Lucrarea nr. 4

Prelucrarea si analiza calitativ a fluidelor biologice complexe. Izolarea si identificarea compuilor

biochimici din lapte

Background

Laptele este o suspensie apoasa coloidala format din mai multe componente: glucide, lipide,

proteine i fosfai. Coninutul in fiecare din aceste componente depinde de sursa laptelui (de vaca, de oaie,

de capr, etc.) precum i de modul de procesare la care a fost supus fiecare sortiment.

Cazeina este cea mai importanta proteina din lapte. Acesta funcioneaz ca proteina de stocare,

care ndeplineste cerinele nutriionale. Cazeina poate fi izolat din lapte prin acidifiere pentru a o aduce la

punctul izoelectric. La punctul izoelectric, numrul de sarcini pozitive pe o proteina este egal cu numrul de

sarcini negative. Proteinele sunt mai puin solubile n ap la punctul izoelectric, deoarece tind s formeze

agregate datorit interaciunilor electrostatice. Captul pozitiv al moleculei de protein atrage captul

negativ al altei molecule de proteine, iar agregatele formate precipit din soluie.

Pe de alt parte, dac o molecula de proteina are o sarcin net pozitiv (la un pH sczut - condiii

acide) sau o sarcina net negativ (la un pH ridicat -condiii bazice), solubilitatea n ap crete.

Lactoza este glucida care se gasete in lapte i este, din punct de vedere structural, compus dintr-o

molecul de -D-glucoz i una de -D-galactoz, unite prin legtur 1,4--glicozidic.

n prima parte a acestui experiment, veti izola cazeina din lapte. Cazeina va fi separata ca un

precipitat insolubil prin acidularea laptelui(care are un pH de aproximativ 6.6) la punctul izoelectric al

cazeinei (pH 4.6). Lipidele care precipit mpreun cu cazeina pot fi eliminate prin dizolvarea n alcool. Dupa

separarea caseinei si ndepartarea grasimilor veti separa si celelalte proteine solubile (lactoalbumina si

lactoglobulina) prin denaturare si precipitare, in final in solutie ramanand numai lactoza.

n a doua parte a acestui experiment, veti realiza identificarea caseinei si lactozei prin efectuarea

unor teste chimice cunoscute.

A. Izolarea cazeinei

Intr-un pahar Erlenmeyer de 250-mL se introduc 50 ml lapte si se incalzeste pe baie de apa la 400C

sub agitare.

Cand laptele atinge temperatura dorita, se scoate din baie si se adauga sub agitare 1.5 ml acid

acetic glacial sub agitare. Se observa formarea precipitatului.

Se lasa inc 15 minute agitnd ocazional, apoi se filtreaza printr-o panza de tifon. Se indeparteaza

apa din precipitat presand cu ajutorul unei baghete. Precipitatul format se transfera intr-un pahar uscat, iar

filtratul se utilizeaza mai departe pentru izolarea lactozei.

Peste precipitat se adauga 15 ml etanol. Se agita bine 10 minute, maruntind precipitatul cat mai

bine, apoi se lasa sa se decanteze si se filtreaza. Precipitatul se scoate pe o hartie de filtru amplasata intr-o

placuta Petri si se lasa la uscat circa 15 minute, maruntind din cand in cand cu ajutorul unei spatule.

Se cantareste produsul obtinut si se calculeaza procentul de cazeina din lapte cu formula:

cazeina

B. Izolarea lactozei

Filtratul obtinut in prima faza se amesteca cu 2.5g Na2CO3 si se incalzete pe baie de apa la fierbere timp

de 10 minute, cand are loc precipitarea celorlalte proteine (lactalbumine si lactoglobuline). Solutia se

filtreaza fierbinte pe un filtru cutat, apoi se raceste si se utilizeaza pentru identificarea lactozei.

C. Analiza chimica a cazeinei

Se prepara o solutie de cazeina prin introducerea a 0.2g din cazeina separata in 25 ml apa se agita pana la

dizolvare completa.

1. Testul biuretului

Este unul din cele mai importante teste pentru proteine. Cand o proteina reactioneaza cu sulfatul de

cupru(II) testul pozitiv este dat de formarea unui complex de cupru care are culoarea violet.

