10-analiza si controlul medicamentului

454 CAPITOLUL 11 SPECTROMETRIA DE MASA CAPITOLUL 11 SPECTROMETRIA DE MASA 455

Ceata este concentrata prin incalzire si cu un gaz uscat si ea pierde moleculele desolvent prin desolvatarea si evaporarea ionilor, pana ce nu mai exisla decat moleculeprotonate ,,cationizate" nefragmentate, purtatoare ale unui numar variabi! de sarcini.Aceste tehnici au avantajul ca sunt mai blande si conduc la formarea unor ioni purtatoride mai multe sarcini, z, care poate fi chiar mai mare de 30; acesti ioni se numesc,,pseudomoleeulari" si se formeaza inaintca intrarii in Spectrometrul de masa. Deoarece

domeniul de masa al spectrometrului se poate extinde pana la M =10 Da, cu un astfel dcprocedeu se pot studia si analiza proteine, glicoproteine, zaliaruri etc. In f igura 11.9 esteprezentat spectrul de masa al citocromului C de cal, cu M = 12.360, in care picurileconsecutive d if era cu o unitate de masa.

M- 12360 Da

687,5

, i

700

r

1

800

(a)

H4

900

1

m/z

ra/z

773,0 773,25 773,5

(b)

773,75 774,0

Figura 11.9 Spectrul de masa al citocromului C de cal, molecula proteica avandM = 12.360 Da (a) si un spectru de mare rezolutie m domeniul

m/z = 772-774 (b), adica In domeniul Jncadrat cu linie punctata din (a)

In manunchiul izotopic(sailaglomerarea izotopica) (figura 11.9 b)toti ionii poartaacelasi numar de sarcinii,- iar din acest spectru este posibil sa se calculeze greutateamoleculara aproximativa si numarul de sarcini purtate de ionii Tn cauza.

Odata formafi, ionii pozitivi din camera de ionizare sunt indepartati cu ajutorulunui potential usor pozitiv aplicat unui ,,repulser", care este o placa metalica (incarcatapozitiv) si apoi sunt accelerati prin conducerea lor printre doua serii de electrozi intrecare se aplica diferente de potential foarte mari. Daca se admite un ion cu masa ,,m",energia lui cinetica depinde de campul electric cu potentialul V la care este supus ionulsi de sarcina sa z, astfel ca:

(111)

v = viteza pe care o primeste ionul

La iesirea din campul de accclerafie, energiile cinetice ale tuturor ionilor suntegale, ionii fiind animati de o mi§care rectilinie uniforma, dar vitezele lor difera Tnfunctie de masa lor (m) si de sarcina lor (z).

11.4. Defectoare

Pentru detecfia ionilor formajj in camera de ionizare, acceleraji si indepartati dinaceasta camera, se utilizeaza diferite tipuri de detectoare. Aceste detectoare trebuie safie foarte sensibile la sarcinile electrice transportate de ioni. Numarul de ioni individual!ai aceleiasi specii este de regula foarte mare, astfel ca semnalul este de tip analogic, darunele detectoare an o mare puterc de multiplicare, putand detecta impactul unui singurion, deci sunt extrem de sensibile.

In plus, trebuie sa existe certitudinea ca numarul de ioni detectati corespundenumarului de ioni produ?i, indiferent care ar f i masa lor. Spectrele de masa se objin prinbaleierea in camp magnetic.

Exista in practica analitic3 a spectrometriei de masa mai multe tipuri de detectoare,dintre care se prezinta pe scurt cateva.

1) Multiplication de electron! cu dinode separate. Dinoda este un electrod alunui tub electronic cu emisie secundara de electron! (de aceea acest electrod se numestecatod emisiv). Electronii emisi sunt accelerati in zece etape, de calre alti zece electrozi,dupa care sunt captati de anod (Figura 11.10).

catod dc coiiver.sk- dinode

(a)

(b)

• i

(c)

Figura 11.10 Sistem cu dinode separate si catod de conversie a ionilor Tn electron! (a)detaliu al catodului de conversie (b), si o sectiune Tntr-un tub multiplicator

cu multe dinode (c)

1 = catod de conversie; 2 = dinode; 3 = conversie in fotoni; 4 = conversia fotonilor Tnelectron!; 5 = flux de ioni; 6 = anod colector

456CAPITOLUL11 SPECTROMETRIA DE MASA

Practic, ionii ppzitivi se ciocnesc cle un catod de conversie care emite electron!,,multiplicati" de 10 3 dinode dispuse in cascada, asa cum se poate observe din figura11.10 (a), ceea ce confera acestui tip de detector o foarte marc sensibilitate. Multiplica-torii de tip dinode sunt reprezentati de figura 11.10 (b), iar tuburile multiplicatoare deelectron! (similare fototuburilor utilizate si in spectrofotometrie), numite si dynolit infigura 11.10 (c); fototubul multiplicator converteste mai Tntai ionii in fotoni, iar acestia

sunt transformaji in electron!.

2) Multiplication de electron! cu dinode continue (channeltron, In engleza).In acest caz, ionii sunt deviati catre un colector cu intrare in forma de cornet, confecfionatdin sticla dopata cu plumb, conul avand rol de catod de conversie. Acest catod emiteelectron! care sunt atrasi de un electrod pozitiv, iar socurile succesive si numeroaseproduse de electron! asupra peretilor produce multiplicarea lor, ca si in cazul dinodelorseparate. Acest tip de multiplicator este astfel conceput, incat axa lui sa nu coincida cutraiectoria ionilor, ceea ce protejeaza partea sensibila a detectorului de impactul speciilorneutre si astfel fotonii emisi de filament pot smulge electron!.

3) Detectorii cu microcanale sunt alcatuiti dintr-un numar foarte mare de micro-dinode continue (channeltroni) aranjate in forma de cuib de albine, avand un rolcorespunzand cu un fel de placa fotografica. Fiecare detector este constrtiit dintr-oportiune de microtub cu d.i. = 25 |J.m. captusit in interior cu un material semiconductor,care functioneaza ca o dinoda continua. si in acest caz fluxul mare de electron! emisi(similar unei avalanse) este captat de un anod, ceea ce permite inregistrarea simultana a

ionilor cu mase diferite.lonizarea se poate produce si cu plasma de argon cu detectie cvadrupol.

11.5. Performantele spectrometrelor de masaAceste performante depind de sensibilitatea determinaiii raportului m/z, iar masa

cea mai mare care corespunde acestui raport (in daltoni) depinde dc numarul sarcinilor

z ale unui ion.Asa dc exemplu, pcntru un raport m/z = 2000, se poate detecta o mass de 80.000 Da.dacii ionu l poar t f t 40 de sarcini. De regula, precizia u n u i MS-spectromctru se expr ima

Tn daltoni.Spectrele de masa se obtin prin baleiaje repetate, avand loc o reinnoire a ionilor

in f iecare moment. Sensibilitatea unui spectrometru de masa se exprima in masa cle probanecesara si consumata, care este de ordinul a catorva pg/s sau femtomol/s, caz in care seobtine un semnal normalizat. Evident ca sensibilitatea acestor aparate depinde de modul

de ionizare.O alta performanta care se poate atribui spectrometriei de masa este ,,rezolutia"

R, care depinde de largimea picului cle masa. Teoretic (dec! la modul absolut), un pic demasa nu trebuie sa aiba o largime, deoarece el reprezinta o masa precisa, dar examinarea

spectrelor cle masa arata ca nu este asa.

CAPITOLUL 11 SPECTROMETRiA DE W1ASA 457

Cu cat largimea picurilor de masa este mai mica si cu cat pulerea de separare apicurilor este mai mare, cu atat rezolutia este mai mare, iar spectrometrul de masa estemai performant. Rezolutia se poate calcula prin impartirea raportului m/z al p iculu i la

largimea picului Am/z, utilizand relatia:

m/zR =

Am/zsau R = -

Am(11-2)

in figura 11.11 este reprezentat un pic de masa si datele necesare calcularii rezo-lutiei (a) si un spectru de masa al unei probe continand plumb (b). Asa cum se observadin figura 11.11 (a), este marcata valoarea largimii picului la 1/2 din Inalf imea sa, iarpentru instrumentele electromagnetice si largimea picului la 10% din inaltime.

100

(b)

m/zr~

203 209

Figura 11.11 Reprezentarea unui pic de masa si datele necesare evaluarii rezolutiei (a)si un spectru de joasa rezolujie dat de o proba de plumb (b)

compozitia izotopica a plumbului: (1) A = 204:1,4%, (2) A = 206:24,1%,(3) A = 207:22,1%, (4) A = 208:52,4%;

simbolul plumbului: £,Pb ; R = 500

In cazul spectrometrelor de masa cu sector magnetic, rezolutia R este constants,iar Am variaza cu m. Cele mai mari rezokifii se obtin cu spectrometrele de masa curezonanta ciclotronica, pentru care R= 10.000.000, dec! exceptionala. In cazul spectro-metrelor pentru care Am = constant, limita de masa corespunde si valorii rezolutiei,deoarece, plecand cle la aceasta valoare. nu se mai poate face distinctie intre m si m+1.

Cunoscand puterea de rezolutie a unui aparat, se poate aprecia ,,puterea dedistinc(ie" a picurilor.

Asa de exemplu, pentru R = 300, se poate dis t inge intre picuri le cu m = 300 si cum + Am = 301, iar pen t ru R = 30.000, se pot dislinge p icur i le cu m = 300 si m + Am= 300,01.

458 CAPITOLUL 11 SPECTROMETRIA DE MASA

11.6. Tipuri de analizoare de masa

11.6.1. Analizorul cu camp magnetic

lonii format! in camera de ionizare, accelerati si indepartati de catre un repulser,sunt condusi in analizorul (filtrul de masa) cu camp magnetic, care esle un tub curbat,plasat Tntr-un camp magnetic perpendicular pe traiectoria ionilor pozitivi. De aceea,traiectoria lor rectilinie deviaza, devenind curbata, in functie de valoarea raportului m/z,asa cum rezulta din figura 11.12.

camp magnetic

\

tensiune deaccelerare

siirsa

de ioni

Figura 11.12 Analizor de masa cu simpla focalizare

Deoarece campul magnetic exercita o forta centripeta care echilibreaza forfacentrifuga (mv /r) generata de miscarea circulara uniforma a ionilor, numai ionii careau o raza de curbura r ce coincide cu raza de curbura a analizorului (tubului) pot sa-siurmeze drumul pana la colector, ceilalti se pierd in interiorul instalafiei. Este importantfaptul ca, sub actiunea campului magnetic, are loc o usoara dispersie a ionilor cu masediferite, deci cu rapoarte m/z diferite, ceea ce asigura concentrarea (focalizarea) lor petraiectorii separate si captarea lor in locuri diferite (ex.: nij/Z], m2/z2, 1113/23 ?i ni4/z4).Campul magnetic are o intensitate de I = 1 Tesla (10.000 Gauss).

Analizoarele cu simpla focalizare au o rezolutie mai scazuta, dar cele cu dublafocalizare au o rezolutie mare(vezi figura 11.13).

Cu analizoarele de acest tip se pot analiza compusi cu mase pana la 3500 u.a.m.,cu rezolutii cuprinse Tntre 10.000-150.000 (pentru 10% depresiune), iar vitezade baleiaja campului magnetic este mai mica decat in cazul altor analizoare.

CAPITOLUL 11 SPECTROMETRIA DE MASA 459

11.6.2. Analizorul electromagnetic

Analizorul electromagnetic primeste ionii accelerati si indepartati din camera deionizare in doua module sau componente, unul electrostatic si altul magnetic, perpendicu-lar pe traiectoriile ionilor, ceea ce asigura separarea ionilor, cu o mare rezolutie, darnumai pentru mase nu prea ridicate. In figura 11.13 este prezentat modulul conjinandsectorul electrostatic si eel magnetic.

V

Figura 11.13 Schema unui analizor electromagnetic cu dubla focalizare

P = proba;CI = camera de ionizare; V = vid; SE = sector electric; SM = sector magnetic;Col. I = colector ioni; TS = trasare semnal; R = curbura sectoarelor.

Trebuie precizat ca, din numarul total de ioni pozitivi format!, accelerati cu maimultc placi incarcate cu potentiale negative din ce in ce mai mari, numai 5% ajung ladetector. Viteza ionilor accelerati detennina o usoara dispersie a energiei cinetice aionilor, care se poate neutraliza, conducand ionii prin sectorul electric, adica doi electrozicilindrici concentric!. Acest sector are rol de filtru de energie cinetica si, datoritacampului sau radial, el are si rolul de a focaliza fluxul de ioni pe directia de deplasare,redresand traiectoriile lor la intrarea in sector.

Apoi, sunt condusi in sectorul magnetic care este de fapt analizorul magneticcurbat in care ionii sunt separati dupa raportul lor m/z. Analizorul magnetic se mainumeste si prisma magnetica si are, prin urmare, rol de focalizare pe directie a ionilorcu acelasi raport m/z in punctul F2, dupa ce tree prin fanta F! (figura 11.13)

Analizorul cu dubla focalizare (figura 11.13) realizeaza focalizarea pe directie siin energia cinetica si el realizeaza si o corectare a abaterilor unghiulare si energetice aleionilor.

