise prin c puşe)ă

CARACTERE MORFOBIOLOGICEMorfologia: filamente spiralate cu 5-8 spire neregulate, flexibile şi mobile, cu mişc ri de flexie şiă înşurubare. G-, colorate în albastru-violet dup Giemsa.ăCaractere de cultur : bacterii anaerobe, cultiv ă ă in vitro pe medii complexe şi in vivo (ou embrionat, artropode, animale de laborator).Structura antigenic : variabilitate pronă un at !ţ ăHabitat:

• Omul bolnav – în sânge şi esuturi infectate ţ• Roz toareă• Vectori (p duchi, c puşe) – în hemolimf , saliv , intestină ă ă ă

FEBRA RECURENTĂFebra recurent epidemică ăAgentul cauzal - B.recurrentisSursa de infec ie – omul bolnavţVector - Pediculus humanusContaminare – prin hemolimfa eliberat la zdrobirea p duchiloră ăPoarta de intrare – tegumentul lezat, conjunctiva Febra recurent endemică ăAgen ii cauzali - ţ B.hispanica, B.persica, B.duttoni, etcSursa de infec ie – roz toarele s lbatice sau peridomesticeţ ă ăVectori–c puşe din genul ă OrnithodorosContaminare – prin în ep tur , prin intermediul lichidului coxal, prin dejec ii analeţ ă ă ţ

PATOGENEZA FEBREI RECURENTEPerioada de incuba ieţ – 3-14 zile (borreliile se multiplic în viscere – ficat, splin , creier, etc.)ă ăPerioada febrilă – debut brutal, cu febr 40-41 grade şi frison (endotoxina eliberat în sânge laă ă distrugerea borreliilor). Algii difuze, stare de tifos, semne meningeale, hepato-splenomegalie, icter. Criza febril dureaz 7 zile.ă ăUrmeaz o perioad ă ă afebrilă de o s pt mân , succedat de alt criz termic cu durat maiă ă ă ă ă ă ă ă scurt .ăAccesele se repet (2-4-10 recuren e).ă ţMecanismul recuren elorţBorreliile care p trund în organism prezint varia ii antigenice succesive. Sub ac iuneaă ă ţ ţ anticorpilor bactericizi forma i la sfârşitul acceselor febrile se selecteaz varianta antigenicţ ă ă responsabil de urm torul acces.ă ăFebra recurent endemic are o evolu ie mai benign , cu recuren e mai frecvente.ă ă ţ ă ţ

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL FEBREI RECURENTEPrelevate: sânge, LCRMetode de diagnostic:Examenul microscopic (în perioada febril ):ă

o preparate native (fond negru, contrast de faz )ăo frotiuri colorate Giemsa

88

o RIFExamenul biologic (infectarea cobailor, şobolanilor)

TRATAMENTUL ŞI PROFILAXIA FEBREI RECURENTETratament: peniciline, tetracicline, cloramfenicolProfilaxie: lupta contra vectorilor şi protec ia individual ţ ă

99.Borreliozele. Clasificarea agentului cauzal al bolii Lyme (familie, gen, sp.). Patogeneza bolii Lyme, manifestarile clinice. Diagnosticul microbiologic al bolii Lyme. Prelevate. Examenul microscopic. Izolarea si identificarea B.burgdorferi. Diagnosticul serologic.

BOALA LYMEAgentul cauzal – Borrelia burgdorferi (B.burgdorferi sensu stricto, B.afzelii, B.garinii)Caractere morfoculturale – bacterie helicoidal , mobil , efectueaz mişc ri de flexie şi rota ie.ă ă ă ă ţ Nu se coloreaz prin metoda Gram.ăSe cultiv lent (câteva s pt mâni) numai pe medii speciale.ă ă ăHABITAT ŞI CONTAMINARERezervor de infec ie: roz toare, animale domestice (câini, cai, etc), p s ri.ţ ă ă ăVectori: c puşe din genurile ă Ixodes şi Amblyomma, ân ari, t uniţ ţ ăContaminare: prin în ep tura vectorului infectatţ ăEVOLU IA BOLII LYMEŢIncuba ie – 2-4 s pt mâniţ ă ăFaza primară (leziune cutanat – ă eritemul cronic migrator, febr , cefalee, astenie). Durataă – 3-4 s pt.ăFaza secundară – durata 2-6 s pt mâni – manifest ri neurologice, cardiace, cutanate, osteo-ă ă ăarticulare.Faza ter iarţ ă – dureaz luni, ani – afec iuni cronice cutanate (acrodermatit cronică ţ ă ă atrofiant ), articulare (artrite cronice), neurologice (encefalomielite).ă

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL BOLII LYMEPrelevate: biopsii cutanate, sânge, LCR, lichid articularMetode de diagnostic:Examenul microscopic (preparate native, colora ia special a biopsiilor, impregnare argentic )ţ ă ăExamenul bacteriologicDiagnosticul serologic (RIFI, ELISA, Western-blot)PCRTratament – peniciline, tetraciclineProfilaxie – informarea popula iei, ţ extragerea c puşeloră

100. Leptospirozele. Clasificarea agentilor patogeni (familie, gen, sp., s/v). Factorii de patogenitate ai leptospirelor. Patogeneza infectiei. Diagnosticul microbiologic. Prelevate, examenul microscopic, izolarea si identificarea culturii pure. Metoda biologica, diagnosticul serologic ( RHAI, RFC, RAL). Profilaxia si tratamentul specific al leptospirozelor.

Leptospirele sunt bacterii care pot infecta numeroase specii de animale (în special vertebrate) şi accidental omul. ClasificareFamilia LeptospiraceaeGenul LeptospiraSpp. L.interrogans (patogen pentru om şi animale)ă

L.biflexa (saprofit , ape de suprafa )ă ţăL.parva (saprofit , apa de conduct ) ă ă

CARACTERE MORFOBIOLOGICECaractere morfologice – bacterii fine şi spiralate, cu 10-30 spire strânse şi regulate, cu capetele îndoite în cîrlig (aspect de S, C, ?).Realizeaz mişc ri de înşurubare, flexie şi transla ie.ă ă ţPot fi examinate la microscopul cu fond negru sau cu contrast de faz .ăColora ia Giemsa – roz-palţ

89

CARACTERE MORFOBIOLOGICECaractere de culturăMedii lichide cu s ruri anorganiceă tamponate cu fosfa i şi îmbog ite cu ser de iepureţ ăţ (mediile Korthof, Stuart, Wervort-Volf), medii semisinteticeAerobioză28-30 grade CLeptospirele se multiplic în 3-10 zile (pân la o lun ) ă ă ă f r a tulbura mediulă ă

Structura antigenic a ă L.interrogansAntigene cu specificitate de gen, LPZAntigene majore de grup (peste 20 serogrupuri)Ex.: L.icterohaemorrhagia, grippotyphosa, hebdomadis, canicola, pomona, autumnalis, etc.Antigene proteice minore de tip (peste 200 serotipuri/variante) - proteice

PATOGENEZA LEPTOSPIROZELORSursa de infec ie: roz toarele s lbatice, accidental-roz toarele peridomestice sau animaleleţ ă ă ă domestice (porci, câini, cai, bovine) – leptospirele sunt gazduite in tubii contor i proximali renali.ţPoarta de intrare: tegument şi mucoaseC ile de transmitere:ă

1. Alimentar (alimente şi apa contaminat )ă2. Contact direct cu animalele infectate 3. Contact indirect (cu apa contaminat )ă

Leptospirele sunt antrenate în circula ia sangvin f r leziuni la poarta de intrareţ ă ă ă .Incuba ia – 1-2 s pt mâni (10 zile)ţ ă ăEvolu ia leptospirozelor:ţ

Faza septicemic (generalizat ) – 7 zileă ăfebr , frison, sindrom meningealăFaza afebril (1-3 ză ile)Faza organic (febr , sindrom meningeal, sindrom hepato-renal, sindrom cardio-vascular-ă ăhemoragic, icter)

Imunitatea: umoral , specific de tip, durabil ă ă ă

DIAGNOSTICUL DE LABORATORPrelevate: sânge, LCR (prima s pt mân ), urin (din s pt mâna II de boal ), probe necropticeă ă ă ă ă ă ă (sec iuni histologice renale, hepatice)ţMetode de diagnosticExamenul microscopic (fond negru, contrast de faz , colora ia Giemsa sau impregna iaă ţ ţ argentic a sec iunilor histologice), RIFă ţExamenul bacteriologicProbele sunt îns mân ate în câte 3-5 tuburi cu mediu de cultur , incubate în aerobioz la 28ă ţ ă ă grade pân la 1-3 luni.ăIdentificarea în baza caracterelor:

Microscopice De cultură De patogenitate Serologice (RFC, RAL)

Examenul biologic (inocularea intraperitoneal a cobailor). Peste 1-3 zile leptospirele pot fiă depistate în exsudatul din cavitatea abdominal .ăTehnici PCR (detectarea ADN)Diagnocticul serologic (din s pt. II)ă

Reac ii cu specificitate de gen (RFC, RHAI, RIFI, ELISA) ţReac ii cu specificitate de tip (de referin )-RAL (Reac ia de ţ ţă ţ Aglutinare-Liz )ăTitrul diagnostic - 1/400 sau creşterea în dinamic de 4 oriă

TRATAMENT ŞI PROFILAXIETratament: penicilin , tetraciclin , gama-globulina antileptospiroas ă ă ă

90

Profilaxie: deratizarea, igiena şi protec ia muncii, supravegherea bazinelor de ap , vaccinareaţ ă selectiv (vaccin inactivat, durata imunit ii-1 an) ă ăţ

101. Escherichiozele. C lasificarea E.coli dupa structura antigenica. Habitatul, rolul in fiziologia omului. Factorii de patogenitate. Fenotipurile diareigene, bacteriemice, uropatogene. Infectiile intestinale cauzate de categoriile fenotipurilor diareigene. Infectiile extraintestinale cauzate de E.coli. Diagnosticul microbiologic al colienteritelor la copii. Prelevate. Izolarea, acumularea, identificarea culturii pure (biochimica, serologica), diagnosticul serologic.

FAMILIA ENTEROBACTERIACEAEPeste 30 genuri cu 130 speciiHabitat: intestinul omului, animalelor Martor al contamin rii fecale a mediuluiăMajoritatea constituie flora normal (comensal ) intestinală ă ă

CLASIFICAREA ÎN FUNC IE DE PATOGENITATE:ŢEnterobacterii patogene: genurile Shigella, Salmonella, Yersinia, unele variante ale speciei Escherichia coli;Enterobacterii condi ionat patogeneţ : genurile Citrobacter, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Morganella, Proteus, Providencia, Serratia, Edwardsiella, etc.

TESTE-CHEIE ALE FAMILIEI 1. Bacterii (bastonaşe) gramnegative2. Nesporogene3. Mobile-peritriche/imobile4. Facultativ-anaerobe5. Fermenteaz glucoza (A, AG)ă6. Catalaza-pozitive7. Oxidaza-negative8. Reduc nitra ii în nitri iţ ţ

TESTE PRIMARE (identificarea genurilor)1. Utilizarea citratului de Na (mediul Simmons)2. Utilizarea malonatului de Na3. Hidroliza ureei (testul Preus)4. Decarboxilarea lizinei (LDC)5. Dezaminarea fenilalaninei (FAD)6. Producere de H2S în mediul multitest (ex.: Kligler)7. Fermentarea glucozei pân la acizi (testul MR)ă8. Fermentarea glucozei pân la acetoin (testul VP)ă ă9. Mobilitatea (în geloz semilichidă ă)

TESTE SECUNDARE (identificarea speciilor/variantelor)1. Teste biochimice (fermentarea glucidelor, decarboxilarea aminoacizilor (arginin ,ă

ornitină), producerea indolului, etc)2. Fagoidentificarea şi lizotipia3. Colicinogenotipia4. Seroidentificarea 5. Antibiograma

CARACTERE MORFOBIOLOGICECaractere morfologice: bastonaşe G-, 1 - 6 µm x 0,3 - 1 µm, mobile peritriche (Klebsiella, Yersinia pestis, Shigella – imobile), nesporogene, formeaz microcapsule (ă Klebsiella – capsulat ), posed fimbrii.ă ăCaractere de cultură:

Anaerobe facultativ Temperatura optim 37 grade ă C (limite – 18 – 45 grade) Nepreten ioase nutritivţ

91

Colonii S, apar dup 18-24 h de incubare, 2 - 3 mmă (dup repic ri pot apare colonii R),ă ă Klebsiella – mucoide, Proteus – invadeaz suprafa a mediului ă ţ

MEDII DE CULTURĂDe transport: glicerin 30%, solu ie salin 3%, solu ie tampon-fosfată ţ ă ţDe îmbog ireăţ a bacteriilor patogene: Kauffmann, Muller, bulion selenit, etcDiferen ial-diagnosticeţ :

I. De izolare ENDO, LEVIN, PLOSKIREVComponen a: baz nutritiv , lactoz , indicatorţ ă ă ăColoniile L+ : colorate Coloniile L- : incolore (frecvent flora patogen )ăMediul Wilson-Blair cu sulfit de Bi (Salmonella reduce sulfitul în sulfur de Bi – colonii negre peă mediul verde)

II. De acumulare şi identificare preliminară (medii multitest)Russel, Kligler (glucoz , lactoz , s ruri de Fe)ă ă ăOlkeni ki (glucoz , lactoz , zaharoz , uree, s ruri de Fe)ţ ă ă ă ă

III. De identificare final ă (medii cu citrat, malonat, şirul Hiss, medii cu aminoacizi, gelatina, etc)

CARACTERE ANTIGENICEAg O (R), de perete, LPZ, termostabil şi rezistent la alcool, sensibil la formol, specificitate de gen, specie, grupAg H, flagelar, proteic, termolabil şi inactivat de alcool, rezistent la formol, specificitate de tip (variant ) ăAg K, superficial, capsular, termovariabil, specificitate de specie, tip (mascheaz Ag Oă , inaglutinabilitate cu seruri anti-O). Variante – L, A, B la E.coli, Vi – la Salmonella şi CitrobacterAg F, fimbrial, termolabil, nespecific ECA – antigen comun fam. Enterobacteriaceae (interes taxonomic) – Ag Kunin

GENUL ESCHERICHIAGenul Escherichia Spp.: E.coli, E.blattae, E.fergusonii, E.vulneris, E.hermaniiHabitat: intestinul omului şi animalelor (80% din flora aerob intestinal ), 10ă ă 7-109 bacterii/gram fecale.Contamineaz solul şi apele de suprafa . Prezen a ă ţă ţ E.coli - indicator de contaminare fecal .ăRolul E.coli în fiziologia umană1. Manifest activitate antagonist fa de alte bacterii, inclusiv cele patogene.ă ă ţă2. Stimuleaz dezvoltarea esutului limfoid prin intermediul Ag saleă ţ3. Particip la procesele de digestie, inclusiv în metabolismul colesterolului şi acizilor biliariă4. Asigur organismul cu vitamine, sintetizând vitamine B, K, acid nicotinic, acid folic, etc.ă

CARACTERE MORFOBIOLOGICEE.coli – enterobacterie tipic , mobil , lactoza+, fermenteaz glucidele cu formare de AG (testeă ă ă primare: MR +, mobilitate +, celelalte sunt negative)Structura antigenică

Ag O – 180 tipuri (O1, O2, O3......O180)Ag H – 60 tipuri (H1, H2, etc)Ag K – 100 tipuri

Din combina ii rezult serovariante: ex. O55:H2:K1ţ ăFactori de patogenitate1. Capsula (antifagocitar, Ag K1 – camuflaj imunologic datorit epitopilor comuni cu polisialozilă -

glicopeptide cerebrale la nou-n scu i)ă ţ2. Proteine din ME şi LPZ (anti-complement, protec ie de factorii bactericizi ai sângelui,ţ

adeziune, invazie)3. Fimbrii (adeziune)4. Toxine (endotoxina, enterotoxine termostabile - ST şi termolabile - LT, citotoxine – “Shiga-

like” toxine (SLT-1, SLT-2)5. Hemolizina 6. Siderofori (sisteme de captare a Fe)

ROLUL E. COLI ÎN PATOLOGIA UMANĂ92

FENOTIPURI DIAREIGENETulpini enteropatogene: EPEC (O26, O55, O111, O125, O142, etc). Responsabile de gastro-enterite infantile (infec ii salmoneliforme). Ader la mucoasa intţ ă estinului sub ire printr-oţ protein din membrana extern f r a penetra intracelular. ă ă ă ăTulpini enteroinvazive: EIEC (O28, O124, O143, etc). Responsabile de sindrom dizenteric cu invazia mucoasei colonului, penetrare intracelular , ulcera ii. Factori de patogenitate: adezine,ă ţ citotoxine.Tulpini enterotoxigene: ETEC (O6, O8, O20, O25, O115, etc). Responsabile de “diareea c l torului”, sindrom holeriformă ă . Adeziunea la enterocitele intestinului sub ire este asigurat deţ ă pili (CFA “colonization factor antigen” sau CS “coli surface factors”). Elaboreaz toxine –ă enterotoxine ST şi/sau LT. Activeaz adenilat- respectiv guanilat ciclaza enterocitelor,ă provocând o secre ie sporit a ionilor de Clţ ă - şi inhibi ia absorb iei ionilor de Naţ ţ +, antrenând o pierdere hidric important .ă ăTulpini enterohemoragice: EHEC (O157:H7; O26, O111). Responsabile de colite hemoragice cu sindrom uremic-hemolitic (anemie hemolitic +trombocitopenie+insuficien renal ). Posedă ţă ă ă factori de adeziune şi produc citotoxine capabile de difuzie în organism (“Shiga-like” toxine – SLT 1 şi SLT 2). Produc frecvent hemolizin . ăTulpini enteroagregative: EAggEC (O111:H12). Posed adezine, hemolizine şi SLT. Provoacă ă diaree persistent (peste 14 zile) la copii. Ader agregativ la suprafa a culturilor de celule.ă ă ţTulpini enteroadezive: EAEC. Ader difuz la celulele intestinale şi culturile de celule.ă Provoac sindroame diareice. ă

FENOTIPURI UROPATOGENE (O1, O2,O4,O6). Posed afinitate pentru mucoasa uro-ăgenital (fimbrii tipul P sau 1, Ag O şi K specifice, hemolizine, etc).ă

FENOTIPURI BACTERIEMICE Alte forme clinice provocate de E.coli:

Şoc endotoxinicMeningite la nou-n scu i (preponderent tulpini cu Ag K1)ă ţInfec ii ale pl gilor (frecvent de origine nozocomial )ţ ă ăColecistite, peritonite, salpingite, etc.Toxiinfec ii alimentareţ

DIAGNOSTIC DE LABORATORPrelevate în func ie de forma clinic : materii fecale, urin , sânge, LCR, puroi, etcţ ă ăMetode de diagnostic

Examenul microscopic de orientare (frotiu Gram în infec ii extraţ -intestinale, RIF)Examenul bacteriologic (de baz , cantitativ)ăExamenul serologic (retrospectiv, de confirmare)RA cu autotulpini (titru diagnostic – 1:200)

Tratamentul escherichiozelorAntibiotice (conform antibiogramei)Eubiotice (colibacterin , lactobacterin , bifidumbacterin , bificol, etc)ă ă ă

Profilaxia escherichiozelor - nespecifică

102. D izenteria. Clasificarea agentilor patogeni (familie, gen, spp.). Factorii de patogenitate ai shigelelor. Patogeneza dizenteriei, simptomele clinice. Diagnosticul microbiologic. Prelevatele. Microscopia (RIF), izolarea, acumularea, identificarea culturii pure (biochimica, serologica), serodiagnosticul. Profilaxia si tratamentul specific al dizenteriei.

