2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice

(continuare)

Metode turbidimetrice

http://namrataheda.blogspot.ro/2013/07/Măsurarea activității enzimatice a

lipazei din S.aureus

Rollof, J. et al., Acta path. Microbiol.

Immunol. Scand., Sect.B, 92,

155-158, 1984

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.2. Metode de determinare

a activității enzimatice

Metode nefelometrice

https://www.pinterest.co.uk/

Măsurarea activității celulazei din

Trichoderma reesei

Mummi, M., J. et al., Anal. Biochem.,

116, 133-136, 1981

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.2. Metode de determinare

a activității enzimatice

Metode nefelometrice

trends.directindustry.com/ Măsurarea activității enzimelor

pancreatice II. Lipase

Zinterhofer., L. et al., Clin. Chim.

Acta, 44, 173-178, 19873

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.2. Metode de determinare

a activității enzimatice

Luminometria

Firefly (Photinus pyralis)

Etichetarea cu FITC a compușilor cu –NH2

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice

Luminometria

https://www.etsy.com/

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice

Polarimetria

Hidroliza zaharozei folosind

soluții de diluții 1:250, 1:500,

1:1000 de invertază din drojdie

McIntosh,. K.A. et al. (1998),

J. Pharm. Biomed. Anal.,

17, 1037-1045

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice

Metode electrochimice

Bisswanger, H. (2012) Practical Enzymology

Wiley-Blackwell, Weinheim, Germany Ramsay, R. R. and Tipton, K. F. (2017)

Molecules, 2017, 22, 1192

Disfuncții ale gutei pentru

pacienți cu EED

https://www.pinterest.co.uk/pin/

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.2. Metode de determinare a

activității enzimatice

Etichetarea radioactivă

Metodă discontinuă de măsurare a activității

enzimatice (P pe filtru)

Rossomando, E.(Ed) HPLC in Enzymatic Analysis,

Capitol 1, Willey & Sons (1998)

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice

Etichetarea radioactivă

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice

Alte metode

Separarea substratului și produșilor unei reacții

catalizate de adenozin kinaza

pe HPLC (fază inversă)

Rossomando, E.(Ed) HPLC in Enzymatic Analysis,

Capitol 1, Willey & Sons (1998)

2.6. Imobilizarea enzimelor

2. Purificarea enzimei

a) Metode fizice de imobilizare a enzimelor

imobilizarea prin adsorbție și includere a enzimelor

m = k1 Ck2

izoterma Freundlich

m =k1 k2 C

1 + k2 C

izoterma Langmuir

2.6. Imobilizarea enzimelor

2. Purificarea enzimei

a) Metode fizice de imobilizare a enzimelor

imobilizarea prin adsorbție și includere a enzimelor

Cantitatea de enzimă adsorbită - parametri:

• Concentrația soluției enzimei care este supusă imobilizării

• Timpul de contact

• Tincubare

• Influența pH-ului

www.easybiologyclass.com

2.6. Imobilizarea enzimelor

2. Purificarea enzimei

a) Metode fizice de imobilizare a enzimelor

imobilizarea prin adsorbție a enzimelor

Suporturi utilizate

• Suport mineral (Al2O3, argilă)

• Suport organic (amidon)

• Sefaroză mofificată

• Rășini schimbătoare de ioni

Interacțiunilor slabe

interacțiuni electrostatice

hidrofobe

punți de hidrogen

Mărimea particulelor

D = 500 nm – 1 mm

https://www.intechopen.com

2.6. Imobilizarea enzimelor

2. Purificarea enzimei

a) Metode fizice de imobilizare a enzimelor

imobilizarea prin includere a enzimelor

• Sechestrarea enzimelor într-o matrice

• Matricea – polimeri solubili în apă

• Exemple de matrici

Geluri de poliacrilamidă

Triacetat de celuloză

Agar-agar

Gelatină

Caragenan

alginate

2.6. Imobilizarea enzimelor

2. Purificarea enzimei

a) Metode fizice de imobilizare a enzimelor

imobilizarea prin includere a enzimelor

Avantaje - dezavantaje

Variază forma și natura matricilor

Dimensiunea porilor matricii poate fi ajustată

Posibile “scăpări” ale enzimelor cu M mică

Agarul și caragenanul – dimensiuni mari - pori

Dimensiunea porilor poate fi ajustată variind

conc polimerului

Metoda nu poate fi utilizată în procesele industriale

Preferată pentru experimente la scară mică

2.6. Imobilizarea enzimelor

2. Purificarea enzimei

a) Metode chimice de imobilizare a enzimelor

Legarea covalentă a enzimelor

Formarea de legături covalente între

enzimă și suport

Metodă preferată de imobilizare

Grupări chimice care pot forma legături

covalente cu suportul

Grupări amino, imino

Grupări -OH

Grupări -COOH

Grupări –SH și –SCH3

Grupări guanidil și imidazol

Nuclee fenolice

2.6. Imobilizarea enzimelor

2. Purificarea enzimei

a) Metode chimice de imobilizare a enzimelor

Legarea covalentă a enzimelor

Matrici / suporturi utilizate în legarea covalentă a enzimelor:

Carbohidrați: celuloză, DEAE celuloză, agaroză

Agenți sintetici: poliacrilamidă

Proteine (colagen, gelatină, albumină)

Matrici cu grupări amino: amino-benzil-celuloză

Suporturi anorganice: sticlă poroasă, silicagel

CNBr-agaroză și CNBr-Sepharose

Grupările –OH și –NH2 formează mai ușor legături covalente

2.6. Imobilizarea enzimelor

2. Purificarea enzimei

a) Metode chimice de imobilizare a enzimelor

Legarea covalentă a enzimelor

Metode de legare covalentă

Diazotare

Gr –NH2 suport ↔ Y sau H din enzimă

Formarea legături peptidice

–NH2 suport

HOOC- din enzimă

Illanes, Enzyme Bocatalysis. Principles and

applications, Springer (2008)

2.6. Imobilizarea enzimelor

2. Purificarea enzimei

a) Metode chimice de imobilizare a enzimelor

Legarea covalentă a enzimelor

Metode de legare covalentă

2.6. Imobilizarea enzimelor

2. Purificarea enzimei

a) Metode chimice de imobilizare a enzimelor

Legarea covalentă a enzimelor

Metode de legare covalentă

Utilizarea agenților polifuncționali

Portman, R.(2008), Biology of Metals,

22(2):363-375

2.6. Imobilizarea enzimelor

2. Purificarea enzimei

a) Metode chimice de imobilizare a enzimelor

reticularea enzimelor

Metode de legare covalentă

2.6. Imobilizarea enzimelor

2. Purificarea enzimei

Aplicații ale enzimelor imobilizate

Producerea industrială a

antibioticelor

băuturilor

aminoacizilor

Aplicații biomedicale

tratament

diagnoză

eliberare medicamente

Industrie alimentară

gemuri

jeleuri

siropuri

Cercetare

HPR – experimente blotting

proteaze – lizare celulară

2.6. Imobilizarea enzimelor

2. Purificarea enzimei

Aplicații ale enzimelor imobilizate

Producerea biodieselului

din uleiuri vegetale

Managementul apelor reziduale

tratarea apelor de canal

tratarea efluenți industriali

Industrie textilă

degresare

bio-netezire

dezmembrare țesături

Industria detergenților

imobilizare lipaze

îndepărtarea murdăriei