460 CAPITOLUL 11 SPECTROMETRIA DE MASA CAPITOLUL 11 SPECTROMETRIA DE MAS A 461

11.6.3. Analizori cu capcane de ioni

1) Analizorul cu capcana de ioni si cu rezonanta ciclotronica. Si in acest cazionii forma|i si acumulati in camera de ionizare sunt accelerati de forte electrostatice simagnetice. Pentru un raport m/z dat si in functie de intensitatea fortelor mcntionate, ioniiexcitati (accelerafi) sunt evacuati si apoi colectati de catre un sistem de detectie al caruisemnal este proportional cu intensitatea fiecarui fascicul ionic.

Modul de functionare al analizorului cu rezonanta ciclotronica se bazeaza peprincipiul capcanei magnetice a ionilor si are performante deosebite Tn ceea ce privesteprecizia determinarii masei.

Practic, ionii format! Tn camera de ionizare (de exemplu, prin impact electronic)sunt supusi actiunii unui camp electric slab si unui camp magnetic intens care se exercitaperpendicular pe directia ionilor. De aceea, acest camp magnetic imprima ionilor omiscare circulara Tn planul de propagare, raza cercului fiind data de relatia urmatoare:

- mV (11.3)qH

cledusa din (11.4)

q = sarcina Tn coulomb!;v = frecventa Tn m/s;H = intensitatea campului magnetic Tn tesla;in = masa Tn kg.

Miscarea circulara a ionilor este prezentata schematic Tn figura 11.14, iar Tn f igura11.15 este reprezentata o schema a capcanei ionice.

z

semnal

Figura 11.14 Traiectoriile circulare aleionilor in carqpul magnetic, in ciclotron

Figura 11.15 Schema unei capcane ionicemagnetice

1 si 2 = placi detectoare de semnal;3 si 4 = placi atragaloare de ioni;5 si 6 = placi de excitare a ionilor.

Raza cercului data de ecuatia (11.3) este destul de mica pentru o frecventa v mica—>

si un camp magnetic Hslab (R = cativa mm), astfel ca ionii pot fi antrenati pe o traiectoriecirculara chiar Tn camera de ionizare, Tn condifii de vid Tnaintat si de respingere a ionilorde catre peretii capcanei.

In aceste conditii se poate descrie frecventa ciclotronului utilizand relatiilefrecventei si a vitezei unghiulare co(frecven|a ciclotronului se mai numeste si frecvenjagiromagnetica):

v = coR, co = 27tv

de unde:v =

2ian

(11.5)

(11.6)

Asa cum se observa din relajia (11.6), frecventa unui ion (v) depinde de masa lui ,dar nu depinde de viteza lui, ceea ce explica faptul ca, la un moment dat, frecventeleionilor cu mase diferite sunt cu atat mai diferite, cu cat sunt mai multi ioni prinsi incapcana magnetica. Aceste diferente stau la baza analizei maseior prin determinarea catmai precisa a frecventelor diversilor ioni (deci abundenta lor).

Intensitatea campului magnetic, in celufe clreptunghiulara (sau circulara), este

H=3-8 tesla. Acest camp este creat de un solenoid supraconductor existent in capcana.

Ionii format! prin impact electronic sunt obligati sa urmeze traiectorii circularecu o frecventa caracteristica fiecaria dintre ioni, fara a se putea detecta vreun semnal.Pentru detectarea diferitelor frecvenje ale diversilor ioni, este necesar sa se impuna unimpuls scurt, de 1 (is, al unei benzi de radiofrecventa care sa includa toate frecventelece urmeaza sa fie detectate. Acest impuls determina o crestere a razelor orbitelor lorcirculare, datorita energiei pe care o primesc ionii. Ionii care au aceeasi masa incep sase intoarca in faza si sa treaca aproape de placa detectoare superioara. Practic, tofi ioniiproduc un semnal care se poate detecta, semnal care se numeste intcrferograma si caredepinde de timp [I = f(t)]. Desigur ca intensitatea semnalului scade pe masura ce scadeexcitatia care inceteaza la un moment dat. In condifiile de functionare a analizorului (siimplicit a spectrometrului de masa), calculatorul efectueaza o analiza Fourier, facandtrecerea de la I = f(t) la I = f(v), deci de la o funcjie de timp a interf erogramei la o functiede frecventa. respectiv la functia de masa I = f(m/q), obtinandu-se Tn final spectrui demasa.

In conclude, acest detector permite separarea ionilor format! Tn camera deionizare, tot pe baza diferentei dintre rapoartele lor m/z, dar spectrele de frecventa suntob^inute prin transformarea Fourier, ceea ce permite o mare precizie in masuratorile demasa. De altfel, frecventa este o expresie a fiecarui flux (raza) ionic, iar amplitudineafiecarei raze (frecventa) este proportionala cu abundenta fiecarui ion, deci cu nuniarulde ioni din fiecare specie ionica produsa in camera de ionizare.

462 CAPITOLUL11 SPECTROMETRIA DE MASA

2) Analizorul cu capcana de ioni (Ion Trap Detector - ITD). in camera de ioni-zare sunt plasati trei electrozi a caror suprafafa interna este hiperboloidala. Unul dintreacesti electrozi este inelar, iar ceilalti doi alcatuiesc peretii superior si inferior ai camereide ionizare. Electrodului inelar central i se aplica un potential alternativ de frecventaradio fixa, iar electrozii superior si inferior sunt legati la masa. Acest camp are rol decapcana pentru ionii formafi prin bombardament ionic (impact ionic) sau prin ionizarechimica. care sunt mentinuji in rezonanta ciclotronica pana ce se mareste amplitudineavariatiei de potential, moment in care ionii ajung la o stare de instabilitate. Ca urmare,se produce o crestere a amplitudinii de oscilatie pe directia axiala, astfel ca la un momentdat, ionii sunt evacuati din capcana in mod secvential, in functie de rapoartele m/z.Fluxurile de ioni separate sunt colectate de sistemul de detectie.

Detectorul de acest tip are o rezolutie medie pentru domeniul de masa 30-650u.a.m. si este potrivit pentru identificarea simpla si pentru dozarea ionilor format! prinfragmentare.

11.6.4. Analizorul cu filtru cvadrupolAcest tip de analizor este utilizat intr-un mare numar dc analize care nu necesita

o foarte mare rezolutie. El este preferat in astfel de cazuri, fiind mai putin costisitor, cuo constructie mai simpla, relativ comoda §i functioneaza numai cu un camp electric. Inplus, acest tip de analizor necesita un vid mai putin avansat si se poate cupla cucromatografia in faza gazoasa si cu plasma cuplata inductiv pentru analize de gaze, deaer etc. Prin urmare, acest analizor este utilizat pentru f iltrarea, focalizarea si separareacurentilor ionici prin oscilatii in camp electric de inalta frecventa. Analizorul cvadrupoleste alcatuit din patru bare de 10-20 cm, conexe dona cate doua, astfel racordate incat sase creeze intre ele o diferenta de potential, cum se poate observa din f igura 11.16.

+U1 ! '-U

(a) (b)

Figura 11.16 Sectiune printr-un cvadrupol (a) si schema unui cvadrupol (b)

Doua bare sunt incarcate pozitiv (+) si doua negativ (—), fiecarei perechi deelectrozi aplicandu-i-se cate un voltaj, decalat cu 180°, deci care alterneaza. Peste aceastatensiune se suprapune un camp de inalta frecventa (cvadrupolul nu necesita un electro-magnet, de aceea este mai ieftin).


Ionii care parasesc camera de ionizare sunt orientati spre cvadrupol, care este vidatsi obligaji sa se deplaseze rectiliniu de-a lungul axei O-z. Cand un ion patrunde incvadrupol prin punctul ,:O", el intra de fapt in spatiul central dintre cele patru bare, careeste practic un ,,canal", cu axa O-z, Traiectoria acestui ion pozitiv este determinate decomponentele vectorului vitezei in cele trei direcfii xyz, iar peretii acestui canal atragsau resping ionul in f uncjie de polaritatea lor. Asa se explica f aptul ca ionul se deplaseazaintre doua bare incarcate pozitiv care-l focalizeaza (orienteaza) pe axa O-z intr-undomeniu de potential, numit ,,zona de stabilitate", in timp ce barele incarcate negativ ildefocalizeaza, ceeace face sa apara o bosa de potential (cocoasa) instabila in planul yOz.

Prin urmare, tensiunile alternative (+ si -) sunt defazate intre perechile de bare,iar campul rezultant este alcatuit din doua parfi, una fixa si alta variabila. de aceea ioniicare intra in cvadrupol sunt supusi unei forte variabile ca intensitate si directie, ceea ceface ca ionii sa aiba traiectorii complexe. de regula instabile, in forma de elice (respectivde tirbuson) in cele trei dimensiuni xyz.

Este important faptul ca exista analizoare cu tandem de 2-3 cvadrupoli cuplati cuun gazcromatograf, care asigura separarea prealabila a componentelor din probe multi-componente. Acest lucru este necesar mai ales in cazul amestecurilor de componeneticare dau mai multe picuri fiecare, ceea ce are ca efect suprapunerea semnalelor maimultor componenti, astfel ca este practic aproape imposibil de interpretat un astfel despectru de masa. Mai mult, in cazul urmelor de compusi, suprapunerea spectrelor(semnalelor) poate da un zgomot de fond (datorat scurgerii coloanei) care modifiesintensitatea picurilor. In astfel de cazuri, prin utilizarea unui analizor SM/SM, care seobjine prin asocierea mai multor cvadrupoli, se poate imbunatati rezolutia si implicitpreciziaanalizei. In f igura 11.17 este prezentat un cuplaj de trei cvadrupoli legati in serie.

Figura 11.17 Schema unui spectrometru de masa cu analizor In cuplaj de trei cvadrupoli

1, 2 sj 3 = vid; 4 = camera de ionizare; 5, 6 si 7 = cvadrupoli; 8 = camera de coliziune;9 = Ar, gaz de coliziune; 10 = detector, 11 = catre recorder; O = punct de intrare incvadrupol


Trebuie precizat ca, din punct de vedere constructiv, montarea cap la cap a celortrei cvadrupoli distinct! nu este posibila din punct de vedere tehnic, de accea de regula secupleaza, de exemplu, doua analizoare in serie sail doi cvadrupoli si separat al treilea sause cupleaza un modul magnetic cu un cvadrupol sau un analizor cu timp de zbor (TOP =time of flight) cu un cvadrupol etc. Asa cum se observa din f igura 11.17, Tntre cvadrupolii(5) si (7) este intercalatS o camera de coliziune in care este inclus un al treilea cvadrupol.

Primul cvadrupol are rolul de filtru ionic, care selecjioneaza unul din ionii careprovin din substanta de analizat. lonul selecjionat este condus in camera dc coliziunepentru a fi fragmentat din nou cu un gaz, cum este argonul sau chiar azotul. Ionii generatide ionul selectionat sunt condusi la un al doilea analizor cvadrupol, dupa care seinregistreazS :,spectrul de fragmentare" al ionului selectionat (ceilalti ioni formati insursa de ioni, adica in camera de ionizare, sunt exclusi). Cvadrupolul (6) (dec! al doilea)este folosit drept camera de coliziune cu gazul de fragmentare, fiind alimentat cu otensiune alternativa mica, iar in acest analizor presiunea este mare.

Acest tip de analizoare sunt utilizate pentru determinarea tuturor ionilor generatide ionul selectionat de primul cvadrupol - filtru, considerat ca un precursor. Este posibilca un astfel de analizor sa fie utilizat pentru cunoasterea precursorilor unui ion selectio-nat .cu eel de al treilea cvadrupol folosit in acest caz ca filtru.

11.6.5. Analizorul cu timp de zbor

Analizorul cu timp de zbor - TOP (time of flight) functioneaza pe relatia careexista intre masa si vitezele ionilor formati in camera de ionizare, ioni care avandrapoarte m/z diferite, au si viteze de deplasare (zbor) diferite. Ionii formati in sursa deioni sunt expulzati sub forma de ,,pachete" sau fascicule de ioni (razS de ioni sau curentionic) cu ajutorul unor impulsuri de potential scurte, de 2-30 kV, care se repeta de zecide ori intr-o secunda pentru a parcurge o distanta liniara determinata L, fara interventiaunui camp oarecare. Relatia amintita reuneste distanta liniara ,,L" cu masa ,,m" si timpul,,t", utilizand doua relatii simple:

!/2mv2 = qU si L = vt

U = tensiunea in V, iar v = viteza

din care, prin eliminarea lu i ,,v" . se objine:

ELq

'2LJ

L2

(11.7)

(11.8)

Daca se considers ca masele a doi ioni, incarcati cu cate o singura sarcina, suntegale cu n^ = 29, iar m, = 33 daltoni si ca L = 1 m, U = 2000 V, iar t = 8,51 LIS, raportultimpilor de zbor este cgal cu 0,934.