GENUL SHIGELLA. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL DIZENTERIEIShigelele – strict umane. Cauzeaz infec ii intestinale - şigeloze, cea mai grav form –dizenteriaă ţ ă ă bacterian .ăClasificarea genului Shigella (biochimic şi antigenic):

A – Shigella dysenteriae (12 s/v, 12 b/v) Manitol -B – Shigella flexneri (6 s/v, 14 ss/v, 23 b/v)C – Shigella boydii (18 s/v)D – Shigella sonnei (1 s/v, 7 b/v)

Subgrupele B, C, D – manitol +

93

CARACTERE MORFOBIOLOGICE Enterobacteriaceea tipice, imobile, lactozo-negative, scindeaz glucoza pana la acizi (testulă MR+), celelalte teste primare sunt negative.Factori de patogenitate:

1. Factori de adeziune la mucoasa colonului (fimbrii, LPZ)2. Microcapsula (antifagocitar)3. Factori de penetrare şi multiplicare intracelulară4. Toxine:

Shigatoxina - neurotoxic , enterotoxic , citotoxic – elaborat de ă ă ă ă S.dysenteriae 1 Enterotoxine (Shiga-like toxine (SLT), verotoxine) Endotoxina

Structura antigenică: Ag O şi K cu specificitate de gen, specie, subspecie, variant ăRezisten a în mediul externţ :

S.dysenteriae - foarte sensibil (1-2 ore)ăS.flexneri – persist 1-3 s pt mâni în ap , 2 luni în lactateă ă ă ăS.sonnei – persist şi se multiplic în lactateă ă

PATOGENEZA DIZENTERIEI BACTERIENESursa de infec ieţ : bolnav, reconvalescent, purt torăTransmiterea fecal-oral : ăContact direct (mâini murdare)Alimentar (alimente, ap )ăDoza infectant : 10-10ă 2 bacteriiBacteriile se multiplic în intestin, colonizeaz epiteliul colonului şi macrofagele din foliculiiă ă limfoizi, penetreaz intă racelular (prin macropinocitoz dirijat ). Bacteriile se propag intraă ă ă - şi entercelular gra ie polimeriz rii actinei la un pol al celulţ ă ei (caracter determinat plasmidic). Urmeaz multiplicarea local intracelular cu invazia celulelor vecine provocând moartea lor.ă ă ă Aceasta duce la inflama ie fibrinoas intens a colonului, micro-abcese şi ulcera ii, cu apari iaţ ă ă ţ ţ mucusului, puroiului şi sângelui în materiile fecale.Perioada de incuba ieţ – 2 - 4 zileSemne clinice – febr , dureri abdominale, tenesme (spasme rectale), scaune lichide muco-ăsanguinolente frecvente. Vindecarea în 2-5 zile (clinic , apoi microbiologic ).ă ăForme cronice sau portaj sunt posibile.

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL DIZENTERIEIPrelevate: probe de scaun (elementele muco-sanguinolente), apa, alimente, lavaje de pe suprafe eţMetode de diagnostic

1. Examenul microscopic – RIF2. Examenul bacteriologic :

Izolarea culturii pure pe medii DD (Endo, Levin, Ploskirev) sau Îmbog irea şighelelor înăţ bulion selenit

Coloniile L- sunt repicate pe mediile Olkeni ki, Kligler pentru ţ acumularea culturii pure şi identificare preliminară(lactoza/zaharoza -, glucoza A, ureea -, H2S -)

Identificarea definitiv a culturii pureă o Caractere morfotinctorialeo Caractere de cultur ăo Caractere biochimice (teste primare, secundare)o Caractere antigenice (seroidentificarea prin RA pe lam cu seruri imune anti-ă Shigella poli-

şi monovalente)o Fagoidentificareao Virulen a (testul Sereny la cobai)ţo Antibiograma

Analiza rezultatelor şi formularea r spunsului ă3. Diagnosticul serologic (din a 5-7 zi de boal )ă

94

RA, RHAI (adul i 1:400 (ţ S.flexneri); 1:200 (S.sonnei); copii 1:100; coproanticorpi (Ig A – 1:80) ELISARIFI

Imunitate: specific de tip, 1-2 ani, umoral (IgA)ă ăProfilaxie: vaccinuri ribosomale, inactivate, atenuate (imunitate de scurt durat ) ă ăTratament: antibiotice (trimetoprim, sulfamide, tetraciclin , ampicilina, etc), eubiotice,ă bacteriofagi, vaccin inactivat (dizenteria cronic )ă

103. Salmonelozele. Clasificarea salmonelelor (familie, gen, specii, subspecii). Clasificarea Kauffmann-White dupa structura antigenica. Samonelele tifoparatifoidice. Dinamica titrului de anticorpi in febrele tifoparatifoidice, la purtatori sanatosi si ai anticorpilor anamnestici. Diagnosticul serologic. Reactia de aglutinare Widal. Tehnica efectuarii, citirea si interpretarea rezultatelor. Aplicarea practica a reactiilor RHAI, Vi-RHAI.

CLASIFICARE Genul: Salmonella (Daniel Elmer Salmon, veterinar american, care a descoperit bacteria în 1885)Specii: Salmonella enterica, Salmonella bongoriSubspecii ale speciei S.enterica: enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae, indicaSe cunosc peste 2500 Serovariante, majoritatea tulpinilor izolate din patologii umane (99,5%) aparţin ss. S.enterica enterica: S. London, S. Enteritidis, S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Paratyphi B, S.Choleraesuis, etc Salmonella enterica subspecia enterica serovar Typhi = Salmonella Typhi

CLASIFICAREA KAUFFMANN-WHITE (conform structurii antigenice)Ag O – 67 variet i antigenice (O1, O2, O3, ... O65, etc), permite repartizarea salmonelelor inăţ serogrupe (A, B, C, D, E,...Z, O51,...)Frac ii antigenice majore desemneaz grupa: O2 – A; O4 – B, O6 – C, O9 – D, etcţ ăFrac ii antigenice minore – comune O1, O12ţ ,…Ag H –defineşte serovariante în cadrul grupei. Structura flagelinei este determinat de 2 geneă cromozomiale diferite, care se exprim alternativ (varia ie de faz , frecven a 10ă ţ ă ţ -4).

Ag H faza 1 (specific ) – Haă ; Hb; Hc; Hd; Hg,m… Ag H faza 2 (nespecific ) – H1,2; H1,5; H1,7ă ;…

Serovar monofazic: O1,2,12:Ha (S.Paratyphi A)Serovar difazic: O1,4,12:HbH1,2 (S.Paratyphi B)Ag Vi (K), termolabil, prezent la S.Typhi, S.Paratyphi C, S.Dublin. Este concentrat la polii bacteriei.S. Typhi – O9,12:HdVi+ / O9,12:HdVi-

Conform patogenit ii pentru gazd se disting:ăţ ă• Salmonele monopatogene (umane) (S.Typhi, S.Paratyphi A)• Salmonele bipatogene (patogene pentru om şi animale, ubicvitare) – majoritatea

104. Salmonelozele. Salmonelele tifoparatifoide, clasificarea (familie, gen, specie, subspecii), structura antigenica, factorii de patogenitate. Patogeneza febrelor tifoparatifoide. Prelevatele si metodele de diagnostic in dependenta de perioada de boala. Izolarea, acumularea, identificarea hemoculturii si coproculturii (biochimica, serologica, fagoidentificarea). Profilaxia si tratamentul specific.

Caractere de cultur ă• Medii de îmbog ire : Muller, Kauffmann (medii cu bilăţ ă, tetrationat), bulion cu selenit de

Na• Medii DD de izolare a culturii pure: Endo, Levin , Ploskirev (colonii S, lactozo-); mediul cu

sulfit de bismut Wilson-Blair (colonii negre) • Medii DD de acumulare şi diferen iereţ : Olkeni ki, Kligler (glucoza AG, lactoza-, Hţ 2S+,

ureaza-)

95

Teste primare: utilizeaz citratul de Na, produc Hă 2S, MR+, LDC+, mobilitate+, celelalte teste – negative.Teste secundare: scindeaz glucidele AG, indol-, ornitindecarboxilaza+, etcăEXCEP IE: S.Typhi – citrat-, HŢ 2S-, scindeaz glucoza pân la acid; S.Paratyphi A – Hă ă 2S+/-, LDC-

FACTORI DE PATOGENITATE1. Fimbrii (adeziune)2. Capacitatea de a penetra în celule şi de multiplicare intracelular (Macrofage, celuleă

epitel)3. Endotoxina 4. Citotoxine (SLT) – inhib sinteza proteic (necroz )ă ă ă5. Enterotoxine (LT, ST) – activeaz adenilat/guanilatciclazele membranare (diaree)ă6. Siderofori (captarea Fe)7. Ag Vi (antifagocitar, inhib activarea C, rezisten la activitatea bactericid a serului)ă ţă ă

Majoritatea salmonelelor (98%) sunt sensibile la bacteriofagul O1. Exist bacteriofagi cuă specificitate de specie şi variant .ăHabitat: intestinul omului, animalelor, p s rilor. ă ăRezisten a în mediul externţ : salmonelele rezist la 70ă °C 30 min., rezistente la concentra iiţ mari de sare. Se înmul esc în produse alimentare la temperatura camerei.ţ

ROLUL SALMONELELOR ÎN PATOLOGIA UMANĂSALMONELOZE:

Febre tifo-paratifoide (S.Typhi, S.Paratyphi A, B, C) Salmoneloze digestive (toxi-infec ii alimentare, gastro-enterite)ţ Manifest ri extra-digestive:ă

bacteriemii nontifoidice infec ii pleuro-pulmonareţ afec iuni osteo-articulare (osteite, osteomielite, artrite septice, etc)ţ infec ii cardio-vasculareţ (pericardite, arterite) infec ii urinareţ infec ii abdominale (colecistite, abces al ficatului, splineiţ ) infec ii ale SNC (meningite, abces al creierului, abces epidural, etc) ţ

FEBRELE TIFO-PARATIFOIDEAgen ii cauzali – S.ţ Typhi, S.Paratyphi A, B, (C)Sursa de infec ie – omul bolnav, purt torul ţ ăContaminarea fecal-oral (ap , alimente)ă ă , contact directDoza infectant – 10ă 5 bacteriiPATOGENEZA

a. Traversarea epiteliului intestinal intact b. Invazia şi multiplicarea intracelular la nivelul pl cilor Peyer şi esutului limfoid al tubuluiă ă ţ

digestiv (perioada de incuba ie)ţc. P trunderea în ganglionii limfatici mezenterici cu multiplicarea salmonelelor (perioadaă

prodromal )ăI s pt mân de boal (bacteriemie)ă ă ă ă . Invadarea fluxului sangvin, via sistemul limfatic (diseminarea germenilor cu eliberarea endotoxinei). Endotoxina pe cale sangvin parvine la centrii neurovegetativi ai ventriculului 3,ă determinând febr , stare de tifos, colaps cardio-vascular, leziuni intestinale.ăII s pt mân de boal (difuzie parenchimatoas )ă ă ă ă ăBacteriile sunt fixate în organele SRE şi se multiplic în ficat, splin , m duv osoas , esută ă ă ă ă ţ limfoid, etc III-IV s pt mân de boal (faza alergic ). ă ă ă ă ăDin ficat salmonelele p trund în c ile biliare, apoi iar şi în intestin. La nivelul pl cilor Pă ă ă ă eyer se dezvolt o reac ie de hipersensibilitate tip 4 - necroz , ă ţ ă ulcera ii. ţ Din aceast perioad începeă ă eliminarea salmonelelor cu saliva, materiile fecale, urina, bila, etc.

Manifest ri cliniceă

96

Perioada de incuba ieţ - 1-3 s pt mâniă ăPerioada prodromală (de invazie) – 1-3 zilePerioada de stare. Debut brutal, cu frison, febr 39-4ă 1 grade, cefalee, stupoare, somnolen ,ţă delir, com . Erup ii cutanate (rozeole) apar pe abdomen, torace, spate în ziua a 8-9 de boală ţ ă (embolii limfatice cu bacterii). Diaree, constipa ie, tulbur ri cardiovasculare. Durata 7-10 zileţ ă Complica iiţ : hemoragii intestinale, perforarea intestinului, peritonit , miocardit , meningit ,ă ă ă psihoz etc. ăPerioada de reconvalescenţă (1-3-6 luni)

Imunitatea – celular , umorală ă5-10% convalescen i – purt tori pân la 3 luni (ţ ă ă cu depistarea salmonelelor în bil sau/şiă urin )ă3-5% convalescen i (ţ cu litiaz biliar ) – purt tori cronici– ă ă ă (1-10 ani – toat via aă ţ )

Recidive sunt posibile (desc rc ri bacteriemice din focare profunde, forme L), seă ă caracterizeaz prin simptome atenuate şi evolu ie de scurt durată ţ ă ă

DIAGNOSTICUL DE LABORATORPRELEVATE: sânge (perioada febril , în special I s pt mân de boal ), urin (începând cu a IIă ă ă ă ă ă s pt mân ), materii fecale (II-III s pt mân de boal ), exudat din rozeole, ser sangvin (din ziuaă ă ă ă ă ă ă a 7-ea), bil , m duv osoas ă ă ă ăMETODE DE DIAGNOSTICExamenul microscopic – RIFIdentificarea finală în baza studiului caracterelor morfotinctoriale, de cultur , biochimice,ă antigenice (RA pe lam cu seruri imune polivalente ABCDE, seruri monovalente anti-O de grupă (O2, O4, O6, O9, etc) , seruri monospecifice anti-H (de variant ), ă seruri anti-Vi, sensibilitatea la bacteriofagi). Rezultatul definitiv negativ – în ziua a 11.

Rozeolocultura (exudatul din rozeole se întroduce în 3-5 ml bulion biliat). Mielocultura (0,5 ml m duva osoas din stern în 3-5 ml bulion biliată ă ). Bilicultura (dup 3-6 luni de la vindecare, 5-10 ml bil se întroduc în BPă ă ).

Se examineaz ca şi hemocultura.ă Coprocultura (din s pt. 2) – 3-5 g materii fecale se îns mân eaz direct pe medii DD şi peă ă ţ ă

medii de îmbog ire.ăţ Urocultura (10 ml urin se centrifugheaz , sedimentul se examineaz ulterior ca şiă ă ă

coprocultura).Serodiagnostic (din II s pt mân )ă ă ăRA Widal (la dilu ii ale serului bolnavului se adaog diagnosticuri OH din S.Typhi, ParatyphiA şiţ ă B). Titrul diagnostic 1/200 sau creşterea în dinamic a titrului ăRA modificarea Felix (utilizarea separat a diagnosticurilor O şi H). ăAnticorpii anti-O (Ig M) apar primii (începând cu ziua 7-8) şi dispar dup 2-3 luni (maximumă s pt. II-III).ăAnticorpii anti-H (Ig M, apoi Ig G) apar mai târziu (10-12 zi) şi persist o durat mai lung . Înă ă ă debut de reconvalescen (s pt mâna a IV) titrul Ac anti-O şi anti-H se egaleaz .ţă ă ă ăRHAI (cu diagnosticuri eritrocitare O).

INVESTIGAREA PURT TORILORĂ Coproculturi repetate Urocultura Bilicultura Serodiagnostic Reac ia de Vi-aglutinare (eritrocite sensibilizate cu Ag Vi). Titrul diagnostic - 1/40ţ Reac ia de ţ latex-aglutinare Determinarea claselor de imunoglobuline Ig M sau Ig G

Tratament: FluorochinoloneCefalosporine de genera ia IIIţ

97

CloramfenicolAmpicilin ăCotrimoxazol

Profilaxia specific : vaccinarea selectiv (zone endemice, militari, personal medical, etc)ă ăVaccinul chimic TABTe Vaccinul atenuat Ty2 (administrare oral , imunitate local sIg A), contraindicat gravidelor,ă ă copiilor, imunodeprima ilor ţvaccinul subunitar din Ag Vi (areactogen, imunitate 3-5 ani)

105. Sa lmonelozele. Salmonelele nontifoidice (bipatogene). Clasificarea (familie, gen, specii, subspecii). Structura antigenica, clasificarea Kauffmann-White. Serovariante mai frecvent izolate. Factorii de patogenitate. Patogeneza salmonelozelor, formele clinice. Diagnosticul microbiologic. Prelevate, izolarea, acumularea, identificarea culturii pure (biochimica, serologica). Diagnosticul serologic.