Testul este pozitiv pentru orice proteina ce contine doua sau mai multe din urmatoarele grupe:

Mod de lucru

Intr-o eprubeta se introduc 2 ml solutie de caseina, se adauga 5 picaturi de solutie NaOH 10% si 2

picaturi de solutie 5% CuSO4. Se agita bine si se noteaza rezultatul.

2. Testul cu ninhidrina

Aminoacizii si proteinele care au o grupa amino libera reactioneaza cu ninhidrina dand un complex albastru-

violet:

Mod de lucru

Intr-o eprubeta se introduc 2 ml suspensie de caseina, se adauga 5 picaturi de solutie de ninhidrina

si se incalzeste la fierbere cu atentie timp de 5 min. Se agita bine si se noteaza rezultatul.

Obs. 1. Solutia de ninhidrina contine etanol. Atentie la incalzire.

2. Ninhidrina reactioneaza si cu proteinele din piele, dand compusi colorati, care se

indeparteaza greu. Feriti contactul pielii cu solutia de ninhidrina.

3. Testul xantoproteic

Este o reactie caracteristica proteinelor care contin aminoacizi cu inel benzenic. Acidul azotic concentrat

reactioneaza cu inelul benzenic conducand la nitroderivati de culoare galbena.

Intr-o eprubeta se introduc 2 ml suspensie de caseina, se adauga 10 picaturi de acid azotic

concentrat si se incalzeste pe baie de apa cu atentie timp de 5 min. Se agita bine si se noteaza rezultatul.

D. Analiza chimica a lactozei

1 Testul cu reactiv Benedict Glucidele reductoare sunt detectate cu ajutorul reactivului Benedict care conine ioni de

Cu2+(albastru) si care in urma unui proces redox datorat grupei aldehidice trec in ioni de Cu+ care precipita sub forma de Cu2O (rosu). Lactoza, fiind formata dintr-o molecula de glucoza si una de galactoza unite prin legtur 1,4--glicozidic are hidroxilul anomeric liber si poate da test pozitiv cu reactivul Benedict.

Mod de lucru Intr-o eprubeta se introduc 3 ml solutie de lactoza separata anterior. Se adauga apoi 3 picaturi de

reactiv Benedict, se agita bine si se introduce intr-o baie de apa la fierbere unde se mentine 2 minute. Se scoate si se noteaza culoarea observata.

2.2. Testul cu reactiv Barfoed

Reactivul Barfoed (solutie de acetat de Cu in acid acetic) contine ioni de Cu2+ in mediu acid. Conditiile de oxidare sunt mai blande si numai monozaharidele reducatoare dau test pozitiv in timp ce dizaharidele reducatoare nu dau acest test. Mod de lucru

Intr-o eprubeta se introduc 3 ml solutie de lactoza separata anterior. Se adauga apoi cate 5picaturi

de reactiv Barfoed, se agita bine si se introduce intr-o baie de apa adusa la fierbere unde se mentine 2

minute (masurate din momentul in care apa incepe din nou sa fiarba). Se scoate si se noteaza culoarea

observata.

Se completeaza tabelul:

Volum lapte (ml)

Masa cazeina separata (g)

Procent cazeina in lapte(%)

Cantitate de cazeina intr-un litru de lapte (g/l)

Teste chimice de identificare Culoare observata Observatii

Cazeina

Testul biuretului

Testul cu ninhidrina

Test xantoproteic

Lactoza

Reactia cu reactiv Benedict

Reactia cu reactiv Barfoed

Intrebari

1. Cazeina are un punctul izoelectric la pH 4.6. Ce tip de sarcini (pozitive sau negative) vor fi majoritare in structura cazeinei in lapte? 2. Daca se adauga o cantitate mai mare de acid acetic se va obtine o cantitate mai mare de cazeina sau nu? Explicati raspunsul dat. 3. In locul acidului acetic poate fi utilizat si alt acid? Dati exemple de produse comune care pot fi utilizate pentru precipitarea cazeinei. 4. Un procent destul de mare din populatia globului (aprox. 5%) prezinta intoleranta la lactoza. Care este cauza intolerantei la lactoza?