Cu astfel de analizoare se pot determina compusi cu mase foarte mari, de pana la300 kDa, insa rezolutia depinde de precizia cu care se masoara timpii de zbor (parcurs),precum si de dispersia energetica a ionilor. Pentru a obtine rezolujii corespunzatoare, seutilizeaza ionizarea cu laser, cand fonnarea ionilor este practic instantanee, in catevananosecunde si un reflector de ioni, cu rol de respingere a ionilor. In aceste conclitii, ion i ipozitivi cei mai rapizi pStrund in zona campului reflectorului si sunt respinsi maiputernic, ceea ce contribuie la corectarea timpilor de zbor, facilitancl astfel focalizareaionilor cu aceeasi masa la detector si, in acest fel, separarea diferitelor f luxuri de ioni siobtinerea spectrului de masa. Schema constructiva a unu i spectrometru de masa cu timpde zbor este prezentata in f igura 11.18.

1+++3++4 5 6

•:m,if.

m.

in,

PV

Figura 11.18 Schema constructiva a unui spectrometru de masa cu timp de zbor

1 = introducerea probei, 2 = modul de ionizare MALD1; 3, 4 = grila de extracfie siaccelerare; 5 = colector-piaca multicanal; 6 = multiplicator de electron!; 7 = iesiresemnal; 8 = recorder (spectru de masa); PV = pompa de vid.

De precizat ca grila de accelerare are o cadere de potential de 5000 V, lungimeatubului de zbor este L = 1 m si ca in camera de ionizare exists vid. Pentru focalizareaionilor este necesarS o oglinda electrostatics cu care se face o focalizare a t impulu iionilor care, desi au aceeasi masa, au energii initiale diferite. De asemenea, este importantfaptul ca acest tip de analizor are o rezolu|:ie relativ mare, de cateva sule.

Tot pe timpul de zbor (sau de parcurs) se bazeaza si unele analizoare portative cumobilitate ionica, numite si spectrometre cu mobilitate de ioni, IMS, in care ionii suntobligati sa se deplaseze spre detector intr-un tub care functioneaza la presume atmos-ferica, diferind astfel de analizoarele cu tirnp de zbor sub vid. In figura 11.19 esteprezentata o schema constructiva acestui analizor.

466 CAPITOLUL11 SPECTROMETRIA DE MASA

10

M

Figura 11.19 Schema constructiva a unui analizor cu mobilitate de ioni

1 = introducere proba, 2 = grila pentru ionii initial!, 3 = electrozi, 4 = grila finals, 5 =intrare aer, 6 = colector de ioni, 7 = iesire aer, 8 = sursa de 63Ni, 9 = ioni formaji inreactie, 10 = ioni reactanti proveniti din aer

Asa cum se observa din aceasta figura, componen{ii probei introclusa prin (1) sunt

supusi interactiunii cu raze p~ emise de o sursa de nichel ""Mi (8). In prezenta aerului seformeaza agregate ionice ale componentelor din aer, cum sunt: [(N2)x(H2O)yH] si[(N9)X(H:>O),,O2]~, care tiiid sa se f ixeze pe moleculele de analit existente in proba, potri-vit cu afinitatea lor electronica. Prin urmare, in acest caz se produce o ionizare chimicaa analitilor din proba sub actiunea agregatelor ionice din aer, rezultand un aerosol carese deplaseaza spre detector sub actiunea unui camp electric creat de electrozi (3). Zboruldureaza cateva milisecunde, mobilitatea ionilor depinzand de masa ionilor, de marimeasi sarcina lor, de temperatura si de presiunea aerului.

Acest analizor este utilizat in cercetarea unor compusi tinta ai unor substantecunoscute, sensibilitatea detectiei fiind de ordinul ppb.

11.7. Unele apSicatii analitice ale spectrometriei de masa

De regula, detectia compusjlor organici, inclusiv medicamentosi, nu se face prinspectrometrie dc masa, decat daca ei se afla in stare pura. Dar substantele medicamen-toase. care trebuie sa fie detectate si dozate prin spectrometrie de masa, se gasesc inamesteccu alte substanfe, deci in matrici complexe, ceeace implicapretratareap.realabilaa probelor prin extractie si purificare. Din aceste considerente, spectrometria de masa seutilizeaza in cuplaj cu HPLC sau / si GC, legand capalul de iesire al coloanei la camerade ionizare a unui spectrometru de masa. In acest fel se poate analiza fiecare fractiune(pic) care iese din coloana cromatografica. pe masura ce avanseaza elutia, inclusiv incazul urmelor de substante existente in proba.

Aceste cuplaje sunt utilizate la detectia si dozarea moleculelor organice, inclusivmedicamentoase, din matrici complexe, cum sunt cele biologice (biochimice), sau dinextractele de plante, ceea ce face posibila detectia lor din urina, sange, plasma, tesuturi,


precuin si studiul biodisponibilitajii si al metabolismului medicamentelor. De asemenea,spectrometria de masa este utilizata in analiza elementala si in aceea a amestecurilorizotopice si in studiile de structura a substanfelor organice.

Trebuie insa sublimate cateva dintre dificultafile care apar la realizarea acestorcuplaje, determinate de cantitatile mici si foarte mici de substante care se gasesc inefluentii cromatografici (lichizi si gazosi), de prezenta eluentilor in efluenli, de presiu-ni le diferite din cromatograf si din spectrometru I de masa. precum si de nevoia armoni-zarii timpilor de iesire a picurilor cromatografice cu inregistrarea spectrelor de masa.Acest ultim aspect este important pentru obtinerea unor rezultate reproductibile, pentruasigurarea unor inregistrari repetate ale maximelor spectrelor, de o parte si de alta apicului.

Pentru exemplificarea acestor aspecte, trebuie spus ca in procedecle cu baleiajrepetat, analizoru! trebuie sa baleieze mai multe sute de un i t a t i de masa, cu o cadentilde cca. 10 spectre pe secunda.

Baleiajul repetat (sau repetitiv) se face pe tot parcursul elutiei, iar picurilecromatografice sunt restabilite fie utilizand curenlul total de ioni colectati in timpul unuibaleiaj, realizandu-seasazisa,,cromatogramademasa", fie utilizand curentii ionici cores-punzatori ionilor, deci ,,fragmentogramele".

Prin urmare, raspunsul depinde de numarul de achizitii, deoarece curentul ionictotal obfinut reprezinta suma curentilor individual! memorati, fiind necesar sa fieutilizate analizoare cu baleiaj rapid, cum sunt cele cu timp de zbor, cu cvaclrupol sau cucapcana de ioni

11.7.1. Cuplajul gazcromatografie-spectrometrie de masa(GC-MS)

In practica analitica este utilizat mai ales acest cuplaj, deoarece cuplajul HPLC-SMeste mai greu de realizat, datorita necesitatii de eliminare a faze! mobile, in special candaceasta este apa, care stanjeneste functionarea corecta a spectrometrelor de masa. Infigura 11.20 sunt prezentate schema generala de cuplaj (a), prin intermediul unui tub detransfer (b) si prin intermediul unui separator cu jet molecular (c).

468 CAPITOLU L 11 SPECTROMETRIA DE MAS A

regulator dc

pmltinu

Icic dc injcclic

u probcl

partea dc gazcromatografie (scpararc)

(a)

partca dc spectrometrie dc masa(dctcctic si dctcrminarc cantitativa)

col Da i) 3

(2 mi-tain)

GC

1 1

1 1

I - 11 (Sml/min) +

i

(M <6'5c?l11

inanta dc

incal/iri1

_- * SM

transfer capilarfi

(0,5 ml/min)

re

/min)

GC

(C)

Figura 11.20 Schema generala a cuplajului GC-MS (a), a tubului de transfer (b)si a separatoralui cu jet molecular (c)

In realizarea acestui cuplaj, faza stafionara trebuie sa aiba o volatilitate foartescazuta si o mare stabilitate termica, pentru a se evita complet orice distilare, deoarece odistiiare chiar minima perturba traseele spectrometrului. De asemenea, trebuie utilizatun gaz inert chimic pentru a nu interfera traseele mentionate. De aceea se utilizeaza deregula heliu si hidrogen, care Tndeplinesc aceste conditii, spre deosebire de azot, care nuse poate utiliza, deoarece da doua picuri cu maselc m, = 28 si m2 = 29. Cand sunt utilizatecoloane umplute, devine importanta diferenja de presiune dintre iesirea din coloanacromatografica sj intrarea in spectrometrul de masa.

Pentru atenuarea acestei diferenfe se utilizeaza separatoare intre gazcroamtografsi spectrometrul de masa, pentru reducerea presiunii efluentului (eluatului)^gazos. con-comitent cu imbogatirea vaporilor cu analiji prin eliminarea gazului vector. In plus, prin


utilizarea tinor coloane capilare cu debit mic este posibila introducerea clirecta a efluen-tului care iese din gazcromatograf Tn spectrometrul de masa, fara nici o interfata.

DacS se admite ca se separa, de exemplu, un compus organic molecular, M,dintr-un amestec muiticomponent, prin gazcromatografie, acesta este condus direct dincoloana cromatografica in camera de ionizare, in care are loc fragmentarea compusuluimolecular prin impact electronic cu un flux deelectroni de 70 eV. Se admite ca seformeaza patru ioni notati cu ni|, m->, m^ si m4 si ca pentru formarea pr imulu i ion(principal) se consuma 10-15 eV, iar reslul energiei provoaca ruperea Legaturilor iniera-tomice interne cu formarea ultimilor ioni molecular!. Pentru separarea ionilor molecu-lari, aces.tia sunt condusi Tn sectorul magnetic, care este de fapt analizorul magnetic, sauin doua sectoare consecutive, unul electric ?i altul magnetic, realizandu-se Tn acest dinurma caz o dubla focalizare, asa cum se poate obsefva din figura 11.21 (b). Separareacelor patru ioni molecular! se observa mai bine din figura 11.21 (a), pentru ca detaliulsepararii este desenat mai bine decat Tn figura (b), Tnsa separarea prin sistemul de dublafocalizare, care se numeste Nier-Johnson este mai buna, mai neta.

detector

Figura 11.21 Schema dublei focalizari Tn camp electric si apoi magnetic (b) si schemasepararii ionilor molecular! mi, mz, ma si m4 In camp magnetic (a)

SE = sector electric, SM = sector magnetic

11.7.2. Cuplajul cromatografie de lichide-spectrometrie demasa (HPLC-MS)

Cuplajul HPLC-MS se aplica in cazul substanfelor volatilizabile, dar stabiletermic, precum si pentru analiza moleculelor polare sau termolabile, in acest din urmacaz nef i ind obligatorie derivatizarca prealabila a analitilor. Este important f aptul ca acestcuplaj se poate adapta sj utiliza pentru analiza peptidelor, nucleotidelor. nucleozideior s,ia altor molecule biologice si pentru moleculele de substante medicamentoase, in specialpentru antibiotice.

Insa asa cum s-a mai subliniat, Tn cazul acestui cuplaj este relativ dificil sa serealizeze si sa se stapaneascS interfata dintre HPLC si MS, mai ales atunci cand seutilizeaza ca faza mobila apa care, patrunzand in spectrometru, modifies presiunea Tn

470 CAPITOLUL 11 SPECTROMETRIA DE MASACAPITOLUL 11 SPECTROMETRIA DE MASA 471

camera de ionizare (sursa de ioni). Pentru a se evita asemenea interferente, este necesaraeliminarea intr-o masura cat mai mare posibila a eliientului si mai ales a apei, printr-unsistem de pomparc potrivit, astfel incat eluentul ramas sa poata participa la ionizareachimica a substantelor de analizat, in acest caz apa jucand acelasi rol ca un gaz reactiv.

Trebuie subliniat inca un aspect important si anume acela ca prin utilizarea unuiastfel de procedeu de indepartare a apei in sursa de ionizare se poate asigura o presiunemai mare decat in cazul impactului electronic, ceea ce este compatibil cu constrangerileHPLC determinate de presiune. Practic, in cuplajul HPLC-MS, trebuie gasit un com-promis intre debitul fazei mobile in HPLC, pulverizarea sa si indepartarea excesului ei,astfel incat sa se poata asigura o presiune compatibila cu procesul de ionizare ininteriorul sursei de ioni.

In figura 11.22 este prezentata o schema constructiva a cuplajului HPLC-MS.

Figura 11.22 Schema constructiva a cuplajului HPLC-MS

1 = camera de desolvatare prin eliminarea excesului de apa (eluent); 2 = sistem deTncalzire; 3 = camera de ionizare a spectrometrului de masa; P| = 25.000 Pa, P? = 500Pa, P3 = 50 Pa, iar P4 = 0,002 Pa.

Dispozitivele de cuplare a GC cu MS (Figura 11.20 (b) si (c)), adica tubul inter-mediar de transfer si separatorul cu jet molecular, se pot utiliza si pentru cuplajulHPLC-MS, dar mai potrivita este interfafa in care se utilizeazS un separator cu fasciculde particule (c).

In prezent exista mai multe sisteme care se pot cupla sau combina pentru a se creaconditii precise si eficiente de utilizare a acestui cuplaj de analizci si control:

- divizareaefluentului;

- reducerea debitelor intre 10-150 uL/min pentru coloane de 2 mm;

- utilizarea unor microcoloane de 5-10 u.L/min;

- pomparea criogenica a azotului lichid;

- pulverizarea (nebulizarea) sub presiune cu traversare prin diafragme;

- evaporarea si formareajetului de gaze.