SALMONELOZE DIGESTIVE (gastro-enterite, toxi-infec ii alimentare)ţConsecutive consumului de alimente contaminate cu salmonele (ou , maionez , patiserie cuă ă crem , carne, etc).ăAgen ii cauzali: salmonele bipatogene ţ

Gr. B (S. Typhimurium, S. Paratyphi B, S. Heidelberg, S. Derbi)Gr. C (S. Choleraesuis, S. Newport, S. Paratyphi C)Gr. D (S. Enteritidis, S. Dublin)Gr. E (S. Anatum)

PATOGENEZA GASTROENTERITELOR Sursa de infec ieţ : animalele domestice şi p s rile (bolnave sau purt tori cronici)ă ă ăTransmiterea pe cale alimentar (alimente contaminate direct de la surs sau pe parcursulă ă procesului tehnologic), prin ap sau contact direct.ăDoza infectantă – 106-108 salmoneleSalmonelele colonizeaz mucoasa intestinului sub ire, fiind entero-invazive provoacă ţ ă distrugerea epiteliului (SLT) şi o reac ie inflamatoare intens (gastroenterit , gastroenterocolitţ ă ă ă acut ). ă Enterotoxina provoac diaree (activeaz adenilatciclaza sau guanilatciclazaă ă enterocitelor), endotoxina absorbit ac ioneaz asupra SNC – semne de intoxica ie. ă ţ ă ţGastroenteritele pot fi urmate de bacteriemii.Manifest ri clinice: ă

Perioada de incuba ie – 8 - 48 oreţDebut brusc şi evolu ie acut (1-3 zile) cu diaree, vom , febr , cefalee, stare de r u.ţ ă ă ă ăEvolu ie sever – la sugari, b trâni, imunodeprima i (în special ţ ă ă ţ cu SIDA).

TOXIINFEC II ALIMENTAREŢSurvin ca urmare a ingestiei unui aliment în care s-au acumulat cantit i mari de mi/o (10ăţ 5 – 107). Nimerind în intestin, bacteriile p trund în sânge, se distrug, iar endotoxina eliberată ă provoac semnele clinice de intoxicare.ăAlte forme de salmoneloze (septicemii, meningite, infec ii urinare, etc) se dezvolt laţ ă persoane cu rezisten a sc zut .ţ ă ă

Diagnosticul de laborator al salmonelozelorPrelevate: mase fecale, mase vomitive, sânge, sp l turi gastrice, urin , resturi de alimenteă ă ă suspecte.Metode de diagnostic:

Examenul bacteriologic – de baz (coprocultur , hemocultur , urocultur ...)ă ă ă ăRIF – pentru diagnostic rapidSerodiagnostic - RHAI

Profilaxia salmonelozelor – nespecificăTratamentul– simptomatic, antibioterapie la necesitate

106. Holera. Clasificarea vibrionilor (familie, gen, sp.). Criteriile de clasificare a V.cholerae în serogrupe, biovariante, serovariante. Factorii de patogenitate ai V.cholerae. Patogeneza holerei. Diagnosticul microbiologic. Prelevate.

98

Principiile metodelor rapide, citirea, interpretarea rezultatelor. Importanta metodei serologice de diagnostic a holerei.

Familia: VibrionaceaeGenuri: Vibrio Aeromonas (inf de plag , diaree, septicemii)ă Plesiomonas (gastroenterite, septicemii, meningite) Photobacterium (saprofit) Enhydrobacter (saprofit)Caractere generale (cheie): bastonaşe G-, drepte sau încurbate, mobile (mono sau lophotrichi), reduc nitra ii în nitri i, fermenteaz glucidele, oxidazţ ţ ă a+, catalaza+

GENUL VIBRIOBastonaşe G-, încurbate, nesporogene, necapsulate, mobile monotricheClasificarea:- Vibrioni halotoleranti - Vibrio cholerae (agen ii holerei şi diareelor ţ holeriforme)- Vibrioni halofili – V.parahaemolyticus, V.alginolyticus, V.anguillarum, V.vulnificus, V.metschnikovii (oportunisti, cauzeaz toxiinfec ii alimentare, septicemii, meningite, supura ii)ă ţ ţ- Vibrioni free life (saprofi i)ţ

VIBRIO CHOLERAEClasificare :Serogrupuri:Vibrio cholerae O1, O2, ... O155- V.cholerae O1 şi V.cholerae O139 Bengal (descris in 1992, mutant al Ag O, biovarul El Tor)– agen ii cauzali ai holereiţBiovariante ale V.cholerae O1 :

V.cholerae cholerae (clasic) – descoperit in 1817 de catre R. Koch, 6 pandemii V.cholerae El Tor – izolat in 1905 in Lazaret din El Tor, in 1961 determina pandemia a VII

Serovariante ale V.cholerae O1 - Ogawa, Inaba, HikojimaV.cholerae non O1/non O139 (O2, O3,... etc, vibrioni NAG) – responsabili de sindrom holeriform, diaree, toxiinfec ii alimentare ţ

HOLERAAgen ii cauzaliţ : V.cholerae O1 (b/v Clasic şi El Tor; s/v Ogawa, Inaba, Hikojima), V.cholerae O139 BengalCaractere de culturăAnaerobi facultativi, temperatura optim de cultivare -- 37 grade. Cresc pe medii simple, dară prefer pH alcalin (8-9) şi concentra ii de 3% NaCl. Sensibili la pH acid ă ţMediu de îmbog ireăţ – Apa peptonat alcalin 1% (AP)ă ăMedii de izolare a culturii pure – Geloza alcalin (mediu electiv-selectiv)ă - GAMediul TCBS (tiosulfat-citrat-bil -ă zaharoz ) – DD şi selectivăManifestarea creşteriiAP – peste 6 ore de incubare – v l fin la suprafa a mediului ă ţGA – peste 12 ore – colonii S (R atipice), transparente, cu nuan alb struieţă ăTCBS – peste 12 ore – colonii S, opace, galbene (fermentarea zaharozei)Caractere biochimice: V.cholerae este catalaza+ şi oxidaza+, reduce nitra ii în nitri i, produceţ ţ indol, posed gelatinaz şi LCD, fermenteaz glucoza pân la acid.ă ă ă ăConform activit ii glicolitice ăţ V.cholerae apar ine grupului ţ I Heiberg (fermenteaz zaharoza şiă manoza, nu fermenteaz arabinoza)ăSe disting 2 biotipuri (variante) de V.cholerae: clasic (V.cholerae cholerae) şi El Tor (V.cholerae El Tor), identice morfologic şi antigenic.

Diferen ierea biovariantelorţSTRUCTURA ANTIGENIC A Ă VIBRIO CHOLERAE

• Ag O somatic, LPZ, termostabil (peste 155 serogrupe - O1, O2....O155…) Ag O1 este constituit din 3 frac ii - A,B,C ţ 3 serovariante V.cholerae: Ogawa (A,B), Inaba (A, C), Hikojima (A; B; C)

• Ag H, proteic, termolabil, comun pentru V.cholerae

99

FACTORI DE PATOGENITATE Factori de adeziune (pili, Ag O1, glicocalixul) Enzime de patogenitate (mucinaza, neuraminidaza, LDC, lecitinaza) Enterotoxina (toxina holeric , holeragen), constituit dină ă tr-o subunitate A (A1, A2) şi 5 subunit i B.ăţ Mecanismul de ac iuneţ : Subunit ile B servesc la fixarea de receptorul gangliozidic GM1 deăţ pe membrana enterocitului, A2 asigur p trunderea intracelular a fragmentului A1. Acestaă ă ă activeaz adenilatciclaza membranar , ce duce la creşterea concentra iei de AMPc intracelulară ă ţ cu inhibitia absorbtiei bicarbonatului şi secre ia exagerat a cloridului. Apa şi electroli ii (Naţ ă ţ + şi K+) se acumuleaz în lumenul intestinal. Rezult deshidratare extracelular intens cuă ă ă ă hemoconcentra ie, şoc hipovolemic şi acidoz metabolic .ţ ă ă

PATOGENEZA HOLEREI ŞI MANIFEST RILE CLINICEĂHOLERA – toxiinfec ie intestinal acut , strict uman .ţ ă ă ăAgentul cauzal – V.cholerae O1/O139Sursa de infec ie – bolnav, convalescent, purt tor s n tosţ ă ă ă (crustacee acvatice?)Mecanismul de transmitere:

1. fecal-oral2. contact direct (manual)3. alimentar (apa, alimente)

Doza infectant – 10ă 9 UFC (104 pentru persoane cu hipoaciditate gastric )ăVibrionii care au supravie uit nimeresc în intestinul sub ire. Local mucinaza descompuneţ ţ mucusul, ce permite adeziunea la enterocit şi multiplicarea vibrionilor (colonizarea) cu secre iaţ toxinei.

Evolu ia clinic a holerei:ţ ăI - perioada de incuba ieţ (2-5 zile)II – enterita holeric (scaune frecvente, abundente, apoase, aspect “zeam de orez”)ă ăIII – gastro-enterita (scaune frecvente – 20 ori pe zi – vome abundente. Consecin eţ – deshidratare, caren e de s ruri, acidoz , hipoxie tisular , hipotensiune, contrac ii (crampe)ţ ă ă ă ţ musculare.IV - Algida holerică (stare extrem de grav , hipotermie, asfixie, colaps, com , deces)ă ă

Imunitatea – umoral (să IgA, IgG), antibacterian şi antitoxic , de scurt durat (2 ani), reinfec iiă ă ă ă ţ sunt posibile

107. Holera. Criteriile de clasificare a V.cholerae (serogrupe, biovariante, serovariante), factorii de patogenitate. Diagnosticul microbiologic. Prelevatele, recoltarea, conservarea. Metoda microscopica. Metoda bacteriologica: îmboga irea, izolarea, acumularea, identificarea culturii pure (teste biochimice,ţ biologice, serologice). Etapele, durata examenului bacteriologic. Profilaxia specifica a holerei.

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HOLEREIPrelevate: mase vomitive, materii fecale, bil (purt tori)ă ă , de la cadavru – 3 fragmente din intestinul sub ire şi vezica biliarţ ă, prelevate din mediul extern (apa, alimente)Metode de diagnostic1. Diagnosticul rapid- Studierea mobilit ii (preparate native – bacterii mobile, încurbate, grupate în “bancuri deăţ peşti” sau “pesc ruşi în zbor”ă- Frotiu Gram (bacterii G-, încurbate)- Imobilizarea vibrionilor cu serul anti-O1- Imobilizarea vibrionilor cu bacteriofagi “C” şi “ET”- RIF2. Examenul bacteriologic (de baz )ăPrelevatele se îns mân eaz în AP I (îmbog ire) şi GA I (TCBS) (izolarea culturii pure) –ă ţ ă ăţ termostat

100

Peste 6 ore se examineaz cultura din AP (v l la suprafa ), utilizat pentru diagnosticul rapid,ă ă ţă ă apoi se reîns mân eaz pe AP II şi GA II.ă ţ ăPeste 12 ore se examineaz coloniile de pe GA ă I sau TCBS. Coloniile suspecte (plate şi transparente cu nuan alb strie pe GA, galbene pe TCBS) sunt expuse diagnosticului rapid (5ţă ă teste), apoi repicate pe mediul cu lactoz şi zaharoz pentru acumularea culturii pure şiă ă diferen iere primar . ţ ă AP II poate fi utilizată pentru efectuarea testelor rapide si însămânţare pe GA III.Culturile lactoza-/zaharoza+ sunt identificate morfologic, cultural, biochimic, serologic (cu ser O1 polivalent, apoi cu seruri monospecifice Ogawa şi Inaba), diferen ierea biovariantelor.ţ3. Depistarea toxinei In vivo (ansa ligaturata la iepure, culturi de celule)In vitro (ELISA, cu utilizarea gangliozidului GM1) Tehnici de biologie moleculara (PCR, etc)4. Serodiagnostic (retrospectiv)Anticorpii (aglutinine, vibriocine) apar dup 10-15 zile de boal .ă ă- RA (serul bolnavului + diagnostic din V.cholerae O1 (titrul diagnostic 1/80)- RHAI (serul bolnavului + diagnostic eritrocitar)- Dozarea antitoxinelor (ELISA, RHAI)- Reac ia de vibrioliz (serul bolnavului + cultur de vibrioni + complement)ţ ă ă . - Titrul diagnostic – 10-4

TRATAMENTUL ŞI PROFILAXIA HOLEREITratament - Antibiotice (tetraciclin , sulfanilamideă , doxiciclina)- Rehidratare- Tratament simptomatic Profilaxie - Igiena individual şi colectivă ă- Vaccinarea (vaccin inactivat, vaccin subunitar, holeragen-anatoxin ) ăImunitatea –pân la 6 luniăVaccinul viu este in proces de studiu.

VIBRIONII HALOFILIV. parahaemolyticus – toxiinfec ii alimentare, consecutive utiliz rii fructelor de mareţ ă , gastro-enteriteV. vulnificus, V. alginolyticus – procese supurative (otite, conjunctivite, infec ii de plag , etc)ţ ă

CAMPYLOBACTERCARACTERE MORFOBIOLOGICEReprezentantii genului Campylobacter sunt bastonase Gram -, incurbate in virgula, in S sau “pescarus in zbor”, mobili monotrichi. Trei specii de Campylobacter sunt patogene pentru om : C. fetus, C. jejuni, C.coli .Campylobacter au metabolism respirator microaerofil. Pot fi izolate pe medii selective imbogatite cu singe continand numeroase antibiotice (bacitracin[, novobiocina, vancomicina, polimixina, etc)Temperatura optima – 37 grade C. Colonii S, plate, cenusii, translucide, 1-2 mm diametru, apar peste 2-4 zile de cultivare.HABITATCampylobacter se intalnesc in tubul digestiv al animalelor, in special pasari, ovine, porci. Contaminarea omului are loc pe cale digestiva (apa, lapte, carne).PATOGENIE SI FORME CLINICEC. jejuni/coli au o putere enteropatogena importanta, fiind responsabile de enterite. Afecteaza toate varstele, dar mai frecvent copiii, in conditii de igiena precara. Maladia evolueaza benign cu vindecare spontana in cateva zile.C. fetus determina septicemii la persoane fragilizate: cirotici, diabetici, cardiaci, gravide...SENSIBILITATE LA ABErithromycina este antibioticul de electie in tratamentul campilobacteriozelor digestive.Alte antibiotice: tetraccclina, aminoside, cloramfenicol, ampicilina

101

108. Ricke ttsiozele. Tifosul exantematic. Agentii cauzali (familie, gen, sp.). Patogeneza infectiei. Diagnosticul microbiologic. Prelevate. Metodele microscopica, biologica. Diagnosticul serologic si diferentierea tifosului exantematic epidemic, endemic, bolii Brill-Zinsser. Profilaxia specifica.

CARACTERISTICA GENERAL A RICKETTSIILORĂRickettsiile = bacterii intracelulare obligatorii. Ciclul lor de dezvoltare necesit o gazdă ă vertebrat (om, câine, şobolan) şi un vector (p duche, purice, c puş , acarian).ă ă ă ăReprezint mi/o ă G- de dimensiuni mici, comparabile cu virusurile mari (500 nm). Totuşi, reprezint bacterii, deoarece se multiplic prin diviziune binar , posed ADN şi ARN, suntă ă ă ă sensibile la antibiotice.

CLASIFICAREFamilia RickettsiaceaeGenuri: Rickettsia (care include 2 grupuri)Grupul tifos, constituit din R.prowazekii (responsabil de tifosul exantematic epidemic, vectoră p duchele) şi ă R. typhi (responsabil de tifosul exantematic endemic, murin, vector puricele)ăGrupul febrelor p tateă , transmise prin c puşe (ă R.rickettsii, R.conorii, R.australis, R.akari, R.sibirica, etc)Genul Orientia, cu unica specie O.tsutsugamushi, agentul febrei de l st rişă ăGenul Coxiella, unica specie C.burnetii, responsabil de febra QăN.B. Genurile Ehrlichia şi Bartonella nu mai apar in familiei Rickettsiaceae.ţ

RICKETTSIACaractere morfotinctoriale: bacterii G-, polimorfe (coco-bacterii, bastonaşe, forme filamentoase, etc), imobile, asporogene, posed microcapsul . Prin tehnica de colorare Macchiavello-Gimeneză ă (fucsin +verde de malahit) rickettsiile apar colorate în roşu pe fondul verde palid al citoplasmei.ă Colora ia Giemsa – roşii în citoplasma albastr .ţ ăCaractere de cultură: fiind parazi i intracelulari (nu pot fosforila glucoza şi folosesc metaboli iţ ţ intermediari din gazd ), rickettsiile nu cresc pe medii artificiale. Ele pot fi cultivate doar peă animale de laborator, vectori, ou embrionat de g in sau culturi de celule.ă ăRickettsiile se multiplic prin diviziune binar în interiorul celulei-gazd . Imediat dup diviziune,ă ă ă ă în condi ii nutritive bune, rickettsiile sunt antrenate în mişc ri rapide şi parcurg citoplasmaţ ă celulei-gazd în toate direc iile. Aceste deplas ri sunt determinate de polimerizarea filamenteloră ţ ă de actin . Atunci când mediul este s rac diviziunea se opreşte, bacteriile se alungesc, cuă ă apari ia formelor filamentoase. ţ

Strategii de multiplicare intracelular :ăReprezentan ii genului ţ Rickettsia vie uiesc liber în citoplasm , gra ie capacit ii de a p r siţ ă ţ ăţ ă ă rapid vacuola de fagocitoz . ă Coxiella burnetii se multiplica în fagolizosomi cu pH acid.Structura antigenic a rickettsiiloră :

• Ag corpuscular cu specificitate de specie• Ag solubil cu specificitate de grup

Frac ii Ag comune cu tulpina Proteus OXţo OX 19 pentru grupul tifos exantematico OX 2 şi OX 19 pentru grupul febrelor p tateăo OX K pentru grupul tifos de l st rişă ă

Factori de patogenitate: Exotoxina Hialuronidaza Hemolizina

TIFOSUL EXANTEMATIC1909 – Ch. Nicolle la institutul Pasteur din Tunis descrie transmiterea tifosului epidemic prin intermediul p duchelui (premiul Nobel)ă .1910 – Brill descoper tifosul de rec dere, descris dup 20 de ani de Zinsser, de undeă ă ă denumirea maladiei Brill-Zinsser.