Dintre accste sisteme se descriu succint doua mai frecvent utilizate:

1) Sistemul cu diafragmd in care capatul de iesire al coloanei HPLC este legat lao sonda cu rol de reglare a presiunii in domeniul 1 -3 bar! pentru formarea unui jet. Varfi.ilmetalic al sondei este format dintr-o diaf ragma care este strapunsa de un orificiu centralde 5 (-tin, iar un robinet-ac permite obtinerea presiunii necesare formarii unui jet la iesireafluidului din sonda, jet care se disperseaza (fragmenteaza) in picaturi minuscule. Pica-turile jetului patrund intr-o incinta de desolvatare prin liofilizare (cu ajutorul unei pompecriogenice puternice), iar dupa aceasta uscare intra in camera de ionizare. Prin urmare,inoleculele de solvent ionizate prin impact electronic actioneaza ca reactiv de ionizare aanalijilor. Cu aceasta tehnica se pot prelucra si analiza efluenti care pot confine pana la85% apa.

2) Sistemul cu jet gazos, termospray, in care capatul de iesire al coloanei estecuplat cu un tub metalic capilar a carui temperatura se mareste progresiv, pe toatalungimea sa, prin programarea unui termocuplu.

In aceste condifii se formeaza un jet gazos, de ceata fina, formata din picaturilede solvent si de particule de substante de analizat, care sunt volatilizate complet atuncicand intra in camera de accelerare, adica in sursa de ioni, iar o pompa auxiliara, pozitio-nata la capatul opus al capilarei, asigura indepartarea excesului de solvent. Ionizareamoleculelor se produce chiar in capilara, odata cu evaporarea solventului. moment incare creste densitatea sarcinilor electrice in jurul particulelor de analiji. In figura 11.23este prezentata o schema constructiva si de functionare a cuplajului HPLC-MS (ter-mospray).

Figura 11.23 Schema constructiva a cuplajului HPLC-MS - termospray

1 = dinspre coloana cromatografica; 2 = lichid; 3 = dispozitiv deincalzire; 4 = incepereavaporizarii; 5 = vaporizare totala; 6 = sursa de ioni; 7 = repulser; 8 = pompa criogenica;9 = filtru de masa. *'


Pentru a favoriza ionizarea si cresterea niimarului de sarcini, se introduce in fazamobila utilizata Tn HPLC o sare de amoniu a carei prezenta determina formarea unorasociatii cu analitii, numiti ,,dusteri", a caror marime scade pe masura ce avanseaza incapilara.

Aceasta ionizare este blanda, de aceea nu necesita o alta sursa de energie, decatschimbul de proton i. In acest fel se obtin curenti ionici ai ionilor pozitivi si negativi, acaror intensitate poate f i mare.

B + NHj— >BH+ + NH3

B + CHsCOCT — > B~ + CH3-COOH

Cand se lucreaza in polaritate de faze inverse, ionizarea saruri lor necesita o fazamobila care sa contina eel putin 1 0% apa. Sarea cea man utilizata este acetatul de amoniu0.01 M si 0,001 M, iar in cazul in care nu se introduce aceasta sare in faza mobila, eatrebuie sa se adauge post-coloana HPLC. In sfarsit, analitii sunt injectati in cantitati de|-ig, iar limita de detectie este de ordinul nanogramelor.

11.7.3. Identificarea unei molecule de analit

Identificarea oricarei molecule de substanta organica se face prin comparareaspectrului sau de masa cu un spectru al aceleiasi substante existent intr-o biblioteca clespectre sau cu un spectru de masa al aceleiasi substance, dar de puritate standard (maimare de 99,95%). De fapt, identif icarea unei molecule organice se face prin spectrele demasa date de elementele mai frecvente pe care !e contin (Tabelul 1 1 .1).

Tabelul 11.1 Elemente mai frecvent intalnite in compusi organic!

Element

Hidrogen

Carbon

Azot

Oxigen

Fluor

Sulf

Clor

Masa atomicau.a.m.

1,00794

12,01115

14,00674

15,99940

18,99840

32,066

35,45274

%

'H (99,985)2H (0,015)

12C (98,90)I3C (1,10)14N (99,63)LvN (0,37)

1^0 (99,63)]10 (0,04)1SO (0,20)19F (100)32S (95,02)JJS (0,75)j4S (4,21)

35C1 (75,77)37C1 (24,2.3)

Masa (Da)

1,0078252jJ3J4050

12,00000013,003355

14,00307415,000108

15,99491516,99931117,999160

18,998403

31,97207032,97145633,967866

34,96885236,965903


Trebuie avut in vedere ca izomerii aceleiasi substante pot da spectre apropiate,insa practic spectrele lor nu sunt riguros identice, decat in cazuri extrem de rare, fn cazulizomerilor optici, acestia pot fi diferentiati prin timpul lor de retentie pe coloanecromatografice potrivite.

Cele mai precise informal!! le ofera spectrele obtinute prin ionizare cu impactelectronic care produce fragmentarea maxima, cu cea mai mare abundenta.

11.7.4. Determinarea formulelor brute

In acest scop se pot utilizadona procedee, unt i l bazat pe abundentele izotopice, iaraltul pe spectrele de inalta rezolutie.

1) Procedeul bazat pe abundentele izotopice tine seama de faptul ca, inclusiv incazul unui com pus chimic pur, nu se obtine un singur spectru de masa, ci un ,,amestec despectre de masa", datorita faptului ca elementele naturale sunt formate din doi sau maimulti izotopi si de aceea pentru o formula bruta exista un amestec izotopic molecularcaracteristic ale carui proprietati se pot calcula.

Asa de exemplu, pentru spectrul dc masa al bioxidului de carbon se admite ca acestaeste un amestec de spectre de masa, datorita faptului ca in molecula CO2 intra mai mul t iizotopi ai carbonului si oxigenului:

I2c 13'C 12C

CO/ co2- CO/16'02

I 6'O, Ifi etc.

'0,

Desigur ca abundenta izotopilor naturali este cunoscuta si se poate lua la nevoiedin tabele. Se stie ca, fata de I2C, in carbonul natural exista numai 1,08% 13C, iar fatade O, exista in oxigenul natural numai 0,2% ISO.

In schimb, fa{a de ^C\, exista in clorul natural 33% 37C1, iar fata de 79Br, existain bromul natural 97,5% 81Br.

Prin unnare, existenfa amestecurilor izotopice in divers! compusi conduce laspectre complicate, dar abundenta si localizarea lor in ioni molecular! de forma M+ + 1,M + 2 sau M + 3 permite determinarea formulei brute a diversilor ioni, daca spectro-mctrul este destul de sensibil. Cu altecuvinte, intensitatile diverselor picuri de masa, carealcatuiesc amestecul izotopic al ionnlui ini t ial , reflects abundentele izotopice naturaleale elementelor prezente, ceea ce iinpune utilizarea unui program cle calculator pentrudeterminarea formulei brute.

2) Procedeul bazat pe rezolutia inalta a spectrului prin tehnica ,,peak matching"(compararea picurilor) face posibila determinarea directs a formulei brute, p r in deter-minarea masei ionului cu o mare precizie. In acest caz se poate sesiza orice ambiguitatepc baza cunoasterii exacte a elementelor prezente si a maselor lor cu o precizie de 4-5

474 CAPITOLUL 11 SPECTROMETRIA DE MAS A

zecimale. De altfel, spectrometrele de masa si cuplajele care includ aceasta metoda deanaliza ofera masa moleculara cea mai apropiata in funcfie de masa folosita, deoareceele sunt asistate de calculator. De asemenea, pentru reducerea calculelor exista sialgoritmi. care tin seama de masele elemetelor care alcatuiesc moleculele cercetate. Intabelul 11.1 sunt date masele atomice ale izotopilor catorva elemente mai importante.

11.7.5. Stabilirea formulei moleculare

Spectrele de masa pot fi utilizate cu sanse mari de certitudine pentru stabilireaformulei moleculare a unei substante, deoarece pozitia fiecami pic care provine dinfragmentarea unui ion precedent (exceptand cazul unor rearanjari) ofera informatii carese pot utiliza pentru stabilirea ionului in cauza.

Spre exemplu, prezenta unui pic cu (M-l)+ inseamna ca acest ion s-a format prinpierderea unui atom de hidrogen, iar prezenta unui pic cu masa (M-l5)+ inseamna caacest ion provine din ionul M* prin pierderea foarte probabila a unei grupe metil (CH3,cu masa M = 15); sau daca ionul M conduce la un ion cu masa (M-18) , inseamna caionul a pierdut o molecula de apa si exemplele pot continua.

In acest context, trebuie sa se tina seama ca, de regula, procesul de fragmentaresau eel de rearanjare a ionilor care se formeaza din ionul molecular trebuie sa conducala radical! sau ioni mai stabili decat ionul din care provin.

Fragmentarea duce la formarea ionilor inoleculari, iar la formarea fiecarui ionmolecular se rupe legatura cea mai polarizabila (cu caracterul eel mai polar), cu elimi-narea unui electron din aceasta legatura. De regula, ruperea acestor legaturi se face laatomii de carbon cei mai substituiti, rezultand carbocationii cei mai stabili, cum suntcarbocationii terjiari, conform urmatoarei reacfii:

?:CH3-CH2-C-j-CH2—CH2—CH3

^

HI

-2e"CH3—CH7—CT + CH3—CH2—CH2-

CH3

In cazul compusilor organic! cu duble legaturi in catene liniare, cum este cazulclublei legaturi alii, aceasta favorizcaza ruperea legaturii imediat invecinate dublei lega-turi, iar in cazul compusilor aromatic! substituifi cu catene liniare in a, se rup legaturilea-(3, cu formarea unor cationi alii, benzil etc., stabili potrivit reactiilor urmatoare:

CHj-CH—CH2-f-Ri

CH2 i'R

CH2=CH— CH/cation alilic

CH2

cation b e n z i l i c

+ R-


Fragmentarea legSturilor oc-|3 in care este implicat un heteroatom se face in asafel incat sarcina pozitiva sa ramana la ionul heteroatomic, asa cum se observa din reacliaurmatoare:

R—CH2—CH,—O-R » R—CH2- + R_O-CH2+

Rearanjarea intramoleculara este un fenomen care se produce atunci cand se potforma prin fragmentare specii instabile, mai ales daca acestea contin un heteroatom.Rearanjarea intramoleculara se face prin migrarea unui atom de hidrogen din pozifia ya atomului de carbon de care este legat heteroatomul. Intermediar, se formeaza o stareciclica, dupa care se rupe legatura din pozitia p. Acest tip de rearanjare, numita,,rearanjare Mac Lafferty", se produce mai ales in cazul moleculelor confinand o grupacarbonil (ce exista inclusiv intr-o grupa carboxil), asa cum se observa din exemplul datmai jos:

H •- H +O

/CM

CH2

R H2C ~CH3 •CH2

In acest context se impune si menjionarea ,,picurilor metastabile". care au o duratade viata ce depinde de energia lor interna, si face ca descompunerea lor sa aiba uncaracter statistic. Iar pentru identificarea ionilor se utilizeaza tocmai instabilitatea lor.

Un ion format in sursa in condifii normale este destul de stabil pentru a ajunge ladetector si a fi inregistrat in spectru in pozitia sa normals. Daca insa, este vorba de union metastabil, a carui durata de viata este mai mica de cateva ms. el se descompunepartial pe traiectul de zbor, dupa o cinetica de ordinul unu (pentru o esantionare statis-tica), potrivit reacfiei:

M • —> m' + m'-

Ionul m (fiu ai M •) apare intr-un analizor cu dubla focalizare inaintea iesirii din

sectorul electrostatic, pierzandu-se in peretii analizorului deoarece energia sa cineticaeste insuficienta. Daca insa reactia de descompunere are loc intre iesirea din sectorulelectric si intrarea in eel magnetic, se poate face o reglare speciala a aparatului, astfelincat sa se poata observa urma ionului mT care are o pseudomasa m*, diferita de masareala. In figura 11.24 este prezentat spectrul cu trei picuri care corespund unei t ranzit i imetastabile. Picul m* sc numeste ,,picdifiiz" datorita formei sale mai putin nete si pozitieicare poate sa nu corespunda unei mase reale. Masa ionului difuzeste egala cu m* = m"/M.


M

M

Figura 11.24 Spectrul celor trei picuri ale tranzitiei metastabile

In figura 11.25 este prezentat, pentru exemplificare, spectrul de masa al teo-brominei in care apar ioni metastabili. De exemplu, ionul molecular cu m = 180 Da pierdegrnpa —CONH— cu m = 43 Da, transformandu-se in ionul cu m = 137 Da. Tranzitiametastabi IS conduce la formarea ionului difuzcu m = 104,3 Da. In mod similar, ionul cum = 137 Da pierde CO (28 Da), dand ionul metastabi I cu m = 87,9 Da.

O M.

-U-- N Speclru i^arlia180 ~43 > 137 ——•* 10?

(B6J)_

Me

_ — Xjjji

66.7 104.3

1ST I

tt _ |J> __

80 100 ir.'z 120

Figura 11.25 Spectrul de masa al teobrominei, tn care apar ioni metastabili

Uneori rearanjarea este Tnsotita de asocierea mai multor fragmente, asa cum seTntampla Tn cazul reactief Diels Aider, atunci cand sunt prezente grupari etiienice sidietilenice, asociere din care rezulta compusi ciclici stabili.

Stabilirea structurii unei molecule organice implica si cunoa§terca ,,filiatieiionilor". Pentru aceasta se impime izolarea buna a compusului de analizat (ceea ceinseamna separarea lui Tntr-o stare cat mai pura), conditie care, asociata cu experientaoperatorului analist, face posibila intocmirea unei scheme de fragmentare (care nu sepoate face Tn cazul amestecurilor prost separate, si cu rezolutie slaba). Filiatia ionilor sepoate determina prin MS/MS (mas-masspectrometrie, dec! cu doua analizoare), asa cumarata figura 11.26 (filiatia se poate stabili p r in punerea in evident! a ionilor metastabili).

CAPITOLUL 11 SPECTROMETRIA DE MAS* 477

Daca in camera de ionizare se formeaza mai inul t i ioni, notati cu M|, M}, Mt, IVfJ, f iliafia

ionilor M| si Mj se poate reprezenta ca mai jos.

j, ->M{2 ->M*,

1 2 3 4

Figura 11.26 Stabilirea filiatiei unui ion prin MS-MS, metoda ascendents

1 = camera de ionizare; 2 = analizorul A j fix pe M{; 3 = camera de coliziune;4 =analizorul Aj cu baleiaj; 5 = introducerea unui gaz reactiv; 6 = spectrul de masa obtinut

Daca se considers un amestec de molecule notate cu MA, MB, Mc si MD, din care

se obtin, Tn camera de ionizare, ionii molecular! IVTj", Mj, Mj, Mj. in primul analizor A,

se baleiaza intreaga masa, iar ionii format! tree Tn camera intermediara de coliziune (3),in functie de val.oarea rapoartelor lor m/z;. In aceasta camera se continua procesu! defragmentare. Al doilea analizor Aj (4) este reglat astfel incat, sa lase sa treaca maideparte numai ionul M,, daca se cauta numai filiatia lui. Tn acest fel, Tn functie debaleiajul pr imului analizor, se poate gasi ionul m/z din care s-a format ionul M|.

Este interesanta si o alta aplicatie a MS/MS la identificarea directs a unui compusoarecare, fara separarea lui prealabila, utilizand procedeul descendent. In acest caz,primul analizor nu permite trecerea In camera de coliziune clecat a ionului majoritarcaracteristic substantei analizate, iar dupa fragmentare, analizorul al doilea cu baleiaj daspectrul fragmentelor rezultate. Daca acest spectru este similar aceluia dat de o substantade referinta, se obtine proba doveditoare ca substanta analizata se poate cloza p r infragmentometrie.

Seadniitedin nou amestecul de substante MA, MQ, M^si Mn, caredau aceiasi patru

ioni molecular! M{, M,, M|. M^. Daca trebuie sa se dovedeasca prezenta substantei MA,

stiincl ca aceasta da ionul caracteristic M{ (fara ca amestecul sa fie separat), se poate

utiliza numai Stabilirea fragmentului M{ . Desigur ca si celeialte molecule (MB, Mc si

MD) pot da fragmente cu aceeasi masa si sarcina, de aceea, pentru a dovedi prezentasubstantei MA, nu putem folosi acest spectru.

478 CAPITOLUL11 SPECTROMETRIA DE MASACAPITOLUL 11 SPECTROMETRIA DE MASA

Dar daca se poate demonstra ca ionul M| produce mai mult i ioni si anume M|,

MT, Mt, Mj, se poate afirma ca este prezenta substanta MA, ceea ce se poate exemplif icaprin figura 11.27 prezentata mai jos. Detectia prin MS/MS are o sensibilitate de pico-graine.

Figura 11.27 Dovedirea prezentei substance! MA prin MS/MS, procedeu ascendent

1 = camera de ionizare; 2 = analizorul A| fixat pe M{; 3 = camera de coliziune; 4 =analizorul A? cu baleiaj; 5 = introducerea gazului reactiv; 6 = recorder

11.7.6. Utilizarea spectrometriei de masatn analizacantitativa

Determinarea cantitativa a unei substante prin spectrometrie de masa se face directpe proba de analizat, folosind pentru ionizare bombardarea substantei cu atomi rapizi(FAB) sau prin izolarea MS/MS, aplicand o etalonare prealabila. Aceste tehnici suntposibile numai in laboratoarele specializate in spectrometria de masa cu variantele sale.

In schimb, se pot utiliza cuplaje HPLC-MS, in care se face separarea cromato-grafica prealabila a substantei (Tntr-o forma pura), dupa care se realizeaza ionizarea eiin spectrometrul de masa. Pentru dozarea diverselor substanje separate, se tine seama defaptul ca abundenfa absolula a fiecarui ion. rezultat in conditii experimentale rigurosstabilite, este functie de cantitatea de substanta introdusa in analiza. respectiv in spec-trometrul de masa.

Este dcci necesara masurarea curentului ionic total in timpul ,.sedereii"analituluiin camera de ionizare. Pentru aceasta se aplica un baleiaj repetat, ceea ce face posibilainregistrarea completa a spectrelor de masa si implicit efectuarea de masuratori alecurentilor ionici, a caror suina este analoga cu curentul obtinut cu detectiile obisnuite incromatografie.

Selectivitatea determina rilor cantitative este data de selectivitatea separarii reali-zate prin tehnica cromatografica utilizata (care este, de regula, HPLC). Se poate totusiobtine o specificitate si o sensibilitate mare, daca se fac masuratori selective paralele pe

479

un singur ion, SIM (single ion monitoring) sau in cazul in care se inregistreaza separatcurenfii ionici ai mai multor fragmente, de exemplu 2-8. Sensibilitatea este mai marepentru analizoarele cu baleiaj rapid, cum sunt cele cvadrupol sau cu capcana ionica, iarreproductibilitatea este conditionata de stabilitatea diversilor parametri operator!, maiales a potentialelor de ionizare si de accelerare.

11.7.7. Determinarea rapoartelor izotopice

Izotopii diverselor elemente sunt atat componente ale regnului mineral, cat si alecelor animal si vegetal (numite ?i regnul viu). Izotopii unui element dat se pot diferentiape calea biosintezei. Ei traverseaza peretii celulei cu viteze usor diferite, de aceea inprodusii animal! si vegetal! care se formeaza prin biosinteza compozitia izotopicavariaza usor, dar in proportii detectabile. De aici decurge si importanta detectiei falsifi-carii uleiur i lor alimentare, a aromelor, sucurilor de f ructe etc., la care se adauga studiilemetabolismelor din plante, precum si numeroasele aplicatii medicale.

Pentru exemplificare, se menfioneaza faptul ca raportul izotopic '3C/'2C al vanili-nei naturale este mai mic decat eel al vanilinei de sinteza. Iar in cazul glucozei, acestraport variaza in functie de ciclul biologic parcurs de o planta. Mai mult, este posibilachiardeterminareaprovenienteigeograf ice a unor substante organicedeoriginevegetala.De aici decurge si importanta evaluarii raportului C/ "C, utilizand pentru comparatiecarbonatul de calciu produs de ,,Pee Dee - USA", care are o abundenta foarte ridicata a

C, dovedita de valoarea raportului izotopic C/ "C = 1,12372-10"". Pentru determina-rea experimentala a acestui raport, se utilizeaza intensitatile picurilor date de JCO2 (45)si !2CO2 (44), rezultate din combustia probei. Procedand in acest fel, se obtine o abun-denta naturala notata cu 8, care are, de regula, o valoare negative, utilizand expresia:

5%,,= 1.000

13CO9

12,C02 :proba

13C0212C02 refcrinte

(11.9)

Deoarece aceasta masuratoare se face dupa combustia probei (in cazul carbonatu-lui de calciu folosit ca etalon (este vorba de o descompunere termica la CO2 si CaO), nuse pot detennina variatiile izotopice care pot avea loc la nivelul diverselor pozitii ale uneisubstante analizate. Din acest punct de vedere. determinarea raportului izotopic deuteriu/hidrogen (D/H) prin rezonanta magnetica nucleara (RMN) est mai buna, mai perfor-manta.


Pentru cazul general a dona substanfe A si B, ale caror varietati izotopice senoteaza cu 5A si 5B, se poate calcula valoarea experimental;* 8M a amestecului, luand in

considerare combinatia ponderata a 8A si 5B, ceea ce permite obtinerea procenlajelor deA si B din amestec. Notand cu x fractiunea de B si cu 1-x fractiunea de A, se obtine:

SB

cle unde:

8B-8A

(11.10)

(11.11)

Pentru a se obtine informatii demne de incredere, trebuie sa se asigure o preciziefoarte mare a masuratorilor, ceea ce implica o anumitS ordine a operatiilor care se fac.Astfel, combustia prin care se pregateste proba pentru analiza se face chiar Tnainteainjectarii in spectrometrul de masa. Pentru aceasta, aparatura actuala cupleaza in linie(sau in serie) un gazcromatograf cu un cuptor tubular de combustie, care confine CuO(adus la 800°C), un spectrometru cu sector magnetic cu rezolutie joasa care include uncolector multi-ioni, capabil sa detecteze fiecare masa individual!, asacum se observa inf igura 11.28.

Figura 11.28 Cuplajul GC-MS pentru determinarea rapoartelor izotopice

I ~ GC; 2 = intrare He; 3 = injectie proba; 4 = FLD.= detector cu ionizare in f lacara; 5= intrare He; 6 = tub de combustie; 7 = capcana pentru apa; 8 = intrare CCv, 9 = sectormagnetic; 10 = colector triplu

Acest cuplaj trebuie sa aiba o foarte mare sensibilitate, ceea ce se poate asiguraincluzand in acest tandem mai mulf i detector! de tip Faraday, fiecare dint re acestia cule-gand o singura masa, dupa separarea lor in seclorul magnetic. In cazul mentionat in figuraanterioara este vorba de un colector triplu pentru speciile de CO2 cu mase m ( = 44, m, = 45si m3 = 46.

MSsurarea precisS a rapoartelor izotopice pentru izotopii foarte rari nu esteposibila cu spectrometrele conventionale, de aceea in cazul urmelor infinitezimale deizotopi exista spectrometre de masa cu tandem, denumite ,,tendetroni", care deriva dinacceleratoarele dc particule de tip Van der Graaff. Primul spectrometru de masa dintr-unastfel de tandem separa ionii negativi care corespund masei selectionate, dupa care seelimina interferentii izobari, iar apoi ionii sunt accelerati de o difercnfa de potential demai multi megavolti spre capStul pozitiv al acceleratorului. In zborul lor, ionii intra incoliziune cu o tinta solida sau gazoasa, proces dupa care exists numai atom! izolati,Tncarcati cu mai multe sarcini pozitive.

Din cele expuse, se poate constata complexitatea acestor procese, de aceeamasuratorile de concentratie trebuie sa se faca prin compararea in alternanta a sem-nalelor diferitilor izotopi care provin din proba, din standardele de referinta sau dinmartorii analitici.

Trebuie subliniat faptul ca, utilizand astfel de cuplaje in tandem, datarea vechimiiunor obiecte prin determinarea I4C este mult mai precisa decat datarea prin masuratoride radioactivitate.

11.7.8. Identifrcarea unui compus cu ajutorul spectrotecii MS

Exista spectroteci care corespund unor colectii (biblioteci) cle spectre de masa alesubstanjelor cunoscute, in care sunt incluse (codate) principalele picuri ale acestora,picuri care au eel mai bun acord (deci concords eel mai bine) cu picurile substantei deidentificat.

Utilizarea acestor spectroteci, in care se cauta picurile care intereseaza, implicaurmatoarele etape:

- reducerea datelor, prin care spectrul substantei care intereseaza este redus la eelmult 16 picuri, acordand preferinta picurilor mai grele, mai semnificative decatpicurile usoare; fiecare spectru este redus in biblioteca la 8 picuri;

- precercetarea, care consta in selectionarea spectrelor recluse din spectroteca, laacele spectre care au picuri cu aceleasi pozitii ca si picurile din spectrul redus alsubstantei cercetate, chiar daca intensitatea lor este diferita;

- cercetarea principala, care consta in reluarea selectiei precedente printr-unalgoritm mai fin (mai subtil) care include printre criteriile de alegere intensitatea,masa si raritatea picului. afectand un indice de identitate de la zero la 1000fiecarui spectru, prin aceasta putandu-se face o clasare prin similaritate descres-catoare; trebuie precizat faptul ca exists numerosi algoritmi de cercetare, iar prinmodificarea criteriilor de alegere se poate reduce cercetarea prin verificarea sidiscernerea intre diverse clasamente.

Cea mai importantS spectroteca de masa este aceea a NIST, (National Institut ofStandards and Technology), care includea peste 250.000 de spectre la nivelul ai iului 1996,iar in prezent numarul spectrelor este desigur mai mare.