102

1916 – Rocha-Lima descoper bacterii fine în corpul unui p duche de la un bolnav de tifos.ă ă Aceste mi/o au fost denumite Rickettsia prowazekii (în cinstea lui Von Prowazek şi Ricketts, care au murit de tifos studiind maladia).1928 – Mooser separ tifosul murin de tifosul epidemic.ăAgen ii cauzali ai tifosului exantematic:ţ

R.prowazekii – provoac tifosul exantematic epidemic.ă R.typhi – provoac tifosul endemic, murin.ă

Patogeneza tifosului exantematic epidemic:Sursa de infec ieţ – omul bolnav de tifos exantematic sau de boala Brill-ZinsserVectorul – p duchele umanăP duchele se infecteaz de la bolnav în ultimele 2 zile de incuba ie, pe parcursul perioadeiă ă ţ febrile şi 2-3 zile dup normalizarea temperaturi. Rickettsiile se multiplic în celulele epitelialeă ă intestinale ale p duchelui fiind eliminate cu dejectele. Astfel, omul se contamineaz nu prină ă în ep tura p duchelui, ci prin leziunile cutanate sau mucoase în care au nimerit dejecteleţ ă ă insectei. Infectarea este posibil şi prin inhalarea prafului în care se con in rickettsii uscate sauă ţ la nimerirea acestui praf pe conjunctiva ochiului. În SUA – de la veveri e zbur toare prinţ ă intermediul ectoparazi ilor acestora. ţDup inoculare rickettsiile trec în sânge, penetreaz în celulele endoteliale ale vaselor sangvineă ă mici, se înmul esc şi le distrug. Rickettsiile secret factori procoagulan i care determinţ ă ţ ă tromboz cu inflama ie periadventi ial a vaselor mici (nodulii Popov-Frankel). Leziunile suntă ţ ţ ă mai numeroase în tegument, SNC, miocard.Perioada de incuba ie – 6-23 zile (10-12 zile)ţDebutul este brusc, cu febr 40-41 grade C, cefalee, insomnie, sl biciuni, excita ie,ă ă ţ hiperactivitate nervoas şi psihic . ă ăSe observ hiperemia fe ei şi faringelui, sclerele sunt injectate. ă ţÎn ziua a 4-6 a maladiei apare o erup ie cutanat rozeolo-peteşial (pe trunchi, apoi peţ ă ă membre), înso it de splenomegalie.ţ ăFebra dispare peste 2 s pt mâni. Convalescen a este lung şi astenia durabil . Dup vindecareă ă ţ ă ă ă nu r mân sechele. ă

Imunitatea anti-rickettsian este mediat celular, anticorpii neutralizeaz efectul toxic ală ă ă rickettsiilor. Îns imunitatea nu elimin obligatoriu toate rickettsiile prezente în organismul convalescentului.ă ă Aceste bacterii latente se manifest la persoane în vârst în absen a pediculozei, atunci cândă ă ţ imunitatea scade (boala Brill-Zinsser, tifosul de rec dere, tifosul f r p duche). Procesulă ă ă ă infec ios poate fi reactivat sub influen a unor maladii intercurente, a stresului, etc.ţ ţÎn timpul maladiei B-Z rickettsiemia este de 10 ori mai rar decât în forma epidemic aă ă tifosului exantematic şi dureaz cel mult 5-8 zile. Evolu ia este benign , erup ia este maiă ţ ă ţ abundent , roz , intoxica ia este redus . La b trâni pot surveni complica ii vasculare. ă ă ţ ă ă ţ

Tifosul exantematic endemic: agentul cauzal este R.typhi, sursa de infec ie – şobolanul, iarţ vectorul – puricele. Clinica se aseam n cu cea a tifosului epidemic, dar gravitatea este redus -ă ă ă simptome mai pu in severe, erup ia mai s rac . ţ ţ ă ă

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL TIFOSULUI EXANTEMATIC Diagnosticul direct (examenul microscopic, bacteriologic) se efectueaz în laboratoareă specializate.Prelevate: sânge, bioptate din esuturile infectate, vectoriţExamenul microscopic: se examineaz celulele endoteliale circulante în sânge sau frotiuri-ăamprente din esutul infectat. Frotiurile se coloreaz Giemsa sau Macchiavello. Rickettsiile aparţ ă roşii pe fondul albastru (respectiv verde) al citoplasmei celulei-gazd . Poate fi montat RIF.ă ăExamenul bacteriologic: prelevatele sunt inoculate la cobai sau şoarece, în cavitatea vitelină a oului embrionat de g in sau pe culturi celulare. Tulpina izolat astfel va fi identificat prină ă ă ă RIF, RFC, RAR.Examenul serologic: este bazat pe depistarea Ac din serul bolnavului cu ajutorul Ag din Proteus OX şi Ag rickettsiene (de grup sau de specie).Reac ii nespecificeţ : Reac ia de aglutinare Weil-Felix, foloseşte ca Ag suspensii de Proteus OXţ 19. Se pozitiveaz la sfârşitul primei s pt mâni de boal . Titrul aglutininelor atinge valoareaă ă ă ă

103

maxim la începutul convalescen ei şi scade la valori nesemnificative peste câteva luni după ţ ă boal . Valoare diagnostic are creşterea titrurilor de cel pu in 4 ori pe parcursul bolii. ă ă ţReac ii cu antigene rickettsiene (specifice):ţ

1. RFC, cu Ag rickettsian total. Devine pozitiv la finele primei s pt mâni de boal , maxim înă ă ă ă s pt mâna 3 sau 4 şi persist mai mul i ani dup vindecare. Sunt semnificative titruriă ă ă ţ ă peste 1:16, cu creşterea de cel pu in 4 ori în evolu ia bolii.ţ ţ

2. RAR (reac ia de aglutinare a rickettsiilor). Este foarte sensibil şi specific , cu utilizareaţ ă ă Ag corpusculare purificate. Curba aglutininelor evolueaz paralel cu cea a Ac fixatori deă complement. Titrul diagnostic - 1:160 şi mai mult.

3. RHAI. Hemaglutininele pot fi detectate din ziua a 4 de boal în titruri 1:20 – 1:40 careă cresc în s pt mâna a 2 atingând cifrele 1:160-1:ă ă 320. Titrul diagnostic este de 1:160. Peste 3 luni de la debutul bolii titrul acestor Ac scade pân la valori nesemnificative.ă

4. RIFI5. RN a toxinei rickettsiene. Se efectueaz pe şoricei. In calitate de toxin se utilizeaz oă ă ă

suspensie de rickettsii vii, care va fi neutralizat cu ser imun în diferite dilu ii.ă ţIdentificarea ADNului rickettsian prin PCR

Diferen ierea dintre tifosul exantematic şi boala Brill-ZinsserţPentru boala Brill-Zinsser este caracteristic:

1. Tifos exantematic în anamneză2. Absen a pediculozeiţ3. Evolu ie benignţ ă4. Reac ia Weil-Felix negativţ ă5. Titrul Ac în RFC nu creşte în dinamică6. Ac din clasa Ig G

Diferen ierea tifosului exantematic epidemic de cel endemicţ Evolu ie benign în tifos endemicţ ă Dup titrul Ac în reac iile cu Ag specificeă ţ Inocularea intraperitoneal la cobai masculi: ă R.prowazekii provoac febr , iar ă ă R.typhi –

inflama ie scrotalţ ă

Tratamentul tifosului exantematicAntibiotice care penetreaz intracelular: ăTetracicline (doxiciclina, minociclina)CloramfenicolRifampicina, eritromicina, ciprofloxacina

Profilaxia tifosului exantematicM suri antiparazitare: desp duchere, deratizare, respectarea igieneiă ăProfilaxia specifică: exist ă vaccinuri inactivate (corpusculare şi subunitare) preparate din cultur rickettsian izolat în oul embrionat, în p duchi sau în pl mânii şoriceilor albi. Acesteă ă ă ă ă vaccinuri confer imunitate de scurt durat .ă ă ăVaccinul viu, preparat din tulpina E de R.prowazekii este mai imunogen, dar are propriet iăţ alergizante.

Genul Coxiella reuneşte bacterii intracelulare G- (coco-bacterii), care se disting de reprezentan ii genului Rickettsia prin rezisten a la agen i fizici (formeaz spori) şi prin structuraţ ţ ţ ă lor antigenic diferit . Se caracterizeaz prin varia ie antigenic (de faz ). Faza I este virulent ,ă ă ă ţ ă ă ă faza II este atenuat .ăSpecia-tip este C.burnetii, cu reparti ie mondial . Provoac ţ ă ă febra Q (Query fever). Rezervorul de germeni şi sursa de infec ie îl constituie animalele (roz toare, ovine, caprine,ţ ă bovine). C ile de transmitere la omă :

Aerogen (pic turi, praf)ă Alimentar (lapte contaminat) Prin vectori-artropode – foarte rar

Profesiile expuse riscului: agricultori, veterinari, muncitori la abatoare, m celariă

104

Dup o incuba ie de 2-3 s pt mâni boala debuteaz brutal cu febr ini ial în platou, apoiă ţ ă ă ă ă ţ ondulant , cefalee, transpira ii, astenie, semne de bronho-pneumonie, pneumopatie atipică ţ ă şi/sau hepatit . ăComplica ii – endocardita subacut sau cronic cu hemoculturi negative.ţ ă ă

Diagnosticul de laborator al febrei QIzolarea bacteriilor din bioptate (ficat, tegument, valve) sau din sânge. Se efectueaz inoculareaă cobailor, a oului embrionat de g in sau a culturilor de celule. Tulpina izolat se identific în RIFă ă ă ăDepistarea rapid a ă C.burnetti în prelevate prin RIFDetectarea genomului cu ajutorul PCRDiagnosticul serologic:

1. RFC cu Ag de faza I şi II (existen a Ac anti-faza I este utill în diagnosticulţ ă endocarditelor);

2. RIFI (permite separarea IgG, IgM şi IgA); creşterea titrului Ac IgA este specific în endocardite;

3. ELISA.

109. Caracterele morfobiologice ale virusurilor gripale (clasificarea in serogrupuri si serotipuri, morfologia, structura virionului, structura antigenica, variabilitatea genetica). Patogeneza gripei. Diagnosticul de laborator al gripei. Prelevatele, metodele de diagnostic (virusoscopica, virusologica, serologica). Profilaxia si terapia specifica a gripei.

FAMILIILE ORTHO- ŞI PARAMYXOVIRIDAE Mixovirusurile reunesc virusuri ARN- cu afinitate pentru mucoproteine (myxo – mucus) repartizate în 2 familii:

• Orthomyxoviridae• Paramyxoviridae

FAMILIA Orthomyxoviridae Paramyxoviridae

DIMENSIUNE 100 nm 200 nm

NUCLEOCAPSIDASimetrieDiametru

Helicoidală8 nm

Helicoidală16 nm

GENOMUL ARN-, transcriptaz asociat , 8ă ă segmente

ARN-, transcriptaz asociat ,ă ă nesegmentat

SUPERCAPSIDASpiculi H şi NSpiculi F

Separa iţabsen iţ

Asocia iţprezen iţ

REPLICAREA GENOMULUI

În nucleu În citoplasmă

FAMILIA ORTHOMYXOVIRIDAEGenuri: Influenzavirus A (virusul gripal A)

Influenzavirus B (virusul gripal B)Influenzavirus C (virusul gripal C)Thogotovirus (virusurile Dhori şi Thogoto)

Agen ii cauzali ai gripei – infec ie respiratorie acut cu simptome sistemice importante. ţ ţ ăTipul A provoac pandemii periodice (1918 – 20 mln decesuri, 1957, 1968, 1977)ăTipurile A şi B – epidemii regionale şi locale. Anual – 3-5 mln cazuri grave, 300 – 500 mii decesuri1933 – prima cultur de virus gripal uman (Smith, Andrewes şi Laidlaw).ă

MORFOLOGIA, COMPOZI IA CHIMIC A VIRUSUŢ Ă LUI GRIPAL tipul AParticule rotunde, 80-120 nm, sau filamentoase, constituite din:

1. Genom = 8 segmente de ARN105

2. Capsida (NC) – tubulară, de simetrie helicoidal , separat pentru fiecare segmentă ă3. Supercapsida:

Dublu strat lipidic extern (origine celular )ă Strat intern proteic (matrice, prot. virale M1, M2) – asigur leg tura dintre GP deă ă

suprafa şi NC; M2-canal ionicţă 2 tipuri de GP înserate în membran : ă hemaglutinina - HA (H) şi neuraminidaza -NA

(N), distincte morfologic şi biologic (virusul gripal C – doar HA)Hemaglutinina (HA, H) H1 – H16Trimer compus din 2 polipeptide HA1 şi HA2HA1 – fixarea specific a virionilor la receptori ă glicopeptidici membranari (inclusiv de pe hematii), ce con in acid N-acetilneuraminicţ /acid sialicHA2 – fuziunea supercapsidei cu membrana celulei-gazdăAnticorpii anti-HA:

Inhib fixarea virusului de celula- intă ţ ă Inhib hemaglutinarea ă

Neuraminidaza (NA) N1 – N9Tetramer, polipeptid unicFunc ii : ţ

Cliveaz leg tura dintre acidul sialic şi glucidul al turat (tratarea celulelor cuă ă ă neuraminidaz impiedic infec ia celulei cu virus)ă ă ţ

Asigur detaşarea virionilor înmuguri i prin eliminarea acidului neuraminică ţ /sialic din receptorii celulari

Anticorpii anti-NA limiteaz diseminarea virioniloră

STRUCTURA ANTIGENICĂAg interne NP şi M, specifice de tip A,B,CAg externe HA şi NA, specifice de subtip şi de variantă16 variante de HA (H1-H16) şi 9 de NA (N1-N9), asocia iile lor formeaz subtipuri de virus A.ţ ăLa om – N1, N2 şi H1, H2, H3 (H1N1; H2N2; H3N2)VARIA II ANTIGENICE ALE HA ŞI NAŢVaria ii Ag minoreţ – drift (muta ii punctiforme, modific câ iva AA din HA sau/şi NAţ ă ţ cu aparitia unor varietăţi de serotipuri, caracteristic pentru tipurile A şi B) – provoac epidemiiă fiecare 3-4 ani.Varia ii Ag majoreţ – shift (recombina ii genetice, schimbarea complet a unuiţ ă sau câtorva segmente genomice –HA, NA, P, M, etc. Determina mutaţii importante, aparitia serotipurilor noi) - provoac pandemii.ă

Cultivarea virusului gripal 1. Ou embrionat de g in (cavitatea amniotic şi alantoic )ă ă ă ă2. Culturi de celule (fibroblaşti de pui, culturi primare de rinichi de maimu , etc)ţă3. Reproducerea infec iei la maimu e, dihori ţ ţ

MULTIPLICAREA VIRUSULUIATAŞAREA (adsorb ia) – HA1+acid neuraminicţPENETRAREA – endocitozăDECAPSIDAREA – fuziunea supercapsidei şi membranei vacuolei de endocitoz , NC penetrează ă în nucleu prin porii membranei nucleareBIOSINTEZA (eclipsa)

Transcrierea ARNm (transcriptaze P1, P2, P3) Transla ia ARNm şi sinteza proteinelor virale (Ct)ţ Replicarea genomului (ARNv....ARNc....ARNv)

ASAMBLAREA• În citoplasmă: HA şi NA se inser în MCt, iar M1 şi M2 o c ptuşesc din interioră ă• În nucleu: NP se asociaz cu ARN-, formând NC, apoi migreaz spre zonele modificate aleă ă

MCt (via AG)ELIBERAREA – înmugurireNA ajut la desprinderea virionilor de MCt şi evit formarea agregatelor. Celula r mâne aparentă ă ă viabil , dar epuizat şi moare. Citoliza este determinat de r spunsul imun citotoxic (NK, LTC). ă ă ă ă

106

PATOGENEZA GRIPEIVirusul gripal A se întâlneşte la om şi animale: porc, cal, p s riă ă , foci, balene, etc.Virusul gripal B – om (foci)Virusul gripal C – om (câine, porc)Sursa de infec ieţ – omul bolnav (animale? Cazuri sporadice de grip aviar la om (H7N1, H9N2,ă ă H5N1) – 2003/04 în Vietnam, 1997 – Hong Kong).

Virusul este prezent în rinofaringe în primele 2 zile de la debutul boliiMecanismul de transmitere – aerogen, prin pic turi Flugge (tuse, str nut).ă ăVirusul se propag în c ile respiratorii superioare şi inferioare, inducând o inflama ie a mucoaseiă ă ţ şi edem al laringelui, traheii şi bronhilor. Celulele epiteliale ciliate sunt distruse (f r a afectaă ă celulele bazale). Procesul regenerativ începe cu ziua a 5 şi repararea complet a epiteliului areă loc în 1 lun . ăContingent de risc - persoane în vârst , copii, imunodeprima i, bolnavi cu maladii croniceă ţ cardiovasculare, respiratorii, insuficien renal , diabet.ţă ă

Forme cliniceo Gripa inaparentă, asimptomaticăo Gripa comună (benign , durata 4-7 zile). Incuba ia câteva oreă ţ - 2 zile. Debut brutal, cu

frison, febr , cefalee, rinoree, tuse, mialgii, artralgii, anorexie, astenie (IFN?). Complica iiă ţ (infec ii secundare bacteriene): otite, sinusite, bronşite, bronhopneumonii, etc.ţ Complica ii rare: sindromul Reye (encefalit acut cu degenerescen a ficatului);ţ ă ă ţ sindromul Guillain-Barre (poliradiculonevrit ).ă

o Gripa malignă (pneumonie viral primitiv cu edem pulmonar şi IRA)ă ă

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL GRIPEIPrelevate: lavaje/aspira ii nazale, traheale, expectora ii bronşice (în primele 48 ore)ţ ţExamenul virusoscopic –microscopia electronica, RIFExamenul virusologic

1. Izolarea în oul embrionat de g in de 10-11 zile sau culturi de celule (MDCK).ă ă 2. Indicarea virusului – activitate hemaglutinant fa de eritrocite de cobaiă ţă , g in , curcan aă ă

lichidului amniotic şi alantoic, hemadsorb ia lor pe cultura de celule.ţ 3. Identificarea – RIF, RIHA, RIHAds, RN

Detectarea Ag virale în sedimentul celular (RIF, ELISA) Detectarea genomului viral Serodiagnosticul gripei Retrospectiv, de confirmare. Se examineaz seruri perechi. Se determin creşterea titrului deă ă Ac de 4 ori, sau prezen a Ac Ig M.ţReac ii: ţ

RFC cu Ag NP (determinarea tipului)RIHA cu suşa viral circulantă ăELISARN

Imunitatea: celular (LTC, NK), umoral (Ig G, Ig A), specific de ă ă ă subtip.

TRATAMENTUL GRIPEI• Amantadin , rimantadin .ă ă Împiedic p trunderea NC în citoplasma celulei infectate cuă ă

virus A. Posibilitate rezistenta tulpini. • Zanamivir, oseltamivir. Au structura similar acidului neuraminic. Inhib activitatea NA,ă ă

împiedicând eliberarea virusurilor A şi B şi diseminarea lor prin mucus, determină agregarea virionilor.