11.7.9. Alte apficatii ale spectrometriei de masa m analizasi controlul medicamentelor

1) Compararea spectrelor de masa obtinute prin impact electronic si prinionizare chimica. S-a mai subliniat faptul ca aceste doua tehnici se pot combina prinmodif icarea vitezelor de pompare in camera de ionizare, modificand orificiul de pom-pare, corelata cu inchiderea sursei pentru ionizarea chimica si deschiderea ei pent™ionizarea prin impact electronic si invers. In acest fel se pot obfine, in cateva secunde,cele doua spectre a caror analiza comparativa se poate utiliza pentru detectia, dozarea sipentru analiza structural a moleculelor de substante medicamentoase. In figura 11.29sunt prezentate, pentru exemplificare, spectre de masa ale efedrinei obtinute prin acestedoua tehnici.

100

80

60

40

20

i i ,i

Oc^=^ HCni

106i , ,

CH-CH-CH3

HO HN-CH3

M+lir.fi

14S

107

(a) (b)

Figura 11.29 Spectrele de masa ale efedrinei obtinute prin impact electronic (a)si prin ionizare chimicS (b)

Un alt exemplu este acela al spectrelor teofilinei, obtinut prin impact electronic(figura 11.30-a) si a pentilteofilinei (objinuta prin derivatizarea teofilinei inainteasepararii). obtinute prin impact electronic (figura 11.30-b) §i prin ionizare chimica(figura 11,30-c). Pentru obtinerea spectrelor prin ionizare cu impact electronic, se facebombardarea moleculelor de pentilteofilina cu un flux de electron! de 70 eV, din care10-15 eV se consuma pentru formarea ionului molecular primar, iar exceclentul deenergic interna se consuma pentru ruperea altor legaturi chimice pentru formareacelorlalti ioni sau fragmente'ionice.


10011

Ml

fa)

2

100

50

(b)r

0

I S

70

93

70

0

•>

'T4f7"i220

123

\ i . ,

120

50

270

lOf

50

c)

1

2

10 ' ' ' ' 70(1 '

51

279

( i"• ' 280

Figura 11.30 Spectrele de masa ale teofilinei (a) si ale pentilteofilinei, obtinute prinimpact electronic (a si b) si prin ionizare chimica (c)

Asa cum se poate vedea din aceste spectre, ionizarea prin impact electronicproduce o fragmentare mai avansata a moleculei, de aceea spectrele prin impact elec-tronic (IE) sunt mai bogate In benzi. Abundenfa mai mare a iomilui de baza m/z = 250(figura b) reflects stabilizarea structurii biciclice a teofilinei printr-un fenomen derezonanta. Fragmentarea implica mai intai ruperea catenei laterale n-pentil, formandu-se ionii cu m/z = 221, m/z = 207 (M-C3H7), m/z = 194 (M-C4H8), m/z = 193 (M-C4H9) sia ionului molecular de baza cu m/z = 180 (M-CjHjo). lonul de baza pierde in continuarefragmentele CONCH3 si CO pe seama primului ciclu, cu formarea ionilor m/z = 123 sim/z = 95.

Spectrul obtinut prin ionizare chimica este mai simplu, el incluzand ionul cvasi-molecular m/z = 251 (M+H), care poate fi considerat ca pic de baza si ionii m/z - 279(M+C2H5) si m/z = 291 (M+C3H5).

2) Analiza unui numar de 500 de substante toxice, dopante, Tntre care stimu-lante, analgezice-narcotice, anabolice steroidice si beta-blocante, dintre care multe sepot detecta prin metabolitii lor din urinS. Pentru analiza acestor substanlc, IOC (Interna-tional Olympic Committee) a acreditat cca. 20 de laboratoare din kime, in lupta contradopingului. De remarcat ca numai in Franta se fac cca. 7000 de analize anual, pentrudelectiasi determinareacantitativa a substantelor incriminate. Laboratoarele insarcinatecu aceste analize, elaboreaza protocoale analitice detaliate, in care se raporteaza mai alesrezultatele obtinute in ceea ce priveste urmatoarele probleme:

- screeningul rapid al acestor substante, bazat pe teste de culoare si detectia princuplaj GC-MS sau HPLC-MS;

- identificarea confirmata prin anal iza atenta a f iecarei probe poziti ve in pri ma faza,utilizand aceleasi doua cuplaje mentionate anterior, dar cu aparatiira maiperformanta, mai selectiva si mai sensibila; totodata se incearca estimarisemnificative a substantelor de acest fel;

- cuantifiarea precis^ prin cromatografie conventional^ sau cu tehnici spectro-fotometrice, respectiv prin HPLC cuplata cu detectia UV sau prin fiuorimetrie.


3) In continuare se prezinta spectrele de masa ale catorva substante medicamen-toase, dupa ionizarea lor prin diverse procedee.

(1) Spectrul de masa al bumetanidei; ionizare prin impact electronic - El; poten-tial de ionizare: 70 eV; pic de baza cu m/z = 304; intensitatea relativa afragmentelor:

- m/z intensitatea - m/z intensitatea

IM.I-1

M.I

tut

364 74,0 196 19,2321 91,8 168 30,8304 100,0 911 7,0240 63,0 771 0,4

' - • 31

2'

*p \ T •i ,,r 1 1 1 .. . , i . i 'i , i i . .'220 2

•

254 V2 28J

13

1

31

1,

4

!'I i i i i 1 1 i 1 1 i ' i i T ' ^ ' ' | ' ' ' M ' ' ' ' 1 ' ' ^* i^T" | • • • • j i - - •

•«•»•

Figura 11.31 Spectrul de masa al bumetanidei

(2) Spectrele de masa ale dozapinei prin impact electronic (a) §i prin bombarda-ment cu atomi rapizi - FAB (b), figura 11.32.

100-

a so-s

243

256

192

99

TT1"'V"I*T

326

100 2OO 300

Figura 11.32a Spectrele de masa ale clozapinei prin impact electronic

voltaj acceleratie 3 kV; voltaj ionizare 70 eV; curent ionizare 0,3 mA; T camera ionizare170°C

T O O

75 -

BO -

%•£ 25 -

O -

2-13

15O 2OO 250 30O 350

Figura 11.32b Spectrele de masa ale clozapinei prin bombardament cu atomi rapizi - FAB

matrice de alcool 3-nitrobenzilic; bombardare cu atomi de xenon; voltaj acceleratie 6keV

10090

80

i, figura 11.33

273

1 8

J>5 j,,_ .i] _ .. t f . i i i . 1 ^ _Jt t, S I130 HO 150 160 170 180 \90 "5)0 210 220 230~" 240~ "256 ' ~260 ' 270 ^280" JW (M. ^"Z

Figura 11.33 Spectrul de masa al didanosinei

ionizare termospray; pic de baza m/z =137 pentru hipoxantina protonata; pic m/z = 273pentru hipoxantina dimerizata; pic m/z = 154 pentru aductul xantina-amoniu; pic m/z =178 pentru aductul cu acetonitril

486CAPITOLUL11 SPECTROMETRIA DE MASA

(4) Spectrul de mas* al metixenului, figure 11.34

m.

SB

"\ fla

70' B/

- JLrnlUJ.

/

165

\

1 >" "9 1

t J H JW-, '7-

VT-CM,

X^S./^xfXCOD30g\

210/

E35

1 ... . 1 £ •

Figura 11.34 Spectrul de masa al metixenului

f ragmentare prin impact electronic; pic de baza cu m/z = 197, datorat tioxantenei

(5) Spectrul de masa al simvastatinei, f igura 11.35

159

100 —:|

60 —

:

60-]I:;

40 -f;

20 —

„

0 —

43

5

'<

illM

157

71

I

JHf

—

143

105

ilj ,iltkiWw

131129 j

llR |l

uUin •f

IJ•n 1 itTT

198

Iyf

199

224

iTTTT \\\ ,,,!,,,

4182.0 -i

1.5 -

1.0 -

0.5 -

-

400

0.0 —

3021 41

; r- 303 i50 100 150 200 250 300 350 400

Figura 11.35 Spectrul de masa al simvastatinei

impact electronic; voltaj de ionizare: 90 eV; ionul cu m/z = 418 corespunde simvastatinei


(6) Spectrul de masa al tenoxicamului, f igura 11.36

oo-

80-

6 0 -

40

20

oiliiiiliLi dl L blJ 1

50 100 150J m/z

, 1 i.1 1 1 F

200 250 300 350

Figura 11.36 Spectrul de masa al tenoxicamului

ionizare prin impact electronic la 70 eV; presiunea sursei: 10-6 torri; curent de emisie:1 mA

(7) Spectrele de masa ale tiamfenicolului, f igura 11.37

Jl

z-

244

I t

illuikLs! !i!

488

3110B 200 30B 400 300

Figura 11.37a Spectrele de masa ale tiamfenicolului - impact electronic

voltaj de ionizare: 70 eV

1......

488

1R0

CAPITOLUL 11 SPECTROMETRIA DE MASA

7 18

Lk600100 200 300 409 300

Figura 11.37b Spectrele de masa ale tiamfenicolului - ionizare chimica

gaz reactiv: metan

(8) Spectrul de masa al tolazamidei, figura 11.38

100

>M

•5 80 "TO

I 6 0 "1| 40 -

20

-

.5

41

L

1|,

(

66

i l l:!.,, j

' "sir ™

1

TO"

1 3 156

LIL

139

,

171 197

190J 216 2541 [H! ' [W ' ' IbU ' I8U ' 2)0 ' J.'M 4tu iou

CAPITOLUL 12 SPECTROMETRIA DE REZONANTA MAGNETIC* NUCLEARA 489

Figura 11.38 Spectrul de masa al tolazamidei

ionizare prin impact electronic; voltaj de ionizare: 70 eV; temperatura sursei: 200°C; picmolecular m/z - 91; abundente foarte scazute pentru majoritatea picurilor

Rezonanta magnetica nucleara se bazeaza pe interactia spinului nuclear cu uncamp magnetic. Primele lucrari in domeniu sunt ale fizicienilor Bloch si Purcell (1945).care an pus bazele teoretice si practice ale acestei inetode exceptional de analiza.

Rezonanta magnetica nucleara, RMN, este utilizata In numeroase domenii, cumsunt analiza calitativa si cantitativa, dar mai ales analiza structurala a compusilororganic!, inclusiv medicamentosi si de interes biomedical, cercetarea moleculelor biolo-gice fiind de neconceput azi fara aceasta telinica In care se imbina rezultatele dezvoltariitehnologice cu cele stiintifice si cu inteligenta si cultura profesionala a specialistilor Inacest domeniu.

Merita a fi subliniata In acest context ,,imageriaRMN" prin care se obtin ,,cartografii"ale unor medii structurate, cu aplicatii in determinarea infarctului cerebral, a prezenteitumoriior canceroase si in alte scopuri medicale.

12.1. Producerea spinului nuclearNucleele atomice poseda un moment magnetic de spin, datorat miscarii lor de

rotatie in jurul unei axe, fenomen analog momentului magnetic al electronilor care serotesc in jurul propriei lor axe si care produc acest spin electronic. In figura i2 . l esteprezentata o schema de producere a spinului nuclear (a) si spinul nucleului atomului dehidrogen (proton) (b).

Prin urmarc, orice particula, inclusiv nucleul atomic, are un spin, adica o miscare—>

de rotatie In juru l propriei sale axe care se noteaza cu I . Spinul nuclear este un parametruvectorial introdus de mecanica cuantica si el permite explicarea comportarii atomilor inmedii in care exists o directie privilegiata. Spinul nuclear este determinat de un dezechili-bru care apare intre masa si sarcinile nucleare.

490 CAPITOLUL 12 SPECTROMETRIA DE REZONANTA MAGNETICA NUCLEAR ACAPITOLUL 12 SPECTROMETRIA DE REZONANTA MAGNETICA NUCLEARA 491

(b)

Figura 12.1 Reprezentarea producerii spinului nuclear (a) si spinul nucleului atomuluide hidrogen (b)

Nucleele atomice care au un numar impar de protoni sau de neutroni (dar nuambele numere impare) au numere cuantice de spin egale cu 1/2 sau cu multiplii aiacestuia, deci 3/2, 5/2, inclusiv zero etc. Deoarece spinul nucleului se apropie conceptual

-»de momentu! cinetic L (din mecanica clasica), el are dimensiunile J-s si, ca urrnare, prinintroducerea unui atom intr-un camp magnetic, el ,,recunoa$te" o orientare privilegiatadin spatiu, care corespunde campului magnetic, putand sa interactioneze apoi cu oradiaj.ie electromagnetics din regiunea undelor hertziene si sa absoarba o anumita

frecventa v pentru a da un spectru RMN.

Deoarece in cazul in care numarul de protoni sau de neutroni este impar, rezulta, ca exista un nucleon neimperechiat. In cazul elementelor alcatuite din mai multi izotopi,

fiecare izotop are spinul sau nuclear, ca urmare a variatiei masei atomice. Intabelul 12.1sunt date valorile spinului nuclear pentru atomii catorva elemente mai f recvent intalnite.

Tabelul 12.1 Valorile spinului pentru cativa atomi uzuali

Numar protoni

impar

par

impar

impar

par

Numar neutroni

par

par

impar

impar

par

impar

Numar de spin I

0

1/2

1/2

1

3/2

5/2 '

Exemple

!2r 32Q 28Q-6L> 16b> 14bl

lu 15X, I9C 31D]H, 7N, 9F, 15P

\cTH, M

7N

5B> 35Bl

«l

12.2. Absorbtia de radiatii si variatia energies

Absorbtia radiatiilor electromagnetice de catre materie este insojita de o variatiea energiei. Aceasta variatie este mica in cazul RMN (dar relativ mare in spectrometrie),fapt care sugereaza ca in rezonanta magnetica nucleara se absorb lungimi de unda mari,cu energie mica, asa cum se intampla in general in variatia spinilor unor particule (dealtfel undele hertziene se caracterizeaza prin lungimi de unda mari).

-»Luand in considerare un nucleu izolatal carui spin este diferit de zero (I *0), el se

comporta ca un magnet minuscul al carui „moment magnetic u. „ are dimensiunile J-T"1

si care este egal cu:

j?=y.? (12.1)

Vectorul momentului magnetic nuclear este coliniar cu momentul de spin sau este

opus acestuia, in functie de semnul ,,raportului giromagnetic y", numit adesea si constantsgiromagnetica.

-4Daca se introduce acum acelasi nucleu izolat (avand I ^0) intr-un camp magnetic

-)exterior H0 care poate produce o inductie magnetica si care face cu vectorul spinului un

-» _,unghi 6, apare un cuplu Tntre II0 si u,, care itiodifica energia potentiala a nucleului. De

retinut ca momentul magnetic (X nu se aliniaza si deci nu urmeaza directia campuiui exte-—> „

rior H0. Intr-un astfel de caz energia E a nucleului este egala cu:

£ = -)?• Ho sau E = -i?-H0 sau E = -ueos(e)H0 (12.2)

Se poate vorbi in acest caz de o dirijare a proiecjiei u,z a momentului magnetic_>(.1 pe axa Oz, de catre campul magnetic inductor H0. De asemenea, conform regulilor

mecanicii cuantice, proiectia )iz a unui nucleu nu poate avea decat 21+1 valori si, caurmare, nici energia potentiala E nu poate km decat tot 21+1 valori, in acest camp

-»magnetic H0. In figura 12.2 este prezentat momentul magnetic u,, momentul de spin I ,

-» -proiectia momentului magnetic u,7 si campul magnetic inductor H0.

Cuantificarea momentului jaz este in stransa legatura cu valorile pennise m ale

proiectiei vectorului spinului pe axa Oz, iar valorile lui m in unitaji naturale (h/27i) suntegale cu:

m=-I,-I+l,..., 1-1,1 (12.3)

492CAP1TOLUL 12 SPECTROMETRIA DE REZONANTA MAGNETICA NUCLEARA CAPITOLUL 12 SPECTROMETRIA DE REZONANTA MAGNETICA NUCLEARA 493

Daca se combina acum relajia (12.1) curelajia (12.2), se objine o expvesie generala acelor 21+1 valori permise ale energiei:

E = -y-m-Ho (12.4)

Atunci cand 1=1/2, energia E poate aveadoua valori (Tn jouli) care corespund la m= 1/2

si la m= -1/2, astf el: Figura 12.2 Reprezentarea proiectiei j z

,._ .. a momentului magnetic u. pe axa Oz j>ubacflunea campului magnetic exterior H0

Acest fenomen se poate reprezenta printr-o schema care include succesiunea deprocese ce au loc, atunci cand un nucleu care se roteste in jurul propriei sale axe (Figuva12.3 a) ,,prime§te un micsoc", care determina continuarea miscarii, dar in doua directii(figura 12.3 b si c). Acest soc este determinat de campul magnetic in care evolueazanucleul-sfarleaza. In figura 12.3 c este reprezentat sectorul magnetic si cele doua nivelede energie (1 s.i 2) care corespund starilor energetice E[ si Ej (respecliv Ea si Ep).

(a)(b)

Ea

AE=Ea-E(3+AE|-AE

(c)

Figura 12.3 Rezonanta nucleara si relaxare

§ocul primit de nucleu este determinat de un emitator de inalta frecventa, careproduce o basculare (baleiere) a vectorului magnetic. In figura 12.4 este prezentata oschema de principiu a unui spectrometru de rezonanta magnetica nucleara (a), precumsi dispunerea perpendiculara pe campul magnetic a unui camp oscilant de radiof recventa

-> -»(b) §i o reprezentare a campurilor H0, H| si a semnalului RMN (c).

(b)

Figura 12.4 Schema constructiva a unui spectrometru de rezonanta magneticanucleara (b) si dispunerea perpendiculars pe campul magnetic a unui camp oscilantde radiofrecventa (a) si reprezentarea campurilor H0, HI si a semnalului RMN-S (c)

In loc de E] si de E2 se pot nota aceste energii cu Ea si Ep, iar aparitia mai multornivele de energie se mai numeste si efect Zeemaii, dupa efectul Zeeman care consta insepararea nivelelor electronice de encrgie intalnita Tn spectrofotometrie. Cele douanivele de energie se pot reprezenta astfel (figura 12.5), pentru I =±1/2:

Figura 12.5 Nivelele energiei nucleare )Ei si Ea pentru I = ±1/2

Ej pentru 1 = 1/2, fata de un camp cuenergie joasaE] pentru I = -1/2, fata de un camp cuenergie mai mare

Revenincl la figura 12.2, trebuie precizat ca, daca se cunosc u si u,z . se poatecalcula unghiul conului de revolutie, deoarece cuantificarea proiectiei vectorului spin peaxa Oz permite baleierea suprafe{ei conului de revolutie. Aceasta miscare se numeste,,mi§caredeprecesie" Tn jurul unei axe paralele la axa campului magnetic si se caracteri-zeaza prin frecventa sa care variaza proportional cu intensitatea campului.

Pentru intelegerea acestei ,,miscari imateriale" a unui spin nuclear, se poate acceptaun exemplu material care este sfarleaza, pe care o putem numi ,,sfarleaza magnetica" si

a carei mi§care sub actiunea campului magnetic H0 se poate reprezenta prin figura 12.6.

494 CAPITOLUL 12 SPECTROMETRIA DE REZONANT A MAGNETIC A NUCLEAR A CAPITOLUL 12 SPECTROMETRIA DE REZONANTA MAGNETICA NUCLEARA 495

Sau

(a)(b)

Figura 12.6 Reprezentarea unui nucleu cu spin egal cu 1/2 (al unui atom existent

intr-o solutie) (a) si efectul campului magnetic H0 asupra lui

in cazul (a), lipsa campului magnetic face ca momentul magnetic u sa nu aiba o orientare—>preferentiala in timp, dar in cazul (b) are o orientare in raport cu H0, opusa acestuia in

primul caz si colineara in al doilea caz

Sfarleaza, in miscarea de rotate in jurul axei sale, face un unghi 9 fata de campulde gravitatie. Miscarea sf arlezei magnetice este o miscare giroscopica, iar aceasta rezultadin combinarea miscarii de rotatie in jurul axei sale cu cuplul de revenire (readucere).Intrucat regulile (normele) vectorului magnetic si proiectia sa sunt cuantificate, unghiul6 ramane constant in timp. De aceea, in cazul unui nucleu cu I = 1/2, se pot calcula

-4unghiuri le permise de I in raport cu axa Oz intre 55' si 125', tinand seama desigur denormele vectorului spinului (date de expresiaVl(I+l) si proiectia sa I).Unghiul 6 = 54,74', utilizat in multe determinari RMN. se numeste ,,unghi magic".

Studiul si determinarea unor atomi prin RMN sunt conditionate de imparitateanumarului de proton! z din nucleu sau de imparitatea neutronilor din nucleu. Cu alecuvinte, pot fi studiaji prin RMN numai atomii care au numarul de spin 1 = 1/2 sau multipli

ai acestuia (deci I & 0).

Astfel, atomii de JH, l^C, 'gF, ^P au numarul de spin I = 1/2 si pot fi studiati in

RMR iar deuteriul ^H = ?D si 147N au I = 1. In schimb, atomii de U

6C, He, '|o, ^Si, Snu pot f i studiati prin RMN. Este important faptul ca mai mult de jumatate din nucleidele(elemcntele) stabile cunoscute au eel pufin un izotop care da un semnal RMN, darsensibilitatea detectiei variaza foarte mult in functie de nucleele atomice. Asa se explicausurinta detectarii prin RMN a nuclcelor de JH sau gF, spre deosebire de 6C care da unsemnal de mil de ori mai putin sensibil decat al protonului (pe o parte, datorita abundenteiizotopice mici a JC, iar pe de alta parte naturii acestui nucleu).

12.3. Grupuri sau populatii de nuclee

Comparativ cu scara aproape infinitezimala a microparticulelor aflate in discutie,la scara macroscopica la care se lucreaza experimental, o cantitate inf ima (data) dintr-uncompus molecular contine un numar considerabil de molecule din acesta; de aceea, f i indvorba de un numar foarte marc de nuclee, se pot judeca fenomenele in discutie intr-oconceptie statistics. Revenind la figura 12.4 si considerand ca nucleele identice au

->numarul de spin I = 1/2, in absenta unui camp magnetic exterior H0, orientSrile vectorilordc spin sunt aleatoare, variind constant. Dar, din punct de vedere energetic, aceste nucleeapartin unei singure populatii ,,in stare degenerata". Intr-un camp magnetic inductor

—>puternic H0, cu orientare Oz, are loc o interactiune Tntre f iecare vector magnetic nuclear(al acelorasi nuclee mentionate) cu acest camp inductor. Ca urmare, se pot distingc douagrupuri de nuclee care au energiile egale cu E|, respectiv E2, in functie de proiectiavectorului lor de spin pe axa Oz, asa cum se poate vedea din figura 12.7.

+1-0,820,620,41

0,13

-1-

0

_--"""""

•

*--.--__

f- *. I?_ ff?n\

'Hoj

cr"~~~T n ^

1,4 4,7 7 9,3Tesla

~->

m=-l/2

AE

r E, (Ea)

m= +1/2

60 200 300 400MHz(pt. 1 proton)

Figura 12.7 Schema scindarii celor doua nivele energetice ale unui nucleu cu I = 1/2,Ei si £2 (sau Ea ?i Ep) sub actiunea campului magnetic

Au fost alese patru valori ale intensitatii campului magnetic inductor H0, valoricare corespund protonului si sunt exprimate in tesla (IT = 10.000 Gauss). Diferenta deenergie dintre cele doua stari este egala cu:

E = E 2 -Ei=y—-Ho (12.6)

si ea este proportionals cu campul magnetic inductor H0, asa cum se poate vedea in figura

data mai sus. Trebuie precizat ca raportul (E2 — E))/H0 nu depinde decat de raportulgiromagnetic y, adica de nucleul in cauza. In tabelul 12.2 sunt date valorile lui ypentrucateva nuclee mai importante (in acest label rad inseamna radian si ea este unitatea de

496 CAPITOLUL 12 SPECTROMETRIA DE REZONANTA MAGNETIC A NUCLEARA CAPITOLUL 12 SPECTROMETRIA DE REZONANTA MAGNETICA NUCLEARA 497

masura a unghiurilor plane; 1 radian este egai cu unghiul care are varful in centrul iinuicere si care subintinde un arc a carui lungime este egala cu raza cercului; valoareanumerica a unui radian este egala cu 57°17'45").

Tabelul 12.2 Valorile lui y pentru nuclee mai importante studiate prin RMN

Nuclee N

'HI9p

3lp

13C

•y(rad s"1 T1)

2,67522 IxlO8

2.5181 xlO8

1,084 x!08

0.67283 xlO8

SensibilitateaN/1H

10,83

6,6x1 0"2

l,8x!0'4

Numarul nucleelor care se afla in starea de energie Ej este putin mai mare decatnumarul nucleelor ce se gasesc in starea de energie E2 si tocmai acest mic exces de nuclee

~>ale populatiei E, dau semnale RMN. Prin marirea intensitatii campukii magnetic H0 semareste diferenta dintre cele cloua populatii (grupuri) de nuclee E] si E2, ceea ce deter-mina o accentuare a sensibilitatii.

finand seama de magnetizarea slaba a prbbei, se poate construi grafic vectorul

M0. care se numeste ,,magnetiitare macroscopica", folosind toli vectorii u. individual!, asa

cum se observa in figura 12.8 (b).

? H0

(a) (b)

Figura 12.8 Reprezentarea schematics a miscarii de precesie a vectorului-spin a 5

nuciee identice, independents, Tn campul magnetic exterior H0 (a) sivectorui de magnetizare macroscopica M0 (b) care rezulta din orientarileindividuale ale unui numar mare de nuclee

Vectorul de magnetizare macroscopica este luat in vedere, de regula. pentru aexplica intr-o maniera mai simpla origina semnalului care se observa atunci cand tree instarea de rezonanta (rezonanta nucleara).

Pentru a exemplifica diferenta mica dintre populatiile E, si E2 (deci dintrenumerele N, si N2 de nuclee care apartin acestor populatii), se poate caicula raportuldintre aceste doua populatii (nuinit echilibru de repartitie Boltzmann), utilizand relatiaunnatoare:

N2 _^§R = NT = e kT <12-7)

Pentru T = 300°K, H0 = 5,3 T (tesla) si k = 8,3 14/6,022- 1023 JK'1, valoarea raportuluiR = 0,999964.