• Interferon, unguent oxolinic.Tratament simptomatic (antipiretice, antibiotice, etc)

PROFILAXIA SPECIFIC A GRIPEIĂ1. Vaccinuri inactivate: con in 2 tulpini de virus A (H1N1 şi H3N2) şi o tulpin B, cultivate ţ ă in

ovo şi inactivate cu beta-propiolacton. Inoculare i/m, s/c; Ig G persist 5-6 luni.ă2. Vaccinuri vii atenuate: tulpinile sunt cultivate in ovo la 25 C, atenuate prin pasaje

multiple. Administrare intranazal prin aerozol, imunitate local (Ig A).ă ă

107

3. Vaccinuri subunitare: constituite din HA şi NA4. În curs de cercetare – vaccinuri vii/subunitare recombinante, vaccinuri polinucleotidice.

Situa ia cuţ rent a infec iei prin virusul gripal nou A(H1N1)ă ţLa 18 octombrie OMS raporteaz ă 414 945 de cazuri confirmate de grip de tip nou A(H1N1) şiă 4999 de decese.Evenimentele derulate prin apari ia brusc , r spândirea rapid şi transmiterea de la om la om aţ ă ă ă gripei noi A(H1N1), au impus OMS s ridice faza pandemic la ă ă nivelul 6.S-a stabilit c virusul gripal nou A(H1N1) con ine gene ale virusului gripal de origine porcină ţ ă (tulpini americane şi euro-asiatice), gene de origine aviar şi uman . Oamenii de ştiin l-au maiă ă ţă numit „reasortant cvadruplu”. Sub aspect antigenic virusul gripal de tip nou A(H1N1) mult diferă de acel gripal sezonier uman A(H1N1), de aceea vaccinurile antigripale umane sezoniere nu pot acorda protec ie contra gripei de tip nou A(H1N1). ţEpidemiologieVirusul nou A(H1N1) se transmite de la om la om prin aceleaşi mecanisme ca şi virusurile gripale sezoniere. Ele în mod obişnuit se transmit de la om la om prin tuse şi str nut de laă persoanele bolnave cu grip . Uneori oamenii se pot îmboln vi indirect prin atingereaă ă suprafe elor, obiectelor infectate cu virusuri gripale şi ulterior atingând mucoasele oculare,ţ bucale şi nazale. Oamenii pot fi contagioşi cu o zi înaintea apari iei simptomelor gripale şi 7 zile de la debutulţ maladiei. Copiii, în special cei mici, pot fi contagioşi mai multe zile.Particularit ile tabloului clinicăţGripa cu virusul nou A(H1N1), spre deosibire de cea sezonier , se manifest clinic preponderentă ă la persoane tinere, anterior s n toase. Manifest rile clinice sunt asem n toare cu cele din gripaă ă ă ă ă sezonier . Pacien ii prezint semne clinice caracteristice, ce includ cel pu in dou dină ţ ă ţ ă urm toarele simptome: febr , tuse, dureri în faringe, mialgii generale, cefalee (mai desă ă frontal ), frisoane, posibil diaree şi vom . Frecven a atest rii sindromului dispeptic (11-38%)ă ă ţ ă este mai mare decât în gripa sezonier . Durata bolii în majoritatea cazurilor este de 4-6 zile, cuă o maxim de 13 zile. Este posibil dezvoltarea pneumoniilor, care pot evolua cu sfârşit letal.ă ăPe lâng semnele gripale clasice, frecvent înregistrate, se num r şi angina. Totodat , maiă ă ă ă mul i pacien i, care n-au necesitat spitalizare, n-au avut febr . În cazurile soldate cu decesţ ţ ă tabloul clinic s-a prezentat prin febr , sl biciune pronun at , tahicardie, tahipnee, sc dereaă ă ţ ă ă nivelului de satura ie pulmonar cu oxigen, hipotensiune şi cianoz tegumentar .ţ ă ă ă În Mexic evolu ia clinic s-a remarcat prin pneumonii severe, cu multiple infiltrate şi mai rar - cuţ ă opacit i bazilare la examinarea radiografic , dup care a urmat sindromul deăţ ă ă stresei respiratorii acute (SDRA), înso it de insuficien renal . Miocardita acut a fost suspectat la câ iva bolnavi.ţ ţă ă ă ă ţ Mul i pacien i au f cut stop cardiac peste pu in timp dup spitalizare. Durata median întreţ ţ ă ţ ă ă apari ia primelor semne clinice şi deces a fost de 10 zile (între 2 şi 33 zile).ţ

FAMILIA PARAMYXOVIRIDAESUBFAMILII :

PARAMYXOVIRINAE (genurile Paramyxovirus, Rubulavirus, Morbillivirus) PNEUMOVIRINAE (genurile Pneumovirus, Metapneumovirus)

CARACTERISTICA GENERAL A PARAMYXOVIRUSURILORĂVirusuri învelite, sferice, uneori filamentoase, 150-400 nm.Genomul – ARN- nesegmentat (transcriptaza asociat )ăCapsida – de simetrie helicoidal , constituit din proteina NP. În asocia ie cu ARN formeaz NCă ă ţ ă tubular de 18 nm diametruăSupercapsida – dublu strat lipidic, proteina intern matrice M, spiculi glicoproteici însera i înă ţ membran :ă

HN – adeziunea la celula- int ţ ă F – fuziunea supercapsidei cu membrana celular în timpul penetr rii virusului în celulă ă ă

formare de sinci ii în culturi de celuleţReproducerea are loc în Ct

110. Familia Picornaviridae. Genul Enterovirus. Caracterele morfobiologice ale virusurilor poliomielitice (morfologia, structura virionului, structura antigenica). Patogeneza poliomielitei. Diagnosticul de laborator. Prelevatele

108

(recoltarea, prelucrarea prealabila), metodele de diagnostic (virusologica, serologica). Profilaxia specifica a poliomielitei.

FAM. PICORNAVIRIDAEagenti patogeni ai unor imbolnaviri digestive, respiratorii, uneori nervoase, +/- exantem la om si animale (bovine, porcine, simiene) Clasificare:

Genul Enterovirus - boli la om Genul Rhinovirus - boli la om Genul Cardiovirus Genul Aphtovirus

Genul Enterovirus Clasificare:

68 serotipuri (antigenicitate, imbolnaviri): v. Poliomielitice 1, 2, 3 v. Coxsackie: grup A (23 serotipuri), grup B (6 serotipuri) v. Echo: 32 serotipuri Enterov. (Ev): 68- 71 v. Hepatitei A (Ev 72)

Caractere comune Morfologie virioni sferic , 27-30nm, neinveliti

• capsid : cubica (icosaedric, 60 subunitati (organizate in 12 pentamere); subunitatea are 4 proteine capsidale (VP1, VP2, VP3 in exterior si VP4 in interior)

• genom: ARN m.c., sens +, are atasat o VPg cu rol de initiere replicare Structura antigenica depinde de epitopii exteriori VP1, VP2 si VP3 induc Ac SN, v.polio VP1 rol in SN Diferente Ag prin: RSN, imunodifuzie - in gel, RFC Reactii incrucisate : v.polio 1 si 2

Actiunea agentilor fizici si chimici:rezista zile la +220C si n sapt. la +40C distruse la +500C; ionii Mg++ rol protector (Mg Cl2 stabilizator vaccin )conservare indelungata : - 700C UV, deshidratarea: inactivare rapida Incorporarea de coloranti (rosu neutru, acridin orange) le sensibilizeaza la lumina.lipsa invelis: rezistenta la solventi lipidici (eter, cloroform) detergenti rezistente la: lizol, fenol, derivati de amoniu cuaternar sensibile la: formol (0,3%), clor, guanidina

Multiplicare:1. adsorbtia pe receptori dep. de: pH si electroliti; la om: gena de pe cromozom 19 codifica

receptor pentru v. polio 2. patrundere: viropexie 3. decapsidare, pierdere VP4 :4. eliberare ARNv care devine ARNm, tradus la ribozomi 5. sinteza poliproteina gigant, scindare in P1 apoi clivare in VPO, VP3, VP1 si P1 si P3

(clivare in replicaze si proteaze = VPg care initiaza sint. ARN si ARN polimeraza)6. prod. de ARN progen sens + se face cu ARN polimeraza care sintetiz. catene

complementare sens- apoi de sens + , concomitent cu sint. proteine virale7. asamblarea in reticulul endoplasmatic

ciclu infectant: 5-10 ore (particule/celula = 10 5)

V. POLIOMIELITIC PoliovirusClasificare – serotipuri:

tip 1: Brunhilde

109

tip 2: Lansing tip 3: Leon

Relatii virus – celula gazda cultivare:culturi primare rinichi maimuta, amnios uman, linii continue: KB, HeLa, Hep2efect citopatic: rotunjire, crestere refringentei, picnoza, degenerare, desprindere det. plaje circulare, clare, margini nete – folosite la clonarea tulpini atenuateanimale: cimpanzei, maimute Rhesus, Cinomoglus: inoculare i. medulara, i. cerebrala sau orala: viremie, eliminare v. fecale, paralizii flasce si r.i. umoral

Patogeneza – clinica manifestare infectie: asimptomatica/imbolnavire minora – majoritaraafectare sistem nervos, meningita aseptica si/sau poliomielita paralitica severa evolutie: patrundere: orofaringe, transport tesut limfoid (rinof., placi Peyer), multiplicare, diseminare limfatica, viremie tranzitorie cu manifestari clinice minore (respiratorii, digestive). Uneori multiplicare masiva tesut r.e. cu viremie persistenta si invazia sistemului nervos; virus prezent sange inainte debut clinic (+/- paralizii); infectare sanguina a sistemului nervos, diseminare pe axoni, clinic: febra, cefalee, redoarea cefei, paralizii flasce (leziuni neuroni motori coarne ant. maduva = poliomielita paralitica acuta). Posibila invazie a creier, talamus, hipotalamus, nuclei cerebelosi, trunchi cerebral, cortex motor = poliomielita bulbara/encefalita poliomielitica cu evolutii extrem de grave. Lezare nervi cranieni: paralizia faringe, paralizia corzi vocale (perechea X), paralizii oculare (perechea V)leziuni neuronale/extraneuronale: cromatoliza, distructie masiva, neuronofagie; edem, proliferare cel., infiltrat perivacular limfocitar (ggl ., placi Peyer, miocard) factori predispozanti: traume, efort fizic, sarcina, injectii, amigdalectomie incubatie 7-14 zile

Imunitate :• dupa boala sau vaccinare: rezistenta indelungata de tip

RIU: Ac neutralizanti fata de VP1 si VP2 apar inainte debut (multiplicare intestinala si tesut

limfoid) Ac circulanti previn diseminarea, nivel maxim 2-6 sapt., persista toata viata Ac FC apar mai tirziu si dureaza mai putin Ac SN si FC trec pasiv la copil = rezistenta 0-6 luni

imunodeficienti: fac boala atipica cu afectare s.n.• imunitatea locala:

IgA impiedica reinfectia la intestin amigdalectomia scade rezistenta locala

Epidemiologie: raspindire globala fosta endemica zone calde si epidemica zone remperate eradicare: 2000sursa de v.: om cu infectie inaparenta transmisie: fecal-orala (direct/indirect: apa, alimente infectate, secretii faringiene); v. prezent in orofaringe n. zile inainte debut eliminare fecale: 3-6 sapt dupa imbolnavire susceptibilitate: generala

Profilaxie:vaccin inactivat (Salk): preparat culturi rinichi maimuta, inactivat formol

1. confera imunitate umorala (blocheaza v. la orof)2. elimina posib de mutante si revertanti 3. utilizabil in zone tropicale 4. utilizare imunodepresati

110

5. necesita rapeluri numeroase vaccin viu atenuat (Sabin): preparat pe diploide umane sau culturi simiene

1. induce i. locala si umorala persistenta (toata viata) 2. blocheaza multiplicarea intestinala 3. administrare orala 4. posiblie reversii si mutante virulente 5. transmitere v. vaccinale la neimunizati6. paralizii post vaccinale (1 caz/1milion vaccinari)

vaccin ADN recombinant (de viitor din polipeptide virale VP1 sau genom viral

111. Familia Picornaviridae. Genul Enterovirus. Caracterele morfobiologice ale virusurilor Coxsackie (morfologia, structura virionului). Clasificarea dupa structura antigenica. Rolul in patologia umana. Diagnosticul de laborator al infectiilor cauzate de virusurile Coxsackie. Prelevatele (recoltarea, prelucrarea prealabila), metodele de diagnostic.

Coxsackie virusRelatii virus – celula gazda cultivare: culturi de celule: V. Coxsackie B: culturi primare rinichi maimuta, rinichi embrionar, amnios umanV. gr. A: linie continua RD ECP: rotunjire, desprindere animale: V.C grup A inoc. soarece n.n. (i. cerebral, subcutanat, i. peritoneal) polimiozita, edem/necroza musculaturii striate, paralizii flasce; VC grup B: meningoencefalita (encefalomalacie), pancreatita, miocardita, hepatita si necroza tesut adipos Patogeneza – clinica patrundere: respiratorie si digestiva, diseminare sanguina cu localizari diverse:herpangina: debut brusc, febra, disfagie (vezicule, papule, zone rosii pe pilieri, palat, amigdale). Evolutie benigna (4-6 zile). Afectare copii.Boala – gurii, mainilor si picioarelor: herpangina, exantem maculopapular si veziculos bulos (maini, picioare, fese). Vindecare 7-14 zile Pleurodinia, mialgia epidemica (boala Bornholm): febra, stare generala alterata, durere retrosternala (diafragm), +/- pericardita Miocardita: la nou-nascut (transmitere perinatala), frecvent fatala; adult benigna Menigite aseptice, pancreatite, nefrite, malformatii congenitale (gravide) Imunitate: specifica de serotip: evid. prin RSN, IF, ELISA Ac SN apar la 7 zile, max. 3 saptamini, persista indelungat.

Epidemiologie:raspindire globala endemo- epidemic (vara – toamna); focare epidemice colectivitati (scoli,crese) sursa: om transmisie: fecal – orala; aerosoli susceptibilitate: generala

DIAGNOSTIC LABORATORproduse patologice: materii fecale, exsudat faringian, l.c.r., cheag sanguin, lichide veziculare, exsudat conjunctival, probe necroptice (maduva spinarii, perete – continut intestinal, muschi toracici, formatiuni nervoase)izolare – identificare izolare

culturi celulare v Coxsackie B, V.polio, V.Echo : culturi primare rinichi maimuta, diploide umane V.Coxsackie A: lina celulara RD animale: V.Coxsackie A si B: soarece nou-nascut

identificare : culturi celulare : SN cu seruri specifice de tip (Polio, Coxsackie B si Echo) animale : SN la v Coxsackie A

111

diagnostic serologic:Det. Ac pe probe duble (0-2/3 sapt) prin: SN, RFC, HAI, ELISA, precipitare in gel, reducerea plajelor

diagnostic de certitudine: virus izolat si r.i. serc (crestere de 4 ori a Ac) tablou clinic caracteristic (paralizii)context epidemiologic pentru enteroviroze

112. Familia Picornaviridae. Genul Enterovirus. Caracterele morfobiologice ale virusurilor ECHO (morfologia, structura virionului, structura antigenica). Rolul in patologia umana. Diagnosticul de laborator al infectiilor cauzate de virusurile ECHO. Prelevatele (recoltarea, prelucrarea prealabila), metodele de diagnostic.

113. Virusurile hepatitice. Virusurile hepatitelor A si E. Clasificarea (familie, gen, sp.). Caracterele morfobiologice. Markerii serologici. Patogeneza hepatitelor A si E. Diagnosticul de laborator al hepatitelor A si E. Prelevatele, metodele de diagnostic. Profilaxia specifica.

HEPATITE – leziuni inflamatoare ale ficatuluiORIGINE – infec ioas , medicamentoas , toxic , autoimun , etc ţ ă ă ă ăHepatitele virale – leziuni determinate de ac iunea citopatic direct a virusului în cauz , sau,ţ ă ă ă mai frecvent, de reac ia imun contra celulelor hepatice infectate.ţ ăVIRUSURILE HEPATITICEVirusuri dominant hepatotrope

1. Virusul hepatitei A – HAV- (fam. Picornaviridae)2. Virusul hepatitei B – HBV- (fam. Hepadnaviridae)3. Virusul hepatitei C – HCV- (fam. Flaviviridae)4. Virusul hepatitei D – HDV - (neclasificat)5. Virusul hepatitei E – HEV - (fam. Hepeviridae)6. Virusul hepatitei G – HGV?7. Virusurile TT (Circovirus ?)8. Virusuri ce afecteaz ficatul ocazional: Coxsackie, ă virusul citomegalic (CMV), virusul

Epstein-Barr (EBV), virusul herpes simplex (HSV), ş.a.MANIFEST RI CLINICO-BIOLOGICE ALE HEPATITELORĂIncuba ia – variabil (15 zile – ţ ă 6 luni)Gravitatea – hepatitele A şi E au evolu ie benign , hepatitele B, C, D – acute şi cronice,ţ ă complica ii graveţForma clinic clasică ă – febr , artralgii, astenie, erup ii, deregl ri digestive, urmate de icter (3ă ţ ă s pt mâni), asociat cu anorexie, oligurie, decolorarea maselor fecale, ă ă bilirubinurie.Forme anicterice, asimptomatice (80-90% cazuri)Hepatita fulminantă – foarte gravăHepatita cronică persistentă şi cronic activă ă (cu citoliz )ăComplica ii – ciroz , cancer primitiv al ficatuluiţ ăManifest ri extrahepatice, determinate de complexe imune circulante – periarterit nodoas ,ă ă ă poliartrit , glomerulonefrit , poliradiculonevrite, etc.ă ăRM - ar endemic prin hepatitele B şi C. Indicele de prevalen a HBV este de peste 8%, iar alţ ă ă ţă HCV de 5%.

VIRUSUL HEPATITEI AFamilia PicornaviridaeGenul HepatovirusSpecie Virusul hepatitei A (HAV)Dimensiuni – 28-30 nm

Genom – ARN+, liniar Capsidă – icosaedric , 60 capsomeri, compuşi fiecare din 4 polipeptide VP1, VP2, VP3, VP4ă

Rezistenţă: total la 60ă 0C – 1 or , par ial - 12 ore, rezist la % de clor uzuale. Inactivat deă ţ ă ă formol, beta-propiolacton, UV, hipoclorit de sodiu.