12.4. Ecuatia Larmor

Din punct de vedere analitic, este necesar sa se provoace un semnal de rezonantaprin crearea unor conditii de trecere a nucleelor de la nivelul E, la nivelul E,. In acestmod se poate evalua diferenfa de energie AE = E2 - E,, iar daca aceasta diferenta sepoate detecta (pentru 1 =1/2), se poate identifica un nucleu in functie de raportul saugiromagnetic.

Aceasta concepfie se poate transpune in practica RMN prin iradierea nucleelor

aflate intr-un camp magnetic H0, cu ajutorul unei surse de radiatii electromagnetice cu

f recventa variabila, a carei directie de propagare trebuie sa fie perpendiculars pe campulmagnetic exterior, inductor. Nucleele pot absorb! energie daca se indeplinesle conditia:

hv = £2 - E] = AE (12.8)

Daca se pleaca de la ecuatia (12.6), se poate obtine ecuatia fundamentala arezonantei nucleare:

v = 'H0 (12.9)

numita ecuatia lui Larmor, care stabileste legatura dintre campul magnetic in care se aflanucleele atom ice si frecventa radiatiei electromagnetice care asigura conditia de re-zonanta, adica semnalul in spectru. Ecuatia Larmor este generala, oricare este valoarealui I, iar radiof recvenfacare provoaca precesia Larmor se numeste si frecventa de precesieLarmor, deoarece la aceasta frecventa vectorul spinului se roteste in juruldirectiei medii Oz.

Este interesant faptul ca, desi Larmor a trait ceva mai devreme fata de aparitiaRMN, el a demonstrat ca pulsatiasau frecventa unghiulara to, numita si viteza unghiularade rotatie a spinului in jurul axei Oz, este egala cu co = yH0, dar si cu co = 2jcv, ceea ceconfirma legea fundamentala in RMN. Desi cele doua valori ale frecventei au aceeasivaloare, elc au intelesuri diferite, prima exprima frecventa cuantei care se'para niveleleE, si E2, iar a doua exprima frecventa mecanica de precesie. «•

Pentru un nucleu dat, frecventa Larmor creste cu intensitatea campului magneticexterior H0 si se situeaza in domcniul undelor scurte. Aceasta frecventa variaza (pentru

498 CAPITOLUL 12 SPECTROMETRIA DE REZONANTA MAGNETICA NUCLEARA

un camp magnetic de un tesla) de la 42,5774 MHz, in cazul nucleului hidrogenului (H(proton), la 0,7292 MHz, pentru nucleul aurului. Pentru alte nuclee ale unor elemente maifrecvent intalnite, valorile frecventelor de rezonanta, intr-un camp magnetic de I tesla,sunt urmatoarele:

'Hv = 42,58

13C

9,71

15N4.32

Sip17,24 40,06

12.5. Deplasarea chimica si relaxareaIn consideratiile anterioare s-au facut referiri la cazul unui nucleu atomic izolat si

la comportarea lui Intr-un camp magnetic exterior H0 determiriat de un camp de Inalta

frecventa.

Insa nucleul unui atom se gaseste In realitate In cadrul unei molecule, deci Intr-o,,inconjurare chimica" determinata de prezenta altor nuclee si de legaturile dintre atomiimolecule! considerate. Aceasta inconjurare modif ica usor valoarea campului magneticexterior cu care vine Tn contact. Electronii legaturilor dintre atomi provoaca un campmagnetic opus campului magnetic exterior, efect care poate fi considerat ca o micaecranare magnctica si care se numeste ,.blindaj". Efectul de blindaj produce ,,varia(iilocale" ale campului magnetic, ceea ce are drept consecinta decalarea frecventelor derezonanta In raport cu procesele similare care se petrec In vid.

Si tocmai aceste fenomene stau la baza spectrometriei RMN prin care se studiazaun singur tip de nucleu; nu toate nucleele posibile care s-ar repartiza pe o banda defrecvenfa de mai multe zeci de MHz. Practic, se studiaza structura fina care este carac-teristica fiecarui compus, studiu care se face intr-un interval foarte redus de f recvente,de cca. 1000 Hz. Trebuie spus ca in astfel de studii trebuie sa se tina seama de campul

magnetic efectiv Hel- care atinge nucleul si care se gaseste in urmatoarea relatie cucampul magnetic exterior (inductor):

Hef=H 0 ( l - (T) (12.10)

in care o este ,,constantade ecran" (sau de ecranare), iar orice variaf ie a parametru-lui 0 se repercuteaza asupra frecventei de rezonanta a nucleului si accst fenomen senumeste ,,deplasare chimici". Deplasarea chimica se produce cu absorbtia unor cantitatimici de energie, observandu-se atatea cleplasari chimice diferite, cate comportari diferiteare molecula si deci cate valori diferite are constanta de ecranare o.

Spre exempiu, in cazul moleculelor mari, au loc numeroase efecte de ecranare, deaceea spectrelc RMN in astfel de cazuri se interpreteaza greu.

finand seama de efectul de ecranare, deci de campul magnetic efectiv, relatiaLarmor are, pentru un nucleu cu 1 = 1/2, urmatoarea expresie:

V i = T - ' H 0 ( l - O i )2rt

(12.11)

CAPITOLUL 12 SPECTROMETRIA DE REZONANTA MAGNETICA NUCLEARA 499

In determinant RMN experimentale se constata ca variafii mici ale campuluimagnetic H0 determina o deplasare mica a frecvenfei de rezonanta aprotonului, de aceeatemperatura magnetului trebuie sa fie stabilizata cu o precizie de 1/100 grade. Deasemenea, este necesara si reducerea concernitenta a heterogenitatii campului, ceea cese realizeaza prin punerea in rotatie a probei intr-un tub cu pereti subtiri.

Revenind la schema constructive a unui spectrometru RMN (figura 12.4), la localde introducere a probei se provoaca rezonanfa prin suprapunerea pe campul magnetic

-» ->inductor H0 a unui camp magnetic oscilant slab H] , produs de o sursa formata dintr-o

—>bobina alimentata cu curent alternativ de radiofrecventa. Acest camp aditional H (

trebuie sa aiba o orientare convenabila, de aceea axa de propagare a radiofrecventeitrebuie sa fie perpendiculara pe axa Oz (Figura 10.4 b). Atunci cand radiofrecventasursei si frecventa de precesie sunt identice, are loc un transfer de energie dinspre sursaspre nuclee, care tree din starea de energie E, in starea de energie E2 mai bogata inenergie, ceea ce determina modificarea celor doua populatii de nuclee.

Trebuie precizat cii, prin aplicarea campului oscilant de radiofrecventa, vectorul demagnetizare incepe si basculeze, datori ta impu l su lu i pr imi t , de aceea momentelemagnetice ale nucleelor individuate pierd coerenta de faza datorita interac(iunilordintre spini i nucleelor invecinate, care se produc cu o viteza mai mare decat aceea areorientirii lor pentru a ajunge din nou la reparti t ia Bol tzmann init iala a celor douapopulat i i . Impulsul primit , notat cu M0, pierde componenta sa in planul xOy fara aregasi valoarea in i t ia la in directia Oz (figura 12.8 b).

Prin urmare, proba este iradiata cu un impuls puternic de cateva microsecuncle,care confine toate frecventele domeniului de lucru.

Asa de exempiu, pentru a acoperi o banda de frecven(e de eel putin 6000 Hz si pen t rua iradia to(i protonii, indiferent de inconjurarea lor, sunt necesari 300 MHz. Cu toateacestea, nu to|i protonii capteaza frecventa care provoaca rezonanta lor, ci numai omica fractiune dintre acestia.

De remarcat ca aceste procese sunt mai complexe decat se poate exprima intr-oprezentare de principii, de aceea spectrometrul RMN Inregistreaza, la revenirea la stareade echilibru, un semnal complex de mai multe secunde, datorat combinarii diferitelorfrecvente de precesie, a caror intensitate descreste exponential, fenomen care constaintr-o descrestere a inductiei (FID = free induction decay).

—>Dupa iradierea unui nucleu cu un impuls de radiofrecventa, impulsul M0 tincle sa

dobandeasca valoarea de echilibru de dinaintea iradierii, intr-un timp variabil caredepinde de mediu. Revenirea mentionata este functie de pierderea coerentei de faza, caurmare a unei interactiuni spin-spin, precum $i de revenirea populatiilor de nuclee lastarea lor initiala, ceea ce se numeste ,,proces de relaxare". Relaxarea implica, prinurmare, doi limpi si anume ,,timpul de relaxare longitudinal" T,, in care are loc reconsti-tuirea populatiilor prin interactiuni ale spinului cu refeaua si ,,timpul de relaxare trans-versal" T2, in care se produce pierderea coerenfei de faza.

500 CAPITOLUL 12 SPECTROMETRIA DE REZONANTA MAGNETICA NUCLEARA

—»Aceste componente T[ si T2 ale vectorului M0 trebuie sa fie distinct intclese,

deoarece timpul Tj, numit si timp de viata, poate varia in cazul protonului ( H), de lacateva secunde pentru solutii, pana la cateva ore in cazul probelor solide. Atunci canclvascozitatea probei creste, Tj scade, ceea ce determina o largire a benzilor, iar valoarealui T2 se rasf range asupra largimii razelor. In figura 12.9 sunt reprezentatc variatiilccelor doua procese de relaxare in care sunt implica|:i timpii T) si T2.

Figura 12.9 Reprezentarea proceselor ude relaxare

-»T], timp de relaxare longitudinal;- T2, timp de relaxare transversal. •-

timp

Producerea rezonantei si procesul de relaxare, deci de revenire la starea initialsde energie, se pot reprezenta si prin schema data in figura 12.9 (b).

AE

m-absorbtie

I t ic .

relaxarecu emisie

E, (Ea)

relaxarefara emisiede energie

M

execs

Figura 12.9 (b) Producerea rezonantei si a relaxarii

(n[ si n2 sur|t numerele speciilor / nucleelor neexcitate si excitate)

In aceasta figura AE este energia necesara pentru a se produce, de exemplu,rezonanta protonului, adica trecerea nucleului atomului de hidrogen de la nivelul deenergie EI (Ea) la nivelul de energie E^ (Ep). Nucleele care ajung la acest din urma nivelde energie (si care alcatuiesc unul din cele doua grupuri de energie identica) revin rapidla starea fundamentals de energie E], prin relaxare cu sau fara emisie de energie.

Trebuie precizat ca AE'este foarte mica, deoarece energiile E! §i E2 au valori destul de

apropiate.

CAPITOLUL 12 SPECTROMETRIA DE REZONANTA MAGNETICA NUCLEARA 501

12.6. Deplasarea chimica si masurarea ei

In spectrometria RMN nu se compara spectrele RMN obtinute cu diverse spec-trometre si nu se identifies diferitele substante existente in proba pe baza frecventelorabsolute ale semnalelor obtinute experimental, deoarece se stie ca, potrivit ecuatieiLarmor, cele mai mici variatii ale campului se rasf rang asupra frecventelor de rezonanta.

Ca urmare a acestui fapt, trebuie sa se detecteze deplasarile chimice pe o scararelativa Av/v, care este independents de aparat. Pentru aceasta, se imparte abaterea f rec-

ventei v intre fiecare semnal dat de substanta studiata si semnalul unui standard intern

(care este unic), utilizat ca referinta, la frecventa proprie a spectrometrului, notata cu vap

si caracteristica fiecarui aparat. Valorile acestor rapoarte se exprima in ppm, iar depla-sarea chimica, notata cu 5, si exprimata de asemenea in ppm, care corespunde unui semnal

de f recven{3 v; fata de frecven^a de referinta vrcf, se calculeaza astfel:

(12.12)

AH/H0:

Vap Vap

Deplasarea chimica se exprima nu numai prin raportul Av/vap. ci si prin raportul

Av AH8=-

Vap AH0

(12.13)

Av = difcrenfa frecventelor de rezonanta;AH0 = diferenta campurilor magnetice aplicate.

Deplasarea chimica 8, exprimata prin rapoartele de mai sus, are o valoare foartemica, de numai cateva milionimi, de aceea ea se exprima in ppm si tot din acest motiv seexprima in ppm si scara valorilordeplasarilor chimice. In tabelul 12.3 sunt date valoriledeplasarii chimice 5, in ppm, pentru cateva nuclee mai importante.

Tabelul 12.3 Valorile deplasarilor chimice pentru unele nuclee

Nucleul de:

]H13C19F31p

Intinderea scarii 5; ppm

30400

1000800

Este important de retinut ca, in cazul spectrometriei RMN-protonica, trebuie sase evile utilizarea solventilor hidrogenati ai caror protoni interfere masuratorile derezonanta prin propria lor rezonanta. Daca este totusi necesar sa se utilizeze un astfel desolvent, trebuie alesi derivafi deuteraji care sa confina numai deuteriu. De aceea seutilizeaza apa grea, cloroformul deuterat, piridina deuterata, DMSO-deuterat (dimetil-sulfoxid deuterat) etc.

10-analiza si controlul medicamentului

Documents

Transcript of 10-analiza si controlul medicamentului