HAV a fost depistat în 1973 prin IME112

Primul vaccin – 1992Se cunosc 7 genotipuri (om, maimu e)ţ

Cultivarea : Marmozete, cimpanzei Celule de hepatocarcinom uman Celule diploide umane Celule din rinichi de maimuţă

Receptorul celular – mucina (GP membranar)ECP nu provoacă

PATOGENEZA HEPATITEI ASurs şi rezervor de infec ieă ţ – omul bolnavMecanismul de transmitere – fecal-oral (mâini murdare, alimentele, apa contaminate); cazuistic – transfuzionalHAV se multiplic în esutul limfoid intestinal şi citoplasma hepatocitelor. Se elimin cu maseleă ţ ă fecale dup 2 s pt mâni de la infectare, diminueaz odat cu apari ia semnelor clinice. Viremiaă ă ă ă ă ţ – 1-2 s pt mâni.ă ăHepatocitoliza este determinat de LT CD8, NK. ăIncuba ia ţ – 30 zile (15 – 50 zile)Forme clinice – forme asimptomatice (90%), forme benigne (1-2 s pt.), rareori – forme grave,ă fulminante. Lipsa croniciz rii!ă

Markerii virali în cursul maladiei:• HAV (Ag viral) (mase fecale, sânge) în ultimele 2 s pt mâni de incuba ie şi câteva zile deă ă ţ

la apari ia icterului ţ• IgM anti-HAV – depistate de la debutul fazei icterice, titru maxim peste o s pt mân şiă ă ă

dispar dup 8-12 s pt mâni. ă ă ă• IgG anti-HAV – persist toat via a.ă ă ţ• ARN viral (în mase fecale, sânge, hepatocite).

VIRUSUL HEPATITEI VIRALE E (HEV)HEV – depistat în 1983 prin MEFamilia– HepeviridaeGenul - HepevirusStructura HEVDimensiuni – 27 – 30 nm

Genom – ARN+ (descris în 1990)Capsidă – icosaedric (protein unic glicozilat )ă ă ă ă

HEV se repartizeaz în 3 grupe genomice: ăI – asiatic , II – mexican , III – nord-american (include şi tulpini porcine)ă ă ăPatogenezaSursa de infec ieţ – omul bolnavMecanismul de transmitere – fecal-oral (ap , alimente), posibil parenteral (la hemofili,ă persoane cu transfuzii, hemodializ )ăPerioada de incuba ieţ – 30 zileClinica – hepatit acut , asem n toare cu hepatita A. ă ă ă ă Forme grave la femei gravide, în special în trimestrul III al sarcinii (20-40% mortal). Risc de avort şi naştere prematur (12 – 30% cazuri)ă

Markerii HEV:• Virusul (Ag viral) prezent în mase fecale în faza acut (ME)ă• IgM (3 luni de la debut) şi IgG anti-HEV• Genomul viral în mase fecale, hepatocite

114. Virusurile hepatitice. Virusu l hepatitei B. Clasificarea (familie, gen, sp.). Caracterele morfobiologice. Markerii serologici. Patogeneza hepatitei B, consecintele. Diagnosticul de laborator al hepatitei B. Prelevatele, metodele de diagnostic. Profilaxia specifica.

113

VIRUSUL HEPATITEI VIRALE B (HBV)Ag “Australia” a fost detectat în 1964 de Blumberg, actualmente numit Ag HBsHBV – virus ADN, ciclul de replicare comport o etap de transcrip ie inversă ă ţ ăExtrem de contagios şi prezent în titruri mari în lichide biologice. Provoac hepatite acute, chiară fulminante, hepatite cronice, ciroz , hepatocarcinom. ăPeste 350 mln persoane infectate în lume.Peste 1,5 mln decesuri anual.ClasificareFamilia – HepadnaviridaeGenul – OrthohepadnavirusSpecia – Virusul hepatitei B (HBV)MorfologiaParticule sferice de 42 nm (particulele Dane), infec ioase – virionul complet (10ţ 9 part/ml) Particule sferice, lipsite de acid nucleic, de 22 nm, neinfectioaseStructuri tubulare, 200-700 nm lungime, neinfectioase

Structura HBV (particula Dane)Genomul: ADN circular bicatenar par ial (2/3). Posed catena lung L(-) şi catena scurt S(+).ţ ă ă ă Se disting 8 genotipuri (A – H). Nucleocapsida (NC, core) – icosaedric , comport Ag HBc, asociat cu Ag HBe (solubil). În NCă ă se afl şi ADN-polimeraza şi timidin kinaza.ăSupercapsida – dublu strat lipidic asociat cu proteine virale (Ag HBs). Un receptor pentru albumin din supercapsid intervine la etapa de penetrare a virusului. ă ăRezisten aţ : HBV este rezistent la ac iunea eterului, la desicare şi c ldur . ţ ă ăHBV îşi p streaz infec iozitatea mai mul i ani la -20 grade, câteva luni la +30 grade, câteva oreă ă ţ ţ la +60 grade. Este distrus la fierbere şi cu hipoclorit de sodiu.Animale experimentale – maimu e cimpanzei.ţ

Structura antigenic a HBV (markeri epidă emiologici) Ag HBs, de suprafa . Posed dţă ă eterminan i de grup (ţ a) şi de tip (d/y şi w/r). Serotipuri ale

Ag HBs : ayw, ayr, adw, adr, etc. Anticorpii anti-HBs au rol protector. Ag HBc, din NC, nu este detectabil în ser, doar în nucleul hepatocitelor infectate. Ag HBe, solubil, component al NC. Prezent în ser şi martor de infec iozitate (replicareţ

viral ).ă ADN polimeraza Timidin kinaza

Ag suscit sinteza Ac anti-HBs, anti-HBc, anti-HBe, anti-ADN polimeraz .ă ă

Multiplicarea HBVVirusul penetreaz în hepatocit debarasat de supercapsid datorit receptorului s u pentruă ă ă ă albumină.Dup decapsidare ADN este completat de polimeraza viral , devenind bicatenar. ă ăADN-ul viral p trunde în nucleul celuleiă . ARN polimeraza gazdei transcrie catena ADN L(-) în ARN-pregenomic (+) şi ARNm.În citoplasm are loc transă larea ARNm şi sinteza proteinelor virale.ARN-pregenomic (+) este încorporat în capsid şi ADN polimeraza viral sintetizeaz catena Lă ă ă (-) – activitate de reverstranscriptaz .ăPe matricea catenei L (-) este sintetizat catena S (+)ă .Polimeraza manifest activitate de RNaz H şi degradeaz ARN-pregenomic.ă ă ăNC cap t supercapsida la nivelul MCt şi ă ă virionul nou format este eliberat prin înmugurire (particulele Dane, infec ioase).ţProteinele externe (HBs) sunt produse în exces şi se asambleaz în ser în particule sferice sauă tubulare, neinfec ioase. ţHBV nu este citolitic. Hepatocitoliza este determinat de r spunsul imun al gazdei. Hepatociteleă ă infectate prezint pe suprafa a lor antigene virale, ce stimuleaz un r spuns imun.ă ţ ă ăLimfocitele T CD8 şi celulele NK atac şi distrug celulele bolnave, iar anticorpii specificiă neutralizeaz virusul circulant. ă

114

DE RE INUT !!!Ţ1. ADN viral dublu catenar este extrem de stabil, poate persista sub form de plasmid înă ă

hepatocit, fiind la originea portajului cronic şi fenomenelor de reactivare.2. ADN viral se poate integra în cromozomul hepatocitelor (ac iune oncogen posibil ).ţ ă ă3. Implicarea transcriptazei inverse se afl la originea unei rate de muta ii crescuteă ţ

(rezisten la chimioterapice, eşec în cursul seroterapiei sau vaccinare, mutante f r Agţă ă ă HBe).

Patogeneza hepatitei virale BSursa de infec ieţ – omul. HBV este prezent în sângele bolnavului, secre ii genitale şi sperm ,ţ ă saliv , lapte, urin , lacrimi.ă ăC ile de transmitere a HBVă :

1. Parenteral prin sânge şi derivate (transfuzii, tratament cu produse sangvine, activitate profesional , injec ii cu seringi contaminate -toxicomani, tatuaj, piercingă ţ , acupunctur ).ă

2. Sexual (homo-/hetero-).3. Vertical – de la mam la copil (la naştere sau în perioada neonatal ).ă ă4. Transmiterea direct (contact, s rut) nu este exclus .ă ă ă5. Riscul infec iei prin injec ie – 20-30%ţ ţ6. Contagiozitate sangvin extrem – de 10 ori superioar infec iei cu HCV şi de 100 ori –ă ă ă ţ

HIV.Perioada de incuba ie - ţ 30–180 zile (10 s pt m)ă ăPerioada de stare – simptomatic la 20-30% pacien i (forme anicterice 70-80%ă ţ ) Vindecare – 90%Hepatita viral B poate evolua spre cronicizare (10ă % la persoane imunocompetente).Hepatita fulminant –ă 0,1 - 1%Ciroza hepatic sau cancer – 20ă %

CINETICA MARKERILOR Hepatita acut ă

o Ag HBs este primul marker depistat în ser dup 1-3 luni de la contagiu, persist 1-2ă ă luni şi dispare peste câteva s pt mâni dup normalizarea transaminazeloră ă ă . Persist laă purt torii cronici.ă

o Ag HBe apare imediat dup HBs, marker de replicare viral , dispare înaintea Ag HBs.ă ăo Ac anti-HBc (IgM) apar peste 2-4 s pt dup Ag HBs.ă ăo Ac anti-HBe apar dup încetarea replic rii virale, odata cu dispari ia Ag HBe. Markeră ă ţ

de pronostic favorabil.o Ac anti-HBs apar peste 2-3 s pt mâni dup dispari ia Ag HBs (ă ă ă ţ fereastră

imunologică). Neutralizan i. Markeri ai vindec rii. Lipsesc la purt torii cronici.ţ ă ăEvolu ie favorabilţ ă: dispari ia Ag HBs şi Ag HBe, apari ia succesiv a Ac anti-HBc, anti-HBe şiţ ţ ă anti-HBs. Hepatita fulminantă – prezen a constant a IgM anti-HBc în titru înalt.ţ ă Hepatite cronice (evolu ie peste 6 luni).ţ Hepatit cronic activă ă ă (persisten a Ag HBs, Ag HBe şi Ac anti-HBcţ - IgG). Hepatit cronic persistentă ă ă (Ag HBs, Ac anti-HBe, anti-HBc) - purt tor cronic de Agă

HBs. (Reactiv ri sunt posibile, supraveghere necesar ). ă ă

115. Virusurile hepatitice. Virusul hepatitei C. Clasificarea (familie, gen, sp.). Caracterele morfobiologice. Markerii serologici. Patogeneza hepatitei C, consecintele. Diagnosticul de laborator al hepatitei C. Prelevatele, metodele de diagnostic. Profilaxia specifica.

VIRUSUL HEPATITEI CIdentificat în 1989. În prezent – 180-200 mln infecta iţ .Familia FlaviviridaeGenul HepacivirusDimensiuni – 55-65 nm

Genom – ARN+, liniar. Heterogenitate genetic - se disting 6 (11 ?) genotipuri şi numeroaseă subgenotipuri. HCV circulă sub forma de un amestec complex şi instabil de populaţii virale

115

genetic distincte. În Europa predomin genotipul 1, care este mai pu in sensibil laă ţ tratamentul cu IFN. Capsida – icosaedric , protein unic .ă ă ăSupercapsida – derivat din membrana ă reticulului endoplasmatic, cu 2 glicoproteine virale E1 şi E2.

Replicarea HCV are loc in citoplasma hepatocitelor şi a celulelor mononucleate din sângeMarkeri epidemiologici – Ag HCV, Ac anti-HCV, ARN viralTransmitere:

1. Prin transfuzii, transplant de esut şi organeţ2. Droguri administrate i/v3. Nozocomial (în mediu medico-chirurgical, stomatologie, piercing, tatuaj, acupunctur )ă4. Vertical 5. Sexual 6. Intrafamilial (foarfece, peptene, aparat de ras, etc)

Incuba ia ţ – 4 – 12 s pt mâniă ăHepatita C acută: 70-90% - asimptomatic , activitatea seric a transaminazelor (în specială ă ALAT) este moderat crescut şi tranzitorie, uneori oscilant . Se poate vindeca spontan în 20 %ă ă cazuri, f r a conferi imunitate complet .ă ă ăHepatita C fulminantă – co-infec ie cu HBV sau HAV.ţHepatita C cronică (80% cazuri) – persisten a HCV peste 6 luni de la infec ia acut . Creştereţ ţ ă cronic a activit ii ALAT, care este moderat şi fluctuant . Co-infec ia cu HIV – factoră ăţ ă ă ţ stimulator.Complica iiţ – ciroz (20% cazuri), cancer.ă

116. Virusurile hepatitice. Virusul hepatitei D. Clasificarea (familie, gen, sp.). Caracterele morfobiologice. Markerii serologici. Patogeneza hepatitei D, superinfectie si coinfectie. Diagnosticul de laborator al hepatitei D. Prelevatele, metodele de diagnostic. Profilaxia specifica.

VIRUSUL HEPATITEI DAgent viral defectiv, satelit al HBV, 36-37 nm. Descoperit în 1977.Genul Deltavirus

Genom – ARN-, circular (3 genotipuri)Capsida – sferic , 2 proteine, Ag DeltaăSupercapsidă – derivat din HBV, cu 3 forme de Agă HBs

Se replic în nucleu, independent de HBV, dar care îi ă asigur supercapsida cu Ag HBs.ăManifest efect citopatic direct sau via r spunsul imun celular.ă ăMarkerii HDV – Ag HDV, Ac anti-HDV, ARN viral (asocia i cu markeri ai HBV)ţ .Patogeneza hepatitei DMecanismele şi c ile de transmitereă – identice cu HBV. Infec ia Delta se poate manifesta în acelaşi timp cu hepatita B (co-infec ie, evolu ie acut , riscţ ţ ţ ă de forme fulminante) sau survine la un purt tor cronic (suprainfec ie, risc de hepatit cronică ţ ă ă activ cu evolu ie rapid în ciroz , forme fulminante sunt posibile).ă ţ ă ă

Virusul hepatitei virale G (HGV, GBV-C)Descoperit concomitent de c tre 2 echipe de cercet tori, manifest analogie genomic cu HCV.ă ă ă ăTransmiterea parenteral este predominant . Exist portaj cronic (2 – 30 %) f r anomalieă ă ă ă ă hepatic . Formele acute sunt rare, asociate cu alte hepatite virale.ăClinic se aseam n cu hepatita viral C.ă ă ăVirusul TT (TTV)Virus ADN simplu, apropiat de Circovirus.Se transmite prin sânge, fecal-oral şi vertical.Este foarte r spândit în rândul popula iei – 2-12% din donatori sunt purt tori de virus (20-60 %ă ţ ă la hemofili, toxicomani, hemodializa i).ţSe identific la 40-50 % de bolnavi cu hepatit nonA-nonG. ă ă

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALEDiagnostic paraclinic: dozarea transaminazelor, bilirubinei, raportul albumine/globuline.

116

Trombopenie, leucocitoz , diminuarea protrombinei – factori de “alert ”.ă ăDiagnostic etiologicDetectarea virionilor (ME, IME) sau Ag virale (ELISA, RIF) în bioptate hepatice sau sânge.Detectarea AN virali întrahepatic sau în sânge (hibridare, PCR).Eviden ierea anticorpilor antivirali în serul sangvin prin tehnici ELISA, ARI, imunoblot, RIFIţDiagnosticul hepatitei AEviden ierea Ig M anti-HAV (Ig G – imunitate)ţDiagnosticul hepatitei BDepistarea Ag HBs, Ag HBe, Ac anti-HBc, anti-HBs, anti-HBe, anti-polimeraz în ser; Ag HBc – înă hepatocit)Diagnosticul hepatitei CDepistarea Ac anti-HCV (80% peste 15 s pt de la expozi ie, 95% - 5 luni, 97% - 6 luni )ă ţDiagnosticul hepatitei DEviden ierea Ac anti-HDVţ

PROFILAXIA HEPATITELOR VIRALE1. Control eficace al donatorilor de sânge, esuturi, organe, ţ sperm , prevenirea MST şiă

nozocomiale, utilizarea materialelor de uzaj unic, ameliorarea condi iilor sanitare, etc. ţ2. Imunizarea activă

Anti-hepatita A – vaccin inactivat (10-20 ani).Anti-hepatita B (vaccin recombinant Ag HBs). Vaccin anti-hepatita D şi E– în curs de studiu.

3. Imunizarea pasivăImunoglobuline specifice anti- HAV, anti-HBV, anti-HEV.

Tratament specific al hepatitelor A şi E nu exist .ăTratamentul specific al hepatitei B Interferon alfaVidarabin, lamivudin, entecavir, telbivudin, adefovir (!!! Selec ia tulpinilor rezistente)ţImunoterapieTratamentul specific al hepatitei CInterferon alfaRibavirinImunoterapie

117. Infectia HIV-SIDA. Virusul HIV. Clasificarea (familie, gen, variante). Structura virionului. Markerii serologici. Celulele tinta si rezervorul celular. Patogeneza infectiei HIV. SIDA. Diagnosticul de laborator al infectiei HIV-SIDA (reste directe si indirecte de depistare, teste de confirmare, diagnosticul serologic). Terapia specifica.

FAMILIA RETROVIRIDAE. VIRUSUL HIV ŞI INFEC IA HIV/SIDAŢPrima descriere clinic a SIDA – 1981ă1983–HIV a fost identificat la Paris, ins. Pasteur1986 - propus denumirea HIV ă (Human Immunodeficiency Virus)1986 – a fost izolat HIV-2, Africa de VestÎn prezent – 40 mln persoane infectate cu HIVZilnic se infecteaz 5-6 mii persoaneă

Retroviridae – familie numeroas de virusuri ARN dotate cu o enzim numită ă ă reverstranscriptaz : ARN ă ADNd.cCLASIFICAREA FAM. RETROVIRIDAESubfamilia OrthoretrovirinaeGenurile: Alpharetrovirus, Betaretrovirus, Gammaretrovirus, Deltaretrovirus, Epsilonretrovirus (induc tumori şi leucemii), Lentivirus (virusul HIV)Subfamilia SpumaretrovirinaeGenul: Spumavirus (nepatogeni)

CARACTERE MORFOSTRUCTURALE GENERALE ALE FAMILIEI RETROVIRIDAEDimensiuni – 80-130 nm

117

Form – sferică ăGenom – dou molecule de ARN+, capacitate de integrare în nucleu suă b form de ADNă proviralEnzima – reverstranscriptazaCapsid – icosaedrică ăSupercapsid – derivat din MCP, lipidic cu GP virale înă ă ă serate

Ciclul replicativ este identic.VIRUSUL HIV. STRUCTURA ŞI ORGANIZAREA GENOMULUI

HIV-1 şi HIV-2 – responsabili de Sindromului Imuno-Deficien ei Achizi ionate (SIDA)ţ ţHIV-1 – reparti ie mondialţ ăHIV-2 – limitat la Africa de Vest

Structura virusului HIV-1 / HIV-2Genomul: diploid – 2 molecule de ARN+ identice, nu sunt utilizate în calitate de ARNm Enzime: reverstranscriptaza (RT), integraza, proteazaCapsida: în form de trunchi de con, constituit din 2 proteine p24/26 CA (intern , major ) şiă ă ă ă p7,9 NC (a nucleocapsidei, asociat ARNă )Supercapsida: dublu strat lipidic de origine celular în care sunt înserate 2 GP viraleă

Gp120/125, de suprafa , asigur fixarea virusului la receptorul celular CD4. Regiunea V3ţă ă este responsabil de ataşare şi induce anticorpi neutralizan i specifici ă ţ

Gp41/36, transmembranar , legat de gp120, responsabil de fuziunea supercapsidei cuă ă ă membrana celulară

Proteina p17/16, matrice, c ptuşeşte stratul intern al SC, asociat cu proteazaă ăGenomul, proteinele interne (p24, p7, p17) şi enzimele constituie nucleoidul (core) viral.Structura genomului (apr. 10 mii nucleotide)

• Gena gag (group antisens) prot. structurale interne (p24 şi p17)• Gena pol (polimerase) 3 enzime: RT (p66), integraza (p31), proteaza (p9)• Gena env (enveloppe) o prot. precursor gp160, clivat ulterior în gp41 şi gp120ă• Gene regulatoare tat, rev, nef, vif, vpr şi vpu (HIV-1) sau vpx (HIV-2)

Omologia dintre HIV-1 şi HIV-2 este de 42%, mai înalt la nivelul genelor ă gag şi pol (peste 50%) şi redus la nivelul genelor ă env (39%).Se disting 3 grupe genomice ale HIV-1: M, O şi N. Grupul M (major) comport 10 subtipuri (A-H, Jă şi K), repartizate geografic neuniform (majoritatea – în Africa, B – Europa occidental si Americaă de Nord, F – România, G – Rusia, etc).Structura antigenică – toate proteinele şi glicoproteinele virale sunt imunogene.

Rezisten a HIVţHIV este sensibil la solven i lipidici şi detergen i, la 56 grade C este inactivat în 30 min, în 5ţ ţ minute - 0,2 % hipoclorit de Na, 70% etanol, 0,2% glutaraldehid . Labil la pH-uri extreme,ă radia ii UV şi RXţCultivarea

o Celule mononucleate de la persoane s n toase ă ăo Linii celulare din LT – MT2o Animale sensibile – maimu ele cimpanzei (HIV-1), Rhesus (HIV-2) ţ

CICLUL DE REPLICAREAtaşarea HIV la celula-gazd prin legarea gp120 la receptorul celular CD4. Rezult oă ă modificare conforma ional a gp120, ce permite buclei V3 a acestei gp s se fixeze deţ ă ă coreceptori de pe suprafa a celulei: CCR5 şi CXCR4, CCR3, CCR2b ş.a.ţPenetrarea NC prin fuziunea supercapsidei (gp41) cu MCt.Decapsidarea şi eliberarea ARN viral asociat cu RT.Retrotranscrierea ARN+ în ADN- (RT). RT degradeaz ARN+, apoi transcrie ADN- în ADNd.c.,ă care va fi circularizat, apoi integrat (integraza) în cromozomul celular, constituind provirusul.Transcrierea ADNv în ARNm prin intermediul ARN-polimerazei II celulare.Sinteza proteinelor virale sub controlul factorilor celulari şi proteinelor reglatoare.

Poliproteina gag/pol 160 kd (p17 MA, p24 CA, p7 NC, p10 (proteaza), p66 (RT), p31 (integraza)Poliproteina env 160 kd (gp41 şi gp120)

Transcrierea ARN viral (ARN+)

118

Asamblarea NCEliberarea prin înmugurire la nivelul MCt modificat prin inserarea gp viraleă : 10 mlrd de virioni/zi/o persoan infectat .ă ăVariabilitatea HIV este determinat de erorile comise de RT (o eroare la fiecare 10 mii baze).ă Muta iile survin în special la nivelul genei ţ env (bucla V3 din gp120, care intervine în fixarea HIV de coreceptori, reprezint epitopul major de neutralizare). Nu exist 2 suşe virale identice. Laă ă bolnav este prezent o popula ie viral polimorf , cu genomuri diferite.ă ţ ă ăConsecin e: ţ

dificultatea de a ob ine vaccin eficientţ selec ia mutantelor rezistente la antiretroviraleţ

CELULELE- INT ŞI REZERVORUL CELULARŢ Ă Limfocite TCD4+ (Th) (99% de replicare, ECP-sinci ii)ţ CPA: monocite/macrofage tisulare (replicare slab , ECP minim), celulele dendriticeă

(prezente în timus, tegument, mucoase, organe limfoide, SNC şi sânge perif.). Ele au rol de vector şi rezervor de virus (adsorb HIV la suprafa a lor şi il transport în organeleţ ă limfoide, unde el se replic în celulele CD4+).ă

Se disting suşe cu tropism macrofagic (M, sau R5), utilizeaz coreceptorul ă CCR5, şi suşe cu tropism limfocitar (T, sau X4), coreceptorul CXCR4.Limfocitele T pot fi infectate cu ambele suşe (prezint ambii receptori).ăÎn primo-infec ieţ – suşe R5, în stadiu de SIDA – suşe X4.Mecanismele de distrugere a limfocitelor T CD4:

1. Liza direct a celulelor infectate (ECP).ă2. Limfocitele T CD8 pot distruge limfocitele T CD4 infectate.3. Apoptoz în urma stimul rii antigenice a celulelor care au fost în contact cu Ag HIV.ă ă4. Limfocitele infectate, acoperite cu gp120 pot provoca fixarea, fuziunea şi moartea

limfocitelor neinfectate.5. Hiperstimulare celular cu dezvoltarea anergiei celulare.ă

PATOGENEZA ŞI CLINICA INFEC IEI CU HIVŢTransmiterea:

Cale sexual (heteă ro-/homo-). Cale sangvin (toxicomani, hemofili, transfuzii de sânge sau transplante de organe,ă

manopere medicale penetrante-injec ii, acupunctur , tatuaj, pearcing).ţ ă Cale vertical (ă in utero în ultimele s pt mâni de sarcin , în timpul naşterii sau în timpulă ă ă

al pt rii).ă ăEVOLU IA MALADIEIŢPrimo-infec ia (peste 20 zile dup contaminare). Durata 2-4 s pt mâni. Are loc:ţ ă ă ă

1. multiplicarea intens şi diseminarea virusului, ă2. sc derea num rului de limfocite T CD4ă ă ,3. creşterea num rului limfocitelor CD8. ă

Diminuarea şarjei virale este determinat de r spunsul imun specific celular şi umoral (Ac anti-ă ăgp120, gp41, p24). Evolu ia poate fi asimptomatic sau simptomatic (50%): adenopatieţ ă ă cervical , febr , faringit , oboseal , mialgii, erup ii cutanate.ă ă ă ă ţFaza asimptomatic , de laten clinic (durata aproximativ 10 ani). ă ţă ăVirusul se replic în organele limfoideă , num rul LT CD4 diminueaz lent sau r mâne stabil.ă ă ă Apar variante noi de virus care se multiplic , SI le recunoaşte şi reac ioneaz specific, ciclul seă ţ ă repet de multiple ori. Aceasta duce la diminuarea progresiv a LT CD4 şi epuizarea SI, urmată ă ă de multiplicarea necontrolat a HIV şi dispari ia complet a limf. T CD4.ă ţ ăFaza clinic (SIDA)ă – incuba ia 8-10 ani Num rul LT CD4 500-200 celule/ml.ţ ăSe manifest clinic prin ă febr cronic , pierdere în greutate, diaree, afec iuni ale tuturoră ă ţ organelor şi sistemelor, infec ii oportuniste, tumori (sarcomul Kaposi, limfome).ţ

Parazi i: ţ Toxoplasma, Histoplasma, Leishmania Bacterii: Mycobacterium, Salmonella, etc Fungi: Pneumocystis carinii, Cryptococcus neoformans, Cryptosporidium, Candida, etc Virusuri: HSV, HZV, CMV.

5-10% de infecta i sunt “asimptomatici de lung durat ”.ţ ă ă• Şarj viral redus .ă ă ă

119

• Num rul LT CD4 stabil (peste 500/ml).ă• R spuns imun celular şi umoral constant.ă• Absen a semnelor clinice.ţ

R spunsul imună :Umoral – Ac anti-gp120 împiedic fixarea HIV.ăCelular – LT CD8 recunosc şi distrug celulele infectate (în special LT CD4, Th).

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFEC IEI HIV/SIDAŢTeste indirecte de depistare

Teste ELISA de depistare a Ac (dup 22 zile de la contagiu)ăTeste combinate Ag - Ac (detectarea Ag p24 şi Ac anti-p24 prin tehnici ELISA)Teste rapide (RA cu particule de gelatin sensibilizate)ă

Teste de confirmare (în caz de reac ie pozitiv ). Tehnica de referin – Western-blotţ ă ţă (separarea el-for. a proteinelor virale, transferarea lor pe o band de nitroceluloz , tratarea cuă ă serul cercetat, apoi efectuarea RIE). Pot fi detecta i Ac contra tuturor Ag.ţCriterii de apreciere: un ser este considerat pozitiv dac sunt prezen i Ac contra cel pu in 2ă ţ ţ Ag de suprafa (gp160, gp120, gp41), asocia i cu Ac contra cel pu in o protein intern (p24,ţă ţ ţ ă ă p17 sau a enzimelor) Teste directeDetectarea Ag p24 (marker direct al infec iei HIV) prin tehnici ELISA. Poate fi detectat în primo-ţinfec ie pân la seroconversie, apoi dispare şi reapare în momentul evolu iei spre SIDA. ţ ă ţDetectarea ARN-lui plasmatic sau ADNv prin teste de amplificare genic .ăPrezen a ARNv în ser denot replicarea constant a virusului. Determinarea şarjei virale esteţ ă ă utilizat pentru monitorizarea unui pacient infectat.ăIzolarea HIV în culturăSe realizeaz prin inocularea cu plasm sau celule mononucleate de la bolnav a unei culturi deă ă celule mononucleate de la donatori s n toşi.ă ăReplicarea este detectat prin eviden ierea Ag p24, RT sau a ARNv.ă ţDiagnosticul primo-infec ieiţ (markerii virali)

1. ARNv plasmatic (apare dup 8-17 zile de la contagiu)ă2. Ag p24 în ser (p n la apari ia Ac anti-p24)ă ă ţ3. Ac anti-HIV (dup 3 s pt mâni de la contagiu)ă ă ă4. Monitorizarea virologic a seropozitiviloră5. Parametrii imuno-hematologici (formula sangvin , determinarea subpopula iilor de LTă ţ

(valori absolute, raport T CD4/T CD8), dozarea Ig, microglobulinei beta2)6. Markerii virali (şarja viral plasmatic (ARNv), Ag p24, Ac anti-p24)ă ă

CHIMIOTERAPIA ANTIRETROVIRALĂDup mecanismul de ac iuneă ţ :Inhibitori nucleozidici şi nucleotidici ai RT (Abacavir, Didanosin, Lamivudin, Stavudin, Zalcitabin, Zidovudin, Tenofovir)Inhibitori nenucleozidici ai RT (Delavirdin, Efavirenz, Nevirapin)Inhibitori ai proteazelor (Amprenavir, Indinavir, Lopinavir, Nelfinavir, Ritonavir, Sanquinavir Inhibitorii adeziunii şi penetr riiă – în curs de evaluare (CD4, T20)Inhibitor al asambl rii şi eliber riiă ă - Interferonul alfa Tratamentul este indicat tuturor bolnavilor de SIDA şi persoanelor cu num rul LT CD4+ mai mică de 350/ml.Este indicat asocierea a 3 chimioterapice: 2 INRT + 1 IP; 2 INRT + 1 INNRT, 3 INRT, 1 INRT+1ă INNRT+IPDificult i:ăţ

1. Durata şi costul tratamentului2. Toxicitatea preparatelor3. Dezvoltarea rezisten eiţ

Monitorizarea terapiei antiretrovirale: M surarea şarjei virale (copii ARNv în plasm )ă ă Determinarea numeric a LT CD4+ ă

PROFILAXIA INFEC IEI HIV/SIDAŢ

120

M suri nespecifice: prevenirea transmiterii HIVă .Profilaxia specific – dificil !!!ă ă

Existen a a 2 virusuri HIV-1 şi HIV-2 cu numeroase subtipuri genetice şi antigenice.ţ Infec ia natural nu este stopat de r spunsul imun, iar memoria imunologic esteţ ă ă ă ă

mediocr .ă Nu este definitiv clar rolul LT CD8+ (Tc). Lipsa unui model animal satisf c tor.ă ă

VIRUSURILE HTLV (Human T-cell Lymphotropic Virus)Genul DeltaretrovirusSpecii HTLV-1 şi HTLV-2Structura – comun retrovirusurilorăTransmiterea – contact sexual, vertical, prin sânge (cu limfocite).Puterea oncogen determinat de gena transactivatoare ă ă tax.Manifest ri clinice – 1-5% din persoanele infectate dezvolt peste 20-30 ani leucemie acut cuă ă ă celule T.Diagnostic – depistarea virusului prin ELISA şi confirmarea W-B, PCR.Tratament – antiretrovirale, IFN.

ONCOGENEZA VIRALĂCancerul este consecin a deregl rii procesului normal de proliferare celular .ţ ă ăC ile de apari ie a cancerului:ă ţ

Hiperactivitatea genelor de stimulare a creşterii Blocarea genelor care inhib creştereaă

Virusuri cu poten ial oncogen:ţ Virusuri cu genom ADN (Papovaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, Hepadnaviridae) Virusuri cu genom ARN (Retroviridae)

Caracter comun – capacitatea genomului viral de a se integra în cromosomul celulei-gazdă transformarea ei.Transformarea celular – modific ri ale func iilor biologice ale celulei, ce duc la multiplicareaă ă ţ necontrolat a celulelor şi capacitatea de invazie a esuturilor.ă ţVirusurile oncogene con in gene care pot induce tumori – ţ v-oncToate celulele con iţ n gene omologe: proto-oncogene/c-onc (induc o protein care controlează ă replicarea ADN şi multiplicatea celular ).ăV-onc şi c-onc nu sunt identice!!! C-onc pot induce tumori numai în urma unor muta ii.ţMecanismele oncogenezei:

1. Virusul aduce în celul o oncogen .ă ă2. Virusul activeaz proto-oncogenele celulare.ă

118. Familia Herpesviridae. Clasificarea (subfamilii, genuri, spp.). Caracterele morfobiologice ale virusurilor herpetice. Virusurile HSV 1 si HSV 2. Patogeneza infectiilor cauzate (infectia primara, latenta, reactivarile). Particularitatile de evolutie la persoane imunocompromise. Diagnosticul de laborator al infectiilor cauzate de HSV. Prelevatele. Metodele de diagnostic. Profilaxia si terapia specifica.

FAMILIA HERPESVIRIDAEVirusurile herpetice - agenţi patogeni ai omului, primatelor şi altor mamifere (porci, cai, vite), ai păsărilor (găini, curcani, etc), peştilor şi broaştelor, reunind peste 100 de virusuri.Clasificarea virusurilor herpetice de interes medical:Subfamilia Alphaherpesvirinae

genul Simplexvirus (HSV-1, HSV-2)genul Varicellovirus (VZV)

Subfamilia Betaherpesvirinaegenul Cytomegalovirus (CMV )genul Roseolovirus (HHV-6/7)

Subfamilia Gammaherpesvirinaegenul Lymphocryptovirus (EBV)genul Rhadinovirus (HHV-8)

121

CARACTERE GENERALE ALE HERPESVIRUSURILORStructura virionuluiVirion sferic, 150-200 nm diametru, constituit din:

centru dens, de forma unui mosor (bobină), de natură proteică, pe care este înf şă urat acidul nucleic;genomul viral – ADNd.c., constituit din 80-100 genecapsida de simetrie icosaedrică, formată din 162 capsomere;tegument – structură proteică fibrilară, situată între capsidă şi supercapsidă;peplos (supercapsida), dublu strat lipidic, pe suprafaţa căreia proiemină spiculi scurţi, constituţi din 5-8 glicoproteine, responsabile de adeziune şi fuziune.

Enzime (ADN-polimeraza ADN-dependentă, timidin-kinaza, ribonucleotid-reductaza, serin-proteaza).Caractere biologice

virusuri dermo, limfo şi neurotrope determină infecţii latente, recurente majoritatea prezintă potenţial oncogen posedă numeroase enzime ce intervin în multiplicarea virală prezintă un spectru foarte larg de gazde şi o gamă diversă de forme clinice sunt virusuri fragile şi se transmit numai prin contact direct

Rezistenţa la agenţi fizici şi chimiciÎn stare liofilizată, la 4 grade, virusurile herpetice se menţin ani de zile. Relativ instabile la temperaturi ambientale (+ 22 grade C), inactivate de solvenţi lipidici, detergenţi, dezinfectanţi uzuali, pH extreme. Prezintă sensibilitate la acţiunea inhibitorilor sintezei ADN (acyclovir, etc).

Multiplicarea viralăAdsorb ia virionuluiţ la suprafa a celulei- int .ţ ţ ăPenetrarea NC prin fuziunea supercapsidei virale cu membrana celular .ăDegradarea partiala a capsidei de enzime celulare şi p trunderea ADN viral în nucleul celuleiă . Sinteza proteinelor celulare se opreşte.Biosinteza: în 3 runde consecutive are loc transcrierea ARNm viral cu sinteza ulterioar a 3ă tipuri de proteine: foarte precoce (alpha, immediate early), precoce (beta, early), care sunt în majoritate enzime şi proteine tardive (gamma, late), care sunt proteine de structur .ăReplicarea ADNAsamblarea NC are loc în nucleu. P r sindu-l prin inmugurire, NC se învelesc cu membranaă ă nuclear intern , în care sunt înserate GP virale imature, pe care o „dezbrac ” în procesul deă ă ă înmugurire prin membrana nuclear extern . În citoplasm NC cap t proteinele tegumentuluiă ă ă ă ă şi sunt ulterior re-învelite în supercapsid într-o vezicul de exocitoz , în membrana c reia seă ă ă ă con in GP virale mature.ţVirionii sunt elibera iţ prin exocitoz .ă

Celula infectată este alterată ireversibil prin: Inhibarea rapidă a metabolismului celular. Fragmentarea cromozomului şi apariţia incluziilor intranucleare – corpusculii Cowdry. Apariţia de sinciţii şi celule gigante.

SUBFAMILIA ALPHAHERPESVIRINAEGENUL SimplexvirusSpecii: Herpes simplex virus tip 1 (HSV-1)

Herpes simplex virus tip 2 (HSV-2) Cultivare:

• Culturi celulare primare umane sau din rinichi de iepure, fibroblaste de embrion de găină, linii celulare HeLa

• Ouă embrionate de găină (pe membrana chorioalantoică produc pustule – pocks-uri)• Animale de laborator• Şoarece nou-născut (letal)• Iepure (keratoconjunctivită după scarificarea corneei)

122

• Cobai infectat intraplantar (erupţie veziculară locală)Patogeneza infecţiilor cu HSVSursa de virus – omul (90% au Ac anti-HSV1 şi 20% anti-HSV2)Transmiterea virusului:

1. Contact direct: prin salivă sau lichidul vezicular, mai rar prin obiecte contaminate recent cu salivă (preponderent HSV-1)

2. Contact sexual (preponderent HSV 2)3. În timpul naşterii (herpes neonatal, HSV 2) 4. Transplacentar (herpes congenital, HSV 2))5. Prin intermediul transplantelor de organe infectate6. Autoinocularea

Infecţia cu HSV -1Primo-infecţia este precoce, la 1-3 ani, în 90% cazuri – asimptomatică. Manifestări clinice:

herpesul labialgingivostomatită (erupţie veziculară şi ulceroasă, adenopatie cervicală, febră)kerato-conjunctivită (prezintă riscul ulceraţiei corneei şi orbirii)eczema herpeticum (survine la pacienţi cu eczeme cronice, se manifestă ca o dermatită veziculară generalizată)panariţiu herpetic (la personalul medical, la copii – autoinoculare)meningite, menindo-encefalite, consecutiv infecţiei pe calea nervilor trigemen sau olfactiv (letalitate 70%).

După infecţie (clinică sau asimptomatică) virusul se localizează în ganglionul trigemen, determinând o infecţie latentă. Genomul viral persistă sub formă de episom. Replicarea ADN nu are loc, exprimându-se doar câteva gene “de latenţă”.Reactivarea infecţiei (herpesul recurent) are loc consecutiv scăderii rezistenţei organismului: stress, radiaţii, frig, infecţii, perturbări hormonale, etc. Virusul se propagă centrifug pe cale nervoasă, determinând o infecţie locală (frecvent la joncţiunea cutaneo-mucoasă): herpes labial, nazal, keratita herpetică (buchet de vezicule, se acoperă cu cruste în câteva zile, vindecarea survine în 10 zile).

Infecţia cu HSV -2Determină preponderent infecţii genitale. Primo-infecţia are loc la persoane de 15-25 ani (primele contacte sexuale) sau la nou-născuţi (herpes congenital, neonatal). 75% cazuri primo-infecţia este inaparentă.Manifestări clinice:

• herpesul genital (leziuni veziculo-ulcerative ale penisului, vulvei, vaginului, colului uterin, perineului, feselor, proctita herpetică. După infecţia primară virusul rămâne latent în ganglionii lombari şi sacrali, determinând recurenţe, cu aceeaşi localizare, care sunt mai puţin severe.

• herpesul neonatal. Contractat de nou-născut la naştere sau de la personalul medical cu herpes oral sau panariţiu herpetic. Se manifestă prin septicemie sau conjunctivită. Netratat progresează cu diseminare viscerală şi deces (65%). Infecţia poate fi asimptomatică.

• infecţie congenitală. Transmiterea transplacentară determină malformaţii congenitale, vicii.

• cancer de col uterin şi vulvar.La gazde imunocompromise infecţia cu HSV evoluează grav, cu diseminare masivă şi afectarea organelor interne. Recurenţele sunt mai frecvente, cu ulcerare, necroză, extindere.

Răspuns imun: umoral şi celular, se instalează după 1-3 săptămâni de la infecţie. Ig M apar şi în reactivări şi sunt martor de multiplicare virală. Ig nu sunt protectoare, reactivările au loc în prezenţa Ac. Imunitatea celulară joacă rolul principal în controlul infectiei cu HSV.

Diagnosticul de laborator al infecţiei cu HSVPrelevate: lichid din vezicule, ulceraţii, cruste, fragmente bioptice sau necroptice.Diagnosticul direct

123

Examenul microscopicMEMicroscopia optică – pe frotiuri colorate cu hem-eozină se observă celule mari, cu incluzii intranucleare eozinofile (Cowdry)

Detectarea Ag virale: RIF cu Ac monoclonali Examenul virusologic

Izolarea virusului pe animale sensibile, ou embrionat de găină sau culturi celulareIndicarea virusului : manifestări clinice la animal, apariţia veziculelor pe membrana chorio-alantoica a oului embrionat, ECP specific pe culturile de celule (celule gigante sincitiale cu incluzii intranucleare)Identificarea virusului cu ajutorul serurilor imune specifice (RN, RIF, ELISA)Detectarea genomului viral prin tehnici de biologie moleculară (hibridare in situ, PCR)

Diagnosticul indirect Serodiagnostic. Examinarea serurilor perechi (precoce şi tardiv) cu evidenţierea creşterii titrului de Ac de cel puţin 4 ori. Reacţii utilizate: RFC, RN, RIFI, ELISA.

Tratamentul specific al infecţiei cu HSVo Vidarabin (adenin-arabinosid). Analog nucleozidic al guaninei. Inhibitor competitiv al ADN

polimerazei viraleo Acyclovir, Valacyclovir, Zovirax (acycloguanosid), Penciclovir, famciclovir. Analogi

nucleozidici ai guaninei. Inhibitori ai ADN polimerazei virale, manifestă activitate numai asupra virusului în curs de replicare.

o Foscarnet (phosphonoformat). Dezechilibrează reacţia de polimerizare a ADN.

119. Familia Herpesviridae. Genul Varicellovirus. Caracterele morfobiologice ale VZV. Patogeneza varicelei si zonei-zoster. Particularitatile de evolutie la persoane imunocompromise. Diagnosticul de laborator al infectiilor cauzate de HZV. Prelevatele. Metodele de diagnostic. Profilaxia specifica.

GENUL VaricellovirusSpecia – virusul Varicella-Zoster (VZV), agentul etiologic al varicelei în primo-infecţie şi al zonei-zoster prin reactivare.Cultivarea – numai pe culturi celulare (celule primare de origine umană, simiană, din rinichi de iepure, linii celulare)

Patogeneza infecţiei cu VZVInfecţia primară – varicelaSursa de virus – omulTransmiterea – aerogenă, prin secreţii rinofaringiene sau prin contact cu lichidul vezicular sau obiecte recent contaminate cu lichid vezicular.Varicela se manifestă în special la copii de 2-6 ani, evoluând epidemic iarna şi primăvara. Contagiozitate maximă cu 1-2 zile înaintea erupţiei şi o săptămână după ultimul puseu eruptiv. Perioada de incubaţie – 14 zileDupă pătrundere virusul se multiplică local în căile respiratorii (mai rar conjunctivă) şi ganglionii limfatici locali. Urmează faza de viremie primară, cu durata de 10-11 zile şi cu afectarea sistemului reticulo-endotelial. Peste 5 zile urmează viremia secundară cu răspândirea şi multiplicarea virusului în tegument, conjunctivă, tractul respirator (ţesuturilor de origine ectodermică). Apare febra şi succesiunea unor valuri de erupţie pruriginoasă care evoluează independent (maculă – papulă – vezicule cu lichid clar, apoi cruste) şi ating tot corpul. Dispar fără cicatrice. Odată cu apariţia Ac (2-3 săptămâni) simptomele dispar. Evoluţia este benignă.La persoane cu deficienţe imunitare – leziuni hemoragice, suprainfecţie bacteriană, encefalite, pneumonii, varicela diseminată, letală.La gravide în primele 20 săptămâni de sarcină varicela poate determina o embriofetopatie.

Reactivarea (Zona-Zoster)În cursul primoinfecţiei, prin nervii senzitivi sau hematogen, VZV diseminează spre ganglionii spinali sau ai nervilor cranieni, unde persistă latent. În caz de reactivare virusul se multiplică şi se deplasează pe cale nervoasă centrifugă spre sectorul cutanat corespunzător, determinând

124

Zona-Zoster. Infecţia debutează cu neuralgie severă, hiperestezie şi erupţie veziculară localizată unilateral în dermatomul nervului afectat. Poate fi asociată cu meningită sau paralizii. Forme clinice: zoster oftalmic, zoster motor, encefalomielita.Erupţiile persistă până la apariţia răspunsului imun (umoral, celular).

Tratament – acyclovir, valacyclovir, famciclovir. Tratament simptomatic (analgezice, antipruriginoase).Profilaxie – vaccin viu atenuat, tulpina Oka (în special la imunodeprimaţi).Pentru prevenirea evoluţiei grave la contacţi (nou-născuţi, copii până la 15 ani, gravide neimunizate, persoane cu imunodeficienţe) se administrează Ig umană hiperimună specifică sau gammaglobuline de convalescenţi de zona.

SUBFAMILIA GAMMAHERPESVIRINAEGENUL LymphocryptovirusSpecia – virusul Epstein-Barr (EBV)EBV este agentul cauzal al mononucleozei infecţioase, implicat în etiologia unor tumori: limfomul Burkitt, carcinomul nasofaringean, leucoplakia păroasă a limbii. Este limfo şi epiteliotrop.Structura antigenică a EBV:

1. antigen precoce (early antigen) – EA – enzime implicate în replicare2. antigen de membrană – MA 3. antigen nuclear – EBNA4. antigen al capsidei virale – VCA

Cultivare:Culturi din limfocite B, provenite din sânge din cordonul ombilical. Infectate cu EBV suferă transformare prin proliferare continuă - „imortalizarea limfocitelor”.Inocularea de celule limfoblastoide la şobolani nou-născuţi, hamsteri, şoareci induce tumori secretoare de IgM sau IgG. Celulele-ţintă pentru EBV exprimă pe suprafaţa membranei celulare moleculele CR2 (CD21) – receptor pentru fracţia C3b a complementului, de care se ataşează virusul – limfocitele B şi celulele epiteliale ale oro- şi rinofaringelui.Infecţia celulelor epiteliale este litică, cu moartea celulei şi producere de virus. Celulele infectate astfel exprimă pe membrană Ag EA şi VCA.În contrast, EBV induce infecţie latentă a limfocitelor B in vivo şi transformă limfocitele B normale in vitro cu proliferarea lor continua - „linii limfoblastoide imortalizate”. Limfocitele infectate latent exprimă Ag EBNA şi MA.

Patogeneza mononucleozei infecţioseAfectează în special copiii şi adolescenţii. Sursa de infec ţ ie – omul.Transmiterea se efectuează prin intermediul salivei (boala sărutului), obiecte contaminate recent, rareori transfuzii.Poarta de intrare – orofaringele. EBV afectează limf B direct sau după traversarea ţesutului epitelial amigdalian prin transcitoză. Aceste limfocite B proliferează şi produc virus, care infectează alte celule, astfel afectând toate ţesuturile limfoide din organism. Incuba ţ ia – 30-50 zileSemne clinice – angină, astenie, febră, adenopatie generalizată, splenomegalie şi hepatită Complica ţ ii : anemie hemolitică, purpură trombocitopenică, meningită.În sânge – limfocite B atipice, care prezintă Ag EBNA şi MA. Vindecarea survine peste câteva zile sau săptămâni (răspunsul imun).Reactivarea endogenă a EBV conduce la sindromul de mononucleoză cronică, cu febră, astenie şi producere anormală de Ig.Imunitate:

o umorală = prezenţa Ac (IgM antiVCA sunt markeri de infecţie recentă, IgG antiVCA si antiEBNA – semnal de infecţie persistentă).

o celulară = supresată, numărul de Ts fiind majorat pentru o perioadă de 8 săptămâni. Pe suprafaţa limfocitelor B apar neoantigene (antigene Paul-Bunnell), ce induc Ac heterofili (Ac faţă de hematii de oaie).

Diagnosticul de laborator125

Prelevate: spălătură faringiană, sânge (limfocite), bioptate (ganglioni limfatici, splină)Examenul microscopic: pe frotiuri din sânge – limfocite B mari, anormale, cu citoplasma bazofilă şi nucleu fragmentatDetectarea Ag EBNA în RIF cu Ac monoclonaliExamenul virusologic: izolarea virusului pe cultură de limfocite B şi observarea transformării maligne cu apariţia unei linii continuiDiagnosticul serologic: In infecţia primară se evidenţiază Ac heterofili (testul Paul-Bunnell).Teste pentru detectarea Ac specifici faţă de Ag virale pe probe duble de ser: infecţii primare – IgM şi Ig G (peste 2 săpt) anti VCA (persista titru mic toată viaţa), în

convalescenţă – anti EBNA infecţia reactivată şi în neoplazii reapar Ig G anti EA în titru mare şi sunt prezenţi Ac

antiEBNA

120. Familia Herpesviridae. Genul Cytomegalovirus. Caracterele morfobiologice ale virusului citomegalic. Patogene za infectiilor cauzate de CMV , manifestarile clinice (infectie primare, reactivarile). Diagnosticul de laborator al infectiilor cauzate de CMV. Prelevatele. Metodele de diagnostic. Profilaxia specifica.

SUBFAMILIA BETAHERPESVIRINAEGENUL CytomegalovirusSpecia Virusul cytomegalic (CMV)Cultivarea – numai pe culturi de celule primare din fibroblaste umane sau culturi de miometru.Celulele – ţintă: macrofagele, celulele endoteliale, limfocitele T şi B, celulele-suşă din măduva osoasă, celulele epiteliale ale canalelor glandulare.

Patogeneza infecţiei cu CMVSursa de infec ţ ie – omulTransmiterea:

1. Prin contact direct cu secrete şi excrete ale bolnavilor (salivă, lacrimi, lapte, urină, secreţii ale colului uterin, vaginale, spermă, mase fecale, sânge).

2. Congenital (vertical).3. Neonatal (în timpul naşterii, prin lapte).4. Transfuzii de sânge sau transplante de organe.

Primoinfec ia ţ este în general asimptomatic (80-90%). În caz de viremie este urmat deă ă persisten a latent a virusului în glandele salivare şi limfocite B.ţ ăManifest ri clinice:ăInfec ia congenitalţ ă

• moarte in utero cu avort;• naştere prematur , cu dezvoltarea bolii cu incluzii citomegalice (microcefalie,ă

hepatosplenomegalie, purpur trombocitopenic , pneumonie intersti ial , defecteă ă ţ ă neurologice). Patomorfologic - celulele infectate devin gigante (citomegalie), cu incluzii intranucleare specifice în „ochi de bufni ”.ţă

Infec ia postnatalţ ă (infectarea în timpul naşterii sau cu laptele matern). Copiii elimin virusulă prin urin şi saliv . Decurge inaparent în majoritatea cazurilor. La prematuri – pneumonieă ă intersti ial , sechele neurologice şi retardare psihomotorie.ţ ăInfec ia primar a copilului sau a adolescentuluiţ ă . Dup o incuba ie de 30 de zileă ţ diseminarea viral se manifest prin febr , hepatosplenomegalie, adenopatii asociate cuă ă ă sindrom mononucleozic (neutropenie, limfocitoz , bazofilie). Evolu ie benign .ă ţ ăInfec ia adultuluiţ (doar la imunodeprima i, persoane cu transfuzii sau transplante). Seţ aseam n cu mononucleoza infec ioas ă ă ţ ă (cu febr şi splenomegalie, dar f r angin , f ră ă ă ă ă ă adenit şi f r Ac heterofiliă ă ă )Dup primoinfec ie virusul persist latent în limfocite.ă ţ ă

Reactiv rileă se traduc prin apari ia unei viremii tranzitorii şi excre ia virusului. Laţ ţ imunodeprima i – pneumonie, hepatit , infec ie generalizat .ţ ă ţ ă

126

Imunitate – umoral (Ac neutralizan i, fixatori de complement) şi celular prin intermediulă ţ ă limfocitelor Tc şi celulelor NK. CMV are efect imunosupresor, ducând la creşterea nr limfocitelor Ts şi diminuarea limfocitelor Th.

Diagnosticul de laborator al infec iilor citomegaliceţPrelevate: frac ia leucocitar a sângelui, urin , sp l tur rinofaringean , secre ii cervicale,ţ ă ă ă ă ă ă ţ probe bioptice sau necroptice.Diagnosticul microscopic. Prezen a celulelor mari, cu incluzii intranucleare în „ochi de bufni ”ţ ţă pe frotiuri din leucocite, plasm , sediment urinar sau sec iuni tisulareă ţDetectarea Ag virale cu Ac monoclonali (RIF, ELISA)Examenul virusologic – dificil. Cultivarea pe culturi de celule este lent (2-8 s pt mâni). ECP-ă ă ă celule mari, incluziuni eozinofile intranucleare şi bazofile intracitoplasmaticeDetectarea genomului viral (PCR)Serodiagnostic. Cercetarea serurilor perechi în RFC, RHAI, RIFI, ELISA

Infec ie congenital – izolarea virusului în primele 2 s pt mâni de via , depistarea Ig M.ţ ă ă ă ţăInfec ie recurent : reapari ia excre iei virale la pacien i seropozitivi.ţ ă ţ ţ ţ

Tratament: gancyclovir, valgancyclovir, foscarnet, cidofovirProfilaxie: vaccin viu atenuat sau/şi plasm sau globulin hiperimun se administrează ă ă ă gravidelor seronegative, recipien ilor de transplant ţHHV 6 – întâlnit la adul i în 90%. Agent implicat în etiologia unei afec iuni cutanateţ ţ - exanthum subitum. La persoane cu imunosupresie – pneumonii, encefalite, retinite, etc.HHV 7 – izolat de la adul i s n toşi (aprox. 75%), care excret virusul prin saliv . Sediul laten eiţ ă ă ă ă ţ – epiteliul glandelor salivare, limfocite T CD4. Omologie de 50% cu CMV.HHV 8 – asociat cu sarcomul Kaposi.

127